JPH07123995A - トリペプチド化合物 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【構成】 下記一般式で示されるトリペプチド化合物又
はその塩。 【化１】 （式中、Ｒは、アルデヒド基、又は、ヒドロキシメチル
基を意味する。）ストレプトミセス エスピー Ｑ−２
１７０５株から製造する上記トリペプチド化合物の製造
方法。 【効果】 カテプシンＬ阻害作用を有するので、骨粗鬆
症、悪性腫瘍性高カルシウム血症、骨ページェット病等
の骨疾患の治療及び予防に有用である。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、骨粗鬆症、悪性腫瘍性
高カルシウム血症、骨ページェット病等の骨疾患に有用
な新規Ｑ−２１７０５−Ａ及びＱ−２１７０５−Ｂ化合
物及びそれらの製造方法に関するものである。

【０００２】

【従来の技術】近年、高齢者人口の急激な増加、女性の
閉経年齢の延長、腎透析性骨粗鬆症又は悪性腫瘍性高カ
ルシウム血症患者の増加にともない、骨形成不全又は骨
崩壊促進を内容とする骨疾患の予防又は治療が増々重要
になってきている。なかでも骨粗鬆症は骨折を多発し、
寝たきり老人の原因になることから、その有効な予防又
は治療薬の開発が望まれている。

【０００３】骨は、一旦形成された後は全く変化しない
ものではない。骨は常に骨芽細胞と破骨細胞により造ら
れては壊されていて、骨形成と骨吸収のバランスの上に
成り立っているのである。また骨の支持組織は、主に有
機質であるコラーゲン繊維と無機質であるカルシウム塩
とであり、この両者が結びついて軽くて強固な骨を形成
しているのである。骨崩壊の起こる原因は多種多様であ
るが、最近の研究から、骨崩壊の起こる分子レベルの要
因は２種であることが明かにされてきている。その第１
はカルシウムの吸収と沈着不全に関するものであり、そ
の第２は骨支持組織であるコラーゲン繊維の分解亢進を
原因とするものである。

【０００４】前者はカルシウムの供給量、転送、吸収並
びに沈着を内容としており、ビタミンＤ誘導体か女性ホ
ルモン等が、主に関与している。このような疾患の予防
又は治療にはカルシウムを補うか、または維持する療法
が採用され、活性型ビタミンＤ₃製剤やカルシウム製剤
等が用いられている。更に骨からの脱灰を抑制する目的
でエストロゲン製剤及びカルシトニン製剤のようなホル
モン剤等が用いられている。

【０００５】一方、後者は骨支持組織の主成分をなすコ
ラーゲン繊維の分解を要因としており、従来はコラーゲ
ンを分解するプロテアーゼであるコラゲナーゼが着目さ
れてきた。しかし、最近の研究から、これらのコラーゲ
ン繊維は通常のコラゲナーゼでは分解されないで、リソ
ゾーム中のプロテアーゼの一種であるカテプシンＬによ
り、きわめてよく分解されることが明らかにされ、カテ
プシンＬが骨のコラーゲン繊維を分解するのに主役を演
じているものと考えられてきている（BIOmedica 629,7
(6),(1992)）。

【０００６】従って、カテプシンＬを有効に阻害する化
合物は、骨粗鬆症、悪性腫瘍性高カルシウム血症、骨ペ
ージェット病等の骨疾患の予防又は治療薬として有効で
あると期待されている。

【０００７】このような状況から、ある種のジペプチド
を有効成分とする骨疾患の予防及び治療剤が特開平５−
１５５７６４号に開示されている。更に、Agric. Biol.
Chem., 799 49(3),(1989) にトリペプチドである天然
由来のストレピンＰ−１(Strepin P-1)が開示され、シ
ステインプロテアーゼであるパパイン及びカルパインの
阻害作用が記載されている。しかし、ストレピンＰ−１
は本発明化合物と構造を異にするものであり、カテプシ
ンＬの阻害については示唆も開示もされていない。

【０００８】

【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、骨粗
鬆症、悪性腫瘍性高カルシウム血症、骨ページェット病
等の骨疾患に有用な新規Ｑ−２１７０５−Ａ及びＱ−２
１７０５−Ｂ化合物を提供することにある。

【０００９】より詳細には、吸収性骨疾患において、カ
ルシウムを補給又は維持する従来の療法に代えて、カテ
プシンＬを阻害する新規化合物を提供することにある。
カテプシンＬが骨支持組織の主成分をなすコラーゲン繊
維の分解を促進するからである。

【００１０】更に、新規なＱ−２１７０５菌株から新規
なＱ−２１７０５−Ａ及びＱ−２１７０５−Ｂ化合物を
製造する方法及び化学合成により両化合物を取得する方
法を提供することにある。

