JPH07107079B2 - ヒト−免疫グロブリンｅ結合因子 - Google Patents
ヒト−免疫グロブリンｅ結合因子Info
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- JPH07107079B2 JPH07107079B2 JP61133957A JP13395786A JPH07107079B2 JP H07107079 B2 JPH07107079 B2 JP H07107079B2 JP 61133957 A JP61133957 A JP 61133957A JP 13395786 A JP13395786 A JP 13395786A JP H07107079 B2 JPH07107079 B2 JP H07107079B2
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- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
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- C07—ORGANIC CHEMISTRY
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Description
【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 この発明は、新規な精製されたヒト免疫グロブリンＥ結
合因子（IgE-BF）、その個々の場合によってはグリコシ
ル化されている蛋白質及びそれらの断片、並びにそれら
の使用に関する。
合因子（IgE-BF）、その個々の場合によってはグリコシ
ル化されている蛋白質及びそれらの断片、並びにそれら
の使用に関する。
アレルギー性疾患は、その高い頻度（人口の20〜30％）
及び治療法の不存在のため、主要な健康問題である。治
療法は抗ヒスタミン剤の使用又は幾分効果的な免疫性に
限定されている。古典的な抗アレルギー剤は、特に治療
された患者において深刻な副作用を生じさせるため、幾
つかの欠点を有する。免疫法は１〜２のアレルゲンに限
定されるが、ほとんどの患者は多数のアレルゲンに対し
て感受性である。
及び治療法の不存在のため、主要な健康問題である。治
療法は抗ヒスタミン剤の使用又は幾分効果的な免疫性に
限定されている。古典的な抗アレルギー剤は、特に治療
された患者において深刻な副作用を生じさせるため、幾
つかの欠点を有する。免疫法は１〜２のアレルゲンに限
定されるが、ほとんどの患者は多数のアレルゲンに対し
て感受性である。
大部分のアレルギー性疾患が無数の空媒アレルゲン、例
えば花粉、動物のフケ、又ははイエダニ等、食品抗原、
医薬、例えばペニシリン、又は膜翅目昆虫の毒に対して
向けられた免疫グロブリンＥ（IgE）抗体により介在さ
れる。IgEの生産制御する機作は実験室動物において広
範囲に研究されている〔K.Ishizaka,Ann.Rev.Immunol.
2.159（1984）〕。これらの研究は、動物モデルにおい
てIgEの生産を調節する抗原特異的ではないがIgEアイソ
タイプ特異的機構の存在を明瞭に示している。これらの
制御機構のエフェクター分子は、IgEに対するその親和
性のためにIgE−結合因子（IgE-BF）と命名された。IgE
-BFはIgE抑圧因子（IgE-SF）及びIgE−相乗因子（IgE-P
F）に分けられ、これらの因子はその炭水化物含量にお
いてのみ異る。EgE-SFはグリコシル化されていないか、
又はIgE-PFより少なくグリコシル化されている。動物モ
デルにおけるIgEの実際の生産はこれら２つの種類のIgE
-BF間の比率により決定される。
えば花粉、動物のフケ、又ははイエダニ等、食品抗原、
医薬、例えばペニシリン、又は膜翅目昆虫の毒に対して
向けられた免疫グロブリンＥ（IgE）抗体により介在さ
れる。IgEの生産制御する機作は実験室動物において広
範囲に研究されている〔K.Ishizaka,Ann.Rev.Immunol.
2.159（1984）〕。これらの研究は、動物モデルにおい
てIgEの生産を調節する抗原特異的ではないがIgEアイソ
タイプ特異的機構の存在を明瞭に示している。これらの
制御機構のエフェクター分子は、IgEに対するその親和
性のためにIgE−結合因子（IgE-BF）と命名された。IgE
-BFはIgE抑圧因子（IgE-SF）及びIgE−相乗因子（IgE-P
F）に分けられ、これらの因子はその炭水化物含量にお
いてのみ異る。EgE-SFはグリコシル化されていないか、
又はIgE-PFより少なくグリコシル化されている。動物モ
デルにおけるIgEの実際の生産はこれら２つの種類のIgE
-BF間の比率により決定される。
異なる制御Ｔリンパ球集団により分泌されるグリコシル
化阻害因子又はグリコシル化増強因子のいずれかの影響
に依存して、同じ細胞がIgE-SF又はIgE-PFのいずれかを
生産することができる。
化阻害因子又はグリコシル化増強因子のいずれかの影響
に依存して、同じ細胞がIgE-SF又はIgE-PFのいずれかを
生産することができる。
M.Sarfati等〔Immunology53、197,207,783（1984）は、
囓歯動物において記載されているのと同じ生物学的活性
を有するIgE-BFを分泌するヒトＢセルラインの存在を記
載している。他の研究者はヒトＴ細胞による〔T.F.Huff
及びK.Ishizaka、Proc.Natl Acad Sci.（USA）81、1514
（1984）〕及びラット／マウスＴ−細胞ハイブリドーマ
による〔ヨーロッパ特許出願No.155,192〕IgE-BFの生産
を記載している。ＴセルラインのIgE-BFとＢ細胞由来の
それとの関連は知られていない。この発明は今や、ヒト
Ｂ細胞由来のIgE-BFを高度に精製された形で提供する。
囓歯動物において記載されているのと同じ生物学的活性
を有するIgE-BFを分泌するヒトＢセルラインの存在を記
載している。他の研究者はヒトＴ細胞による〔T.F.Huff
及びK.Ishizaka、Proc.Natl Acad Sci.（USA）81、1514
（1984）〕及びラット／マウスＴ−細胞ハイブリドーマ
による〔ヨーロッパ特許出願No.155,192〕IgE-BFの生産
を記載している。ＴセルラインのIgE-BFとＢ細胞由来の
それとの関連は知られていない。この発明は今や、ヒト
Ｂ細胞由来のIgE-BFを高度に精製された形で提供する。
母乳供与が新生児の免疫反応性を変化せしめることがす
でに知られている。最近の予見的な研究はさらに、排他
的母乳供与が危険性の高い幼児をアレルギー性疾患から
保護することを示した。これらの観察を説明するために
多くの機構が用いられる。これらは、（ｉ）外来性食品
抗原への暴露が少ないこと、（ii）多くの栄養抗原及び
他の環境抗原に対して特異的な抗体をブロックするミル
クlgAによる保護、（iii）アレルギー性疾患の開始を指
令することが知られている一般的ウィルス性疾患に対す
る保護、及び最後に（iv）新生児の未成熟免疫系を調節
することができる免疫制御因子のヒト−ミルク中での存
在〔S.S.Crago及びJ.Mestecky、Surv.Immunol.Res.2、1
64（1983）〕である。母乳供与新生児の免疫反応性につ
いてのよく報告されている観察は、特異抗体もしくはイ
デオタイプ、免疫制御因子、又は制御リンパ球のヒト初
乳中での存在により説明されよう。従って、母乳供与
は、新生児にIgE−抑制因子、又はIgE抗体生産の制御に
関与する小児リンパ球を妨害することができる他の分子
（例えばグリコシル化阻害因子）もしくは細胞を供与す
ることにより該新生児を保護することができることが示
唆される〔S.A.Roberts及びM.W.Turner、Immunlogy48、
195（1983）；並びにJarrett及びE.Hall、Nature280、1
45（1979）〕。
でに知られている。最近の予見的な研究はさらに、排他
的母乳供与が危険性の高い幼児をアレルギー性疾患から
保護することを示した。これらの観察を説明するために
多くの機構が用いられる。これらは、（ｉ）外来性食品
抗原への暴露が少ないこと、（ii）多くの栄養抗原及び
他の環境抗原に対して特異的な抗体をブロックするミル
クlgAによる保護、（iii）アレルギー性疾患の開始を指
令することが知られている一般的ウィルス性疾患に対す
る保護、及び最後に（iv）新生児の未成熟免疫系を調節
することができる免疫制御因子のヒト−ミルク中での存
在〔S.S.Crago及びJ.Mestecky、Surv.Immunol.Res.2、1
64（1983）〕である。母乳供与新生児の免疫反応性につ
いてのよく報告されている観察は、特異抗体もしくはイ
デオタイプ、免疫制御因子、又は制御リンパ球のヒト初
乳中での存在により説明されよう。従って、母乳供与
は、新生児にIgE−抑制因子、又はIgE抗体生産の制御に
関与する小児リンパ球を妨害することができる他の分子
（例えばグリコシル化阻害因子）もしくは細胞を供与す
ることにより該新生児を保護することができることが示
唆される〔S.A.Roberts及びM.W.Turner、Immunlogy48、
195（1983）；並びにJarrett及びE.Hall、Nature280、1
45（1979）〕。
今までIgE-SF活性を有するIgE-BFはヒト初乳中に同定さ
れておらず、そしてその単離はどこにも記載されていな
い。驚くべきことに、このようなIgE-BFが今や高度に精
製された形で単離された。
れておらず、そしてその単離はどこにも記載されていな
い。驚くべきことに、このようなIgE-BFが今や高度に精
製された形で単離された。
lgEはアレルギー性疾患の進行に重要な役割を示す。従
って、精製されたIgE−結合因子はアレルギー性疾患及
びそれと関連する免疫制御疾患の診断及び治療のために
重要である。特に、IgE−抑圧活性を有するIgE-BFはア
レルギー性疾患の治療のために有用であり、他方IgE−
相乗活性を有するIgE-BFは感染に対する耐性、例えば寄
生性感染に対する耐性を増加するであろう。
って、精製されたIgE−結合因子はアレルギー性疾患及
びそれと関連する免疫制御疾患の診断及び治療のために
重要である。特に、IgE−抑圧活性を有するIgE-BFはア
レルギー性疾患の治療のために有用であり、他方IgE−
相乗活性を有するIgE-BFは感染に対する耐性、例えば寄
生性感染に対する耐性を増加するであろう。
IgE-BFの検出のための既知のアッセイ法はロゼット阻害
試験に基礎を置いており、この方法においては、IgEの
ためのリセプター（FcεＲ）を発現するリンポブラスト
イドＢセルラインからのRPMI8866細胞がIgE−コートさ
れたウシ赤血球と共にロゼット形成する。後者がまずIg
E-BFと前インキュベートされておれば、それらはもはや
RPMI8866細胞に結合することができず、従ってロゼット
を形成する細胞の比率が低下する。このアッセイ法は定
量的でなく、ウシ赤血球へのIgEのカップリングの可変
性のために技術的に微妙であり、そしてロゼットを顕微
鏡下で観察しなければならず、セルラインが永久的に入
手可能でなければならず、IgE−コート赤血球を規則的
に調製しなければならない等のために厄介であり、この
結果１日に１人で合理的に行うことができる試験の数は
少数（20〜40）である。従って、多数の、例えば１日当
り数百のサンプルに適用することができる定量的で実施
が容易なアッセイ法を提供することが最も望ましいであ
ろう。このような測定法は、IgE-BFの生理病理学の研究
を促進するのみならず、この測定法は種々の生物学的液
体、例えばIgE-BFを分泌するセルラインからの培養上清
からのIgE-BFの精製をモニターするためにも使用される
であろう。さらに、これは診断目的で血清中のIgE-BFを
検出しそして定量するために使用することができよう。
試験に基礎を置いており、この方法においては、IgEの
ためのリセプター（FcεＲ）を発現するリンポブラスト
イドＢセルラインからのRPMI8866細胞がIgE−コートさ
れたウシ赤血球と共にロゼット形成する。後者がまずIg
E-BFと前インキュベートされておれば、それらはもはや
RPMI8866細胞に結合することができず、従ってロゼット
を形成する細胞の比率が低下する。このアッセイ法は定
量的でなく、ウシ赤血球へのIgEのカップリングの可変
性のために技術的に微妙であり、そしてロゼットを顕微
鏡下で観察しなければならず、セルラインが永久的に入
手可能でなければならず、IgE−コート赤血球を規則的
に調製しなければならない等のために厄介であり、この
結果１日に１人で合理的に行うことができる試験の数は
少数（20〜40）である。従って、多数の、例えば１日当
り数百のサンプルに適用することができる定量的で実施
が容易なアッセイ法を提供することが最も望ましいであ
ろう。このような測定法は、IgE-BFの生理病理学の研究
を促進するのみならず、この測定法は種々の生物学的液
体、例えばIgE-BFを分泌するセルラインからの培養上清
からのIgE-BFの精製をモニターするためにも使用される
であろう。さらに、これは診断目的で血清中のIgE-BFを
検出しそして定量するために使用することができよう。
この発明は、IgE-BFと交差反応するリンパ球FcεＲに対
するモノクローナル抗体の調製により前記の問題点に対
して解決を与える。同時に、これらのモノクローナル抗
体はアフィニティークロマトグラフィーによるIgE-BFの
効果的な精製を可能にする。IgE−コート固相上でのア
フィニティークロマトグラフィーによるIgE-BFの既知の
精製法は、IgE-BFに対するIgEの低い親和性のために低
い収量を伴い、精製された因子に対するさらに進んだ研
究を困難にしていた。
するモノクローナル抗体の調製により前記の問題点に対
して解決を与える。同時に、これらのモノクローナル抗
体はアフィニティークロマトグラフィーによるIgE-BFの
効果的な精製を可能にする。IgE−コート固相上でのア
フィニティークロマトグラフィーによるIgE-BFの既知の
精製法は、IgE-BFに対するIgEの低い親和性のために低
い収量を伴い、精製された因子に対するさらに進んだ研
究を困難にしていた。
この発明の第１の目的は、精製さえた形態のIgE−結合
因子（IgE-BF）、その個々の場合によってはグリコシル
化されている蛋白質、及びそれらの断片、並びにその単
離方法を提供することである。
因子（IgE-BF）、その個々の場合によってはグリコシル
化されている蛋白質、及びそれらの断片、並びにその単
離方法を提供することである。
この発明の他の目的は、IgE-BFの定性的及び定量的測定
並びに精製のために有用なモノクローナル抗体を提供す
ることである。
並びに精製のために有用なモノクローナル抗体を提供す
ることである。
この発明の第３の目的は、この発明のIgE-BF、個々の蛋
白質又は断片を投与することによるアレルギーの予防及
び／又は治療のための方法、並びにこれらの成分を含ん
で成る医薬組成物を提供することである。
白質又は断片を投与することによるアレルギーの予防及
び／又は治療のための方法、並びにこれらの成分を含ん
で成る医薬組成物を提供することである。
この発明は精製されたヒト免疫グロブリンＥ結合因子
（IgE-BF）、その個々の場合によってはグリコシル化さ
れている蛋白質、及びその断片に関する。この発明の好
ましい態様においては、この精製されたIgE-BF及びその
構成成分はヒトＢ細胞上清、又はヒト初乳から単離され
る。
（IgE-BF）、その個々の場合によってはグリコシル化さ
れている蛋白質、及びその断片に関する。この発明の好
ましい態様においては、この精製されたIgE-BF及びその
構成成分はヒトＢ細胞上清、又はヒト初乳から単離され
る。
例えば、この発明の精製されたIgE-BFは次のように特徴
付けられる。
付けられる。
（１） IgEのためのリンパ球リセプター（FcεＲ）に
対するモノクローナル抗体により認識されてそして結合
されるヒト由来の場合によってはグリコシル化されてい
る蛋白質を含む。
対するモノクローナル抗体により認識されてそして結合
されるヒト由来の場合によってはグリコシル化されてい
る蛋白質を含む。
（２） SDSポリアクリルアミドゲル電気泳動（SDS-PAG
E）及び銀染色により決定される場合、25〜28KD（キロ
ダルトン、kg/mole）の見かけ上のおよその分子量を有
する分子、及び場合によっては、FcεＲに対して特異的
なモノクローナル抗体に結合する他の蛋白質、例えば45
〜60KDのダイマー及び／又は一層低分子量、すなわち10
〜20KDの部分消化された蛋白質から成る。
E）及び銀染色により決定される場合、25〜28KD（キロ
ダルトン、kg/mole）の見かけ上のおよその分子量を有
する分子、及び場合によっては、FcεＲに対して特異的
なモノクローナル抗体に結合する他の蛋白質、例えば45
〜60KDのダイマー及び／又は一層低分子量、すなわち10
〜20KDの部分消化された蛋白質から成る。
（３） 例えばアガロースゲルに結合したIgEへの吸着
及びそれからの可能性ある回収により決定される場合、
IgEに可逆的に結合する。
及びそれからの可能性ある回収により決定される場合、
IgEに可逆的に結合する。
（４） 例えばFcεＲを発現するRPMI8866細胞へのIgE
−コートラテックス粒子の結合の阻害によって決定され
る場合、IgEのためのリセプターを担持する細胞へのIgE
の結合をブロックする。
−コートラテックス粒子の結合の阻害によって決定され
る場合、IgEのためのリセプターを担持する細胞へのIgE
の結合をブロックする。
（５） 例えば放射性ラベルされたIgE及びミクロタイ
タープレート上に固定されたそれに対するモノクローナ
ル抗体を用いて決定される場合、IgEに対して特異的な
モノクローナル抗体へのIgEの結合をブロックする。
タープレート上に固定されたそれに対するモノクローナ
ル抗体を用いて決定される場合、IgEに対して特異的な
モノクローナル抗体へのIgEの結合をブロックする。
（６） IgEのためのリセプター（FcεＲ+）を発現する
ヒトＢ細胞の上清又はヒト初乳の構成成分である。
ヒトＢ細胞の上清又はヒト初乳の構成成分である。
上記のIgE-BFの個々のIgE-BF蛋白質は次のように特徴付
けられる。
けられる。
（１） 後で特徴付けるように、IgE-BFの構成成分であ
る。
る。
（２） 例えばSDS-PAGE又はゲル濾過高圧液体クロマト
グラフィーのごとき常用の蛋白質分析法に従えば均一で
ある。
グラフィーのごとき常用の蛋白質分析法に従えば均一で
ある。
（３） 場合によってはグリコシル化されている。
（４） SDS-PAGEにより決定される場合、25〜28KDの見
かけ分子量を有する。
かけ分子量を有する。
（５） 次のようなおよその範囲の全アミノ酸組成：ア
スパラギン酸／アスパラギン19〜23、グルタミン酸／グ
ルタミン25〜31、セリン22〜26、スレオニン８〜10、グ
リシン15〜25、アラニン16〜20、アルギニン10〜12、プ
ロリン13〜16、バリン10〜12、メチオニン３〜５、イソ
ロイシン７〜９、ロイシン13〜17、トリプトファン０、
フェニルアラニン６〜９、システイン３〜４、リジン８
〜10、ヒスチジン４〜５、及びチロシン６〜８を有す
る。
スパラギン酸／アスパラギン19〜23、グルタミン酸／グ
ルタミン25〜31、セリン22〜26、スレオニン８〜10、グ
リシン15〜25、アラニン16〜20、アルギニン10〜12、プ
ロリン13〜16、バリン10〜12、メチオニン３〜５、イソ
ロイシン７〜９、ロイシン13〜17、トリプトファン０、
フェニルアラニン６〜９、システイン３〜４、リジン８
〜10、ヒスチジン４〜５、及びチロシン６〜８を有す
る。
SDS-PAGEによってはおよその分子量が決定し得るのみで
あり、この発明の化合物の実際の分子量は20〜35KDの範
囲にあることを理解すべきである。同様に、全アミノ酸
分析法の不確実性のため、実際のアミノ酸組成は上記の
アミノ酸組成の範囲とは異るかもしれない。
あり、この発明の化合物の実際の分子量は20〜35KDの範
囲にあることを理解すべきである。同様に、全アミノ酸
分析法の不確実性のため、実際のアミノ酸組成は上記の
アミノ酸組成の範囲とは異るかもしれない。
これらの個々のモノクローナル抗体の幾つかは、208.25
A.4.3/135と称するモノクローナル抗体により結合され
るがしかし208.25D.2/94と称するモノクローナル抗体に
よっては有意な程度には結合されず、この逆も成立す
る。
A.4.3/135と称するモノクローナル抗体により結合され
るがしかし208.25D.2/94と称するモノクローナル抗体に
よっては有意な程度には結合されず、この逆も成立す
る。
個々のIgE-BF蛋白質はグリコシル化されているから、又
は炭水化物残基を欠いている。典型的には、グリコシル
化されたIgE-BF蛋白質は１又は複数の炭水化物基、例え
ばＮ−アセチルグリコサミン、もしくはアスパラギン残
基にＮ−グリコシド化により連結されたＮ−アセチルグ
ルコサミンを含有するオリゴサッカライド、及び／又は
Ｎ−アセチルガラクトサミン、もしくはセリンもしくは
スレオニン残基にＯ−グリコシド化により連結されたＮ
−アセチルガラクトサミンを含有するオリゴサッカライ
ドを含む。オリゴサッカライドはサリチル酸、例えばＮ
−アセチルニューラミネート又はＮ−グリコリルニュー
ラミネートを含むことができる。
は炭水化物残基を欠いている。典型的には、グリコシル
化されたIgE-BF蛋白質は１又は複数の炭水化物基、例え
ばＮ−アセチルグリコサミン、もしくはアスパラギン残
基にＮ−グリコシド化により連結されたＮ−アセチルグ
ルコサミンを含有するオリゴサッカライド、及び／又は
Ｎ−アセチルガラクトサミン、もしくはセリンもしくは
スレオニン残基にＯ−グリコシド化により連結されたＮ
−アセチルガラクトサミンを含有するオリゴサッカライ
ドを含む。オリゴサッカライドはサリチル酸、例えばＮ
−アセチルニューラミネート又はＮ−グリコリルニュー
ラミネートを含むことができる。
この発明はまた次のように特徴付けられるIgE-BFの断片
に関する。
に関する。
（１） 場合によっては上に特徴付けられたIgE-BFの構
成成分である。
成成分である。
（２） 通常の蛋白質分析法、例えばSDS-PAGE又はゲル
濾過高圧液体クロマトグラフィーに従えば均一である。
濾過高圧液体クロマトグラフィーに従えば均一である。
（３） SDS-PAGEにより決定される場合、10〜20KD、好
ましくは14〜16KDの見かけ分子量を有する。
ましくは14〜16KDの見かけ分子量を有する。
（４） 前に特徴付けられた個々のIgE-BF蛋白質の部分
的酵素消化により得られる。
的酵素消化により得られる。
この発明はまた、精製されたIgE-BF、その個々の場合に
よってはグリコシル化されている蛋白質及びそれらの製
造方法に関し、この方法はIgE-BFを含有する溶液、例え
ばRPMI8866細胞のごときIgE-BF産生細胞の培養上清又は
ヒト初乳調製物をFcεＲに対して特異的なモノクローナ
ル抗体を担持する担体材料と接触せしめ、未結合蛋白質
及び他の外来性物質を除去し、前記担体上の抗体に結合
したIgE-BFを選択的に切り離し、そして単離し、そして
所望により精製されたIgE-BFをその個々の場合によって
はグリコシル化されている蛋白質及び／又はそれらの断
片に分離することを特徴とする。
よってはグリコシル化されている蛋白質及びそれらの製
造方法に関し、この方法はIgE-BFを含有する溶液、例え
ばRPMI8866細胞のごときIgE-BF産生細胞の培養上清又は
ヒト初乳調製物をFcεＲに対して特異的なモノクローナ
ル抗体を担持する担体材料と接触せしめ、未結合蛋白質
及び他の外来性物質を除去し、前記担体上の抗体に結合
したIgE-BFを選択的に切り離し、そして単離し、そして
所望により精製されたIgE-BFをその個々の場合によって
はグリコシル化されている蛋白質及び／又はそれらの断
片に分離することを特徴とする。
IgE-BFを含有する細胞培養上清又は細胞抽出物はそれ自
体既知の方法に従って調製される。適当な細胞はヒト由
来のリンパ球、特にインビトロで培養することができる
リンパ球、例えばリンパブラストイドセルライン、特に
連続性のヒトＢ細胞系、例えばヒトＢセルラインRPMI88
66である。IgE-BFを生産するこのようなセルラインの培
養上清を直接に、場合によっては濃縮した後にこの発明
の精製工程に導くか、あるいはあらかじめ既知方法によ
