JPH07115985A - 生理活性物質ａｍ４２９９、それらの製法ならびに用途 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【構成】 下記一般式（１） 【化１】 〔式中、Ｒは−ＣＨ₂ ＯＨまたは−ＣＨ（ＮＨ₂)ＣＯＯ
Ｈで表される基を示す。〕で示される生理活性物質ＡＭ
４２９９またはそれらの無毒性塩、クロメロスポリウム
属に属する一般式（１）で示される生理活性物質ＡＭ４
２９９生産菌を培地に培養し、次いで培養物から該生理
活性物質ＡＭ４２９９を採取することを特徴とする該生
理活性物質ＡＭ４２９９の製法、ならびに一般式（１）
で示される生理活性物質ＡＭ４２９９またはそれらの無
毒性塩を有効成分とする骨疾患の予防または治療剤。 【効果】 新規なチオ−ルプロテア−ゼ阻害活性を有す
るＡＭ４２９９Ａ物質およびＡＭ４２９９Ｂ物質ならび
にそれらの無毒性塩を提供するもので、これらの物質は
悪性体液性高カルシウム血症、骨ペ−ジェット病および
骨粗鬆症等の骨疾患、さらに続発性副甲状腺機能亢進症
に伴う骨疾患の予防または抑制しうるもので、種々の骨
疾患の予防または治療剤として有用である。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、クロメロスポリウム
（Chromelosporium)属に属する微生物が生産するチオ−
ルプロテア−ゼ阻害活性を有する生理活性物質ＡＭ４２
９９またはそれらの無毒性塩、それらの製造法、さらに
はそれらを有効成分とする骨疾患の予防または治療剤に
関する。

【０００２】

【従来の技術】従来、チオ−ルプロテア−ゼを特異的に
阻害する活性を有する物質としては、微生物によって生
産されるＥ−６４（Agric.Biol.Chem.42: 523-528, 197
8), Thiolstatin (Agric.Biol.Chem.49: 895-897, 198
5),Estatins(J.Antibiotics.42:1362-1369, 1989) など
が知られている。また合成的手法により得られたものと
しては、Ｅ−６４物質の誘導体など（特開昭５２−３１
０２４号公報、特開昭５３−１０８９２３号公報、特開
昭５４−１４１７３４号公報、特開昭５５−３５０１２
号公報、特開平２−３０４０７５号公報）が知られてい
る。

【０００３】近年、高齢者人口の増加と共に老人病が増
加している。中でも骨粗鬆症をはじめとする骨疾患は骨
折を多発し、寝たきり老人につながる疾病として、その
予防と治療法の開発が望まれている。骨は常に造られて
は壊され、骨形成と骨吸収のバランスの上にその構造お
よび量は維持されている。従って、加齢あるいはその他
の原因によりそのバランスが崩れると、種々の骨疾患を
発症する。骨吸収の異常亢進によって起こる疾患として
は、骨髄腫やリンパ腫などが原因で起こる悪性高カルシ
ウム血症、局所性骨吸収によりもたらされる骨ペ−ジェ
ット病、加齢により骨重量が減少する骨粗鬆症などが挙
げられる。

【０００４】骨は主にコラ−ゲン線維とカルシウム塩か
らなり、この両者が結びついて強固な骨が形成される。
とりわけカルシウム塩は全骨重量の７０％を占めるが、
骨疾患においてはその進行と共にカルシウム塩が骨から
血液中に溶けだして徐々に失われる。このような疾患の
予防または治療には、これまでカルシウムを補うかある
いは維持する療法が採用され、活性型ビタミンＤ₃ 製剤
およびカルシウム製剤などが用いられてきた。また骨か
らの脱灰を抑制する目的でエストロゲン製剤およびカル
シトニン製剤のようなホルモン剤が用いられてきた。

【０００５】このようなカルシウム塩の減少防止の観点
に基づく治療に加えて、最近、骨疾患におけるコラ−ゲ
ン線維の減少防止の重要性も着目されつつある。即ち、
骨の支持体として存在するＩ型コラ−ゲンがチオ−ルプ
ロテア−ゼの一種であるカテプシンＬにより分解される
ことが明らかにされている（BIO Industry.8: 313-318,
1991)。カテプシンＬが関節軟骨を構成するコラ−ゲン
のタイプＩＩ型、ＩＸ型およびＸＩ型を中性領域で分解
することも報告されている（FEBS Letters.269: 189-19
3, 1990)。またチオ−ルプロテア−ゼの阻害剤が骨吸収
を抑制することも報告されている（Biochemical and Bi
ophysical Research Communications.125: 441-447, 19
84) 。このような状況から、ある種のチオ−ルプロテア
−ゼ阻害剤がカルシウム塩とコラ−ゲン線維の減少を同
時に抑制しうる物質として、これを骨吸収性疾患の治療
に用いることが提案されている（特開昭６３−２８４１
２７号公報、特開平２−２１８６１０号公報）。しかし
ながら、実用的な治療剤の提供には至っていない。

【０００６】

【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、悪性
高カルシウム血症、骨ペ−ジェット病および骨粗鬆症や
続発性副甲状腺機能亢進症に伴う骨吸収性疾患の予防ま
たは治療に有用な新規チオ−ルプロテア−ゼ阻害物質を
提供することにある。より詳細には、骨吸収性疾患にお
いて、カルシウムを補給または維持する従来の療法に代
えて、骨中のカルシウム塩の減少を抑制すると同時に、
コラ−ゲン線維の減少も抑制して、より効果的な予防お
よび治療を可能とする骨疾患治療剤を提供することにあ
る。

