JPH0714358B2 - 酵素または基質の測定法 - Google Patents
酵素または基質の測定法Info
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- JPH0714358B2 JPH0714358B2 JP63087923A JP8792388A JPH0714358B2 JP H0714358 B2 JPH0714358 B2 JP H0714358B2 JP 63087923 A JP63087923 A JP 63087923A JP 8792388 A JP8792388 A JP 8792388A JP H0714358 B2 JPH0714358 B2 JP H0714358B2
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Description
【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、脱水素反応に関与する酵素または基質、特に
生体試料中に存在する当該酵素または基質の測定法に関
する。
生体試料中に存在する当該酵素または基質の測定法に関
する。
脱水素反応に関与する酵素または基質、特に臨床検査の
分野で生体試料中に存在する当該酵素または基質を測定
する場合、大きく分けて２つの方法がある。第１の方法
は化学反応を利用する方法であり、第２の方法は酵素反
応を利用する方法である。
分野で生体試料中に存在する当該酵素または基質を測定
する場合、大きく分けて２つの方法がある。第１の方法
は化学反応を利用する方法であり、第２の方法は酵素反
応を利用する方法である。
本発明は、酵素反応を利用する方法に関する測定法であ
るので、以下、これについての説明を行う。
るので、以下、これについての説明を行う。
酵素反応を用いる測定法は、酸化酵素を用いる方法と、
脱水素酵素を用いる方法とに分けることができる。本発
明は、脱水素酵素を利用する方法に関する測定法であ
る。脱水素酵素を利用する方法に関しては、以下の３つ
の方法が知られている。これらはすべて、脱水素酵素反
応によって生成する還元型補酵素、即ち、通常はニコチ
ンアミドアデニンジヌクレオチド還元型（NADH）、ニコ
チンアミドアデニンジヌクレオチドホスフェート還元型
（NADPH）を測定するものである。
脱水素酵素を用いる方法とに分けることができる。本発
明は、脱水素酵素を利用する方法に関する測定法であ
る。脱水素酵素を利用する方法に関しては、以下の３つ
の方法が知られている。これらはすべて、脱水素酵素反
応によって生成する還元型補酵素、即ち、通常はニコチ
ンアミドアデニンジヌクレオチド還元型（NADH）、ニコ
チンアミドアデニンジヌクレオチドホスフェート還元型
（NADPH）を測定するものである。
以下に、補酵素としてニコチンアミドアデニンジヌクレ
オチド（NAD）、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチ
ドホスフェート（NADP）を使用した場合について、その
反応式および測定手段を示す。
オチド（NAD）、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチ
ドホスフェート（NADP）を使用した場合について、その
反応式および測定手段を示す。
１）上記反応で生成したNADH,NADPHを340nmの紫外部吸
光度で測定する。
光度で測定する。
２）上記反応で生成したNADH,NADPHに電子伝達体、ホル
マザンを作用させ、生成するジホルマザン色素を可視部
の吸光度で測定する。
マザンを作用させ、生成するジホルマザン色素を可視部
の吸光度で測定する。
３）上記反応で生成したNADH,NADPHに電子伝達体を酸素
の存在下に作用させ、生成する過酸化水素を測定する。
の存在下に作用させ、生成する過酸化水素を測定する。
ところが、上記１）の方法は、可視部での測定が不能で
あるため、紫外部での測定に限られる。しかも、生体試
料中には、紫外部に吸収を持つ物質が数多く含まれてい
るばかりか、生体試料の濁りも測定に大きく影響するの
で測定の精度に劣るという問題点がある。
