JPH07184643A - 遺伝子操作により改変されたボルデテラ（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ）菌株 - Google Patents
遺伝子操作により改変されたボルデテラ（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ）菌株Info
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- JPH07184643A JPH07184643A JP6335163A JP33516394A JPH07184643A JP H07184643 A JPH07184643 A JP H07184643A JP 6335163 A JP6335163 A JP 6335163A JP 33516394 A JP33516394 A JP 33516394A JP H07184643 A JPH07184643 A JP H07184643A
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Abstract
(57)【要約】
【目的】 百日咳用ワクチンの成分として利用される抗
原生産に有用な遺伝操作により改変された菌株を提供す
る。 【構成】 百日咳菌から遺伝子操作によってＦＨＡを欠
失させ、さらに菌無毒化された変異ＴＯＸ遺伝子（ＴＯ
Ｘ *）を導入するか、あるいは百日咳菌におけるＰＲＮ
遺伝子のプロモータ部分をＦＨＡのプロモーターで置換
した融合遺伝子を百日咳菌に導入する。
原生産に有用な遺伝操作により改変された菌株を提供す
る。 【構成】 百日咳菌から遺伝子操作によってＦＨＡを欠
失させ、さらに菌無毒化された変異ＴＯＸ遺伝子（ＴＯ
Ｘ *）を導入するか、あるいは百日咳菌におけるＰＲＮ
遺伝子のプロモータ部分をＦＨＡのプロモーターで置換
した融合遺伝子を百日咳菌に導入する。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、遺伝子操作により改変
されたボルデテラ属菌株に関する。
されたボルデテラ属菌株に関する。
【０００２】
【従来の技術】ヒト百日咳は、ボルデテラ属の菌、特に
ボルデテラ・ペルツシスによって起こる。この細菌に感
染したり、ワクチン接種をすると、細菌が生産する数種
のタンパク、特にペルツシス毒素（ＰＴ）、フィラメン
ト状ヘマグルチニン（ＦＨＡ）、６９ｋＤａ外膜タンパ
ク（６９ｋＤまたはパ−タクチン）および房状縁アグル
チノ−ゲンに対する抗体が形成される。ＰＴは主要な防
御抗原であるとともに、毒素でもある。これらの抗原を
用い、単一成分または複合成分を含むペルツシスワクチ
ンの製剤化が報告されている。そのためには、効率的な
生産および精製がきわめて重要な要素である。
ボルデテラ・ペルツシスによって起こる。この細菌に感
染したり、ワクチン接種をすると、細菌が生産する数種
のタンパク、特にペルツシス毒素（ＰＴ）、フィラメン
ト状ヘマグルチニン（ＦＨＡ）、６９ｋＤａ外膜タンパ
ク（６９ｋＤまたはパ−タクチン）および房状縁アグル
チノ−ゲンに対する抗体が形成される。ＰＴは主要な防
御抗原であるとともに、毒素でもある。これらの抗原を
用い、単一成分または複合成分を含むペルツシスワクチ
ンの製剤化が報告されている。そのためには、効率的な
生産および精製がきわめて重要な要素である。
【０００３】
【発明が解決しようとしている課題】ボルデテラ・ペル
ツシスを用いた醗酵の過程で、６９ｋＤまたはＰＴに比
較してそれぞれ７倍および１０倍も高いＦＨＡが生産さ
れることが認められている。
ツシスを用いた醗酵の過程で、６９ｋＤまたはＰＴに比
較してそれぞれ７倍および１０倍も高いＦＨＡが生産さ
れることが認められている。
【０００４】したがって、ワクチン成分の生産という点
では、ＰＴおよびパ−タクチンは量的に制限された抗原
である。さらに、ＦＨＡの生産量が比較的過剰であるた
め、低レベルで生産されるその他の抗原の精製が困難で
ある。特にＰＴの場合、精製法によってはＦＨＡの精製
時にある程度精製されるが、それ以上の精製は困難であ
る。また、活性なＰＴがＦＨＡ調製物中に混在する恐れ
があるので、これらの元から存在する少量の毒素を化学
的に無毒化する必要がある。
では、ＰＴおよびパ−タクチンは量的に制限された抗原
である。さらに、ＦＨＡの生産量が比較的過剰であるた
め、低レベルで生産されるその他の抗原の精製が困難で
ある。特にＰＴの場合、精製法によってはＦＨＡの精製
時にある程度精製されるが、それ以上の精製は困難であ
る。また、活性なＰＴがＦＨＡ調製物中に混在する恐れ
があるので、これらの元から存在する少量の毒素を化学
的に無毒化する必要がある。
【０００５】遺伝学的に無毒化したペルツシス毒素（ヨ
−ロッパ特許出願番号０３２２１１５およびその米国特
許番号５，０８５，８６２；出願人：本出願人と同一；
参照文献：Ｌｏｏｓｍｏｒｅら、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍ
ｕｎ．，５８，３６５３［１９９０］）の場合、このよ
うな問題はない。いずれの場合にも、ＦＨＡを生産しな
いボルデテラ・ペルツシス菌株またはＰＴを生産しない
菌株またはその両者があれば、ワクチン生産の観点から
きわめて有利である。例えば、その他のいずれの抗原
も、ＦＨＡ遺伝子欠失菌株ＦＨＡ- を用い、最適醗酵、
精製条件下で生産することができる。同様に、ＰＴ- 菌
株を使用することにより、ペルツシス毒素が混在しない
ＦＨＡを製造することができる。
−ロッパ特許出願番号０３２２１１５およびその米国特
許番号５，０８５，８６２；出願人：本出願人と同一；
参照文献：Ｌｏｏｓｍｏｒｅら、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍ
ｕｎ．，５８，３６５３［１９９０］）の場合、このよ
うな問題はない。いずれの場合にも、ＦＨＡを生産しな
いボルデテラ・ペルツシス菌株またはＰＴを生産しない
菌株またはその両者があれば、ワクチン生産の観点から
きわめて有利である。例えば、その他のいずれの抗原
も、ＦＨＡ遺伝子欠失菌株ＦＨＡ- を用い、最適醗酵、
精製条件下で生産することができる。同様に、ＰＴ- 菌
株を使用することにより、ペルツシス毒素が混在しない
ＦＨＡを製造することができる。
【０００６】ボルデテラ・ペルツシスの遺伝子より生産
される物質の中には、百日咳用ワクチンには必要ないも
の、例えば皮膚壊死毒素（ＤＮＴ）ならびに多分アデニ
レ−ト シクラ−ゼ毒素も含まれている。このような物
質をコ−ドした遺伝子座は、菌株が生存し、その他の抗
原も満足できる量を生産している限り、ワクチン生産菌
株には必要ないものと考えられる。このような不要な遺
伝子を除去するためには、除去遺伝子座にｉｎ ｓｉｔ
ｕで遺伝子を挿入することにより、さらに遺伝子操作を
行う必要がある。例えば、アデニレ−ト シクラ−ゼ遺
伝子（ＣＹＡ）を除去し、さらにワクチンとして使用し
たい抗原遺伝子のうち１個の遺伝子の１個以上のコピー
をＣＹＡ遺伝子座に挿入することができる。この遺伝子
は、除去遺伝子のｉｎ ｓｉｔｕにおける直接遺伝子挿
入へのフランキングシーケンスを用いた同種組換えによ
り導入することができる。別の方法としては、縦列挿入
または複製プラスミッドの導入により、遺伝子のコピー
を染色体に導入することができる。抗原の発現を改良す
るために、ｖｉｒレギュロンＢｖｑ等の調節遺伝子の複
数のコピーも導入することができる。
される物質の中には、百日咳用ワクチンには必要ないも
の、例えば皮膚壊死毒素（ＤＮＴ）ならびに多分アデニ
レ−ト シクラ−ゼ毒素も含まれている。このような物
質をコ−ドした遺伝子座は、菌株が生存し、その他の抗
原も満足できる量を生産している限り、ワクチン生産菌
株には必要ないものと考えられる。このような不要な遺
伝子を除去するためには、除去遺伝子座にｉｎ ｓｉｔ
ｕで遺伝子を挿入することにより、さらに遺伝子操作を
行う必要がある。例えば、アデニレ−ト シクラ−ゼ遺
伝子（ＣＹＡ）を除去し、さらにワクチンとして使用し
たい抗原遺伝子のうち１個の遺伝子の１個以上のコピー
をＣＹＡ遺伝子座に挿入することができる。この遺伝子
は、除去遺伝子のｉｎ ｓｉｔｕにおける直接遺伝子挿
入へのフランキングシーケンスを用いた同種組換えによ
り導入することができる。別の方法としては、縦列挿入
または複製プラスミッドの導入により、遺伝子のコピー
を染色体に導入することができる。抗原の発現を改良す
るために、ｖｉｒレギュロンＢｖｑ等の調節遺伝子の複
数のコピーも導入することができる。
【０００７】欠失菌株の例として、ＴＯＸ -、ＦＨＡ -、
ＰＲＮ -、ＣＹＡ -、ＤＮＴ -またはこれらの遺伝子欠失
の組合せまたは別の遺伝子欠失との組合せが考えられ
る。挿入遺伝子としては、ＴＯＸ、ＦＨＡ、ＰＲＮのい
ずれか、またはその他の在来遺伝子、突然変異遺伝子ま
たはハイブリッド遺伝子を挙げることができ、１個以上
のコピーを縦列または別々に挿入することができる。別
の遺伝子の除去に関係なく、このように遺伝子コピー数
の増加を目的とした遺伝子操作を行うことにより、ボル
デテラの抗原生産性を著しく増進し、抗原精製の最適化
が可能となる。
ＰＲＮ -、ＣＹＡ -、ＤＮＴ -またはこれらの遺伝子欠失
の組合せまたは別の遺伝子欠失との組合せが考えられ
る。挿入遺伝子としては、ＴＯＸ、ＦＨＡ、ＰＲＮのい
ずれか、またはその他の在来遺伝子、突然変異遺伝子ま
たはハイブリッド遺伝子を挙げることができ、１個以上
のコピーを縦列または別々に挿入することができる。別
の遺伝子の除去に関係なく、このように遺伝子コピー数
の増加を目的とした遺伝子操作を行うことにより、ボル
デテラの抗原生産性を著しく増進し、抗原精製の最適化
が可能となる。
【０００８】Ｌｅｅら（１９８９，ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍ
ｍｕｎ．，５７：１４１３−１４１８）は、複数のコピ