【０００７】

【課題を解決するための手段】上記目的を達成するため
各方面から検討した結果、本発明者らは、安全性の面か
ら天然物に着目し、微生物の醗酵生産物に注目するに至
り、各種微生物を検索した結果、沖縄県西表島で採取し
た山林土壌サンプルから新たに分離した糸状菌Ｍ４２９
９株が培養液中に目的物質を蓄積することを発見した。
そして更にこれらの物質についてその理化学的性質を詳
細に研究した結果、従来未知の新規物質であることを確
認し、下記一般式（１）

【０００８】

【化４】

【０００９】〔式中、Ｒは−ＣＨ₂ ＯＨまたは−ＣＨ
（ＮＨ₂)ＣＯＯＨで表される基を示す。〕で示される生
理活性物質を見い出し、生理活性物質ＡＭ４２９９と命
名し、これらと同一の構造を有する物質の報告はない。
また、一般式（１）で示される物質において基Ｒが−Ｃ
Ｈ₂ ＯＨの場合にＡＭ４２９９Ａ物質、及び一般式
（１）で示される物質において基Ｒが−ＣＨ（ＮＨ₂)Ｃ
ＯＯＨの場合にＡＭ４２９９Ｂ物質と命名した。

【００１０】そして更に研究の結果、下記の述べる通り
同定したクロメロスポリウム属に属する一般式（１）で
示される生理活性物質ＡＭ４２９９生産菌を培地に培養
し、次いで培養物から該生理活性物質ＡＭ４２９９を採
取することを特徴とする該生理活性物質ＡＭ４２９９の
工業的製法を確立し、またチオ−ルプロテア−ゼ阻害作
用も併せて確認し、本発明を完成するに至った。

【００１１】本発明に係わるＡＭ４２９９Ａ物質ならび
にＡＭ４２９９Ｂ物質は、次に示される理化学的性質を
有する新規物質である。ＡＭ４２２２Ａ物質の理化学的性質 （ａ）物質の色及び状態 白色粉末 （ｂ）比旋光度 ［α］_D ²² ＋１４．６°（ｃ＝０．５、Ｈ₂ Ｏ） （ｃ）分子式 Ｃ₁₅Ｈ₂₆Ｏ₆ Ｎ₂ （ｄ）ＦＡＢ−ＭＳ ｍ／ｚ ３３１（Ｍ＋Ｈ）⁺ （ｅ）元素分析 計算値（％）（Ｃ₁₅Ｈ₂₆Ｏ₆ Ｎ₂ ・２Ｈ₂ Ｏに対し
て）：Ｃ，４９．１７；Ｈ，８．２５；Ｎ，７．６５ 実測値（％） Ｃ，４９．３８；Ｈ，７．９６；Ｎ，
７．９１ （ｆ）溶解性 水、ジメチルスルホキシド、酢酸、ピリジンに可溶；ベ
ンゼン、クロロホルム、酢酸エチルに不溶性。 （ｇ）呈色反応 ヨウ素蒸気反応、過マンガン酸カリウム脱色反応に陽性
を示し、塩化第二鉄反応、ニンヒドリン反応、モ−リッ
シュ反応に陰性を示す。 （ｈ）Ｒｆ値 約０．２４ メルク社製、Ｋｉｅｓｅｌｇｅｌ ６０Ｆ
₂₅₄ 使用 展開溶媒：クロロホルム／メタノ−ル／酢酸（５：２：
０．１） （ｉ）紫外部吸収スペクトル（１００γ／ｍｌとして蒸
留水に溶解） 末端吸収を示す。 （ｊ）赤外部吸収スペクトル（ＫＢｒによる。図１に示
す。） 有意なシグナルは次のとおりである。

【００１２】３４００、１６４０、１５６０、１３９
０、９００ｃｍ^-1付近。 （ｋ） ¹Ｈ−ＮＭＲスペクトル（４００ＭＨｚ、Ｄ
₂ Ｏ） ケミカルシフトは次のとおりである。 ０．８９（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．４Ｈｚ）、０．９３（３
Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．４Ｈｚ）、１．３３（２Ｈ，ｍ）、
１．５０−１．５８（４Ｈ，ｍ）、１．６０−１．６８
（３Ｈ，ｍ）、３．２１（２Ｈ，ｍ）、３．４３（１
Ｈ，ｄ，Ｊ＝２．４Ｈｚ）、３．５７（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝
２．４Ｈｚ）、３．５９（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝６．８Ｈ
ｚ）、４．３１（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝５．６Ｈｚ） （ｌ）¹³Ｃ−ＮＭＲスペクトル（２７０ＭＨｚ，Ｄ
₂ Ｏ） ケミカルシフトは次のとおりである。

【００１３】１７５．０（ｓ）、１７４．７（ｓ）、１
７０．７（ｓ）、６２．６（ｔ）、５５．３（ｄ）、５
３．８（ｄ）、５３．７（ｄ）、４０．８（ｔ）、４
０，１（ｔ）、３１．８（ｔ）、２９．０（ｔ）、２
５．３（ｄ）、２３．３（ｑ）、２３．０（ｔ）、２
１．７（ｑ） （ｍ）アミノ酸分析（６Ｎ ＨＣｌ、１０５°Ｃ，１８
時間加水分解） ロイシンＡＭ４２９９Ｂ物質の理化学的性質 （ａ）物質の色及び状態 白色粉末 （ｂ）比旋光度 ［α］_D ²² −７．２°（ｃ＝０．５、Ｈ₂Ｏ） （ｃ）分子式 Ｃ₁₆Ｈ₂₇Ｏ₇ Ｎ₃ （ｄ）ＦＡＢ−ＭＳ ｍ／ｚ ３７５（Ｍ＋Ｈ）⁺ （ｅ）元素分析 計算値（％）（Ｃ₁₆Ｈ₂₇Ｏ₇ Ｎ₃ ・Ｈ₂ Ｏに対して）：
Ｃ，４６．９４；Ｈ，７．６３；Ｎ，１０．２６ 実測値（％） Ｃ，４７．１４；Ｈ，７．７５；Ｎ，１
０．７２ （ｆ）溶解性 水、ジメチルスルホキシド、酢酸、ピリジンに可溶；ベ
ンゼン、クロロホルム、酢酸エチルに不溶性。 （ｇ）呈色反応 ヨウ素蒸気反応、過マンガン酸カリウム脱色反応、ニン
ヒドリン反応に陽性を示し、塩化第二鉄反応、モ−リッ
シュ反応に陰性を示す。 （ｈ）Ｒｆ値 約０．１９ メルク社製 Ｋｉｅｓｅｌｇｅｌ ６０Ｆ
₂₅₄ 使用 展開溶媒：クロロホルム／メタノ−ル／酢酸（５：５：
０．５） （ｉ）紫外部吸収スペクトル（１００γ／ｍｌとして蒸
留水に溶解） 末端吸収を示す。 （ｊ）赤外部吸収スペクトル（ＫＢｒによる。図２に示
す。） 有意なシグナルは次のとおりである。