【００１１】

【課題を解決するための手段】即ち、本発明は下記一般
式で表わされるトリペプチド化合物又はその塩である。

【００１２】

【化２】

【００１３】（式中、Ｒは、アルデヒド基、又は、ヒド
ロキシメチル基を意味する。） また、本発明によれば、ストレプトミセス属に属し、か
つ、上記トリペプチド化合物を生産する能力を有する微
生物を培地に培養し、培養物中に当該トリペプチド化合
物を生産して蓄積させ、当該培養物から当該トリペプチ
ドを採取することを特徴とする上記トリペプチド化合物
の製造方法が提供される。

【００１４】更にまた、本発明によれば、上記トリペプ
チド化合物又はその塩を有効成分とすることを特徴とす
るカテプシンＬ阻害剤が提供される。また、本発明によ
れば、上記トリペプチド化合物又はその塩を有効成分す
ることを特徴とする骨粗鬆症、悪性腫瘍性カルシウム血
症又は骨ページェット症の予防又は治療剤が提供され
る。

【００１５】以下、本発明を更に詳細に説明する。本発
明化合物は、不斉炭素原子を有しており、各種異性体が
存在する。本発明では、これらの異性体の分離されたも
の及びそれらの混合物をも包含する。また、本発明化合
物は、塩を形成する場合がある。塩としては、具体的に
は、ナトリウム、カリウム、等の無機塩基の塩、トリエ
チルアミン、ジエチルアミン、ピリジウムイオン等の有
機塩基の塩が挙げられる。

【００１６】本発明化合物を生産する菌株としては、例
えば、インドネシア領カリマンタン島で採取された土壌
より分離された微生物ストレプトミセス エスピー Ｑ
−２１７０５株を挙げることができる。

【００１７】以下、この菌株の菌学的性質を説明する。 １．形態的特徴 本菌株はオートミール寒天培地、チロシン寒天培地で比
較的良く生育し、基生菌糸の色調は、黄灰〜黄茶色であ
る。気菌糸は、ベネット寒天培地上でよく形成され、白
色を呈する。気菌糸から分岐した胞子柄上に２、３個か
ら２０数個の胞子が連鎖し、成熟に従って湾曲しコイル
状になる。液体培養で、基生菌糸の断片化は見られな
い。電子顕微鏡による観察では、胞子の形状は円筒形、
大きさは０．３〜０．６μｍ×０．８〜１．２μｍで、
その表面は平滑状である。胞子嚢、運動性胞子等の特殊
な器官は観察されない。

【００１８】２．各種寒天培地上の性状 各種寒天培地上の性状は、以下に示すとおりである。特
に記載しないかぎり、２７℃で２１日間培養し、常法に
従って観察したものである。色調の記載については色の
標準（日本色彩研究所）によった。

【００１９】

【表１】

【００２０】（注）Ｇ：生育温度 Ａ：気菌糸
の着生及びその色相 Ｒ：裏面の色相 Ｓ：可溶性色素 ３．生理的性状

【００２１】

【表２】

【００２２】（注）生育温度範囲及び至適生育温度は各
温度（5,10,15,20,24,27,32,37,40,45,50℃）で、７−
２１日までの観察結果である。それ以外は特に指摘のな
いかぎり、２７℃で２週間後の観察結果を示す。 ４．炭素源の資化性

【００２３】

【表３】

【００２４】（注） ＋：生育する ±：生育が疑わ
しい −：生育しない ５．菌体成分の化学分析 LECHVALIERらの方法(LECHVALIER, M.P. et al;pp 277-2
38 in DIETZ, A. et al ed., Actinomycete Taxonomy,
SIM Special Publication No.6, 1980)に従い、本菌株
の酸加水分解物の分析を行った結果、LL−ジアミノピメ
リン酸が検出された（細胞壁タイプＩ）。主要な菌体メ
ナキノンは、ＭＫ−９（Ｈ₈）であった。 以上よりＱ
−２１７０５株の性状を要約すると、色調は、基生菌糸
が黄灰色から黄茶色で気菌糸が白色である。気菌糸上に
２、３〜２０数個の胞子連鎖を作り、基生菌糸は断片化
しない。細胞壁タイプはＩ、主要なメナキノンはＭＫ−
９（Ｈ₈）である。

【００２５】上記諸性状を有する菌種を各種文献（Berg
ey's Manual of Systematic Bacteriology vol.4,1989.
等）により検索すると、本菌株はストレプトミセス(Str
eptomyces)属に属す菌株と判断される。そこで、本菌株
をストレプトミセス エスピー(Streptomyces sp.)Ｑ−
２１７０５と命名した。