る予備精製、例えば限外濾過、透析又はクロマトグラフ
ィーによる精製、例えばDEAE−セルロースもしくは架橋
デキストランゲル、例えばセファデックスによる精製に
かける。
体既知の方法に従って調製される。適当な細胞はヒト由
来のリンパ球、特にインビトロで培養することができる
リンパ球、例えばリンパブラストイドセルライン、特に
連続性のヒトＢ細胞系、例えばヒトＢセルラインRPMI88
66である。IgE-BFを生産するこのようなセルラインの培
養上清を直接に、場合によっては濃縮した後にこの発明
の精製工程に導くか、あるいはあらかじめ既知方法によ
る予備精製、例えば限外濾過、透析又はクロマトグラフ
ィーによる精製、例えばDEAE−セルロースもしくは架橋
デキストランゲル、例えばセファデックスによる精製に
かける。
IgE-BFを含有するヒト初乳調製物は次のようにして得ら
れる。健康な志願者からのヒト初乳を出産後最初の２日
間に集める。但し、この後に集めた乳も使用可能であ
る。初乳をプロテアーゼ阻害剤、例えばフェニルメチル
スルホニルフルオリド、ベンズアミジン、ε−アミノカ
プロン酸及び／又はEDTAで処理し、次に例えば超遠心分
離又は濾過により澄明にし、そして例えば塩酸により約
pH4に酸性化してカゼインを沈澱せしめる。例えば濾過
又は遠心分離によりガゼインを除去した後、澄明な調製
物を緩衝液、例えば2M Tris緩衝液により中和し、そし
て好ましくは段階的に濾過系に通して50KD以上の大分子
を除去する。例えば、第１フィルターの孔は約0.45μｍ
の直径を有し、そしてその濾液をメンブランフィルタ
ー、例えば50KDの好ましいカット−オフ点を有するアミ
コンXM50フィルターに通す。濾過の後、調製物を蒸留水
に対して透析しそして凍結乾燥する。この初乳調製物を
好ましくはクロマトグラフ法によりさらに精製して約10
〜30KDの分子量を有するポリペピチドを集める。任意の
常用のクロマトグラフ法、例えばセファデックスＧ−75
のごときアガロースゲル上でのゲル濾過クロマトグラフ
ィーを使用することができる。例えば、初乳調製物を、
界面活性剤及び他の添加剤を含有する緩衝液中アガロー
スゲルカラムに適用し、そして分子量画分を集める。Ig
E-BFを含有する画分は約10〜30KDの分子量のポリペプチ
ドを含有する画分である。これらをプールし、場合によ
っては濃縮し、そして透析する。
れる。健康な志願者からのヒト初乳を出産後最初の２日
間に集める。但し、この後に集めた乳も使用可能であ
る。初乳をプロテアーゼ阻害剤、例えばフェニルメチル
スルホニルフルオリド、ベンズアミジン、ε−アミノカ
プロン酸及び／又はEDTAで処理し、次に例えば超遠心分
離又は濾過により澄明にし、そして例えば塩酸により約
pH4に酸性化してカゼインを沈澱せしめる。例えば濾過
又は遠心分離によりガゼインを除去した後、澄明な調製
物を緩衝液、例えば2M Tris緩衝液により中和し、そし
て好ましくは段階的に濾過系に通して50KD以上の大分子
を除去する。例えば、第１フィルターの孔は約0.45μｍ
の直径を有し、そしてその濾液をメンブランフィルタ
ー、例えば50KDの好ましいカット−オフ点を有するアミ
コンXM50フィルターに通す。濾過の後、調製物を蒸留水
に対して透析しそして凍結乾燥する。この初乳調製物を
好ましくはクロマトグラフ法によりさらに精製して約10
〜30KDの分子量を有するポリペピチドを集める。任意の
常用のクロマトグラフ法、例えばセファデックスＧ−75
のごときアガロースゲル上でのゲル濾過クロマトグラフ
ィーを使用することができる。例えば、初乳調製物を、
界面活性剤及び他の添加剤を含有する緩衝液中アガロー
スゲルカラムに適用し、そして分子量画分を集める。Ig
E-BFを含有する画分は約10〜30KDの分子量のポリペプチ
ドを含有する画分である。これらをプールし、場合によ
っては濃縮し、そして透析する。
FcεＲに対して特異的な（そしてIgE-BFと交差反応す
る）モノクローナル抗体とIgE-BFを構成する蛋白質上の
抗原決定基との間の結合相互作用に基いて、IgE-BFを他
の蛋白質及び外来性物質から分離する。この目的のた
め、IgE-BFを含有する溶液を前記モノクローナル抗体が
結合されている担体材料と、イムノアフィニティークロ
マトグラフィーとして知られている方法により接触せし
める。この目的のため、無機又は無機の適当な担体材
料、例えば珪酸塩、架橋されたアガロース、デキストラ
ン、又は適切に官能化された形のポリアクリルアミド
に、場合によってはこれらを活性化した後、それ自体既
知の方法により後記するこの発明のモノクローナル抗体
又はその誘導体を負荷する。例えば、活性化されたエス
テル官能基、例えばＮ−ヒドロキシサクシンイミドエス
テル基を含有する担体材料を水性緩衝液中に懸濁し、そ
して次に未結合モノクローナル抗体を洗浄除去し、そし
て担体材料のカップリングしていない反応性部位を例え
ばエタノールアミンのごとき第一アミンによりブロック
する。担体材料を適当な水性溶剤、例えば塩溶液、例え
ばNaCl溶液、又は緩衝液、例えばリン酸緩衝化NaCl溶
液、NaHCO3溶液又は３−（Ｎ−モリホリノ）−プロパン
スルホン酸溶液中に懸濁し、そしてIgE-BFを含有する溶
液と接触せしめる。例えばクロマトグラフィーカラムに
注入し、そしてIgE-BFを含有する溶液を所望により加圧
下でポンプにより導入し、あるいは重力により流過せし
める。未結合蛋白質及び他の不純物を、水性溶液、例え
ばおよそpH5〜９の緩衝液及び／又は塩溶液、例えばNaC
l溶液（これらは場合によっては界面活性剤、例えばポ
リエチレン−ソルビタン樹脂酸エステルを含有する）に
より洗浄除去する。担体上の抗体に結合したIgE-BFを適
当な水性溶液、例えばおよそpH2〜５の緩衝液、例えば
グリシン緩衝液により、あるいは異る組成又は塩溶液、
例えば濃NH4SCN溶液のpHグラジエントにより溶出する。
得られる精製されたIgE-BFを含有する溶液を場合によっ
て中和し、そして精製されたIgE-BFを溶液からそれ自体
既知の方法に従って、例えばセファデックス上でのクロ
マトグラフィー、電気透析、等電点フォーカシング、電
気泳動濃縮及び／又は真空濃縮により単離する。
る）モノクローナル抗体とIgE-BFを構成する蛋白質上の
抗原決定基との間の結合相互作用に基いて、IgE-BFを他
の蛋白質及び外来性物質から分離する。この目的のた
め、IgE-BFを含有する溶液を前記モノクローナル抗体が
結合されている担体材料と、イムノアフィニティークロ
マトグラフィーとして知られている方法により接触せし
める。この目的のため、無機又は無機の適当な担体材
料、例えば珪酸塩、架橋されたアガロース、デキストラ
ン、又は適切に官能化された形のポリアクリルアミド
に、場合によってはこれらを活性化した後、それ自体既
知の方法により後記するこの発明のモノクローナル抗体
又はその誘導体を負荷する。例えば、活性化されたエス
テル官能基、例えばＮ−ヒドロキシサクシンイミドエス
テル基を含有する担体材料を水性緩衝液中に懸濁し、そ
して次に未結合モノクローナル抗体を洗浄除去し、そし
て担体材料のカップリングしていない反応性部位を例え
ばエタノールアミンのごとき第一アミンによりブロック
する。担体材料を適当な水性溶剤、例えば塩溶液、例え
ばNaCl溶液、又は緩衝液、例えばリン酸緩衝化NaCl溶
液、NaHCO3溶液又は３−（Ｎ−モリホリノ）−プロパン
スルホン酸溶液中に懸濁し、そしてIgE-BFを含有する溶
液と接触せしめる。例えばクロマトグラフィーカラムに
注入し、そしてIgE-BFを含有する溶液を所望により加圧
下でポンプにより導入し、あるいは重力により流過せし
める。未結合蛋白質及び他の不純物を、水性溶液、例え
ばおよそpH5〜９の緩衝液及び／又は塩溶液、例えばNaC
l溶液（これらは場合によっては界面活性剤、例えばポ
リエチレン−ソルビタン樹脂酸エステルを含有する）に
より洗浄除去する。担体上の抗体に結合したIgE-BFを適
当な水性溶液、例えばおよそpH2〜５の緩衝液、例えば
グリシン緩衝液により、あるいは異る組成又は塩溶液、
例えば濃NH4SCN溶液のpHグラジエントにより溶出する。
得られる精製されたIgE-BFを含有する溶液を場合によっ
て中和し、そして精製されたIgE-BFを溶液からそれ自体
既知の方法に従って、例えばセファデックス上でのクロ
マトグラフィー、電気透析、等電点フォーカシング、電
気泳動濃縮及び／又は真空濃縮により単離する。
イムノアフィニティークロマトグラフィーにおいて使用
すべきモノクローナル抗体の選択は精製すべきIgE-BFの
種類及び由来に依存する。例えば、Ｂ細胞上清からのIg
E-BFは好ましくは207.25A.4.4/30又は207.25A.4.4/45と
称するモノクローナル抗体により精製し、他方初乳由来
のIgE-BFは好ましくは208.25D.2/94及び／又は、207.25
A.4.4/30と称するモノクローナル抗体により精製する。
すべきモノクローナル抗体の選択は精製すべきIgE-BFの
種類及び由来に依存する。例えば、Ｂ細胞上清からのIg
E-BFは好ましくは207.25A.4.4/30又は207.25A.4.4/45と
称するモノクローナル抗体により精製し、他方初乳由来
のIgE-BFは好ましくは208.25D.2/94及び／又は、207.25
A.4.4/30と称するモノクローナル抗体により精製する。
IgE-BFを単離するための他の任意の方法がこの発明に含
まれることを理解すべきである。
まれることを理解すべきである。
所望により、イムノアフィニティークロマトグラフィー
において得られるヒトIgE-BFをさらに精製し、そして例
えばイオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマト
グラフィー、調製用逆相もしくは疎水性相互作用高速液
体クロマトグラフィー（HPLC）又は関連するクロマトグ
ラフ法、調製用ポリアクリルアミドゲル電気泳動等、あ
るいはこれらの精製及び分離段階の組合わせにより、そ
の個々の場合によってはグリコシル化されている蛋白質
に分離する。
において得られるヒトIgE-BFをさらに精製し、そして例
えばイオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマト
グラフィー、調製用逆相もしくは疎水性相互作用高速液
体クロマトグラフィー（HPLC）又は関連するクロマトグ
ラフ法、調製用ポリアクリルアミドゲル電気泳動等、あ
るいはこれらの精製及び分離段階の組合わせにより、そ
の個々の場合によってはグリコシル化されている蛋白質
に分離する。
特に、イムノアフィニティークロマトグラフィーにより
得られたヒトIgE-BFを、弱塩基性イオン交換体、例えば
ジエチルアミノエチル（DEAE）置換されたセルロース又
はアガロース上でのイオン交換クロマトグラフィーによ
りさらに精製し、場合によっては次にモノクローナル抗
体を用いるイムノアフィニティークロマトグラフィーに
よりさらに精製する。弱塩基性陰イオン交換体を有する
イオン交換クロマトグラフィー材料を適当な水性緩衝
液、例えはpH6〜９の緩衝液、例えばTris緩衝液又はリ
ン酸緩衝液中で平衡化し、次にヒトIgE-BFと接触せしめ
る。好ましくは、クロマトグラフィーはカラム中で行
い、そしてヒトIgE-BFの溶液をポンプによりイオン交換
材料中に通す。未結合蛋白質及び不純物を緩衝液により
カラムから洗浄除去した後、目的とする場合によっては
グリコシル化されているペピチドを増加する塩濃度によ
り、例えば増加する量の塩化ナトリウムを含有するTris
緩衝液により溶出する。イオン交換クロマトグラフィー
はHPLCカラム上でも行うことができることを理解すべき
である。
得られたヒトIgE-BFを、弱塩基性イオン交換体、例えば
ジエチルアミノエチル（DEAE）置換されたセルロース又
はアガロース上でのイオン交換クロマトグラフィーによ
りさらに精製し、場合によっては次にモノクローナル抗
体を用いるイムノアフィニティークロマトグラフィーに
よりさらに精製する。弱塩基性陰イオン交換体を有する
イオン交換クロマトグラフィー材料を適当な水性緩衝
液、例えはpH6〜９の緩衝液、例えばTris緩衝液又はリ
ン酸緩衝液中で平衡化し、次にヒトIgE-BFと接触せしめ
る。好ましくは、クロマトグラフィーはカラム中で行
い、そしてヒトIgE-BFの溶液をポンプによりイオン交換
材料中に通す。未結合蛋白質及び不純物を緩衝液により
カラムから洗浄除去した後、目的とする場合によっては
グリコシル化されているペピチドを増加する塩濃度によ
り、例えば増加する量の塩化ナトリウムを含有するTris
緩衝液により溶出する。イオン交換クロマトグラフィー
はHPLCカラム上でも行うことができることを理解すべき
である。
同様に、ヒトIgE-BFを調製用逆相HPLCにより精製するの
が好ましい。このような精製及び個々の場合によっては
グリコシル化されている蛋白質への分離は、疎水性基、
例えば炭素原子数２〜20個のアルキル基又はフェニル基
を担支するシリカを基礎とする担体材料上で行う。低級
アルキル基、例えばｎ−ブチル基を担持するシリカを基
礎とする担体材料が好ましい。ヒトIgE-BFの溶液を逆相
HPLCカラム上に注入し、そして増加する量の極性水混和
性有機溶剤、例えばアセトニトリル、低級アルコール、
例えばメタクリレート、エタノール又はプロパノール、
テトラヒドロフラン等、好ましくはアセトニトリルを含
有する水性酸性溶液、例えばトリフルオロ酢酸水溶液中
で処理する。
が好ましい。このような精製及び個々の場合によっては
グリコシル化されている蛋白質への分離は、疎水性基、
例えば炭素原子数２〜20個のアルキル基又はフェニル基
を担支するシリカを基礎とする担体材料上で行う。低級
アルキル基、例えばｎ−ブチル基を担持するシリカを基
礎とする担体材料が好ましい。ヒトIgE-BFの溶液を逆相
HPLCカラム上に注入し、そして増加する量の極性水混和
性有機溶剤、例えばアセトニトリル、低級アルコール、
例えばメタクリレート、エタノール又はプロパノール、
テトラヒドロフラン等、好ましくはアセトニトリルを含
有する水性酸性溶液、例えばトリフルオロ酢酸水溶液中
で処理する。
個々の場合によってはグリコシル化されている蛋白質は
好ましくは調製用ドデシル硫酸ナトリウム（SDS）ポリ
アクリルアミドゲル電気泳動により得る。グリセリン及
びSDSを含有する適当な緩衝液、例えばTris緩衝液中ヒ
トIgE-BFの溶液を調製し、そして10〜15％、好ましくは
12％のアクリルアミド及び0.5％まで、例えば約0.3％の
ビス−アクリルアミドを含有するポリアクリルアミドゲ
ルに適用する。ゲル電気泳動は通常の方法で分子量マー
カーと共に行う。均一な分子量画分をゲルから溶出し、
そして例えばイオン交換クロマトグラフィー、電気泳動
濃縮及び／又は真空濃縮により純粋な形で単離する。
好ましくは調製用ドデシル硫酸ナトリウム（SDS）ポリ
アクリルアミドゲル電気泳動により得る。グリセリン及
びSDSを含有する適当な緩衝液、例えばTris緩衝液中ヒ
トIgE-BFの溶液を調製し、そして10〜15％、好ましくは
12％のアクリルアミド及び0.5％まで、例えば約0.3％の
ビス−アクリルアミドを含有するポリアクリルアミドゲ
ルに適用する。ゲル電気泳動は通常の方法で分子量マー
カーと共に行う。均一な分子量画分をゲルから溶出し、
そして例えばイオン交換クロマトグラフィー、電気泳動
濃縮及び／又は真空濃縮により純粋な形で単離する。
適当な塩及び／又は緩衝液及び溶剤混合物中での透析、
溶解及び再沈澱の通常の方法が分離法に含まれる場合が
あることを理解すべきである。
溶解及び再沈澱の通常の方法が分離法に含まれる場合が
あることを理解すべきである。
IgE-BF又は個々のグリコシル化されている蛋白質はさら
に、グリコシル結合の部分的又は全体的開裂により加工
してこの発明のより少なくグリコシル化された蛋白質又
はグリコシル化されていない蛋白質を生じさせることが
できる。例えば、この発明の蛋白質をグリコシド結合を
開裂せしめる酵素、例えばＮ−グリカナーゼ、ニューラ
ミニダーゼ及び／又はＯ−グリコシダーゼにより、適当
な緩衝液、例えば場合によっては添加物、例えば活剤、
例えばドデシル硫酸ナトリウム、トウィーン又はNP-4
0、錯化剤、例えばEDTA、塩、例えばカルシウム塩、還
元剤、例えばβ−メルカプトエタノール等を含有するリ
ン酸緩衝液又はTris緩衝液中で処理する。得られる反応
生成物を個々の場合によってはグリコシル化されている
蛋白質又はIgE-BF断片について前に記載したのと同様に
して処理する。
に、グリコシル結合の部分的又は全体的開裂により加工
してこの発明のより少なくグリコシル化された蛋白質又
はグリコシル化されていない蛋白質を生じさせることが
できる。例えば、この発明の蛋白質をグリコシド結合を
開裂せしめる酵素、例えばＮ−グリカナーゼ、ニューラ
ミニダーゼ及び／又はＯ−グリコシダーゼにより、適当
な緩衝液、例えば場合によっては添加物、例えば活剤、
例えばドデシル硫酸ナトリウム、トウィーン又はNP-4
0、錯化剤、例えばEDTA、塩、例えばカルシウム塩、還
元剤、例えばβ−メルカプトエタノール等を含有するリ
ン酸緩衝液又はTris緩衝液中で処理する。得られる反応
生成物を個々の場合によってはグリコシル化されている
蛋白質又はIgE-BF断片について前に記載したのと同様に
して処理する。
この発明のIgE-BFの断片及び個々の場合によってはグリ
コシル化されている蛋白質の断片は、IgE-BF含有溶液の
又は個々の蛋白質のプロテアーゼ処理により得られる。
例えば、初乳又はIgE-BF含有細胞上清にプロテアーゼ阻
害剤を加えない場合、これらの溶液中に本来的に存在す
るプロテアーゼがIgE-BF及びその個々の蛋白質を開裂せ
しめるであろう。そうでなければ、IgE-BFを含有する容
液又はその個々の蛋白質を含有する溶液にプロテアー
ゼ、例えばパパイン又はトリプシンを意図的に添加する
ことができる。
コシル化されている蛋白質の断片は、IgE-BF含有溶液の
又は個々の蛋白質のプロテアーゼ処理により得られる。
例えば、初乳又はIgE-BF含有細胞上清にプロテアーゼ阻
害剤を加えない場合、これらの溶液中に本来的に存在す
るプロテアーゼがIgE-BF及びその個々の蛋白質を開裂せ
しめるであろう。そうでなければ、IgE-BFを含有する容
液又はその個々の蛋白質を含有する溶液にプロテアー
ゼ、例えばパパイン又はトリプシンを意図的に添加する
ことができる。
IgE-BF断片は、IgE-BF及び／又は個々の場合によっては
グリコシル化されている蛋白質について前に記載したよ
うにして、例えば限外濾過、ゲル濾過クロマトグラフィ
ー、免疫クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラ
フィー、調製用逆相HPLC、及び／又は調製用SDSポリア
クリルアミドゲル電気泳動により単離し又は精製する。
グリコシル化されている蛋白質について前に記載したよ
うにして、例えば限外濾過、ゲル濾過クロマトグラフィ
ー、免疫クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラ
フィー、調製用逆相HPLC、及び／又は調製用SDSポリア
クリルアミドゲル電気泳動により単離し又は精製する。
単離されたIgE-BF、その個々の蛋白質及び／又はその断
片のIgE結合及びIgE合成抑制活性は、それ自体既知の方
法により、例えばロゼット阻害アッセイ、抗−IgE抗体
へのIgEの結合のブロッキング、アフィニティークロマ
トグラフィー実験等により決定することができる。IgE
−及びlgG−がカップリングされたアガロースゲル上で
の吸着及び溶出実験は、ロゼット阻害活性及び抗−IgE
抗体へのIgEの結合のブロッキングが確かにIgEを結合す
る因子に基ずくことを示す特異性対照として採用するこ
とができる。
片のIgE結合及びIgE合成抑制活性は、それ自体既知の方
法により、例えばロゼット阻害アッセイ、抗−IgE抗体
へのIgEの結合のブロッキング、アフィニティークロマ
トグラフィー実験等により決定することができる。IgE
−及びlgG−がカップリングされたアガロースゲル上で
の吸着及び溶出実験は、ロゼット阻害活性及び抗−IgE
抗体へのIgEの結合のブロッキングが確かにIgEを結合す
る因子に基ずくことを示す特異性対照として採用するこ
とができる。
この発明はまた、IgE-BFと交差反応する、IgEのための
リンパ球細胞リセプター（FcεＲ）に対する新規なモノ
クローナル抗体に関する。
リンパ球細胞リセプター（FcεＲ）に対する新規なモノ
クローナル抗体に関する。
この発明のモノクローナル抗体は、例えばFcεＲを発現
するRPMI8866細胞へのIgE−コートラテックス粒子の結
合を阻害するその能力により検出される。モノクローナ
ル抗体を含有する溶液と共にインキュベートし、次に蛍
光IgE−コートラテックス粒子と共にインキュベートし
た後に蛍光ラベルを担持する細胞を計数することにより
阻害の量が決定される。FcεＲへの蛍光IgE−コートラ
テックス粒子の結合の阻害はまた、FcεＲを発現するこ
とが知られている他のＢ細胞系を用いても示される。
するRPMI8866細胞へのIgE−コートラテックス粒子の結
合を阻害するその能力により検出される。モノクローナ
ル抗体を含有する溶液と共にインキュベートし、次に蛍
光IgE−コートラテックス粒子と共にインキュベートし
た後に蛍光ラベルを担持する細胞を計数することにより
阻害の量が決定される。FcεＲへの蛍光IgE−コートラ
テックス粒子の結合の阻害はまた、FcεＲを発現するこ
とが知られている他のＢ細胞系を用いても示される。
さらに、モノクローナル抗体はFcεＲを発現する細胞へ
結合するその能力によっても検出することができる。モ
ノクローナル抗体を含有する溶液と共にインキュベート
し、そして次にこの発明のモノクローナル抗体と結合す
るフルオレッセインと接合した第２抗体の溶液、例えば
フルオレッセインと接合したヤギ抗−マウス免疫グロブ
リン試薬の溶液と共にインキュベートした後に蛍光ラベ
ルを担持する細胞を計数することによって決定される。
結合するその能力によっても検出することができる。モ
ノクローナル抗体を含有する溶液と共にインキュベート
し、そして次にこの発明のモノクローナル抗体と結合す
るフルオレッセインと接合した第２抗体の溶液、例えば
フルオレッセインと接合したヤギ抗−マウス免疫グロブ
リン試薬の溶液と共にインキュベートした後に蛍光ラベ
ルを担持する細胞を計数することによって決定される。
発現されるFcεＲに向けられたモノクローナル抗体のセ
ルラインに対する特異性は次の観察により証明される。
ルラインに対する特異性は次の観察により証明される。
（１） 無傷のモノクローナル抗体分子及びそのＦ（a
b′）2断片が最初の免疫感作のために用いられたものと
は異る幾つかのFcεＲ発現セルラインへのIgEの結合を
ブロックする。
b′）2断片が最初の免疫感作のために用いられたものと
は異る幾つかのFcεＲ発現セルラインへのIgEの結合を
ブロックする。
（２） モノクローナル抗体が試験されたすべてのFcε
Ｒ発現セルラインに直接結合するが、しかし幾つかのFc
εＲ−ネガティブセルラインには結合しない。
Ｒ発現セルラインに直接結合するが、しかし幾つかのFc
εＲ−ネガティブセルラインには結合しない。
（３） FcεＲ発現細胞へのモノクローナル抗体の結合
がEgEにより選択的にブロックされるが、しかし他のク
ラスの免疫グロブリンによってはブロックされない。
がEgEにより選択的にブロックされるが、しかし他のク
ラスの免疫グロブリンによってはブロックされない。
（４） モノクローナル抗体は、正常ヒト末梢血単核細
胞上のIgGのリセプター（FcγＲ）へのIgGの結合に影響
を与えない。
胞上のIgGのリセプター（FcγＲ）へのIgGの結合に影響
を与えない。
FcεＲに対して特異的なモノクローナル抗体がIgE-BFと
交差反応することは、例えばRPMI8866細胞上のIgEリセ
プターへのモノクローナル抗体の結合をIgE-BFがブロッ
クする事実により示される。
交差反応することは、例えばRPMI8866細胞上のIgEリセ
プターへのモノクローナル抗体の結合をIgE-BFがブロッ
クする事実により示される。
IgE-BFと交差反応しそしてマウス／マウス−ハイブリド
ーマ細胞により生産される、FcεＲに対するモノクロー
ナル抗体が好ましい。この発明のこのような好ましいモ
ノクローナル抗体の例を第１表に挙げる。これらはアイ
ソタイプIgG1又はIgG2bに属する。クローンNo.208.25A.