あるため、紫外部での測定に限られる。しかも、生体試
料中には、紫外部に吸収を持つ物質が数多く含まれてい
るばかりか、生体試料の濁りも測定に大きく影響するの
で測定の精度に劣るという問題点がある。
２）の方法は、ジホルマザン色素が反応チューブやセル
に吸着し分光光度計や、その他の機器を汚染するという
欠点がある。
に吸着し分光光度計や、その他の機器を汚染するという
欠点がある。
３）の方法は、電子伝達体として用いるPMS（フェナジ
ンメトサルフェイト）が常温において容易に変質し、活
性低下がみられる等の問題点が残されている。
ンメトサルフェイト）が常温において容易に変質し、活
性低下がみられる等の問題点が残されている。
また、上記何れの方法においても、測定系に添加される
NAD、NADPの量が多いので経済的にも劣るきらいがあ
る。
NAD、NADPの量が多いので経済的にも劣るきらいがあ
る。
さらに、測定時間を短縮し、より効率的に当該酵素また
は基質を定量する方法が待望されているのが実情であ
る。
は基質を定量する方法が待望されているのが実情であ
る。
本発明の目的は、上記従来の方法の持つ欠点ないしは問
題点を解消し、脱水素反応に関与する酵素または基質
を、精度よく、機器を汚染することなく、簡単に、しか
も短時間で、かつ経済的に測定する方法を提供すること
である。
題点を解消し、脱水素反応に関与する酵素または基質
を、精度よく、機器を汚染することなく、簡単に、しか
も短時間で、かつ経済的に測定する方法を提供すること
である。
本発明は、脱水素反応に関与する酵素または基質の測定
法において、NADおよび／またはNADPの存在下、基質に
脱水素酵素を作用させることによって生成するNADHおよ
び／またはNADPH型補酵素にピロロキノリンキノンを反
応させ、生成する過酸化水素を定量することを特徴とす
る酵素または基質の測定法である。以下、NAD（Ｐ）はN
ADおよび／またはNADPを意味し、NAD（Ｐ）ＨはNADHお
よび／またはNADPHを意味する。
法において、NADおよび／またはNADPの存在下、基質に
脱水素酵素を作用させることによって生成するNADHおよ
び／またはNADPH型補酵素にピロロキノリンキノンを反
応させ、生成する過酸化水素を定量することを特徴とす
る酵素または基質の測定法である。以下、NAD（Ｐ）はN
ADおよび／またはNADPを意味し、NAD（Ｐ）ＨはNADHお
よび／またはNADPHを意味する。
本発明方法における反応を、補酵素としてNADを、脱水
素酵素としてグルコース−６−リン酸脱水素酵素を使用
した場合を代表例として示せば次の通りである。
素酵素としてグルコース−６−リン酸脱水素酵素を使用
した場合を代表例として示せば次の通りである。
・NADH＋PQQ→NAD+＋PQQH2 ・PQQH2＋O2→PQQ＋H2O2 〔上記式中、Ｇ−６−Ｐはグルコス−６−リン酸を、PQ
Qはピロロキノリンキノンを、PQQH2はピロロキノリンキ
ノン還元体型を表わす〕 本発明において、測定の対象となる脱水素反応に関与す
る酵素および基質に関して、たとえば基質としてはグル
コース、グルコース−６−リン酸、マレイト、３α−ヒ
ドロキシステロイド、乳酸などが、従って酵素としては
グルコース脱水素酵素、グルコース−６−リン酸脱水素
酵素、マレイン脱水素酵素、３α−ヒドロキシステロイ
ド脱水素酵素、乳酸脱水素酵素などが例示され、本発明
においては、特に生体試料中に含まれるこれら基質およ
び酵素が測定の対象となる。
Qはピロロキノリンキノンを、PQQH2はピロロキノリンキ
ノン還元体型を表わす〕 本発明において、測定の対象となる脱水素反応に関与す
る酵素および基質に関して、たとえば基質としてはグル
コース、グルコース−６−リン酸、マレイト、３α−ヒ
ドロキシステロイド、乳酸などが、従って酵素としては
グルコース脱水素酵素、グルコース−６−リン酸脱水素
酵素、マレイン脱水素酵素、３α−ヒドロキシステロイ
ド脱水素酵素、乳酸脱水素酵素などが例示され、本発明
においては、特に生体試料中に含まれるこれら基質およ
び酵素が測定の対象となる。
本発明の方法において、NAD（Ｐ）Ｈを生成させるまで
の工程、即ち脱水素反応に関与する酵素または基質にNA
D（Ｐ）の存在下に脱水素酵素を作用させる工程は自体
