JPH07135998A - α−アミラーゼ活性測定法およびその試薬組成物 - Google Patents

α−アミラーゼ活性測定法およびその試薬組成物

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JPH07135998A
JPH07135998A JP28936793A JP28936793A JPH07135998A JP H07135998 A JPH07135998 A JP H07135998A JP 28936793 A JP28936793 A JP 28936793A JP 28936793 A JP28936793 A JP 28936793A JP H07135998 A JPH07135998 A JP H07135998A
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Abstract

(57)【要約】 【目的】 非還元性末端グルコースがβ−ガラクトース
で修飾されたβ−ガラクトシルマルトオリゴ糖を基質と
するアミラーゼ測定方法において、血清や尿などの体液
中のβ−ガラクトシダーゼの作用により基質が分解する
ことを抑制し、アミラーゼ活性を正確に測定する測定法
およびその測定試薬を提供する。 【構成】 還元末端グルコースの１位の水酸基が色原体
を結合し、非還元末端グルコースの４位または６位の水
酸基がβ−ガラクトースで修飾されたβ−ガラクトシル
マルトオリゴ糖を基質とし、α−グルコシダーゼおよび
／またはβ−グルコシダーゼを追随酵素とし、さらにβ
−ガラクトシダーゼ阻害剤を含む試薬を使用する。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、非還元性末端グルコー
スの４位または６位の水酸基をβ−ガラクトースで修飾
したβ−ガラクトシルマルトオリゴ糖を基質として用い
るアミラーゼ活性測定法及びその試薬組成物に関する。
【０００２】
【従来の技術】従来から膵液や尿等の体液中に含有され
るα−アミラーゼ活性を測定することにより、各種疾患
の診断が行われている。この方法ではα−アミラーゼの
活性測定法には、例えばマルトオリゴ糖（マルトトリオ
ース、マルトテトラオース、マルトペンタオース、マル
トヘキサオース等）を基質とする方法がある。この方法
では、α−アミラーゼ含有試料に該マルトオリゴ糖とα
−グルコシダーゼとを作用させて基質からグルコースを
遊離させ、遊離するグルコース量の量を測定することに
より、α−アミラーゼの活性を知ることができる。
【０００３】またマルトオリゴ糖誘導体として、還元性
末端グルコースにフェニル基、ナフチル基または、それ
らの誘導体をアグリコンとして結合させた基質を用いる
方法も提案されている。例えば基質としてｐ−ニトロフ
ェニルマルトペンタオシド（特公昭57-53079号公報）、
ｐ−ニトロフェニルマルトヘキサオシド（特公昭57-530
79号公報）、ｐ−ニトロフェニルマルトヘプタオシド
（特公昭62-50119号公報）、２，４−ジニトロマルトペ
ンタオシド（特公昭59-13199号公報）等が利用されてい
る。これらの基質を使用するとアグリコンが遊離し、遊
離したアグリコン、例えばｐ−ニトロフェニールを光学
的に測定することにより、α−アミラーゼの活性を測定
することが出来る。
【０００４】上記方法では、α−グルコシダーゼの作用
により、僅かではあるがブランク値が上昇し、その結
果、測定値の誤差が大きくなるという欠点が生じ、α−
グルコシダーゼと基質とを一液化することは難しいこと
であった。このような欠点を解消するために、マルトオ
リゴ糖の非還元性末端のグルコースの４位および／また
は６位の水酸基を修飾したタイプの基質が市販され利用
されるようになった。最近、上記合成糖より天然糖に近
い形のα−アミラーゼの基質として、非還元性末端グル
コースの４位または６位の水酸基がβ−ガラクトース修
飾された、β−ガラクトシルマルトオリゴ糖誘導体が開
発された（特開平3-264596号公報、特開平5-208989号公
報など) 。
【０００５】このような基質としては、例えば、２−ク
ロロ−４−ニトロフェニル ４−Ｏ−β−Ｄ−ガラクト
ピラノシル−β−マルトテトラオシドなどがある。この
基質は、追随酵素（α−グルコダーゼ、β−グルコシダ
ーゼ、グルコアミラーゼ等）の一液化条件において、α
−グルコシダーゼの作用を受けず、またその合成が容易
であり、水溶性に優れ、かつアミラーゼの作用様式をよ
り純粋に反映するなど多くの利点がある。通常、臨床診
断の場においては血清および尿中のα−アミラーゼを測
定し、疾患の有無を判断する。しかしながら、血清およ
び尿中にはβ−ガラクトシダーゼが存在する可能性を有
する。具体的に尿中には数ユニット（ＩＵ）存在するこ
とが知られている（東京化学同人発行、生化学データブ
ック、第1606頁、1979年発行) 。
【０００６】したがって、尿中にβ−ガラクトシダーゼ
が存在すると、基質であるガラクトシルマルトオリゴ糖
誘導体の非還元性末端グルコースに修飾されたガラクト
シル基のβ結合を加水分解し、ガラクトースとマルトオ
リゴ糖誘導体を生じることになる。生じたマルトオリゴ
糖誘導体は、追随酵素であるα−グルコシダーゼの作用
を受けることになり、測定のブランク値を上昇させ、そ
の結果、測定値の誤差が大きくなる。このことは非還元
性末端グルコースをブロックし、上記追随酵素の作用か
ら基質の分解を阻止するという本来の効果が消失するこ
とになる。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、上記
非還元性末端グルコースがβ−ガラクトースで修飾され
たβ−ガラクトシルマルトオリゴ糖を基質とするアミラ
ーゼ測定方法において、血清や尿などの体液中のβ−ガ
