JPH07108231B2 - 遺伝子産物の製造法 - Google Patents
遺伝子産物の製造法Info
- Publication number
- JPH07108231B2 JPH07108231B2 JP2411657A JP41165790A JPH07108231B2 JP H07108231 B2 JPH07108231 B2 JP H07108231B2 JP 2411657 A JP2411657 A JP 2411657A JP 41165790 A JP41165790 A JP 41165790A JP H07108231 B2 JPH07108231 B2 JP H07108231B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- plasmid
- gene
- dna
- sequence
- promoter
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Lifetime
Links
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title claims description 51
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title claims description 6
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims description 21
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 12
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 4
- 241001037822 Bacillus bacterium Species 0.000 claims description 3
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 76
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 50
- 238000000034 method Methods 0.000 description 43
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 39
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 37
- 244000063299 Bacillus subtilis Species 0.000 description 32
- 235000014469 Bacillus subtilis Nutrition 0.000 description 32
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 24
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 22
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 22
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 22
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 22
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 21
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 18
- 108010002350 Interleukin-2 Proteins 0.000 description 17
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 17
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 14
- 238000012869 ethanol precipitation Methods 0.000 description 14
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 13
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 13
- 102000012410 DNA Ligases Human genes 0.000 description 12
- 108010061982 DNA Ligases Proteins 0.000 description 12
- ZKHQWZAMYRWXGA-UHFFFAOYSA-N Adenosine triphosphate Natural products C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1C1OC(COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)C(O)C1O ZKHQWZAMYRWXGA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 11
- 241000193830 Bacillus <bacterium> Species 0.000 description 11
- 102000000588 Interleukin-2 Human genes 0.000 description 11
- 102000016943 Muramidase Human genes 0.000 description 11
- 108010014251 Muramidase Proteins 0.000 description 11
- 108010062010 N-Acetylmuramoyl-L-alanine Amidase Proteins 0.000 description 11
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 11
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 11
- 239000004325 lysozyme Substances 0.000 description 11
- 229960000274 lysozyme Drugs 0.000 description 11
- 235000010335 lysozyme Nutrition 0.000 description 11
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 11
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 101000599940 Homo sapiens Interferon gamma Proteins 0.000 description 10
- 229960005091 chloramphenicol Drugs 0.000 description 10
- WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N chloramphenicol Chemical compound ClC(Cl)C(=O)N[C@H](CO)[C@H](O)C1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N 0.000 description 10
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 10
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 102000003960 Ligases Human genes 0.000 description 9
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 description 9
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 9
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 9
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 9
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 9
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 9
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 9
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 8
- RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N Diethyl ether Chemical compound CCOCC RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 8
- 239000013611 chromosomal DNA Substances 0.000 description 8
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 8
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 8
- 108010074328 Interferon-gamma Proteins 0.000 description 7
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 7
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 7
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 7
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 6
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 6
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 6
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 6
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 6
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 6
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 6
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 5
- 239000007984 Tris EDTA buffer Substances 0.000 description 5
- 239000000047 product Substances 0.000 description 5
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 4
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 4
- 108010008286 DNA nucleotidylexotransferase Proteins 0.000 description 4
- 102100029764 DNA-directed DNA/RNA polymerase mu Human genes 0.000 description 4
- 102100037850 Interferon gamma Human genes 0.000 description 4
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 4
- 101150055766 cat gene Proteins 0.000 description 4
- 239000013599 cloning vector Substances 0.000 description 4
- RGWHQCVHVJXOKC-SHYZEUOFSA-N dCTP Chemical compound O=C1N=C(N)C=CN1[C@@H]1O[C@H](CO[P@](O)(=O)O[P@](O)(=O)OP(O)(O)=O)[C@@H](O)C1 RGWHQCVHVJXOKC-SHYZEUOFSA-N 0.000 description 4
- HAAZLUGHYHWQIW-KVQBGUIXSA-N dGTP Chemical compound C1=NC=2C(=O)NC(N)=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 HAAZLUGHYHWQIW-KVQBGUIXSA-N 0.000 description 4
- 229960005542 ethidium bromide Drugs 0.000 description 4
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 4
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 4
- 238000011160 research Methods 0.000 description 4
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 4
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 4
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 4
- 150000005691 triesters Chemical class 0.000 description 4
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 3
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 3
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000700721 Hepatitis B virus Species 0.000 description 3
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 3
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 3
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 3
- AIYUHDOJVYHVIT-UHFFFAOYSA-M caesium chloride Chemical compound [Cl-].[Cs+] AIYUHDOJVYHVIT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 3
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 3
- NHVNXKFIZYSCEB-XLPZGREQSA-N dTTP Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)[C@@H](O)C1 NHVNXKFIZYSCEB-XLPZGREQSA-N 0.000 description 3
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 3
- VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N dithiothreitol Chemical compound SC[C@@H](O)[C@H](O)CS VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N 0.000 description 3
- ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N ethidium bromide Chemical compound [Br-].C12=CC(N)=CC=C2C2=CC=C(N)C=C2[N+](CC)=C1C1=CC=CC=C1 ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 3
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 3
- 238000002264 polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 3
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 3
- 210000001938 protoplast Anatomy 0.000 description 3
- 102220201851 rs143406017 Human genes 0.000 description 3
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 3
- 238000009210 therapy by ultrasound Methods 0.000 description 3
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 3
- CKTSBUTUHBMZGZ-SHYZEUOFSA-N 2'‐deoxycytidine Chemical group O=C1N=C(N)C=CN1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)C1 CKTSBUTUHBMZGZ-SHYZEUOFSA-N 0.000 description 2
- ZKHQWZAMYRWXGA-KQYNXXCUSA-J ATP(4-) Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](COP([O-])(=O)OP([O-])(=O)OP([O-])([O-])=O)[C@@H](O)[C@H]1O ZKHQWZAMYRWXGA-KQYNXXCUSA-J 0.000 description 2
- 108010088751 Albumins Proteins 0.000 description 2
- 102000009027 Albumins Human genes 0.000 description 2
- 241000194103 Bacillus pumilus Species 0.000 description 2
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 2
- 108010035563 Chloramphenicol O-acetyltransferase Proteins 0.000 description 2
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 2
- 108020004635 Complementary DNA Proteins 0.000 description 2
- 101001002657 Homo sapiens Interleukin-2 Proteins 0.000 description 2
- 102100034343 Integrase Human genes 0.000 description 2
- 108010050904 Interferons Proteins 0.000 description 2
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 2
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 2
- COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N L-phenylalanine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 2
- LRHPLDYGYMQRHN-UHFFFAOYSA-N N-Butanol Chemical compound CCCCO LRHPLDYGYMQRHN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- JOCBASBOOFNAJA-UHFFFAOYSA-N N-tris(hydroxymethyl)methyl-2-aminoethanesulfonic acid Chemical compound OCC(CO)(CO)NCCS(O)(=O)=O JOCBASBOOFNAJA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 2
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 2
- 108010021757 Polynucleotide 5'-Hydroxyl-Kinase Proteins 0.000 description 2
- 102000008422 Polynucleotide 5'-hydroxyl-kinase Human genes 0.000 description 2
- 108091034057 RNA (poly(A)) Proteins 0.000 description 2
- 108010092799 RNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 2
- 229910003798 SPO2 Inorganic materials 0.000 description 2
- 101100478210 Schizosaccharomyces pombe (strain 972 / ATCC 24843) spo2 gene Proteins 0.000 description 2
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 2
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 2
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 2
- 239000007994 TES buffer Substances 0.000 description 2
- 239000004098 Tetracycline Substances 0.000 description 2
- 241000711975 Vesicular stomatitis virus Species 0.000 description 2
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 2
- 238000010804 cDNA synthesis Methods 0.000 description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 2
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 description 2
- OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N cytosine Chemical compound NC=1C=CNC(=O)N=1 OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- SUYVUBYJARFZHO-RRKCRQDMSA-N dATP Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 SUYVUBYJARFZHO-RRKCRQDMSA-N 0.000 description 2
- 239000007857 degradation product Substances 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 2
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 2
- DNJIEGIFACGWOD-UHFFFAOYSA-N ethyl mercaptane Natural products CCS DNJIEGIFACGWOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 2
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 2
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 2
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 2
- UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N guanine Chemical compound O=C1NC(N)=NC2=C1N=CN2 UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 2
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 2
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 2
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 2
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 2
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 2
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 2
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 2
- HJRIWDYVYNNCFY-UHFFFAOYSA-M potassium;dimethylarsinate Chemical compound [K+].C[As](C)([O-])=O HJRIWDYVYNNCFY-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 229920002477 rna polymer Polymers 0.000 description 2
- 239000012266 salt solution Substances 0.000 description 2
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 2
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 description 2
- 229960002180 tetracycline Drugs 0.000 description 2
- 229930101283 tetracycline Natural products 0.000 description 2
- 235000019364 tetracycline Nutrition 0.000 description 2
- 150000003522 tetracyclines Chemical class 0.000 description 2
- RWQNBRDOKXIBIV-UHFFFAOYSA-N thymine Chemical compound CC1=CNC(=O)NC1=O RWQNBRDOKXIBIV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 description 2
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical group C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 1
- PGSPUKDWUHBDKJ-UHFFFAOYSA-N 6,7-dihydro-3h-purin-2-amine Chemical group C1NC(N)=NC2=C1NC=N2 PGSPUKDWUHBDKJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000186361 Actinobacteria <class> Species 0.000 description 1
- 229930024421 Adenine Natural products 0.000 description 1
- GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N Adenine Chemical compound NC1=NC=NC2=C1N=CN2 GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000194110 Bacillus sp. (in: Bacteria) Species 0.000 description 1
- 241000276408 Bacillus subtilis subsp. subtilis str. 168 Species 0.000 description 1
- 101710132601 Capsid protein Proteins 0.000 description 1
- 108010062580 Concanavalin A Proteins 0.000 description 1
- 102000004594 DNA Polymerase I Human genes 0.000 description 1
- 108010017826 DNA Polymerase I Proteins 0.000 description 1
- 101150013191 E gene Proteins 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 1
- 101001054334 Homo sapiens Interferon beta Proteins 0.000 description 1
- 108010000521 Human Growth Hormone Proteins 0.000 description 1
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 description 1
- 108700005091 Immunoglobulin Genes Proteins 0.000 description 1
- 102000008070 Interferon-gamma Human genes 0.000 description 1
- 102000014150 Interferons Human genes 0.000 description 1
- 108091092195 Intron Proteins 0.000 description 1
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N L-tryptophane Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OWRUUFUVXFREBD-KKUMJFAQSA-N Lys-His-Leu Chemical compound [H]N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC1=CNC=N1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O OWRUUFUVXFREBD-KKUMJFAQSA-N 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 101710163270 Nuclease Proteins 0.000 description 1
- 101710149086 Nuclease S1 Proteins 0.000 description 1
- 108020005187 Oligonucleotide Probes Proteins 0.000 description 1
- 108090000854 Oxidoreductases Proteins 0.000 description 1
- 108020002230 Pancreatic Ribonuclease Proteins 0.000 description 1
- 102000005891 Pancreatic ribonuclease Human genes 0.000 description 1
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 1
- 241000635201 Pumilus Species 0.000 description 1
- 239000012980 RPMI-1640 medium Substances 0.000 description 1
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 1
- 229910003797 SPO1 Inorganic materials 0.000 description 1
- 101100150136 Saccharomyces cerevisiae (strain ATCC 204508 / S288c) SPO1 gene Proteins 0.000 description 1
- 108020004682 Single-Stranded DNA Proteins 0.000 description 1
- VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M Sodium acetate Chemical compound [Na+].CC([O-])=O VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 241000191940 Staphylococcus Species 0.000 description 1
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 description 1
- 239000004809 Teflon Substances 0.000 description 1
- 229920006362 Teflon® Polymers 0.000 description 1
- BDYBHQWMHYDRKJ-UNQGMJICSA-N Thr-Phe-Met Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)O)N)O BDYBHQWMHYDRKJ-UNQGMJICSA-N 0.000 description 1
- AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N Threonine Natural products CC(O)C(N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 description 1
- QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N Tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- 241000269370 Xenopus <genus> Species 0.000 description 1
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 1
- 229960000643 adenine Drugs 0.000 description 1
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 description 1
- 210000001691 amnion Anatomy 0.000 description 1
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 1
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 230000000840 anti-viral effect Effects 0.000 description 1
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 1
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 1
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 1
- 238000000376 autoradiography Methods 0.000 description 1
- 239000003782 beta lactam antibiotic agent Substances 0.000 description 1
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 1
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 1
- 229910052792 caesium Inorganic materials 0.000 description 1
- TVFDJXOCXUVLDH-UHFFFAOYSA-N caesium atom Chemical compound [Cs] TVFDJXOCXUVLDH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 1
- OSQPUMRCKZAIOZ-UHFFFAOYSA-N carbon dioxide;ethanol Chemical compound CCO.O=C=O OSQPUMRCKZAIOZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 1
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 1
- 238000004737 colorimetric analysis Methods 0.000 description 1
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 1
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000000120 cytopathologic effect Effects 0.000 description 1
- 229940104302 cytosine Drugs 0.000 description 1
- SUYVUBYJARFZHO-UHFFFAOYSA-N dATP Natural products C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1C1CC(O)C(COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 SUYVUBYJARFZHO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- SSJJWVREPZVNBF-DGXVIIAXSA-N dG10 Chemical compound C1=NC(C(NC(N)=N2)=O)=C2N1[C@H](O[C@@H]1COP(O)(=O)O[C@@H]2[C@H](O[C@H](C2)N2C3=C(C(NC(N)=N3)=O)N=C2)COP(O)(=O)O[C@@H]2[C@H](O[C@H](C2)N2C3=C(C(NC(N)=N3)=O)N=C2)COP(O)(=O)O[C@@H]2[C@H](O[C@H](C2)N2C3=C(C(NC(N)=N3)=O)N=C2)COP(O)(=O)O[C@@H]2[C@H](O[C@H](C2)N2C3=C(C(NC(N)=N3)=O)N=C2)COP(O)(=O)O[C@@H]2[C@H](O[C@H](C2)N2C3=C(C(NC(N)=N3)=O)N=C2)COP(O)(=O)O[C@@H]2[C@H](O[C@H](C2)N2C3=C(C(NC(N)=N3)=O)N=C2)COP(O)(=O)O[C@@H]2[C@H](O[C@H](C2)N2C3=C(C(NC(N)=N3)=O)N=C2)COP(O)(=O)O[C@@H]2[C@H](O[C@H](C2)N2C3=C(C(NC(N)=N3)=O)N=C2)CO)C[C@@H]1OP(O)(=O)OC[C@@H](O1)[C@@H](O)C[C@@H]1N1C(N=C(NC2=O)N)=C2N=C1 SSJJWVREPZVNBF-DGXVIIAXSA-N 0.000 description 1