既知の手段によって行うことで足りる。
の工程、即ち脱水素反応に関与する酵素または基質にNA
D（Ｐ）の存在下に脱水素酵素を作用させる工程は自体
既知の手段によって行うことで足りる。
次いでかくして生成したNAD（Ｐ）Ｈをピロロキノリン
キノンと反応させて過酸化水素を発生させ、当該過酸化
水素を定量する。
キノンと反応させて過酸化水素を発生させ、当該過酸化
水素を定量する。
ピロロキノリンキノンは近年発見された脱水素酵素の補
酵素であり、化学名を4,5−ジヒドロ−4,5−ジオキシ−
1H−ピロロ〔2,3−ｆ〕キノリン−2,7,9−トリカルボン
酸といい、細菌の細胞膜、ミトコンドリア等に存在する
ことが知られている。本発明で使用されるピロロキノリ
ンキノンはその由来を特に限定されるものではなく、た
とえば細菌のメチロトローフ（methylotroph）やアセト
バクター（Acetobacter）のもの、あるいは合成による
ものが使用される。
酵素であり、化学名を4,5−ジヒドロ−4,5−ジオキシ−
1H−ピロロ〔2,3−ｆ〕キノリン−2,7,9−トリカルボン
酸といい、細菌の細胞膜、ミトコンドリア等に存在する
ことが知られている。本発明で使用されるピロロキノリ
ンキノンはその由来を特に限定されるものではなく、た
とえば細菌のメチロトローフ（methylotroph）やアセト
バクター（Acetobacter）のもの、あるいは合成による
ものが使用される。
本発明のNAD（Ｐ）Ｈとピロロキノリンキノンとの反応
は、通常適当な緩衝液中（たとえば、トリス−塩酸緩衝
液、リン酸緩衝液）で行われる。反応液のpHは、通常４
〜10好ましくは５〜８の範囲である。反応温度も特に制
限されないが、通常20〜40℃の範囲である。
は、通常適当な緩衝液中（たとえば、トリス−塩酸緩衝
液、リン酸緩衝液）で行われる。反応液のpHは、通常４
〜10好ましくは５〜８の範囲である。反応温度も特に制
限されないが、通常20〜40℃の範囲である。
本発明方法に用いられるピロロキノリンキノン濃度は特
に制限されず、反応条件や測定時間によって適宜設定さ
れ、通常１分〜20分であり、特に３分〜８分であること
が好ましい。
に制限されず、反応条件や測定時間によって適宜設定さ
れ、通常１分〜20分であり、特に３分〜８分であること
が好ましい。
本発明方法に用いるNAD（Ｐ）の量は、通常0.01mM〜200
0mM程度、好ましくは0.2mM〜20mM程度であるが、従来法
における使用量の20％程度でも充分本発明の目的が達成
される。これは、後述するように、本発明においてはNA
Dがサイクリックに利用できることに起因する。
0mM程度、好ましくは0.2mM〜20mM程度であるが、従来法
における使用量の20％程度でも充分本発明の目的が達成
される。これは、後述するように、本発明においてはNA
Dがサイクリックに利用できることに起因する。
本発明方法において生成する過酸化水素を測定する方法
は本発明の目的を達成しうる限りいかなる方法でもよい
が、過酸化水素電極を用いる電極法、ペルオキシダーゼ
の存在下に４−アミノアンチピリンおよび色原体を反応
させてキノンイミン色素を生成させる酸化発色法、カタ
ラーゼを用いるカタラーゼ発色法などの常法を使用すれ
ば充分である。
は本発明の目的を達成しうる限りいかなる方法でもよい
が、過酸化水素電極を用いる電極法、ペルオキシダーゼ
の存在下に４−アミノアンチピリンおよび色原体を反応
させてキノンイミン色素を生成させる酸化発色法、カタ
ラーゼを用いるカタラーゼ発色法などの常法を使用すれ
ば充分である。
本発明においては、ピロロキノリンキノン１分子が非酵
素的にNADHまたはNADPH1分子と反応して過酸化水素１分
子を生成する。
素的にNADHまたはNADPH1分子と反応して過酸化水素１分
子を生成する。
その際ピロロキノリンキノンとNAD（Ｐ）との反応は不
可逆的であるから、脱水素酵素反応自体の見かけの反応
速度が速くなり、従って本発明における測定に要する反
応時間が短縮されることになる。
可逆的であるから、脱水素酵素反応自体の見かけの反応
速度が速くなり、従って本発明における測定に要する反
応時間が短縮されることになる。
また、本発明の測定法においては、NAD（Ｐ）がサイク