ーを行う複製プラスミッドからのＴＯＸオペロンを発現
させることにより、ボルデテラ・ペルツシスの高毒素生
産性菌株を作ることを試みている。しかし、ＰＴ生産性
の増加は認められず、プラスミッドは再配列され、ＴＯ
Ｘオペロンは欠失し、トランス配列体は無毒性に変換さ
れた。
ｍｕｎ．，５７：１４１３−１４１８）は、複数のコピ
ーを行う複製プラスミッドからのＴＯＸオペロンを発現
させることにより、ボルデテラ・ペルツシスの高毒素生
産性菌株を作ることを試みている。しかし、ＰＴ生産性
の増加は認められず、プラスミッドは再配列され、ＴＯ
Ｘオペロンは欠失し、トランス配列体は無毒性に変換さ
れた。
【０００９】
【課題を解決するための手段】本発明によって、遺伝操
作により改変された百日咳用ワクチンの成分として利用
される抗原生産に有用な新規な菌株が提供される。この
菌株には、無毒化された変異ＴＯＸ遺伝子（ＴＯＸ *）
を含み、ＦＨＡが欠失した菌株、及びＦＨＡのプロモー
ターにＰＲＮを融合させたハイブリッド遺伝子を有する
菌株が含まれる。百日咳用ワクチンの成分として利用さ
れる抗原生産に有用な新規な菌株が提供される。これら
の菌株の代表例としては、ボルデテラ・ペルツシス（Bo
rdetellapertusis）４９０−３２４株及び５９１−４７
３株がある。
作により改変された百日咳用ワクチンの成分として利用
される抗原生産に有用な新規な菌株が提供される。この
菌株には、無毒化された変異ＴＯＸ遺伝子（ＴＯＸ *）
を含み、ＦＨＡが欠失した菌株、及びＦＨＡのプロモー
ターにＰＲＮを融合させたハイブリッド遺伝子を有する
菌株が含まれる。百日咳用ワクチンの成分として利用さ
れる抗原生産に有用な新規な菌株が提供される。これら
の菌株の代表例としては、ボルデテラ・ペルツシス（Bo
rdetellapertusis）４９０−３２４株及び５９１−４７
３株がある。
【００１０】ＰＴ（ＴＯＸ）、ＦＨＡ（ＦＨＡ）、パー
タクチン（ＰＲＮ）およびアデニレート シクラーゼ
（ＣＹＡ）の遺伝子をクーロン化し、配列した（Ｎｉｃ
ｏｓｉａら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．
Ｕ．Ｓ．Ａ．，８３，４６３１［１９８６］；Ｌｏｏｓ
ｍｏｒｅら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１７，
８３６５［１９８９］；Ｒｅｌｍａｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎ
ａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，８６，２６
３７［１９８９］；Ｃｈａｒｌｅｓら、Ｐｒｏｃ．Ｎａ
ｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，８６,３５５
４［１９８９］；Ｇｌａｓｅｒら、Ｍｏｌｅｃ．Ｍｉｃ
ｒｏｂｉｏｌ．２，１９［１９８８］）。ペルツシス毒
素は６個のポリペプチドからなる複合タンパクであり、
単一なプロモーターから発現される５種類の構造遺伝子
によりコード化されている。その酵素的およびそのほと
んどの毒性はそのサブユニットＳ１により調節され、そ
の細胞結合性および分裂特性はＢ−サブユニットを形成
する別のサブユニットによる。Ｓ１またはＢサブユニッ
ト遺伝子上の特定の遺伝暗号の部位特異的突然変異によ
り、完全毒素が無毒化される（ヨーロッパ特許３２２１
１５、米国特許５，０８５，８６２およびＬｏｏｓｍｏ
ｒｅら、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．５８，３６５３
［１９９０］）。
タクチン（ＰＲＮ）およびアデニレート シクラーゼ
（ＣＹＡ）の遺伝子をクーロン化し、配列した（Ｎｉｃ
ｏｓｉａら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．
Ｕ．Ｓ．Ａ．，８３，４６３１［１９８６］；Ｌｏｏｓ
ｍｏｒｅら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１７，
８３６５［１９８９］；Ｒｅｌｍａｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎ
ａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，８６，２６
３７［１９８９］；Ｃｈａｒｌｅｓら、Ｐｒｏｃ．Ｎａ
ｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，８６,３５５
４［１９８９］；Ｇｌａｓｅｒら、Ｍｏｌｅｃ．Ｍｉｃ
ｒｏｂｉｏｌ．２，１９［１９８８］）。ペルツシス毒
素は６個のポリペプチドからなる複合タンパクであり、
単一なプロモーターから発現される５種類の構造遺伝子
によりコード化されている。その酵素的およびそのほと
んどの毒性はそのサブユニットＳ１により調節され、そ
の細胞結合性および分裂特性はＢ−サブユニットを形成
する別のサブユニットによる。Ｓ１またはＢサブユニッ
ト遺伝子上の特定の遺伝暗号の部位特異的突然変異によ
り、完全毒素が無毒化される（ヨーロッパ特許３２２１
１５、米国特許５，０８５，８６２およびＬｏｏｓｍｏ
ｒｅら、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．５８，３６５３
［１９９０］）。
【００１１】同種異形組替えを行ったのち、エレクトロ
ポーレーションでボルデテラ・ペルツシスに形質転換を
行うことにより、ＴＯＸオペロンを除去する方法がヨー
ロッパ特許３２２，１１５および米国特許５，０８５，
８６２で公開されている。端的にいうと、Ｓ１２／Ｔｅ
ｔR遺伝子カセットを用いてボルデテラ・ペルツシス菌
のストレプトマイシン耐性株の遺伝子を除去すると、ス
トレプトマイシン感受性で、テトラサイクリン耐性の表
現型が得られる。さらに一連の組替えを行って選択可能
カートリッジを置き換えることにより、ストレプトマイ
シン耐性となる。このような手順により、抗生物質耐性
遺伝子の集積をみることなく、ボルデテラ・ペルツシス
における特定遺伝子を置換することが可能である。Ｓ１
２／ＴｅｔR遺伝子カセットは、ＴＯＸ５’-フランキン
グ部位の２．９ｋｂ Ｓａｕ３ＡＩ／ＥｃｏＲＩフラグ
メントおよびＴＯＸ３’-フランキング部位の５ｋｂ
ＥｃｏＲＩ／ＳａｌＩフラグメントを用いた対立遺伝子
交換により、ＴＯＸ遺伝子座に導入することができる。
ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて突然変異を起こした対立遺伝
子による遺伝子カセットの置換については、すでに報告
されている（ヨーロッパ特許３２２，１１５、米国特許
５，０８５，８６２；Ｐｉｚｚａら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，
２４６，４９７［１９８９］; Ｚｅａｌｅｙら、Ｂｉｏ
／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，８，１０２５［１９９
０］）。ＦＨＡおよびＰＮＲ遺伝子の除去も同様な手順
を用いて行われている。ここでも、これらの手順を用い
て、元の、または新規の遺伝子座にコピー遺伝子を有す
るボルデテラ・ペルツシス菌株を遺伝子工学的に創製し
た（表１（Ａ）および（Ｂ））。これらの実験はコノー
ト バイオセーフティ委員会により承認され、レベル２
または３の封じ込め施設で行った。
ポーレーションでボルデテラ・ペルツシスに形質転換を
行うことにより、ＴＯＸオペロンを除去する方法がヨー
ロッパ特許３２２，１１５および米国特許５，０８５，
８６２で公開されている。端的にいうと、Ｓ１２／Ｔｅ
ｔR遺伝子カセットを用いてボルデテラ・ペルツシス菌
のストレプトマイシン耐性株の遺伝子を除去すると、ス
トレプトマイシン感受性で、テトラサイクリン耐性の表
現型が得られる。さらに一連の組替えを行って選択可能
カートリッジを置き換えることにより、ストレプトマイ
シン耐性となる。このような手順により、抗生物質耐性
遺伝子の集積をみることなく、ボルデテラ・ペルツシス
における特定遺伝子を置換することが可能である。Ｓ１
２／ＴｅｔR遺伝子カセットは、ＴＯＸ５’-フランキン
グ部位の２．９ｋｂ Ｓａｕ３ＡＩ／ＥｃｏＲＩフラグ
メントおよびＴＯＸ３’-フランキング部位の５ｋｂ
ＥｃｏＲＩ／ＳａｌＩフラグメントを用いた対立遺伝子
交換により、ＴＯＸ遺伝子座に導入することができる。
ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて突然変異を起こした対立遺伝
子による遺伝子カセットの置換については、すでに報告
されている（ヨーロッパ特許３２２，１１５、米国特許
５，０８５，８６２；Ｐｉｚｚａら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，
２４６，４９７［１９８９］; Ｚｅａｌｅｙら、Ｂｉｏ
／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，８，１０２５［１９９
０］）。ＦＨＡおよびＰＮＲ遺伝子の除去も同様な手順
を用いて行われている。ここでも、これらの手順を用い
て、元の、または新規の遺伝子座にコピー遺伝子を有す
るボルデテラ・ペルツシス菌株を遺伝子工学的に創製し
た（表１（Ａ）および（Ｂ））。これらの実験はコノー
ト バイオセーフティ委員会により承認され、レベル２
または３の封じ込め施設で行った。
【００１２】ボルデテラ・ペルツシス２９−８株（ＡＴ
ＣＣ登録番号５３９７３）は、コノートのワクチン菌株
１０５３６に由来する菌株であり、ＴＯＸオペロンを欠
失し、大腸菌Ｓ１２遺伝子およびテトラサイクリン耐性
遺伝子を含むカッセトで置換された菌株である（Ｚｅａ
ｌｅｙら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，８，１０２