【００１４】３４００、１６４９、１５６０、１３９
０、９００ｃｍ^-1付近 （ｋ） ¹Ｈ−ＮＭＲスペクトル（４００ＭＨｚ、Ｄ
₂ Ｏ） ケミカルシフトは次のとおりである。 ０．９０（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝５．４Ｈｚ）、０．９４（３
Ｈ，ｄ，Ｊ＝５．４Ｈｚ）、１．４０（２Ｈ，ｍ）、
１．５３−１．６７（５Ｈ，ｍ）、１．８８（２Ｈ，
ｍ）、３．２３（２Ｈ，ｍ）、３．４５（１Ｈ，ｄ）、
３．５９（１Ｈ，ｄ）、３．７４（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝６．
１Ｈｚ）、４．３２（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝４．９Ｈｚ） （ｌ）¹³Ｃ−ＮＭＲスペクトル（２７０ＭＨｚ、Ｄ
₂ Ｏ） ケミカルシフトは次のとおりである。

【００１５】１７５．６（ｓ）、１７５．１（ｓ）、１
７４．６（ｓ）、１７０．７（ｓ）、５５．６（ｄ）、
５５．３（ｄ）、５３．９（ｄ）、５３．７（ｄ）、４
０．８（ｔ）、３９．９（ｔ）、３１．０（ｔ）、２
９．０（ｔ）、２５．４（ｔ）、２３．１（ｑ）、２
２．８（ｔ）、２１．７（ｑ） （ｍ）アミノ酸分析（６Ｎ，ＨＣｌ、１０５°Ｃ，１８
時間加水分解） ロイシン、リジン また、本発明に係わるＡＭ４２９９Ａ物質ならびにＡＭ
４２９９Ｂ物質は、上記した理化学的性質からみてペプ
チドの性状を示しているが、その構造解析を試みた結
果、下記の一般式（１）で示される化学構造式を得た。

【００１６】

【化５】

【００１７】〔式中、Ｒは−ＣＨ₂ ＯＨまたは−ＣＨ
（ＮＨ₂)ＣＯＯＨで表される基を示す。〕具体的には、
基Ｒが−ＣＨ₂ ＯＨで表される物質をＡＭ４２９９Ａと
称し、基Ｒが−ＣＨ（ＮＨ₂)ＣＯＯＨで表される物質を
ＡＭ４２９９Ｂと称し、以下、総称して生理活性物質Ａ
Ｍ４２９９ともいう。）。

【００１８】本発明に係わる生理活性物質ＡＭ４２９９
は、例えば、本発明者らが西表島で採取した山林土壌サ
ンプルから新たに分離した微生物Ｍ４２９９株によって
生産されるほか、ペプチド合成等化学合成法によっても
製造することができる。Ｍ４２９９株の菌学的性状を詳
細に示すと次のとおりである。 （１）各培地における生育状態 （ａ）バレイショ・ブドウ糖寒天培地（ＰＤＡ）。 ２５°Ｃで培養した場合、集落の生育は極めてはやく、
３日培養で直径６０ｍｍ以上となる。７日間培養の場
合、菌叢はやや盛り上がり、綿毛状となる。はじめ白色
であるがのちに灰橙色（６Ｂ３、４）、分生子が形成さ
れた部分は褐橙色（６Ｃ４）となる。分生子は局所的に
形成され、その部分は粉状となる。浸出液、拡散性色素
は出さない。裏面は橙白色（５Ａ２）や淡橙色（５Ａ
３）となる。

【００１９】（ｂ）バレイショ・ニンジン寒天培地（Ｐ
ＣＡ）。 ２５°Ｃで培養した場合、集落の生育は極めてはやく、
３日で直径６０ｍｍ以上となる。菌糸は薄く、培地を這
うように生育し、菌叢は極めて薄く、平坦、局所的に分
生子の形成が見られ、その部分は粉状となる。淡橙色
（５Ａ４）や灰橙色（５Ｂ４）、分生子が形成された部
分は褐橙色（６Ｃ４）となる。浸出液、拡散性色素は出
さない。裏面は橙白色（５Ａ２）や淡橙色（５Ａ３）と
なる。

【００２０】（ｃ）麦芽汁寒天培地（ＭＡ）。 ２５°Ｃで培養した場合、集落の生育は極めてはやく、
３日で直径６０ｍｍ以上となる。菌叢はベルベット状−
綿毛状、中央部はレンズ状に盛り上がる。はじめ白色で
あるが後にやや着色した黄白色（４Ａ２）となる。浸出
液、拡散性色素は出さない。裏面は黄白色（４Ａ２）や
淡黄色（４Ａ３）となる。（各培地における生育状態の
色の表示は Kornerup, A. and Wanscher, J. H.1978.
“ Methuen handbook of colour. 3rd ed,”Eyre Methu
en, London. の表示に従った。）