4.3/135,207.25A.4.4/30,207.25A.4.4/45,208.25D.2.1/
176、及び208.25D.2/94により生産されるモノクローナ
ル抗体が好ましい。
ーマ細胞により生産される、FcεＲに対するモノクロー
ナル抗体が好ましい。この発明のこのような好ましいモ
ノクローナル抗体の例を第１表に挙げる。これらはアイ
ソタイプIgG1又はIgG2bに属する。クローンNo.208.25A.
4.3/135,207.25A.4.4/30,207.25A.4.4/45,208.25D.2.1/
176、及び208.25D.2/94により生産されるモノクローナ
ル抗体が好ましい。
以下、第１表に示したこの発明のモノクローナル抗体を
“Mab−（番号）”として命名し、ここで番号はクロー
ンNo.の斜線の後の２個又は３個の数字に対応する。
“Mab−（番号）”として命名し、ここで番号はクロー
ンNo.の斜線の後の２個又は３個の数字に対応する。
この発明のモノクローナル抗体の誘導体は、例えば断
片、例えばFab,Fab′又はＦ（ab′）2断片であって、Ig
F-BFの抗原決定基に対してそれらの特異性を維持してい
るもの、例えば放射性ヨウ素（125I,131I）、炭素
（14C）、硫黄（35S）、トリチウム（3H）等によりラベ
ルされた放射性ラベルモノクローナル抗体、ビオチン又
はアビジンとのモノクローナル抗体接合体、あるいは酵
素とのモノクローナル抗体接合体、例えばホースラデイ
ッシュ・パーオキシダーゼ、アルカリ性ホスファター
ゼ、β−Ｄ−ガラクトシダーゼ、グルコースオキシダー
ゼ、グルコアミラーゼ、カルボニックアンヒドラーゼ、
アセチルコリンエステラーゼ、リゾチーム、マレートデ
ヒドロゲナーゼ、又はグルコース−６−ホスフェートデ
ヒドロゲナーゼとの接合体である。好ましい誘導体は
125Iでラベルされたモノクローナル抗体、抗体断片Ｆ
（ab′）2、及びモノクローナル抗体又はＦ（ab′）2断
片とビオチンとの接合体である。
片、例えばFab,Fab′又はＦ（ab′）2断片であって、Ig
F-BFの抗原決定基に対してそれらの特異性を維持してい
るもの、例えば放射性ヨウ素（125I,131I）、炭素
（14C）、硫黄（35S）、トリチウム（3H）等によりラベ
ルされた放射性ラベルモノクローナル抗体、ビオチン又
はアビジンとのモノクローナル抗体接合体、あるいは酵
素とのモノクローナル抗体接合体、例えばホースラデイ
ッシュ・パーオキシダーゼ、アルカリ性ホスファター
ゼ、β−Ｄ−ガラクトシダーゼ、グルコースオキシダー
ゼ、グルコアミラーゼ、カルボニックアンヒドラーゼ、
アセチルコリンエステラーゼ、リゾチーム、マレートデ
ヒドロゲナーゼ、又はグルコース−６−ホスフェートデ
ヒドロゲナーゼとの接合体である。好ましい誘導体は
125Iでラベルされたモノクローナル抗体、抗体断片Ｆ
（ab′）2、及びモノクローナル抗体又はＦ（ab′）2断
片とビオチンとの接合体である。
この発明のモノクローナル抗体及びその誘導体はそれ自
体既知の方法により得られ、この方法は、該モノクロー
ナル抗体を分泌するハイブリドーマ細胞を適当な環境中
で増殖せしめ、そしてその環境からモノクローナル抗体
を単離し、そして所望により得られたモノクローナル抗
体をその誘導体に転換することを特徴とする。特に、ハ
イブリドーマ細胞をインビトロ培養し、そして培養上清
からモノクローナル抗体を単離するか、あるいはハイブ
リドーマ細胞を適当な哺乳類動物中でインビボ増殖せし
め、そして該動物の体液からモノクローナル抗体を回収
し、そして所望により得られたモノクローナル抗体をそ
の誘導体に転換する。
体既知の方法により得られ、この方法は、該モノクロー
ナル抗体を分泌するハイブリドーマ細胞を適当な環境中
で増殖せしめ、そしてその環境からモノクローナル抗体
を単離し、そして所望により得られたモノクローナル抗
体をその誘導体に転換することを特徴とする。特に、ハ
イブリドーマ細胞をインビトロ培養し、そして培養上清
からモノクローナル抗体を単離するか、あるいはハイブ
リドーマ細胞を適当な哺乳類動物中でインビボ増殖せし
め、そして該動物の体液からモノクローナル抗体を回収
し、そして所望により得られたモノクローナル抗体をそ
の誘導体に転換する。
イソビトロ培養のための適当な培地は標準的な培地、例
えばドルベコの改良イーグル培地又はRPMI1640培地であ
って、場合によっては哺乳動物血清、例えばウシ胎児血
清、又は他の増殖支持補充剤、例えば２−アミノエタノ
ール、インシュリン、トランスフェリン、低密度リポ蛋
白質、オレイン酸等、及び微量元素を含有する。モノク
ローナル抗体の単離は、場合によっては濃縮された培養
上清中に含有される蛋白質を硫酸アンモニウム等によっ
て沈澱せしめ、次に免疫グロブリンを標準的クロマトグ
ラフ法、例えばゲル濾過、イオン交換クロマトグラフィ
ー、DEAEセルロース上でのクロマトグラフィー、又はイ
ムノアフィニティークロマトグラフィーにより精製す
る。
えばドルベコの改良イーグル培地又はRPMI1640培地であ
って、場合によっては哺乳動物血清、例えばウシ胎児血
清、又は他の増殖支持補充剤、例えば２−アミノエタノ
ール、インシュリン、トランスフェリン、低密度リポ蛋
白質、オレイン酸等、及び微量元素を含有する。モノク
ローナル抗体の単離は、場合によっては濃縮された培養
上清中に含有される蛋白質を硫酸アンモニウム等によっ
て沈澱せしめ、次に免疫グロブリンを標準的クロマトグ
ラフ法、例えばゲル濾過、イオン交換クロマトグラフィ
ー、DEAEセルロース上でのクロマトグラフィー、又はイ
ムノアフィニティークロマトグラフィーにより精製す
る。
インビボ生産は目的の抗体を大量に得るためのスケール
アップを可能にする。ハイブリドーマの大規模培養のた
めの技法は当業界において知られており、そして均一懸
濁培養、例えばエアーリフト反応器中もしくは連続攪拌
反応器中での培養、又は固定化されたもしくは捕捉され
た細胞培養、例えば中空繊維中、マイクロカプセル中、
アガロースミクロビーズ上もしくはセラミックカートリ
ッジ上での培養を含む。
アップを可能にする。ハイブリドーマの大規模培養のた
めの技法は当業界において知られており、そして均一懸
濁培養、例えばエアーリフト反応器中もしくは連続攪拌
反応器中での培養、又は固定化されたもしくは捕捉され
た細胞培養、例えば中空繊維中、マイクロカプセル中、
アガロースミクロビーズ上もしくはセラミックカートリ
ッジ上での培養を含む。
大量の目的とするモノクローナル抗体はまたハイブリド
ーマ細胞のインビボでの増殖によっても得ることができ
る。細胞クローンを同系哺乳類動物に注射し、こうして
抗体産生腫瘍を増殖せしめる。１〜３週間後、該動物の
体液から目的のモノクローナル抗体を回収する。例え
ば、Ba1b/cマウスに由来する。ハイブリドーマ細胞を場
合によってはプリスタンのごとき炭化水素により処理さ
れたBa1b/cマウスに腹腔内注射し、そして１〜２週間後
にこれらのマウスの腹水を集める。目的とするモノクロ
ーナル抗体を体液からそれ自体既知の方法により、例え
ば硫酸アンモニウム等によって蛋白質を沈澱せしめ、次
に標準的クロマトグラフ法、例えばゲル濾過、イオン交
換クロマトグラフィー、DEAEセルロース上でのクロマト
グラフィー、又はイムノアフィニティークロマトグラフ
ィーによって精製することにより単離する。
ーマ細胞のインビボでの増殖によっても得ることができ
る。細胞クローンを同系哺乳類動物に注射し、こうして
抗体産生腫瘍を増殖せしめる。１〜３週間後、該動物の
体液から目的のモノクローナル抗体を回収する。例え
ば、Ba1b/cマウスに由来する。ハイブリドーマ細胞を場
合によってはプリスタンのごとき炭化水素により処理さ
れたBa1b/cマウスに腹腔内注射し、そして１〜２週間後
にこれらのマウスの腹水を集める。目的とするモノクロ
ーナル抗体を体液からそれ自体既知の方法により、例え
ば硫酸アンモニウム等によって蛋白質を沈澱せしめ、次
に標準的クロマトグラフ法、例えばゲル濾過、イオン交
換クロマトグラフィー、DEAEセルロース上でのクロマト
グラフィー、又はイムノアフィニティークロマトグラフ
ィーによって精製することにより単離する。
IgE-BF抗原決定基に対するそれらの特異性を維持してい
るモノクローナル抗体の断片、例えばFab,Fab′又はＦ
（ab′）2は、インビボ又はインビトロ培養により得ら
れたモノクローナル抗体から、それ自体既知の方法によ
り、例えばペプシンもしくはパパインのごとき酵素によ
る消化及び／又は化学的還元によるジスルフィド結合の
開裂により得ることができる。
るモノクローナル抗体の断片、例えばFab,Fab′又はＦ
（ab′）2は、インビボ又はインビトロ培養により得ら
れたモノクローナル抗体から、それ自体既知の方法によ
り、例えばペプシンもしくはパパインのごとき酵素によ
る消化及び／又は化学的還元によるジスルフィド結合の
開裂により得ることができる。
放射性ヨウ素、例えば125Iによりラベルされたモノクロ
ーナル抗体はそれ自体既知の方法により、放射性ヨウ化
ナトリウム又はヨウ化カリウムと化学的酸化剤、例えば
次亜塩素酸ナトリウム、クロラミンＴ等又は酵素的酸化
剤、例えばラクトパーオキシダーゼもしくはグルコース
オキシダーゼ及びグルコースとを用いてモノクローナル
抗体をラベルすることにより調製される。放射性ラベル
されたこの発明のモノクローナル抗体はまた、インビト
ロ培養の培地に放射性ラベルさらた栄養を加えることに
より調製される。このようなラベルされた栄養は例えば
放射性炭素（14C）、トリチウム（3H）、硫黄（35S）等
を含有し、そして例えばＬ−（14C）−ロイシン、Ｌ−
（3H）−ロイシン、又はＬ−（35S）−メチオニンであ
る。
ーナル抗体はそれ自体既知の方法により、放射性ヨウ化
ナトリウム又はヨウ化カリウムと化学的酸化剤、例えば
次亜塩素酸ナトリウム、クロラミンＴ等又は酵素的酸化
剤、例えばラクトパーオキシダーゼもしくはグルコース
オキシダーゼ及びグルコースとを用いてモノクローナル
抗体をラベルすることにより調製される。放射性ラベル
されたこの発明のモノクローナル抗体はまた、インビト
ロ培養の培地に放射性ラベルさらた栄養を加えることに
より調製される。このようなラベルされた栄養は例えば
放射性炭素（14C）、トリチウム（3H）、硫黄（35S）等
を含有し、そして例えばＬ−（14C）−ロイシン、Ｌ−
（3H）−ロイシン、又はＬ−（35S）−メチオニンであ
る。
この発明のモノクローナル抗体の酵素接合体は、当業界
において知られている方法により、例えば前記のように
した調製されたモノクローナル抗体又はその断片を所望
の酵素と、カップリング剤、例えばグルタルアルデヒ
ド、過ヨウ素酸塩、N,N′−ｏ−フェニレンジマレイミ
ド、Ｎ−（ｍ−マレイミドベンゾイルオキシ）−サクシ
ンイミド、Ｎ−（３−（２′−ピリジルジチオ）−プロ
ピオノキシ）−サクシンイミド、Ｎ−エチル−Ｎ′−
（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド等の
存在下で反応せしめることにより調製される。モノクロ
ーナル抗体とアビジンとの接合体が同様にして得られ
る。ビオチンとの接合体は、例えば、この発明のモノク
ローナル抗体をビオチン−Ｎ−ヒドロキシサクシンイミ
ジルエステルと反応せしめることにより得られる。
において知られている方法により、例えば前記のように
した調製されたモノクローナル抗体又はその断片を所望
の酵素と、カップリング剤、例えばグルタルアルデヒ
ド、過ヨウ素酸塩、N,N′−ｏ−フェニレンジマレイミ
ド、Ｎ−（ｍ−マレイミドベンゾイルオキシ）−サクシ
ンイミド、Ｎ−（３−（２′−ピリジルジチオ）−プロ
ピオノキシ）−サクシンイミド、Ｎ−エチル−Ｎ′−
（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド等の
存在下で反応せしめることにより調製される。モノクロ
ーナル抗体とアビジンとの接合体が同様にして得られ
る。ビオチンとの接合体は、例えば、この発明のモノク
ローナル抗体をビオチン−Ｎ−ヒドロキシサクシンイミ
ジルエステルと反応せしめることにより得られる。
同様にして、モノクローナル抗体断片、例えばＦ（a
b′）2断片と前記の酵素又はビオチンとの接合体を調製
することができる。
b′）2断片と前記の酵素又はビオチンとの接合体を調製
することができる。
この発明はさらに、IgE-BFと交差反応する、IgEのため
のリンパ球細胞リセプター（FcεＲ）に対するモノクロ
ーナル抗体を分離することを特徴とするハイブリドーマ
セルラインに関する。
のリンパ球細胞リセプター（FcεＲ）に対するモノクロ
ーナル抗体を分離することを特徴とするハイブリドーマ
セルラインに関する。
特に、この発明は、骨髄腫細胞と、FcεＲを発現するリ
ンパ球により免疫感作された哺乳類動物のＢリンパ球と
のハイブリドであるセルラインに関する。好ましくは、
これらのセルラインはマウス骨髄腫細胞と、FcεＲを発
現するリンポブラストーマ細胞により免疫感作された同
系マウスのＢリンパ球とのハイブリドである。
ンパ球により免疫感作された哺乳類動物のＢリンパ球と
のハイブリドであるセルラインに関する。好ましくは、
これらのセルラインはマウス骨髄腫細胞と、FcεＲを発
現するリンポブラストーマ細胞により免疫感作された同
系マウスのＢリンパ球とのハイブリドである。
1985年２月２日に、パスツール研究所（パリ）のCollec
tion Nationale de Cultures de Microoganismesにそれ
ぞれNo.I−425及びＩ−420として寄託されている208.25
A.4.3/135及び208.25D.2.1/176と称するハイブリドーマ
セルライン、1985年５月29日に上記の寄託機関にそれぞ
れNo.I−451及びＩ−452として寄託されている207.25A.
4.4/30及び207.25A.4.4/45と称されるハイブリドーマセ
ルライン、並びに1985年10月１日に上記の寄託機関にN
o.I−486として寄託される208.25D.2/94と称するハイブ
リドーマセルラインが特に好ましい。これらのハイブリ
ドーマセルラインは、マウス骨髄腫セルラインNSI/1
と、生存8866細胞により免疫感作されたBalb/cマウスの
膵臓のＢリンパ球とのハイブリドである。これらは安定
なセルラインであり、そしてそれぞれMab-135、Mab-17
6、Mab-30、Mab-45、及びMab−94と称するモノクローナ
ル抗体を分泌する。セルラインは深冷凍結培養物中で維
持することができ、そして解凍及び再クローニングによ
り再活性化することができる。
tion Nationale de Cultures de Microoganismesにそれ
ぞれNo.I−425及びＩ−420として寄託されている208.25
A.4.3/135及び208.25D.2.1/176と称するハイブリドーマ
セルライン、1985年５月29日に上記の寄託機関にそれぞ
れNo.I−451及びＩ−452として寄託されている207.25A.