５［１９９０］；ヨーロッパ特許３２２，１１５，米国
特許５，０８５，８６２）。同種異形遺伝子組替えによ
り、Ｓ１２／ＴｅｔR遺伝子カッセトをＴＯＸ遺伝子の
縦列コピーで置換し、野生型に比較してＰＴ生産能が約
２〜３倍高い菌株（１１９０−７４）を創製する。同様
に、Ｓ１サブユニットにＡｒｇ９→Ｌｙｓ９およびＧｌ
ｙ１２９→Ｇｌｕ１２９突然変異を有する遺伝学的に無
毒化したＰＴ類縁体（ＰＴアナログ）を遺伝子工学的に
創製するように突然変異を起させた縦列ＴＯＸ *オペロ
ンを２９−８株に導入し（Ｌｏｏｓｍｏｒｅら、Ｉｎｆ
ｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．，５８，３６５３［１９９
０］）、１９１−１３４株を創製した（ＡＴＣＣ登録番
号５５２０５）。
ＣＣ登録番号５３９７３）は、コノートのワクチン菌株
１０５３６に由来する菌株であり、ＴＯＸオペロンを欠
失し、大腸菌Ｓ１２遺伝子およびテトラサイクリン耐性
遺伝子を含むカッセトで置換された菌株である（Ｚｅａ
ｌｅｙら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，８，１０２
５［１９９０］；ヨーロッパ特許３２２，１１５，米国
特許５，０８５，８６２）。同種異形遺伝子組替えによ
り、Ｓ１２／ＴｅｔR遺伝子カッセトをＴＯＸ遺伝子の
縦列コピーで置換し、野生型に比較してＰＴ生産能が約
２〜３倍高い菌株（１１９０−７４）を創製する。同様
に、Ｓ１サブユニットにＡｒｇ９→Ｌｙｓ９およびＧｌ
ｙ１２９→Ｇｌｕ１２９突然変異を有する遺伝学的に無
毒化したＰＴ類縁体（ＰＴアナログ）を遺伝子工学的に
創製するように突然変異を起させた縦列ＴＯＸ *オペロ
ンを２９−８株に導入し（Ｌｏｏｓｍｏｒｅら、Ｉｎｆ
ｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．，５８，３６５３［１９９
０］）、１９１−１３４株を創製した（ＡＴＣＣ登録番
号５５２０５）。
【００１３】３９０−１０１株（ＡＴＣＣ登録番号５５
１５７）は、コノートのワクチン菌株１０５３６に由来
する菌株であり、ＦＨＡ遺伝子座がＳ１２／ＴｅｔR遺
伝子カッセトで置換された菌株である。この菌株のＦＨ
Ａ遺伝子座に別のＴＯＸオペロンを挿入し、ＰＴ生産能
が１０５３６株よりも約２倍高く、ＦＨＡを全く生産し
ない５９０−２０８株が創製されている。
１５７）は、コノートのワクチン菌株１０５３６に由来
する菌株であり、ＦＨＡ遺伝子座がＳ１２／ＴｅｔR遺
伝子カッセトで置換された菌株である。この菌株のＦＨ
Ａ遺伝子座に別のＴＯＸオペロンを挿入し、ＰＴ生産能
が１０５３６株よりも約２倍高く、ＦＨＡを全く生産し
ない５９０−２０８株が創製されている。
【００１４】９８９−５６株（ＡＴＣＣ登録番号５３９
７５）は、１０５３６株に由来する菌株であり、Ｓ１サ
ブユニットにＬｙｓ９Ｇｌｙ１２９突然変異を有するＰ
Ｔ類縁体を発現する（米国特許出願番号５８９，４２
３、出願日：１９９０年９月１８日）。そのＦＨＡ遺伝
子をＳ１２／ＴｅｔR遺伝子カッセトで置換することに
より、ＴＯＸ*／ＦＨＡ菌株４９０−３２４が得られ
る。さらに２個の縦列ＴＯＸ *オペロンをＦＨＡ遺伝子
座に導入することにより３個のＴＯＸ *遺伝子コピーを
有する８９０−３９３株（ＡＴＣＣ登録番号５５２０
６）を創製することができ、この菌株は約３倍も高いＰ
Ｔ類縁体を発現する。
７５）は、１０５３６株に由来する菌株であり、Ｓ１サ
ブユニットにＬｙｓ９Ｇｌｙ１２９突然変異を有するＰ
Ｔ類縁体を発現する（米国特許出願番号５８９，４２
３、出願日：１９９０年９月１８日）。そのＦＨＡ遺伝
子をＳ１２／ＴｅｔR遺伝子カッセトで置換することに
より、ＴＯＸ*／ＦＨＡ菌株４９０−３２４が得られ
る。さらに２個の縦列ＴＯＸ *オペロンをＦＨＡ遺伝子
座に導入することにより３個のＴＯＸ *遺伝子コピーを
有する８９０−３９３株（ＡＴＣＣ登録番号５５２０
６）を創製することができ、この菌株は約３倍も高いＰ
Ｔ類縁体を発現する。
【００１５】同じ手法を用いて１０５３６株からＰＲＮ
遺伝子を取り除くことにより、１０９０−１０８−３株
（ＡＴＣＣ登録番号５５１５６）を創製した。ＰＲＮ遺
伝子座は、同様にＰＲＮ遺伝子の重複コピーまたはハイ
ブリッドオペロンの導入にも使用することができる。ハ
イブリッドオペロンの遺伝子工学的創製法については、
我々のヨーロッパ特許出願番号ＥＰＯ ４５３，２１６
およびその米国特許出願番号６８７，２３１、出願日１
９９１年４月１８日に記載されている。端的に説明する
と、ハイブリッドオペロンは、ボルデテラの構造遺伝子
からなり、その別の遺伝子プロモーターにより調節され
ている。ＦＨＡプロモーターの調節下にあるパータクチ
ン構造遺伝子で構成されているハイブリッド遺伝子の縦
列コピーをＰＲＮ遺伝子座に導入することにより、１０
９１−２９７株が得られ、この菌株は野生型に比較して
約２０倍も高いパータクチンを発現する。
遺伝子を取り除くことにより、１０９０−１０８−３株
（ＡＴＣＣ登録番号５５１５６）を創製した。ＰＲＮ遺
伝子座は、同様にＰＲＮ遺伝子の重複コピーまたはハイ
ブリッドオペロンの導入にも使用することができる。ハ
イブリッドオペロンの遺伝子工学的創製法については、
我々のヨーロッパ特許出願番号ＥＰＯ ４５３，２１６
およびその米国特許出願番号６８７，２３１、出願日１
９９１年４月１８日に記載されている。端的に説明する
と、ハイブリッドオペロンは、ボルデテラの構造遺伝子
からなり、その別の遺伝子プロモーターにより調節され
ている。ＦＨＡプロモーターの調節下にあるパータクチ
ン構造遺伝子で構成されているハイブリッド遺伝子の縦
列コピーをＰＲＮ遺伝子座に導入することにより、１０
９１−２９７株が得られ、この菌株は野生型に比較して
約２０倍も高いパータクチンを発現する。
【００１６】我々は、ボルデテラ・ペルツシスの遺伝子
コピー数を増加することにより、特定の抗原の生産能を
除去し、特定の抗原の生産能を高めるようにボルデテラ
・ペルツシスを遺伝子工学的に改良することができた。
そのほかの遺伝子コピーは、同種異形遺伝子組替えによ
り天然または新規の遺伝子座に単一または重複コピーす
ることができる。それらの遺伝子は、天然遺伝子または
突然変異遺伝子または新規なハイブリッド遺伝子でもよ
い。また、それらの遺伝子は、別の細菌種から得た異種
同形遺伝子でもよい。遺伝子を除去したのち、天然また
は新規な遺伝子を単一または重複挿入する方法を用いる
ことにより、新規なワクチン製剤に使用できる抗原の生
産能を高めることができる。ここに記載した手法を用い
ることにより、望ましくない遺伝子を除去し、生産量が
限られている抗原の発現を増強し、精製工程を単純化す
ることができる。特定の抗原の発現が効果的に行われる
ので、ある種の成長促進添加物も添加する必要がないも
のと考えられる。
コピー数を増加することにより、特定の抗原の生産能を
除去し、特定の抗原の生産能を高めるようにボルデテラ
・ペルツシスを遺伝子工学的に改良することができた。
そのほかの遺伝子コピーは、同種異形遺伝子組替えによ
り天然または新規の遺伝子座に単一または重複コピーす
ることができる。それらの遺伝子は、天然遺伝子または
突然変異遺伝子または新規なハイブリッド遺伝子でもよ
い。また、それらの遺伝子は、別の細菌種から得た異種
同形遺伝子でもよい。遺伝子を除去したのち、天然また
は新規な遺伝子を単一または重複挿入する方法を用いる
ことにより、新規なワクチン製剤に使用できる抗原の生
産能を高めることができる。ここに記載した手法を用い
ることにより、望ましくない遺伝子を除去し、生産量が
限られている抗原の発現を増強し、精製工程を単純化す
ることができる。特定の抗原の発現が効果的に行われる
ので、ある種の成長促進添加物も添加する必要がないも
のと考えられる。
【００１７】
【実施例】本明細書および以下の実施例では、使用した
分子遺伝学、タンパク生化学および発酵の方法ならびに
ハイブリドーマの手法は必ずしも詳細に記載されていな
いが、これらは学術文献に詳細に記載されており、当該
分野の専門知識を有する者には容易に類推できるもので
ある。 実施例１ 本実施例は、ベクターおよび菌株の構造ならびにそれら
の分子の特徴づけを説明するものである。
分子遺伝学、タンパク生化学および発酵の方法ならびに
ハイブリドーマの手法は必ずしも詳細に記載されていな
いが、これらは学術文献に詳細に記載されており、当該
分野の専門知識を有する者には容易に類推できるもので
ある。 実施例１ 本実施例は、ベクターおよび菌株の構造ならびにそれら
の分子の特徴づけを説明するものである。
【００１８】ＤＮＡ操作、サザーンブロット分析および
プローブのニックトランスレーションはＳａｍｂｒｏｏ
ｋら（分子クローニング：実験マニュアル、第２版、Ｃ
ｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔ
ｏｒｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．
Ｙ．［１９８９］）に従って行った。制限酵素は、製造
業者の指針に従って使用した。遺伝子は、Λシャロン３
５で調製したボルデテラ・ペルツシス１０５３６ゲノム
ライブラリーからクーロン化した（ヨーロッパ特許３２
２，１１５および米国特許５，０８５，８６２に記
載）。エレクトロポーレーション転換用のＤＮＡプラス
ミッドは、Ｉｓｈ−ＨｏｒｏｗｉｃｚおよびＢｕｒｋｅ
（Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，９，２９８９［１
９８８］）に従って調製した。サザーンブロッティング
用の染色体ＤＮＡはＹａｃｏｏｂおよびＺｅａｌｅｙ
（Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．，１６，１６３９［１
９８８］）に従って調製した。 実施例２ 本実施例では、無指定の対立遺伝子交換によるボルデテ
ラ・ペルツシス染色体における遺伝子の置換法を説明す
る。