【００２６】本菌株は通産省工業技術院生命工学工業技
術研究所に受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１３９１７号として
寄託されている。

【００２７】なお、微生物は、人工的に又は自然に、変
異を起こしやすいが、本発明のストレプトミセス エス
ピー Ｑ−２１７０５株は、天然から分離された菌株の
ほかに、これを紫外線、Ｘ線、化学薬剤などで人工的に
変異させたもの及びそれらの自然変異株についても包含
するものである。

【００２８】（製造法）Ｑ−２１７０５化合物の製造は
ストレプトミセス エスピー Ｑ−２１７０５株を培地
に培養し、培養物より採取することにより行われる。培
養方法は一般微生物の培養方法に準じて行われるが、通
常は液体培地により深部培養法が有利である。

【００２９】培養に用いられる培地としては、ストレプ
トミセス エスピー Ｑ−２１７０５株が利用する栄養
源を含有する培地であればよく、合成培地、半合成培地
又は天然培地が用いられる。培地の組成は、例えば炭素
源としてはグルコース、フラクトース、デンプン、植物
油等が、窒素源としては肉エキス、ペプトン、グルテン
ミール、綿実粕、大豆粉、落花生粉、魚粉、コーンスチ
ーブリカー、乾燥酵母、酵母エキス、硫酸アンモニウ
ム、硝酸アンモニウム、尿素その他の有機、無機の窒素
源が用いられる。また、金属塩としては、Ｎａ、Ｋ、Ｍ
ｇ、Ｃａ、Ｚｎ、Ｆｅなどの硫酸塩、硝酸塩、塩化物、
炭酸塩、燐酸塩などが必要に応じて添加される。

【００３０】さらに、必要に応じてメチオニン、システ
ィン、シスチン、チオ硫酸塩、オレイン酸メチル、ラー
ド油、シリコン油、界面活性剤などの本発明化合物生成
促進物質又は消泡剤を添加することもできる。

【００３１】培養条件としては好気的条件下に培養する
のが一般的に有利で、培養温度は約１５〜４５℃の範
囲、好ましくは約２４〜３７℃付近で行われる。培地の
ｐＨは約５〜１０、好ましくは約６〜８の範囲に調整す
ると好結果が得られる。培養期間は培地の組成、温度条
件に応じて適宜設定される。

【００３２】培養物より目的とするＱ−２１７０５化合
物を単離採取するには通常の微生物の培養物より生理活
性物質を単離する方法が適用される。目的物は培養液中
及び菌体に含有されるので、遠心分離又は濾過により菌
体を分離した後、濾過液及び菌体から有効物質の抽出を
行う。即ち、適当な溶剤に対する溶解性及び溶解度の
差、種々の吸着剤に対する吸着親和性の差、２種の液相
間における分配の差などを利用する一般の生理活性物質
の製造に用いられる手段によって、分離、採取、精製さ
れる。これらの方法は必要に応じて単独に用いられ、又
は任意の順序に組合せ、また反復し適用できる。次に本
発明化合物及びその塩の化学合成方法を説明する。

【００３３】

【化３】

【００３４】（式中、Ｐａはアミノ末端の保護基を、Ｐ
ｃはカルボキシル基の保護基を、Ｘはハロゲン原子、ヒ
ドロキシ基等の脱離基を、ＴＨＦはテトラヒドラフラン
を、ＷＳＣＤは１−エチル−３−（３−（Ｎ，Ｎ−ジメ
チルアミノ）プロピル）カルボジイミド塩酸塩を、ＨＯ
ＢＴは、１−ヒドロキシベンゾトリアゾールを、ＡｃＯ
Ｅｔは酢酸エチルを、ＤＩＢＡＬ−Ｈはジイソブチルア
ルミニウムヒドリドを意味する。） 例えば、バリル−フェニルアラニン誘導体（ＩＩ）を出
発原料とし、チロシン誘導体と縮合させ、チロシル−バ
リル−フェニルアラニン誘導体（ＩＩＩ）とし、次い
で、トリペプチド（ＩＩＩ）のアミノ末端及びチロシル
基に２−メチルプロピルカルボニル基を縮合反応で導入
してトリペプチド（ＩＶ）とし、最後に、チロシル基の
エステルの切断と同時に末端カルボキシル基を還元し、
本発明化合物（Ｉ）が得られる。しかし、本発明化合物
を得るためには、アミノ基を縮合させる順序は任意であ
る。例えば、チロシル−バリル誘導体を出発原料とし、
フェニルアラニンを縮合させてもよい。また、２−メチ
ルプロピルカルボニル基を導入する工程の順序も問わな
い。