ラクトシダーゼの作用により基質が分解することを抑制
し、アミラーゼ活性を正確に測定する方法および試薬を
提供することにある。
【０００８】
【課題を解決するための手段】すなわち本発明は還元末
端グルコースの１位の水酸基が色原体を結合し、非還元
末端グルコースの４位または６位の水酸基がβ−ガラク
トースで修飾されたβ−ガラクトシルマルトオリゴ糖、
α−グルコシダーゼおよび／またはβ−グルコシダーゼ
およびβ−ガラクトシダーゼ阻害剤を含む試薬を、試料
中のα−アミラーゼに作用させ、生成する色原体を測定
することを特徴とするα−アミラーゼ活性測定法であ
る。
【０００９】また本発明は還元末端グルコースの１位の
水酸基が色原体を結合し、非還元末端グルコースの４位
または６位の水酸基がβ−ガラクトースで修飾されたβ
−ガラクトシルマルトオリゴ糖、α−グルコシダーゼお
よび／またはβ−グルコシダーゼおよびβ−ガラクトシ
ダーゼ阻害剤を含むことを特徴とするα−アミラーゼ活
性測定用試薬組成物である。
【００１０】本発明において使用する還元末端グルコー
スの１位の水酸基が色原体を結合し、非還元末端グルコ
ースの４位または６位の水酸基がβ−ガラクトースで修
飾されたβ−ガラクトシルマルトオリゴ糖とは、グルコ
ース数が２〜７であるマルトオリゴ糖の還元末端グルコ
ースの１位の水酸基に、α−グルコシダーゼ及びβ−グ
ルコシダーゼの追随酵素により加水分解を受けると呈色
する色原体をα−結合またはβ−結合し、非還元末端グ
ルコースの４位または６位の水酸基がβ- ガラクトシル
基で修飾されたものをいう。
【００１１】色原体としては、可視部に吸光度を有する
ものに限定されるものではなく、紫外部に吸光度を有す
るものや、蛍光測定あるいは発光測定が可能である化合
物でもよい。可視部に吸光度を有する色原体としては、
置換基としてニトロ基を有するフェノール類、例えば２
−クロロ−４−ニトロフェノール、ｐ−ニトロフェノー
ル等がある。紫外部に吸光度を有する色原体としては、
アニリノ基、メチルアニリノ基、ヒドロキシアニリノ
基、カルボキシフェニルアミノ基などがある。蛍光測定
が可能である化合物としては、２−ピリジルアミノ基、
３−ピリジルアミノ基、ウンベリフェリル基などがあ
る。
【００１２】本発明に使用する基質としては、下記式に
て示される化合物が例示される。
【００１３】
【化１】 （式中、Ｒ1 およびＲ2 のいずれか一方はβ−ガラクト
ピラノシル基を示し、他方は水素を示し、Ｒ3 はｐ−ニ
トロフェニル基またはハロゲン置換ｐ−ニトロフェニル
基を示し、ｎは０〜５の整数を示す。）
【００１４】還元末端グルコースの１位の水酸基が色原
体をα−結合し、非還元末端グルコースの４位または６
位の水酸基がβ−ガラクトースで修飾されたβ−ガラク
トシルマルトオリゴ糖としては、４−ニトロフェニル
４−Ｏ−β−Ｄ−ガラクトピラノシル−α−マルトシ
ド、４−ニトロフェニル ４−Ｏ−β−Ｄ−ガラクトピ
ラノシル−α−マルトトリオシド、４−ニトロフェニル
４−Ｏ−β−Ｄ−ガラクトピラノシル−α−マルトテ
トラオシド、４−ニトロフェニル ４−Ｏ−β−Ｄ−ガ
ラクトピラノシル−α−マルトペンタオシド、４−ニト
ロフェニル ６−Ｏ−β−Ｄ−ガラクトピラノシル−α
−マルトテトラオシド、４−ニトロフェニル ６−Ｏ−
β−Ｄ−ガラクトピラノシル−α−マルトペンタオシ
ド、２−クロロ−４−ニトロフェニル ４−Ｏ−β−Ｄ
−ガラクトピラノシル−α−テトラオシドまたは２−ク
ロロ−４−ニトロフェニル ４−Ｏ−β−Ｄ−ガラクト
ピラノシル−α−マルトペンタオシド等がある。
【００１５】還元末端グルコースの１位の水酸基が色原
体をβ−結合し、非還元末端グルコースの４位または６
位の水酸基がβ−ガラクトースで修飾されたβ−ガラク
トシルマルトオリゴ糖としては、２−クロロ−４−ニト
ロフェニル ４−Ｏ−β−Ｄ−ガラクトピラノシル−β
−マルトシド、２−クロロ−４−ニトロフェニル ４−
Ｏ−β−Ｄ−ガラクトピラノシル−β−マルトトリオシ
ド、２−クロロ−４−ニトロフェニル ４−Ｏ−β−Ｄ
−ガラクトピラノシル−β−マルトテトラオシドまたは
２−クロロ−４−ニトロフェニル ４−Ｏ−β−Ｄ−ガ
ラクトピラノシル−β−マルトペンタオシド、２−クロ
ロ−４−ニトロフェニル ６−Ｏ−β−Ｄ−ガラクトピ
ラノシル−β−マルトテトラオシドまたは２−クロロ−
４−ニトロフェニル ６−Ｏ−β−Ｄ−ガラクトピラノ
シル−β−マルトペンタオシド、４−ニトロフェニル
４−Ｏ−β−Ｄ−ガラクトピラノシル−β−テトラオシ
ドまたは４−ニトロフェニル ４−Ｏ−β−Ｄ−ガラク
トピラノシル−β−マルトペンタオシド等が挙げられ
る。このような化合物の製造法としては、特開平3-2645
96号公報、特開平5-208989号公報および特願平4-209277
号明細書に記載された方法などがある。
【００１６】β−ガラクトシダーゼ阻害剤としては、例
えばβ−Ｄ−チオガラクトシル類、キレート剤またはア
ミン類、または１ｍＭ以上のカルシウムイオン、ラクト
ース、ガラクトスタインが挙げられる。β−チオガラク
トシド誘導体としては、例えばイソプロピルチオガラク
トシド、等がある。またキレート剤としては、ＥＤＴＡ
−２Ｎａ、ＥＤＴＡ−３Ｎａ等がある。さらにアミン類
としては、例えばエタノールアミン、メルカプチルアミ
ン等がある。カルシウイオンの供給源としては、塩化カ
ルシウム、酢酸カルシウム等がある。
【００１７】本発明に用いるα−グルコシダーゼは、動
物、植物または微生物などから得られるα−グルコシダ
ーゼが利用でき、その起源を問わない。
【００１８】本発明において用いるβ−グルコシダーゼ
は、植物、微生物などから得られるβ−グルコシダーゼ
が利用でき、その起源を問わない。
【００１９】本発明のα−アミラーゼ活性測定用試薬組