プローブのニックトランスレーションはＳａｍｂｒｏｏ
ｋら（分子クローニング：実験マニュアル、第２版、Ｃ
ｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔ
ｏｒｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．
Ｙ．［１９８９］）に従って行った。制限酵素は、製造
業者の指針に従って使用した。遺伝子は、Λシャロン３
５で調製したボルデテラ・ペルツシス１０５３６ゲノム
ライブラリーからクーロン化した（ヨーロッパ特許３２
２，１１５および米国特許５，０８５，８６２に記
載）。エレクトロポーレーション転換用のＤＮＡプラス
ミッドは、Ｉｓｈ−ＨｏｒｏｗｉｃｚおよびＢｕｒｋｅ
（Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，９，２９８９［１
９８８］）に従って調製した。サザーンブロッティング
用の染色体ＤＮＡはＹａｃｏｏｂおよびＺｅａｌｅｙ
（Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．，１６，１６３９［１
９８８］）に従って調製した。 実施例２ 本実施例では、無指定の対立遺伝子交換によるボルデテ
ラ・ペルツシス染色体における遺伝子の置換法を説明す
る。
【００１９】特定の遺伝子の除去および別の遺伝子の挿
入とも、同じ原理を適用した。特定の遺伝子の除去は、
マーカーカセットの挿入によって行う。ボルデテラ・ペ
ルツシスの形質転換は、Ｚｅａｌｅｙらが報告した（Ｂ
ｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，８，１０２５［１９９
０］）エレクトロポーレーションによって行った。簡単
に説明すると、ヘプタキス（２,６−ｏ−ジメチル）β-
シクロデキストリンを添加したＳｔａｉｎｅｒ Ｓｃｈ
ｏｌｔｅ培地（Ｉｍａｉｚｕｍｉら、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉ
ｍｍｕｎ．，４１，１１３８［１９８３］）１ｌ中で細
胞数が約５ｘ１０9個／ｍｌに達するまで培養したの
ち、遠心分離（５０００×ｇ、１５分間、４℃）により
細胞を集めた。細胞を５００ｍｌの蒸留水で２回、５０
ｍｌの１０％グリセロールで１回洗い、１０％グリセロ
ール１０ｍｌに懸濁させ、小分けして-７０℃で凍結し
た。形質転換にあたって、細胞懸濁液２００μｌを採
り、直線状のＤＮＡ１０〜５０μｇまたは螺旋状のＤＮ
Ａプラスミッド５μｇと混合し、氷上で１０分間インキ
ュベーションした。Ｐｏｗｅｒ Ｐｌｕｓユニットを装
着したＢＴＸトランスフェクター１００（Ｂｉｏｔｅｃ
ｈｎｏｌｏｇｉｅｓ ａｎｄ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａ
ｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）を
用い、０．８ｍｍの電極間間隙からこの混合液に６５０
Ｖの指数関数形崩壊パルスを照射した。細胞に１ｍｌの
培地を添加し、さらに３６℃で振とう培養した。ＴＯＸ
-菌株のＴＯＸ遺伝子座にＴＯＸ対立遺伝子を集積させ
るため、直線状のＤＮＡで細胞の転換を行った。形質転
換後さらに１時間非選択的に培養したのち、培地にアン
ピシリンを５０μｇ／ｍｌの割合で添加し、さらに３６
℃で１５〜２４時間培養した。これより１ｍｌを採り、
１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシンを含むＢｏｒｄ
ｅｔ−Ｇｅｎｇｏｕ培地に接種したのち、３６℃で３〜
５日間培養し、形質転換体を発現させた。
入とも、同じ原理を適用した。特定の遺伝子の除去は、
マーカーカセットの挿入によって行う。ボルデテラ・ペ
ルツシスの形質転換は、Ｚｅａｌｅｙらが報告した（Ｂ
ｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，８，１０２５［１９９
０］）エレクトロポーレーションによって行った。簡単
に説明すると、ヘプタキス（２,６−ｏ−ジメチル）β-
シクロデキストリンを添加したＳｔａｉｎｅｒ Ｓｃｈ
ｏｌｔｅ培地（Ｉｍａｉｚｕｍｉら、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉ
ｍｍｕｎ．，４１，１１３８［１９８３］）１ｌ中で細
胞数が約５ｘ１０9個／ｍｌに達するまで培養したの
ち、遠心分離（５０００×ｇ、１５分間、４℃）により
細胞を集めた。細胞を５００ｍｌの蒸留水で２回、５０
ｍｌの１０％グリセロールで１回洗い、１０％グリセロ
ール１０ｍｌに懸濁させ、小分けして-７０℃で凍結し
た。形質転換にあたって、細胞懸濁液２００μｌを採
り、直線状のＤＮＡ１０〜５０μｇまたは螺旋状のＤＮ
Ａプラスミッド５μｇと混合し、氷上で１０分間インキ
ュベーションした。Ｐｏｗｅｒ Ｐｌｕｓユニットを装
着したＢＴＸトランスフェクター１００（Ｂｉｏｔｅｃ
ｈｎｏｌｏｇｉｅｓ ａｎｄ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａ
ｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）を
用い、０．８ｍｍの電極間間隙からこの混合液に６５０
Ｖの指数関数形崩壊パルスを照射した。細胞に１ｍｌの
培地を添加し、さらに３６℃で振とう培養した。ＴＯＸ
-菌株のＴＯＸ遺伝子座にＴＯＸ対立遺伝子を集積させ
るため、直線状のＤＮＡで細胞の転換を行った。形質転
換後さらに１時間非選択的に培養したのち、培地にアン
ピシリンを５０μｇ／ｍｌの割合で添加し、さらに３６
℃で１５〜２４時間培養した。これより１ｍｌを採り、
１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシンを含むＢｏｒｄ
ｅｔ−Ｇｅｎｇｏｕ培地に接種したのち、３６℃で３〜
５日間培養し、形質転換体を発現させた。
【００２０】ＦＨＡ遺伝子座に正しく集積する割合を増
すために、ＦＨＡ欠失ボルデテラ・ペルツシス菌株は２
段階で形質転換させた。螺旋形ＤＮＡプラスミッドのエ
レクトロポーレーションを行い、アンピシリン培地（５
０μｇ／ｍｌ）で培養し、プラスミッド集積菌株を選抜
した。ＡｐR、ＴｅｔR、ＳｔｒS形質転換体は、ＤＮＡ
頻度約５００／μｇで得られ、ＴＯＸまたはＦＨＡ遺伝
子座のいずれかに全プラスミッドが集積したためと推定
された。ストレプトマイシンを含む培地にこれらの一次
形質転換体をストリークすると、ＳｔｒRコロニーが得
られ、分子間組替えによりそのＳ１２／ＴｅｔR遺伝子
カセットをＴＯＸオペロンで置換した。 実施例３ 本実施例は、菌株の培養および抗原の特性化について説
明するものである。
すために、ＦＨＡ欠失ボルデテラ・ペルツシス菌株は２
段階で形質転換させた。螺旋形ＤＮＡプラスミッドのエ
レクトロポーレーションを行い、アンピシリン培地（５
０μｇ／ｍｌ）で培養し、プラスミッド集積菌株を選抜
した。ＡｐR、ＴｅｔR、ＳｔｒS形質転換体は、ＤＮＡ
頻度約５００／μｇで得られ、ＴＯＸまたはＦＨＡ遺伝
子座のいずれかに全プラスミッドが集積したためと推定
された。ストレプトマイシンを含む培地にこれらの一次
形質転換体をストリークすると、ＳｔｒRコロニーが得
られ、分子間組替えによりそのＳ１２／ＴｅｔR遺伝子
カセットをＴＯＸオペロンで置換した。 実施例３ 本実施例は、菌株の培養および抗原の特性化について説
明するものである。
【００２１】菌株は、温度、ｐＨおよび溶存酸素調整下
でヘプタキス（２，６−ｏ−ジメチル）β-シクロデキ
ストリンを含む改良Ｓｔａｉｎｅｒ−Ｓｃｈｏｌｔｅ培
地を用い、１０リットルのＣｈｅｍＡｐバイオリアクタ
ーまたは１０ｍｌの培地で定常的に培養した（Ｉｍａｉ
ｚｕｍｉら、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．，４１，１１
３８［１９８３］）。抗原生産能は、培地の上清を採
り、単一特異性ポリクロナール抗体またはモノクロナー
ル抗体を用い、抗原特異性ＥＬＩＳＡ中で検定した。
でヘプタキス（２，６−ｏ−ジメチル）β-シクロデキ
ストリンを含む改良Ｓｔａｉｎｅｒ−Ｓｃｈｏｌｔｅ培
地を用い、１０リットルのＣｈｅｍＡｐバイオリアクタ
ーまたは１０ｍｌの培地で定常的に培養した（Ｉｍａｉ
ｚｕｍｉら、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．，４１，１１
３８［１９８３］）。抗原生産能は、培地の上清を採
り、単一特異性ポリクロナール抗体またはモノクロナー
ル抗体を用い、抗原特異性ＥＬＩＳＡ中で検定した。
【００２２】ＰＴは、Ｌｏｏｓｍｏｒｅら（Ｉｎｆｅｃ
ｔ．Ｉｍｍｕｎ．，５８,３６５３［１９９０］）に従
ってフェテュイン捕捉ＥＬＩＳＡ中で測定した。ＦＨＡ
はマウスの腹水から精製したモノクロナール抗ＦＨＡ抗
体により捕捉し、第２の抗体としてセイヨウワサビのパ
ーオキシダーゼに抱合させたウサギのポリクロナールＩ
ｇＧ抗ＦＨＡを用いた。標準として精製した抗原を用い
た。
ｔ．Ｉｍｍｕｎ．，５８,３６５３［１９９０］）に従
ってフェテュイン捕捉ＥＬＩＳＡ中で測定した。ＦＨＡ
はマウスの腹水から精製したモノクロナール抗ＦＨＡ抗
体により捕捉し、第２の抗体としてセイヨウワサビのパ
ーオキシダーゼに抱合させたウサギのポリクロナールＩ
ｇＧ抗ＦＨＡを用いた。標準として精製した抗原を用い
た。
【００２３】ペルツシス毒素はヨーロッパ特許３２２，
１１５、米国特許５，０８５，８６２および米国特許
４，９９７，９１５の記載に従って精製した。９８９−
５６菌株および３重コピーＴＯＸ *株８９０−３９３が
生産したＰＴ類縁体を比較分析したところ、図８に示す
ごとく、ＳＤＳ−ＰＡＧＥパターンおよびＨＰＬＣプロ
フィールに差は認められなかった。野生型および遺伝子
工学により改良した菌株により生産された在来のＰＴお
よびＰＴ類縁体の生物学的特性を表２に示す。その結果