【００３５】ペプチド（ＩＩ）及びペプチド（ＩＩＩ）
のアミノ末端は、保護基（Ｐａ）で保護されることが好
ましい。縮合反応をする前に、この保護基は反応Ａで脱
保護される。

【００３６】Ｐａ、Ｐｃは、ペプチド分野で通常用いら
れる保護基がよい。アミノ基の保護基（Ｐａ）として
は、例えば具体的には、ベンジルオキシカルボニル基、
ｐ−ニトロベンジルオキシカルボニル基、ｐ−メトキシ
ベンジルオキシカルボニル基、ｐ−クロロベンジルオキ
シカルボニル基、１，１−ジメチルエトキシカルボニル
基、イソボルニルオキシカルボニル基、ｐ−ビフェニル
イソプロピルオキシカルボニル基、３，５−ジメトキシ
−α、α−ジメチルベンジルオキシカルボニル基、９−
フルオレニルメチルオキシカルボニル基、メチルスルホ
ニルエトキシカルボニル基等が挙げられる。

【００３７】また、カルボキシル基の保護基（Ｐｃ）と
しては、例えば具体的にはベンジル基、ｐ−ニトロベン
ジル基、ｐ−メトキシベンジル基、ジフェニルメチル
基、ベンズヒドリル基等の置換ベンジル基類、ｔｅｒｔ
−ブチル基、メチル基、エチル基、フェナシル基、トリ
クロロエチル基等が挙げられる。

【００３８】まず、脱保護である接触水素添加反応Ａを
説明する。水素添加触媒として、パラジウム・カーボン
が好適に用いられ、それ以外にもパラジウムブラック、
水酸化パラジウムなどを用いてもよい。水素源として、
水素ガスが好適に用いられるが、水素ガスの代わりに、
シクロヘキセン、ギ酸、１，４−シクロヘキサジエン等
を用いてもよい。溶媒としては、ＴＨＦ、メタノール、
エタノール、酢酸エチル等、一般に接触水素添加反応に
用いられるものなら何でもよい。また、用いられる保護
基に応じて、水素添加に限られず、一般に用いられる脱
保護反応を適用する。

【００３９】次に、チロシン等のアミノ酸とペプチドの
縮合反応Ｂに付いて説明する。この反応では、縮合剤を
用いることが好ましく、縮合剤としては、１−エチル−
３−（３−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノ）プロピル）カル
ボジイミド（ＷＳＣＤ）を好適に用いることができる。
その他に、Ｎ，Ｎ−ジシクロヘキシルカルボジイミド
（ＤＣＣ）、ジフェニルホスホリルアジド（ＤＤＰ
Ａ）、イソブチルクロロホルメート、カルボニルジイミ
ダゾールベンゾトリアゾリル−Ｎ−ヒドロキシトリスジ
メチルアミノホスホニウムヘキサフルオロリン化物塩
（Ｂｏｐ試薬）などのペプチド結合形成に一般に用いら
れる縮合剤を用いることができる。

【００４０】ＷＳＣＤ、ＤＣＣ等の縮合剤と共に用いて
もよい添加剤としては、ＨＯＢＴがあり、その他にＮ−
ヒドロキシスクシンイミド（ＨＯＮＳｕ）、３−ヒドロ
キシ−４−オキソ−３，４−ジヒドロ−１，２，３−ベ
ンゾトリアジン（ＨＯＯＢｔ）などが挙げられる。

【００４１】カルボン酸誘導体の代わりに、活性エステ
ルを用いて縮合してもよい。ｐ−ニトロフェノール等の
フェノール系、Ｎ−ヒドロスクシンイミド、１−ヒドロ
キシベンゾトリアゾール等のＮ−ヒドロキシルアミン系
の化合物と反応させて得られる活性エステル；炭酸モノ
アルキルエステル、又は、有機酸と反応させて得られる
混合酸無水物や塩化ジフェニルホスホリル、Ｎ−メチル
モルホリンとを反応させて得られるリン酸系混合酸無水
物；エステルをヒロラジン、亜硝酸アルキルと反応させ
て得られる酸アジド；酸クロライド、酸ブロマイド等の
酸ハライド；対称型酸無水物、等のＣ端活性体を用いる
Ｃ端活性化法を適用して製造できる。