【００２１】（２）生理的諸性状 Ｍ４２９９株は１１．５−３９℃で生育可能で、最適生
育温度は２２−３６℃である（バレイショ・ブドウ糖寒
天培地上で測定した。）。また、本菌株はｐＨ３．４−
９．８で生育可能で、最適生育ｐＨは７．８−８．３で
ある（バレイショ・ブドウ糖寒天培地上で測定し
た。）。

【００２２】（３）顕微鏡下における形態的特色 菌糸は壁が薄く透明、滑面、幅は３−５μｍである。分
生子柄は単生し、菌糸より起立する。長さは９３−８０
０μｍ、幅は５−１５μｍである。分生子柄は途中で左
右均等に２分枝することを１−４回繰り返し、その先端
に円筒形もしくはこん棒形の分生子形成細胞を生じる。
分生子形成細胞は長さ４０−１２０μｍであり、時とし
て菌糸より直接生じる。分生子形成様式はホロブラステ
ィック（holoblastic)である。分生子は同時的に形成さ
れ、分生子形成細胞の表面全体を覆う。形成初期はイボ
状で、その部分は金棒に似る。やがて球状に膨らみ、個
々の分生子はかぶら型となる。直径は４．８−７．５μ
ｍ、表面は滑面、黄褐色となる。分生子は成熟とともに
離脱する。

【００２３】（４）微生物の同定及び寄託 上記諸性質より、Ｍ４２９９株は糸状菌の不完全菌類
（Deuteromycotina)に属する菌株と考えられる。分生子
柄は単生し、分生子形成様式はホロブラスティック型、
分生子は分生子柄が分枝した先端に同時的に形成される
などの特徴からボトリティス（Botrytis) 属、クロメロ
スポリウム(Chromelosporium) 属、オエドセファルム
（Oedocephalum) 属が考えられる¹⁾。分生子柄の分枝は
左右均等に二分枝することを１−４回繰り返し、分生子
形成細胞は円筒形もしくはこん棒形となることからクロ
メロスポリウム（Chromelosporium)属に属すると考えら
れる²⁾。この属には現在９種認められているが ¹⁾ 、分
生子柄が単生し、分生子の表面が滑面などの特徴からク
ロメロスポリウム・フルブム（C.fulvum）およびクロメ
ロスポリウム・マクロスペルマム（C.macrosperumum)の
２種が考えられる^1,2)。Ｍ４２９９株の分生子の大きさ
は４．８−７．５μｍであり、クロメロスポリウム・フ
ルブム（C.fulvum) の分生子の大きさとほぼ一致してい
た²⁾。

【００２４】以上の結果より本菌株は、クロメロスポリ
ウム・フルブム（C.fulvum) と種を同じくするものと判
断し、本菌株をクロメロスポリウム・フルブム（Chrome
losporium fulvum）Ｍ４２９９と命名し、工業技術院生
命工学工業技術研究所に受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１３８
２５として寄託した。参考文献 １）Hennebert,G.L. 1973. Botrytis and Botrytis-lik
e genera. Persoonia7: 183-204 ２）Hennebert,G.L. and Korf,R.P. 1975. The peat mo
ld, Chromelosporiumollare, conidial state of Peziz
a ostracoderma, and its misapplied names,Botrytis
crystallina, Botrytis spectabilis, Ostracoderma ep
igaeum and Peziza atrovinosa. Mycologia 67: 214-24
0. 本発明の生理活性物質ＡＭ４２９９の生産は、上記に挙
げた特定の微生物の使用に限定されるものではないこと
を理解すべきである。本発明は記載の微生物からＸ線照
射、紫外線照射、Ｎ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニト
ロソグアニジン、２−アミノプリン等の変異処理により
取得できる人工変異株ならびに自然変異株を含めて生理
活性物質ＡＭ４２９９物質を生産しうる全ての変異株の
使用をも包含するものである。

【００２５】本発明に係わる生理活性物質ＡＭ４２９９
物質は、クロメロスポリウム属に属する該物質生産菌、
例えば、クロメロスポリウム・フルブム（C.fulvum) Ｍ
４２９９株を資化しうる炭素および窒素源を含む栄養培
地中に接種し、好気的条件下例えば、振盪培養、通気攪
拌培養等で培養することにより生産せしめることができ
る。

【００２６】炭素源としては、グルコ−ス、デキストリ
ン、シュ−クロ−ス、フラクト−ス、マルト−ス、グリ
セリン、澱粉、糖蜜等の炭水化物を使用するのが好まし
い。窒素源としては、大豆粉、綿実粉、コ−ンスティ−
プリカ−、肉エキス、落花生粉、ペプトン、小麦胚芽、
酵母エキス、オ−トミ−ル、グルテンミ−ル、魚粉等を
使用するのが好ましいが、アンモニウム塩、例えば硫酸
アンモニウム、硝酸アンモニウム、リン酸アンモニウム
等や尿素、アミノ酸等の無機及び有機の窒素化合物も有
利に使用することができる。

【００２７】これらの炭素源及び窒素源は、併用するの
が有利であるが、純粋なものを必ずしも使用する必要は
ない。不純なものには、生長因子や微量要素が含まれて
いる場合などもあり、有利な場合があるからである。必
要ある場合には、例えば次のような無機塩類を培地に添
加してもよい：塩化ナトリウム、塩化カリウム、炭酸カ
ルシウム、炭酸ナトリウム、炭酸カリウム、リン酸ナト
リウム、リン酸カリウム、マグネシウム塩、銅塩、コバ
ルト塩、鉄塩、亜鉛塩、マンガン塩等。