4.4/30及び207.25A.4.4/45と称されるハイブリドーマセ
ルライン、並びに1985年10月１日に上記の寄託機関にN
o.I−486として寄託される208.25D.2/94と称するハイブ
リドーマセルラインが特に好ましい。これらのハイブリ
ドーマセルラインは、マウス骨髄腫セルラインNSI/1
と、生存8866細胞により免疫感作されたBalb/cマウスの
膵臓のＢリンパ球とのハイブリドである。これらは安定
なセルラインであり、そしてそれぞれMab-135、Mab-17
6、Mab-30、Mab-45、及びMab−94と称するモノクローナ
ル抗体を分泌する。セルラインは深冷凍結培養物中で維
持することができ、そして解凍及び再クローニングによ
り再活性化することができる。
この発明はまた、FcεＲに結合しそしてIgE-BFと交差反
応するモノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマセ
ルラインの製造方法に関し、この方法は、適当な哺乳動
物をFcεＲを発現するリンパ球により免疫感作し、この
哺乳動物の抗体産生細胞を骨髄腫細胞と融合せしめ、融
合において得られたハイブリド細胞をクローン化し、そ
して所望の抗体を分泌する細胞クローンを選択すること
を特徴とする。
応するモノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマセ
ルラインの製造方法に関し、この方法は、適当な哺乳動
物をFcεＲを発現するリンパ球により免疫感作し、この
哺乳動物の抗体産生細胞を骨髄腫細胞と融合せしめ、融
合において得られたハイブリド細胞をクローン化し、そ
して所望の抗体を分泌する細胞クローンを選択すること
を特徴とする。
抗原として、FcεＲを発現する任意のリンパ球、さらに
は破壊された細胞又はFcεＲを含有する細胞壁材料又は
リセプターそれ自体を使用することができる。FcεＲを
発現するリンパ球はＢ細胞又はさらにＴ細胞であること
ができ、好ましくはエプスタイン−バールウイルスによ
り形質転換されたセルライン又はリンポブラストーマセ
ルラインである。ヒトＢ細胞の連続的セルラインである
RPMI8866細胞が抗原として最も好ましい。場合によって
は細胞を適当なマイトジエン、例えばコンカナバリンＡ
により、又は糖蛋白質合成調節化合物、例えばチュニカ
マイシンにより、抗原として使用する前に刺激する。
は破壊された細胞又はFcεＲを含有する細胞壁材料又は
リセプターそれ自体を使用することができる。FcεＲを
発現するリンパ球はＢ細胞又はさらにＴ細胞であること
ができ、好ましくはエプスタイン−バールウイルスによ
り形質転換されたセルライン又はリンポブラストーマセ
ルラインである。ヒトＢ細胞の連続的セルラインである
RPMI8866細胞が抗原として最も好ましい。場合によって
は細胞を適当なマイトジエン、例えばコンカナバリンＡ
により、又は糖蛋白質合成調節化合物、例えばチュニカ
マイシンにより、抗原として使用する前に刺激する。
免疫感作のために好ましい哺乳動物はマウス、特にBalb
/cマウスである。免疫感作に例えば、生存RPMI8866細胞
を３〜８回、非経腸的に、例えば腹腔内に及び／又は皮
下に、３〜５週間の間隔で、約107〜約108細胞の量で注
射することにより行う。
/cマウスである。免疫感作に例えば、生存RPMI8866細胞
を３〜８回、非経腸的に、例えば腹腔内に及び／又は皮
下に、３〜５週間の間隔で、約107〜約108細胞の量で注
射することにより行う。
最終免疫注射の後２〜５日目に採取した、免疫感作され
た哺乳動物の抗体産生細胞を、融合促進剤の存在下で適
当なセルラインの骨髄腫細胞と融合せしめる。幾つかの
適当な骨髄腫セルラインが当業界において知られてい
る。酵素ヒポキサンチングアニジンホスホリボシルトラ
ンスフェラーゼ（HGPRT）又は酵素チミジンキナーゼ（T
K）を欠き、従ってヒポキサンチン、アミノプテリン及
びチミジンを含有する選択培地（HAT培地）中で生存で
きないハイブリドーマセルラインが好ましい。HAT培地
中で生存せずそして免疫グロブリン又はその断片を分泌
しない骨髄腫細胞及び誘導されたセルライン、例えばセ
ルラインNSI/1−Ag4/1、X63-Ag8.653、又はSp2/0−Ag14
が特に好ましい。考慮される融合促進剤は例えばセンダ
イウイルスは他のパラミクソウイルスであって場合によ
ってはUV−不活性化された形のもの、カルシウムイオ
ン、界面活性リピド、例えばリソレシチン、又はポリエ
チレングリコールである。好ましくは、骨髄腫細胞を分
子量1000〜4000のポリエチレングリコール約30〜60％お
よび場合によっては約５〜15％のジメチルスルホキシド
を含有する溶液中で、免疫感作された哺乳動物由来の脾
細胞３〜４倍過剰量と融合せしめる。
た哺乳動物の抗体産生細胞を、融合促進剤の存在下で適
当なセルラインの骨髄腫細胞と融合せしめる。幾つかの
適当な骨髄腫セルラインが当業界において知られてい
る。酵素ヒポキサンチングアニジンホスホリボシルトラ
ンスフェラーゼ（HGPRT）又は酵素チミジンキナーゼ（T
K）を欠き、従ってヒポキサンチン、アミノプテリン及
びチミジンを含有する選択培地（HAT培地）中で生存で
きないハイブリドーマセルラインが好ましい。HAT培地
中で生存せずそして免疫グロブリン又はその断片を分泌
しない骨髄腫細胞及び誘導されたセルライン、例えばセ
ルラインNSI/1−Ag4/1、X63-Ag8.653、又はSp2/0−Ag14
が特に好ましい。考慮される融合促進剤は例えばセンダ
イウイルスは他のパラミクソウイルスであって場合によ
ってはUV−不活性化された形のもの、カルシウムイオ
ン、界面活性リピド、例えばリソレシチン、又はポリエ
チレングリコールである。好ましくは、骨髄腫細胞を分
子量1000〜4000のポリエチレングリコール約30〜60％お
よび場合によっては約５〜15％のジメチルスルホキシド
を含有する溶液中で、免疫感作された哺乳動物由来の脾
細胞３〜４倍過剰量と融合せしめる。
融合の後、細胞を再懸濁しそして選択HAT培地中で培養
する。これによってハイブリドーマ細胞のみが生存す
る。なぜなら、これらは骨髄腫細胞由来のインビトロで
生育そして複製する能力と、免疫感作された哺乳動物の
抗体産生脾臓細胞に由来する、HAT培地で生存するため
に必須のHGPRT又はTK遺伝子の欠失を併せ持つからであ
る。
する。これによってハイブリドーマ細胞のみが生存す
る。なぜなら、これらは骨髄腫細胞由来のインビトロで
生育そして複製する能力と、免疫感作された哺乳動物の
抗体産生脾臓細胞に由来する、HAT培地で生存するため
に必須のHGPRT又はTK遺伝子の欠失を併せ持つからであ
る。
ハイブリドーマ細胞の拡張のために適当な培地は標準的
培地、例えばダルベコの改良イーグル培地、最少必須培
地、RPMI1640培地等であって、これらには場合によって
は血清、例えば10〜15％のウシ胎児血清、アミノ酸、及
び抗生物質、例えばペニシリン及び／又はストレプトマ
イシンが補充されている。好ましくは、フィーダー細
胞、例えば正常マウス腹腔浸潤細胞、脾細胞、骨髄マク
ロファージ等を細胞増殖の最初に添加する。ハイブリド
ーマ細胞に対して正常な骨髄腫細胞がオーバーグローす
るのを防止するため、選択HAT培地を一定間隔で培地に
補充する。
培地、例えばダルベコの改良イーグル培地、最少必須培
地、RPMI1640培地等であって、これらには場合によって
は血清、例えば10〜15％のウシ胎児血清、アミノ酸、及
び抗生物質、例えばペニシリン及び／又はストレプトマ
イシンが補充されている。好ましくは、フィーダー細
胞、例えば正常マウス腹腔浸潤細胞、脾細胞、骨髄マク
ロファージ等を細胞増殖の最初に添加する。ハイブリド
ーマ細胞に対して正常な骨髄腫細胞がオーバーグローす
るのを防止するため、選択HAT培地を一定間隔で培地に
補充する。
ハイブリドーマ細胞培養上清を目的とするモノクローナ
ル抗体について、次のアッセイ法によりスクリーニング
する。このアッセイ法においては、培養上清により前処
理されるRPMI8866細胞へのIgE−コートラテックス粒子
の結合の阻害を測定する。陽性のハイブリドーマ細胞を
例えば限界稀釈法により好ましくは２回以上クローニン
グする。クローン化されたセルラインを常法に従って凍
結することができる。
ル抗体について、次のアッセイ法によりスクリーニング
する。このアッセイ法においては、培養上清により前処
理されるRPMI8866細胞へのIgE−コートラテックス粒子
の結合の阻害を測定する。陽性のハイブリドーマ細胞を
例えば限界稀釈法により好ましくは２回以上クローニン
グする。クローン化されたセルラインを常法に従って凍
結することができる。
この発明のモノクローナル抗体及びその誘導体は、リン
パ球又は初乳由来のIgE-BF、個々の場合によってはグリ
コシル化されている蛋白質及びそれらの断片の定性的及
び定量的測定及び／又はリンパ球もしくは初乳からのIg
E-BFの精製のために有用である。
パ球又は初乳由来のIgE-BF、個々の場合によってはグリ
コシル化されている蛋白質及びそれらの断片の定性的及
び定量的測定及び／又はリンパ球もしくは初乳からのIg
E-BFの精製のために有用である。
例えば、モノクローナル抗体又はその誘導体、例えば酵
素接合体、ビオチン接合体又は放射性誘導体は、例えば
FcεＲ又はIgE-BF上の抗原決定基とモノクローナル抗体
との間の結合相互作用に基く既知の任意のイムノアッセ
イにおいて用いることができる。これらのアッセイ法の
例として、ラジオイムノアッセイ、酵素イムノアッセ
イ、イムノフルオレッセンス、ラテックス凝集及び血球
凝集が挙げられる。リンパ球により生産され又は初乳か
ら単離されたIgE-BFはこの発明のモノクローナル抗体の
助けによりイムノアフィニティークロマトグラフィーに
より精製することができる。
素接合体、ビオチン接合体又は放射性誘導体は、例えば
FcεＲ又はIgE-BF上の抗原決定基とモノクローナル抗体
との間の結合相互作用に基く既知の任意のイムノアッセ
イにおいて用いることができる。これらのアッセイ法の
例として、ラジオイムノアッセイ、酵素イムノアッセ
イ、イムノフルオレッセンス、ラテックス凝集及び血球
凝集が挙げられる。リンパ球により生産され又は初乳か
ら単離されたIgE-BFはこの発明のモノクローナル抗体の
助けによりイムノアフィニティークロマトグラフィーに
より精製することができる。
この発明は特に、この発明のモノクローナル抗体及び／
又は放射性ラベルされたその誘導体を用いる。IgE-BFの
測定のためのラジオイムノアッセイ（RIA）に関する。R
IAの任意の既知の変法、例えば均一相でのRIA、固相RIA
又は不均一RIA、ジングルRIA又はダブル（サンドイッ
チ）RIA〔IgE-BFの直接又は間接（競争的）測定〕を用
いることができる。
又は放射性ラベルされたその誘導体を用いる。IgE-BFの
測定のためのラジオイムノアッセイ（RIA）に関する。R
IAの任意の既知の変法、例えば均一相でのRIA、固相RIA
又は不均一RIA、ジングルRIA又はダブル（サンドイッ
チ）RIA〔IgE-BFの直接又は間接（競争的）測定〕を用
いることができる。
適当な担体、例えばポリスチレン、ポリプロピレンもし
くはポリ塩化ビニルのタイタープレートもしくは試験管
のプラスチック表面、ガラスもしくはプラスチックビー
ズ、濾紙、又はデキストラン、ニトロセルロースもしく
は酢酸セルロースのシート等をこの発明のモノクローナ
ル抗体を用いて単純吸着により、又は例えばグルタルア
ルデヒドもしくは臭化シアンによる担体の活性化の後に
コートし、次にIgE-BF含有試験溶液又は標準溶液、及び
IgE-BFの異るエピトープを認識するこの発明の第２モノ
クローナル抗体の125Iラベル化誘導体とインキュベート
する。同じモノクローナル抗体の125Iラベル化誘導体を
用いることは好ましくはないが可能である。
くはポリ塩化ビニルのタイタープレートもしくは試験管
のプラスチック表面、ガラスもしくはプラスチックビー
ズ、濾紙、又はデキストラン、ニトロセルロースもしく
は酢酸セルロースのシート等をこの発明のモノクローナ
ル抗体を用いて単純吸着により、又は例えばグルタルア
ルデヒドもしくは臭化シアンによる担体の活性化の後に
コートし、次にIgE-BF含有試験溶液又は標準溶液、及び
IgE-BFの異るエピトープを認識するこの発明の第２モノ
クローナル抗体の125Iラベル化誘導体とインキュベート
する。同じモノクローナル抗体の125Iラベル化誘導体を
用いることは好ましくはないが可能である。
この発明はさらに、この発明のモノクローナル抗体及び
／又はそれと酵素又はビオチンとの接合体、例えばモノ
クローナル抗体断片とビオチンと接合体を用いる。IgE-
BFの測定のための酵素イムノアッセイに関する。例え
ば、RIAについて上記した担体をこの発明のモノクロー
ナル抗体によりコートし、IgE-BFを含有する試験溶液又
は標準溶液と共にインキュベートし、そして次に異なる
モノクローナル抗体の代りに、アビジン酵合アモクロー
ナル抗体又は抗体断片と適当な酵素との接合体の溶液と
共にインキュベートし、次に結合した酵素接合抗体の量
を可視化する酵素基質の溶液と共にインキュベートす
る。酵素接合モノクローナル抗体の代りに、ビオチン接
合モノクローナル抗体又は抗体断片をアビジン酵素接合
体と共に使用することができる。
／又はそれと酵素又はビオチンとの接合体、例えばモノ
クローナル抗体断片とビオチンと接合体を用いる。IgE-
BFの測定のための酵素イムノアッセイに関する。例え
ば、RIAについて上記した担体をこの発明のモノクロー
ナル抗体によりコートし、IgE-BFを含有する試験溶液又
は標準溶液と共にインキュベートし、そして次に異なる
モノクローナル抗体の代りに、アビジン酵合アモクロー
ナル抗体又は抗体断片と適当な酵素との接合体の溶液と
共にインキュベートし、次に結合した酵素接合抗体の量
を可視化する酵素基質の溶液と共にインキュベートす
る。酵素接合モノクローナル抗体の代りに、ビオチン接
合モノクローナル抗体又は抗体断片をアビジン酵素接合
体と共に使用することができる。
この発明の酵素イムノアッセイにおける好ましい酵素
は、酵素基質例えば５−アミノサリチル酸、ｏ−フェニ
レンジアミン、3,3′−ジメトキシベンジジン、3,3′、
5,5′−テトラメチルベンジジン、2,2′−アジノ−ビス
−（３−エチルベンゾチアゾリン−６−スルホン酸）又
はこれらに類似するものと過酸化水素とにより発色し得
るホースラデイッシュパーオキシダーゼ、及び例えば酵
素基質ｐ−ニトロフェニルホスフェートからｎ−ニトロ
フェノールを放出するアルカリ性オスファターゼであ
る。
は、酵素基質例えば５−アミノサリチル酸、ｏ−フェニ
レンジアミン、3,3′−ジメトキシベンジジン、3,3′、
5,5′−テトラメチルベンジジン、2,2′−アジノ−ビス
−（３−エチルベンゾチアゾリン−６−スルホン酸）又
はこれらに類似するものと過酸化水素とにより発色し得
るホースラデイッシュパーオキシダーゼ、及び例えば酵
素基質ｐ−ニトロフェニルホスフェートからｎ−ニトロ
フェノールを放出するアルカリ性オスファターゼであ
る。
RIAについて前記したような適切な担体をこの発明のモ
ノクローナル抗体でコートし、次にIgE-BFを含有する試
験溶液又は標準溶液、及びこの発明のモノクローナル抗
体又はその断片とビオチンとの接合体の溶液と共にイン
キュベートし、次にアビジン−酵素接合体、例えばアビ
ジン−ホースラデイッシュパーオキシダーゼ接合体の溶
液、及び酵素基質の溶液と共にインキュベートすること
から成る酵素イムノアッセイが特に好ましい。
ノクローナル抗体でコートし、次にIgE-BFを含有する試
験溶液又は標準溶液、及びこの発明のモノクローナル抗
体又はその断片とビオチンとの接合体の溶液と共にイン
キュベートし、次にアビジン−酵素接合体、例えばアビ
ジン−ホースラデイッシュパーオキシダーゼ接合体の溶
液、及び酵素基質の溶液と共にインキュベートすること
から成る酵素イムノアッセイが特に好ましい。
FcεＲに対するモノクローナル抗体及びその誘導体の、
IgE-BFの定性的及び定量的測定のためのこの発明に従う
使用はまた、それ自体既知の他のイムノアッセイ、例え
ば、蛍光物質との抗体接合体又は抗原接合体を用いるイ
ムノフルオレッセンス試験、抗原又は抗体がコートされ
たラテックス粒子を用いるラテックス凝集、あるいは抗
体又は抗原がコートされた赤血球を用いる血球凝集試験
等を包含する。
IgE-BFの定性的及び定量的測定のためのこの発明に従う
使用はまた、それ自体既知の他のイムノアッセイ、例え
ば、蛍光物質との抗体接合体又は抗原接合体を用いるイ
ムノフルオレッセンス試験、抗原又は抗体がコートされ
たラテックス粒子を用いるラテックス凝集、あるいは抗
体又は抗原がコートされた赤血球を用いる血球凝集試験
等を包含する。
この発明はさらに、IgE-BF、個々の場合によってはグリ
コシル化されている蛋白質及びその断片の定性的及び定
量的測定のための試験キットに関し、このテットはIgE-
BFと交差反応するFcεＲに対するモノクローナル抗体及
び／又はその誘導体、並びに場合によっては付属物を含
むことを特徴とする。
コシル化されている蛋白質及びその断片の定性的及び定
量的測定のための試験キットに関し、このテットはIgE-
BFと交差反応するFcεＲに対するモノクローナル抗体及
び／又はその誘導体、並びに場合によっては付属物を含
むことを特徴とする。
ラジオイムノアッセイのためのこの発明のキットは、例
えば、前に定義したような適切な担体、この発明のモノ
クローナル抗体の場合によっては凍結乾燥された物又は
濃縮された溶液、この発明の125Iラベルされた同一の又
は異るモノクローナル抗体の場合によっては凍結乾燥さ
れた物又は濃縮された溶液、IgE-BF及び／又は個々の場
合によってはグリコシル化されている蛋白質の標準溶
液、緩衝液、非特異的吸着及び凝集の形成を防止するた
めの洗剤、ピペット、反応容器、換算曲線等を含む。
えば、前に定義したような適切な担体、この発明のモノ
クローナル抗体の場合によっては凍結乾燥された物又は
濃縮された溶液、この発明の125Iラベルされた同一の又
は異るモノクローナル抗体の場合によっては凍結乾燥さ
れた物又は濃縮された溶液、IgE-BF及び／又は個々の場
合によってはグリコシル化されている蛋白質の標準溶
液、緩衝液、非特異的吸着及び凝集の形成を防止するた
めの洗剤、ピペット、反応容器、換算曲線等を含む。
酵素イムノアッセイのためのこの発明の試験キットは、
例えば、前に定義したような適当な担体、この発明のモ
ノクローナル抗体の場合によっては凍結乾燥されたもの
又は濃縮された溶液、この発明のモノクローナル抗体又
は抗体断片と酵素又はビオチンとの接合体の場合によっ
ては凍結乾燥された物又は濃縮された溶液、IgE-BF及び
／又は個々の場合によってはグリコシル化されている蛋
白質の標準溶液、緩衝液、固体又は溶解した形の酵素基
質、非特異的吸着及び凝集の形成を防止するための洗
剤、ピペット、反応容器、換算曲線等を含む。
例えば、前に定義したような適当な担体、この発明のモ
ノクローナル抗体の場合によっては凍結乾燥されたもの
又は濃縮された溶液、この発明のモノクローナル抗体又
は抗体断片と酵素又はビオチンとの接合体の場合によっ
ては凍結乾燥された物又は濃縮された溶液、IgE-BF及び
／又は個々の場合によってはグリコシル化されている蛋
白質の標準溶液、緩衝液、固体又は溶解した形の酵素基
質、非特異的吸着及び凝集の形成を防止するための洗
剤、ピペット、反応容器、換算曲線等を含む。
この発明はさらに、あらゆる種類の抗原、例えば花粉、
ネコのフケ、イエダニ等に対してアレルギーを有する患
者におけるアレルギー状態の治療又は予防のための、精
製されたIgE-BF、個々の場合によってはグリコシル化さ
れている蛋白質及びそれらの断片の使用に関する。母乳
が供与されていない特に高い危険を有する新生児を含む
危険期における高い危険を有する患者の治療が特に重要
であろう。この発明のIgE-BFは、経腸的に、例えば鼻
に、直腸に、又は経口的に、あるいは非経腸的に、例え
ば筋肉内に、皮下に、又は静脈内に、通常単位投与形と
して、例えば錠剤、糖依丸、アンプル、バイアル、又は
坐薬の形で投与される。投与されるべき精製IgE-BF、そ
の個々の場合によってはグリコシル化されている蛋白質
又はその断片の量は患者の体重及び一般的状態、投与の
態様等に依存し、そして医師の判断に基くべきである。
一般に約100μｇ〜約5000μg/kg体重／日が投与されよ
う。
ネコのフケ、イエダニ等に対してアレルギーを有する患
者におけるアレルギー状態の治療又は予防のための、精
製されたIgE-BF、個々の場合によってはグリコシル化さ
れている蛋白質及びそれらの断片の使用に関する。母乳
が供与されていない特に高い危険を有する新生児を含む
危険期における高い危険を有する患者の治療が特に重要
であろう。この発明のIgE-BFは、経腸的に、例えば鼻
に、直腸に、又は経口的に、あるいは非経腸的に、例え
ば筋肉内に、皮下に、又は静脈内に、通常単位投与形と
して、例えば錠剤、糖依丸、アンプル、バイアル、又は
坐薬の形で投与される。投与されるべき精製IgE-BF、そ
の個々の場合によってはグリコシル化されている蛋白質
又はその断片の量は患者の体重及び一般的状態、投与の
態様等に依存し、そして医師の判断に基くべきである。
一般に約100μｇ〜約5000μg/kg体重／日が投与されよ
う。
この発明はさらに、IgE-BF、その個々の場合によっては
グリコシル化されている蛋白質又はそれらの断片を抗ア
レルギー的に有効な量において、場合によっては、経
口、直腸、鼻内又は非経口的、例えば筋肉内、皮下、又
は腹腔内への投与のために適しそして活性成分と不都合
な相互作用をしない常用の医薬として許容される担体と
共に含んで成る医薬に関する。
グリコシル化されている蛋白質又はそれらの断片を抗ア
レルギー的に有効な量において、場合によっては、経
口、直腸、鼻内又は非経口的、例えば筋肉内、皮下、又
は腹腔内への投与のために適しそして活性成分と不都合
な相互作用をしない常用の医薬として許容される担体と
共に含んで成る医薬に関する。
固体粉末を含有する錠剤、カプセル、バイアル、又は注
入溶液、好ましくは水溶液 もしくは懸濁液を含有する
ネプライザー、スプレー、バイアル、アンプル等が適当
であり、これらの液剤は、例えば活性成分を単独で又は
担体、例えばマンニトール、ラクトース、アルブミン等
と共に含む凍結乾燥品から、使用の前に調製することも
可能である。医薬製剤は無菌化することができ、そして
所望により添加剤、例えば防腐剤、安定剤、乳化剤、溶
解剤、緩衝剤及び／又は浸透圧調整剤を含有することが
できる。無菌化は小孔サイズ（直径0.45μｍ以下）のフ
ィルターを通す無菌濾過により行うことができ、この後
で調製物を所望により凍結乾燥することができる。無菌
状態を維持するために抗生物質も添加することができ
る。
入溶液、好ましくは水溶液 もしくは懸濁液を含有する
ネプライザー、スプレー、バイアル、アンプル等が適当
であり、これらの液剤は、例えば活性成分を単独で又は
担体、例えばマンニトール、ラクトース、アルブミン等
と共に含む凍結乾燥品から、使用の前に調製することも
可能である。医薬製剤は無菌化することができ、そして
所望により添加剤、例えば防腐剤、安定剤、乳化剤、溶
解剤、緩衝剤及び／又は浸透圧調整剤を含有することが
できる。無菌化は小孔サイズ（直径0.45μｍ以下）のフ
ィルターを通す無菌濾過により行うことができ、この後
で調製物を所望により凍結乾燥することができる。無菌
状態を維持するために抗生物質も添加することができ
る。
この発明の医薬製剤は単位投与形、例えば単位投与当り
１〜2000mgの医薬として許容される担体と、単位投与当
り約１〜100mg、好ましくは２〜50mgの活性成分、すな
わち精製されたIgE-BF又はその個々の蛋白質を含んで成
るアンプルとして提供される。
１〜2000mgの医薬として許容される担体と、単位投与当
り約１〜100mg、好ましくは２〜50mgの活性成分、すな