【００４２】また、適用される方法によっては、トリエ
チルアミン、ピリジン、Ｎ−メチルモルホリン等の塩基
の存在下に反応させるのが反応を円滑に進行させる上で
好ましい場合がある。反応は、通常溶媒中冷却下乃至室
温下に行われる。用いられる溶媒は、クロロホルム、四
塩化炭素、シクロロエタン、テトラヒドロフラン、ジオ
キサン、ジメトキシメタン、ジメトキシエタン、酢酸エ
チル、ベンゼン、ジメチルホルムアミド、ジメチルスル
ホキシド、又はこれらの任意の混合溶媒等の通常用いら
れる溶媒が用いられる。

【００４３】反応Ｃはイソバレリルクロライドの縮合反
応である。イソバレリル酸を用い反応Ｂと同様の縮合法
を用いてもよい。

【００４４】反応Ｄは、カルボキシル基末端のエステル
基をアルデヒドへ還元する。この反応にはジイソブチル
アルミニウムヒドリド（ＤＩＢＡＬ−Ｈ）が好適に用い
られる。これ以外にもビス（２−メトキシエトキシ）ア
ルミニウムヒドリド、アルミニウムナトリウムヒドリド
ビス（Ｎ−メチルピペラジノ）アルミニウムヒドリド、
ジイソブチルアルミニウムナトリウムヒドリドなども用
いられる。溶媒はトルエン以外にも、ＴＨＦ、エーテ
ル、ヘキサン等、普通、金属水素化物の還元に用いられ
る有機溶媒なら何でも良い。

【００４５】このようにして製造された本発明に従う化
合物は、遊離のまま又はその塩として単離され、精製さ
れる。単離、精製は、抽出、結晶化、再結晶、各種クロ
マトグラフィー等の通常の化学操作を適宜適用して行わ
れる。

【００４６】また、ラセミ化合物は適当な原料化合物を
用いることにより、又は一般的なラセミ分割法（例え
ば、一般的な光学活性酸（酒石酸等）とのジアステレオ
マー塩に導き、光学分割する方法等）により、立体化学
的に純粋な異性体に導くことができる。また、ジアステ
レオマー混合物は常法、例えば分別結晶化又はクロマト
グラフィー等により分離できる。

【００４７】

【実施例】以上、本発明化合物及びその製造法について
説明したが、以下、実施例により更に詳細に説明する。
但し、本発明化合物はこれらの実施例により何等制限さ
れるものではない。

【００４８】（実施例１）グルコース１％，ポテトスタ
ーチ２％，イーストエキストラクト（DIFCO LABORATORI
ES社製）０．５％，ポリペプトン（DIFCO LABORATORIES
社製）０．５％，CaCO₃０．４％を含む培地(pH 7.0)を
作成し、この培地を５００ｍｌ三角フラスコに各１００
ｍｌずつ分注して、１２１℃で２０分間滅菌した。この
培地に、元スラントよりＱ−２１７０５株の菌糸をかき
取って接種し、毎分２１０回転の振とう培養を２７℃で
３日間行ない種培養液とした。次に、上記培地を５Ｌ作
成し、この培地を５００ｍｌ三角フラスコに各１００ｍ
ｌずつ分注し、１２１℃で２０分間滅菌したものに、種
培養液を４％の割合で植菌し、毎分２１０回転の振とう
培養を２７℃で３日間行った。このようにして得られた
培養液をケイソウ土とともに濾過し、得られた培養濾液
４．５Ｌを１Ｎ水酸化ナトリウム水溶液でｐＨ１０に調
整し、同量の酢酸エチルで抽出した。この酢酸エチル層
をｐＨ３の塩酸水溶液で洗浄後、濃縮乾固し、粗活性画
分２１３ｍｇを得た。この粗活性画分を、ワコーゲルＣ
２００（和光純薬社製）（内径２ｃｍで長さが１９ｃ
ｍ。）を用いたシリカゲルカラムクロマトグラフィーを
行った。移動相をクロロホルム−メタノール／９８：２
（３００ ｍＬ），９７：３（１ Ｌ）と順次変化させ
たところ、活性画分はクロロホルム−メタノール／９
７：３で溶出した。この活性画分を、ＬＨ−２０（ファ
ルマシア社製）（内径２ｃｍで長さが９０ｃｍ）のカラ
ムクロマトグラフィーでメタノールで溶出して精製し、
Ｑ−２１７０５−Ａ及びＢを含有する活性画分３３．８
ｍｇを得た。これを少量のメタノールに溶解させ、分取
高速液体クロマトグラフィー（島津社製、商品名、ＳＴ
Ｒ−ＯＤＳ−Ｈ。内径が１０ｍｍで長さが２５０ ｍｍ
のカラムを用いた。ＵＶ ２０５ｎｍで検出した。移動
相：５７％ メタノール、流速：３ｍＬ／ｍｉｎ．）に
より精製した。保持時間２０〜２１分で単一ピークを示
す画分を集めて濃縮後、酢酸エチルで抽出し、得られた
酢酸エチル層を濃縮乾固することにより、Ｑ−２１７０
５−Ａを白色粉末として０．５ｍｇ得た。同様に、保持
時間１８〜２０分で単一ピークを示す画分を集めて濃縮
後、酢酸エチルで抽出し、得られた酢酸エチル層を濃縮
乾固することにより、Ｑ−２１７０５−Ｂを白色粉末と
して１８．７ｍｇ得た。Ｑ−２１７０５−Ａ及びＱ−２
１７０５−Ｂの構造式を示す。