成物は、上記ガラクトシルマルトオリゴ糖、α−グルコ
シダーゼおよび／又はβ−グルコシダーゼおよびβ−ガ
ラクトシダーゼ阻害剤を含有するものであり、緩衝液の
ほかに必要に応じてその他の添加物、例えば界面活性
剤、塩化ナトリウム等の塩類、蛋白結合防止剤、防腐剤
などを含有しても良い。
【００２０】還元末端グルコースの１位の水酸基が色原
体をα−結合し、非還元末端グルコースの４位または６
位の水酸基がβ−ガラクトースで修飾されたβ−ガラク
トシルマルトオリゴ糖を基質とする場合、α−グルコシ
ダーゼおよびβ−ガラクトシダーゼ阻害剤を含む。
【００２１】還元末端グルコースの１位の水酸基が色原
体をβ−結合し、非還元末端グルコースの４位または６
位の水酸基がβ−ガラクトースで修飾されたβ−ガラク
トシルマルトオリゴ糖であって、グルコース数が２また
は３のものを基質とする場合、β−グルコシダーゼおよ
びβ−ガラクトシダーゼ阻害剤を含む。
【００２２】還元末端グルコースの１位の水酸基が色原
体をβ−結合し、非還元末端グルコースの４位または６
位の水酸基がβ−ガラクトースで修飾されたβ−ガラク
トシルマルトオリゴ糖であって、グルコース数が４〜７
のものを基質とする場合、α−グルコシダーゼ、β−グ
ルコシダーゼおよびβ−ガラクトシダーゼ阻害剤を含
む。
【００２３】本発明のα−アミラーゼ活性測定用試薬組
成物を用いたα−アミラーゼ活性の測定は、還元末端グ
ルコースの１位の水酸基が色原体を結合し、非還元末端
グルコースの４位または６位の水酸基がβ−ガラクトー
スで修飾されたβ−ガラクトシルマルトオリゴ糖、α−
グルコシダーゼおよび／またはβ−グルコシダーゼおよ
びβ−ガラクトシダーゼ阻害剤を含む試薬を、試料中の
α−アミラーゼに作用させ、生成する色原体を測定す
る。生成された色原体は常法に従って測定する。例えば
可視部に吸光度を有する化合物であれば、吸光度計によ
り吸光度変化を測定する。
【００２４】本発明において、体液中のβ−ガラクトシ
ダーゼ活性は以下の方法により測定する。ｏ−ニトロフ
ェニル−β−ガラクトピラノシド（ＯＮＰＧ）を基質と
して、β−ガラクトシダーゼの作用より生成するｏ−ニ
トロフェノールの生成量を４１０ｎｍの吸光度の変化で
測定する。１分間の１マイクロモルのｏ−ニトロフェノ
ールを生成する酵素量を１ユニット（ＩＵ）とする。
【００２５】β−ガラクトシダーゼの活性測定方法 １．試薬 ０．１Ｍ リン酸緩衝液 ｐＨ７．３ （３７℃） ３．３６Ｍ メルカプトエタノール溶液 ３０ｍＭ ＭｇＣｌ2 溶液 ０．３４ｍＭ ＯＮＰＧ溶液（ｏ−ニトロフェニル−β
−Ｄ−ガラクトピラノシド） ２．操作方法 下記反応混液をキュベットに調製し、３７℃で約５分予
備加温する。 ２．５ｍｌ ０．１Ｍリン酸緩衝液ｐＨ７．３ ０．１ｍｌ メルカプトエタノール溶液 ０．１ｍｌ ＭｇＣｌ2 溶液 ０．１ｍｌ ＯＮＰＧ溶液 酵素液を０．１ｍｌ添加し、緩やかに混和後、水を対照
に３７℃に制御された分光光度計で４１０ｎｍの吸光度
変化を２〜３分間記録し、その初期直線部分から、１分
間あたりの吸光度変化量を求める。（△ＯＤｔｅｓｔ） 盲検は、酵素液の代わりに酵素希釈液（１．０ｍＭのＭ
ｇＣｌ2 を含む５０ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ７．３）を
０．１ｍｌを加え、上記同様に操作を行って１分あたり
の吸光度変化を求める。（△ＯＤｂｌａｎｋ）
【００２６】３．計算式
【数１】 3.5 ：ｏ−ニトロフェノールの上記測定条件下でのミリ
モル分子吸光係数(ｃｍ2/micromole) 1.0 ：光路長(cm)
【００２７】
【実施例】次に実施例および比較例により本発明を更に
詳細に説明する。 参考例１ 非還元末端グルコースをガラクトースで修飾し基質を使
用するα−アミラーゼの活性測定法へのβ−ガラクトシ
ダーゼの影響 １．試薬組成 ５０ｍＭ グッド緩衝液（ＰＩＰＥＳ） ｐＨ７．０ α−グルコシダーゼ ９０ Ｕ／ｍｌ β−グルコシダーゼ １２ Ｕ／ｍｌ ＣａＣｌ2 ０．５ｍＭ ２−クロロ−４−ニトロフェニル ４−Ｏ−β−Ｄ− −ガラクトピラノシル−β−マルトテトラオシド ２ｍＭ ２．サンプル 大腸菌由来β−ガラクトシダーゼを０ＩＵ／ｍｌ、１０
ＩＵ／ｍｌ、２０ＩＵ／ｍｌ、１００ＩＵ／ｍｌ、２０
０ＩＵ／ｍｌになるように蒸留水で調製した。 ３．検討方法 上記試薬３ｍｌにサンプル０．２５ｍｌを添加し、３７
℃において３分間放置した後、４０５ｎｍにおける吸光
度の変化を測定し、１分間あたりの吸光度変化量からα
−アミラーゼの活性測定法に対するβ−ガラクトシダー
ゼの影響（△ＯＤ/min）を測定した。その結果を表１に
示す。
【００２８】
【表１】
【００２９】β−ガラクトシダーゼ活性が高くなるのに
つれて、測定値（△ＯＤ/min）が上昇し、α−アミラー
ゼの活性測定法に対する影響度が大きくなっていること
が表１から明らかである。
【００３０】実施例１ イソプロピルチオガラクトシドの効果の検討（その１） 参考例１の試薬に、イソプロピルチオガラクトシドを各
種濃度添加し、α−アミラーゼの活性測定法に対するβ
−ガラクトシダーゼの影響度を測定した。サンプルとし
て大腸菌由来β−ガラクトシダーゼ１００ＩＵ／ｍｌを
用い、比較例１に記載した検定方法に基づき検討を実施
した。なお、結果を表２に示す。
【００３１】
【表２】
【００３２】イソプロピルチオガラクトシドの添加濃度
を高くするのに従い、測定値は低くなりα−アミラーゼ
の活性測定法に対するβ−ガラクトシダーゼの影響は回
避されていることが表２から明らかである。。
【００３３】実施例２ 各種β−ガラクトシダーゼ阻害剤の効果の検討 参考例１の試薬に、各種β−ガラクトシダーゼ阻害剤を
各種濃度添加し、α−アミラーゼの活性測定法に対する