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 1
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 1
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 1
- 238000000432 density-gradient centrifugation Methods 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 230000003544 deproteinization Effects 0.000 description 1
- 230000001066 destructive effect Effects 0.000 description 1
- 239000005546 dideoxynucleotide Substances 0.000 description 1
- 229940042399 direct acting antivirals protease inhibitors Drugs 0.000 description 1
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 1
- 239000012894 fetal calf serum Substances 0.000 description 1
- 238000011049 filling Methods 0.000 description 1
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 1
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 1
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000005484 gravity Effects 0.000 description 1
- ZJYYHGLJYGJLLN-UHFFFAOYSA-N guanidinium thiocyanate Chemical compound SC#N.NC(N)=N ZJYYHGLJYGJLLN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000000003 hoof Anatomy 0.000 description 1
- 102000055277 human IL2 Human genes 0.000 description 1
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 1
- 238000001802 infusion Methods 0.000 description 1
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 1
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 1
- 229940079322 interferon Drugs 0.000 description 1
- 239000003120 macrolide antibiotic agent Substances 0.000 description 1
- 238000002844 melting Methods 0.000 description 1
- 230000008018 melting Effects 0.000 description 1
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 1
- 210000000214 mouth Anatomy 0.000 description 1
- JBPWDTQELHPIPV-UHFFFAOYSA-N n-(3,6-dihydro-2h-pyridin-1-yl)pyridine-4-carboxamide Chemical compound C=1C=NC=CC=1C(=O)NN1CCC=CC1 JBPWDTQELHPIPV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000013557 nattō Nutrition 0.000 description 1
- 239000002751 oligonucleotide probe Substances 0.000 description 1
- 210000000287 oocyte Anatomy 0.000 description 1
- 101150019841 penP gene Proteins 0.000 description 1
- 239000000137 peptide hydrolase inhibitor Substances 0.000 description 1
- 210000005259 peripheral blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000011886 peripheral blood Substances 0.000 description 1
- COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N phenylalanine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- PHEDXBVPIONUQT-RGYGYFBISA-N phorbol 13-acetate 12-myristate Chemical compound C([C@]1(O)C(=O)C(C)=C[C@H]1[C@@]1(O)[C@H](C)[C@H]2OC(=O)CCCCCCCCCCCCC)C(CO)=C[C@H]1[C@H]1[C@]2(OC(C)=O)C1(C)C PHEDXBVPIONUQT-RGYGYFBISA-N 0.000 description 1
- 230000026731 phosphorylation Effects 0.000 description 1
- 238000006366 phosphorylation reaction Methods 0.000 description 1
- 229920001469 poly(aryloxy)thionylphosphazene Polymers 0.000 description 1
- 238000007692 polyacrylamide-agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 230000001376 precipitating effect Effects 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 description 1
- 238000001742 protein purification Methods 0.000 description 1
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 1
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 1
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 1
- 230000003362 replicative effect Effects 0.000 description 1
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 1
- 229940071089 sarcosinate Drugs 0.000 description 1
- FSYKKLYZXJSNPZ-UHFFFAOYSA-N sarcosine Chemical compound C[NH2+]CC([O-])=O FSYKKLYZXJSNPZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108700004121 sarkosyl Proteins 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001632 sodium acetate Substances 0.000 description 1
- 235000017281 sodium acetate Nutrition 0.000 description 1
- KSAVQLQVUXSOCR-UHFFFAOYSA-M sodium lauroyl sarcosinate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCC(=O)N(C)CC([O-])=O KSAVQLQVUXSOCR-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- AEEZIRBYGITPDN-UHFFFAOYSA-M sodium;dodecanoyl sulfate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCC(=O)OS([O-])(=O)=O AEEZIRBYGITPDN-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 239000002689 soil Substances 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 238000010257 thawing Methods 0.000 description 1
- 229940104230 thymidine Drugs 0.000 description 1
- 229940113082 thymine Drugs 0.000 description 1
- 230000005026 transcription initiation Effects 0.000 description 1
- 238000000844 transformation Methods 0.000 description 1
- 230000014621 translational initiation Effects 0.000 description 1
- 101150016309 trpC gene Proteins 0.000 description 1
- 239000012137 tryptone Substances 0.000 description 1
- 238000009281 ultraviolet germicidal irradiation Methods 0.000 description 1
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 1
- 239000002132 β-lactam antibiotic Substances 0.000 description 1
- 229940124586 β-lactam antibiotics Drugs 0.000 description 1
Landscapes
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は遺伝子産物の製造法に関
する。さらに詳しくは、本発明はプロモーター活性を有
する組み換えＤＮＡを用いて形質転換させたバチルス属
菌を用いた遺伝子産物の製造法に関する。
する。さらに詳しくは、本発明はプロモーター活性を有
する組み換えＤＮＡを用いて形質転換させたバチルス属
菌を用いた遺伝子産物の製造法に関する。
【０００２】
【従来の技術】遺伝子操作技術は大腸菌を用いて進歩
し、すでに多くの異種遺伝子が大腸菌内で発現されてい
る。枯草菌は土壌中に生棲し、これまでに動物や植物の
病気に関連したことが知られていないばかりではなく、
納豆など食品の生産にも利用されて古くからその安全性
が知られている。また枯草菌は工業上広く使用される発
酵微生物であって、その工業的規模での管理体制が確立
している。さらに枯草菌はグラム陽性細菌であって、グ
ラム陰性細菌である大腸菌に比べて、多くの抗生物質た
とえばβ−ラクタム抗生物質やマクロライド抗生物質に
対して感受性であるために生菌を迅速に死にいたらしめ
ることが可能である。これら枯草菌のすぐれた特性に注
目して現在、枯草菌を用いた異種遺伝子の発現系の開発
が注目されている。しかしながら、枯草菌では大腸菌に
おけるような優れた発現ベクターがないために、枯草菌
内で異種遺伝子が発現された例は大腸菌に比べて極めて
少なくその例としては、Ｂ型肝炎ウイルスＣ抗原遺伝子
および口蹄病ウイルス主抗原（ＶＰＩ）遺伝子の発現
［K. Hardy et al: Nature, ２９３, ４８１（１９８
１）］，大腸菌のtrpＣ遺伝子の発現［D. W. Williams
et al: Gene, １６，１９９（１９８１）］，マウスdih
ydrofolate reductase 遺伝子の発現［D. M. Williams
et al: Gene，１６，１９９（１９８１）］；R. G. Sch
oner et al: Gene，２２，４７（１９８３），ヒトイン
ターフェロン−β遺伝子の発現［S. Chang et al: Proc
eedings of the IVth International Symposium
on Genetics ofIndustrial Microorganisms p.２７７
（１９８２）］などが挙げられるにすぎない。また、一
般にその発現量が少ないために、枯草菌では強力なプロ
モーターを有する優れた発現ベクターの開発が望まれて
いる。現在までに塩基配列まで明らかにされた枯草菌の
プロモーターとして、vegプロモーター，tmsプロモータ
ー，penPプロモーター，ＳＰＯ１プロモーター，φ２９
ＡＩプロモーター［ C. P.Moran Jr. et al: Mol. Gen.
Genetics, １８６，３３９（１９８２）］やＳＰＯ２
プロモーター［R. G. Schoner et al. Gene, ２２，４
７（１９８３）］などが知られてはいるが、これらのう
ちで、実際に遺伝子発現に利用されたものはＳＰＯ２プ
ロモーターのみである。また、これまでに発現された異
種遺伝子産物の殆んどは融合蛋白質として産生されてい
る。
し、すでに多くの異種遺伝子が大腸菌内で発現されてい
る。枯草菌は土壌中に生棲し、これまでに動物や植物の
病気に関連したことが知られていないばかりではなく、
納豆など食品の生産にも利用されて古くからその安全性
が知られている。また枯草菌は工業上広く使用される発
酵微生物であって、その工業的規模での管理体制が確立
している。さらに枯草菌はグラム陽性細菌であって、グ
ラム陰性細菌である大腸菌に比べて、多くの抗生物質た
とえばβ−ラクタム抗生物質やマクロライド抗生物質に
対して感受性であるために生菌を迅速に死にいたらしめ
ることが可能である。これら枯草菌のすぐれた特性に注
目して現在、枯草菌を用いた異種遺伝子の発現系の開発
が注目されている。しかしながら、枯草菌では大腸菌に
おけるような優れた発現ベクターがないために、枯草菌
内で異種遺伝子が発現された例は大腸菌に比べて極めて
少なくその例としては、Ｂ型肝炎ウイルスＣ抗原遺伝子
および口蹄病ウイルス主抗原（ＶＰＩ）遺伝子の発現
［K. Hardy et al: Nature, ２９３, ４８１（１９８
１）］，大腸菌のtrpＣ遺伝子の発現［D. W. Williams
et al: Gene, １６，１９９（１９８１）］，マウスdih
ydrofolate reductase 遺伝子の発現［D. M. Williams
et al: Gene，１６，１９９（１９８１）］；R. G. Sch
oner et al: Gene，２２，４７（１９８３），ヒトイン
ターフェロン−β遺伝子の発現［S. Chang et al: Proc
eedings of the IVth International Symposium
on Genetics ofIndustrial Microorganisms p.２７７
（１９８２）］などが挙げられるにすぎない。また、一
般にその発現量が少ないために、枯草菌では強力なプロ
モーターを有する優れた発現ベクターの開発が望まれて
いる。現在までに塩基配列まで明らかにされた枯草菌の
プロモーターとして、vegプロモーター，tmsプロモータ
ー，penPプロモーター，ＳＰＯ１プロモーター，φ２９
ＡＩプロモーター［ C. P.Moran Jr. et al: Mol. Gen.
Genetics, １８６，３３９（１９８２）］やＳＰＯ２
プロモーター［R. G. Schoner et al. Gene, ２２，４
７（１９８３）］などが知られてはいるが、これらのう
ちで、実際に遺伝子発現に利用されたものはＳＰＯ２プ
ロモーターのみである。また、これまでに発現された異
種遺伝子産物の殆んどは融合蛋白質として産生されてい
る。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】これらの状況に鑑み、
本発明者らは枯草菌を用いた、より強力な遺伝子発現系
の開発を目標にして研究を進めてきた。その結果、枯草
菌の染色体ＤＮＡから強力なプロモーターが得られるこ
とを知り、これに基づき遺伝子の発現ベクターの構築お
よび遺伝子の発現に成功して本発明を完成した。
本発明者らは枯草菌を用いた、より強力な遺伝子発現系
の開発を目標にして研究を進めてきた。その結果、枯草
菌の染色体ＤＮＡから強力なプロモーターが得られるこ
とを知り、これに基づき遺伝子の発現ベクターの構築お
よび遺伝子の発現に成功して本発明を完成した。
【０００４】
【課題を解決するための手段】本発明は図１で示される
塩基配列もしくはプロモーター活性を有するその一部の
下流にＳＤ配列、およびＳＤ配列の下流に目的とする蛋
白質をコードする遺伝子を含む組み換えＤＮＡで形質転
換させたバチルス属菌を培養し、培養物から目的とする
蛋白質を採取することを特徴とする遺伝子産物の製造法
を提供するものである。図１で示される塩基配列のＤＮ
Ａは、たとえば自体公知のＤＮＡの調製法、たとえばLo
vettらの方法［Methods in Enzymology，６８，３４２
（１９７９）］などを用いて得られるバチルス（Bacill
us）属菌の染色体ＤＮＡを原料としてプロモータークロ
ーニングベクターを用いてクローニングすることにより
得ることができる。上記の染色体ＤＮＡはバチルス属菌
のものであればいかなるものであってもよく、たとえば
バチルス・サチリス（Bacillus subtilis）ＪＢ−１−
１６８（ＩＦＯ−１４１４４），Bacillus subtilis １
６８，Bacillus subtilis ＭＩ１１４などの株があげら
れる。なお、Bacillus subtilis １６８はザ・バチルス
・ジェネテイク・ストック・センター［The Bacillus G
enetic Stock Center］にＢＧＳＣNo.１Ａ１［The Baci
llus Genetic Stock Center, Catalog of Strains（Sec
ond edition）］として保管され、また、Bacillus subt
ilis ＭＩ１１４は文献［Gene, ２４，２５５（１９８
３）］に記載されている公知菌であり、また三菱生命研
から入手可能である。
塩基配列もしくはプロモーター活性を有するその一部の
下流にＳＤ配列、およびＳＤ配列の下流に目的とする蛋
白質をコードする遺伝子を含む組み換えＤＮＡで形質転
換させたバチルス属菌を培養し、培養物から目的とする
蛋白質を採取することを特徴とする遺伝子産物の製造法
を提供するものである。図１で示される塩基配列のＤＮ
Ａは、たとえば自体公知のＤＮＡの調製法、たとえばLo
vettらの方法［Methods in Enzymology，６８，３４２
（１９７９）］などを用いて得られるバチルス（Bacill
us）属菌の染色体ＤＮＡを原料としてプロモータークロ