【００２８】培養にあたり、発泡の激しい時には、必要
に応じて液体パラフィン、動物油、植物油、鉱物油、シ
リコン等を添加してもよい。目的物質を大量に工業生産
するには、他の醗酵生産物の場合と同様に、通気攪拌培
養するのが好ましい。少量生産の場合は、フラスコを用
いる振盪培養が好適である。

【００２９】培養を大きなタンクで行う場合、生理活性
物質ＡＭ４２９９の生産工程において菌の生育遅延を防
止するため、はじめに比較的少量の培地に生産菌を接種
培養した後、次に培養物を大きな生産タンクに移して、
そこで生産培養するのが好ましい。この場合、前培養に
使用する培地及び生産培養に使用する培地の組成は、両
者とも同一であってもよいし必要あれば両者を変えても
よい。

【００３０】培養は通気攪拌条件で行うのが好ましく、
例えばプロペラやその他機械による攪拌、ファ−メンタ
−の回転または振盪、ポンプ処理、空気の吹き込み等既
知の方法が適宜使用される。通気用の空気は滅菌したも
のを用いる。培養温度は、本生理活性物質ＡＭ４２９９
生産菌が本物質を生産する範囲内で適宜変更しうるが、
通常は１２−３９℃、好ましくは２８℃前後で培養する
のがよい。培養ｐＨは、通常は３．５−９．８、好まし
くはｐＨ７前後で培養するのがよい。培養時間は、培養
条件や培養量によっても異なるが通常は約１日−１週間
である。

【００３１】培養物から目的とする生理活性物質ＡＭ４
２９９を採取する方法としては、例えば、水、有機溶
媒、これらの混合溶媒による抽出；イオン交換樹脂法又
は吸着若しくは分配クロマトグラフィ−；シリカゲルク
ロマトグラフィ−；単一溶媒又は混合溶媒からの再結晶
等常法が適宜単独であるいは組み合わせて使用できる。
生理活性物質ＡＭ４２９９の回収、精製は上記のように
既知の方法を適宜利用して行うが、例えば次のようにし
てもよい。培養により生成した生理活性物質ＡＭ４２９
９は主として培養液中に分泌される水溶性物質であるの
で、一般には遠心分離、濾過等の手段により菌体を除去
した上清あるいは濾液を例えば活性炭、合成吸着樹脂等
を使用する吸着クロマトグラフィ−、各種イオン交換樹
脂等を使用するイオン交換クロマトグラフィ−を使用す
ることにより、生理活性物質ＡＭ４２９９を含む粗物質
を採取することができる。更に精製するにはシリカゲ
ル、アルミナ等を使用する吸着カラムクロマトグラフィ
−、ゲル濾過法、各種イオン交換ゲル濾過カラムクロマ
トグラフィ−、オクタデシル化されたシリカゲルを担体
とする逆相分配カラムクロマトグラフィ−及びＨＰＬ
Ｃ、更には向流分配法、結晶、再結晶化等の精製手段を
順次又は適宜組み合わせて行うことにより精製できる。
また生理活性物質ＡＭ４２９９は酸性または両性物質で
あり、塩基または酸と反応して無毒性塩を形成すること
ができる。生理活性物質ＡＭ４２９９の塩基との塩とし
てはナトリウム塩、カリウム塩などのアルカリ金属塩、
カルシウム塩、マグネシウム塩等のアルカリ土金属塩、
アンモニウム塩などが挙げられ、酸との塩としては、塩
酸塩、硫酸塩等の酸付加塩が挙げられる。

【００３２】本発明の製剤は、有効成分として用いられ
る生理活性物質ＡＭ４２９９としては、ＡＭ４２９９Ａ
物質、ＡＭ４２９９Ｂ物質及びそれらの無毒性塩のうち
いずれか一種であっても、それらの混合物であってもよ
く、生理活性物質４２９９物質を例えば、直腸投与、経
鼻ないしバッカル吸入等の経肺、点鼻、点眼、外用、経
口または皮下、静脈内および筋肉内を含む非経口などの
投与または吸入に適した有機あるいは無機担体または賦
形剤と共に含有する固型、半固型あるいは液状の製剤の
形で用いることができる。有効成分は例えば、錠剤、ペ
レット剤、トロ−チ、カプセル剤、坐剤、クリ−ム剤、
軟膏剤、エアゾ−ル剤、吸入用粉末剤、液剤、乳剤、懸
濁剤、その他使用に適した剤形に用いられる慣用の無毒
性の医薬として許容される担体と共に配合することがで
きる。さらに、必要に応じて補助剤、安定化剤、粘調化
剤、着色剤および香料を使用することができる。生理活
性物質ＡＭ４２９９またはその無毒性塩は疾患の経過ま
たは状態に所望の治療効果を生じるに足りる量を製剤に
含有させればよい。

【００３３】この製剤を人に適用する場合、静脈内、筋
肉内または経口投与によるのが好ましい。有効成分の治
療有効量は治療される各患者の年齢および条件によって
変動するが、一般に有効成分を、静脈内投与の場合には
人の体重１ｋｇ当たり１日量０．０１−３０ｍｇ、筋肉
内投与の場合には人の体重１ｋｇ当たり１日量０．１−
３０ｍｇ、経口投与の場合には人の体重１ｋｇ当たり１
日量０．５−５０ｍｇで骨疾患の予防または治療のため
に投与することができる。本発明に係わる生理活性物質
ＡＭ４２９９物質及び／又はその塩が対象とする疾患と
は、骨吸収性疾患を意味するもので骨疾患の予防または
治療剤であって、具体的には、悪性高カルシウム血症、
骨ペ−ジェット病、骨粗鬆症が例示される。