β−ガラクトシダーゼの影響度を測定した。サンプルと
して大腸菌由来β−ガラクトシダーゼ１００ＩＵ／ｍｌ
を用い、比較例１に記載した検定方法に基づき検討を実
施した。なお、結果を表３に示す。
【００３４】
【表３】
【００３５】β−ガラクトシダーゼ阻害剤を添加するこ
とにより、測定値は低下しα−アミラーゼ活性測定法に
対するβ−ガラクトシダーゼの影響は、回避されている
ことが表３から明らかである。
【００３６】参考例２ 尿中のβ−ガラクトシダーゼ活性の測定 健常者２０名の尿中のβ−ガラクトシダーゼ活性を上記
方法により測定した。結果を表４に示す。
【００３７】
【表４】
【００３８】健常者２０名の尿中のβ−ガラクトシダー
ゼ活性は、０〜６ＩＵ／ｌ程度含まれていることがわか
った。各種疾患では、高値のβ−ガラクトシダーゼ含有
尿検体が存在する可能性は否定できない。
【００３９】実施例３ イソプロピルチオガラクトシドの効果の検討（その２） 健常者２名の尿に大腸菌由来β−ガラクトシダーゼを１
０ＩＵ／ｍｌとなるように添加したサンプルを調製し、
尿中α−アミラーゼ活性を参考例１で記載した方法によ
り測定した。また、終濃度５ｍＭのイソプロピルチオガ
ラクトシドを添加した試薬でも上記β−ガラクトシダー
ゼを添加した尿サンプル中のα−アミラーゼ活性を測定
し、両者の測定値を比較した。また、非還元末端グルコ
ースがガラクトースで修飾されていないマルトオリゴ糖
誘導体基質を用いたα−アミラーゼ測定法である、体外
診断用医薬品ダイヤカラー・ＡＭＹネオレート（東洋紡
績社製）を対照試薬として用いて同時に尿サンプル中の
α−アミラーゼ活性を測定した。α−アミラーゼ活性
は、キャリブザイムＰ（国際試薬社製）のα−アミラー
ゼ活性表示値をもとに各試薬での測定値を補正して、α
−アミラーゼ活性値とした。結果を表５に示す。
【００４０】
【表５】
【００４１】イソプロピルチオガラクトシドを添加しな
い試薬（比較例）では、α−アミラーゼ活性測定値が、
約７ＩＵ／Ｌ程度高く測定されている。
【００４２】実施例４ カルシウムイオンの効果の検討（その１） 参考例１の試薬に、ＣａＣｌ2 を各種濃度添加し、α−
アミラーゼの活性測定法に対するβ−ガラクトシダーゼ
の影響度を測定した。サンプルとして大腸菌由来β−ガ
ラクトシダーゼ１００ＩＵ／ｍｌを用い、比較例１に記
載した検定方法に基づき検討を実施した。なお、結果を
表６に示す。
【００４３】
【表６】
【００４４】カルシウムイオンの添加濃度を高くするの
に従い、測定値は低くなりα−アミラーゼの活性測定法
に対するβ−ガラクトシダーゼの影響は回避されている
ことが表6 から明らかである。またカルシウムイオン0.
5mM 以下では影響を回避する効果がなく、1mM 以上でβ
−ガラクトシダーゼの影響を回避する効果があることが
わかる。
【００４５】実施例５ マルシウムイオンの効果の検討（その２） 健常者２名の尿に大腸菌由来β−ガラクトシダーゼを１
０ＩＵ／ｍｌとなるように添加したサンプルを調製し、
尿中α−アミラーゼ活性を参考例１で記載した方法によ
り測定した。また、終濃度５ｍＭのＣａＣｌ2 を添加し
た試薬でも上記β−ガラクトシダーゼを添加した尿サン
プル中のα−アミラーゼ活性を測定し、両者の測定値を
比較した。また、非還元末端グルコースがガラクトース
で修飾されていないマルトオリゴ糖誘導体基質を用いた
α−アミラーゼ測定法である、体外診断用医薬品ダイヤ
カラー・ＡＭＹネオレート（東洋紡績社製）を対照試薬
として用いて同時に尿サンプル中のα−アミラーゼ活性
を測定した。α−アミラーゼ活性は、キャリブザイムＰ
（国際試薬社製）のα−アミラーゼ活性表示値をもとに
各試薬での測定値を補正して、α−アミラーゼ活性値と
した。結果を表７に示す。
【００４６】
【表７】
【００４７】ＣａＣｌ2 を添加しない試薬（比較例）で
は、α−アミラーゼ活性測定値が、約７ＩＵ／Ｌ程度高
く測定されている。
【００４８】
【発明の効果】本発明の非還元末端グルコースをβ−ガ
ラクトースで修飾したβ−ガラクトシルマルトオリゴ糖
を基質として測定するアミラーゼ活性測定法では、β−
ガラクトシダーゼ阻害剤を使用することにより、試料中
のβ−ガラクトシダーゼによるガラクトシルマルトオリ
ゴ糖の分解を阻止し、正確に試料中のα−アミラーゼ活
性測定方法を提供できる。さらに本発明では上記利点を
有するα−アミラーゼ活性測定試薬組成物を提供でき
る。
─────────────────────────────────────────────────────
【手続補正書】
【提出日】平成５年１２月２１日
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正内容】
【書類名】 明細書
【発明の名称】 α−アミラーゼ活性測定法およびその
試薬組成物
【特許請求の範囲】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、非還元性末端グルコー
スの４位または６位の水酸基をβ−ガラクトースで修飾
したβ−ガラクトシルマルトオリゴ糖を基質として用い
るアミラーゼ活性測定法及びその試薬組成物に関する。
【０００２】
【従来の技術】従来から膵液や尿等の体液中に含有され
るα−アミラーゼ活性を測定することにより、各種疾患
の診断が行われている。この方法ではα−アミラーゼの
活性測定法には、例えばマルトオリゴ糖（マルトトリオ
ース、マルトテトラオース、マルトペンタオース、マル
トヘキサオース等）を基質とする方法がある。この方法
では、α−アミラーゼ含有試料に該マルトオリゴ糖とα
−グルコシダーゼとを作用させて基質からグルコースを
遊離させ、遊離するグルコース量の量を測定することに
より、α−アミラーゼの活性を知ることができる。
【０００３】またマルトオリゴ糖誘導体として、還元性