ーニングベクターを用いてクローニングすることにより
得ることができる。上記の染色体ＤＮＡはバチルス属菌
のものであればいかなるものであってもよく、たとえば
バチルス・サチリス（Bacillus subtilis）ＪＢ−１−
１６８（ＩＦＯ−１４１４４），Bacillus subtilis １
６８，Bacillus subtilis ＭＩ１１４などの株があげら
れる。なお、Bacillus subtilis １６８はザ・バチルス
・ジェネテイク・ストック・センター［The Bacillus G
enetic Stock Center］にＢＧＳＣNo.１Ａ１［The Baci
llus Genetic Stock Center, Catalog of Strains（Sec
ond edition）］として保管され、また、Bacillus subt
ilis ＭＩ１１４は文献［Gene, ２４，２５５（１９８
３）］に記載されている公知菌であり、また三菱生命研
から入手可能である。
【０００５】染色体ＤＮＡを用いてプロモーター活性を
有するＤＮＡ断片をクローニングする場合に用いられる
ベクター（プロモータークローニングベクター）として
は、たとえば制限酵素切断部位にバチルス属菌の染色体
ＤＮＡ断片を挿入させ、その断片中にプロモーターが存
在していることを知ることが出来るプラスミドであれば
いかなるものであってもよく、たとえばプロモーター部
分が欠損した遺伝子を有するプラスミドなどがあげら
れ、具体的にはプラスミドｐＢＴＭ１２６（図２）など
があげられる。なお、このプラスミドｐＢＴＭ１２６は
ウイリアムスら［J. Bacteriol.,１４６，１１６２（１
９８１）］によって報告されたｐＰＬ６０３と同一であ
る。すなわち、これらのプラスミドｐＢＴＭ１２６とｐ
ＰＬ６０３はスタフィロコッカス（Staphylococcus）属
由来のカナマイシン耐性プラスミドｐＵＢ１１０［Plas
mid, ６，６７（１９８１）］とバチルス・プミルス（B
acillus pumilus）ＮＣＩＢ８６００のクロラムフェニ
コール・アセチル・トランスフェラーゼ（以後、ＣＡＴ
と略す場合もある）遺伝子との組み換えプラスミドか
ら、ＣＡＴ遺伝子のプロモーター部分を欠損させて構築
されたものであり、クロラムフェニコールに対する耐性
が失われている。このプラスミドｐＢＴＭ１２６に染色
体由来のプロモーター活性を有するＤＮＡ断片をクロー
ニングするためには、本プラスミドのＣＡＴ構造遺伝子
の上流の制限酵素切断部位たとえばＥcoＲＩ，ＰstＩ部
位に、染色体ＤＮＡを制限酵素で切断して得られたＤＮ
Ａ断片をたとえばＴ４ＤＮＡリガーゼを用いて連結さ
せ、これを用いて Bacillus subtilisの形質転換を行
い、クロラムフェニコール耐性の形質転換体を分離すれ
ばよい。なお、プロモーター活性は、たとえばウイリア
ムスらの方法（前出）に従って測定することができる。
有するＤＮＡ断片をクローニングする場合に用いられる
ベクター（プロモータークローニングベクター）として
は、たとえば制限酵素切断部位にバチルス属菌の染色体
ＤＮＡ断片を挿入させ、その断片中にプロモーターが存
在していることを知ることが出来るプラスミドであれば
いかなるものであってもよく、たとえばプロモーター部
分が欠損した遺伝子を有するプラスミドなどがあげら
れ、具体的にはプラスミドｐＢＴＭ１２６（図２）など
があげられる。なお、このプラスミドｐＢＴＭ１２６は
ウイリアムスら［J. Bacteriol.,１４６，１１６２（１
９８１）］によって報告されたｐＰＬ６０３と同一であ
る。すなわち、これらのプラスミドｐＢＴＭ１２６とｐ
ＰＬ６０３はスタフィロコッカス（Staphylococcus）属
由来のカナマイシン耐性プラスミドｐＵＢ１１０［Plas
mid, ６，６７（１９８１）］とバチルス・プミルス（B
acillus pumilus）ＮＣＩＢ８６００のクロラムフェニ
コール・アセチル・トランスフェラーゼ（以後、ＣＡＴ
と略す場合もある）遺伝子との組み換えプラスミドか
ら、ＣＡＴ遺伝子のプロモーター部分を欠損させて構築
されたものであり、クロラムフェニコールに対する耐性
が失われている。このプラスミドｐＢＴＭ１２６に染色
体由来のプロモーター活性を有するＤＮＡ断片をクロー
ニングするためには、本プラスミドのＣＡＴ構造遺伝子
の上流の制限酵素切断部位たとえばＥcoＲＩ，ＰstＩ部
位に、染色体ＤＮＡを制限酵素で切断して得られたＤＮ
Ａ断片をたとえばＴ４ＤＮＡリガーゼを用いて連結さ
せ、これを用いて Bacillus subtilisの形質転換を行
い、クロラムフェニコール耐性の形質転換体を分離すれ
ばよい。なお、プロモーター活性は、たとえばウイリア
ムスらの方法（前出）に従って測定することができる。
【０００６】プロモーター活性を有するＤＮＡ断片は該
形質転換株からプラスミドを調製した後、これを、たと
えば制限酵素で切断し、ポリアクリルアミドゲル電気泳
動、アガロースゲル電気泳動などの自体公知の方法を用
いて単離することができる。また、単離されたＤＮＡ断
片の塩基配列は自体公知の方法、たとえばジヌクレオチ
ド合成鎖停止法［Proc. Natl. Acad. Sci.,ＵＳＡ，７
４，５４６３（１９７７）］を用いて決定できる。ま
た、プロモーター活性を有する図１で示されるＤＮＡ断
片およびその一部は自体公知の方法、たとえばトリエス
テル法［R. Crea et al：Proc. Natl. Acad.Sci.,ＵＳ
Ａ，７５，５７６５（１９７８）］を用いて化学合成す
ることもできる。本発明のＤＮＡ断片は強力なプロモー
ター活性を有し、バチルス属菌の優れた発現ベクターの
プロモーターとして有用であることのみならず、大腸菌
や放線菌の発現ベクターのプロモーターとしても利用可
能であると考えられる。目的とする蛋白質は転写開始に
必要なプロモーターおよびリボゾーム結合部位（ＳＤ配
列）の下流に目的とする蛋白質をコードする遺伝子を連
結させたＤＮＡでバチルス属菌を形質転換させ、得られ
る形質転換株を培養することにより得ることができる。
形質転換株からプラスミドを調製した後、これを、たと
えば制限酵素で切断し、ポリアクリルアミドゲル電気泳
動、アガロースゲル電気泳動などの自体公知の方法を用
いて単離することができる。また、単離されたＤＮＡ断
片の塩基配列は自体公知の方法、たとえばジヌクレオチ
ド合成鎖停止法［Proc. Natl. Acad. Sci.,ＵＳＡ，７
４，５４６３（１９７７）］を用いて決定できる。ま
た、プロモーター活性を有する図１で示されるＤＮＡ断
片およびその一部は自体公知の方法、たとえばトリエス
テル法［R. Crea et al：Proc. Natl. Acad.Sci.,ＵＳ
Ａ，７５，５７６５（１９７８）］を用いて化学合成す
ることもできる。本発明のＤＮＡ断片は強力なプロモー
ター活性を有し、バチルス属菌の優れた発現ベクターの
プロモーターとして有用であることのみならず、大腸菌
や放線菌の発現ベクターのプロモーターとしても利用可
能であると考えられる。目的とする蛋白質は転写開始に
必要なプロモーターおよびリボゾーム結合部位（ＳＤ配
列）の下流に目的とする蛋白質をコードする遺伝子を連
結させたＤＮＡでバチルス属菌を形質転換させ、得られ
る形質転換株を培養することにより得ることができる。
【０００７】上記のＳＤ配列としては枯草菌内で機能す
るものであればいかなるものであってもよく、またその
配列のいくつかは、すでに公知である［J. R. McLaughl
inet al：J. Biol. Chem. ２５６，１１２８３（１９８
１），C. P. Moran Jr. etal：Mol. Gen. Genetics, １
８６，３３９（１９８２）］。したがって、ＳＤ配列を
含むオリゴヌクレオチドを染色体ＤＮＡから単離する
か、または自体公知の方法、たとえばトリエステル法
（前出）によって化学合成し、プロモーターを有するベ
クターにおいてプロモーターの下流に挿入すれば求める
発現ベクターを構築することができる。また、該オリゴ
ヌクレオチドはＳＤ配列の下流に制限酵素認識部位
（例、ＣlaＩサイト，ＢamＨＩサイト，ＳalＩサイト）
を有している方が便利である。発現に使用される遺伝子
は介在配列を有さず、かつ塩基配列の明らかなものがよ
り望ましく、染色体から単離された遺伝子，mＲＮＡか
ら得られた相補ＤＮＡ，化学合成した遺伝子，半合成遺
伝子などいかなるものであってもよい。具体的には免疫
インターフェロン遺伝子，Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）
表面抗原遺伝子，ＨＢＶコア抗原遺伝子，免疫グロブリ
ンＥ遺伝子，ヒト成長ホルモン遺伝子，インターロイキ
ン−２遺伝子などがあげられ、該遺伝子の全部またはそ
の一部を使用してもよい。また、これらの遺伝子を発現
ベクターに挿入して発現プラスミドを構築する際、必要
に応じて適当な合成オリゴヌクレオチドを遺伝子に連結
させてもよい。このようにして得られるプラスミドでバ
チルス属菌を形質転換させる場合、宿主は特に限定する
必要はなく、たとえば、Bacillus subtilis ＢＧＳＣ１
Ａ１，ＢＧＳＣ１Ａ３３９，ＢＧＳＣ１Ａ３４０などが
挙げられる［The Bacillus Genetic Stock Center, C
atalog of Strains（Second edition）１９８２年発
行］。形質転換体はそれ自体公知の培地、たとえばＬ培
地などで２０〜４０℃，３〜４８時間培養される。培養
終了後それ自体公知の方法で菌体を集め、凍結融解法，
リゾチーム添加法，超音波処理法あるいは界面活性剤添
加法などの方法を単独あるいはこれらを組み合せた方法
で菌体を溶解させ、産生された蛋白質を抽出することが
できる。抽出された蛋白質は通常の蛋白質精製法にした
がって精製され、目的とする蛋白質を得ることができ
る。目的とする蛋白質がヒト免疫インターフェロンの場
合、以下の方法によって抽出することができる。ヒト免
疫インターフェロン遺伝子を有するバチルス属菌を培養
して、菌体を集め、集められた菌体を凍結融解法、リゾ
チーム添加法および超音波処理法のうち２方法以上の組
み合わせで溶菌させ、ヒト免疫インターフェロンを抽出
する。
るものであればいかなるものであってもよく、またその
配列のいくつかは、すでに公知である［J. R. McLaughl
inet al：J. Biol. Chem. ２５６，１１２８３（１９８
１），C. P. Moran Jr. etal：Mol. Gen. Genetics, １
８６，３３９（１９８２）］。したがって、ＳＤ配列を
含むオリゴヌクレオチドを染色体ＤＮＡから単離する
か、または自体公知の方法、たとえばトリエステル法
（前出）によって化学合成し、プロモーターを有するベ
クターにおいてプロモーターの下流に挿入すれば求める
発現ベクターを構築することができる。また、該オリゴ
ヌクレオチドはＳＤ配列の下流に制限酵素認識部位
（例、ＣlaＩサイト，ＢamＨＩサイト，ＳalＩサイト）
を有している方が便利である。発現に使用される遺伝子
は介在配列を有さず、かつ塩基配列の明らかなものがよ
り望ましく、染色体から単離された遺伝子，mＲＮＡか
ら得られた相補ＤＮＡ，化学合成した遺伝子，半合成遺
伝子などいかなるものであってもよい。具体的には免疫
インターフェロン遺伝子，Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）
表面抗原遺伝子，ＨＢＶコア抗原遺伝子，免疫グロブリ
ンＥ遺伝子，ヒト成長ホルモン遺伝子，インターロイキ
ン−２遺伝子などがあげられ、該遺伝子の全部またはそ
の一部を使用してもよい。また、これらの遺伝子を発現
ベクターに挿入して発現プラスミドを構築する際、必要
に応じて適当な合成オリゴヌクレオチドを遺伝子に連結
させてもよい。このようにして得られるプラスミドでバ
チルス属菌を形質転換させる場合、宿主は特に限定する
必要はなく、たとえば、Bacillus subtilis ＢＧＳＣ１
Ａ１，ＢＧＳＣ１Ａ３３９，ＢＧＳＣ１Ａ３４０などが
挙げられる［The Bacillus Genetic Stock Center, C
atalog of Strains（Second edition）１９８２年発
行］。形質転換体はそれ自体公知の培地、たとえばＬ培
地などで２０〜４０℃，３〜４８時間培養される。培養
終了後それ自体公知の方法で菌体を集め、凍結融解法，
リゾチーム添加法，超音波処理法あるいは界面活性剤添
加法などの方法を単独あるいはこれらを組み合せた方法
で菌体を溶解させ、産生された蛋白質を抽出することが
できる。抽出された蛋白質は通常の蛋白質精製法にした
がって精製され、目的とする蛋白質を得ることができ
る。目的とする蛋白質がヒト免疫インターフェロンの場
合、以下の方法によって抽出することができる。ヒト免
疫インターフェロン遺伝子を有するバチルス属菌を培養
して、菌体を集め、集められた菌体を凍結融解法、リゾ
チーム添加法および超音波処理法のうち２方法以上の組
み合わせで溶菌させ、ヒト免疫インターフェロンを抽出
する。
【０００８】凍結融解法においては、−２０℃〜−１６
０℃程度で凍結させた菌体を＋４℃付近で融解時間１０
秒〜３分程度で融解させる方法が好適に用いられる。リ
ゾチーム添加法に用いられるリゾチームはいかなる種類
のリゾチームであってもよく、菌体濃度１×１０4〜１
×１０10cells／ml程度に最終濃度５０〜５０００μｇ
／ml程度，好ましくは５００〜１０００μｇ／ml程度と
なるようにリゾチームを加え、＋１５℃〜＋４０℃程
度，好ましくは＋２８℃〜＋３７℃程度で処理すること
が好ましい。処理時間はリゾチームの種類、量、処理温
度によって異なるが、一般には５分〜３０分が好まし
い。
０℃程度で凍結させた菌体を＋４℃付近で融解時間１０
秒〜３分程度で融解させる方法が好適に用いられる。リ
ゾチーム添加法に用いられるリゾチームはいかなる種類
のリゾチームであってもよく、菌体濃度１×１０4〜１
×１０10cells／ml程度に最終濃度５０〜５０００μｇ
／ml程度，好ましくは５００〜１０００μｇ／ml程度と
なるようにリゾチームを加え、＋１５℃〜＋４０℃程
度，好ましくは＋２８℃〜＋３７℃程度で処理すること
が好ましい。処理時間はリゾチームの種類、量、処理温
度によって異なるが、一般には５分〜３０分が好まし
い。
【０００９】超音波処理法においては波長１０ＫＨz〜
３０ＫＨz程度で５〜６０秒程度、好ましくは５〜２０
秒程度処理して菌体を破砕する条件が好適である。これ
らの３方法のうちの２方法を組み合わせた方法で菌体を
破砕することにより、容易にヒト免疫インターフェロン
を抽出することができるが、３方法を組み合わせて菌体
を破砕することがより好ましい。また、必要に応じ、種
々の界面活性剤，プロテアーゼ阻害剤を添加してもよ
い。本願の特許請求の範囲の欄、発明の詳細な説明の
欄、図面の簡単な説明の欄および図面で用いる記号の意
義は表１に示すとおりである。
３０ＫＨz程度で５〜６０秒程度、好ましくは５〜２０
秒程度処理して菌体を破砕する条件が好適である。これ
らの３方法のうちの２方法を組み合わせた方法で菌体を
破砕することにより、容易にヒト免疫インターフェロン
を抽出することができるが、３方法を組み合わせて菌体
を破砕することがより好ましい。また、必要に応じ、種
々の界面活性剤，プロテアーゼ阻害剤を添加してもよ
い。本願の特許請求の範囲の欄、発明の詳細な説明の
欄、図面の簡単な説明の欄および図面で用いる記号の意
義は表１に示すとおりである。
【００１０】表 １ ＤＮＡ： デオキシリボ核酸 cＤＮＡ： 相補デオキシリボ核酸 Ａ ： アデニン Ｔ ： チミン Ｇ ： グアニン Ｃ ： シトシン ＲＮＡ： リボ核酸 mＲＮＡ： 伝令リボ核酸 dＡＴＰ： デオキシアデノシン三リン酸 dＴＴＰ： デオキシチミジン三リン酸 dＧＴＰ： デオキシグアノシン三リン酸 dＣＴＰ： デオキシシチジン三リン酸 ＡＴＰ： アデノシン三リン酸 ＥＤＴＡ： エチレンジアミン四酢酸 ＳＤＳ： ドデシル硫酸ナトリウム Ｌｅｕ： ロイシン Ｔｈｒ： スレオニン Ｃｙｓ： システイン Ｍｅｔ： メチオニン Ｇｌｕ： グルタミン酸 Ｌｙｓ： リジン Ｈｉｓ： ヒスチジン Ｐｈｅ： フェニールアラニン Ｇｌｎ： グルタミン
【００１１】
【実施例】以下に参考例及び実施例を示して本発明をさ
らに詳しく説明するが、本発明はこれに限定されるべき
ものではない。 参考例１ プロモータークローニングベクターｐＢＴＭ１２６の構
築 プラスミドｐＢＴＭ１２６は、Williamsらの方法に従い
以下のように作製した。財団法人発酵研究所より入手し
たBacillus pumilus ＮＣＩＢ８６００（ＩＦＯ−１２
０８９）よりＤＮＡを調製し、そのＤＮＡ（６.５μ
ｇ）を４０ユニットの制限酵素ＥcoＲＩと３７℃，１時
間反応させて切断したのち、６８℃で１５分間加熱し、
エタノール沈澱を行った。一方、プラスミドｐＵＢ１１
０（２.０μｇ）を２０ユニットの制限酵素ＥcoＲＩと
３７℃で１時間反応させて切断したのち、６８℃で１５
分間加熱し、エタノール沈澱を行った。両沈澱を水に溶
かして混合し、これに６０nmoleのＡＴＰ，１０ユニッ
トのＴ４ＤＮＡリガーゼ（宝酒造製）およびリガーゼ緩
衝液を加えた反応液（１００μｌ）を１１℃で３０時間
保温し、エタノール沈澱を行った。沈澱をＴＥ緩衝液
（５０μｌ）に溶解し、その２５μｌを用いてBacillus
subtilis ＭＩ１１４の形質転換を行った。クロラムフ
ェニコール耐性の形質転換株よりプラスミドを調製し、
該プラスミドをｐＢＴＭ１２４と命名した。次にプラス
ミドｐＢＴＭ１２４（２.５μｇ）を１４ユニットの制
限酵素ＰstＩと３７℃，１時間反応させて切断し、６８
℃で１５分間加熱処理したのち、エタノール沈澱を行っ
た。沈澱を水に溶解し、６６nmoleのＡＴＰ，１０ユニ
ットのＴ４ＤＮＡリガーゼ（宝酒造製）およびリガーゼ
緩衝液を加えた反応液（１００μｌ）を１１℃で２４時
間保温し、エタノール沈澱を行った。沈澱をＴＥ緩衝液
に溶解し、バチルス・サチルスＭＩ１１４を形質転換さ
せ、カナマイシン耐性の形質転換株からプラスミドを調
製して、該プラスミドをｐＢＴＭ１２５と命名した。本
プラスミドはプラスミドｐＢＴＭ１２４のＣＡＴ遺伝子
のプロモーター部位（ＰstＩ断片）が脱落したものであ
る。次にプラスミドｐＢＴＭ１２５（２.５μｇ）を１
８ユニットの制限酵素ＢamＨＩおよび１５ユニットの制
限酵素ＢglＩＩと３７℃で１時間反応させて切断し、６
８℃で１５分間加熱処理したのちエタノール沈澱を行っ
た。沈澱を水に溶解したのち、６６nmoleのＡＴＰ，１
３ユニットのＴ４ＤＮＡリガーゼ（宝酒造製）およびリ
ガーゼ緩衝液を含む反応液（１００μｌ）中で１１℃で
２８時間保温し、これを用いてバチルス・サチルスＭＩ
１１４の形質転換を行った。カナマイシン耐性の形質転
換株からプラスミドを調製し、該プラスミドをｐＢＴＭ
１２６と命名した。
らに詳しく説明するが、本発明はこれに限定されるべき
ものではない。 参考例１ プロモータークローニングベクターｐＢＴＭ１２６の構
築 プラスミドｐＢＴＭ１２６は、Williamsらの方法に従い
以下のように作製した。財団法人発酵研究所より入手し
たBacillus pumilus ＮＣＩＢ８６００（ＩＦＯ−１２
０８９）よりＤＮＡを調製し、そのＤＮＡ（６.５μ
ｇ）を４０ユニットの制限酵素ＥcoＲＩと３７℃，１時
間反応させて切断したのち、６８℃で１５分間加熱し、
エタノール沈澱を行った。一方、プラスミドｐＵＢ１１
０（２.０μｇ）を２０ユニットの制限酵素ＥcoＲＩと
３７℃で１時間反応させて切断したのち、６８℃で１５
分間加熱し、エタノール沈澱を行った。両沈澱を水に溶
かして混合し、これに６０nmoleのＡＴＰ，１０ユニッ
トのＴ４ＤＮＡリガーゼ（宝酒造製）およびリガーゼ緩
衝液を加えた反応液（１００μｌ）を１１℃で３０時間
保温し、エタノール沈澱を行った。沈澱をＴＥ緩衝液
（５０μｌ）に溶解し、その２５μｌを用いてBacillus
subtilis ＭＩ１１４の形質転換を行った。クロラムフ
ェニコール耐性の形質転換株よりプラスミドを調製し、
該プラスミドをｐＢＴＭ１２４と命名した。次にプラス
ミドｐＢＴＭ１２４（２.５μｇ）を１４ユニットの制
限酵素ＰstＩと３７℃，１時間反応させて切断し、６８
℃で１５分間加熱処理したのち、エタノール沈澱を行っ
た。沈澱を水に溶解し、６６nmoleのＡＴＰ，１０ユニ
ットのＴ４ＤＮＡリガーゼ（宝酒造製）およびリガーゼ
緩衝液を加えた反応液（１００μｌ）を１１℃で２４時
間保温し、エタノール沈澱を行った。沈澱をＴＥ緩衝液
に溶解し、バチルス・サチルスＭＩ１１４を形質転換さ
せ、カナマイシン耐性の形質転換株からプラスミドを調
製して、該プラスミドをｐＢＴＭ１２５と命名した。本
プラスミドはプラスミドｐＢＴＭ１２４のＣＡＴ遺伝子
のプロモーター部位（ＰstＩ断片）が脱落したものであ
る。次にプラスミドｐＢＴＭ１２５（２.５μｇ）を１
８ユニットの制限酵素ＢamＨＩおよび１５ユニットの制