【００３４】

【実施例】次に実施例によって本発明をさらに説明する
が、本発明の範囲はこれらのみに限定されるものではな
い。

【００３５】

【実施例１】生理活性物質ＡＭ４２９９の醗酵生産 グルコ−ス１％、デキストリン１％、イ−ストエキス
０．５％、カゼイン水解物０．５％、ＣａＣＯ₃ ０．１
％、セライト１％からなる前培養培地（滅菌前ｐＨ７．
０）を５００ｍｌ容三角フラスコに１００ｍｌずつ分注
し、１１５℃で１５分間滅菌した。この各々の培地にク
ロメロスポリウム・フルブム（C.fulvum)Ｍ４２９９株
（ＦＥＲＭ Ｐ−１３８２５）の斜面培養物を一白金耳
ずつ接種し、ロ−タリ−シェ−カ−（毎分２００回転）
で２６°Ｃ、７２時間培養した。次にグルコ−ス２％、
ペプトン１％、コ−ンスティ−プリカ−１％、ＫＨ₂ Ｐ
Ｏ₄０．２％、ＭｇＳＯ₄ ・７Ｈ₂ Ｏ ０．１％、ＦＳ
−アンチフォ−ム（Dow Corning K.K 社製）０．０２％
からなる本培養培地（ｐＨ６．５）を調整し、この本培
養培地２０Ｌを３０Ｌ容ジャ−ファ−メンタ−に注入し
た。これを１２０℃で２０分間滅菌した後、先に得た前
培養物を０．５％接種し、２６℃で４日間培養した。攪
拌は２００ｒｐｍ、通気量は２０Ｌ／分で行った。

【００３６】生理活性物質ＡＭ４２２９の検定 本発明の生理活性物質ＡＭ４２９９はチオ−ルプロテア
−ゼを阻害する活性を有するため、この作用に基づいて
定量が可能であり、培養液からの生理活性物質ＡＭ４２
９９の回収、精製などの目的に利用することができる。
検定方法を以下に示す。

【００３７】１ｍＭエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴ
Ａ）および２．７ｍＭシステイン含有１００ｍＭ酢酸緩
衝液（ｐＨ５．０）０．５ｍｌ、カテプシンＬ溶液５０
μｌ（酵素量０．５μｇ；Nova-Boichem社製）あるい
は、カテプシンＢ溶液５０μｌ（酵素量０．０１２５ｕ
ｎｉｔ；Ｓｉｇｍａ社製）に各種濃度の生理活性物質Ａ
Ｍ４２９９の２５μｌを加えた反応液を２６℃で５分間
プレインキュベ−ションした。ついで２ｍｇのＮα−Ｃ
ＢＺ−Ｌ−ｌｙｓｉｎｅ−ｐ−ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌ
ｅｓｔｅｒ（Ｓｉｇｍａ社製）を１ｍｌのメタノ−ル
に溶解した基質溶液２５μｌを反応液に加え２６℃で３
０分間インキュベ−ションを行った。反応は、０．１Ｎ
塩酸０．５ｍｌを反応液に加えることにより停止させ
た。本反応液の３２６ｎｍにおける吸光度（Ｓ）を測定
した。同様に反応液に阻害剤を加えないでインキュベ−
ションした時の３２６ｎｍにおける吸光度（Ｂ）を測定
し、次式によって阻害（％）を求めた。阻害（％）＝１
００ｘ（Ｂ−Ｓ）／Ｂ

【００３８】生理活性物質ＡＭ４２９９の吸着、精製 上記の培養方法で得られた培養物８０Ｌ（４バッチ合
計）を６Ｎ塩酸でｐＨ６．５に調整し、濾過により菌体
を除去した培養濾液７５Ｌを得た。その濾液を予め作製
した５Ｌのカ−ボンカラム（φ１０×１００ｃｍ）に付
した。３０Ｌの水でカラムを洗浄した後、５０％アセト
ン水１０Ｌで目的物質を溶出した。上記で得た溶出液を
減圧下で約５００ｍｌまで濃縮し、ｐＨを６．５に修正
した後、アンバ−ライトＩＲ−１２０Ｂ（Rohm & Haas
社製；Ｈ⁺ 型）２Ｌのカラム（φ７．６×５０ｃｍ）に
チャ−ジし、水２Ｌで目的物質を溶出し、溶出液を減圧
下で約２００ｍｌまで濃縮した。次に、その濃縮液をｐ
Ｈ８に調整し、３００ｍｌのＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｄｅ
ｘ（Pharmacia 社製；Ｃｌ^- 型）カラム（φ３．６×４
０ｃｍ）にチャ−ジした。１Ｌの水でカラムを洗浄した
後、１．３Ｌの水と１．３Ｌの０．２Ｍ塩化ナトリウム
水溶液で直線濃度勾配溶出を行い、２０ｍｌずつ分画を
行って、目的物質はフラクションＮｏ．５４−Ｎｏ．７
２に溶出された。この溶出画分を集め、脱塩のために２
００ｍｌのカ−ボンカラム（φ３．２×４０ｃｍ）にチ
ャ−ジし、１Ｌの水でカラムを洗浄後、ｐＨ９のアンモ
ニア性５０％アセトン水溶液７００ｍｌで目的物質を溶
出した。