末端グルコースにフェニル基、ナフチル基または、それ
らの誘導体をアグリコンとして結合させた基質を用いる
方法も提案されている。例えば基質としてｐ−ニトロフ
ェニルマルトペンタオシド（特公昭57-53079号公報）、
ｐ−ニトロフェニルマルトヘキサオシド（特公昭57-530
79号公報）、ｐ−ニトロフェニルマルトヘプタオシド
（特公昭62-50119号公報）、２，４−ジニトロマルトペ
ンタオシド（特公昭59-13199号公報）等が利用されてい
る。これらの基質を使用するとアグリコンが遊離し、遊
離したアグリコン、例えばｐ−ニトロフェノールを光学
的に測定することにより、α−アミラーゼの活性を測定
することが出来る。
【０００４】上記方法では、α−グルコシダーゼの作用
により、僅かではあるがブランク値が上昇し、その結
果、測定値の誤差が大きくなるという欠点が生じ、α−
グルコシダーゼと基質とを一液化することは難しいこと
であった。このような欠点を解消するために、マルトオ
リゴ糖の非還元性末端のグルコースの４位および／また
は６位の水酸基を修飾したタイプの基質が市販され利用
されるようになった。最近、上記合成糖より天然糖に近
い形のα−アミラーゼの基質として、非還元性末端グル
コースの４位または６位の水酸基がβ−ガラクトース修
飾された、β−ガラクトシルマルトオリゴ糖誘導体が開
発された（特開平3-264596号公報、特開平5-208989号公
報など) 。
【０００５】このような基質としては、例えば、２−ク
ロロ−４−ニトロフェニル ４−Ｏ−β−Ｄ−ガラクト
ピラノシル−β−マルトテトラオシドなどがある。この
基質は、追随酵素（α−グルコダーゼ、β−グルコシダ
ーゼ、グルコアミラーゼ等）の一液化条件において、α
−グルコシダーゼの作用を受けず、またその合成が容易
であり、水溶性に優れ、かつアミラーゼの作用様式をよ
り純粋に反映するなど多くの利点がある。通常、臨床診
断の場においては血清および尿中のα−アミラーゼを測
定し、疾患の有無を判断する。しかしながら、血清およ
び尿中にはβ−ガラクトシダーゼが存在する可能性を有
する。具体的に尿中には数ユニット（ＩＵ）存在するこ
とが知られている（東京化学同人発行、生化学データブ
ック、第1606頁、1979年発行) 。
【０００６】したがって、尿中にβ−ガラクトシダーゼ
が存在すると、基質であるガラクトシルマルトオリゴ糖
誘導体の非還元性末端グルコースに修飾されたガラクト
シル基のβ結合を加水分解し、ガラクトースとマルトオ
リゴ糖誘導体を生じることになる。生じたマルトオリゴ
糖誘導体は、追随酵素であるα−グルコシダーゼの作用
を受けることになり、測定のブランク値を上昇させ、そ
の結果、測定値の誤差が大きくなる。このことは非還元
性末端グルコースをブロックし、上記追随酵素の作用か
ら基質の分解を阻止するという本来の効果が消失するこ
とになる。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、上記
非還元性末端グルコースがβ−ガラクトースで修飾され
たβ−ガラクトシルマルトオリゴ糖を基質とするアミラ
ーゼ測定方法において、血清や尿などの体液中のβ−ガ
ラクトシダーゼの作用により基質が分解することを抑制
し、アミラーゼ活性を正確に測定する方法および試薬を
提供することにある。
【０００８】
【課題を解決するための手段】すなわち本発明は還元末
端グルコースの１位の水酸基が色原体を結合し、非還元
末端グルコースの４位または６位の水酸基がβ−ガラク
トースで修飾されたβ−ガラクトシルマルトオリゴ糖、
α−グルコシダーゼおよび／またはβ−グルコシダーゼ
およびβ−ガラクトシダーゼ阻害剤を含む試薬を、試料
中のα−アミラーゼに作用させ、生成する色原体を測定
することを特徴とするα−アミラーゼ活性測定法であ
る。
【０００９】また本発明は還元末端グルコースの１位の
水酸基が色原体を結合し、非還元末端グルコースの４位
または６位の水酸基がβ−ガラクトースで修飾されたβ
−ガラクトシルマルトオリゴ糖、α−グルコシダーゼお
よび／またはβ−グルコシダーゼおよびβ−ガラクトシ
ダーゼ阻害剤を含むことを特徴とするα−アミラーゼ活
性測定用試薬組成物である。
【００１０】本発明において使用する還元末端グルコー
スの１位の水酸基が色原体を結合し、非還元末端グルコ
ースの４位または６位の水酸基がβ−ガラクトースで修
飾されたβ−ガラクトシルマルトオリゴ糖とは、グルコ
ース数が２〜７であるマルトオリゴ糖の還元末端グルコ
ースの１位の水酸基に、α−グルコシダーゼ及びβ−グ
ルコシダーゼの追随酵素により加水分解を受けると呈色
する色原体をα−結合またはβ−結合し、非還元末端グ
ルコースの４位または６位の水酸基がβ- ガラクトシル
基で修飾されたものをいう。
【００１１】色原体としては、可視部に吸光度を有する
ものに限定されるものではなく、紫外部に吸光度を有す
るものや、蛍光測定あるいは発光測定が可能である化合
物でもよい。可視部に吸光度を有する色原体としては、
置換基としてニトロ基を有するフェノール類、例えば２
−クロロ−４−ニトロフェノール、ｐ−ニトロフェノー
ル等がある。紫外部に吸光度を有する色原体としては、
アニリノ基、メチルアニリノ基、ヒドロキシアニリノ
基、カルボキシフェニルアミノ基などがある。蛍光測定
が可能である化合物としては、２−ピリジルアミノ基、
３−ピリジルアミノ基、ウンベリフェリル基などがあ
る。
【００１２】本発明に使用する基質としては、下記式に
て示される化合物が例示される。
【００１３】
【化１】 （式中、Ｒ1 およびＲ2 のいずれか一方はβ−ガラクト
ピラノシル基を示し、他方は水素を示し、Ｒ3 はｐ−ニ
トロフェニル基またはハロゲン置換ｐ−ニトロフェニル
基を示し、ｎは０〜５の整数を示す。）
【００１４】還元末端グルコースの１位の水酸基が色原