【００４９】

【化４】

【００５０】（実施例２） 第一工程 カルボベンゾキシ−Ｌ−バリル−Ｌ−フェニルアラニン
メチルエステル７ｇに、メタノール１００ｍｌとＴＨＦ
４０ｍｌと１０％パラジウム−カーボン３５０ｍｇとを
加え、水素雰囲気下、室温で２時間撹拌した。反応液を
濾過し、溶媒を留去し、Ｌ−バリル−Ｌ−フェニルアラ
ニンメチルエステルの粗品を得た。このＬ−バリル−Ｌ
−フェニルアラニンメチルエステル２．６７ｇに、ジク
ロロメタン１００ｍｌとカルボベンゾキシ−Ｌ−チロシ
ン２．５ｇと１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプ
ロピル）−カルボジイミド塩酸塩１．６９ｇと１ーヒド
ロキシベンゾトリアゾール１．３９ｇとを加え、室温で
２日間撹拌した。反応液を食塩水で洗い、油層に生じた
沈澱を濾取し、カルボベンゾキシ−Ｌ−チロシル−Ｌ−
バリル−Ｌ−フェニルアラニンメチルエステルの粗品
４．８０ｇを得た。

【００５１】得られたカルボベンゾキシ−Ｌ−チロシル
−Ｌ−バリル−Ｌ−フェニルアラニンメチルエステルの
粗品３．４９ｇに、メタノール２００ｍｌと酢酸エチル
５０ｍｌと１０％パラジウムーカーボン７５０ｍｇとを
加え、水素雰囲気下、室温で１．５時間撹拌した。反応
液を濾過し、溶媒を留去し、Ｌ−チロシル−Ｌ−バリル
−Ｌ−フェニルアラニンメチルエステルの粗品２．６１
ｇを得た。このＬ−チロシル−Ｌ−バリル−Ｌ−フェニ
ルアラニンメチルエステルの粗品２．６１ｇに、ジクロ
ロメタン１００ｍｌとイソバレリルクロライド０．８８
ｇとトリエチルアミン０．７４ｇとを加え、室温で１３
時間撹拌した。反応液に、ジクロロメタン１００ｍｌと
イソバレリルクロライド０．７３ｇとトリエチルアミン
０．６８ｇとを加え、室温で１時間撹拌した。反応液を
飽和炭酸水素ナトリウム水溶液と０．１Ｎ塩酸水溶液
で、順次洗い、無水硫酸ナトリウムで乾燥した後、溶媒
を減圧留去した。残留物をジエチルエーテル−メタノー
ルより再結晶して、Ｎ，Ｏ−ジイソバレリル−Ｌ−チロ
シル−Ｌ−バリル−Ｌ−フェニルアラニンメチルエステ
ル１．６２ｇを得た。

【００５２】質量分析値 （ｍ／ｚ）：６１０（Ｍ＋
Ｈ）⁺ 核磁気共鳴スペクトル（４００ＭＨｚ、ＣＤＣＬ₃、Ｔ
ＭＳ内部標準） δ：０．７５〜０．９（１２Ｈ，ｍ），１．０３（３
Ｈ，ｄ），１．９５〜２．１（４Ｈ，ｍ），２．２１
（１Ｈ，ｓｅｐｔｅｔ，Ｊ＝６．８Ｈｚ），２．３９
（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．３Ｈｚ），３．０〜３．５（２
Ｈ，ｍ），３．５〜３．１５（２Ｈ，ｍ），３．７０
（３Ｈ，ｓ），４．２４（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝６．６，
８．５Ｈｚ），４．７２（１Ｈ，ｑ，Ｊ＝７．３Ｈ
ｚ），４．８５（１Ｈ，ｑ，Ｊ＝７．０Ｈｚ），６．１
５（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．８Ｈｚ），６．５１（１Ｈ，
ｄ，Ｊ＝７．８Ｈｚ），６．６３（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．
３Ｈｚ），６．９７（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．３Ｈｚ），
７．１２（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．３Ｈｚ），７．１５〜
７．３（５Ｈ，ｍ）。