【００３９】次いで溶出液を減圧下濃縮し、約５ｍｌと
した溶液にシリカゲル粉末５ｇを加えてよく攪拌混合
し、減圧下水分を除去した。このシカゲル粉末を予め酢
酸エチル−メタノ−ル−濃アンモニア水（５：５：０．
２）の混合溶媒にて作製した２００ｍｌのシリカゲルカ
ラム（φ３．２×４０ｃｍ）にチャ−ジし、同混合溶媒
にて溶出を行い、２０ｍｌずつ分画した。フラクション
Ｎｏ．７２−Ｎｏ．１６８にＡＭ４２９９Ａ物質が溶出
され、これらの画分を集めて減圧濃縮して、ＡＭ４２９
９Ａ物質のアンモニウム塩が白色粉末として６９ｍｇ得
られた。またフラクションＮｏ．２１１−Ｎｏ．２８４
にＡＭ４２９９Ｂ物質が溶出され、これらの画分を集め
て減圧濃縮して、ＡＭ４２９９Ｂ物質のアンモニウム塩
が白色粉末として４５ｍｇ得られた。

【００４０】上記で得たＡＭ４２９９Ａ物質のアンモニ
ウム塩６９ｍｇを３ｍｌの水に溶解し、１２０ｍｌのＣ
Ｍ−Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｃ−２５（Pharmacia 社製；Ｈ
⁺ 型）カラム（φ２．０×４０ｃｍ）にチャ−ジし、水
で溶出を行い２０ｍｌずつ分画した。フラクションＮ
ｏ．１３−Ｎｏ．３１にＡＭ４２９９Ａ物質は溶出され
た。これらの画分を集めて減圧濃縮し、２００ｍｌのＳ
ｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−１５（Pharmacia 社製）カラム
（φ２．０×５０ｃｍ）にチャ−ジし、水で溶出を行い
３ｍｌずつ分画を行った。フラクションＮｏ．１９−Ｎ
ｏ．３０を集め減圧濃縮、凍結乾燥することにより、Ａ
Ｍ４２９９Ａ物質の遊離体の白色粉末を５５ｍｇ得た。

【００４１】同様に上記で得たＡＭ４２９９Ｂ物質のア
ンモニウム塩４５ｍｇを３ｍｌの水に溶解し、１２０ｍ
ｌのＣＭ−Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｃ−２５（Ｈ⁺ 型）カラ
ム（φ２．０×４０ｃｍ）にチャ−ジし、水で溶出を行
い２０ｍｌずつ分画した。フラクションＮｏ．２３−Ｎ
ｏ．３２にＡＭ４２９９Ｂ物質は溶出された。これらの
画分を集めて減圧濃縮し、２００ｍｌのＳｅｐｈａｄｅ
ｘ Ｇ−１５カラム（φ２．０×５０ｃｍ）にチャ−ジ
し、水で溶出を行い、３ｍｌずつ分画を行った。フラク
ションＮｏ．１９−Ｎｏ．２５を集め減圧濃縮、凍結乾
燥することにより、ＡＭ４２９９Ｂ物質の遊離体の白色
粉末を３４ｍｇ得た。

【００４２】

【実施例２】生理活性物質ＡＭ４２９９のチオ−ルプロテア−ゼ阻害
作用 生理活性物質ＡＭ４２９９についてチオ−ルプロテア−
ゼの一種である人腎臓由来のカテプシンＬおよび牛脾臓
由来のカテプシンＢの活性を５０％阻害する濃度（ＩＣ
₅₀値）を求めた。その結果、ＡＭ４２９９Ａ物質のカテ
プシンＬ及びカテプシンＢに対するＩＣ₅₀値はそれぞれ
０．０２９μｇ／ｍｌ、０．０２４μｇ／ｍｌであっ
た。またＡＭ４２９９Ｂ物質のカテプシンＬ及びカテプ
シンＢに対するＩＣ₅₀値はそれぞれ０．０９０μｇ／ｍ
ｌ、０．０４９μｇ／ｍｌであった。

【００４３】ＰＴＨｒｐ（１−３４）により惹起された
ラットの高カルシウム血症に対する本発明の予防および
治療剤の効果 ＰＴＨ−ｒｅｌａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ（ＰＴＨｒ
ｐ；Science,237;893(1987) 、J.Biol.Chem.,264;14806
(1989)、Calcif.Tiss.Int.,36;563(1984) ）は、人の悪
性体液性高カルシウム血症惹起因子として同定された蛋
白質である。本物質の活性型フラグメントであるＰＴＨ
ｒｐ（１−３４）は、ラットに投与すると高カルシウム
血症を引き起こし、またイン・ビトロで骨吸収亢進作用
が示されているので（J. Clinical Investigation,81:
596-600, 1988; Endocrinology, 123: 2841-28848, 198
8)、骨粗鬆症のモデルを組み立てるために用いられた。

【００４４】２４時間前に甲状腺と副甲状腺を摘出した
ウイスタ−系ラット（５週齢、雄、７０−９０ｇ、一群
５匹）にＡＭ４２９９ＡまたはＡＭ４２９９Ｂ物質を１
０ｍｇ／ｋｇおよび２０ｍｇ／ｋｇ体重の用量で経口投
与し、４時間後にＰＴＨｒｐ（１−３４）を１．５ｎｍ
ｏｌｅ／ｋｇ静脈内投与した。ＰＴＨｒｐ（１−３４）
投与１時間後に採血し、血中カルシウム濃度を原子吸光
法で測定した。その結果は表１に示す通りであり、本発
明に係わるＡＭ４２９９Ａ物質およびＡＭ４２９９Ｂ物
質の１０ｍｇ／ｋｇおよび２０ｍｇ／ｋｇ投与群は、血
中カルシウム濃度の上昇を有意に抑制した。

【００４５】

【表１】

【００４６】この結果は、本発明に係わるＡＭ４２９９
Ａ物質及びＡＭ４２９９Ｂ物質が悪性体液性高カルシウ
ム血症を予防または抑制しうることを示し、本発明の生
理活性物質ＡＭ４２９９が骨疾患の予防または治療剤と
して有用であることが明らかになった。続発性副甲状腺機能亢進症に対する本発明の効果 ラットにカルシウム欠乏食を与えると副甲状腺ホルモン
（ＰＴＨ）放出量の増加と続発性副甲状腺機能亢進症と
が発症する。このモデルにおいて血中カルシウムの大半
は骨から溶出したものである。正常範囲内に、血中カル
シウム濃度を維持するため、放出されるＰＴＨによって
骨再吸収が促進される。