わち精製されたIgE-BF又はその個々の蛋白質を含んで成
るアンプルとして提供される。
この発明はまた医薬製剤の製造方法に関し、この方法は
精製されたIgE-BF、その個々の場合によってはグリコシ
ル化されている蛋白質又はそれらの断片を医薬として許
容される担体と混合することを特徴とする。
精製されたIgE-BF、その個々の場合によってはグリコシ
ル化されている蛋白質又はそれらの断片を医薬として許
容される担体と混合することを特徴とする。
この医薬はそれ自体既知の方法により、例えば常用の混
合、溶解、凍結乾燥等により製造され、そして約0.1〜1
00％、特に約１〜50％の活性物質を含有する。
合、溶解、凍結乾燥等により製造され、そして約0.1〜1
00％、特に約１〜50％の活性物質を含有する。
人体の予防的及び治療的処置のためのこの新規な蛋白質
の使用もまたこの発明の対象である。
の使用もまたこの発明の対象である。
（例） 次に、この発明を例によりさらに具体的に説明する。但
し、これによりこの発明の範囲を限定するものではな
い。例において使用する略号は次の意味を有する。
し、これによりこの発明の範囲を限定するものではな
い。例において使用する略号は次の意味を有する。
BSA ウシ血清アルブミン cpm １分当りカウント数 EBV エプスタイン−バール・ウイルス Ｆ（ab′）2 免疫グロブリン断片（ab′）2 FcεＲ IgEのためのリセプター FcεＲ IgGのためのリセプター FCS ウシ胎児血清 FCS-LP FCSがコートされたラテックス粒子 HAT ヒポキサンチン／アミノプテリン／ チミジン HBSS ハンクの平衡塩溶液 HEPES Ｎ−２−ヒドロキシエチルピペラジン −Ｎ′−２−エタンスルホン酸 HPLC 高圧液体クロマトグラフィー HT ヒポキサンチン／チミジン IgE 免疫グロブリンＥ IgE-EF IgE結合因子 IgE-LP IgEがコートされたラテックス粒子 IgE-PS IgE骨髄腫蛋白質 （患者PSから単離されたもの） IgG 免疫グロブリンＧ Mab モノクローナル抗体（１又は複数の抗体） PEG ポリエチレングリコール PBS リン酸緩衝化塩溶液 RIA ラジオイムノアッセイ SD 標準偏差 SDS ドデシル硫酸ナトリウム SDS-PAGE SDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動 TFA トリフルオロ酢酸 Tris トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン 例1.ハイブリドーマセルラインの調製 BALB/cマウスを、PBS中５×107個の生存RPMI8866細胞
（P.Ralph博士、スローンケッタリング研究所、ニュー
ヨーク、米国より入手）を３回４週間の間隔で免疫感作
する。最後の注射の後２日目に集めた個々のマウスの血
清を、例３の方法を用いて抗−FcεＲ活性について試験
する。最も高い力価を示す２匹の動物からの脾細胞をプ
ールし、そしてこれを用いて次の日に融合を行う。脾臓
をほぐし、そして各融合のために１×108個の洗浄され
た脾細胞を25×106個のNSI/I−Ag4/1マウス骨髄腫細胞
（アメリカン・タイプ・ティシュ・カルチュア・コレク
ションから入手）と共に350xgにて５分間ペレット化す
る。細胞ペレットを、15V/V％のジメチルスルホキシド
を含有するRPMI1640培地（ギブコ）28ml中に溶解した20
gのPEGからなるポリエチレングリコール溶液（PEG-154
0;ベーカー）2ml中に30秒間おだやかに再懸濁する。
（P.Ralph博士、スローンケッタリング研究所、ニュー
ヨーク、米国より入手）を３回４週間の間隔で免疫感作
する。最後の注射の後２日目に集めた個々のマウスの血
清を、例３の方法を用いて抗−FcεＲ活性について試験
する。最も高い力価を示す２匹の動物からの脾細胞をプ
ールし、そしてこれを用いて次の日に融合を行う。脾臓
をほぐし、そして各融合のために１×108個の洗浄され
た脾細胞を25×106個のNSI/I−Ag4/1マウス骨髄腫細胞
（アメリカン・タイプ・ティシュ・カルチュア・コレク
ションから入手）と共に350xgにて５分間ペレット化す
る。細胞ペレットを、15V/V％のジメチルスルホキシド
を含有するRPMI1640培地（ギブコ）28ml中に溶解した20
gのPEGからなるポリエチレングリコール溶液（PEG-154
0;ベーカー）2ml中に30秒間おだやかに再懸濁する。
5mlのRPMI/c培地〔１％のペニシリン−ストレプトマイ
シン（ギブコ）、１％のＬ−グルタミン（ギブコ）及び
15V/V％のFCS（ギブコ）を補充したRPMI1640培地〕を90
秒間にわたって添加し、次に追加の5mlを急激に添加す
る。チューブを逆転することによって細胞懸濁液を混合
し、2.5分間放置し、そして350xgにて５分間遠心分離す
る。ペレットを5mlのRPMI/c培地に再懸濁し、そして50
μｌのアリコートを４個のコスター＃3596 24−ウエル
プレートの各ウエルに入れる。このプレートはさらに、
1mlのHAT−培地（40μM2−メルカプトエタノール）、10
0μＭヒポキサンチン、10μＭアミノプテリン及び１μ
Ｍチミジンを補充したRPMI/c）中１×106個の正常BALB/
c脾細胞を収容している。融合の５日後から始めて、所
望により数日ごとにHAT培地を添加又は交換することに
よりすべての培養物を維持する。14日後、HATをHT培地
で置換し、そして28日後RPMI/cで置換する。各ウエルの
上清み（192個の培養物）を、融合の１週間後及び２週
間後に例３に記載するようにして抗−FcεＲ抗体につい
てスクリーニングする。所望の抗体を生産する21個の培
養物を限界稀釈法によりクローン化する。これらをRPMI
/c中に稀釈して10生存細胞/mlの濃度とし、そしてこれ
らの懸濁液の50μｌのアリコートを96−ウエルプレート
（リンブロ＃76-003−05、Flow Labs）のウエルに入れ
る。これらのウエルは100μｌのHT培地及び１×105個の
正常BALB/c脾細胞を収容している。ウエルを顕微鏡観察
して増殖する培養物がモノクローナルであることを確認
する。これらから採取したサンプル上清を抗体活性につ
いて試験し、陽性培養物を選択し、そして大形培養容器
に拡張する。所望の特異性を有する抗体を分泌する14個
のモノクローナルセルラインを最終的に得る。これらを
第１表に挙げる。
シン（ギブコ）、１％のＬ−グルタミン（ギブコ）及び
15V/V％のFCS（ギブコ）を補充したRPMI1640培地〕を90
秒間にわたって添加し、次に追加の5mlを急激に添加す
る。チューブを逆転することによって細胞懸濁液を混合
し、2.5分間放置し、そして350xgにて５分間遠心分離す
る。ペレットを5mlのRPMI/c培地に再懸濁し、そして50
μｌのアリコートを４個のコスター＃3596 24−ウエル
プレートの各ウエルに入れる。このプレートはさらに、
1mlのHAT−培地（40μM2−メルカプトエタノール）、10
0μＭヒポキサンチン、10μＭアミノプテリン及び１μ
Ｍチミジンを補充したRPMI/c）中１×106個の正常BALB/
c脾細胞を収容している。融合の５日後から始めて、所
望により数日ごとにHAT培地を添加又は交換することに
よりすべての培養物を維持する。14日後、HATをHT培地
で置換し、そして28日後RPMI/cで置換する。各ウエルの
上清み（192個の培養物）を、融合の１週間後及び２週
間後に例３に記載するようにして抗−FcεＲ抗体につい
てスクリーニングする。所望の抗体を生産する21個の培
養物を限界稀釈法によりクローン化する。これらをRPMI
/c中に稀釈して10生存細胞/mlの濃度とし、そしてこれ
らの懸濁液の50μｌのアリコートを96−ウエルプレート
（リンブロ＃76-003−05、Flow Labs）のウエルに入れ
る。これらのウエルは100μｌのHT培地及び１×105個の
正常BALB/c脾細胞を収容している。ウエルを顕微鏡観察
して増殖する培養物がモノクローナルであることを確認
する。これらから採取したサンプル上清を抗体活性につ
いて試験し、陽性培養物を選択し、そして大形培養容器
に拡張する。所望の特異性を有する抗体を分泌する14個
のモノクローナルセルラインを最終的に得る。これらを
第１表に挙げる。
例2.モノクローナル抗体の単離及び精製 Balb/cマウスを0.5mlのプリスタン（アルドリッチ）に
より腹腔内前処理する。２週間後、５×106個のクロー
ン化されたハイブリドーマ細胞を腹腔内注射する。８〜
10日後、腹水を集め、800xgで遠心し、そして−20℃に
て貯蔵する。触凍した腹水を50,000xgにて60分間遠心す
る。表面に浮く脂肪層を注意深く除去し、そして蛋白質
濃度を10〜12mg/mlに調整する。０℃にて0.9容量の飽和
硫酸アンモニウム溶液を滴加することによって粗免疫グ
ロブリンを沈澱せしめ、次に20mM Tris-HCl/50mM/Nacl
（pH7.9）に溶解し、そして同じ緩衝液に対して透析す
る。20mM Tris-HCl/25〜400mM Nacl（pH7.9）緩衝液グ
ラジエント系を用いるEDTA-D52セルロース（ワットマ
ン）クロマトグラフィーにより免疫グロブリンＣ画分を
得る。
より腹腔内前処理する。２週間後、５×106個のクロー
ン化されたハイブリドーマ細胞を腹腔内注射する。８〜
10日後、腹水を集め、800xgで遠心し、そして−20℃に
て貯蔵する。触凍した腹水を50,000xgにて60分間遠心す
る。表面に浮く脂肪層を注意深く除去し、そして蛋白質
濃度を10〜12mg/mlに調整する。０℃にて0.9容量の飽和
硫酸アンモニウム溶液を滴加することによって粗免疫グ
ロブリンを沈澱せしめ、次に20mM Tris-HCl/50mM/Nacl
（pH7.9）に溶解し、そして同じ緩衝液に対して透析す
る。20mM Tris-HCl/25〜400mM Nacl（pH7.9）緩衝液グ
ラジエント系を用いるEDTA-D52セルロース（ワットマ
ン）クロマトグラフィーにより免疫グロブリンＣ画分を
得る。
免疫グロブリンＧを硫酸アンモニウムにより再度沈澱せ
しめ、そしてPBS中に10mg/mlの濃度で溶解する。
しめ、そしてPBS中に10mg/mlの濃度で溶解する。
インビトロ増殖によりモノクローナル抗体を得ることも
可能である。ハイブリド細胞を含有する前培養物を生理
的温度（約37℃）にて、培地（10％FCSを補充したRPMI1
640）中で５×105〜106細胞/mlの細胞濃度まで培養す
る。完了した前培養物を3000mlの容積に目盛を付したBe
llco−スピンナーボルトに移す。培地を加えて1500mlの
最終容量とする。この培養物を２〜３日間、５％CO2に
富化された空気中、生理的温度にて30rpmで攪拌する。
さらに培地を加えて培養物の容量を3000mlにする。上記
の培養条件を用いてさらに７〜10日間培養を行う。細胞
の95％が死滅したとき、細胞を含有する培地を1000xgに
て20分間、４℃で遠心する。上清を無菌条件下で濾過す
る（孔サイズ0.2μｍ）。飽和硫酸アンモニウムを添加
して粗免疫グロブリンを得、そして前記のようにして精
製する。
可能である。ハイブリド細胞を含有する前培養物を生理
的温度（約37℃）にて、培地（10％FCSを補充したRPMI1
640）中で５×105〜106細胞/mlの細胞濃度まで培養す
る。完了した前培養物を3000mlの容積に目盛を付したBe
llco−スピンナーボルトに移す。培地を加えて1500mlの
最終容量とする。この培養物を２〜３日間、５％CO2に
富化された空気中、生理的温度にて30rpmで攪拌する。
さらに培地を加えて培養物の容量を3000mlにする。上記
の培養条件を用いてさらに７〜10日間培養を行う。細胞
の95％が死滅したとき、細胞を含有する培地を1000xgに
て20分間、４℃で遠心する。上清を無菌条件下で濾過す
る（孔サイズ0.2μｍ）。飽和硫酸アンモニウムを添加
して粗免疫グロブリンを得、そして前記のようにして精
製する。
精製されたMabを日常的方法により、SDS-PAGEにより、
及びマウスIgサブクラスに対するヒツジ抗血清を用いる
オークテルロニー分析により特徴付ける。サブクラスを
第１表に示す。
及びマウスIgサブクラスに対するヒツジ抗血清を用いる
オークテルロニー分析により特徴付ける。サブクラスを
第１表に示す。
例3.フローサイトメトリーによるFcεＲに対する抗体の
検出 FcεＲに対する抗体を、RPMI8866細胞へのIgEコートラ
テックス粒子（IgE-LP）の結合を阻害するそれらの能力
により検出する。スクリーニングのため、ハイブリドー
マ上清（100μｌ）を、２×105個のRPMI8866細胞を収容
するミクロタイターウエル（96−ウエルＶ−底、Flow L
abs ＃76-321-05）に入れ、そして20℃にて30分間おだ
やかに攪拌する。プレートを300xgにて６分間遠心し、
そして細胞ペレットを再懸濁し、そして10％のFCSが補
充されそして10mM HEPES（pH7.2）により緩衝化されたR
PMI培地（Ｈ−RPMI）により２回洗浄する。MX−コバス
フェア（Covaspheres）（0.7μｍ、20コバレント・テク
ノロジー社、米国）をIgEPSによりコートしそして残留
結合部位をPCSによりM.Sarfati等、Immunology53、783
（1984）に記載されているようにしてブロックすること
により調製したIgE-LP（100μl/ウエル）を細胞と混合
し、平底96−ウエルミクロタイタープレート（コスター
＃3590）に移し、そして300xg、20℃にて15分間共沈せ
しめる。次にプレートを20℃にて30分間攪乱しないでイ
ンキュベートし、この後各細胞単層を再懸濁し、そして
円すい形0.5ml小遠心管（フィッシャーサイエンティフ
ィック＃５−407−６）中に収容された300μｌのFCS上
に重層する。このチューブを125xgにて８分間遠心し、
そして付着していないIgE-LPを含有する上清を吸引除去
する。細胞ペレットをそれぞれ約300μｌのＨ−RPMIに
懸濁し、そして分析するまで氷上に貯蔵する。対照サン
プルは、ハイブリドーマ上清の代りにISI/1細胞からの
上清又はRPMI/c（陽性対照）、又はIgE-LPの代りにFCS
−コートLP（FCS-LP）（陰性対照）を含む。
検出 FcεＲに対する抗体を、RPMI8866細胞へのIgEコートラ
テックス粒子（IgE-LP）の結合を阻害するそれらの能力
により検出する。スクリーニングのため、ハイブリドー
マ上清（100μｌ）を、２×105個のRPMI8866細胞を収容
するミクロタイターウエル（96−ウエルＶ−底、Flow L
abs ＃76-321-05）に入れ、そして20℃にて30分間おだ
やかに攪拌する。プレートを300xgにて６分間遠心し、
そして細胞ペレットを再懸濁し、そして10％のFCSが補
充されそして10mM HEPES（pH7.2）により緩衝化されたR
PMI培地（Ｈ−RPMI）により２回洗浄する。MX−コバス
フェア（Covaspheres）（0.7μｍ、20コバレント・テク
ノロジー社、米国）をIgEPSによりコートしそして残留
結合部位をPCSによりM.Sarfati等、Immunology53、783
（1984）に記載されているようにしてブロックすること
により調製したIgE-LP（100μl/ウエル）を細胞と混合
し、平底96−ウエルミクロタイタープレート（コスター
＃3590）に移し、そして300xg、20℃にて15分間共沈せ
しめる。次にプレートを20℃にて30分間攪乱しないでイ
ンキュベートし、この後各細胞単層を再懸濁し、そして
円すい形0.5ml小遠心管（フィッシャーサイエンティフ
ィック＃５−407−６）中に収容された300μｌのFCS上
に重層する。このチューブを125xgにて８分間遠心し、
そして付着していないIgE-LPを含有する上清を吸引除去
する。細胞ペレットをそれぞれ約300μｌのＨ−RPMIに
懸濁し、そして分析するまで氷上に貯蔵する。対照サン
プルは、ハイブリドーマ上清の代りにISI/1細胞からの
上清又はRPMI/c（陽性対照）、又はIgE-LPの代りにFCS
−コートLP（FCS-LP）（陰性対照）を含む。
蛍光活性化セルソーター（EPICSV（商標）、コールター
・エレクトロニクス）上でサイトメトリー分析を行い、
蛍光測定は、M.Sarfati等、Immunology53、783（1984）
に記載されているように、前方角及び90度の光散乱特性
の両者において行う。サンプルを２分間の間隔で分析
し、各蛍光ヒストグラムは10,000ゲートカウントに基
く。
・エレクトロニクス）上でサイトメトリー分析を行い、
蛍光測定は、M.Sarfati等、Immunology53、783（1984）
に記載されているように、前方角及び90度の光散乱特性
の両者において行う。サンプルを２分間の間隔で分析
し、各蛍光ヒストグラムは10,000ゲートカウントに基
く。
第１図は、陽性対照及び陰性対照を含む蛍光ヒストグラ
ムであって、IgE-LPを用いてRPMI8866細胞の80〜90％が
４個以上のビーズによりラベルされ（チャンネル15以
上）、これに対してFCS-LPを用いた場合ラベルされるの
に１〜３％であることを示している。
ムであって、IgE-LPを用いてRPMI8866細胞の80〜90％が
４個以上のビーズによりラベルされ（チャンネル15以
上）、これに対してFCS-LPを用いた場合ラベルされるの
に１〜３％であることを示している。
第２図は、スクリーニング方法を説明し、そして陽性対
照（029/P0S CNTL）及び抗体を含有するハイブリドーマ
上清（030/＃48及び031/＃72）の蛍光ヒストグラムを示
す。これは、FcεＲに結合する抗体による蛍光ラベル比
の阻害を示している。カッコ内のパーセントは標準化さ
れた全蛍光値であり、このものはラベルされた細胞の平
均チャンネル数とラベルされた細胞の数の積として定義
される。
照（029/P0S CNTL）及び抗体を含有するハイブリドーマ
上清（030/＃48及び031/＃72）の蛍光ヒストグラムを示
す。これは、FcεＲに結合する抗体による蛍光ラベル比
の阻害を示している。カッコ内のパーセントは標準化さ
れた全蛍光値であり、このものはラベルされた細胞の平
均チャンネル数とラベルされた細胞の数の積として定義
される。
例4.間接イムノフルオレッセンスアッセイによる、Fcε
Ｒに対する抗体の検出 ２×105個のRPMI8866細胞をハイブリドーマ上清又はMab
の他の溶液と４℃にて30分間、0.2mlのＨ−RPMIの合計
容量中でインキュベートする。Ｈ−RPMIにより２回洗浄
した後、200μｌのフルオレッセイン接合ギヤ抗−マウ
スIg試薬（GAM-FITC（商標）、コールター・イムノロジ
ー）を加え、そして４℃にて30分間反応せしめる。Ｈ−
RPMIにてさらに２回洗浄した後、細胞を300μｌのＨ−R
PMI中に再懸濁し、そして例３に記載したようにしてフ
ローサイトメトリーにより分析する。
Ｒに対する抗体の検出 ２×105個のRPMI8866細胞をハイブリドーマ上清又はMab
の他の溶液と４℃にて30分間、0.2mlのＨ−RPMIの合計
容量中でインキュベートする。Ｈ−RPMIにより２回洗浄
した後、200μｌのフルオレッセイン接合ギヤ抗−マウ
スIg試薬（GAM-FITC（商標）、コールター・イムノロジ
ー）を加え、そして４℃にて30分間反応せしめる。Ｈ−
RPMIにてさらに２回洗浄した後、細胞を300μｌのＨ−R
PMI中に再懸濁し、そして例３に記載したようにしてフ
ローサイトメトリーにより分析する。
例5.FcεＲに結合するMabの他の特徴付け 5.1.EBVにより形質転換されたＢ細胞へのIgEの結合の阻
害 IgEのそのリセプターへの結合を阻害するこの発明のモ
ノクローナル抗体の能力はRPMI8866セルラインに限定さ
れず、FcεＲを発現することが知られている他のＢセル
ライン、例えばエプスタイン−バールウイルスで形質転
換されたＢセルラインEBV-RCA、EBV-JG及びEBV-WLを用
いても示すことができる〔M.Sarfati等、Immunology5
3、207（1984）。例３においてRPMI8866について記載し
たのと同様にして実験を行う。モノクローナル抗体の１
つMab-133についての結果を第２表に示す。
害 IgEのそのリセプターへの結合を阻害するこの発明のモ
ノクローナル抗体の能力はRPMI8866セルラインに限定さ
れず、FcεＲを発現することが知られている他のＢセル
ライン、例えばエプスタイン−バールウイルスで形質転
換されたＢセルラインEBV-RCA、EBV-JG及びEBV-WLを用
いても示すことができる〔M.Sarfati等、Immunology5
3、207（1984）。例３においてRPMI8866について記載し
たのと同様にして実験を行う。モノクローナル抗体の１
つMab-133についての結果を第２表に示す。
第２表に示す実験の結果は、モノクローナル抗体が、各
ＢセルラインへのIgEの結合を完全にブロックすること
を示している。このデータはさらに、阻害がそのFc領域
により介在されないことを示す。なぜなら、大過剰のマ
ウスIgGがMab-135の阻害活性を模倣することができない
からである。MabがFc結合によってではなくそのFab領域
を介してFcεＲと反応することの一層直接的な証明は、
無傷のMab-135とそのＦ（ab′）2断片（例６）の活性を
比較する実験により得られる。RPMI8866細胞へのIgE−L
Pの結合のブロッキングにおいて、Mab-135のＦ（ab′）
2部分がMab-135自体と同様に効果的であることが観察さ
れる。RPMI8866細胞を、培地、無傷のMab-135（0.5μg/
ml）又はMab-135のＦ（ab′）2断片（0.5μg/ml）のい
ずれかと前インキュベートし、そして次にIgE-LPと反応
せしめる。ラベルされた細胞の％はそれぞれ89.3、0.4
及び0.4％である。IgE-LPではなくFCS-LPとの反応にお
いて細胞の0.5％がラベルされる（陰性対照）。
ＢセルラインへのIgEの結合を完全にブロックすること
を示している。このデータはさらに、阻害がそのFc領域
により介在されないことを示す。なぜなら、大過剰のマ
ウスIgGがMab-135の阻害活性を模倣することができない
からである。MabがFc結合によってではなくそのFab領域
を介してFcεＲと反応することの一層直接的な証明は、
無傷のMab-135とそのＦ（ab′）2断片（例６）の活性を
比較する実験により得られる。RPMI8866細胞へのIgE−L
Pの結合のブロッキングにおいて、Mab-135のＦ（ab′）
2部分がMab-135自体と同様に効果的であることが観察さ
れる。RPMI8866細胞を、培地、無傷のMab-135（0.5μg/
ml）又はMab-135のＦ（ab′）2断片（0.5μg/ml）のい
ずれかと前インキュベートし、そして次にIgE-LPと反応
せしめる。ラベルされた細胞の％はそれぞれ89.3、0.4
及び0.4％である。IgE-LPではなくFCS-LPとの反応にお
いて細胞の0.5％がラベルされる（陰性対照）。
5.2.FcεＲ陽性−及び陰性−セルラインへのMabの結合 EcεＲに対する例えばMab-135の特異性を、FcεＲの発
現についてあらかじめ試験された種々のセルラインへの
直接結合を試験することにより評価する。最初の力価検
定実験において決定された、RPMI8866細胞の90％以上を
ラベルする濃度においてMab-135を使用する。３つのセ
ルラインはIgE-LP又はMab-135と反応せず、他方181.21.
2.20AR細胞は両者と反応する。陰性対照として使用され
たマウスIgGはいずれのセルラインとも結合しない。従
って、IgE及びMab-135結合の間の直接的な一致が証明さ
れる。
現についてあらかじめ試験された種々のセルラインへの
直接結合を試験することにより評価する。最初の力価検
定実験において決定された、RPMI8866細胞の90％以上を
ラベルする濃度においてMab-135を使用する。３つのセ
ルラインはIgE-LP又はMab-135と反応せず、他方181.21.