リックに利用できるので、従来法に比べてNAD（Ｐ）の
添加量を下げることができるものである。
リックに利用できるので、従来法に比べてNAD（Ｐ）の
添加量を下げることができるものである。
よって、本発明方法によれば、脱水素酵素または基質を
測定するに際して、従来の方法の持つ欠点ないし問題点
が解消され、機器を汚染することなく、簡単に、しかも
短時間で、かつ経済的に当該測定を実施することができ
るという効果を有するものである。
測定するに際して、従来の方法の持つ欠点ないし問題点
が解消され、機器を汚染することなく、簡単に、しかも
短時間で、かつ経済的に当該測定を実施することができ
るという効果を有するものである。
以下に本発明を実施例を用いて、より具体的に説明す
る。
る。
実施例１〔NAD（Ｐ）Ｈの定量〕 試薬混液１ ピロロキノリンキノン（2mM） 0.2ml Tris−HCl緩衝液pH7.5（20mM） 1.3ml 1.5ml 試薬混液２ ４−アミノアンチピリン（10mM） 0.1ml TOOS（Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホ
プロピル）−ｍ−トルイジン）（10mM） 0.1ml ペルオキシダーゼ（100U/ml） 0.1ml Tris−HCl緩衝液pH7.5（20mM） 0.2ml 0.5ml 試薬混液１を25℃でプレインキュベートし、５分後にNA
D（Ｐ）Ｈ（0.1〜2.0mM各濃度）を添加し、25℃で正確
に10分間反応させる。10分後試薬混液２を加え、３分後
の550nmの吸光度を測定した。その結果は第１図に示し
た通りである。
プロピル）−ｍ−トルイジン）（10mM） 0.1ml ペルオキシダーゼ（100U/ml） 0.1ml Tris−HCl緩衝液pH7.5（20mM） 0.2ml 0.5ml 試薬混液１を25℃でプレインキュベートし、５分後にNA
D（Ｐ）Ｈ（0.1〜2.0mM各濃度）を添加し、25℃で正確
に10分間反応させる。10分後試薬混液２を加え、３分後
の550nmの吸光度を測定した。その結果は第１図に示し
た通りである。
第１図に示した結果から、NAD（Ｐ）Ｈの濃度に応じて5
50nmの吸光度の上昇が起こり、2.0mM濃度まで直線的で
あることがわかる。このことから、本発明の方法によっ
てNAD（Ｐ）Ｈの定量ができることがわかる。
50nmの吸光度の上昇が起こり、2.0mM濃度まで直線的で
あることがわかる。このことから、本発明の方法によっ
てNAD（Ｐ）Ｈの定量ができることがわかる。
実施例２〔グルコース−６−リン酸の定量〕 試薬混液１ グルコース−６−リン酸脱水素酵素（1000U/ml） 0.1ml ピロロキノリンキノン（2mM） 0.1ml Tris−HCl緩衝液pH7.5（20mM） 0.7ml NAD+（2mM） 0.1ml 1.0ml 試薬混液２ ４−アミノアンチピリン（10mM） 1.0ml TOOS（10mM） 1.0ml ペルオキシダーゼ（100mM） 1.0ml Tris−HCl緩衝液pH7.5（20mM） 1.0ml 4.0ml 上記試薬混液１を25℃でプレインキュベートし、５分後
にグルコース−６−リン酸（10〜100mg/dl各濃度）0.2m
lを添加し、25℃で正確に15分間反応させる。その後、
試薬混液２を0.8ml添加し、３分後に550nmの吸光度を測
定した。その結果は第２図に示した通りである。
にグルコース−６−リン酸（10〜100mg/dl各濃度）0.2m
lを添加し、25℃で正確に15分間反応させる。その後、
試薬混液２を0.8ml添加し、３分後に550nmの吸光度を測
定した。その結果は第２図に示した通りである。
第２図に示した結果から、グルコース−６−リン酸の濃
度に応じて、550nmの吸光度が直線的に上昇した。これ
より、本発明方法によってグルコース６リン酸の濃度を
定量することができることがわかる。
度に応じて、550nmの吸光度が直線的に上昇した。これ
より、本発明方法によってグルコース６リン酸の濃度を
定量することができることがわかる。