限酵素ＢglＩＩと３７℃で１時間反応させて切断し、６
８℃で１５分間加熱処理したのちエタノール沈澱を行っ
た。沈澱を水に溶解したのち、６６nmoleのＡＴＰ，１
３ユニットのＴ４ＤＮＡリガーゼ（宝酒造製）およびリ
ガーゼ緩衝液を含む反応液（１００μｌ）中で１１℃で
２８時間保温し、これを用いてバチルス・サチルスＭＩ
１１４の形質転換を行った。カナマイシン耐性の形質転
換株からプラスミドを調製し、該プラスミドをｐＢＴＭ
１２６と命名した。
【００１２】参考例２ プラスミドｐＨＩＴtrp２１０１の構築 免疫インターフェロン（ＩＦＮ−γ）cＤＮＡを含むプ
ラスミドｐＨＩＴ３７０９および発現ベクターptrp６０
１は特開昭５８−１８９１９７号公報に記載の方法に従
って構築した。まず、プラスミドｐＨＩＴ３７０９を制
限酵素ＰstＩで切断してＩＦＮ−γの構造遺伝子を含む
ＰstＩ断片を得、この断片を制限酵素ＢstＮＩで部分分
解し、ＩＦＮ−γ構造遺伝子内にあるＢstＮＩ部位の切
断されたＢstＮＩ−ＰstＩ断片を得た。ＢstＮＩ切断部
位ののりしろ部分をＤＮＡポリメラーゼＩラージフラグ
メントでうめたのち、トリエステル法によって化学合成
した翻訳開始コドンＡＴＧを含むオリゴヌクレオチドア
ダプター をＴ４ＤＮＡリガーゼで結合させた。一方、上記アダプ
ターを結合させたＩＦＮ−γ遺伝子をptrp７７１［Y. F
ujisawa, et al Nucleic Acids Res., １１，３５８１
（１９８３）］を制限酵素ＰstＩと制限酵素ＣlaＩで切
断して得た断片のトリプトファンプロモーターの下流に
挿入してＴ４ＤＮＡリガーゼを用いて結合させ、ＩＦＮ
−γ発現プラスミドｐＨＩＴtrp１１０１を構築した。
次に、ptrp６０１を制限酵素ＣlaＩおよび制限酵素Ｈpa
ＩＩで処理してtrpプロモーターを含むＣlaＩ−ＨpaＩ
Ｉ断片０.３３ｋｂを得た。この断片を、ＣlaＩで切断
しアルカリホスファターゼ処理したｐＨＩＴtrp１１０
１にＴ４ＤＮＡリガーゼを用いて結合させ、trpプロモ
ーターが二つ直列に入ったｐＨＩＴtrp２１０１を得
た。
ラスミドｐＨＩＴ３７０９および発現ベクターptrp６０
１は特開昭５８−１８９１９７号公報に記載の方法に従
って構築した。まず、プラスミドｐＨＩＴ３７０９を制
限酵素ＰstＩで切断してＩＦＮ−γの構造遺伝子を含む
ＰstＩ断片を得、この断片を制限酵素ＢstＮＩで部分分
解し、ＩＦＮ−γ構造遺伝子内にあるＢstＮＩ部位の切
断されたＢstＮＩ−ＰstＩ断片を得た。ＢstＮＩ切断部
位ののりしろ部分をＤＮＡポリメラーゼＩラージフラグ
メントでうめたのち、トリエステル法によって化学合成
した翻訳開始コドンＡＴＧを含むオリゴヌクレオチドア
ダプター をＴ４ＤＮＡリガーゼで結合させた。一方、上記アダプ
ターを結合させたＩＦＮ−γ遺伝子をptrp７７１［Y. F
ujisawa, et al Nucleic Acids Res., １１，３５８１
（１９８３）］を制限酵素ＰstＩと制限酵素ＣlaＩで切
断して得た断片のトリプトファンプロモーターの下流に
挿入してＴ４ＤＮＡリガーゼを用いて結合させ、ＩＦＮ
−γ発現プラスミドｐＨＩＴtrp１１０１を構築した。
次に、ptrp６０１を制限酵素ＣlaＩおよび制限酵素Ｈpa
ＩＩで処理してtrpプロモーターを含むＣlaＩ−ＨpaＩ
Ｉ断片０.３３ｋｂを得た。この断片を、ＣlaＩで切断
しアルカリホスファターゼ処理したｐＨＩＴtrp１１０
１にＴ４ＤＮＡリガーゼを用いて結合させ、trpプロモ
ーターが二つ直列に入ったｐＨＩＴtrp２１０１を得
た。
【００１３】参考例３ （i） ヒトＩＬ−２をコードするｍＲＮＡの分離 ヒト末梢血より調製したリンパ球を１２−Ｏ−テトラデ
カノイルホルボール−１３−アセテート（ＴＰＡ）（１
５ng／ml）とコンカナバリンＡ（４０μｇ／ml）を含む
ＲＰＭＩ１６４０培地（１０％の牛胎児血清を含む）
中、３７℃で培養し、ＩＬ−２を誘導させた。２４時間
後、この誘導した１×１０10個のヒトリンパ球を５Ｍグ
アニジンチオシアネート、５％メルカプトエタノール、
５０mＭ Ｔris・ＨＣｌ ｐＨ７.６，１０mＭ ＥＤＴＡ
溶液中でテフロンホモゲナイザーによって破壊変性した
後Ｎ−ラウロイリルザルコシン酸ナトリウムを４％にな
るように加え、均質化した混合物を５.７Ｍ塩化セシウ
ム溶液（５.７Ｍ塩化セシウム，０.１Ｍ ＥＤＴＡ）６m
l上に重層し、ベツクマンＳＷ２８のローターを用いて
１５℃で２４０００ｒｐｍ４８時間遠心処理を行い、Ｒ
ＮＡ沈澱を得た。このＲＮＡ沈澱を０.２５％Ｎ−ラウ
ロイルザルコシン酸ナトリウム溶液にとかした後、エタ
ノールで沈澱させ、１０mgのＲＮＡを得た。このＲＮＡ
を高塩溶液［０.５ＭＮaＣl，１０mＭ Ｔris・ＨＣｌ
ｐＨ７.６，１mＭ ＥＤＴＡ，０.３％ＳＤＳ］中でオリ
ゴ（ｄＴ）セルロースカラムに吸着させ、ポリ（Ａ）を
含むｍＲＮＡを低塩溶液（１０mＭ Ｔris・ＨＣｌ ｐＨ
７.６，１mＭ ＥＤＴＡ，０.３％ＳＤＳ）で溶出させる
ことにより、ポリ（Ａ）を含むｍＲＮＡ３００μｇを分
取した。このｍＲＮＡを更にエタノールで沈澱させ、
０.２mlの溶液（１０mＭ Ｔris・ＨＣｌ ｐＨ７.６，
２mＭ ＥＤＴＡ，０.３％ＳＤＳ）に溶かし、６５℃で
２分間処理して１０〜３５％ショ糖密度勾配遠心処理
（ベックマンＳＷ２８のローターを用いて２０℃，２５
０００ｒｐｍで２１時間遠心分離）することにより分画
して２２画分を得た。この各画分につきＲＮＡの一部ず
つを、アフリカツメガエルの卵母細胞に注入し、合成さ
れる蛋白質中のＩＬ−２活性を測定し、画分１１〜１５
（沈降定数８Ｓ−１５Ｓ）にＩＬ−２の活性を検出し
た。この画分のＩＬ−２ｍＲＮＡは約２５μｇであっ
た。
カノイルホルボール−１３−アセテート（ＴＰＡ）（１
５ng／ml）とコンカナバリンＡ（４０μｇ／ml）を含む
ＲＰＭＩ１６４０培地（１０％の牛胎児血清を含む）
中、３７℃で培養し、ＩＬ−２を誘導させた。２４時間
後、この誘導した１×１０10個のヒトリンパ球を５Ｍグ
アニジンチオシアネート、５％メルカプトエタノール、
５０mＭ Ｔris・ＨＣｌ ｐＨ７.６，１０mＭ ＥＤＴＡ
溶液中でテフロンホモゲナイザーによって破壊変性した
後Ｎ−ラウロイリルザルコシン酸ナトリウムを４％にな
るように加え、均質化した混合物を５.７Ｍ塩化セシウ
ム溶液（５.７Ｍ塩化セシウム，０.１Ｍ ＥＤＴＡ）６m
l上に重層し、ベツクマンＳＷ２８のローターを用いて
１５℃で２４０００ｒｐｍ４８時間遠心処理を行い、Ｒ
ＮＡ沈澱を得た。このＲＮＡ沈澱を０.２５％Ｎ−ラウ
ロイルザルコシン酸ナトリウム溶液にとかした後、エタ
ノールで沈澱させ、１０mgのＲＮＡを得た。このＲＮＡ
を高塩溶液［０.５ＭＮaＣl，１０mＭ Ｔris・ＨＣｌ
ｐＨ７.６，１mＭ ＥＤＴＡ，０.３％ＳＤＳ］中でオリ
ゴ（ｄＴ）セルロースカラムに吸着させ、ポリ（Ａ）を
含むｍＲＮＡを低塩溶液（１０mＭ Ｔris・ＨＣｌ ｐＨ
７.６，１mＭ ＥＤＴＡ，０.３％ＳＤＳ）で溶出させる
ことにより、ポリ（Ａ）を含むｍＲＮＡ３００μｇを分
取した。このｍＲＮＡを更にエタノールで沈澱させ、
０.２mlの溶液（１０mＭ Ｔris・ＨＣｌ ｐＨ７.６，
２mＭ ＥＤＴＡ，０.３％ＳＤＳ）に溶かし、６５℃で
２分間処理して１０〜３５％ショ糖密度勾配遠心処理
（ベックマンＳＷ２８のローターを用いて２０℃，２５
０００ｒｐｍで２１時間遠心分離）することにより分画
して２２画分を得た。この各画分につきＲＮＡの一部ず
つを、アフリカツメガエルの卵母細胞に注入し、合成さ
れる蛋白質中のＩＬ−２活性を測定し、画分１１〜１５
（沈降定数８Ｓ−１５Ｓ）にＩＬ−２の活性を検出し
た。この画分のＩＬ−２ｍＲＮＡは約２５μｇであっ
た。
【００１４】（ii） 単鎖ＤＮＡの合成 上記で得たｍＲＮＡおよび逆転写酵素を用い、１００μ
ｌの反応液（５μｇのｍＲＮＡ，５０μｇオリゴ（ｄ
Ｔ），１００ユニットの逆転写酵素，１mＭずつのｄＡ
ＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＧＴＰおよびｄＴＴＰ，８mＭ Ｍｇ
Ｃｌ2，５０mＭＫＣｌ，１０mＭ ジチオスレイトール，
５０mＭ Ｔris・ＨＣｌ ｐＨ８.３）中で４２℃，１時
間インキュベートした後に、フェノールで除蛋白し、
０.１ＮのＮａＯＨで７０℃，２０分処理してＲＮＡを
分解除去した。
ｌの反応液（５μｇのｍＲＮＡ，５０μｇオリゴ（ｄ
Ｔ），１００ユニットの逆転写酵素，１mＭずつのｄＡ
ＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＧＴＰおよびｄＴＴＰ，８mＭ Ｍｇ
Ｃｌ2，５０mＭＫＣｌ，１０mＭ ジチオスレイトール，
５０mＭ Ｔris・ＨＣｌ ｐＨ８.３）中で４２℃，１時
間インキュベートした後に、フェノールで除蛋白し、
０.１ＮのＮａＯＨで７０℃，２０分処理してＲＮＡを
分解除去した。
【００１５】（iii） 二重鎖ＤＮＡの合成 ここで合成された単鎖の相補ＤＮＡを５０μｌの反応液
（ｍＲＮＡとオリゴｄＴを含まない以外は上記と同じ反
応液）中で４２℃２時間反応させることにより二重鎖Ｄ
ＮＡを合成した。
（ｍＲＮＡとオリゴｄＴを含まない以外は上記と同じ反
応液）中で４２℃２時間反応させることにより二重鎖Ｄ
ＮＡを合成した。
【００１６】（iv） ｄＣテイルの付加 この二重鎖ＤＮＡにヌクレアーゼＳ１を５０μｌの反応
液（二重鎖ＤＮＡ，０.１Ｍ酢酸ナトリウムｐＨ４.５，
０.２５Ｍ ＮａＣｌ，１.５mＭ ＺｎＳＯ4，６０ユニッ
トのＳ１ヌクレアーゼ）中で室温３０分間作用させ、フ
ェノールで除蛋白し、エタノールでＤＮＡを沈澱させた
後、これにターミナルトランスフェラーゼを５０μｌの
反応液（二重鎖ＤＮＡ，０.１４Ｍカコジル酸カリウ
ム，０.３ＭＴris（塩基）ｐＨ７.６，２mＭ ジチオス
レイトール，１mＭ ＣｏＣｌ2，０.１５mＭ ｄＣＴＰ，
３０ユニットターミナルトランスフェラーゼ）中で３分
間３７℃で作用させ二重鎖ＤＮＡの３′末端に約１５個
のデオキシシチジン鎖を伸長させた。これらの一連の反
応で約３００ngのデオキシシチジン鎖をもつた二重鎖Ｄ
ＮＡを得た。
液（二重鎖ＤＮＡ，０.１Ｍ酢酸ナトリウムｐＨ４.５，
０.２５Ｍ ＮａＣｌ，１.５mＭ ＺｎＳＯ4，６０ユニッ
トのＳ１ヌクレアーゼ）中で室温３０分間作用させ、フ
ェノールで除蛋白し、エタノールでＤＮＡを沈澱させた
後、これにターミナルトランスフェラーゼを５０μｌの
反応液（二重鎖ＤＮＡ，０.１４Ｍカコジル酸カリウ
ム，０.３ＭＴris（塩基）ｐＨ７.６，２mＭ ジチオス
レイトール，１mＭ ＣｏＣｌ2，０.１５mＭ ｄＣＴＰ，
３０ユニットターミナルトランスフェラーゼ）中で３分
間３７℃で作用させ二重鎖ＤＮＡの３′末端に約１５個
のデオキシシチジン鎖を伸長させた。これらの一連の反
応で約３００ngのデオキシシチジン鎖をもつた二重鎖Ｄ
ＮＡを得た。
【００１７】（v） 大腸菌プラスミドの開列ならびに
ｄＧテイルの付加 一方、１０μｇの大腸菌プラスミドｐＢＲ３２２ＤＮＡ
に制限酵素ＰstＩを５０μｌの反応液（１０μｇＤＮ
Ａ，５０mＭ ＮａＣｌ，６mＭ Ｔris・ＨＣｌｐＨ７.
４，６mＭ ＭｇＣｌ2，６mＭ ２−メルカプトエタノー
ル，１００μｇ／ml牛血清アルブミン，２０ユニットの
ＰstＩ）中で３時間３７℃で作用させてｐＢＲ３２２Ｄ
ＮＡ中に１ケ所存在するＰstＩ認識部位を切断し、フェ
ノールで除蛋白した後、ターミナルトランスフェラーゼ
を５０μｌの反応液（ＤＮＡ１０μｇ，０.１４Ｍカコ
ジル酸カリウム，０.３Ｍ Ｔris・塩基ｐＨ７.６，２m
Ｍジチオスレイトール，１mＭ ＣｏＣｌ2，０.１５mＭ
ｄＧＴＰ，３０ユニットターミナルトランスフェラー
ゼ）中で３分間３７℃で作用させ上記プラスミドｐＢＲ
３２２ＤＮＡの３′末端に約１７個のデオキシグアニン
鎖を延長させた。
ｄＧテイルの付加 一方、１０μｇの大腸菌プラスミドｐＢＲ３２２ＤＮＡ
に制限酵素ＰstＩを５０μｌの反応液（１０μｇＤＮ
Ａ，５０mＭ ＮａＣｌ，６mＭ Ｔris・ＨＣｌｐＨ７.
４，６mＭ ＭｇＣｌ2，６mＭ ２−メルカプトエタノー
ル，１００μｇ／ml牛血清アルブミン，２０ユニットの
ＰstＩ）中で３時間３７℃で作用させてｐＢＲ３２２Ｄ
ＮＡ中に１ケ所存在するＰstＩ認識部位を切断し、フェ
ノールで除蛋白した後、ターミナルトランスフェラーゼ
を５０μｌの反応液（ＤＮＡ１０μｇ，０.１４Ｍカコ
ジル酸カリウム，０.３Ｍ Ｔris・塩基ｐＨ７.６，２m
Ｍジチオスレイトール，１mＭ ＣｏＣｌ2，０.１５mＭ
ｄＧＴＰ，３０ユニットターミナルトランスフェラー
ゼ）中で３分間３７℃で作用させ上記プラスミドｐＢＲ
３２２ＤＮＡの３′末端に約１７個のデオキシグアニン
鎖を延長させた。
【００１８】 （vi） ｃＤＮＡの会合ならびに大腸菌の形質変換 このようにして得られた合成二重鎖ＤＮＡ０.１μｇと
上記プラスミドｐＢＲ３２２，０.５μｇを０.１Ｍ Ｎ
ａＣｌ，５０mＭ Ｔris・ＨＣｌ ｐＨ７.６，１mＭ Ｅ
ＤＴＡよりなる溶液中で６５℃２分間、４５℃２時間加
熱しその後除冷して会合させEneaらの方法［J. Mol. Bi
ol.,９６，４９５（１９７５）］に従って大腸菌ＭＭ２
９４を形質転換させた。
上記プラスミドｐＢＲ３２２，０.５μｇを０.１Ｍ Ｎ
ａＣｌ，５０mＭ Ｔris・ＨＣｌ ｐＨ７.６，１mＭ Ｅ
ＤＴＡよりなる溶液中で６５℃２分間、４５℃２時間加
熱しその後除冷して会合させEneaらの方法［J. Mol. Bi
ol.,９６，４９５（１９７５）］に従って大腸菌ＭＭ２
９４を形質転換させた。
【００１９】（vii） ｃＤＮＡ含有プラスミドの単離 このようにして約２００００個のテトラサイクリン耐性
株が単離され、これら各々のＤＮＡをニトロセルロース
フィルターの上に固定した。次いでTaniguchiらが報告
［Nature，３０２，３０５（１９８３）］したＩＬ−２
のアミノ酸配列をもとにしてアミノ酸Ｎo.７４〜７８
（Ｌｙｓ74−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ−Ｃｙｓ）および
アミノ酸Ｎo.１２２〜１２６（Ｔｈｒ122−Ｐｈｅ−Ｍ
ｅｔ−Ｃｙｓ−Ｇｌｕ）に対応する塩基配列（５´ＡＡ
Ａ ＣＡＴ ＣＴＴ ＣＡＧ ＴＧＴ３´および５´Ａ
ＣＡ ＴＴＣ ＡＴＧ ＴＧＴ ＧＡＡ３′）をトリエ
ステル法［R. Crea et al. Proc. Natl. Acad. Sci. Ｕ
ＳＡ，７５，５７６５（１９７８）］により化学合成し
た。このオリゴヌクレオチドに対してＴ４ポリヌクレオ
チドカイネースを用いて５０μｌの反応液（オリゴヌク
レオチド０.２０μｇ，５０mＭ Ｔris・ＨＣｌ ｐＨ
８.０，１０mＭ ＭｇＣｌ2，１０mＭ メルカプトエタノ
ール，５０μＣｉγ−32ＰＡＴＰ，３ユニットＴ４ポリ
ヌクレオチドカイネース）中で１時間３７℃で反応さ
せ、５′末端を32Ｐで標識した。この標識されたオリゴ
ヌクレオチドをプローブとしてLawnらの方法［Nucleic
Acids Res., ９，６１０３（１９８１）］に従って上記
のニトロセルロースフィルター上に固定したＤＮＡに会
合させ、オートラジオグラフィーによって上記二種類の
オリゴヌクレオチドプローブに反応する菌株を４個単離
した。これらの菌株の各々の菌体からプラスミドＤＮＡ
をアルカリ法［H. C. Birnboim & J. Doly：Nucleic Ac
ids Res.,７，１５１３（１９７９）］によって単離し
た。次にプラスミドＤＮＡの挿入部を制限酵素ＰstＩに
より切り出し、分離したプラスミドのうちでその挿入部
の長さの最も長い断片を含むものをえらび、このプラス
ミドをｐＩＬＯＴ１３５−８（図３）と名づけた。次に
このｐＩＬＯＴ１３５−８プラスミドに挿入されたｃＤ
ＮＡの配列の一次構造（塩基配列）をジデオキシヌクレ
オチド合成鎖停止法とMaxam−Gilbert法によって決定し
た。その一次構造を図４に示す。この塩基配列により規
定されるペプチドはその合成開始信号（Ｎo.６４〜６６
のＡＴＧ）から始まって１５３個のアミノ酸から成る。
この中Ｎ末端から２０個のアミノ酸はシグナルペプチド
と考えられる。上記の一次構造から、このプラスミドは
ヒトＩＬ−２蛋白質をコードする塩基配列を全部持って
いることが判明した。この事実によってプラスミドに組
み込まれた遺伝子を他の発現用プラスミドに組み込むこ
とによりＩＬ−２蛋白質の任意のポリペプチドを生産す
ることができる。
株が単離され、これら各々のＤＮＡをニトロセルロース
フィルターの上に固定した。次いでTaniguchiらが報告
［Nature，３０２，３０５（１９８３）］したＩＬ−２
のアミノ酸配列をもとにしてアミノ酸Ｎo.７４〜７８
（Ｌｙｓ74−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ−Ｃｙｓ）および
アミノ酸Ｎo.１２２〜１２６（Ｔｈｒ122−Ｐｈｅ−Ｍ
ｅｔ−Ｃｙｓ−Ｇｌｕ）に対応する塩基配列（５´ＡＡ
Ａ ＣＡＴ ＣＴＴ ＣＡＧ ＴＧＴ３´および５´Ａ
ＣＡ ＴＴＣ ＡＴＧ ＴＧＴ ＧＡＡ３′）をトリエ
ステル法［R. Crea et al. Proc. Natl. Acad. Sci. Ｕ
ＳＡ，７５，５７６５（１９７８）］により化学合成し
た。このオリゴヌクレオチドに対してＴ４ポリヌクレオ
チドカイネースを用いて５０μｌの反応液（オリゴヌク
レオチド０.２０μｇ，５０mＭ Ｔris・ＨＣｌ ｐＨ
８.０，１０mＭ ＭｇＣｌ2，１０mＭ メルカプトエタノ
ール，５０μＣｉγ−32ＰＡＴＰ，３ユニットＴ４ポリ
ヌクレオチドカイネース）中で１時間３７℃で反応さ
せ、５′末端を32Ｐで標識した。この標識されたオリゴ
ヌクレオチドをプローブとしてLawnらの方法［Nucleic
Acids Res., ９，６１０３（１９８１）］に従って上記
のニトロセルロースフィルター上に固定したＤＮＡに会
合させ、オートラジオグラフィーによって上記二種類の
オリゴヌクレオチドプローブに反応する菌株を４個単離
した。これらの菌株の各々の菌体からプラスミドＤＮＡ
をアルカリ法［H. C. Birnboim & J. Doly：Nucleic Ac
ids Res.,７，１５１３（１９７９）］によって単離し
た。次にプラスミドＤＮＡの挿入部を制限酵素ＰstＩに
より切り出し、分離したプラスミドのうちでその挿入部
の長さの最も長い断片を含むものをえらび、このプラス
ミドをｐＩＬＯＴ１３５−８（図３）と名づけた。次に
このｐＩＬＯＴ１３５−８プラスミドに挿入されたｃＤ
ＮＡの配列の一次構造（塩基配列）をジデオキシヌクレ
オチド合成鎖停止法とMaxam−Gilbert法によって決定し
た。その一次構造を図４に示す。この塩基配列により規
定されるペプチドはその合成開始信号（Ｎo.６４〜６６
のＡＴＧ）から始まって１５３個のアミノ酸から成る。
この中Ｎ末端から２０個のアミノ酸はシグナルペプチド
と考えられる。上記の一次構造から、このプラスミドは
ヒトＩＬ−２蛋白質をコードする塩基配列を全部持って
いることが判明した。この事実によってプラスミドに組
み込まれた遺伝子を他の発現用プラスミドに組み込むこ
とによりＩＬ−２蛋白質の任意のポリペプチドを生産す
ることができる。
【００２０】（viii） プラスミドｐＩＬＯＴ１３５−
８を制限酵素ＨgiＡ１で切断し、１２９４ｂｐのＩＬ−
２遺伝子を含むＤＮＡ断片を得た。このＤＮＡ断片をＴ
４ＤＮＡポリメラーゼで処理した後、アラニンのコドン
ＧＣＡとメチオニンのコドンＡＴＧを有するＣlaＩのリ
ンカー，ＣＧＡＴＡ ＡＴＧ ＧＣＡ を結合させＣla
Ｉ処理した後、ptrp７７１（Y. Fujisawa et al. 前
出）のＣlaＩ site に組み込み、得られたプラスミド
をｐＴＦ５と命名した。
８を制限酵素ＨgiＡ１で切断し、１２９４ｂｐのＩＬ−
２遺伝子を含むＤＮＡ断片を得た。このＤＮＡ断片をＴ
４ＤＮＡポリメラーゼで処理した後、アラニンのコドン
ＧＣＡとメチオニンのコドンＡＴＧを有するＣlaＩのリ
ンカー，ＣＧＡＴＡ ＡＴＧ ＧＣＡ を結合させＣla
Ｉ処理した後、ptrp７７１（Y. Fujisawa et al. 前
出）のＣlaＩ site に組み込み、得られたプラスミド
をｐＴＦ５と命名した。
【００２１】実施例１ プロモーターのクローニング 参考例１で得たプロモータークローニングベクターｐＢ
ＴＭ１２６（２.１μｇ）を制限酵素ＰstＩ（８ユニッ
ト）で３７℃，１時間切断したのち、さらに制限酵素Ｅ
coＲＩ（５ユニット）で３７℃，１時間切断し、６８℃
で１５分間加熱処理して反応を停止させ、エタノール沈
澱を行った。一方、Bacillus subtilisＪＢ−１−１６
８（ＩＦＯ−１４１４４）の染色体（６.２μｇ）をＰs
tＩ（２４ユニット）およびＥcoＲＩ（１５ユニット）
でそれぞれ３７℃，１時間切断し、６８℃で１５分間加
熱処理したのちエタノール沈澱を行った。両沈澱を水に
溶解したのち混合し、アデノシン三リン酸（６６nmol
e）およびＴ４ＤＮＡリガーゼ［宝酒造製］（１０ユニ
ット）存在下で１１℃，２４時間反応し、エタノール沈
澱を行った。沈澱を１０mＭトリス・塩酸緩衝液ｐＨ８.