2.20AR細胞は両者と反応する。陰性対照として使用され
たマウスIgGはいずれのセルラインとも結合しない。従
って、IgE及びMab-135結合の間の直接的な一致が証明さ
れる。
5.3.キャッピング実験 RPMI8866細胞をキャッピング条件下でMab-135又は第１
表中の他の任意のMabと共にインキュベートし、次に洗
浄し、そして最後にIgE-LPと反応せしめる。0.5μg/ml
のMabの存在下、37℃にて60分間インキュベートした
後、細胞はGAM-FITC（例４）に結合する能力を完全に失
い、これによりキャッピングの効果が示され、さらにIg
E-LPへの結合能力を失う（第４表）。対照実験におい
て、キャッピング条件下でのRPMI8866細胞のI2、B1又は
OKT9モノクローナル抗体（ベクトン、ディッキンソン及
びオルソから販売されている）（これらはRPMI8866と強
く反応することが知られている）との前のインキュベー
ションはその後のIgE-LPの結合に影響を与えないことが
見出された。
表中の他の任意のMabと共にインキュベートし、次に洗
浄し、そして最後にIgE-LPと反応せしめる。0.5μg/ml
のMabの存在下、37℃にて60分間インキュベートした
後、細胞はGAM-FITC（例４）に結合する能力を完全に失
い、これによりキャッピングの効果が示され、さらにIg
E-LPへの結合能力を失う（第４表）。対照実験におい
て、キャッピング条件下でのRPMI8866細胞のI2、B1又は
OKT9モノクローナル抗体（ベクトン、ディッキンソン及
びオルソから販売されている）（これらはRPMI8866と強
く反応することが知られている）との前のインキュベー
ションはその後のIgE-LPの結合に影響を与えないことが
見出された。
例6.免疫グロブリン断片Ｆ（ab′）2の調製 腹水から単離されたMab（例２）を酵素ヘプシン（5W/W
％）により37℃にて20時間消化する。この消化物をゲル
濾過（セファデックスＧ−200、ファルマシア）により
画分し、そしてＦ（ab′）2断片を含有する画分を、セ
ファロースにカップリングしたマウスIgG1に対するヤギ
抗体による吸着により残留未消化IgGを除去する。精製
されたIg及びその断片をSDS-PAGEにより試験し、標品を
クマーシーブルーにより染色する。
％）により37℃にて20時間消化する。この消化物をゲル
濾過（セファデックスＧ−200、ファルマシア）により
画分し、そしてＦ（ab′）2断片を含有する画分を、セ
ファロースにカップリングしたマウスIgG1に対するヤギ
抗体による吸着により残留未消化IgGを除去する。精製
されたIg及びその断片をSDS-PAGEにより試験し、標品を
クマーシーブルーにより染色する。
例7.RPMI8866細胞へのMabの結合のIgEによる阻害 RPMI8866細胞とIgEとの前インキュベーションによりFc
εＲが飽和され、そしてその後の、細胞へのMabの結合
が阻害され、EcεＲに対するMabの特異性が証明され
る。これらのアッセイは、RPMI8866細胞の35〜70％をラ
ベルする限定された濃度のMab（0.1μg/ml）を用いるこ
とにより、間接イムノフルオレッセンス（例４）を用い
て行う。
εＲが飽和され、そしてその後の、細胞へのMabの結合
が阻害され、EcεＲに対するMabの特異性が証明され
る。これらのアッセイは、RPMI8866細胞の35〜70％をラ
ベルする限定された濃度のMab（0.1μg/ml）を用いるこ
とにより、間接イムノフルオレッセンス（例４）を用い
て行う。
第３図は、RPMI8866細胞への４種類の異なるMab（0.1μ
g/ml）の結合が、細胞を10μg/ml又は100μg/mlのIgEPS
（IgE10、IgE100）と共に前インキュベートした後に、
濃度依存的に阻害されることを示している。他方、100
μg/mlとヒトIgG（IgG100）と共に前インキュベートし
た後、ラベル化の阻害は明瞭でない。各ヒストグラムは
20,000細胞の分析に基く。
g/ml）の結合が、細胞を10μg/ml又は100μg/mlのIgEPS
（IgE10、IgE100）と共に前インキュベートした後に、
濃度依存的に阻害されることを示している。他方、100
μg/mlとヒトIgG（IgG100）と共に前インキュベートし
た後、ラベル化の阻害は明瞭でない。各ヒストグラムは
20,000細胞の分析に基く。
他の同様の実験において、100〜500μg/mlの範囲の濃度
で用いたIgA、IgM及びIgDがRPMI8866細胞、又は例５
（第２表）に示すFcεＲを発現するEBVセルラインへのM
ab−135の結合に影響を与えないことが見出される。
で用いたIgA、IgM及びIgDがRPMI8866細胞、又は例５
（第２表）に示すFcεＲを発現するEBVセルラインへのM
ab−135の結合に影響を与えないことが見出される。
例8.FcγＲへのIgGの結合に対するMabの影響 これらのアッセイにおいては、末梢血単核細胞を10μg/
mlのMab-135と前インキュベートし、そして次に洗浄
し、そしてIgGでコートされたキツネの赤血球を用いて
ロゼット形成せしめる。Mabの非存在下では細胞の11.4
±4.5％がロゼット形成し、他方10μg/mlのMab-135の存
在下では11.1±3.4％がロゼット形成する（４実験の平
均±標準偏差）。
mlのMab-135と前インキュベートし、そして次に洗浄
し、そしてIgGでコートされたキツネの赤血球を用いて
ロゼット形成せしめる。Mabの非存在下では細胞の11.4
±4.5％がロゼット形成し、他方10μg/mlのMab-135の存
在下では11.1±3.4％がロゼット形成する（４実験の平
均±標準偏差）。
例9.RPMI8866細胞へのMabの結合のIgE-BFによる阻害 S.Romagnani等、J.Immunol.124、1620（1980）により記
載されているようにして、ウシ赤血球をMab、例えばMab
-135によりコートする。３％のBSAを含有するハンク平
衡塩溶液（HBSS-BSA）中２％のMab-135コート赤血球15
μｌを４℃にて60分間、RPMI8866細胞のIgE-BF含有無細
胞上清を10倍濃縮したもの30μｌと、又は陰性対照とし
てのHB101培地と、間欠的に攪拌しながらインキュベー
トする。15μｌのRPMI8866細胞（HBSS-BSA中107細胞/m
l）を加え、そして４℃にて15分間の後、混合物を90x
g、４℃にて５分間遠心し、そして０℃にて２時間保
つ。アクリジンオレンジを含有する200μｌのHBSS-BSA
をペレットに加え、そして細胞をおだやかに再懸濁した
後蛍光顕微鏡のもとで試験する。BSAをコートした赤血
球によりバックグラウンドを決定し、そしてロゼット形
成細胞の％を算出するためにそれを差引く。２連又は３
連の調製物において500〜600細胞についてロゼットを計
数する。
載されているようにして、ウシ赤血球をMab、例えばMab
-135によりコートする。３％のBSAを含有するハンク平
衡塩溶液（HBSS-BSA）中２％のMab-135コート赤血球15
μｌを４℃にて60分間、RPMI8866細胞のIgE-BF含有無細
胞上清を10倍濃縮したもの30μｌと、又は陰性対照とし
てのHB101培地と、間欠的に攪拌しながらインキュベー
トする。15μｌのRPMI8866細胞（HBSS-BSA中107細胞/m
l）を加え、そして４℃にて15分間の後、混合物を90x
g、４℃にて５分間遠心し、そして０℃にて２時間保
つ。アクリジンオレンジを含有する200μｌのHBSS-BSA
をペレットに加え、そして細胞をおだやかに再懸濁した
後蛍光顕微鏡のもとで試験する。BSAをコートした赤血
球によりバックグラウンドを決定し、そしてロゼット形
成細胞の％を算出するためにそれを差引く。２連又は３
連の調製物において500〜600細胞についてロゼットを計
数する。
例10.IgE-BFを精製するためのイムノアフィニティーゲ
ルの調製 アフィ−ゲル（Affi-Gel）10（ビオ−ラド）を製造者の
指示に従って冷蒸留水及びカップリング緩衝液（pH8.
0、0.1M NaHCO3溶液）により洗浄する。カップリング緩
衝液中50％濃度のゲルをプラスチックチューブに導入
し、そして10mgのMab-30を含有する同容量の溶液と混合
し、そしてこの混合物を室温にて４時間回転せしめる。
次に、ゲルをカップリング溶液で洗浄する。なお遊離し
ている活性部位をブロックするため、ゲルを室温にて２
時間0.1mlの1Mエタノールアミン−HCl（pH8.0）で処理
し、そして10mmolのナトリウムアジドを含有するPBSに
より洗浄し、そして４℃でその中に保持する。
ルの調製 アフィ−ゲル（Affi-Gel）10（ビオ−ラド）を製造者の
指示に従って冷蒸留水及びカップリング緩衝液（pH8.
0、0.1M NaHCO3溶液）により洗浄する。カップリング緩
衝液中50％濃度のゲルをプラスチックチューブに導入
し、そして10mgのMab-30を含有する同容量の溶液と混合
し、そしてこの混合物を室温にて４時間回転せしめる。
次に、ゲルをカップリング溶液で洗浄する。なお遊離し
ている活性部位をブロックするため、ゲルを室温にて２
時間0.1mlの1Mエタノールアミン−HCl（pH8.0）で処理
し、そして10mmolのナトリウムアジドを含有するPBSに
より洗浄し、そして４℃でその中に保持する。
同様にして、Mab-45、Mab-94又はMab-135を含有するイ
ムノアフィニティーゲルを調製する。
ムノアフィニティーゲルを調製する。
例11.イムノアフィニティークロマトグラフィーを用い
るヒトＢ細胞上清からのIgE-BFの精製 RPMI8866細胞の培養上清をアミコンYM5メンブランフィ
ルター上で100倍に濃縮する。70mlのこの溶液をMab-30
−又はMab-45−アフィゲルのカラム（例10）2mlに5ml/
時の流速で通す。このゲルを、0.5M NaCl及び0.05％ト
ウィーン20を補充された20容量のPBS、５容量のPBS、及
び５容量の0.9％NaClにより次々と洗浄する。流過液の
蛋白質含量をユビコード（Uvicord）分光光度計による2
80nmでのオン−ライン吸収によりモニターして未吸着蛋
白質の除去を確実にする。次に、カラムを8mlの0.1Mグ
リシン−HCl/0.1M NaCl（pH2.6）により溶出し、そして
蛋白質含有画分を集め、1M Trisにより中和し、そして
蒸留水に対して透析する。
るヒトＢ細胞上清からのIgE-BFの精製 RPMI8866細胞の培養上清をアミコンYM5メンブランフィ
ルター上で100倍に濃縮する。70mlのこの溶液をMab-30
−又はMab-45−アフィゲルのカラム（例10）2mlに5ml/
時の流速で通す。このゲルを、0.5M NaCl及び0.05％ト
ウィーン20を補充された20容量のPBS、５容量のPBS、及
び５容量の0.9％NaClにより次々と洗浄する。流過液の
蛋白質含量をユビコード（Uvicord）分光光度計による2
80nmでのオン−ライン吸収によりモニターして未吸着蛋
白質の除去を確実にする。次に、カラムを8mlの0.1Mグ
リシン−HCl/0.1M NaCl（pH2.6）により溶出し、そして
蛋白質含有画分を集め、1M Trisにより中和し、そして
蒸留水に対して透析する。
ISCO電気泳動コンセントレーターモデル1750（ISCO社）
及び3.5KDのカットオフのスペクトラポール（Spcctrapo
r）膜（スペクトラム・メディカル・インダストリー）
で処理することにより、精製されたIgE-BFの濃縮溶液を
得る。この溶液を25mM酢酸アンモニウム（pH8.6）に対
して透析し、そしてこうして0.2mlに濃縮する。
及び3.5KDのカットオフのスペクトラポール（Spcctrapo
r）膜（スペクトラム・メディカル・インダストリー）
で処理することにより、精製されたIgE-BFの濃縮溶液を
得る。この溶液を25mM酢酸アンモニウム（pH8.6）に対
して透析し、そしてこうして0.2mlに濃縮する。
この精製されたIgF-BFを次のようにして分析する。画分
を１％のSDS及び５％の２−メルカプトエタノールを含
有するLaemmli緩衝液と共にインキュベートし、次にビ
オラドのマニュアルに記載されているようにして12％SD
S-PAGE及び銀染色により個々の蛋白質に分ける。およそ
の分子量が12,16,25〜28,45、及び60KDである蛋白質が
検出される。これらを電気泳動的にニトロセルロース膜
に移行せしめる（0.21Aにて４時間、移行緩衝液:25mM T
ris、pH8.0、192mMグリシン、20V/V％メタノール）。こ
の膜を10％のFCSを含有するTris緩衝化塩溶液によりブ
ロックする。ストリップを切り取り、個々にMab-30、−
135、及び−64とそれぞれ10μg/mlで反応せしめる。６
時間のインキュベーションの後、ストリップを洗浄し、
そしてホースラディッシュ・パーオキシダーゼヤギ抗−
マウスIgGと一夜反応せしめる。ストリップを洗浄し、
そしてビオラドの指示書に記載されているようにして４
−クロロ−１−ナフトール（パーオキシダーゼ基質）に
より発色せしめる。Mab−30、−135及び−64はそれぞれ
25〜20KD蛋白質バンドと反応し、45KD蛋白質バンドと不
規則に反応する。
を１％のSDS及び５％の２−メルカプトエタノールを含
有するLaemmli緩衝液と共にインキュベートし、次にビ
オラドのマニュアルに記載されているようにして12％SD
S-PAGE及び銀染色により個々の蛋白質に分ける。およそ
の分子量が12,16,25〜28,45、及び60KDである蛋白質が
検出される。これらを電気泳動的にニトロセルロース膜
に移行せしめる（0.21Aにて４時間、移行緩衝液:25mM T
ris、pH8.0、192mMグリシン、20V/V％メタノール）。こ
の膜を10％のFCSを含有するTris緩衝化塩溶液によりブ
ロックする。ストリップを切り取り、個々にMab-30、−
135、及び−64とそれぞれ10μg/mlで反応せしめる。６
時間のインキュベーションの後、ストリップを洗浄し、
そしてホースラディッシュ・パーオキシダーゼヤギ抗−
マウスIgGと一夜反応せしめる。ストリップを洗浄し、
そしてビオラドの指示書に記載されているようにして４
−クロロ−１−ナフトール（パーオキシダーゼ基質）に
より発色せしめる。Mab−30、−135及び−64はそれぞれ
25〜20KD蛋白質バンドと反応し、45KD蛋白質バンドと不
規則に反応する。
例12.B細胞上清からのIgE-BFの一層の精製及び25〜28KD
蛋白質の単離 12.1 イオン交換クロマトグラフィー及びイムノアフィ
ニティークロマトグラフィー 0.05M Tris-HCl（pH7.4）中例11の精製されたIgE-BFをT
SK545DEAEカラム（LKB）に加える。カラムを過剰の0.05
M Tris-HClで洗浄し、そして生成物を０〜0.5M NaClグ
ラジエントにより溶出する。25〜28KDの蛋白質は0.15M
の濃度において溶出する。得られた生成物をMab-30−ア
フィゲルのカラムで再度精製し、そして例11に記載した
ようにしてSDS-PAGEにより分析する。
蛋白質の単離 12.1 イオン交換クロマトグラフィー及びイムノアフィ
ニティークロマトグラフィー 0.05M Tris-HCl（pH7.4）中例11の精製されたIgE-BFをT
SK545DEAEカラム（LKB）に加える。カラムを過剰の0.05
M Tris-HClで洗浄し、そして生成物を０〜0.5M NaClグ
ラジエントにより溶出する。25〜28KDの蛋白質は0.15M
の濃度において溶出する。得られた生成物をMab-30−ア
フィゲルのカラムで再度精製し、そして例11に記載した
ようにしてSDS-PAGEにより分析する。
12.2 逆相HPLC 0.1％TFA/5％アセトニトリル中例11の精製されたIgE-BF
を、調製用ハイ−ポアRP-304HPLCカラム（ビオ−ラド）
上で0.1％TFA中５〜75％アセトニトリルのグラジエント
により処理する。例11に記載したようにしてSDS-PAGEに
より分析した場合、このものは均一である。
を、調製用ハイ−ポアRP-304HPLCカラム（ビオ−ラド）
上で0.1％TFA中５〜75％アセトニトリルのグラジエント
により処理する。例11に記載したようにしてSDS-PAGEに
より分析した場合、このものは均一である。
12.3 調製用SDSポリアクリルアミドゲル電気泳動 例11のIgE-BFを同じ緩衝液〔U.K.Laemmli及びM.Favre、
J.Mol.Biol.、80、575（1973）〕に溶解する。スラブゲ
ル（厚さ1.5cm、長さ110mm）をLaemmli及びFavreにより
記載されたようにして調製する。分離用ゲルは12％のア
クリルアミド及び0.32％のビス−アクリルアミドを含有
する。電気泳動の終りにおいて、ゲルを氷冷した0.25mM
KClに浸漬することにより蛋白質を可視化する。このゲ
ルは25〜28KDの分子量範囲の３個の近接したバンドを含
む。中央のバンドを含むゲル片を切り出しそして十分に
洗浄する。
J.Mol.Biol.、80、575（1973）〕に溶解する。スラブゲ
ル（厚さ1.5cm、長さ110mm）をLaemmli及びFavreにより
記載されたようにして調製する。分離用ゲルは12％のア
クリルアミド及び0.32％のビス−アクリルアミドを含有
する。電気泳動の終りにおいて、ゲルを氷冷した0.25mM
KClに浸漬することにより蛋白質を可視化する。このゲ
ルは25〜28KDの分子量範囲の３個の近接したバンドを含
む。中央のバンドを含むゲル片を切り出しそして十分に
洗浄する。
A.J.Brown及びJ.C.Bennett〔Methods in Enzymotogy 9
1、450（1983）〕により記載されているようにして、IS
COサンプル濃縮器（モデル1750）を用いてゲル片から蛋
白質を溶出する。蛋白質を透析してグリシンを除去す
る。W.H.Konigsberg及びHenderson〔Methods in Enzymo
logy 91、254（1983）〕により記載されているようにし
てイオン対抽出によりSDSを除去する。
1、450（1983）〕により記載されているようにして、IS
COサンプル濃縮器（モデル1750）を用いてゲル片から蛋
白質を溶出する。蛋白質を透析してグリシンを除去す
る。W.H.Konigsberg及びHenderson〔Methods in Enzymo
logy 91、254（1983）〕により記載されているようにし
てイオン対抽出によりSDSを除去する。
例13.25〜28KD蛋白質のアミノ酸組成の決定 例12.3に従ってSDS-PAGEにより精製された25〜28KD蛋白
質（48pmole、1.2μｇ）を凍結乾燥し、そして6N HClに
溶解し、そして真空下110℃にて24時間煮沸する。アミ
ノ酸を炭酸水素ナトリウム緩衝液中４′−ジメチルアミ
ノ−アゾベンゼン−４−スルホニルクロリドにより誘導
体にし、そして混合物の５％（アミノ酸当り2.4pmoleに
相当する）を、J.Y.Chang、R.Knecht及びD.G.Braun〔Me
thods of Enzymology、Vol 91、41-48（1983）〕の方法
に従ってウオーターズの装置を用いてメルク・リクロス
ペア100 CH-18/2HPLCカラム上で分析する。
質（48pmole、1.2μｇ）を凍結乾燥し、そして6N HClに
溶解し、そして真空下110℃にて24時間煮沸する。アミ
ノ酸を炭酸水素ナトリウム緩衝液中４′−ジメチルアミ
ノ−アゾベンゼン−４−スルホニルクロリドにより誘導
体にし、そして混合物の５％（アミノ酸当り2.4pmoleに
相当する）を、J.Y.Chang、R.Knecht及びD.G.Braun〔Me
thods of Enzymology、Vol 91、41-48（1983）〕の方法
に従ってウオーターズの装置を用いてメルク・リクロス
ペア100 CH-18/2HPLCカラム上で分析する。
結果を第６図に集約する。蛋白質サンプル中に遊離グリ
シンが過剰に（1.2nmole）存在するため、第６表中Gly
の補正された値は確かではない。アミノ酸残基の数は25
KDの分子量に相当する合計215個のアミノ酸に基いて計
算されている。
シンが過剰に（1.2nmole）存在するため、第６表中Gly
の補正された値は確かではない。アミノ酸残基の数は25
KDの分子量に相当する合計215個のアミノ酸に基いて計
算されている。
例14.25〜28KD蛋白質の断片の調製 14.1 単なる貯蔵による 精製された25〜28KD蛋白質を４℃にて数週間、蛋白質阻
害剤の非存在下で保持する。例11に記載したようにして
サンプルを12％SDS-PAGEにより分離する。25〜28KD蛋白
質のほかに14〜16KD蛋白質が検出される。ニトロセルロ
ースに移した場合、両蛋白質はMab-30と反応する。
害剤の非存在下で保持する。例11に記載したようにして
サンプルを12％SDS-PAGEにより分離する。25〜28KD蛋白
質のほかに14〜16KD蛋白質が検出される。ニトロセルロ
ースに移した場合、両蛋白質はMab-30と反応する。
14.2 パパイン消化による 0.1mlの固定化されたパパイン（ピースケミカルス、沈
澱したゲルml当り7BAEEユニット）を20mM NaH2PO4/20mM
システイン−HCl/10mMEDTAを含有する緩衝液（pH6.2）
で前洗浄し、次に同じ緩衝液中例12.2の精製された25〜
28KD蛋白質に加える。混合物を37℃にて16時間揺動しな
がらインキュベートし、そして遠心分離して反応を停止
せしめる。上清は純粋な14〜16KD蛋白質（SDS-PAGEによ
り決定、例11）を含有し、このものはU937細胞上のでIg
Eコート赤血球のロゼットの形成を阻害する（例18及び
第７表）。
澱したゲルml当り7BAEEユニット）を20mM NaH2PO4/20mM
システイン−HCl/10mMEDTAを含有する緩衝液（pH6.2）
で前洗浄し、次に同じ緩衝液中例12.2の精製された25〜
28KD蛋白質に加える。混合物を37℃にて16時間揺動しな
がらインキュベートし、そして遠心分離して反応を停止
せしめる。上清は純粋な14〜16KD蛋白質（SDS-PAGEによ
り決定、例11）を含有し、このものはU937細胞上のでIg
Eコート赤血球のロゼットの形成を阻害する（例18及び
第７表）。
14.3 トリプシン消化による 0.05mlの不溶化されたトリプシン（シグマ、ml当り86BA
EEユニット）をリン酸緩衝液（pH8）により平衡化し、
次にリン酸緩衝液（pH8）中精製された放射性ラベルさ
れた25〜28KD蛋白質に加える。放射性ラベルされた25〜
28KD蛋白質は、例20においてモノクローナル抗体につい