体をα−結合し、非還元末端グルコースの４位または６
位の水酸基がβ−ガラクトースで修飾されたβ−ガラク
トシルマルトオリゴ糖としては、４−ニトロフェニル
４−Ｏ−β−Ｄ−ガラクトピラノシル−α−マルトシ
ド、４−ニトロフェニル ４−Ｏ−β−Ｄ−ガラクトピ
ラノシル−α−マルトトリオシド、４−ニトロフェニル
４−Ｏ−β−Ｄ−ガラクトピラノシル−α−マルトテ
トラオシド、４−ニトロフェニル ４−Ｏ−β−Ｄ−ガ
ラクトピラノシル−α−マルトペンタオシド、４−ニト
ロフェニル ６−Ｏ−β−Ｄ−ガラクトピラノシル−α
−マルトテトラオシド、４−ニトロフェニル ６−Ｏ−
β−Ｄ−ガラクトピラノシル−α−マルトペンタオシ
ド、２−クロロ−４−ニトロフェニル ４−Ｏ−β−Ｄ
−ガラクトピラノシル−α−テトラオシドまたは２−ク
ロロ−４−ニトロフェニル ４−Ｏ−β−Ｄ−ガラクト
ピラノシル−α−マルトペンタオシド等がある。
【００１５】還元末端グルコースの１位の水酸基が色原
体をβ−結合し、非還元末端グルコースの４位または６
位の水酸基がβ−ガラクトースで修飾されたβ−ガラク
トシルマルトオリゴ糖としては、２−クロロ−４−ニト
ロフェニル ４−Ｏ−β−Ｄ−ガラクトピラノシル−β
−マルトシド、２−クロロ−４−ニトロフェニル ４−
Ｏ−β−Ｄ−ガラクトピラノシル−β−マルトトリオシ
ド、２−クロロ−４−ニトロフェニル ４−Ｏ−β−Ｄ
−ガラクトピラノシル−β−マルトテトラオシドまたは
２−クロロ−４−ニトロフェニル ４−Ｏ−β−Ｄ−ガ
ラクトピラノシル−β−マルトペンタオシド、２−クロ
ロ−４−ニトロフェニル ６−Ｏ−β−Ｄ−ガラクトピ
ラノシル−β−マルトテトラオシドまたは２−クロロ−
４−ニトロフェニル ６−Ｏ−β−Ｄ−ガラクトピラノ
シル−β−マルトペンタオシド、４−ニトロフェニル
４−Ｏ−β−Ｄ−ガラクトピラノシル−β−テトラオシ
ドまたは４−ニトロフェニル ４−Ｏ−β−Ｄ−ガラク
トピラノシル−β−マルトペンタオシド等が挙げられ
る。このような化合物の製造法としては、特開平3-2645
96号公報、特開平5-208989号公報および特願平4-209277
号明細書に記載された方法などがある。
【００１６】β−ガラクトシダーゼ阻害剤としては、例
えばβ−Ｄ−チオガラクトシル類、キレート剤またはア
ミン類、または１ｍＭ以上のカルシウムイオン、ラクト
ース、ガラクトスタチンが挙げられる。β−チオガラク
トシド誘導体としては、例えばイソプロピルチオガラク
トシド、等がある。またキレート剤としては、ＥＤＴＡ
−２Ｎａ、ＥＤＴＡ−３Ｎａ等がある。さらにアミン類
としては、例えばエタノールアミン、メルカプチルアミ
ン等がある。カルシウムイオンの供給源としては、塩化
カルシウム、酢酸カルシウム等がある。
【００１７】本発明に用いるα−グルコシダーゼは、動
物、植物または微生物などから得られるα−グルコシダ
ーゼが利用でき、その起源を問わない。
【００１８】本発明において用いるβ−グルコシダーゼ
は、植物、微生物などから得られるβ−グルコシダーゼ
が利用でき、その起源を問わない。
【００１９】本発明のα−アミラーゼ活性測定用試薬組
成物は、上記ガラクトシルマルトオリゴ糖、α−グルコ
シダーゼおよび／又はβ−グルコシダーゼおよびβ−ガ
ラクトシダーゼ阻害剤を含有するものであり、緩衝液の
ほかに必要に応じてその他の添加物、例えば界面活性
剤、塩化ナトリウム等の塩類、蛋白結合防止剤、防腐剤
などを含有しても良い。
【００２０】還元末端グルコースの１位の水酸基が色原
体をα−結合し、非還元末端グルコースの４位または６
位の水酸基がβ−ガラクトースで修飾されたβ−ガラク
トシルマルトオリゴ糖を基質とする場合、α−グルコシ
ダーゼおよびβ−ガラクトシダーゼ阻害剤を含む。
【００２１】還元末端グルコースの１位の水酸基が色原
体をβ−結合し、非還元末端グルコースの４位または６
位の水酸基がβ−ガラクトースで修飾されたβ−ガラク
トシルマルトオリゴ糖であって、グルコース数が２また
は３のものを基質とする場合、β−グルコシダーゼおよ
びβ−ガラクトシダーゼ阻害剤を含む。
【００２２】還元末端グルコースの１位の水酸基が色原
体をβ−結合し、非還元末端グルコースの４位または６
位の水酸基がβ−ガラクトースで修飾されたβ−ガラク
トシルマルトオリゴ糖であって、グルコース数が４〜７
のものを基質とする場合、α−グルコシダーゼ、β−グ
ルコシダーゼおよびβ−ガラクトシダーゼ阻害剤を含
む。
【００２３】本発明のα−アミラーゼ活性測定用試薬組
成物を用いたα−アミラーゼ活性の測定は、還元末端グ
ルコースの１位の水酸基が色原体を結合し、非還元末端
グルコースの４位または６位の水酸基がβ−ガラクトー
スで修飾されたβ−ガラクトシルマルトオリゴ糖、α−
グルコシダーゼおよび／またはβ−グルコシダーゼおよ
びβ−ガラクトシダーゼ阻害剤を含む試薬を、試料中の
α−アミラーゼに作用させ、生成する色原体を測定す
る。生成された色原体は常法に従って測定する。例えば
可視部に吸光度を有する化合物であれば、吸光度計によ
り吸光度変化を測定する。
【００２４】本発明において、体液中のβ−ガラクトシ
ダーゼ活性は以下の方法により測定する。ｏ−ニトロフ
ェニル−β−ガラクトピラノシド（ＯＮＰＧ）を基質と
して、β−ガラクトシダーゼの作用より生成するｏ−ニ
トロフェノールの生成量を４１０ｎｍの吸光度の変化で
測定する。１分間の１マイクロモルのｏ−ニトロフェノ
ールを生成する酵素量を１ユニット（ＩＵ）とする。
【００２５】β−ガラクトシダーゼの活性測定方法 １．試薬 ０．１Ｍ リン酸緩衝液 ｐＨ７．３ （３７℃） ３．３６Ｍ メルカプトエタノール溶液 ３０ｍＭ ＭｇＣｌ2 溶液 ０．３４ｍＭ ＯＮＰＧ溶液（ｏ−ニトロフェニル−β