０，１mＭ ＥＤＴＡ（ＴＥ緩衝液）に溶解し、B. subti
lis ＭＩ１１４の形質転換をプロトプラスト法［S. Cha
ng and S. N. Cohen；Mol. Gen. Genet., １６８，１１
１（１９７９）］で行い、１２.５μｇ／mlのクロラム
フェニコールを含むＤＭ３寒天プレート［Mol. Gen. Ge
net., １６８，１１１（１９７９）］で選択すると９５
６株の形質転換株が得られた。さらに２００μｇ／mlの
クロラムフェニコールを含むブレイン・ハートインヒュ
ージョン（Difco社，米国）の寒天プレートでレプリカ
すると２０株が生育した。これらの形質転換株は強力な
プロモーター活性を有するＤＮＡ断片を組み込んだプラ
スミドを保有している。
ＴＭ１２６（２.１μｇ）を制限酵素ＰstＩ（８ユニッ
ト）で３７℃，１時間切断したのち、さらに制限酵素Ｅ
coＲＩ（５ユニット）で３７℃，１時間切断し、６８℃
で１５分間加熱処理して反応を停止させ、エタノール沈
澱を行った。一方、Bacillus subtilisＪＢ−１−１６
８（ＩＦＯ−１４１４４）の染色体（６.２μｇ）をＰs
tＩ（２４ユニット）およびＥcoＲＩ（１５ユニット）
でそれぞれ３７℃，１時間切断し、６８℃で１５分間加
熱処理したのちエタノール沈澱を行った。両沈澱を水に
溶解したのち混合し、アデノシン三リン酸（６６nmol
e）およびＴ４ＤＮＡリガーゼ［宝酒造製］（１０ユニ
ット）存在下で１１℃，２４時間反応し、エタノール沈
澱を行った。沈澱を１０mＭトリス・塩酸緩衝液ｐＨ８.
０，１mＭ ＥＤＴＡ（ＴＥ緩衝液）に溶解し、B. subti
lis ＭＩ１１４の形質転換をプロトプラスト法［S. Cha
ng and S. N. Cohen；Mol. Gen. Genet., １６８，１１
１（１９７９）］で行い、１２.５μｇ／mlのクロラム
フェニコールを含むＤＭ３寒天プレート［Mol. Gen. Ge
net., １６８，１１１（１９７９）］で選択すると９５
６株の形質転換株が得られた。さらに２００μｇ／mlの
クロラムフェニコールを含むブレイン・ハートインヒュ
ージョン（Difco社，米国）の寒天プレートでレプリカ
すると２０株が生育した。これらの形質転換株は強力な
プロモーター活性を有するＤＮＡ断片を組み込んだプラ
スミドを保有している。
【００２２】実施例２ 染色体ＤＮＡより得られたＤＮＡ断片のプロモーター活
性はウイリアムスらの方法［前出］に基づき、ＣＡＴ活
性を測定することによって求めた。この活性測定には実
施例１で得られた形質転換体２０株のうちの１株Bacill
ussubtilis Ｔ４８［プラスミドｐＢＴＭ１２８（図２
参照）を含有するBacillussubtilis ＭＩ１１４］を用
い、対照として参考例１で得られたプラスミドｐＢＴＭ
１２４（プロモーターを含むＣＡＴ遺伝子を含有）およ
びｐＢＴＭ１２６（プロモーターが欠損したＣＡＴ遺伝
子を含有）を含むBacillus subtilis ＭＩ１１４を用い
た。まず、各株をクロラムフェニコール含有（５μｇ／
ml）又は非含有のＬ培地４０mlを含む２００ml容三角フ
ラスコで３０℃，１６時間振とう培養した。次に、得ら
れた培養液の１０mlを遠心分離して集めた菌体を２０m
Ｍ トリス−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７.８）で洗浄した。
洗浄菌体を０.５mg／mlのリゾチームを含む同じ緩衝液
１mlに懸濁し、３７℃で２５分間保温したのち超音波破
砕機で２Ａ，１０秒間処理し、遠心分離して得られた上
清を酵素液として、活性測定に用いた。ＣＡＴ活性は
５′，５−ジチオビス（２−ニトロ安息香酸）を用いる
比色法（Methods in Enzymology, ４３巻，７３７頁，
１９７５年）で測定した。蛋白質はLowryらの方法［J.
Biol. Chem., １９３，２６５（１９５１）］によって
定量した。表２にその結果を示す。
性はウイリアムスらの方法［前出］に基づき、ＣＡＴ活
性を測定することによって求めた。この活性測定には実
施例１で得られた形質転換体２０株のうちの１株Bacill
ussubtilis Ｔ４８［プラスミドｐＢＴＭ１２８（図２
参照）を含有するBacillussubtilis ＭＩ１１４］を用
い、対照として参考例１で得られたプラスミドｐＢＴＭ
１２４（プロモーターを含むＣＡＴ遺伝子を含有）およ
びｐＢＴＭ１２６（プロモーターが欠損したＣＡＴ遺伝
子を含有）を含むBacillus subtilis ＭＩ１１４を用い
た。まず、各株をクロラムフェニコール含有（５μｇ／
ml）又は非含有のＬ培地４０mlを含む２００ml容三角フ
ラスコで３０℃，１６時間振とう培養した。次に、得ら
れた培養液の１０mlを遠心分離して集めた菌体を２０m
Ｍ トリス−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７.８）で洗浄した。
洗浄菌体を０.５mg／mlのリゾチームを含む同じ緩衝液
１mlに懸濁し、３７℃で２５分間保温したのち超音波破
砕機で２Ａ，１０秒間処理し、遠心分離して得られた上
清を酵素液として、活性測定に用いた。ＣＡＴ活性は
５′，５−ジチオビス（２−ニトロ安息香酸）を用いる
比色法（Methods in Enzymology, ４３巻，７３７頁，
１９７５年）で測定した。蛋白質はLowryらの方法［J.
Biol. Chem., １９３，２６５（１９５１）］によって
定量した。表２にその結果を示す。
【００２３】
【表２】 表中、＋Ｃｍはクロラムフェニコール５μｇ／mlを含む
Ｌ培地を、−Ｃｍはクロラムフェニコール非含有のＬ培
地を示す。この結果からｐＢＴＭ１２８にクローニング
されたＤＮＡ断片は強力なプロモーター活性を有してい
ることが明らかになった。
Ｌ培地を、−Ｃｍはクロラムフェニコール非含有のＬ培
地を示す。この結果からｐＢＴＭ１２８にクローニング
されたＤＮＡ断片は強力なプロモーター活性を有してい
ることが明らかになった。
【００２４】実施例３ プラスミドの調製 Bacillus subtilis Ｔ４８を１％トリプトン（ディフコ
社，米国），０.５％酵母エキス（ディフコ社），０.５
％塩化ナトリウム，ｐＨ７.２からなるＬ培地（５００m
l）で２８℃，１６時間振とう培養した。得られた５０
０mlの培養液を遠心分離して集めた菌体に、６０mlの２
５％ショ糖を含むＴＥＳ緩衝液（３０mＭ Ｔris・ＨＣ
ｌ ｐＨ８.０−５０mＭ ＮaＣl−５mＭ ＥＤＴＡ），
１２mlの０.２５Ｍ ＥＤＴＡ ｐＨ８.０，１６mlの５
mg／mlリゾチーム溶液および０.８mlの５mg／mlリボヌ
クレアーゼＡ溶液を加え、３７℃で３０分間保温した。
さらに８mlの１０％ラウロイル硫酸ナトリウムを加え、
３７℃で１５分間保温した。つぎに２０mlの５Ｍ塩化ナ
トリウムを加え、０℃で３時間放置したのち遠心分離し
た。その上清に２倍容の冷エタノールを加え、−２０℃
で一夜放置した。遠心分離して得られた沈澱を８.６ml
の０.４％ザルコシールを含むＴＥＳ緩衝液に溶かし、
９ｇの塩化セシウムおよび０.２５mlの３０mg／mlエチ
ジウムブロマイド溶液を加えたのち、ベックマン超遠心
機（ローター５０Ｔi）を用いて２０℃で３８，０００
ｒｐｍで４８時間遠心した。紫外線照射によって検出さ
れるプラスミドのバンドを取り、これに［（比重）＝
１.６］の塩化セシウム−エチジウムブロマイド溶液を
加え、再びベックマン超遠心機（ローターＶti６５）を
用いて２０℃で５５，０００ｒｐｍで６時間遠心した。
プラスミドのバンドを取り、ｎ−ブタノール抽出によっ
てエチジウムブロマイドを除去したのちＴＥ緩衝液で透
析し、プラスミドｐＢＴＭ１２８（図２参照）を調製し
た。２６０nmの吸光度から約３３０μｇのプラスミドが
得られたことがわかった。
社，米国），０.５％酵母エキス（ディフコ社），０.５
％塩化ナトリウム，ｐＨ７.２からなるＬ培地（５００m
l）で２８℃，１６時間振とう培養した。得られた５０
０mlの培養液を遠心分離して集めた菌体に、６０mlの２
５％ショ糖を含むＴＥＳ緩衝液（３０mＭ Ｔris・ＨＣ
ｌ ｐＨ８.０−５０mＭ ＮaＣl−５mＭ ＥＤＴＡ），
１２mlの０.２５Ｍ ＥＤＴＡ ｐＨ８.０，１６mlの５
mg／mlリゾチーム溶液および０.８mlの５mg／mlリボヌ
クレアーゼＡ溶液を加え、３７℃で３０分間保温した。
さらに８mlの１０％ラウロイル硫酸ナトリウムを加え、
３７℃で１５分間保温した。つぎに２０mlの５Ｍ塩化ナ
トリウムを加え、０℃で３時間放置したのち遠心分離し
た。その上清に２倍容の冷エタノールを加え、−２０℃
で一夜放置した。遠心分離して得られた沈澱を８.６ml
の０.４％ザルコシールを含むＴＥＳ緩衝液に溶かし、
９ｇの塩化セシウムおよび０.２５mlの３０mg／mlエチ
ジウムブロマイド溶液を加えたのち、ベックマン超遠心
機（ローター５０Ｔi）を用いて２０℃で３８，０００
ｒｐｍで４８時間遠心した。紫外線照射によって検出さ
れるプラスミドのバンドを取り、これに［（比重）＝
１.６］の塩化セシウム−エチジウムブロマイド溶液を
加え、再びベックマン超遠心機（ローターＶti６５）を
用いて２０℃で５５，０００ｒｐｍで６時間遠心した。
プラスミドのバンドを取り、ｎ−ブタノール抽出によっ
てエチジウムブロマイドを除去したのちＴＥ緩衝液で透
析し、プラスミドｐＢＴＭ１２８（図２参照）を調製し
た。２６０nmの吸光度から約３３０μｇのプラスミドが
得られたことがわかった。
【００２５】 実施例４ プロモーターＤＮＡ断片の単離および性質 実施例３で得られたプラスミドｐＢＴＭ１２８（２２１
μｇ）をＰstＩ（２０８ユニット）およびＥcoＲＩ（２
２０ユニット）でそれぞれ３７℃で１時間切断したのち
１０％ポリアクリルアミドゲル電気泳動にかけた。ゲル
をエチジウムブロマイド溶液に浸して染色し、紫外線ラ
ンプで検出したプロモーターＤＮＡ断片を回収した。電
気的にＤＮＡ断片をゲルから溶出させたのちフェノール
抽出，エーテル抽出を行い、エタノール沈澱した。沈澱
をＴＥ緩衝液に溶かし、３.５５μｇのプロモーターＤ
ＮＡ断片を単離した。得られたプロモーターＤＮＡ断片
の大きさを４％ポリアクリルアミドゲル電気泳動で測定
した。プラスミドｐＢＲ３２２のＨae III分解物を標準
とすると約１２０ｂｐと算出された。本断片の塩基配列
はジヌクレオチド合成鎖停止法（前出）によって図１の
様に決定された。本断片は１１７ｂｐからなり、５′末
端にＥcoＲＩ切断部位を、３′末端にＰstＩ切断部位を
有する。また断片中には−１０領域および−３５領域と
思われる塩基配列が認められる。
μｇ）をＰstＩ（２０８ユニット）およびＥcoＲＩ（２
２０ユニット）でそれぞれ３７℃で１時間切断したのち
１０％ポリアクリルアミドゲル電気泳動にかけた。ゲル
をエチジウムブロマイド溶液に浸して染色し、紫外線ラ
ンプで検出したプロモーターＤＮＡ断片を回収した。電
気的にＤＮＡ断片をゲルから溶出させたのちフェノール
抽出，エーテル抽出を行い、エタノール沈澱した。沈澱
をＴＥ緩衝液に溶かし、３.５５μｇのプロモーターＤ
ＮＡ断片を単離した。得られたプロモーターＤＮＡ断片
の大きさを４％ポリアクリルアミドゲル電気泳動で測定
した。プラスミドｐＢＲ３２２のＨae III分解物を標準
とすると約１２０ｂｐと算出された。本断片の塩基配列
はジヌクレオチド合成鎖停止法（前出）によって図１の
様に決定された。本断片は１１７ｂｐからなり、５′末
端にＥcoＲＩ切断部位を、３′末端にＰstＩ切断部位を
有する。また断片中には−１０領域および−３５領域と
思われる塩基配列が認められる。
【００２６】 実施例５ 発現ベクターｐＢＴＭ１３４の作製 実施例３で得られたプラスミドｐＢＴＭ１２８（７.７
μｇ）を制限酵素ＰstＩ（５１ユニット）と３７℃，１
時間反応させて切断したのち、０.７５ユニットの大腸
菌アルカリフォスファターゼで６５℃，３０分間処理し