て記載するように、125Iヨウ化ナトリウム及びクロラミ
ンＴによりヨード化することにより得られる。消化混合
物を30℃にて16時間揺動しながらインキュベートし、次
に遠心分離して反応を停止する。上清は14〜16KD蛋白質
を含有し、これはXAR-5X線フイルム（コダック）を用い
るオートラジオグラフィーにより検出される。
EEユニット）をリン酸緩衝液（pH8）により平衡化し、
次にリン酸緩衝液（pH8）中精製された放射性ラベルさ
れた25〜28KD蛋白質に加える。放射性ラベルされた25〜
28KD蛋白質は、例20においてモノクローナル抗体につい
て記載するように、125Iヨウ化ナトリウム及びクロラミ
ンＴによりヨード化することにより得られる。消化混合
物を30℃にて16時間揺動しながらインキュベートし、次
に遠心分離して反応を停止する。上清は14〜16KD蛋白質
を含有し、これはXAR-5X線フイルム（コダック）を用い
るオートラジオグラフィーにより検出される。
同様にして、放射性ラベルされた25〜28KD蛋白質を用い
てパパインによる消化を行う。
てパパインによる消化を行う。
第４図は、例11（RPMI8866）及び例15（初乳）の放射性
ラベルされた25〜28KD蛋白質のパパイン及びトリプシン
消化により得られた反応生成物について、0.1％TFA中５
〜75％アセトニトリルのグラジエントを用いるハイ−ポ
アRP-304カラム上での逆相HPLCの分析結果を示す。画分
No.の関数として１分間当りのカウント（cpm）が示され
ている。
ラベルされた25〜28KD蛋白質のパパイン及びトリプシン
消化により得られた反応生成物について、0.1％TFA中５
〜75％アセトニトリルのグラジエントを用いるハイ−ポ
アRP-304カラム上での逆相HPLCの分析結果を示す。画分
No.の関数として１分間当りのカウント（cpm）が示され
ている。
例15.初乳からのIgE-BFの生成 15.1 初乳調製物 15人の選択されない健康な志願者から、産後最初の２日
間の間に初乳を集める。サンプルをプロテアーゼ阻害剤
（1mMフェニルメチルスルホニルフルオリド、10mMベン
ズアミジン、50mMε−アミノカプロン酸及び0.1％EDT
A）により処理し、そしてすぐに−20℃で凍結する。３
個ずつのサンプルから成る５個のプールを平行して処理
する。これらを超遠心により澄明にし、そして次に塩酸
で酸性化（pH4.0）してカゼインを沈澱せしめる。カゼ
インを除去し、そして透明な上清を2M Trisにより中和
し、そして0.45μｍのフィルターを通す。アミコンXM50
膜（分子量カットオフ50KD）により濾過した後、サンプ
ルを蒸留水に対して透析し、そして凍結乾燥する。
間の間に初乳を集める。サンプルをプロテアーゼ阻害剤
（1mMフェニルメチルスルホニルフルオリド、10mMベン
ズアミジン、50mMε−アミノカプロン酸及び0.1％EDT
A）により処理し、そしてすぐに−20℃で凍結する。３
個ずつのサンプルから成る５個のプールを平行して処理
する。これらを超遠心により澄明にし、そして次に塩酸
で酸性化（pH4.0）してカゼインを沈澱せしめる。カゼ
インを除去し、そして透明な上清を2M Trisにより中和
し、そして0.45μｍのフィルターを通す。アミコンXM50
膜（分子量カットオフ50KD）により濾過した後、サンプ
ルを蒸留水に対して透析し、そして凍結乾燥する。
15.2 ゲルクロマトグラフィーによる前精製 40mgの凍結乾燥された初乳調製物（例15.1）を1.5mlの
緩衝液〔40mM NaCl、10mM Tris-HCl（pH8.0）、0.05％
トウィーン20、10mMε−アミノカプロン酸及び0.1％BS
A〕中に溶解し、そして目盛付セファデックスＧ−75カ
ラム（2.5×90cm）に適用する。10〜15、15〜20、20〜2
5、25〜30、30〜45、及び45〜60KDの分子量に相当する
画分をプールし、1.5mlに濃縮し、そしてハンス平衡塩
溶液（HBSS）に対して透析する。例18のIgE阻害試験に
より示されるように20〜30KDの分子量のポリペプチドの
画分がIgE-BFを含有する。段階15.1でプロテアーゼ阻害
剤を省略した場合、活性なIgE-BF蛋白質断片が10〜15KD
の分子量の画分に現われる。
緩衝液〔40mM NaCl、10mM Tris-HCl（pH8.0）、0.05％
トウィーン20、10mMε−アミノカプロン酸及び0.1％BS
A〕中に溶解し、そして目盛付セファデックスＧ−75カ
ラム（2.5×90cm）に適用する。10〜15、15〜20、20〜2
5、25〜30、30〜45、及び45〜60KDの分子量に相当する
画分をプールし、1.5mlに濃縮し、そしてハンス平衡塩
溶液（HBSS）に対して透析する。例18のIgE阻害試験に
より示されるように20〜30KDの分子量のポリペプチドの
画分がIgE-BFを含有する。段階15.1でプロテアーゼ阻害
剤を省略した場合、活性なIgE-BF蛋白質断片が10〜15KD
の分子量の画分に現われる。
15.3 Mab-94−アフィゲル上でのイムノファイニティー
クロマトグラフィーによる精製 初乳調製物（例15.1）又は10mg/mlの蛋白質を含有する
前精製したIgE-BF（例15.2）の溶液を、5ml/分の流速で
Mab-94−アフィゲル（例10）のカラム2mlに通す。ゲル
を、0.5M NaCl及び0.05％トウィーン20を補充した20容
量のPBS、５容量のPBS、及び５容量の0.9％NaClにより
次々に洗浄する。流化流の蛋白質含量をユビコード分光
光度計による280nmにおけるオン−ライン吸収によって
モニターして未結合蛋白質を完全に除去する。次に、カ
ラムを8mlの0.1Mグリシン−HCl（pH2.6）により溶出
し、そして蛋白質含有画分を一緒にする。
クロマトグラフィーによる精製 初乳調製物（例15.1）又は10mg/mlの蛋白質を含有する
前精製したIgE-BF（例15.2）の溶液を、5ml/分の流速で
Mab-94−アフィゲル（例10）のカラム2mlに通す。ゲル
を、0.5M NaCl及び0.05％トウィーン20を補充した20容
量のPBS、５容量のPBS、及び５容量の0.9％NaClにより
次々に洗浄する。流化流の蛋白質含量をユビコード分光
光度計による280nmにおけるオン−ライン吸収によって
モニターして未結合蛋白質を完全に除去する。次に、カ
ラムを8mlの0.1Mグリシン−HCl（pH2.6）により溶出
し、そして蛋白質含有画分を一緒にする。
この方法により得られたIgE-BFは多くの性質をRPMI8866
細胞上清からIgE-BF（例11）と共有するが、例24のラジ
オイムノアッセイにおいて明らかにされるようにMab-94
及びMab-135への結合に関しては異る。
細胞上清からIgE-BF（例11）と共有するが、例24のラジ
オイムノアッセイにおいて明らかにされるようにMab-94
及びMab-135への結合に関しては異る。
15.4 Mab-30−アフィゲルによる処理 例15.3の精製されたIgE-BFを、例15.3に記載したのと正
確に同じ方法により、Mab-30−アフィゲル（例10）のカ
ラム上で処理する。
確に同じ方法により、Mab-30−アフィゲル（例10）のカ
ラム上で処理する。
25〜28KDの溶出された蛋白質は今や次の試験においてRP
MI8866細胞上清から得られた25〜28KD蛋白質（例12）と
区別されない。
MI8866細胞上清から得られた25〜28KD蛋白質（例12）と
区別されない。
（１） 0.05M Tris-HCl中０〜0.5M NaClのグラジエン
トを用いるTSK545DEAEカラム（LKB）上でのイオン交換H
PLCにおいて、0.17M NaClにて溶出する。
トを用いるTSK545DEAEカラム（LKB）上でのイオン交換H
PLCにおいて、0.17M NaClにて溶出する。
（２） 0.1％TFA中５〜75％アセトニトリルのグラジエ
ントを用いるハイ−ポアRP-304カラム（ビオ−ラド）上
での逆相HPLCにおいて31％アセトニトリルにおいて溶出
する。
ントを用いるハイ−ポアRP-304カラム（ビオ−ラド）上
での逆相HPLCにおいて31％アセトニトリルにおいて溶出
する。
（３） SDSポリアクリルアミドゲル電気泳動；蛋白質
が約25〜28KDの分子量をもって移動する。
が約25〜28KDの分子量をもって移動する。
（４） パパイン又はトリプシンにより消化されたサン
プルについて、0.1％TFA中５〜75％アセトニトリルのグ
ラジエントを用いるハイ−ポアRP-304カラム上での逆相
HPLC上で観察されるペプチド断片パターンが同一である
（例14、第４図）。
プルについて、0.1％TFA中５〜75％アセトニトリルのグ
ラジエントを用いるハイ−ポアRP-304カラム上での逆相
HPLC上で観察されるペプチド断片パターンが同一である
（例14、第４図）。
（５） 25〜28KD蛋白質、又はパパイン消化後に得られ
る14〜16KD蛋白質を用いるIgEコートウシ赤血球によるU
937細胞のロゼット形成の阻害（例14）。
る14〜16KD蛋白質を用いるIgEコートウシ赤血球によるU
937細胞のロゼット形成の阻害（例14）。
（６） Mab-94又はMab-135を用いるラジオイムノアッ
セイにより示されるようにイムノアフィニティー性質が
同一である（例24）。
セイにより示されるようにイムノアフィニティー性質が
同一である（例24）。
例16.25〜28KD蛋白質におけるグリコシド結合の開裂 16.1 Ｎ−グルカナーゼによる 例15に従って精製された25〜28KD蛋白質（10μｌ、2.0m
g/ml）を0.5％SDS及び0.1Mβ−メルカプトエタノールの
存在で３分間煮沸する。サンプルを稀釈して0.2Mリン酸
ナトリウム緩衝液（pH8.6）、5.0mM EDTA及び1.25％NP-
40を得る。Ｎ−グルカナーゼ〔フラボバクテリウム・メ
ニンゴセプティクム（Flavobacterium meningosepticu
m）、ゲンチム社（Genzyme（orp.）、ボストン、MA〕を
添加して最終濃度10ユニット/mlとする。この混合物を3
0℃にて一夜インキュベートする。反応サンプルを例11
に記載したようにしてSDSポリアクリルアミドゲル電気
泳動により分析する。生ずる蛋白質は24〜26KDのわずか
に低下した見かけ分子量の位置に現われる。
g/ml）を0.5％SDS及び0.1Mβ−メルカプトエタノールの
存在で３分間煮沸する。サンプルを稀釈して0.2Mリン酸
ナトリウム緩衝液（pH8.6）、5.0mM EDTA及び1.25％NP-
40を得る。Ｎ−グルカナーゼ〔フラボバクテリウム・メ
ニンゴセプティクム（Flavobacterium meningosepticu
m）、ゲンチム社（Genzyme（orp.）、ボストン、MA〕を
添加して最終濃度10ユニット/mlとする。この混合物を3
0℃にて一夜インキュベートする。反応サンプルを例11
に記載したようにしてSDSポリアクリルアミドゲル電気
泳動により分析する。生ずる蛋白質は24〜26KDのわずか
に低下した見かけ分子量の位置に現われる。
16.2 Ｏ−グリコシダーゼによる 天然25〜28KD蛋白質（20μｇ）、又は放射性ラベルされ
た25〜28KD蛋白質（30,000cpm、例14.3）を、0.001M酢
酸カルシウム、10mMD−ガラクトン酸γ−ラクトン、0.0
2M Tris−マレート緩衝液及び１ユニット/mlのニューラ
ミニダーゼ（シグマ）を含有する混合物50μｌ中で、37
℃にて60分間インキュベートする。２〜４ミリユニット
のＯ−グリコシダーゼ〔ディプロコッカス・ニューモニ
ア（Diplococcus pneumoniae）、ゼンチム社〕を加
え、そしてインキュベーションを４時間続ける。反応サ
ンプルをSDS-PAGEにより単離する。生ずる蛋白質はやは
り24〜26KDの見かけ分子量を示す。
た25〜28KD蛋白質（30,000cpm、例14.3）を、0.001M酢
酸カルシウム、10mMD−ガラクトン酸γ−ラクトン、0.0
2M Tris−マレート緩衝液及び１ユニット/mlのニューラ
ミニダーゼ（シグマ）を含有する混合物50μｌ中で、37
℃にて60分間インキュベートする。２〜４ミリユニット
のＯ−グリコシダーゼ〔ディプロコッカス・ニューモニ
ア（Diplococcus pneumoniae）、ゼンチム社〕を加
え、そしてインキュベーションを４時間続ける。反応サ
ンプルをSDS-PAGEにより単離する。生ずる蛋白質はやは
り24〜26KDの見かけ分子量を示す。
例17.モノクローナル抗−IgE抗体へのIgEの結合の、精
製されたIgE-BFによるブロッキング ポリ塩化ビニルミクロタイタープレートのウイルを１μ
g/mlのヒトIgEに対して特異的なモノクローナル抗体
（クローン175）を含有するPBS200μｌと共にインキュ
ベートする。ミクロタイタープレート表面の遊離結合能
を、10％FCS及び0.1％ナトリウムアジドを含有するPBS
によりブロックする。例11の精製されたIgE-BFのPBS溶
液、IgE-BFを含有するRPMI8866細胞由来の100倍濃縮さ
れた培養上清、又は陰性対照として使用されるRPMI8826
細胞由来の溶液150mlを、６×104cpmの125IラベルIgE
（比活性2.5×104cpm/ng）を含有する50μｇのPBSと、
室温において一夜前インキュベートスル。100μｌのこ
の混合物を抗−IgE抗体がコートされているウエルに加
え、室温にて５時間インキュベートした後プレートを洗
浄し、そしてウエルに結合した放射能をベックマン−ガ
ンマ−カウンター中で測定する。
製されたIgE-BFによるブロッキング ポリ塩化ビニルミクロタイタープレートのウイルを１μ
g/mlのヒトIgEに対して特異的なモノクローナル抗体
（クローン175）を含有するPBS200μｌと共にインキュ
ベートする。ミクロタイタープレート表面の遊離結合能
を、10％FCS及び0.1％ナトリウムアジドを含有するPBS
によりブロックする。例11の精製されたIgE-BFのPBS溶
液、IgE-BFを含有するRPMI8866細胞由来の100倍濃縮さ
れた培養上清、又は陰性対照として使用されるRPMI8826
細胞由来の溶液150mlを、６×104cpmの125IラベルIgE
（比活性2.5×104cpm/ng）を含有する50μｇのPBSと、
室温において一夜前インキュベートスル。100μｌのこ
の混合物を抗−IgE抗体がコートされているウエルに加
え、室温にて５時間インキュベートした後プレートを洗
浄し、そしてウエルに結合した放射能をベックマン−ガ
ンマ−カウンター中で測定する。
RPMI8866細胞からの細胞上清及び例11の精製されたIgE-
BFは、幾つかの実験において、陰性対照（RPMI8226細胞
上清）と比較した場合、放射性ラベルされたIgEの結合
をそれぞれ50％及び75％阻害する。
BFは、幾つかの実験において、陰性対照（RPMI8226細胞
上清）と比較した場合、放射性ラベルされたIgEの結合
をそれぞれ50％及び75％阻害する。
ヒトIgEに対して特異的なモノクローナル抗体は例１に
記載したのと同様の常法に従って製造する。Balb/cマウ
スを完全フロインドアジュバント中50μｇのIgE PSによ
り２週間の間隔で２回免疫感作し、最後の注射から２週
間後に、さらに塩溶液中50μｇのIgEを注射する。３日
後に、脾細胞をNSI/1−Ag4/1骨髄腫細胞と融合せしめ
る。IgE及びIgGでコートされたポリ塩化ビニルミクロタ
イタープレート、及びラベルされたヤギ抗マウスIgGを
用いてRIAによりクローンを選択する。モノクローナル
抗体はIgEの熱感受性領域中の決定基に特異的である。
記載したのと同様の常法に従って製造する。Balb/cマウ
スを完全フロインドアジュバント中50μｇのIgE PSによ
り２週間の間隔で２回免疫感作し、最後の注射から２週
間後に、さらに塩溶液中50μｇのIgEを注射する。３日
後に、脾細胞をNSI/1−Ag4/1骨髄腫細胞と融合せしめ
る。IgE及びIgGでコートされたポリ塩化ビニルミクロタ
イタープレート、及びラベルされたヤギ抗マウスIgGを
用いてRIAによりクローンを選択する。モノクローナル
抗体はIgEの熱感受性領域中の決定基に特異的である。
例18.RPMI8866細胞又は937細胞へのIgEの結合のIgE-BF
による阻害 ウシ赤血球を、最適濃度より低い濃度の精製されたIgE
PS（K.Ishizak博士、ジョン・ホプキンス大学、バルチ
モア、MDより）によりコートする。コートされた赤血球
を対照緩衝液（HBSS-BSA）又は試験溶液と共に４℃にて
60分間前インキュベートする。RPMI8866細胞又はU937細
胞を加える。この調製物を90xgにて遠心し、そして４℃
にて２時間インキュベートする。例９に記載したよう
に、アクリジンオレンジを添加した後、細胞を蛍光顕微
鏡下で観察する。
による阻害 ウシ赤血球を、最適濃度より低い濃度の精製されたIgE
PS（K.Ishizak博士、ジョン・ホプキンス大学、バルチ
モア、MDより）によりコートする。コートされた赤血球
を対照緩衝液（HBSS-BSA）又は試験溶液と共に４℃にて
60分間前インキュベートする。RPMI8866細胞又はU937細
胞を加える。この調製物を90xgにて遠心し、そして４℃
にて２時間インキュベートする。例９に記載したよう
に、アクリジンオレンジを添加した後、細胞を蛍光顕微
鏡下で観察する。
精製されたIgE PS、又はゲル1ml当り4mg蛋白質でセファ
ロース4BにカップリングしたポリクローナルIgGを用い
て、例11又は15に記載したのと同様にしてアフィニティ
ークロマトグラフィー実験を行う。流出液（濾液）及び
溶出液をサンプルの最初の容量に濃縮しそしてただちに
中和し、そしてHBSSに対して透析する。
ロース4BにカップリングしたポリクローナルIgGを用い
て、例11又は15に記載したのと同様にしてアフィニティ
ークロマトグラフィー実験を行う。流出液（濾液）及び
溶出液をサンプルの最初の容量に濃縮しそしてただちに
中和し、そしてHBSSに対して透析する。
例19.Mab-135のＦ（ab′）2断片とビオチンとの接合体
の調製 Mab-135の精製されたＦ（ab′）2断片を1.0mg/mlにおい
てIM NaHCO3に対して一夜透析する。pHをチェックし、
そして8.2〜8.6の間であることが見出される。ビデオチ
ンサクシンイミドエステル（ビオサーチ）を使用直前に
DMSOに1.0mg/mlの濃度で溶解する。この溶液0.6mlを抗
体断片溶液に添加し、すぐに混合し、そして室温に４時
間置く。反応混合物を10mmoleのナトリウムアジドを含
有するPBSに対して一夜透析し、次に凍蔵庫に貯蔵す
る。
の調製 Mab-135の精製されたＦ（ab′）2断片を1.0mg/mlにおい
てIM NaHCO3に対して一夜透析する。pHをチェックし、
そして8.2〜8.6の間であることが見出される。ビデオチ
ンサクシンイミドエステル（ビオサーチ）を使用直前に
DMSOに1.0mg/mlの濃度で溶解する。この溶液0.6mlを抗
体断片溶液に添加し、すぐに混合し、そして室温に４時
間置く。反応混合物を10mmoleのナトリウムアジドを含
有するPBSに対して一夜透析し、次に凍蔵庫に貯蔵す
る。
例20.125Iラベル化抗体Mab-135の調製 40μｇのMab-135を、F.C.Greenwood等、Biochem.J.89、
114（1963）の一般的方法に従って0.5mCiの125Iヨウ化
ナトリウム及びクロラミンＴでヨード化する。反応生成
物をイオン交換樹脂ビオラドAgI×８上でのクロマトグ
ラフィーにより精製する。このものは20,000cpm/ngの比
活性を有する。
114（1963）の一般的方法に従って0.5mCiの125Iヨウ化
ナトリウム及びクロラミンＴでヨード化する。反応生成
物をイオン交換樹脂ビオラドAgI×８上でのクロマトグ
ラフィーにより精製する。このものは20,000cpm/ngの比
活性を有する。
同様にして125Iラベル抗体Mab-176及びMab-94を調製す
る。
る。
例21.細胞上清及び血清中のIgE-BFの検出のためのラジ
オイムノアッセイ ポリ塩化ビニルミクロタイタープレートのウエルを15μ
g/mlのMab-176を含有する0.01M酢酸緩衝液（pH9）150μ
ｌと共に室温にて一夜インキュベートする。次に、プレ
ートを洗浄し、そして室温にて２時間、10％ウシ胎児血
清を含有するハンクの平衡塩溶液（HBSS-FCS）200μｌ
と反応せしめ、そして再度洗浄しそして100μｌの試験
サンプルと共に室温にて４時間インキュベートする。HB
SS-FCSを用いてブランクを決定する。プレートを洗浄
し、そして125I−Mab-135（HBSS-FCS中２〜４×105cp
m、例20）と共に室温にて一夜インキュベートし、次に
洗浄しそしてガンマーカウンターで計数する。すべての
洗浄はPBS〔（0.15Mリン酸緩衝化塩溶液（pH7.2）〕を
用いて行う。
オイムノアッセイ ポリ塩化ビニルミクロタイタープレートのウエルを15μ
g/mlのMab-176を含有する0.01M酢酸緩衝液（pH9）150μ
ｌと共に室温にて一夜インキュベートする。次に、プレ
ートを洗浄し、そして室温にて２時間、10％ウシ胎児血
清を含有するハンクの平衡塩溶液（HBSS-FCS）200μｌ
と反応せしめ、そして再度洗浄しそして100μｌの試験
サンプルと共に室温にて４時間インキュベートする。HB
SS-FCSを用いてブランクを決定する。プレートを洗浄
し、そして125I−Mab-135（HBSS-FCS中２〜４×105cp
m、例20）と共に室温にて一夜インキュベートし、次に
洗浄しそしてガンマーカウンターで計数する。すべての
洗浄はPBS〔（0.15Mリン酸緩衝化塩溶液（pH7.2）〕を
用いて行う。
IgE-BFを含有するFcεＲ担持細胞由来の培養上清は、バ
ックグラウンド（0.5％）を越える125I−Mab-135の有意
な結合をもたらす。これに対して、IgE-BFを含有しない
培養上清は陰性結果をもたらす（第８表）。細胞上清中
のIgE-BFの存在又は不存在は例18において記載したロゼ
ット阻害アッセイにより確認される。RIAは、Mab-30上
でのイムノアフィニティークロマトグラフィー（例15.
4）の後のほか、ヒト初乳からのIgE-BFを検出しない。
ックグラウンド（0.5％）を越える125I−Mab-135の有意
な結合をもたらす。これに対して、IgE-BFを含有しない
培養上清は陰性結果をもたらす（第８表）。細胞上清中
のIgE-BFの存在又は不存在は例18において記載したロゼ
ット阻害アッセイにより確認される。RIAは、Mab-30上
でのイムノアフィニティークロマトグラフィー（例15.