−Ｄ−ガラクトピラノシド） ２．操作方法 下記反応混液をキュベットに調製し、３７℃で約５分予
備加温する。 ２．５ｍｌ ０．１Ｍリン酸緩衝液ｐＨ７．３ ０．１ｍｌ メルカプトエタノール溶液 ０．１ｍｌ ＭｇＣｌ2 溶液 ０．１ｍｌ ＯＮＰＧ溶液 酵素液を０．１ｍｌ添加し、緩やかに混和後、水を対照
に３７℃に制御された分光光度計で４１０ｎｍの吸光度
変化を２〜３分間記録し、その初期直線部分から、１分
間あたりの吸光度変化量を求める。（△ＯＤｔｅｓｔ） 盲検は、酵素液の代わりに酵素希釈液（１．０ｍＭのＭ
ｇＣｌ2 を含む５０ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ７．３）を
０．１ｍｌを加え、上記同様に操作を行って１分あたり
の吸光度変化を求める。（△ＯＤｂｌａｎｋ）
【００２６】３．計算式
【数１】 3.5 ：ｏ−ニトロフェノールの上記測定条件下でのミリ
モル分子吸光係数(ｃｍ2/micromole) 1.0 ：光路長(cm)
【００２７】
【実施例】次に実施例および比較例により本発明を更に
詳細に説明する。 参考例１ 非還元末端グルコースをガラクトースで修飾し基質を使
用するα−アミラーゼの活性測定法へのβ−ガラクトシ
ダーゼの影響 １．試薬組成 ５０ｍＭ グッド緩衝液（ＰＩＰＥＳ） ｐＨ７．０ α−グルコシダーゼ ９０ Ｕ／ｍｌ β−グルコシダーゼ １２ Ｕ／ｍｌ ＣａＣｌ2 ０．５ｍＭ ２−クロロ−４−ニトロフェニル ４−Ｏ−β−Ｄ− −ガラクトピラノシル−β−マルトテトラオシド ２ｍＭ ２．サンプル 大腸菌由来β−ガラクトシダーゼを０ＩＵ／ｍｌ、１０
ＩＵ／ｍｌ、２０ＩＵ／ｍｌ、１００ＩＵ／ｍｌ、２０
０ＩＵ／ｍｌになるように蒸留水で調製した。 ３．検討方法 上記試薬３ｍｌにサンプル０．２５ｍｌを添加し、３７
℃において３分間放置した後、４０５ｎｍにおける吸光
度の変化を測定し、１分間あたりの吸光度変化量からα
−アミラーゼの活性測定法に対するβ−ガラクトシダー
ゼの影響（△ＯＤ/min）を測定した。その結果を表１に
示す。
【００２８】
【表１】
【００２９】β−ガラクトシダーゼ活性が高くなるのに
つれて、測定値（△ＯＤ/min）が上昇し、α−アミラー
ゼの活性測定法に対する影響度が大きくなっていること
が表１から明らかである。
【００３０】実施例１ イソプロピルチオガラクトシドの効果の検討（その１） 参考例１の試薬に、イソプロピルチオガラクトシドを各
種濃度添加し、α−アミラーゼの活性測定法に対するβ
−ガラクトシダーゼの影響度を測定した。サンプルとし
て大腸菌由来β−ガラクトシダーゼ２５ＩＵ／ｍｌを用
い、比較例１に記載した検定方法に基づき検討を実施し
た。なお、結果を表２に示す。
【００３１】
【表２】
【００３２】イソプロピルチオガラクトシドの添加濃度
を高くするのに従い、測定値は低くなりα−アミラーゼ
の活性測定法に対するβ−ガラクトシダーゼの影響は回
避されていることが表２から明らかである。。
【００３３】実施例２ 各種β−ガラクトシダーゼ阻害剤の効果の検討 参考例１の試薬に、各種β−ガラクトシダーゼ阻害剤を
各種濃度添加し、α−アミラーゼの活性測定法に対する
β−ガラクトシダーゼの影響度を測定した。サンプルと
して大腸菌由来β−ガラクトシダーゼ２５ＩＵ／ｍｌを
用い、比較例１に記載した検定方法に基づき検討を実施
した。なお、結果を表３に示す。
【００３４】
【表３】
【００３５】β−ガラクトシダーゼ阻害剤を添加するこ
とにより、測定値は低下しα−アミラーゼ活性測定法に
対するβ−ガラクトシダーゼの影響は、回避されている
ことが表３から明らかである。
【００３６】参考例２ 尿中のβ−ガラクトシダーゼ活性の測定 健常者２０名の尿中のβ−ガラクトシダーゼ活性を上記
方法により測定した。結果を表４に示す。
【００３７】
【表４】
【００３８】健常者２０名の尿中のβ−ガラクトシダー
ゼ活性は、０〜６ＩＵ／ｌ程度含まれていることがわか
った。各種疾患では、高値のβ−ガラクトシダーゼ含有
尿検体が存在する可能性は否定できない。
【００３９】実施例３ イソプロピルチオガラクトシドの効果の検討（その２） 健常者２名の尿に大腸菌由来β−ガラクトシダーゼを１
０ＩＵ／ｍｌとなるように添加したサンプルを調製し、
尿中α−アミラーゼ活性を参考例１で記載した方法によ
り測定した。また、終濃度５ｍＭのイソプロピルチオガ
ラクトシドを添加した試薬でも上記β−ガラクトシダー
ゼを添加した尿サンプル中のα−アミラーゼ活性を測定
し、両者の測定値を比較した。また、非還元末端グルコ
ースがガラクトースで修飾されていないマルトオリゴ糖
誘導体基質を用いたα−アミラーゼ測定法である、体外
診断用医薬品ダイヤカラー・ＡＭＹネオレート（東洋紡
績社製）を対照試薬として用いて同時に尿サンプル中の
α−アミラーゼ活性を測定した。α−アミラーゼ活性
は、キャリブザイムＰ（国際試薬社製）のα−アミラー
ゼ活性表示値をもとに各試薬での測定値を補正して、α
−アミラーゼ活性値とした。結果を表５に示す。
【００４０】
【表５】
【００４１】イソプロピルチオガラクトシドを添加しな
い試薬（比較例）では、α−アミラーゼ活性測定値が、
約７ＩＵ／Ｌ程度高く測定されている。
【００４２】実施例４ カルシウムイオンの効果の検討（その１） 参考例１の試薬に、ＣａＣｌ2 を各種濃度添加し、α−
アミラーゼの活性測定法に対するβ−ガラクトシダーゼ
の影響度を測定した。サンプルとして大腸菌由来β−ガ
ラクトシダーゼ２５ＩＵ／ｍｌを用い、比較例１に記載
した検定方法に基づき検討を実施した。なお、結果を表
６に示す。
【００４３】
【表６】
【００４４】カルシウムイオンの添加濃度を高くするの
に従い、測定値は低くなりα−アミラーゼの活性測定法
に対するβ−ガラクトシダーゼの影響は回避されている
ことが表6 から明らかである。またカルシウムイオン0.