【００４７】このモデルは、続発性副甲状腺機能亢進症
ラットにおける生理活性物質ＡＭ４２９９の効果を調べ
るために用いられた。ウィスタ−系ラット（５週齢、
雄、７０−９０ｇ、一群５匹）を５日間カルシウム欠乏
食で飼育した。一夜絶食後、ＡＭ４２９９Ａ物質または
ＡＭ４２９９Ｂ物質を１０ｍｇ／ｋｇおよび２０ｍｇ／
ｋｇ体重の用量で経口投与し、血中カルシウム濃度を薬
剤投与５時間後に、採血し、原子吸光法で測定した。

【００４８】その結果は表２に示す通りであり、ＡＭ４
２９９Ａ物質およびＡＭ４２９９Ｂ物質の１０ｍｇ／ｋ
ｇおよび２０ｍｇ／ｋｇ投与群において血中カルシウム
濃度を有意に低下させ、本発明の生理活性物質ＡＭ４２
９９は、続発性副甲状腺機能亢進症を伴う骨疾患の予防
または治療にも有用であることが確認された。

【００４９】

【表２】

【００５０】急性毒性試験 生後５週齢のＩＣＲ系雌マウス各５匹に、ＡＭ４２９９
Ａ物質またはＡＭ４２９９Ｂ物質を２００ｍｇ／ｋｇ体
重、静脈内注射したが、死亡例はなく、体重増加も無投
与マウス群と全く同じであり、ＡＭ４２９９Ａ物質及び
ＡＭ４２９９Ｂ物質の安全性の高さが確認された。

【００５１】

【実施例３】 実施例１で製造したＡＭ４２９９Ａ物質 ５ｇ バレイショ・澱粉 ９ｇ ステアリン酸マグネシウム １ｇ 以上を擂潰機でよく混和した後、１号ゼラチンハ−ドカ
プセルに１５０ｍｇずつ充填し、１カプセル中５０ｍｇ
のＡＭ４２９９Ａ物質を含有するカプセル剤を得た。ま
た、同様にして、ＡＭ４２９９Ｂ物質を含有するカプセ
ル剤を得た。

【００５２】

【実施例４】 実施例１で製造したＡＭ４２９９Ｂ物質 ５ｇ 食塩 ９ｇ 炭酸水素ナトリウム １ｇ 以上を蒸留水２００ｍｌに溶解した後、アンプルに１ｍ
ｌずつ分注して、１アンプル中２５ｍｇのＡＭ４２９９
Ｂ物質を含有する注射剤を製造した。また、同様にし
て、ＡＭ４２９９Ａ物質を含有する注射剤を製造した。

【００５３】

【発明の効果】本発明は、ＡＭ４２９９Ａ物質およびＡ
Ｍ４２９９Ｂ物質ならびにそれらの無毒性塩を提供する
もので、これらの物質は従来未知の新規チオ−ルプロテ
ア−ゼ阻害物質であって、悪性体液性高カルシウム血
症、骨ペ−ジェット病および骨粗鬆症等の骨疾患、さら
に続発性副甲状腺機能亢進症に伴う骨疾患の予防または
抑制しうることが確認され、種々の骨疾患の予防または
治療剤として有用である。

【００５４】また本発明に係わる有効成分の構造が明ら
かにされたので、微生物による工業的製造のほかに有機
合成による製造も可能となり、その結果各種誘導体の製
造も可能となるので、新規化合物の製造及び新規用途の
開発も大いに期待できる。

【図面の簡単な説明】

【図１】図１はＡＭ４２９９Ａ物質のＫＢｒ錠剤中での
赤外部吸収スペクトルの図を示す。

【図２】図２はＡＭ４２９９Ｂ物質のＫＢｒ錠剤中での
赤外部吸収スペクトルの図を示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｒ 1:645）

Claims (5)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 下記一般式（１） 【化１】 〔式中、Ｒは−ＣＨ₂ ＯＨまたは−ＣＨ（ＮＨ₂)ＣＯＯ
   Ｈで表される基を示す。〕で示される生理活性物質ＡＭ
   ４２９９またはそれらの無毒性塩。
2. 【請求項２】 クロメロスポリウム属に属する下記一般
   式（１） 【化２】 〔式中、Ｒは−ＣＨ₂ ＯＨまたは−ＣＨ（ＮＨ₂)ＣＯＯ
   Ｈで表される基を示す。〕で示される生理活性物質ＡＭ
   ４２９９生産菌を培地に培養し、次いで培養物から該生
   理活性物質ＡＭ４２９９を採取することを特徴とする該
   生理活性物質ＡＭ４２９９の製法。
3. 【請求項３】 微生物がクロメロスポリウム・フルブム
   Ｍ４２９９（ＦＥＲＭ Ｐ−１３８２５）である請求
   項２記載の生理活性物質ＡＭ４２９９の製法。
4. 【請求項４】 下記一般式（１） 【化３】 〔式中、Ｒは−ＣＨ₂ ＯＨまたは−ＣＨ（ＮＨ₂)ＣＯＯ
   Ｈで表される基を示す。〕で示される生理活性物質ＡＭ
   ４２９９またはそれらの無毒性塩を有効成分とする骨疾
   患の予防または治療剤。
5. 【請求項５】 骨疾患が、悪性高カルシウム血症、骨ペ
   −ジェット病または骨粗鬆症である請求項４記載の予防
   または治療剤。