4）の後のほか、ヒト初乳からのIgE-BFを検出しない。
第５図は、IgE-BFを含有するRPMI8866細胞由来の参照培
養上清の一連の２倍稀釈により得られる標準曲線であ
る。アッセイの感度は、標準の1/50,000稀釈においてな
おIgE-BFを検出する程度である。この標準曲線は、結合
した放射能が、１〜1000の濃度範囲において試験された
溶液中に存在するIgE-BFの濃度に直線的に依存すること
を示している。
養上清の一連の２倍稀釈により得られる標準曲線であ
る。アッセイの感度は、標準の1/50,000稀釈においてな
おIgE-BFを検出する程度である。この標準曲線は、結合
した放射能が、１〜1000の濃度範囲において試験された
溶液中に存在するIgE-BFの濃度に直線的に依存すること
を示している。
Ｂ細胞上清中に見出されるようなIgE-BFについての前記
のRIAの特異性の他の証明は、IgE-BFを含有することが
知られているRPMI8866細胞上清をそれぞれIgE-セファロ
ース、IgG−セファロース又はエタノールアミン−セフ
ァロースで前処理する実験から得られる。結合した放射
性ラベルされたMabの明瞭な減少（４回の異る実験にお
いて57〜80％）がIgE−セファロースで処理された細胞
上清のRIAにおいて観察されるが、IgG−セファロースに
より又はエタノールアミン−セファロースにより処理さ
れた細胞上清については有意な低下が見られない。IgE
−セファロースに結合したIgE-BFは０−0.1Mグリシン−
塩酸（pH2.6）を用いる溶出により回収しそしてRIAによ
り検出することができる。固体担体にカップリングした
IgEの親和性は低いため、IgE-セファロース上のIgE-BF
の吸着は完全ではない。
のRIAの特異性の他の証明は、IgE-BFを含有することが
知られているRPMI8866細胞上清をそれぞれIgE-セファロ
ース、IgG−セファロース又はエタノールアミン−セフ
ァロースで前処理する実験から得られる。結合した放射
性ラベルされたMabの明瞭な減少（４回の異る実験にお
いて57〜80％）がIgE−セファロースで処理された細胞
上清のRIAにおいて観察されるが、IgG−セファロースに
より又はエタノールアミン−セファロースにより処理さ
れた細胞上清については有意な低下が見られない。IgE
−セファロースに結合したIgE-BFは０−0.1Mグリシン−
塩酸（pH2.6）を用いる溶出により回収しそしてRIAによ
り検出することができる。固体担体にカップリングした
IgEの親和性は低いため、IgE-セファロース上のIgE-BF
の吸着は完全ではない。
例22.初乳及び血清中のIgE-BFの検出のためのラジオイ
ムノアッセイ ポリ塩化ビニルミクロタイタープレートのウエルを、15
μg/mlのMab-94を含有する0.01M炭酸緩衝液（pH9）100
μｌと共に室温にて一夜インキュベートする。次に、プ
レートを洗浄し、そして室温にて２時間、10％ウシ胎児
血清を含有するハンクの平衡塩溶液（HBSS-FCS）150μ
ｌと反応せしめ、次に再度洗浄し、そして100μｌの試
験サンプルと共に室温にて一夜インキュベートする。HB
SS-FCSを用いてブランクを決定する。プレートを洗浄
し、そしてHBSS-FCS中125I‐Mab-94（３×105cpm/ウエ
ル、例20）100μｌと共に室温にて一夜インキュベート
し、次に洗浄し、そしてガンマーカウンターで計数す
る。すべての洗浄はPBS（0.15Mリン酸緩衝化塩溶液、pH
7.2）により行う。
ムノアッセイ ポリ塩化ビニルミクロタイタープレートのウエルを、15
μg/mlのMab-94を含有する0.01M炭酸緩衝液（pH9）100
μｌと共に室温にて一夜インキュベートする。次に、プ
レートを洗浄し、そして室温にて２時間、10％ウシ胎児
血清を含有するハンクの平衡塩溶液（HBSS-FCS）150μ
ｌと反応せしめ、次に再度洗浄し、そして100μｌの試
験サンプルと共に室温にて一夜インキュベートする。HB
SS-FCSを用いてブランクを決定する。プレートを洗浄
し、そしてHBSS-FCS中125I‐Mab-94（３×105cpm/ウエ
ル、例20）100μｌと共に室温にて一夜インキュベート
し、次に洗浄し、そしてガンマーカウンターで計数す
る。すべての洗浄はPBS（0.15Mリン酸緩衝化塩溶液、pH
7.2）により行う。
第６図は、Mab-94及び125I‐Mab-94を用いるRIAが初乳
及び血清中のIgE-BFの検出のために有用であり、1/32ま
での稀釈について直線的依存性を示すことを証明してい
る。このRIAは100μg/mlまでの他のクラスの免疫グロブ
リン、すなわちIgG、IgM、IgA、IgE及びIgDにより影響
を受けない。Mab-94は、Mab-30上でのイムノアフィニテ
ィークロマトグラフィー（例15.4）後、RPMI8866細胞上
清中に見出されるようなIgE-BF及び初乳由来のIgE-BFを
検出しない。
及び血清中のIgE-BFの検出のために有用であり、1/32ま
での稀釈について直線的依存性を示すことを証明してい
る。このRIAは100μg/mlまでの他のクラスの免疫グロブ
リン、すなわちIgG、IgM、IgA、IgE及びIgDにより影響
を受けない。Mab-94は、Mab-30上でのイムノアフィニテ
ィークロマトグラフィー（例15.4）後、RPMI8866細胞上
清中に見出されるようなIgE-BF及び初乳由来のIgE-BFを
検出しない。
上記のRIAの選択性は、IgE-セファロース上に吸着され
た初乳調製物からの溶出液が容易に検出され、他方IgG
−セファロースに吸着した初乳調製物からの対照溶出液
が反応しない事実からも証明される。
た初乳調製物からの溶出液が容易に検出され、他方IgG
−セファロースに吸着した初乳調製物からの対照溶出液
が反応しない事実からも証明される。
例23.IgE-BF用RIAのための試験キット 例21又は22に記載したラジオイムノアッセイ用試験キッ
トは次のものを含有する。
トは次のものを含有する。
◎ ポリ塩化ビニルミクロタイタープレート ◎ Mab-176又はMab-94の溶液 （10μg/ml） 20ml ◎ 125Iラベル化Mab-135又はMab-94の溶液（比活性６
×106cpm/ml） 20ml ◎ 0.02M炭酸緩衝液（pH9） 20ml ◎ 10％FCSを含有するハンクの平衡塩溶液 100ml ◎ PBS 200ml ◎ IgE-BFを含有するRPMI8866細胞の細胞上清又は初乳
調製物 （参照溶液） 2ml ◎ 標準曲線。
×106cpm/ml） 20ml ◎ 0.02M炭酸緩衝液（pH9） 20ml ◎ 10％FCSを含有するハンクの平衡塩溶液 100ml ◎ PBS 200ml ◎ IgE-BFを含有するRPMI8866細胞の細胞上清又は初乳
調製物 （参照溶液） 2ml ◎ 標準曲線。
例24.由来を異にするIgE-BF及び処理段階を異にするIgE
-BFに対するMabの選択性 RPMI8866細胞からの培養上清を1:10で稀釈する。このも
のは、例21のRIAにおいて125I‐Mab-135の7.5％を結合
し、しかし例22のRIA中125I‐Mab-94の結合は０％であ
ることが見出される。サンプルをMab-135−アフィゲル
を通して濾過する（例10）。濾液は125I‐Mab-135を結
合しない（０％）が、溶出液（0.1Mグリシン−HCl、pH
2.6）は8.5％の125I‐Mab-135を結合する。同じ量のサ
ンプルをMab-94−アフィゲルのカラムを通して濾過す
る。濾液は6.9％の125I‐Mab-135を結合し、他方酸溶出
液はIgE-BFを含有しない（結合０％）。実験を通して、
濾液及び溶出液は同一容量に調製して比較を可能にす
る。全カウントは約3.5×105cpmである。
-BFに対するMabの選択性 RPMI8866細胞からの培養上清を1:10で稀釈する。このも
のは、例21のRIAにおいて125I‐Mab-135の7.5％を結合
し、しかし例22のRIA中125I‐Mab-94の結合は０％であ
ることが見出される。サンプルをMab-135−アフィゲル
を通して濾過する（例10）。濾液は125I‐Mab-135を結
合しない（０％）が、溶出液（0.1Mグリシン−HCl、pH
2.6）は8.5％の125I‐Mab-135を結合する。同じ量のサ
ンプルをMab-94−アフィゲルのカラムを通して濾過す
る。濾液は6.9％の125I‐Mab-135を結合し、他方酸溶出
液はIgE-BFを含有しない（結合０％）。実験を通して、
濾液及び溶出液は同一容量に調製して比較を可能にす
る。全カウントは約3.5×105cpmである。
対応する実験において、1:5で稀釈された初乳は2.6％の
125I‐Mab-94を結合するが、しかし125I‐Mab-135の結
合は０％であることが見出される。Mab-94−アフィゲル
上での吸着の後、125I‐Mab-94の結合は濾液において０
％であり、他方4.5％が酸溶出液において結合される。
無関係のMab（例えば、プロラクチンに対するMab）にカ
ップリングしたアフィゲル上での吸着の後、1.07％の
125I‐Mab-94が濾液において結合され、他方溶出液にお
ける結合は０％である。
125I‐Mab-94を結合するが、しかし125I‐Mab-135の結
合は０％であることが見出される。Mab-94−アフィゲル
上での吸着の後、125I‐Mab-94の結合は濾液において０
％であり、他方4.5％が酸溶出液において結合される。
無関係のMab（例えば、プロラクチンに対するMab）にカ
ップリングしたアフィゲル上での吸着の後、1.07％の
125I‐Mab-94が濾液において結合され、他方溶出液にお
ける結合は０％である。
しかしながら、Mab-94−アフィゲル上で精製された初乳
由来のIgE-BFがMab-30−アフィゲル上に吸着される場合
（例15.4）、濾液は0.2％の125I‐Mab-135及び0.6％の
125I‐Mab-94を結合し、そして今度は溶出液は2.56％の
125I‐Mab-135を結合するがしかし125I‐Mab-94の結合
は０％である。Mab−94−アフィゲル上で精製されてい
ない他の初乳調製物は125I‐Mab-135の０％の結合及び
125I‐Mab-94の5.75％の結合をもたらす。Mab-30−アフ
ィゲルへの吸収後、濾液は８％の125I‐Mab-135及び1.9
5％の125I‐Mab-94を結合し、そして溶出液は6.4％の
125I‐Mab-135及び0.13％のＩ−Mab-94を結合する。
由来のIgE-BFがMab-30−アフィゲル上に吸着される場合
（例15.4）、濾液は0.2％の125I‐Mab-135及び0.6％の
125I‐Mab-94を結合し、そして今度は溶出液は2.56％の
125I‐Mab-135を結合するがしかし125I‐Mab-94の結合
は０％である。Mab−94−アフィゲル上で精製されてい
ない他の初乳調製物は125I‐Mab-135の０％の結合及び
125I‐Mab-94の5.75％の結合をもたらす。Mab-30−アフ
ィゲルへの吸収後、濾液は８％の125I‐Mab-135及び1.9
5％の125I‐Mab-94を結合し、そして溶出液は6.4％の
125I‐Mab-135及び0.13％のＩ−Mab-94を結合する。
例25.IgE-BFの検出のための酵素イムノアッセイ（ELIS
A） ポリ塩化ビニルミクロタイタープレートのウエルを例21
に記載したようにMab-176でコートしそしてHBSS-FCSに
よりブロックする。プレートを100μｌの試験サンプル
と共に室温にて４時間インキュベートし、次に洗浄しそ
して例19のMab-135断片ビオチン接合体（10μg/ml）と
共に室温にて４時間インキュベートする。プレートをPB
Sで洗浄し、そしてアビジン−ホースラディッシュパー
オキシダーゼ接合体（シグマ）の1/3000稀釈物（0.3μg
/ml）と共に室温にて一夜インキュベートする。結合し
た酵素の量を、2,2′−アジノ−ビス−（３−エチルベ
ンゾチアゾリン−６−スルホン酸）ジアンモニウム塩
〔ABTS:ベーリンガーマンハイム、100mlのサイトレート
／ホスフェート緩衝液（0.05Mサイトレート/0.1M Na2HP
O4、pH4.0）、16μｌの30％H2O2を含有中55mg）による
発色、及び405nmにおける光度測定により決定する。
A） ポリ塩化ビニルミクロタイタープレートのウエルを例21
に記載したようにMab-176でコートしそしてHBSS-FCSに
よりブロックする。プレートを100μｌの試験サンプル
と共に室温にて４時間インキュベートし、次に洗浄しそ
して例19のMab-135断片ビオチン接合体（10μg/ml）と
共に室温にて４時間インキュベートする。プレートをPB
Sで洗浄し、そしてアビジン−ホースラディッシュパー
オキシダーゼ接合体（シグマ）の1/3000稀釈物（0.3μg
/ml）と共に室温にて一夜インキュベートする。結合し
た酵素の量を、2,2′−アジノ−ビス−（３−エチルベ
ンゾチアゾリン−６−スルホン酸）ジアンモニウム塩
〔ABTS:ベーリンガーマンハイム、100mlのサイトレート
／ホスフェート緩衝液（0.05Mサイトレート/0.1M Na2HP
O4、pH4.0）、16μｌの30％H2O2を含有中55mg）による
発色、及び405nmにおける光度測定により決定する。
同様にして、Mab-94を用いてプレートをコートし、そし
てMab-94ビオチン接合体を用いて初乳由来のIgE-BFを検
出することができる。
てMab-94ビオチン接合体を用いて初乳由来のIgE-BFを検
出することができる。
例26.IgE-BF用ELISAのための試験キット 例25に記載したILISAのための試験キットは次のものを
含む。
含む。
◎ ポリ塩化ビニルミクロタイタープレート。
◎ Mab-176の溶液（10μg/ml） 20ml ◎ Mab-135断片ビオチン接合体の溶液 （20μg/ml） 20ml ◎0.02M炭酸緩衝液（pH9） 20ml ◎ 10％FCSを含有するハンクの平衡塩溶液 100ml ◎ 凍結乾燥されたアビジン−ホースラディッシュパー
オキシダーゼ接合体 1mg ◎ ABTS 11mg ◎ サイトレート／ホスフェート緩衝液 （0.05Mサイトレート/0.1M Na2HPO4） 20ml ◎ 30％H2O2 1ml ◎ PBS 200ml ◎ IgE-BFを含有する参照溶液 2ml。
オキシダーゼ接合体 1mg ◎ ABTS 11mg ◎ サイトレート／ホスフェート緩衝液 （0.05Mサイトレート/0.1M Na2HPO4） 20ml ◎ 30％H2O2 1ml ◎ PBS 200ml ◎ IgE-BFを含有する参照溶液 2ml。
例27.医薬製剤（非経腸投与用） アフィニティークロマトグラフィーにより精製されたIg
E-BF（例えば11又は15）100mgを600mlの5Nヒト血清アル
ブミンに溶解する。生じた溶液を細菌学的フィルターに
通し、そして濾過された溶液を無菌条件下で100個のバ
イアルに分配して各バイアルが1mgの活性成分を含むよ
うにする。この非経腸的投与に適するバイアルは、好ま
しくは冷所、例えば−20℃において貯蔵する。
E-BF（例えば11又は15）100mgを600mlの5Nヒト血清アル
ブミンに溶解する。生じた溶液を細菌学的フィルターに
通し、そして濾過された溶液を無菌条件下で100個のバ
イアルに分配して各バイアルが1mgの活性成分を含むよ
うにする。この非経腸的投与に適するバイアルは、好ま
しくは冷所、例えば−20℃において貯蔵する。
同様にして、100mgの凍結乾燥された25〜28KD蛋白質を
用いて、1mgの25〜28KD蛋白質（例11又は15）を含むバ
イアルを調製することができる。
用いて、1mgの25〜28KD蛋白質（例11又は15）を含むバ
イアルを調製することができる。
第１図は、（Ａ）IgEでコートされたラテックス粒子又
は（Ｂ）ウシ胎児血清でコートされたラテックス粒子と
反応するRPMI8866細胞の蛍光ヒストグラムである。ラベ
ル化の程度はチャンネル数の関数としてチャンネル当り
の細胞数として定量化され、それ自体が蛍光強度の対数
の関数である。詳細は例３に記載されている。 第２図は、選択されたハイブリドーマ細胞培養上清中の
FcεＲに対する抗体の存在を示す代表的な蛍光ヒストグ
ラムである。詳細は例３に記載されている。 第３図は、RPMI8866細胞への４種類の異なるモノクロー
ナル抗体の結合を阻害するIgE（10μg/ml又は100μg/ml
の濃度における）の能力を示す蛍光ヒストグラムであ
る。lgGは効果を有しない。詳細は例７に記載されてい
る。 第４図は、それぞれRPMI8866細胞及び初乳由来の放射性
ラベルされた25〜28KD蛋白質のパパイン及びトリプシン
消化の後に得られた反応生成物の逆相HPLCの分析結果を
示す。この実験は、両由来の処理された25〜28KD蛋白質
の同一性を示している。 第５図は、例21に記載したラジオイムノアッセイにより
測定した場合の、IgE-BFを含有するRPMI8866細胞由来参
照培養上清の一連の２倍稀釈により得られる標準曲線を
示す。 第６図は、例22に記載したラジオイムノアッセイにより
測定した場合の、異るサンプルの一連の２倍稀釈により
得られた曲線を示す。この図は、Ｂ細胞上清からのIgE-
BF又は異るクラスの免疫グロブリンと比較した場合の、
初乳及び血清中のIgE-BFについてのアッセイの選択性を
示している。
は（Ｂ）ウシ胎児血清でコートされたラテックス粒子と
反応するRPMI8866細胞の蛍光ヒストグラムである。ラベ
ル化の程度はチャンネル数の関数としてチャンネル当り
の細胞数として定量化され、それ自体が蛍光強度の対数
の関数である。詳細は例３に記載されている。 第２図は、選択されたハイブリドーマ細胞培養上清中の
FcεＲに対する抗体の存在を示す代表的な蛍光ヒストグ
ラムである。詳細は例３に記載されている。 第３図は、RPMI8866細胞への４種類の異なるモノクロー
ナル抗体の結合を阻害するIgE（10μg/ml又は100μg/ml
の濃度における）の能力を示す蛍光ヒストグラムであ
る。lgGは効果を有しない。詳細は例７に記載されてい
る。 第４図は、それぞれRPMI8866細胞及び初乳由来の放射性
ラベルされた25〜28KD蛋白質のパパイン及びトリプシン
消化の後に得られた反応生成物の逆相HPLCの分析結果を
示す。この実験は、両由来の処理された25〜28KD蛋白質
の同一性を示している。 第５図は、例21に記載したラジオイムノアッセイにより
測定した場合の、IgE-BFを含有するRPMI8866細胞由来参
照培養上清の一連の２倍稀釈により得られる標準曲線を
示す。 第６図は、例22に記載したラジオイムノアッセイにより
測定した場合の、異るサンプルの一連の２倍稀釈により
得られた曲線を示す。この図は、Ｂ細胞上清からのIgE-
BF又は異るクラスの免疫グロブリンと比較した場合の、
初乳及び血清中のIgE-BFについてのアッセイの選択性を
示している。
フロントページの続き (56)参考文献 Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｖｏｌ．53Ｐ．197− 205 Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｖｏｌ．53Ｐ．207− 214 Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｖｏｌ．53Ｐ．783− 790 日本化学会編「新実験化学講座20生物化 学▲Ｉ▼」（昭53−６−20）丸善Ｐ．54− 56
Claims (9)
- 【請求項１】免疫グロブリンＥ（IgE）抑制因子（IgE-S
F）活性を有する実質的に純粋なヒト免疫グロブリンＥ
結合因子（IgE-BF）であって、 （１） IgEのためのリンパ球リセプター（FcεＲ）に
対するモノクローナル抗体により認識されそして結合さ
れるヒト由来の場合によってグリコシル化されている蛋
白質を含有し、 （２） SDSポリアクリルアミドゲル電気泳動（SDS-PAG
E）により測定する場合25〜28KD（キロ−ダルトン、kg/
mole）の概略見かけ分子量を有する分子、及び場合によ
っては、FcεＲに対して特異的なモノクローナル抗体に
結合する他の蛋白質から成り、 （３） アガロースゲル結合IgEへの吸着及びそこから
の可能な回収により決定する場合、IgEに可逆的に結合
し、 （４） FcεＲを発現するRPMI8866細胞へのIgE被覆ラ
テックス粒子の結合の阻害により決定する場合、IgEの
ためのリセプターを担持する細胞へのIgEの結合をブロ
ックし、 （５） 放射能標識されたIgE及びそれに対するモノク
ローナル抗体であってマイクロタイタープレート上に固
定されたものを用いて決定する場合、IgEに対して特異
的なモノクローナル抗体へのIgEの結合をブロックし、
そして （６） IgEのためのリセプターを発現するヒトＢ細胞
（FcεＲ＋）の培養上清又はヒト初乳中に存在する、 ことを特徴とする当該IgE-BF; 前記IgE-BFの場合によってはグリコシル化されている個
々の蛋白質；あるいは前記の場合によってはグリコシル
化されている個々の蛋白質の断片であって、 （１） IgEのためのリンパ球リセプター（FcεＲ）に
対するモノクローナル抗体により認識されそして結合さ
れ、 （２） アガロースゲル結合IgEへの吸着及びそこから
の可能な回収により決定する場合、IgEに可逆的に結合
し、 （３） FcεＲを発現するRPMI8866細胞へのIgE被覆ラ
テックス粒子の結合の阻害により決定する場合、IgEの
ためのリセプターを担持する細胞へのIgEの結合をブロ
ックし、 （４） 放射能標識されたIgE及びそれに対するモノク
ローナル抗体であってマイクロタイタープレート上に固
定されたものを用いて決定する場合、IgEに対して特異
的なモノクローナル抗体へのIgEの結合をブロックし、 （５） SDS-PAGE又はゲル濾過高圧液体クロマトグラフ
ィーのごとき蛋白質分析の常法に従えば均一であり、そ
して （６） SDS-PAGEにより測定する場合、10〜20KDの見か
け分子量を有する、 ことを特徴とする当該断片。 - 【請求項２】SDS-PAGEにより決定する場合25〜28KDの概
略見かけ分子量を有し、そして次のようなおよその範囲
の全アミノ酸組成：アスパラギン酸／アスパラギン19〜
23、グルタミン酸／グルタミン25〜31、セリン22〜26、
スレオニン８〜10、グリシン15〜25、アラニン16〜20、
アルギニン10〜12、プロリン13〜16、バリン10〜12、メ
チオニン３〜５、イソロイシン７〜９、ロイシン13〜1
7、トリプトファン０、フェニルアラニン６〜９、シス
テイン３〜４、リジン８〜10、ヒスチジン４〜５、及び
チロシン６〜８を有することを特徴とする請求項１に記
載の、場合によってはグリコシル化されている蛋白質。 - 【請求項３】208.25A.4.3/135と称するモノクローナル
抗体により結合されるが、しかし、208.25D.2/94と称す
るモノクローナル抗体によっては有意な程度に結合され
ないことを特徴とする請求項１に記載の、場合によって
はグリコシル化されている蛋白質。 - 【請求項４】208.25D.2/94と称するモノクローナル抗体
によって結合されるが、しかし208.25A.4.3/135と称す
るモノクローナル抗体によっては有意な程度には結合さ
れないことを特徴とする請求項１に記載の、場合によっ
てはグリコシル化されている蛋白質。 - 【請求項５】場合によってはグリコシル化されている個
々のIgE-BF蛋白質の部分的酵素消化により得られる、請
求項１に記載のIgE-BFの断片。 - 【請求項６】SDS-PAGEにより測定する場合、14〜16KDの
見かけ分子量を有する、請求項１に記載のIgE-BFの断
片。 - 【請求項７】免疫グロブリンＥ（IgE）抑制因子（IgE-S
F）活性を有する実質的に純粋なヒト免疫グロブリンＥ
結合因子（IgE-BF）であって、 （１） IgEのためのリンパ球リセプター（FcεＲ）に
対するモノクローナル抗体により認識されそして結合さ
れるヒト由来の場合によってはグリコシル化されている
蛋白質を含有し、 （２） SDSポリアクリルアミドゲル電気泳動（SDS-PAG
E）により測定する場合25〜28KD（キロ−ダルトン、kg/
mole）の概略見かけ分子量を有する分子、及び場合によ
ってはFcεＲに対して特異的なモノクローナル抗体に結
合する他の蛋白質から成り、 （３） アガロースゲル結合IgEへの吸着及びそこから
の可能な回収により決定する場合、IgEに可逆的に結合
し、 （４） FcεＲを発現するRPMI8866細胞へのIgE被覆ラ
テックス粒子の結合の阻害により決定する場合、IgEの
ためのリセプターを担持する細胞へのIgEの結合をブロ
ックし、 （５） 放射能標識されたIgE及びそれに対するモノク
ローナル抗体であってマイクロタイタープレート上に固
定されたものを用いて決定する場合、IgEに対して特異
的なモノクローナル抗体へのIgEの結合をブロックし、
そして （６） IgEのためのリセプターを発現するヒトＢ細胞
（FcεＲ+）の培養上清又はヒト初乳中に存在する、 ことを特徴とする当該IgE-BF; 前記IgE-BFの場合によってはグリコシル化されている個
々の蛋白質；あるいは 前記の場合によってはグリコシル化されている個々の蛋
白質の断片であって、 （１） IgEのためのリンパ球リセプター（FcεＲ）に
対するモノクローナル抗体により認識されそして結合さ
れ、 （２） アガロースゲル結合IgEへの吸着及びそこから
の可能な回収により決定する場合、IgEに可逆的に結合
し、 （３） FcεＲを発現するRPMI8866細胞へのIgE被覆ラ
テックス粒子の結合の阻害により決定する場合、IgEの
ためのリセプターを担持する細胞へのIgEの結合をブロ
ックし、 （４） 放射能標識されたIgE及びそれに対するモノク
ローナル抗体であってマイクロタイタープレート上に固
定されたものを用いて決定する場合、IgEに対して特異
的なモノクローナル抗体へのIgEの結合をブロックし、 （５） SDS-PAGE又はゲル濾過高圧液体クロマトグラフ
ィーのごとき蛋白質分析の常法に従えば均一であり、そ
して （６） SDS-PAGEにより測定する場合、10〜20KDの見か
け分子量を有する、 ことを特徴とする当該断片、 の製造方法であって、IgE-BFを含有する溶液をFcεＲに
対して特異的であり且つヒトIgE-BFと交叉反応するモノ
クローナル抗体を担持する担体材料と接触せしめ、非結
合蛋白質及び他の外来性物質を除去し、担体上の抗体に
結合したIgE-BFを選択的に切り取りそして単離し、そし
て所望により精製されたIgE-BFをその個々の場合によっ
てはグリコシル化されている蛋白質及び／又はそれらの
断片に分離することを特徴とする方法。 - 【請求項８】前記IgE-BFを含有する溶液がIgEのための
リセプターを発現する連続性ヒトＢセルラインの培養上
清である請求項７に記載の方法。 - 【請求項９】前記IgE-BF含有溶液が初乳調製物である請
求項７に記載の方法。
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