た。反応生成物は、反応液をフェノール抽出，エーテル
抽出したのち、エタノール沈澱を行って集めた。沈澱を
少量の水に溶解し、これに５′末端をリン酸化した８塩
基の合成ヌクレオチド ＧＧＡＧＧＴＡＴ（２００n
g），５′末端をリン酸化した１４塩基の合成ヌクレオ
チド ＣＧＡＴＡＣＣＴＣＣＴＧＣＡ（３５０ng），１
００nmoleのＡＴＰ，２８ユニットのＴ４ＤＮＡリガー
ゼ（宝酒造製）およびリガーゼ緩衝液を加え、反応液
（１００μｌ）を１１℃で２０時間保温したのち、エタ
ノール沈澱を行った。沈澱を少量の水に溶解し、２５ユ
ニットのＣlaＩで３７℃，１時間処理したのちセファロ
ース４Ｂカラムで小型オリゴヌクレオチドを除去し、目
的物をエタノール沈澱して集めた。沈澱を水に溶解し、
これに１００nmoleのＡＴＰ，２８ユニットのＴ４ＤＮ
Ａリガーゼ（宝酒造製）およびリガーゼ緩衝液を加えた
反応液（１００μｌ）を１１℃で２０時間保温してＣla
Ｉサイトを連結したのちその５０μｌを用いてプロトプ
ラスト法（前出）によってBacillus subtilis ＭＩ１１
４を形質転換させた。カナマイシンおよびクロラムフェ
ニコール耐性の形質転換株からプラスミドを単離し、こ
のプラスミドをｐＢＴＭ１３４（図５参照）と命名し
た。
μｇ）を制限酵素ＰstＩ（５１ユニット）と３７℃，１
時間反応させて切断したのち、０.７５ユニットの大腸
菌アルカリフォスファターゼで６５℃，３０分間処理し
た。反応生成物は、反応液をフェノール抽出，エーテル
抽出したのち、エタノール沈澱を行って集めた。沈澱を
少量の水に溶解し、これに５′末端をリン酸化した８塩
基の合成ヌクレオチド ＧＧＡＧＧＴＡＴ（２００n
g），５′末端をリン酸化した１４塩基の合成ヌクレオ
チド ＣＧＡＴＡＣＣＴＣＣＴＧＣＡ（３５０ng），１
００nmoleのＡＴＰ，２８ユニットのＴ４ＤＮＡリガー
ゼ（宝酒造製）およびリガーゼ緩衝液を加え、反応液
（１００μｌ）を１１℃で２０時間保温したのち、エタ
ノール沈澱を行った。沈澱を少量の水に溶解し、２５ユ
ニットのＣlaＩで３７℃，１時間処理したのちセファロ
ース４Ｂカラムで小型オリゴヌクレオチドを除去し、目
的物をエタノール沈澱して集めた。沈澱を水に溶解し、
これに１００nmoleのＡＴＰ，２８ユニットのＴ４ＤＮ
Ａリガーゼ（宝酒造製）およびリガーゼ緩衝液を加えた
反応液（１００μｌ）を１１℃で２０時間保温してＣla
Ｉサイトを連結したのちその５０μｌを用いてプロトプ
ラスト法（前出）によってBacillus subtilis ＭＩ１１
４を形質転換させた。カナマイシンおよびクロラムフェ
ニコール耐性の形質転換株からプラスミドを単離し、こ
のプラスミドをｐＢＴＭ１３４（図５参照）と命名し
た。
【００２７】 実施例６ ヒト免疫インターフェロン遺伝子の発現 参考例２で得られたプラスミドｐＨＩＴtrp２１０１よ
り単離して得られたヒト免疫インターフェロン遺伝子を
含む１.０３ｋｂのＣlaＩ−ＰstＩ断片５μｇに５′末
端をリン酸化した８塩基の合成オリゴヌクレオチドＧＡ
ＴＣＧＡＴＣ（３００ng），５′末端をリン酸化した１
２塩基の合成オリゴヌクレオチドＧＡＴＣＧＡＴＣＴＧ
ＣＡ（４５０ng），１００nmoleのＡＴＰ，２０００ユ
ニットのＴ４ＤＮＡリガーゼ（ニューイングランドバイ
オラブ製，米国）およびリガーゼ緩衝液を加えた反応液
（１００μｌ）を１１℃で２４時間保温したのち、エタ
ノール沈澱を行った。沈澱を水に溶解し、２５ユニット
の制限酵素ＣlaＩで３７℃，１時間反応させたのち、セ
ファロース４Ｂカラム（１.５ml）で小型オリゴヌクレ
オチドを除去し、エタノール沈澱を行ってヒト免疫イン
ターフェロン遺伝子の両末端がＣlaＩサイトとなったＤ
ＮＡ断片を得た。一方、実施例５で得られた発現ベクタ
ーｐＢＴＭ１３４の１.１μｇを１０ユニットのＣlaＩ
で３７℃，１時間切断し、０.１ユニットの大腸菌アル
カリ性フォスファターゼで６５℃，３０分間処理したの
ちフェノール抽出およびエーテル抽出し、エタノール沈
澱を行った。この沈澱および上記の沈澱を少量の水に溶
解したのち混合し、さらに１００nmoleのＡＴＰ，１２
００ユニットのＴ４ＤＮＡリガーゼ（ニューイングラン
ドバイオラブ製）およびリガーゼ緩衝液を加えて得られ
た反応液（１００μｌ）を１１℃で２４時間保温し、こ
の５０μｌを用いてプロトプラスト法によってBacillus
subtilis ＭＩ１１４を形質転換させた。カナマイシン
耐性の形質転換株からプラスミドを単離し、ｐＢＴＭ１
３４のＣlaＩサイトにヒト免疫インターフェロン遺伝子
を有するＤＮＡ断片が正方向および逆方向に挿入された
プラスミドをそれぞれｐＨＩＴ−Ｂ１０１（図６参照）
およびｐＨＩＴ−Ｂ１０２と命名した。プラスミドｐＢ
ＴＭ１３４，ｐＨＩＴ−Ｂ１０１およびｐＨＩＴ−Ｂ１
０２を保持するバチルス・サチルスＭＩ１１４を４０ml
のＬ培地（５μｇ／mlのカナマイシン含有）を含む２０
０ml容三角フラスコに寒天培地より接種し、３７℃で５
時間振とう培養したところＯＤ600が１.２に達した。得
られた培養液を遠心分離し、その菌体を３０mＭトリス
・ＨＣｌ緩衝液ｐＨ８.０−５０mＭ ＮaＣl−５mＭ Ｅ
ＤＴＡで２回洗浄したのちドライアイス−エタノール
（−７０℃）で凍結した。この凍結菌体を２mlの５０m
Ｍ トリス・ＨＣｌ緩衝液ｐＨ８.０−１０％ショ糖−１
００mＭ ＮaＣl−１０mＭ ＥＤＴＡ−２０mＭ スペルミ
ジン−１mg／mlアルブミンに懸濁し、４０μｌの２０mg
／mlリゾチーム溶液を加え、３７℃で２０分間保温した
のち、超音波破砕機で１９.５ＫＨz，１０秒間処理し
た。処理液を１５０００ｒｐｍで１５分間遠心し、その
上清をヒト免疫インターフェロンの定量の標品に供し
た。ヒト羊膜由来wish細胞に対する水泡性口内炎ウイル
ス（ＶＳＶ）の細胞変性効果阻止試験により、上記で得
られたヒト免疫インターフェロンの抗ウイルス活性を定
量した結果、プラスミドｐＢＴＭ１３４，ｐＨＩＴ−Ｂ
１０２を有するBacillus subtilis ＭＩ１１４株ではヒ
ト免疫インターフェロン活性は認められなかったが、プ
ラスミドｐＨＩＴ−Ｂ１０１を有するBacillus subtili
s ＭＩ１１４株では１２３８ユニット／ml（抽出液）の
ヒト免疫インターフェロン活性が認められた。
り単離して得られたヒト免疫インターフェロン遺伝子を
含む１.０３ｋｂのＣlaＩ−ＰstＩ断片５μｇに５′末
端をリン酸化した８塩基の合成オリゴヌクレオチドＧＡ
ＴＣＧＡＴＣ（３００ng），５′末端をリン酸化した１
２塩基の合成オリゴヌクレオチドＧＡＴＣＧＡＴＣＴＧ
ＣＡ（４５０ng），１００nmoleのＡＴＰ，２０００ユ
ニットのＴ４ＤＮＡリガーゼ（ニューイングランドバイ
オラブ製，米国）およびリガーゼ緩衝液を加えた反応液
（１００μｌ）を１１℃で２４時間保温したのち、エタ
ノール沈澱を行った。沈澱を水に溶解し、２５ユニット
の制限酵素ＣlaＩで３７℃，１時間反応させたのち、セ
ファロース４Ｂカラム（１.５ml）で小型オリゴヌクレ
オチドを除去し、エタノール沈澱を行ってヒト免疫イン
ターフェロン遺伝子の両末端がＣlaＩサイトとなったＤ
ＮＡ断片を得た。一方、実施例５で得られた発現ベクタ
ーｐＢＴＭ１３４の１.１μｇを１０ユニットのＣlaＩ
で３７℃，１時間切断し、０.１ユニットの大腸菌アル
カリ性フォスファターゼで６５℃，３０分間処理したの
ちフェノール抽出およびエーテル抽出し、エタノール沈
澱を行った。この沈澱および上記の沈澱を少量の水に溶
解したのち混合し、さらに１００nmoleのＡＴＰ，１２
００ユニットのＴ４ＤＮＡリガーゼ（ニューイングラン
ドバイオラブ製）およびリガーゼ緩衝液を加えて得られ
た反応液（１００μｌ）を１１℃で２４時間保温し、こ
の５０μｌを用いてプロトプラスト法によってBacillus
subtilis ＭＩ１１４を形質転換させた。カナマイシン
耐性の形質転換株からプラスミドを単離し、ｐＢＴＭ１
３４のＣlaＩサイトにヒト免疫インターフェロン遺伝子
を有するＤＮＡ断片が正方向および逆方向に挿入された
プラスミドをそれぞれｐＨＩＴ−Ｂ１０１（図６参照）
およびｐＨＩＴ−Ｂ１０２と命名した。プラスミドｐＢ
ＴＭ１３４，ｐＨＩＴ−Ｂ１０１およびｐＨＩＴ−Ｂ１
０２を保持するバチルス・サチルスＭＩ１１４を４０ml
のＬ培地（５μｇ／mlのカナマイシン含有）を含む２０
０ml容三角フラスコに寒天培地より接種し、３７℃で５
時間振とう培養したところＯＤ600が１.２に達した。得
られた培養液を遠心分離し、その菌体を３０mＭトリス
・ＨＣｌ緩衝液ｐＨ８.０−５０mＭ ＮaＣl−５mＭ Ｅ
ＤＴＡで２回洗浄したのちドライアイス−エタノール
（−７０℃）で凍結した。この凍結菌体を２mlの５０m
Ｍ トリス・ＨＣｌ緩衝液ｐＨ８.０−１０％ショ糖−１
００mＭ ＮaＣl−１０mＭ ＥＤＴＡ−２０mＭ スペルミ
ジン−１mg／mlアルブミンに懸濁し、４０μｌの２０mg
／mlリゾチーム溶液を加え、３７℃で２０分間保温した
のち、超音波破砕機で１９.５ＫＨz，１０秒間処理し
た。処理液を１５０００ｒｐｍで１５分間遠心し、その
上清をヒト免疫インターフェロンの定量の標品に供し
た。ヒト羊膜由来wish細胞に対する水泡性口内炎ウイル
ス（ＶＳＶ）の細胞変性効果阻止試験により、上記で得
られたヒト免疫インターフェロンの抗ウイルス活性を定
量した結果、プラスミドｐＢＴＭ１３４，ｐＨＩＴ−Ｂ
１０２を有するBacillus subtilis ＭＩ１１４株ではヒ
ト免疫インターフェロン活性は認められなかったが、プ
ラスミドｐＨＩＴ−Ｂ１０１を有するBacillus subtili
s ＭＩ１１４株では１２３８ユニット／ml（抽出液）の
ヒト免疫インターフェロン活性が認められた。
【００２８】実施例７ ＩＬ−２遺伝子の発現 プラスミドｐＢＴＭ１３４（１μｇ）を制限酵素ＣlaＩ
（１０ユニット）で３７℃，１時間切断し、さらに０.
１ユニットの大腸菌アルカリ性フォスファターゼで６５
℃，３０分間処理したのち、反応液をフェノール抽出お
よびエーテル抽出し、エタノール沈澱を行ってＤＮＡを
沈澱させた。一方、参考例３で得られたＩＬ−２遺伝子
を有するプラスミドｐＴＦ５より、ＩＬ−２遺伝子を含
む１.３ｋｂのＣlaＩＤＮＡ断片を単離した。上記のよ
うにして得られたプラスミドｐＢＴＭ１３４のＣlaＩ分
解物（０.５μｇ）および１.３ｋｂのＣlaＩＤＮＡ断片
（０.６μｇ）を混合し、これに１００nmoleのＡＴＰ，
２０００ユニットのＴ４ＤＮＡリガーゼ（ニューイング
ランド・バイオラブス製）およびリガーゼ緩衝液を加え
た１００μｌの反応液を１１℃で２４時間保温してｐＢ
ＴＭ１３４に１.３ｋｂのＣlaＩＤＮＡ断片を結合させ
た。これを用いてBacillus subtilis ＭＩ１１４を形質
転換させ、得られたカナマイシン耐性株からプラスミド
を調製し、プラスミドｐＢＴＭ１３４のＣlaＩサイトに
ＩＬ−２遺伝子を有する１.３ｋｂのＤＮＡ断片が正方
向および逆方向に挿入されたプラスミドを得、それぞれ
ｐＩＬＴ−Ｂ１０１およびｐＩＬＴ−Ｂ１０２と命名し
た。なお本ＤＮＡ断片の方向性は制限酵素ＥcoＲＩ−Ｘ
baＩを用いて決定した。このプラスミドｐＩＬＴ−Ｂ１
０１を有するBacillus subtilis ＭＩ１１４は財団法人
発酵研究所にＩＦＯ−１４３０５として、また通商産業
省工業技術院微生物工業技術研究所にＦＥＲＭＢＰ−６
１０として寄託されている。プラスミドｐＢＴＭ１３
４，ｐＩＬＴ−Ｂ１０１およびｐＩＬＴ−Ｂ１０２を保
持するBacillus subtilis ＭＩ１１４を４０mlのＬ培地
（５μｇ／mlのカナマイシン含有）を含む２００ml容三
角フラスコで３７℃，４時間振とう培養するとＯＤ600
が１.１〜１.５に達した。得られた培養液を遠心分離し
て集めた菌体を１Ｍ ＫＣｌで３回洗浄したのち、まず
ドライアスイ−エタノール（−７０℃）で凍結した。つ
ぎに凍結菌体を２mlの３０mＭ Ｔris・ＨＣｌ（ｐＨ８.