【００５３】第二工程 上記第一工程で得たＮ，Ｏージイソバレリル−Ｌ−チロ
シル−Ｌ−バリル−Ｌ−フェニルアラニンメチルエステ
ル４００ｍｇに乾燥トルエン６ｍｌを加えた。そのトル
エン溶液に−７８℃で０．９３Ｍジイソブチルアルミニ
ウムヒドリドのヘキサン溶液３．９７ｍｌを滴下した
後、５分間撹拌した。水５ｍｌを加え、室温に戻した
後、１Ｎ塩酸を加え、次いで酢酸エチルで抽出した。飽
和炭酸水素ナトリウム水溶液で洗った後、無水硫酸ナト
リウムで乾燥し、次いで溶媒を留去した。残留物をシリ
カゲルカラムクロマトグラフィーで精製した。クロロホ
ルム−メタノール（９５：５）で溶出される画分より、
イソバレリル−Ｌ−チロシル−Ｌ−バリル−Ｌ−フェニ
ルアラニナール（Ｑ−２１７０５−Ａ）及びイソバレリ
ル−Ｌ−チロシル−Ｌ−バリル−Ｌ−フェニルアラニノ
ール（Ｑ−２１７０５−Ｂ）の混合物７２ｍｇを得た。

【００５４】上記第二工程で得たＱ−２１７０５−Ａ及
びＱ−２１７０５−Ｂの混合物５０ｍｇを実施例１と同
一条件の分取高速液体クロマトグラフィーにより精製
し、Ｑ−２１７０５−Ａ（１９ｍｇ）と、Ｑ−２１７０
５−Ｂ（８ｍｇ）を得た。

【００５５】本発明化合物のカテプシンＬ阻害活性を、
以下の方法で確認した。 カテプシンＬ阻害活性測定法 ヒトの腎臓に由来するカテプシンＬを用いて、Methods
in Enzymology Vol. 80 p. 540-541記載の方法を一部改
変して、カテプシンＬ阻害活性を測定した。

【００５６】酢酸ナトリウム（340 nM）、酢酸（60 m
M）、ジナトリウムEDTA（4 mM）及びジチオトレイトー
ル（8 mM）を含む緩衝液（pH 5.5）７０μｌに、ヒト腎
由来カテプシンＬ（プロトーゲン社製；２０ng／ml上記
緩衝液）１５０μｌと測定検体のメタノール溶液５μｌ
を加えて、３０℃で１分間インキュベートした。次い
で、カルボベンゾキシ−Ｌ−フェニルアラニル−Ｌ−ア
ルギニン−４−メチル−クマリル−７−アミド（ペプチ
ド研製）（20 nM上記緩衝液溶液）７５μｌを加えて３
００μｌとして、更に１０分間インキュベートした。反
応液にモノクロロ酢酸ナトリウム（100 mM）、酢酸ナト
リウム（30 mM）、及び酢酸（70 mM）を含む反応停止液
（pH 4.3）を励起波長370 nm、観測波長460 nmの蛍光度
で測定し、次式によって阻害率を求めた。ただし、ブラ
ンク値は上記の組成の反応液に予め反応停止液を加えて
インキュベーションしたものの蛍光度とした。

【００５７】

【数１】阻害率（％）＝［１−（検体値−ブランク値）
／（コントロール値−ブランク値）］×１００ 上記方法により算出したＱ−２１７０５−Ａ及びＱ−２
１７０５−Ｂの阻害活性のＩＣ₅₀値（Ｍ）を表４にまと
めた。

【００５８】

【表４】

【００５９】次に、Ｑ−２１７０５−Ａ及びＢの物性デ
ータを表５に示す。

【００６０】

【表５】

【００６１】

【発明の効果】本発明化合物は、カテプシンＬ阻害作用
を有するので、カテプシンＬが関与する、骨粗鬆症、悪
性腫瘍性高カルシウム血症、骨ページェット病等の骨疾
患の治療及び予防に有用である。

【００６２】本発明化合物、その非毒性の塩、又はその
水和物を上記の目的で用いるには、通常、経口または非
経口で投与される。投与量は年令、体重、症状、治療効
果、投与方法、処理時間等により異なるが、通常成人ひ
とり当たり、１日につき０．１ｍｇ〜１００ｍｇ、好ま
しくは１ｍｇ〜１０ｍｇの範囲で１日１回から数回に分
け経口投与されるか、若しくは、成人ひとり当たり、１
日につき０．１ｍｇ〜１００ｍｇの範囲で、１日１回か
ら数回に分け非経口投与されるか、又は、１日１時間〜
２４時間の範囲で静脈内持続投与される。投与量は種々
の条件で変動するので、上記投与量範囲より少ない量で
十分な場合もある。