から、単一コピーまたは重複コピー菌株により分泌され
たＰＴは機能的に同等であることが認められた。 実施例４ 本実施例では、ＦＨＡ欠失菌株３９０−１０１の創製に
ついて説明する。
１１５、米国特許５，０８５，８６２および米国特許
４，９９７，９１５の記載に従って精製した。９８９−
５６菌株および３重コピーＴＯＸ *株８９０−３９３が
生産したＰＴ類縁体を比較分析したところ、図８に示す
ごとく、ＳＤＳ−ＰＡＧＥパターンおよびＨＰＬＣプロ
フィールに差は認められなかった。野生型および遺伝子
工学により改良した菌株により生産された在来のＰＴお
よびＰＴ類縁体の生物学的特性を表２に示す。その結果
から、単一コピーまたは重複コピー菌株により分泌され
たＰＴは機能的に同等であることが認められた。 実施例４ 本実施例では、ＦＨＡ欠失菌株３９０−１０１の創製に
ついて説明する。
【００２４】元来、ＦＨＡオペロンは２段階でクーロン
化した。ＦＨＡ Ｂ構造遺伝子の４．５ｋｂ ＢａｍＨ／
ＢａｍＨＩフラグメント内部は、プローブとしてポリク
ロナール抗ＦＨＡ抗体を用い、ｐＥＶ発現ライブラリー
からクーロン化した（Ｒ．Ｃｒｏｗｌら、Ｇｅｎｅ ３
８，３１［１９８５］）。ついで、このフラグメントに
ついてニックトランスレーションを行い、全オペロンを
クーロン化するためのＣｈａｒｏｎファージ ペルツシ
ス ゲノム ライブラリーのプローブとして使用した。
化した。ＦＨＡ Ｂ構造遺伝子の４．５ｋｂ ＢａｍＨ／
ＢａｍＨＩフラグメント内部は、プローブとしてポリク
ロナール抗ＦＨＡ抗体を用い、ｐＥＶ発現ライブラリー
からクーロン化した（Ｒ．Ｃｒｏｗｌら、Ｇｅｎｅ ３
８，３１［１９８５］）。ついで、このフラグメントに
ついてニックトランスレーションを行い、全オペロンを
クーロン化するためのＣｈａｒｏｎファージ ペルツシ
ス ゲノム ライブラリーのプローブとして使用した。
【００２５】ＦＨＡ構造遺伝子の１１ｋｂ 内部Ｅｃｏ
ＲＩ／ＥｃｏＲＩフラグメントを除去し、Ｓ１２／Ｔｅ
ｔR遺伝子カセットで置換し、ｐＧＺ７１プラスミッド
を得た。したがって、このプラスミッドは、２．５ｋｂ
のＢｇ１ＩＩ／ＥｃｏＲＩ５’-ＦＨＡフランキングシ
ーケンスと１．７ｋｂのＥｃｏＲＩ／ＣｌａＩ３’−Ｆ
ＨＡフランキングシーケンスを有している（図１）。
ＲＩ／ＥｃｏＲＩフラグメントを除去し、Ｓ１２／Ｔｅ
ｔR遺伝子カセットで置換し、ｐＧＺ７１プラスミッド
を得た。したがって、このプラスミッドは、２．５ｋｂ
のＢｇ１ＩＩ／ＥｃｏＲＩ５’-ＦＨＡフランキングシ
ーケンスと１．７ｋｂのＥｃｏＲＩ／ＣｌａＩ３’−Ｆ
ＨＡフランキングシーケンスを有している（図１）。
【００２６】図２はｐＧＺ７１プラスミッドの構造を示
している。簡単に説明すると、プラスミッドＳ−２２２
４−１はＦＨＡオペロンの３’−Ｂｇ１ＩＩ／ＥｃｏＲ
Ｉ部分を代表する染色体クーロンを含み、プラスミッド
Ｓ−３５９５−９−１はＦＨＡオペロンの５’−Ｅｃｏ
ＲＩ／Ｂｇ１ＩＩ部分を代表する染色体クーロンを含ん
でいる。両クーロンが部位Ｂｇ１ＩＩで一緒になると、
完全なＦＨＡ構造遺伝子が再構築される。Ｓ−２２２４
−１プラスミッドをＢｇ１ＩＩおよびＥｃｏＲＩで解裂
させると、１．７ｋｂのＦＨＡ３’-フランキング部位
（３’ＦＨＡ）を含むｐＢＲ３２２ベクターフラグメン
トが得られる。Ｓ−３５９５−９−１プラスミッドをＢ
ｇ１ＩＩおよびＥｃｏＲＩで消化し、ＦＨＡ ５’-フラ
ンキングシーケンス（５’ＦＨＡ）を含む２．５ｋｂの
フラグメントをＳ−２２２４−１ベクターの破片で結さ
くすると、Ｓ−３６１６−２プラスミッドが得られる。
プラスミッドｐＧＺ６２はｐＢＲ３２２プラスミッドに
おけるＳ１２／ＴｅｔR 遺伝子カセットを含み、ヨーロ
ッパ特許３２２，１１５および米国特許５，０８５，８
６２に詳しく記載されている。Ｓ−３６１６−２プラス
ミッドはＥｃｏＲＩで消化し、Ｋｌｅｎｏｗポリメラー
ゼを用いて充填し、仔牛のアルカリホスファターゼ（Ｃ
ＡＰ）で脱リン酸した。ｐＧＺ６２プラスミッドはＥｃ
ｏＲＩおよびＢａ１Ｉで消化したのち、充填した。Ｓ−
３６１６−２ベクターフラグメントおよびＰｇｚ６２挿
入フラグメントを結さくし、Ｐｇｚ７１を得た。Ｅｃｏ
ＲＩおよびＢａｌＩ部位を充填することによって、Ｅｃ
ｏＲＩ部位が再生する。
している。簡単に説明すると、プラスミッドＳ−２２２
４−１はＦＨＡオペロンの３’−Ｂｇ１ＩＩ／ＥｃｏＲ
Ｉ部分を代表する染色体クーロンを含み、プラスミッド
Ｓ−３５９５−９−１はＦＨＡオペロンの５’−Ｅｃｏ
ＲＩ／Ｂｇ１ＩＩ部分を代表する染色体クーロンを含ん
でいる。両クーロンが部位Ｂｇ１ＩＩで一緒になると、
完全なＦＨＡ構造遺伝子が再構築される。Ｓ−２２２４
−１プラスミッドをＢｇ１ＩＩおよびＥｃｏＲＩで解裂
させると、１．７ｋｂのＦＨＡ３’-フランキング部位
（３’ＦＨＡ）を含むｐＢＲ３２２ベクターフラグメン
トが得られる。Ｓ−３５９５−９−１プラスミッドをＢ
ｇ１ＩＩおよびＥｃｏＲＩで消化し、ＦＨＡ ５’-フラ
ンキングシーケンス（５’ＦＨＡ）を含む２．５ｋｂの
フラグメントをＳ−２２２４−１ベクターの破片で結さ
くすると、Ｓ−３６１６−２プラスミッドが得られる。
プラスミッドｐＧＺ６２はｐＢＲ３２２プラスミッドに
おけるＳ１２／ＴｅｔR 遺伝子カセットを含み、ヨーロ
ッパ特許３２２，１１５および米国特許５，０８５，８
６２に詳しく記載されている。Ｓ−３６１６−２プラス
ミッドはＥｃｏＲＩで消化し、Ｋｌｅｎｏｗポリメラー
ゼを用いて充填し、仔牛のアルカリホスファターゼ（Ｃ
ＡＰ）で脱リン酸した。ｐＧＺ６２プラスミッドはＥｃ
ｏＲＩおよびＢａ１Ｉで消化したのち、充填した。Ｓ−
３６１６−２ベクターフラグメントおよびＰｇｚ６２挿
入フラグメントを結さくし、Ｐｇｚ７１を得た。Ｅｃｏ
ＲＩおよびＢａｌＩ部位を充填することによって、Ｅｃ
ｏＲＩ部位が再生する。
【００２７】偶発的に生成するストレプトマイシン耐性
ボルデテラ・ペルツシス１０５３６菌株、すなわちボル
デテラ・ペルツシスｓｔｒ２９株（ＡＴＣＣ登録番号５
３９７２）は、直線型ｐＧＺ７１でエレクトロポーレシ
ョン転換すると、対立遺伝子交換によりＦＨＡ構造遺伝
子を失い、ＦＨＡ -の３９０−１０１株（ＡＴＣＣ登録
番号５５１５７）が得られる。ＦＨＡ遺伝子の欠失はサ
ザーンブロット分析およびＦＨＡ特異性ＥＬＩＳＡで確
認した。同様に、ｐＧＺ７１プラスミッドを用いて、Ｔ
ＯＸ *オペロンを含むボルデテラ・ペルツシス９８９−
５６株からＦＨＡ遺伝子を除去し、ボルデテラ・ペルツ
シス４９０−３２４株を創製した。 実施例５ 本実施例では、異なった遺伝子座に２個のＴＯＸ遺伝子
コピーを含むＦＨＡ欠失株５９０−２０８の創製につい
て記載する。
ボルデテラ・ペルツシス１０５３６菌株、すなわちボル
デテラ・ペルツシスｓｔｒ２９株（ＡＴＣＣ登録番号５
３９７２）は、直線型ｐＧＺ７１でエレクトロポーレシ
ョン転換すると、対立遺伝子交換によりＦＨＡ構造遺伝
子を失い、ＦＨＡ -の３９０−１０１株（ＡＴＣＣ登録
番号５５１５７）が得られる。ＦＨＡ遺伝子の欠失はサ
ザーンブロット分析およびＦＨＡ特異性ＥＬＩＳＡで確
認した。同様に、ｐＧＺ７１プラスミッドを用いて、Ｔ
ＯＸ *オペロンを含むボルデテラ・ペルツシス９８９−
５６株からＦＨＡ遺伝子を除去し、ボルデテラ・ペルツ
シス４９０−３２４株を創製した。 実施例５ 本実施例では、異なった遺伝子座に２個のＴＯＸ遺伝子
コピーを含むＦＨＡ欠失株５９０−２０８の創製につい
て記載する。
【００２８】実施例４に記載したように、ＦＨＡフラン
キング部位の間に４．７ｋｂ ＥｃｏＲＩ／ＥｃｏＲＩ
ＴＯＸ オペロンの単一コピーを含むｐＢＲ３２２プラ
スミッド（Ｓ−３７４１−２）を構築した。図２にＳ−
３７４１−２プラスミッドの構造を示す。簡単に説明す
ると、Ｓ−３６１６−２をＥｃｏＲＩで消化し、ＦＨＡ
フランキング部位の間のプラスミッドを解放し、ＣＡＰ
で脱リン酸した。プラスミッドＪ−１６９−１はＴＯＸ
のｐＵＣクーロンであり、それをＥｃｏＲＩで消化して
ＥｃｏＲＩ／ＥｃｏＲＩ ＴＯＸフラグメントを作製し
た。結さくすることにより、ＦＨＡフランキング部位の
間に野生型ＴＯＸオペロンの単一コピーを含むＳ−３７
４１−２が得られる。
キング部位の間に４．７ｋｂ ＥｃｏＲＩ／ＥｃｏＲＩ
ＴＯＸ オペロンの単一コピーを含むｐＢＲ３２２プラ
スミッド（Ｓ−３７４１−２）を構築した。図２にＳ−
３７４１−２プラスミッドの構造を示す。簡単に説明す
ると、Ｓ−３６１６−２をＥｃｏＲＩで消化し、ＦＨＡ
フランキング部位の間のプラスミッドを解放し、ＣＡＰ
で脱リン酸した。プラスミッドＪ−１６９−１はＴＯＸ
のｐＵＣクーロンであり、それをＥｃｏＲＩで消化して
ＥｃｏＲＩ／ＥｃｏＲＩ ＴＯＸフラグメントを作製し
た。結さくすることにより、ＦＨＡフランキング部位の
間に野生型ＴＯＸオペロンの単一コピーを含むＳ−３７
４１−２が得られる。
【００２９】エレクトロポーレンションによりＳ−３７
４１−２をＦＨＡ欠失株３９０−１０１に導入すると、
２個のＴＯＸ非縦列コピーを有する株５９０−２０８が
得られる。５９０−２０８株のゲノムＤＮＡをサザーン
ブロット法で分析し、別のＴＯＸオペロンがＦＨＡ遺伝
子座に正しく配置されていることを確認した。
４１−２をＦＨＡ欠失株３９０−１０１に導入すると、
２個のＴＯＸ非縦列コピーを有する株５９０−２０８が
得られる。５９０−２０８株のゲノムＤＮＡをサザーン
ブロット法で分析し、別のＴＯＸオペロンがＦＨＡ遺伝
子座に正しく配置されていることを確認した。
【００３０】液体培地で培養すると、図１および図２に
示すように、在来株に比較してＰＴの収量が２培であっ
たが、予期したごとく、ＦＨＡの生産は認められなかっ
た。Ｓ−３７４１−２プラスミッドはＡＴＣＣに登録し
た（登録番号７５０３１）。 実施例６ 本実施例は、ＴＯＸ *オペロンの３個のコピーを含むＦ
ＨＡ欠失株８９０−３９３の創製について説明するもの
である。
示すように、在来株に比較してＰＴの収量が２培であっ
たが、予期したごとく、ＦＨＡの生産は認められなかっ
た。Ｓ−３７４１−２プラスミッドはＡＴＣＣに登録し