実施例３〔グルコース−６−リン酸脱水素酵素の定量〕 試薬混液１ グルコース−６−リン酸（1M） 0.1ml PQQ（2mM） 0.1ml Tris−HCl緩衝液pH7.5（20mM） 0.7ml NAD+（2mM） 0.1ml 1.0ml 試薬混液２ ４−アミノアンチピリン（10mM） 1.0ml TOOS（10mM） 1.0ml ペルオキシダーゼ（100mM） 1.0ml Tris−HCl緩衝液pH7.5（20mM） 1.0ml 4.0ml 上記試薬混液１を25℃でプレインキュベートし、５分後
にグルコース−６−リン酸脱水素酵素（１〜20U/ml各濃
度）0.2mlを添加し、25℃で正確に15分間反応させる。1
5分後、２％SDS（ソディウムドデシルサルフェイト）溶
液で反応を停止させ、試薬混液２を0.8ml添加して、３
分後に550nmの吸光度を測定した。その結果は第３図に
示した通りである。
にグルコース−６−リン酸脱水素酵素（１〜20U/ml各濃
度）0.2mlを添加し、25℃で正確に15分間反応させる。1
5分後、２％SDS（ソディウムドデシルサルフェイト）溶
液で反応を停止させ、試薬混液２を0.8ml添加して、３
分後に550nmの吸光度を測定した。その結果は第３図に
示した通りである。
第３図に示した結果から、１分間当たりの吸光度変化量
（Δ550nm/分）は、グルコース−６−リン酸脱水素酵素
の濃度に応じて、直線的に増加していることがわかる。
このことから、本発明の方法によってグルコース−６−
リン酸脱水素酵素が定量できることがわかる。
（Δ550nm/分）は、グルコース−６−リン酸脱水素酵素
の濃度に応じて、直線的に増加していることがわかる。
このことから、本発明の方法によってグルコース−６−
リン酸脱水素酵素が定量できることがわかる。
第１〜３図は本発明の方法による測定法による測定結果
を示したグラフである。
を示したグラフである。
Claims (1)
- 【請求項１】脱水素反応に関与する酵素または基質の測
定法において、NADおよび／またはNADPの存在下、基質
に脱水素酵素を作用させることによって生成するNADHお
よび／またはNADPHにピロロキノリンキノンを反応さ
せ、生成する過酸化水素を定量することを特徴とする酵
素または基質の測定法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP63087923A JPH0714358B2 (ja) | 1988-04-08 | 1988-04-08 | 酵素または基質の測定法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP63087923A JPH0714358B2 (ja) | 1988-04-08 | 1988-04-08 | 酵素または基質の測定法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH01257500A JPH01257500A (ja) | 1989-10-13 |
| JPH0714358B2 true JPH0714358B2 (ja) | 1995-02-22 |
Family
ID=13928441
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP63087923A Expired - Lifetime JPH0714358B2 (ja) | 1988-04-08 | 1988-04-08 | 酵素または基質の測定法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH0714358B2 (ja) |
-
1988
- 1988-04-08 JP JP63087923A patent/JPH0714358B2/ja not_active Expired - Lifetime
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| ＢｉｏｃｈｉｍＢｉｏｐｈｙｓＡｃｔａ，９６４（２），Ｐ．１７５−１８２，１９８８ |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH01257500A (ja) | 1989-10-13 |
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