０）−５０mＭ ＮａＣｌ−５mＭ ＥＤＴＡ−１mg／mlア
ルブミンに懸濁し、これに５０μｌの２０mg／mlリゾチ
ーム溶液を加え、３７℃で１５分間保温したのち、超音
波破砕機で１９.５ＫＨz，１０秒間処理した。この処理
液を１００００ｒｐｍで１０分間遠心し、その上清をＩ
Ｌ−２の定量に供した。ＩＬ−２の定量はＩＬ−２依存
性マウスＮＫＣ３細胞の生育促進を3Ｈ−チミジンの取
込みを測定することによって行った。表３に各プラスミ
ドを保持する菌株のＩＬ−２活性を示す。
（１０ユニット）で３７℃，１時間切断し、さらに０.
１ユニットの大腸菌アルカリ性フォスファターゼで６５
℃，３０分間処理したのち、反応液をフェノール抽出お
よびエーテル抽出し、エタノール沈澱を行ってＤＮＡを
沈澱させた。一方、参考例３で得られたＩＬ−２遺伝子
を有するプラスミドｐＴＦ５より、ＩＬ−２遺伝子を含
む１.３ｋｂのＣlaＩＤＮＡ断片を単離した。上記のよ
うにして得られたプラスミドｐＢＴＭ１３４のＣlaＩ分
解物（０.５μｇ）および１.３ｋｂのＣlaＩＤＮＡ断片
（０.６μｇ）を混合し、これに１００nmoleのＡＴＰ，
２０００ユニットのＴ４ＤＮＡリガーゼ（ニューイング
ランド・バイオラブス製）およびリガーゼ緩衝液を加え
た１００μｌの反応液を１１℃で２４時間保温してｐＢ
ＴＭ１３４に１.３ｋｂのＣlaＩＤＮＡ断片を結合させ
た。これを用いてBacillus subtilis ＭＩ１１４を形質
転換させ、得られたカナマイシン耐性株からプラスミド
を調製し、プラスミドｐＢＴＭ１３４のＣlaＩサイトに
ＩＬ−２遺伝子を有する１.３ｋｂのＤＮＡ断片が正方
向および逆方向に挿入されたプラスミドを得、それぞれ
ｐＩＬＴ−Ｂ１０１およびｐＩＬＴ−Ｂ１０２と命名し
た。なお本ＤＮＡ断片の方向性は制限酵素ＥcoＲＩ−Ｘ
baＩを用いて決定した。このプラスミドｐＩＬＴ−Ｂ１
０１を有するBacillus subtilis ＭＩ１１４は財団法人
発酵研究所にＩＦＯ−１４３０５として、また通商産業
省工業技術院微生物工業技術研究所にＦＥＲＭＢＰ−６
１０として寄託されている。プラスミドｐＢＴＭ１３
４，ｐＩＬＴ−Ｂ１０１およびｐＩＬＴ−Ｂ１０２を保
持するBacillus subtilis ＭＩ１１４を４０mlのＬ培地
（５μｇ／mlのカナマイシン含有）を含む２００ml容三
角フラスコで３７℃，４時間振とう培養するとＯＤ600
が１.１〜１.５に達した。得られた培養液を遠心分離し
て集めた菌体を１Ｍ ＫＣｌで３回洗浄したのち、まず
ドライアスイ−エタノール（−７０℃）で凍結した。つ
ぎに凍結菌体を２mlの３０mＭ Ｔris・ＨＣｌ（ｐＨ８.
０）−５０mＭ ＮａＣｌ−５mＭ ＥＤＴＡ−１mg／mlア
ルブミンに懸濁し、これに５０μｌの２０mg／mlリゾチ
ーム溶液を加え、３７℃で１５分間保温したのち、超音
波破砕機で１９.５ＫＨz，１０秒間処理した。この処理
液を１００００ｒｐｍで１０分間遠心し、その上清をＩ
Ｌ−２の定量に供した。ＩＬ−２の定量はＩＬ−２依存
性マウスＮＫＣ３細胞の生育促進を3Ｈ−チミジンの取
込みを測定することによって行った。表３に各プラスミ
ドを保持する菌株のＩＬ−２活性を示す。
【００２９】
【００３０】
配列番号：１ 配列の長さ：１１７ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：genomic DNA 起源 生物名：Bacillus subtilis 配列: AATTCCAAGT GTTAATATTC CTTAAAAAAC ATTTACTTCC ATGGAAAATG ATGATAGATT 60 AATTTTTAAG AAAAAGAACT GGTAATTCGC GAATTATGAA AAAGCGCTTT TTCTGCA 117 配列番号：２ 配列の長さ：１８ 配列の型：核酸 鎖の数：両方 トポロジー：直鎖状 配列の種類：その他の核酸（化学合成ＤＮＡ） 配列： CGATA ATG TGT TAC TGC C 18 配列番号：３ 配列の長さ：５ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列： Lys His Leu Gln Cys 配列番号：４ 配列の長さ：５ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列： Thr Phe Met Cys Glu 配列番号：５ 配列の長さ：１５ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：その他の核酸（化学合成ＤＮＡ） 配列： AAA CAT CTT CAG TGT 配列番号：６ 配列の長さ：１５ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：その他の核酸（化学合成ＤＮＡ） 配列： ACA TTC ATG TGT GAA 配列番号：７ 配列の長さ：１１ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：その他の核酸（化学合成ＤＮＡ） 配列： CGATA ATG GCA 配列番号：８ 配列の長さ：１４ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：その他の核酸（化学合成ＤＮＡ） 配列： CGATACCTCC TGCA 配列番号：９ 配列の長さ：１２ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：その他の核酸（化学合成ＤＮＡ） 配列： GATCGATCTG CA 配列番号：１０ 配列の長さ：６０４ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：cDNA to mRNA 配列： GGGGGGGGGG GGGGGGGATC ACTCTCTTTA ATCACTACTC ACAGTAACCT CAACTCCTGC 60 CACA ATG TAC AGG ATG CAA CTC CTG TCT TGC ATT GCA CTA AGT CTT GCA 109 CTT GTC ACA AAC AGT GCA CCT ACT TCA AGT TCT ACA AAG AAA ACA CAG 157 CTA CAA CTG GAG CAT TTA CTG CTG GAT TTA CAG ATG ATT TTG AAT GGA 205 ATT AAT AAT TAC AAG AAT CCC AAA CTC ACC AGG ATG CTC ACA TTT AAG 253 TTT TAC ATG CCC AAG AAG GCC ACA GAA CTG AAA CAT CTT CAG TGT CTA 301 GAA GAA GAA CTC AAA CCT CTG GAG GAA GTG CTA AAT TTA GCT CAA AGC 349 AAA AAC TTT CAC TTA AGA CCC AGG GAC TTA ATC AGC AAT ATC AAC GTA 397 ATA GTT CTG GAA CTA AAG GGA TCT GAA ACA ACA TTC ATG TGT GAA TAT 445 GCT GAT GAG ACA GCA ACC ATT GTA GAA TTT CTG AAC AGA TGG ATT ACC 493 TTT TGT CAA AGC ATC ATC TCA ACA CTG ACT TGA TAATTAAGTG CTTCCCACTT 546 AAAACATATC AGGCCTTCTA TTTATTTAAA TATTTAAATT TTACCCCCCC CCCCCCCC 604 配列番号：１１ 配列の長さ：２８ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：その他の核酸（プラスミドの部分配列） 配列： CTGCAGGAGG TATCGATACC TCCTGCAG 配列番号：１２ 配列の長さ：２４ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：その他の核酸（プラスミドの部分配列） 配列： CTGCAGGAGG TATCGATA ATG TGT 配列番号：１３ 配列の長さ：１２ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：その他の核酸（プラスミドの部分配列） 配列： CTGCAGATCG AT
【図１】ＤＮＡ断片の塩基配列を示す。
【図２】プラスミドｐＢＴＭ１２６およびｐＢＴＭ１２
８の制限酵素地図を示す。
８の制限酵素地図を示す。
【図３】プラスミドｐＩＬＯＴ１３５−８を示す。
【図４】プラスミドｐＩＬＯＴ１３５−８に挿入された
ＩＬ−２をコードするｃＤＮＡの塩基配列を示す。
ＩＬ−２をコードするｃＤＮＡの塩基配列を示す。
【図５】プラスミドｐＢＴＭ１３４の構築図を示す。
【図６】プラスミドｐＨＩＴ−Ｂ１０１の構築図を示
す。
す。
【図７】プラスミドｐＩＬＴ−Ｂ１０１の構築図を示
す。
す。
５′は５′末端を示す。 ３′は３′末端を示す。 Ｏriは複製開始点を示す。 Ｋmrはカナマイシン耐性遺伝子を示す。 Ｃmはプロモーター欠損クロラムフェニコール耐性遺伝
子（クロラムフェニコール・アセチル・トランスフェラ
ーゼ遺伝子）を示す。 Ｐはプロモーターを示す。 ＳＤはリボゾーム結合部位を示す。 Ｔcrはテトラサイクリン耐性遺伝子を示す。 Ａmprはアンピシリン耐性遺伝子を示す。 trp−Ｐは trpプロモーターを示す。 ＩＦＮ−γはヒト免疫インターフェロン遺伝子を示す。 ＩＬ−２はインターロイキン−２遺伝子を示す。
子（クロラムフェニコール・アセチル・トランスフェラ
ーゼ遺伝子）を示す。 Ｐはプロモーターを示す。 ＳＤはリボゾーム結合部位を示す。 Ｔcrはテトラサイクリン耐性遺伝子を示す。 Ａmprはアンピシリン耐性遺伝子を示す。 trp−Ｐは trpプロモーターを示す。 ＩＦＮ−γはヒト免疫インターフェロン遺伝子を示す。 ＩＬ−２はインターロイキン−２遺伝子を示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｒ 1:125） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:125） Ｃ１２Ｒ 1:125）
Claims (1)
- 【請求項１】式 ５′ＡＡＴＴＣＣＡＡＧＴＧＴＴＡＡＴＡＴＴＣＣＴＴ
ＡＡＡＡＡＡＣＡＴＴＴＡＣＴＴＣＣＡＴＧＧＡＡＡＡ
ＴＧＡＴＧＡＴＡＧＡＴＴＡＡＴＴＴＴＴＡＡＧＡＡＡ
ＡＡＧＡＡＣＴＧＧＴＡＡＴＴＣＧＣＧＡＡＴＴＡＴＧ
ＡＡＡＡＡＧＣＧＣＴＴＴＴＴＣＴＧＣＡ ３′ で示される塩基配列もしくはプロモーター活性を有する
その一部の下流にＳＤ配列、およびＳＤ配列の下流に目
的とする蛋白質をコードする遺伝子を含む組み換えＤＮ
Ａで形質転換させたバチルス属菌を培養し、培養物から
目的とする蛋白質を採取することを特徴とする遺伝子産
物の製造法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2411657A JPH07108231B2 (ja) | 1990-12-19 | 1990-12-19 | 遺伝子産物の製造法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2411657A JPH07108231B2 (ja) | 1990-12-19 | 1990-12-19 | 遺伝子産物の製造法 |
Related Parent Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP58248645A Division JPS60137291A (ja) | 1983-12-26 | 1983-12-26 | 発現ベクター |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH06284898A JPH06284898A (ja) | 1994-10-11 |
| JPH07108231B2 true JPH07108231B2 (ja) | 1995-11-22 |
Family
ID=18520626
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2411657A Expired - Lifetime JPH07108231B2 (ja) | 1990-12-19 | 1990-12-19 | 遺伝子産物の製造法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH07108231B2 (ja) |
-
1990
- 1990-12-19 JP JP2411657A patent/JPH07108231B2/ja not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH06284898A (ja) | 1994-10-11 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US4582800A (en) | Novel vectors and method for controlling interferon expression | |
| JP2533470B2 (ja) | 豚成長ホルモンを生産するためのｄｎａ配列，組換ｄｎａ分子および生産方法 | |
| JPH0321151B2 (ja) | ||
| GB2079291A (en) | Interferons and process for their preparation | |
| HU196455B (en) | Process for producing transformants giving curative peptides | |
| PL149079B1 (en) | Method of obtaining polypeptides of ifn-beta type | |
| JP2721139B2 (ja) | 動物のインターフェロン | |
| JPH0838177A (ja) | 組換ｄｎａ分子の作製方法 | |
| JPH0745516B2 (ja) | ヒトγ―インターフェロン活性を有するポリペプチドおよびその製造法 | |
| Tsurimoto et al. | Bacteriophage lambda initiators: preparation from a strain that overproduces the O and P proteins | |
| JPH0753114B2 (ja) | キユウリモザイクウイルスの３ａ蛋白質をコ−ドする遺伝子 | |
| US4716112A (en) | Vectors for increased expression of cloned genes | |
| US4705750A (en) | Promoter plasmid containing the promoter and use thereof in transforming Bacillus | |
| JPS58201798A (ja) | アルフア−インタ−フエロンＧｘ−１ | |
| JPH07112435B2 (ja) | 新規インターフェロン−γ−ポリペプチドをコードするＤＮＡ | |
| JPH07108231B2 (ja) | 遺伝子産物の製造法 | |
| EP0126230A1 (en) | Novel DNA and use thereof | |
| RU2008355C1 (ru) | Фрагмент днк, кодирующий синтез гликопротеина g вируса бешенства, рекомбинантная плазмидная днк pvg18-1, кодирующая гликопротеин g вируса бешенства, штамм бактерий escherichia coli - продуцент гликопротеина g вируса бешенства | |
| KR102768742B1 (ko) | 대장균 기반 재조합 균주 및 이의 구축 방법과 응용 | |
| JPH0142279B2 (ja) | ||
| EP0230781A2 (en) | Lymphotoxin gene, method for its production, and lymphotoxin | |
| EP0121569A1 (en) | Novel vector | |
| US5270180A (en) | Method for the production of salmon growth hormone using a synthetic gene | |
| JP3014717B2 (ja) | プリン・ヌクレオシド・ホスホリラーゼをコードするｄｎａ断片 | |
| JPH05137580A (ja) | 新規なプロテインおよびそれをコードする遺伝子 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 19970204 |