た（登録番号７５０３１）。 実施例６ 本実施例は、ＴＯＸ *オペロンの３個のコピーを含むＦ
ＨＡ欠失株８９０−３９３の創製について説明するもの
である。
【００３１】ｐＢＲ３２２プラスミッド（Ｓ−３８２２
−１０）は、実施例４に記載したごとく、ＦＨＡフラン
キング部位間に２個の４．７ｋｂ ＥｃｏＲＩ／Ｅｃｏ
ＲＩＴＯＸ *オペロンコピーを有するように構築した。
Ｓ−３８２２−１０の構造を図３に示す。簡単に説明す
ると、Ｓ−３４８４−３−１５プラスミッドは、突然変
異を起こしたＴＯＸオペロン（ＴＯＸ *）の周りにＴＯ
Ｘ ５’− および３’−フランキングシーケンスを含む
ｐＵＣベクターである。ＴＯＸ *は、Ｓ１サブユニット
にＬｙｓ９Ｇｌｙ１２９置換を有する無毒なＰＴ類縁体
を生産するように設計された突然変異を含んでいる（Ｌ
ｏｏｓｍｏｒｅら、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．，５
８, ３６５３［１９９０］）。Ｓ−３６１６−２はＥｃ
ｏＲＩで消化し、脱リン酸した。Ｓ−３４８４−３−１
５はＥｃｏＲＩで消化したのち、ＴＯＸ *フラグメント
を解裂させた。結さく反応には、ＥｃｏＲＩ-ＥｃｏＲ
Ｉ ＴＯＸ *挿入の５モル過剰量を使用して縦列遺伝子コ
ピーを助長し、Ｓ−３８２２−１０プラスミッドを得
た。このプラスミッドはＦＨＡ遺伝子フランキング部位
の間に２個の隣接したＴＯＸ *コピーを有することが、
制限酵素分析で確認された。
−１０）は、実施例４に記載したごとく、ＦＨＡフラン
キング部位間に２個の４．７ｋｂ ＥｃｏＲＩ／Ｅｃｏ
ＲＩＴＯＸ *オペロンコピーを有するように構築した。
Ｓ−３８２２−１０の構造を図３に示す。簡単に説明す
ると、Ｓ−３４８４−３−１５プラスミッドは、突然変
異を起こしたＴＯＸオペロン（ＴＯＸ *）の周りにＴＯ
Ｘ ５’− および３’−フランキングシーケンスを含む
ｐＵＣベクターである。ＴＯＸ *は、Ｓ１サブユニット
にＬｙｓ９Ｇｌｙ１２９置換を有する無毒なＰＴ類縁体
を生産するように設計された突然変異を含んでいる（Ｌ
ｏｏｓｍｏｒｅら、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．，５
８, ３６５３［１９９０］）。Ｓ−３６１６−２はＥｃ
ｏＲＩで消化し、脱リン酸した。Ｓ−３４８４−３−１
５はＥｃｏＲＩで消化したのち、ＴＯＸ *フラグメント
を解裂させた。結さく反応には、ＥｃｏＲＩ-ＥｃｏＲ
Ｉ ＴＯＸ *挿入の５モル過剰量を使用して縦列遺伝子コ
ピーを助長し、Ｓ−３８２２−１０プラスミッドを得
た。このプラスミッドはＦＨＡ遺伝子フランキング部位
の間に２個の隣接したＴＯＸ *コピーを有することが、
制限酵素分析で確認された。
【００３２】９８９−５６株（ＡＴＣＣ登録番号５３９
７５）は野生株１０５３６に由来するもので、Ｌｙｓ９
Ｇｌｙ１９ ＰＴ類縁体を発現する（図６）。
７５）は野生株１０５３６に由来するもので、Ｌｙｓ９
Ｇｌｙ１９ ＰＴ類縁体を発現する（図６）。
【００３３】ｐＧＺ７１を用いて９８９−５６株からＦ
ＨＡ構造遺伝子を除去し、ＴＯＸ * ＦＨＡの４９０−３
２４株を得た。Ｓ−３８２２−１０を４９０−３２４に
導入することにより、ＦＨＡ遺伝子座に２個および元の
ＴＯＸ遺伝子座に１個、合計３個のＴＯＸ *オペロンコ
ピーを有する８９０−３９３株を創製した（図６）。実
施例３に従って液体培地で培養すると、表１（Ａ）およ
び（Ｂ）に示すように、１０５３６株に比較して３〜４
倍高いＰＴ類縁体の発現が認められた。ボルデテラ・ペ
ルツシス８９０−３９３株によるＰＴ類縁体発現の推移
を図７に示す。
ＨＡ構造遺伝子を除去し、ＴＯＸ * ＦＨＡの４９０−３
２４株を得た。Ｓ−３８２２−１０を４９０−３２４に
導入することにより、ＦＨＡ遺伝子座に２個および元の
ＴＯＸ遺伝子座に１個、合計３個のＴＯＸ *オペロンコ
ピーを有する８９０−３９３株を創製した（図６）。実
施例３に従って液体培地で培養すると、表１（Ａ）およ
び（Ｂ）に示すように、１０５３６株に比較して３〜４
倍高いＰＴ類縁体の発現が認められた。ボルデテラ・ペ
ルツシス８９０−３９３株によるＰＴ類縁体発現の推移
を図７に示す。
【００３４】図６は、８９０−３９３株のゲノムＤＮＡ
をサザーンブロット分析の結果を示す。染色体ＤＮＡを
分離し、Ｂｇ１ＩＩおよびＣ１ａＩで同時に制限分解
し、ニックトランスレーションＴＯＸ特異的プローブで
実証した。ボルデテラ・ペルツシス８９０−３９３株の
制限分解ゲノムＤＮＡのハイブリッドパターン（４列
目）を１０５３６株から得たＤＮＡ（１列目）および９
８９−５６株（２列目）と比較し、在来のＴＯＸオペロ
ンに特異的である３．３および１３ｋｂのＴＯＸ特異性
フラグメントの存在が認められる。しかし、８９０−３
９３株では、さらに５．３、５．０および３．７ｋｂの
ＴＯＸ特異性フラグメントも認められる。
をサザーンブロット分析の結果を示す。染色体ＤＮＡを
分離し、Ｂｇ１ＩＩおよびＣ１ａＩで同時に制限分解
し、ニックトランスレーションＴＯＸ特異的プローブで
実証した。ボルデテラ・ペルツシス８９０−３９３株の
制限分解ゲノムＤＮＡのハイブリッドパターン（４列
目）を１０５３６株から得たＤＮＡ（１列目）および９
８９−５６株（２列目）と比較し、在来のＴＯＸオペロ
ンに特異的である３．３および１３ｋｂのＴＯＸ特異性
フラグメントの存在が認められる。しかし、８９０−３
９３株では、さらに５．３、５．０および３．７ｋｂの
ＴＯＸ特異性フラグメントも認められる。
【００３５】ハイブリッド化のパターンから、この菌株
はＴＯＸ遺伝子座に１個のＴＯＸ *オペロンを有し、Ｆ
ＨＡ遺伝子座にさらに２個の縦列コピーを有することが
認められた。８９０−３９３株はＡＴＣＣに登録した
（登録番号５５２０６）。 実施例７ 本実施例では、 ＴＯＸ遺伝子座に２個のＴＯＸ *縦列コ
ピーを有する１９１−１３４株の創製について説明する
ものである。
はＴＯＸ遺伝子座に１個のＴＯＸ *オペロンを有し、Ｆ
ＨＡ遺伝子座にさらに２個の縦列コピーを有することが
認められた。８９０−３９３株はＡＴＣＣに登録した
（登録番号５５２０６）。 実施例７ 本実施例では、 ＴＯＸ遺伝子座に２個のＴＯＸ *縦列コ
ピーを有する１９１−１３４株の創製について説明する
ものである。
【００３６】ｐＵＣプラスミッド（Ｓ−４０００−５）
は、５’−および３’−ＴＯＸフランキング部位間に２
個の縦列ＴＯＸ *オペロンコピーを有するように構築し
た。４．７ｋｂ ＥｃｏＲＩ／ＥｃｏＲＩ ＴＯＸ *フラ
グメントをオペロンとし、在来ＴＯＸオペロンの２．９
ｋｂ ＳｍａＩ／ＥｃｏＲＩ ５’−フランキング部位お
よび４ｋｂ ＥｃｏＲＩ／ＳａｌＩ ３’−フランキング
部位を用いて縦列遺伝子をＴＯＸ遺伝子座に定位させた
（図１参照）。ＴＯＸフランキング部位については、ヨ
ーロッパ特許３２２，１１５および米国特許５，０８
５，８６２に詳しく記載されている。
は、５’−および３’−ＴＯＸフランキング部位間に２
個の縦列ＴＯＸ *オペロンコピーを有するように構築し
た。４．７ｋｂ ＥｃｏＲＩ／ＥｃｏＲＩ ＴＯＸ *フラ
グメントをオペロンとし、在来ＴＯＸオペロンの２．９
ｋｂ ＳｍａＩ／ＥｃｏＲＩ ５’−フランキング部位お
よび４ｋｂ ＥｃｏＲＩ／ＳａｌＩ ３’−フランキング
部位を用いて縦列遺伝子をＴＯＸ遺伝子座に定位させた
（図１参照）。ＴＯＸフランキング部位については、ヨ
ーロッパ特許３２２，１１５および米国特許５，０８
５，８６２に詳しく記載されている。
【００３７】Ｓ−４０００−５プラスミッドの構造を図
３に示す。簡単に説明すると、ｐＵＣをベースとするＳ
−３４８４−３−１５プラスミッドはＴＯＸフランキン
グ部位間にＴＯＸ *オペロンを含み、ＫｐｎＩで直線化
し、脱リン酸した。Ｓ−３８２２−１０はＦＨＡフラン
キング部位間に縦列ＴＯＸ *オペロンを含み、ＫｐｎＩ
で制限分解し、４．６ｋｂ ＫｐｎＩ／ＫｐｎＩフラグ
メントを除去した。これらの断片を結さくすることによ
り、ＴＯＸフランキング部位間に２個のＴＯＸ *縦列コ
ピーを含むＳ−４０００−５プラスミッドが得られた。
３に示す。簡単に説明すると、ｐＵＣをベースとするＳ
−３４８４−３−１５プラスミッドはＴＯＸフランキン
グ部位間にＴＯＸ *オペロンを含み、ＫｐｎＩで直線化
し、脱リン酸した。Ｓ−３８２２−１０はＦＨＡフラン
キング部位間に縦列ＴＯＸ *オペロンを含み、ＫｐｎＩ
で制限分解し、４．６ｋｂ ＫｐｎＩ／ＫｐｎＩフラグ
メントを除去した。これらの断片を結さくすることによ
り、ＴＯＸフランキング部位間に２個のＴＯＸ *縦列コ
ピーを含むＳ−４０００−５プラスミッドが得られた。
【００３８】Ｓ−４０００−５はＨｉｎｄＩＩＩで直線
化し、２９−８菌株はエレクトロポーレーションにより
転換して１９１−１３４株を得た。１９１−１３４株の
ゲノムＤＮＡをサザーンブロット法で分析したところ、
図６および図７に示したように、縦列ＴＯＸ *オペロン
がＴＯＸ遺伝子座のｉｎ ｓｉｔｕで正しい場所に位置
していることが確認された。１９１−１３４株から得た
染色体ＤＮＡをＢｇ１ＩＩおよびＣｌａＩで同時に消化
した。ＴＯＸ特異性プローブでハイブリッド化すると、
ＴＯＸ遺伝子座にＴＯＸの単一コピーが存在することを
示唆する１３および３．３ｋｂのバンドが認められた
が、別に５．０ｋｂのバンドも検出された。このパター
ンはＴＯＸ遺伝子座に２個のＴＯＸ *縦列コピーが存在
していることを示している。液体培地で培養すると、表
１（Ａ）および（Ｂ）に示すごとく、１９１−１３４株
によるＰＴ類縁体の生産速度は在来株と同様であった
が、生産量は２〜３倍高かった。１９１−１３４株はＡ
ＴＣＣに登録した（登録番号５５２０５）。 実施例８ 本実施例では、ＴＯＸ遺伝子座に集積した野生型ＴＯＸ
オペロンの２個の縦列コピーを含む１１９０−７４株の
遺伝子工学的創製および特性化について記載する。
化し、２９−８菌株はエレクトロポーレーションにより
転換して１９１−１３４株を得た。１９１−１３４株の
ゲノムＤＮＡをサザーンブロット法で分析したところ、