【００６３】本発明による経口投与のための固体組成物
としては、錠剤、散剤、顆粒剤等が用いられる。このよ
うな固体組成物においては、一つまたはそれ以上の活性
物質が、少なくとも一つの不活性な希釈剤、例えば乳
糖、マンニトール、ブドウ糖、ヒドロキシプロピルセル
ロース、微結晶セルロース、デンプン、ポリビニルピロ
リドン、メタケイ酸アルミン酸マグネシウム等と混合さ
れる。組成物は、常法に従って、不活性な希釈剤以外の
添加剤、例えばステアリン酸マグネシウムのような潤滑
剤や繊維素グリコール酸カルシウムのような崩壊剤、ラ
クトースのような安定化剤、グルタミン酸またはアスパ
ラギン酸のような溶解補助剤を含有していてもよい。錠
剤または丸剤は必要によりショ糖、ゼラチン、ヒドロキ
シプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセル
ロースフタレートなどの胃溶性又は腸溶性物質のフィル
ムで被膜してもよい。

【００６４】経口投与のための液体組成物は、薬剤的に
許容される乳濁剤、溶液剤、懸濁剤、シロップ剤、エリ
キシル剤等を含み、一般的に用いられる不活性な希釈
剤、例えば精製水、エタノールを含む。この組成物は不
活性な希釈剤以外に湿潤剤、懸濁剤のような補助剤、甘
味剤、風味剤、芳香剤、防腐剤を含有していてもよい。
非経口投与のための注射剤としては、無菌の水性又は非
水性の、溶液剤、懸濁剤、及び乳濁剤を包含する。水性
の溶液剤、懸濁剤としては、例えば注射剤用蒸留水及び
生理食塩水が含まれる。非水溶性の溶液剤、懸濁剤とし
ては、例えばプロピレングリコール、ポリエチレングリ
コール、オリーブ油の様な植物油、エタノールのような
アルコール類、ポリソルベート８０（商品名）の様な界
面活性剤等がある。このような組成物は、さらに防腐
剤、湿潤剤、乳化剤、分散剤、安定化剤（例えば、ラク
トース）、溶解補助剤（例えば、グルタミン酸、アスパ
ラギン酸）のような補助剤を含んでもよい。これらは例
えばバクテリア保留フィルターを通す濾過、殺菌剤の配
合、又は照射によって、無菌化される。これらはまた無
菌の固体組成物を製造し、使用前に無菌水または無菌の
注射用溶媒に溶解して使用することもできる。

フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ａ６１Ｋ 38/55 ＡＤＵ Ｃ０７Ｋ 5/087 8318−4Ｈ //(Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:465） Ａ６１Ｋ 37/64 ＡＤＵ (72)発明者 寺村 恭子 東京都板橋区小豆沢４−11−11 ジョイフ ァースト205号 (72)発明者 清水 靖代 東京都国立市富士見台２−１−30 国立社 宅２−102号 (72)発明者 柴▲崎▼ 充至 東京都板橋区蓮根３−18−13 ルーミー蓮 根409 (72)発明者 高橋 勇夫 埼玉県川越市大字南田島500−５ (72)発明者 平山 復志 茨城県つくば市二の宮２−５−９ ルーミ ー筑波319号 (72)発明者 ベンジャミン ステアワン インドネシア ジャカルタ 10310 ジャ ランレンバング ナンバー 11 (72)発明者 ラトナ ムルニ ランティアトモジョ インドネシア ジャカルタ 11510 アー ルティー008 アールヴィー 009 コンプ レックス グリーンヴィル ブロック オ ー ナンバー 12

Claims (4)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 下記一般式で表わされるトリペプチド化
   合物又はその塩。 【化１】 （式中、Ｒは、アルデヒド基、又は、ヒドロキシメチル
   基を意味する。）
2. 【請求項２】 ストレプトミセス属に属し、かつ、請求
   項１に記載のトリペプチド化合物を生産する能力を有す
   る微生物を培地に培養し、培養物中に当該トリペプチド
   化合物を生産して蓄積させ、当該培養物から当該トリペ
   プチドを採取することを特徴とする請求項１に記載のト
   リペプチド化合物の製造方法。
3. 【請求項３】 請求項１に記載のトリペプチド化合物又
   はその塩を有効成分とすることを特徴とするカテプシン
   Ｌ阻害剤。
4. 【請求項４】 請求項１に記載のトリペプチド化合物又
   はその塩を有効成分することを特徴とする骨粗鬆症、悪
   性腫瘍性カルシウム血症又は骨ページェット症の予防又
   は治療剤。