5mM 以下では影響を回避する効果がなく、1mM 以上でβ
−ガラクトシダーゼの影響を回避する効果があることが
わかる。
【００４５】実施例５カ ルシウムイオンの効果の検討（その２） 健常者２名の尿に大腸菌由来β−ガラクトシダーゼを１
０ＩＵ／ｍｌとなるように添加したサンプルを調製し、
尿中α−アミラーゼ活性を参考例１で記載した方法によ
り測定した。また、終濃度５ｍＭのＣａＣｌ2 を添加し
た試薬でも上記β−ガラクトシダーゼを添加した尿サン
プル中のα−アミラーゼ活性を測定し、両者の測定値を
比較した。また、非還元末端グルコースがガラクトース
で修飾されていないマルトオリゴ糖誘導体基質を用いた
α−アミラーゼ測定法である、体外診断用医薬品ダイヤ
カラー・ＡＭＹネオレート（東洋紡績社製）を対照試薬
として用いて同時に尿サンプル中のα−アミラーゼ活性
を測定した。α−アミラーゼ活性は、キャリブザイムＰ
（国際試薬社製）のα−アミラーゼ活性表示値をもとに
各試薬での測定値を補正して、α−アミラーゼ活性値と
した。結果を表７に示す。
【００４６】
【表７】
【００４７】ＣａＣｌ2 を添加しない試薬（比較例）で
は、α−アミラーゼ活性測定値が、約７ＩＵ／Ｌ程度高
く測定されている。
【００４８】参考例１ カルシウムイオンがアミラーゼ活性測定に与える影響 １．試薬組成 ５０ｍＭ グッド緩衝液（ＰＩＰＥＳＵ） ｐＨ７．０ α−グルコシダーゼ ９０Ｕ／ｍｌ β−グルコシダーゼ １２Ｕ／ｍｌ ＮａＣｌ ２０ｍＭ ２−クロロ−４−ニトロフェニル４−Ｏ−β−Ｄ−ガラクトピラノシル−β −マルトテトラオシド ２ｍＭ ２．サンプル ヒト由来α−アミラーゼ １００ＩＵ／ｍｌ ３．検出方法 上記試薬組成にさらにＣａＣｌ2 を下表にように各種濃
度添加したのち、３ｍｌをとり、サンプルを０．２５ｍ
ｌ添加して、３７℃において３分間放置した後、４０５
ｎｍにおける吸光度の変化を測定し、１分間当たりの吸
光度変化量からα−アミラーゼの活性を測定した。その
結果を表８に示す 。
【００４９】
【表８】
【００５０】カルシウムイオンの添加濃度を高くするに
従い、ＣａＣｌ2 ０．８ｍＭ以上では測定値が変わら
ず、α−アミラーゼの活性測定法それ自体へのカルシウ
ムイオンの影響はないことが確認された。
【００５１】
【発明の効果】本発明の非還元末端グルコースをβ−ガ
ラクトースで修飾したβ−ガラクトシルマルトオリゴ糖
を基質として測定するアミラーゼ活性測定法では、β−
ガラクトシダーゼ阻害剤を使用することにより、試料中
のβ−ガラクトシダーゼによるガラクトシルマルトオリ
ゴ糖の分解を阻止し、正確に試料中のα−アミラーゼ活
性測定方法を提供できる。さらに本発明では上記利点を
有するα−アミラーゼ活性測定試薬組成物を提供でき
る。

Claims (10)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 還元末端グルコースの１位の水酸基が色
    原体を結合し、非還元末端グルコースの４位または６位
    の水酸基がβ−ガラクトースで修飾されたβ−ガラクト
    シルマルトオリゴ糖、α−グルコシダーゼおよび／また
    はβ−グルコシダーゼおよびβ−ガラクトシダーゼ阻害
    剤を含む試薬を、試料中のα−アミラーゼに作用させ、
    生成する色原体を測定することを特徴とするα−アミラ
    ーゼ活性測定法。
  2. 【請求項２】 β−ガラクトシルマルトオリゴ糖が、還
    元末端グルコースの１位の水酸基が色原体をα−結合ま
    たはβ−結合したものであることを特徴とする請求項１
    項記載のα−アミラーゼ活性測定法。
  3. 【請求項３】 還元末端グルコースの１位の水酸基が色
    原体をα−結合し、非還元末端グルコースの４位または
    ６位の水酸基がβ−ガラクトースで修飾されたβ−ガラ
    クトシルマルトオリゴ糖が、４−ニトロフェニル ４−
    Ｏ−β−Ｄ−ガラクトピラノシル−α−マルトテトラオ
    シドまたは４−ニトロフェニル ４−Ｏ−β−Ｄ−ガラ
    クトピラノシル−α−マルトペンタオシドであることを
    特徴とする請求項１記載のα−アミラーゼ活性測定法。
  4. 【請求項４】 還元末端グルコースの１位の水酸基が色
    原体をβ−結合し、非還元末端グルコースの４位または
    ６位の水酸基がβ−ガラクトースで修飾されたβ−ガラ
    クトシルマルトオリゴ糖が、２−クロロ−４−ニトロフ
    ェニル ４−Ｏ−β−Ｄ−ガラクトピラノシル−β−マ
    ルトテトラオシドまたは２−クロロ−４−ニトロフェニ
    ル ４−Ｏ−β−Ｄ−ガラクトピラノシル−α−マルト
    ペンタオシドであることを特徴とする請求項１記載のα
    −アミラーゼ活性測定法。
  5. 【請求項５】 β−ガラクトシダーゼ阻害剤が、β−Ｄ
    −チオガラクトシル類、キレート剤、アミン類、１ｍＭ
    以上のカルシウムイオン、ラクトースまたはガラクトス
    タチンであることを特徴とする請求項１項記載のα−ア
    ミラーゼ活性測定法。
  6. 【請求項６】 還元末端グルコースの１位の水酸基が色
    原体を結合し、非還元末端グルコースの４位または６位
    の水酸基がβ−ガラクトースで修飾されたβ−ガラクト
    シルマルトオリゴ糖、α−グルコシダーゼおよび／また
    はβ−グルコシダーゼおよびβ−ガラクトシダーゼ阻害
    剤を含むことを特徴とするα−アミラーゼ活性測定用試
    薬組成物。
  7. 【請求項７】 還元末端グルコースの１位の水酸基が色
    原体をα−結合し、非還元末端グルコースの４位または
    ６位の水酸基がβ−ガラクトースで修飾されたβ−ガラ
    クトシルマルトオリゴ糖、α−グルコシダーゼおよびβ
    −ガラクトシダーゼ阻害剤を含むことを特徴とする請求
    項６記載のα−アミラーゼ活性測定用試薬組成物。
  8. 【請求項８】 還元末端グルコースの１位の水酸基が色
    原体をβ−結合し、非還元末端グルコースの４位または
    ６位の水酸基がβ−ガラクトースで修飾されたβ−ガラ
    クトシルマルトオリゴ糖、β−グルコシダーゼおよびβ
    −ガラクトシダーゼ阻害剤を含むことを特徴とする請求
    項６記載α−のアミラーゼ活性測定用試薬組成物。
  9. 【請求項９】 還元末端グルコースの１位の水酸基が色
    原体をβ−結合し、非還元末端グルコースの４位または
    ６位の水酸基がβ−ガラクトースで修飾されたβ−ガラ
    クトシルマルトオリゴ糖、α−グルコシダーゼ、β−グ
    ルコシダーゼおよびβ−ガラクトシダーゼ阻害剤を含む
    ことを特徴とする請求項６記載のα−アミラーゼ活性測
    定用試薬組成物。
  10. 【請求項１０】 β−ガラクトシダーゼ阻害剤が、β−
    Ｄ−チオガラクトシル類、キレート剤、アミン類、１ｍ
    Ｍ以上のカルシウムイオン、ラクトースまたはガラクト
    スタチンであることを特徴とする請求項６項記載のα−
    アミラーゼ活性測定試薬組成物。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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