図６および図７に示したように、縦列ＴＯＸ *オペロン
がＴＯＸ遺伝子座のｉｎ ｓｉｔｕで正しい場所に位置
していることが確認された。１９１−１３４株から得た
染色体ＤＮＡをＢｇ１ＩＩおよびＣｌａＩで同時に消化
した。ＴＯＸ特異性プローブでハイブリッド化すると、
ＴＯＸ遺伝子座にＴＯＸの単一コピーが存在することを
示唆する１３および３．３ｋｂのバンドが認められた
が、別に５．０ｋｂのバンドも検出された。このパター
ンはＴＯＸ遺伝子座に２個のＴＯＸ *縦列コピーが存在
していることを示している。液体培地で培養すると、表
１（Ａ）および（Ｂ）に示すごとく、１９１−１３４株
によるＰＴ類縁体の生産速度は在来株と同様であった
が、生産量は２〜３倍高かった。１９１−１３４株はＡ
ＴＣＣに登録した（登録番号５５２０５）。 実施例８ 本実施例では、ＴＯＸ遺伝子座に集積した野生型ＴＯＸ
オペロンの２個の縦列コピーを含む１１９０−７４株の
遺伝子工学的創製および特性化について記載する。
【００３９】ｐＵＣプラスミッド（Ｓ−３９８０−９）
を構築した。このプラスミッドは、Ｓ−４０００−５と
同様に２個のＴＯＸ *縦列コピーを含む（実施例７）
が、ＴＯＸオペロンは野生型である。Ｓ−３９８０−９
はＨｉｎｄＩＩＩで直線化し、エレクトロポーレーショ
ンによる転移でＴＯＸ欠失株２９−８に導入し、１１９
０−７４株を得た。１１９０−７４株のゲノムＤＮＡを
サザーンブロット法で分析したところ、縦列オペロンは
ｉｎ ｓｉｔｕで正しい場所に位置していることが確認
された。
を構築した。このプラスミッドは、Ｓ−４０００−５と
同様に２個のＴＯＸ *縦列コピーを含む（実施例７）
が、ＴＯＸオペロンは野生型である。Ｓ−３９８０−９
はＨｉｎｄＩＩＩで直線化し、エレクトロポーレーショ
ンによる転移でＴＯＸ欠失株２９−８に導入し、１１９
０−７４株を得た。１１９０−７４株のゲノムＤＮＡを
サザーンブロット法で分析したところ、縦列オペロンは
ｉｎ ｓｉｔｕで正しい場所に位置していることが確認
された。
【００４０】液体培地で培養すると、表１（Ａ）および
（Ｂ）に示すように、１１９０−７４株のＰＴ生産速度
は在来株と同じであったが、ＰＴ生産量は２〜３倍高か
った。プラスミッドＳ−３９８０−９はＡＴＣＣに登録
した（登録番号７５０３３）。 実施例９ 本実施例は、培地中のシクロデキストリン必要量に対す
るＰＴ生産過剰の影響について説明するものである。
（Ｂ）に示すように、１１９０−７４株のＰＴ生産速度
は在来株と同じであったが、ＰＴ生産量は２〜３倍高か
った。プラスミッドＳ−３９８０−９はＡＴＣＣに登録
した（登録番号７５０３３）。 実施例９ 本実施例は、培地中のシクロデキストリン必要量に対す
るＰＴ生産過剰の影響について説明するものである。
【００４１】在来株におけるＰＴ発現を最適化するた
め、典型的な例として０．２％のデキストリン誘導体
（ヘプタキス（２，６−ｏ−ジメチル）β−シクロデキ
ストリン）を培地に添加した（Ｉｍａｉｚｕｍｉら、Ｉ
ｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．４１，１１３８［１９８
３］）。図９から、野性型の１０５３６株では、シクロ
デキストリンを培地中に添加することにより、ＰＴの濃
度が著しく増加することが実証された。１１９０−７４
株は野性型のＴＯＸオペロンの縦列コピー２個を含んで
いる。０．２％のヘプタキス（２，６−ｏ−ジメチル）
β−シクロデキストリン）を含まない培地で培養する
と、図１０に示すごとく、ＰＴの発現にはほとんど影響
が認められない。ＰＴ類縁体を生産する菌株でも、同様
な結果が認められた。さらに、ＰＴまたはＰＴ類縁体の
生産が過剰であっても、ＦＨＡ、アグルチノ−ゲンまた
はパ−タクチン等の抗原の発現にも影響はなかった。 実施例１０ 本実施例では、ＰＲＮ欠失株１０９０−１０８−３の創
製について説明する。
め、典型的な例として０．２％のデキストリン誘導体
（ヘプタキス（２，６−ｏ−ジメチル）β−シクロデキ
ストリン）を培地に添加した（Ｉｍａｉｚｕｍｉら、Ｉ
ｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．４１，１１３８［１９８
３］）。図９から、野性型の１０５３６株では、シクロ
デキストリンを培地中に添加することにより、ＰＴの濃
度が著しく増加することが実証された。１１９０−７４
株は野性型のＴＯＸオペロンの縦列コピー２個を含んで
いる。０．２％のヘプタキス（２，６−ｏ−ジメチル）
β−シクロデキストリン）を含まない培地で培養する
と、図１０に示すごとく、ＰＴの発現にはほとんど影響
が認められない。ＰＴ類縁体を生産する菌株でも、同様
な結果が認められた。さらに、ＰＴまたはＰＴ類縁体の
生産が過剰であっても、ＦＨＡ、アグルチノ−ゲンまた
はパ−タクチン等の抗原の発現にも影響はなかった。 実施例１０ 本実施例では、ＰＲＮ欠失株１０９０−１０８−３の創
製について説明する。
【００４２】ＰＲＮ遺伝子部位は、特異的オリゴヌクレ
オチドプロ−ブを用いて、Ｃｈａｒｏｎファ−ジ ペル
ツシス ライブラリ−から１１．３ｋｂのフラグメント
としてク−ロン化した。オリゴヌクレオチドの配列は、
それぞれＡＡＴＧＡＡＣＡＴＧＴＣＴＣＴＧＴＣＡＣＧ
ＣＣＡＴＴＧＴＣＡＡおよびＴＴＣＣＡＣＧＣＧＧＧＣ
ＴＡＣＣＧＧＴＡＣＡＧＣＴＧＧＴＡＡであり、発表さ
れているＰＲＮシ−ケンスの塩基１４４から塩基１７３
および塩基２８４８から塩基２８７７に相当する（Ｃｈ
ａｒｌｅｓら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ
ｉ．８６，３５５４［１９８９］）。Ｓ−３５９６−４
およびＳ−３７７０−４プラスミッドは完全なパ−タク
チン遺伝子部位ＰＲＮの染色体サブク−ロンである（図
４）。Ｓ−３７７０−４をＣａｌＩで消化することによ
り、コ−ド配列の７ｋｂ内部ＣａｌＩ／ＣａｌＩフラグ
メントを除去し、再結さつしてＳ−３８１８−１プラス
ミッドを得た。このｐＵＣプラスミッドはＰＲＮから
１．６ｋｂのＳａｕ３ＡＩ／ＣａｌＩ ５’−フランキ
ングシ−ケンスおよび３．５ｋｂのＳａｕ３ＡＩ／Ｃａ
ｌＩ ３’−フランキングシ−ケンスを含んでいる。Ｓ
−３８１８−１をＥｃｏＲＩおよびＣｌａＩで消化し、
Ｋｌｅｎｏｗポリメラ−ゼを用いて充填し、脱リン酸し
た。プラスミッドｐＧＺ６２はＥｃｏＲＩおよびＢａｌ
Ｉで消化してＳ１２／ＴｅｔR遺伝子カセットを除去し
たのち、充填した。フラグメントを結さつして、ＰＲＮ
フランキング部位の間に特定のカセットを含むｐＲＹ４
６−１０を得た（図１）。
オチドプロ−ブを用いて、Ｃｈａｒｏｎファ−ジ ペル
ツシス ライブラリ−から１１．３ｋｂのフラグメント
としてク−ロン化した。オリゴヌクレオチドの配列は、
それぞれＡＡＴＧＡＡＣＡＴＧＴＣＴＣＴＧＴＣＡＣＧ
ＣＣＡＴＴＧＴＣＡＡおよびＴＴＣＣＡＣＧＣＧＧＧＣ
ＴＡＣＣＧＧＴＡＣＡＧＣＴＧＧＴＡＡであり、発表さ
れているＰＲＮシ−ケンスの塩基１４４から塩基１７３
および塩基２８４８から塩基２８７７に相当する（Ｃｈ
ａｒｌｅｓら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ
ｉ．８６，３５５４［１９８９］）。Ｓ−３５９６−４
およびＳ−３７７０−４プラスミッドは完全なパ−タク
チン遺伝子部位ＰＲＮの染色体サブク−ロンである（図
４）。Ｓ−３７７０−４をＣａｌＩで消化することによ
り、コ−ド配列の７ｋｂ内部ＣａｌＩ／ＣａｌＩフラグ
メントを除去し、再結さつしてＳ−３８１８−１プラス
ミッドを得た。このｐＵＣプラスミッドはＰＲＮから
１．６ｋｂのＳａｕ３ＡＩ／ＣａｌＩ ５’−フランキ
ングシ−ケンスおよび３．５ｋｂのＳａｕ３ＡＩ／Ｃａ
ｌＩ ３’−フランキングシ−ケンスを含んでいる。Ｓ
−３８１８−１をＥｃｏＲＩおよびＣｌａＩで消化し、
Ｋｌｅｎｏｗポリメラ−ゼを用いて充填し、脱リン酸し
た。プラスミッドｐＧＺ６２はＥｃｏＲＩおよびＢａｌ
Ｉで消化してＳ１２／ＴｅｔR遺伝子カセットを除去し
たのち、充填した。フラグメントを結さつして、ＰＲＮ
フランキング部位の間に特定のカセットを含むｐＲＹ４
６−１０を得た（図１）。
【００４３】直線化したｐＲＹ４６−１０をｓｔｒ２９
株（野性型、ＡＴＣＣ登録番号５３９７２）に導入する
と、ＰＲＮ遺伝子部位を欠く１０９０−１０８−３株が
得られた。サザ−ンブロット分析により、ＰＲＮ遺伝子
カセットがＳ１２／ＴｅｔR遺伝子カセットにより置換
されていることが確認された。パ−タクチン特異性ＥＬ
ＩＳＡを用いた分析で、１０９０−１０８−３株はこの
抗原を生産しないことが確認された。１０９０−１０８
−３株はＡＴＣＣに登録した（登録番号５５１５６）。 実施例１１ 本実施例では、ＰＲＮ遺伝子座に集積したＦＨＡｐＰＲ
Ｎ対立遺伝子の縦列コピー２個を含むボルデテラ・ペル
ツシス１０９１−２９７株の創製について説明する。
株（野性型、ＡＴＣＣ登録番号５３９７２）に導入する
と、ＰＲＮ遺伝子部位を欠く１０９０−１０８−３株が
得られた。サザ−ンブロット分析により、ＰＲＮ遺伝子
カセットがＳ１２／ＴｅｔR遺伝子カセットにより置換
されていることが確認された。パ−タクチン特異性ＥＬ
ＩＳＡを用いた分析で、１０９０−１０８−３株はこの
抗原を生産しないことが確認された。１０９０−１０８
−３株はＡＴＣＣに登録した（登録番号５５１５６）。 実施例１１ 本実施例では、ＰＲＮ遺伝子座に集積したＦＨＡｐＰＲ
Ｎ対立遺伝子の縦列コピー２個を含むボルデテラ・ペル
ツシス１０９１−２９７株の創製について説明する。
【００４４】ＰＲＮの５’−と３’−フランキング部位
ではさまれた２個のＦＨＡｐＰＲＮハイブリッド遺伝子
コピーを含むｐＵＣプラスミッド（Ｓ−４２５８−７）
を構築した。図５にＳ−４２５８−７プラスミッドの構
造を示す。ハイブリッド遺伝子の構造は、ヨ−ロッパ特
許４５３，２１６および米国特許出願６８７，２３１に
詳細に記載されている。簡単に説明すると、Ｓ−３５９
５−９−１プラスミッドは、ＦＨＡ５’−フランキング
部位およびＦＨＡプロモ−タ−部位を含むＦＨＡＢの
５’−部分の染色体サブク−ロンである。Ｓ−３５９５
−１−１プラスミッドはフランキング部位を含むＰＲＮ
遺伝子座の染色体サブク−ロンである。
ではさまれた２個のＦＨＡｐＰＲＮハイブリッド遺伝子
コピーを含むｐＵＣプラスミッド（Ｓ−４２５８−７）
を構築した。図５にＳ−４２５８−７プラスミッドの構
造を示す。ハイブリッド遺伝子の構造は、ヨ−ロッパ特
許４５３，２１６および米国特許出願６８７，２３１に
詳細に記載されている。簡単に説明すると、Ｓ−３５９
５−９−１プラスミッドは、ＦＨＡ５’−フランキング
部位およびＦＨＡプロモ−タ−部位を含むＦＨＡＢの
５’−部分の染色体サブク−ロンである。Ｓ−３５９５
−１−１プラスミッドはフランキング部位を含むＰＲＮ
遺伝子座の染色体サブク−ロンである。
【００４５】Ｓ−３５９５−９−１プラスミッドをＥｃ
ｏＲＩおよびＨｉｎｆＩで消化して、ＦＨＡプロモ−タ
−のほとんど大部分を含む２４０ｂｐのＥｃｏＲＩ／Ｈ
ｉｎｆＩフラグメントを創製した。Ｓ−３５９６−１−
１プラスミッドはＥｃｏＲＩおよびＮｃｏＩで消化し
て、ＰＲＮの３’−フランキング部位の一部とｐＵＣを
含む４ｋｂ断片を得た。９３ｂｐ ＨｉｎｆＩ／Ｎｃｏ
Ｉオリゴヌクレオチドを用いてフラグメントを接続し、
Ｓ−４１１６−７プラスミッドを得た。したがって、こ
のプラスミッドはＦＨＡプロモ−タ−全体とＰＲＮシグ
ナルシ−ケンスのＮｃｏＩ部位までの部分を含んでい
る。Ｓ−３５９６−１−１はＮｃｏＩで消化し、ＰＲＮ
構造遺伝子のほとんどを含む２．２ｋｂフラグメントを
得た。Ｓ−４１１６−７プラスミッドはＮｃｏＩを用い
て直線化し、仔牛アルカリホスファタ−ゼを用いて脱リ
ン酸した。構造遺伝子フラグメントをＦＨＡプロモ−タ
−の後で結さつすることにより、Ｓ−４１３１−９プラ
スミッドを得た。Ｓ−４１３１−９プラスミッドはフラ
ンキング部位を含むＰＲＮ遺伝子座の染色体サブク−ロ
ンである。Ｓ−３７７０−４をＫｐｎＩおよびＥｃｏＲ
Ｉで消化して天然のＰＲＮプロモ−タ−と構造遺伝子の
一部を除去した。Ｓ−４１３１−９プラスミッドＥｃｏ
ＲＩおよびＫｐｎＩで消化し、ＦＨＡプロモ−タ−およ
びＰＲＮ構造遺伝子の５’−半分を含むフラグメントを
Ｓ−３７７０−４ベクタ−フラグメントに結さつしてＳ
−４１４３−１プラスミッドを得た。したがって、この
プラスミッドはＦＨＡｐＰＲＮハイブリッド遺伝子のコ
ピー１個を含んでいる。Ｓ４１４３−１をＢａｍＨＩお
よびＨｉｎｄＩＩＩで消化し、５’−ＰＲＮおよびＦＨ
ＡｐＰＲＮハイブリッド遺伝子を含む５．６ｋｂのフラ
グメントを、ＢａｍＨＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化し
たｐＵＣに挿入し、ＥｃｏＲＩ部位間にハイブリッド遺
伝子を有するプラスミッドＳ−４２５０−１−５を得
た。プラスミッドＳ−４１４３−１はＥｃｏＲで直線化
し、脱リン酸した。Ｓ−４２５０−１はＥｃｏＲＩで消
化し、ハイブリッド遺伝子を遊離させ、Ｓ−４１４３−
１のＥｃｏＲＩ部位に結さつし、反対に向いた２個のハ
イブリッド遺伝子の縦列コピーを有するＳ−４２５８−
７プラスミッドを得た。
ｏＲＩおよびＨｉｎｆＩで消化して、ＦＨＡプロモ−タ
−のほとんど大部分を含む２４０ｂｐのＥｃｏＲＩ／Ｈ
ｉｎｆＩフラグメントを創製した。Ｓ−３５９６−１−
１プラスミッドはＥｃｏＲＩおよびＮｃｏＩで消化し
て、ＰＲＮの３’−フランキング部位の一部とｐＵＣを
含む４ｋｂ断片を得た。９３ｂｐ ＨｉｎｆＩ／Ｎｃｏ
Ｉオリゴヌクレオチドを用いてフラグメントを接続し、
Ｓ−４１１６−７プラスミッドを得た。したがって、こ
のプラスミッドはＦＨＡプロモ−タ−全体とＰＲＮシグ
ナルシ−ケンスのＮｃｏＩ部位までの部分を含んでい
る。Ｓ−３５９６−１−１はＮｃｏＩで消化し、ＰＲＮ
構造遺伝子のほとんどを含む２．２ｋｂフラグメントを
得た。Ｓ−４１１６−７プラスミッドはＮｃｏＩを用い
て直線化し、仔牛アルカリホスファタ−ゼを用いて脱リ
ン酸した。構造遺伝子フラグメントをＦＨＡプロモ−タ
−の後で結さつすることにより、Ｓ−４１３１−９プラ
スミッドを得た。Ｓ−４１３１−９プラスミッドはフラ
ンキング部位を含むＰＲＮ遺伝子座の染色体サブク−ロ
ンである。Ｓ−３７７０−４をＫｐｎＩおよびＥｃｏＲ
Ｉで消化して天然のＰＲＮプロモ−タ−と構造遺伝子の
一部を除去した。Ｓ−４１３１−９プラスミッドＥｃｏ
ＲＩおよびＫｐｎＩで消化し、ＦＨＡプロモ−タ−およ
びＰＲＮ構造遺伝子の５’−半分を含むフラグメントを
Ｓ−３７７０−４ベクタ−フラグメントに結さつしてＳ
−４１４３−１プラスミッドを得た。したがって、この
プラスミッドはＦＨＡｐＰＲＮハイブリッド遺伝子のコ
ピー１個を含んでいる。Ｓ４１４３−１をＢａｍＨＩお
よびＨｉｎｄＩＩＩで消化し、５’−ＰＲＮおよびＦＨ
ＡｐＰＲＮハイブリッド遺伝子を含む５．６ｋｂのフラ
グメントを、ＢａｍＨＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化し
たｐＵＣに挿入し、ＥｃｏＲＩ部位間にハイブリッド遺
伝子を有するプラスミッドＳ−４２５０−１−５を得
た。プラスミッドＳ−４１４３−１はＥｃｏＲで直線化
し、脱リン酸した。Ｓ−４２５０−１はＥｃｏＲＩで消
化し、ハイブリッド遺伝子を遊離させ、Ｓ−４１４３−
１のＥｃｏＲＩ部位に結さつし、反対に向いた２個のハ
イブリッド遺伝子の縦列コピーを有するＳ−４２５８−
７プラスミッドを得た。
【００４６】プラスミッドＳ−４２５８−７を用いて２
段階でＰＲＮ欠失１０９０−１０８−３株の転換を行っ
た。円形プラスミッドＤＮＡのエレクトロポ−レ−ショ
ンを行い、アンピシリンおよびテトラサイクリン耐性に
より選抜した全プラスミッドの挿入を行った。ストレプ
トマイシンを含む培地にこれらの一次転換体をストリ−
クすると、分子間組換えによりＳ１２／ＴｅｔR 遺伝子
カセットがＦＨＡｐＰＲＮハイブリッドで置換されたＳ
ｔｒRコロニ−を得た。このようにして、ＦＨＡｐＰＲ
Ｎハイブリッド遺伝子の２個の縦列コピーを含むボルデ
テラ・ペルツシス１０９１−２９７株を得た。サザ−ン
ブロット分析の結果、図１１に示したように、２個のハ
イブリッド遺伝子がＰＲＮ遺伝子座に正しく位置してい
ることが確認された。液体培地で培養すると、パ−タク
チンの生産速度は野生株と同じであったが、タンパクの
総収率は約２０倍高かった（表３）。 実施例１２ 本実施例では、ペルツシス毒素およびパ−タクチンを過
剰生産するボルデテラ・ペルツシス株の構造について説
明する。
段階でＰＲＮ欠失１０９０−１０８−３株の転換を行っ
た。円形プラスミッドＤＮＡのエレクトロポ−レ−ショ
ンを行い、アンピシリンおよびテトラサイクリン耐性に
より選抜した全プラスミッドの挿入を行った。ストレプ
トマイシンを含む培地にこれらの一次転換体をストリ−
クすると、分子間組換えによりＳ１２／ＴｅｔR 遺伝子
カセットがＦＨＡｐＰＲＮハイブリッドで置換されたＳ
ｔｒRコロニ−を得た。このようにして、ＦＨＡｐＰＲ
Ｎハイブリッド遺伝子の２個の縦列コピーを含むボルデ
テラ・ペルツシス１０９１−２９７株を得た。サザ−ン
ブロット分析の結果、図１１に示したように、２個のハ
イブリッド遺伝子がＰＲＮ遺伝子座に正しく位置してい
ることが確認された。液体培地で培養すると、パ−タク
チンの生産速度は野生株と同じであったが、タンパクの
総収率は約２０倍高かった（表３）。 実施例１２ 本実施例では、ペルツシス毒素およびパ−タクチンを過
剰生産するボルデテラ・ペルツシス株の構造について説
明する。
【００４７】本発明者らは、ヨ−ロッパ特許４５３，２
１６および米国特許出願６８７，２３１で抗原の発現を
改良する手段として，ハイブリッド遺伝子の創製につい
て記載している。上記の実施例１１には、ＦＨＡｐＰＲ
Ｎハイブリッド遺伝子を含むＳ−４１４３−１プラスミ
ッドの構造について記載した。プラスミッドＳ−４１４
３−１を用いてＰＲＮ欠失ボルデテラ・ペルツシス１０
９０−１０８−３株（ＡＴＣＣ登録番号５５１５６）の
転換を行い、ＰＲＮ遺伝子座にＦＨＡｐＰＲＮハイブリ
ッド遺伝子の単一コピーを有する５９１−４７３株（Ａ
ＴＣＣ登録番号５５，３２１）を創製した。上記の実施
例４で記載したように、ボルデテラ・ペルツシス５９１
−４７３株のＴＯＸオペロンを選択性のＳ１２／Ｔｅｔ
Rカセットで置換し、ボルデテラ・ペルツシス８９１−
９８株を得た。上記の実施例７および実施例８に記載し
たように、それぞれＳ−３９８０−９またはＳ−４００
０−５プラスミッドで転換することにより、野生型ＴＯ
Ｘ遺伝子または突然変異ＴＯＸ *遺伝子の縦列コピーを
ＴＯＸ遺伝子座に集積させた。このようにして得られた
ボルデテラ・ペルツシス１０９１−１０７株（ＡＴＣＣ
登録番号５５，３１３）は野生型ＰＴおよびパ−タクチ
ンを過剰生産し、１０９１−３５９株（ＡＴＣＣ登録番
号５５，３１２）はＬｙｓ９ＧＧｌｙ１２９ ＰＴ類縁
体およびパ−タクチンを過剰発現する。図１２および１
３に１０９１−１０７株および１０９１−３５９株を１
０リットルのファ−メンタ−で培養した場合の抗原生産
量を示す。
１６および米国特許出願６８７，２３１で抗原の発現を
改良する手段として，ハイブリッド遺伝子の創製につい
て記載している。上記の実施例１１には、ＦＨＡｐＰＲ
Ｎハイブリッド遺伝子を含むＳ−４１４３−１プラスミ
ッドの構造について記載した。プラスミッドＳ−４１４
３−１を用いてＰＲＮ欠失ボルデテラ・ペルツシス１０
９０−１０８−３株（ＡＴＣＣ登録番号５５１５６）の
転換を行い、ＰＲＮ遺伝子座にＦＨＡｐＰＲＮハイブリ
ッド遺伝子の単一コピーを有する５９１−４７３株（Ａ
ＴＣＣ登録番号５５，３２１）を創製した。上記の実施
例４で記載したように、ボルデテラ・ペルツシス５９１
−４７３株のＴＯＸオペロンを選択性のＳ１２／Ｔｅｔ
Rカセットで置換し、ボルデテラ・ペルツシス８９１−
９８株を得た。上記の実施例７および実施例８に記載し
たように、それぞれＳ−３９８０−９またはＳ−４００
０−５プラスミッドで転換することにより、野生型ＴＯ
Ｘ遺伝子または突然変異ＴＯＸ *遺伝子の縦列コピーを
ＴＯＸ遺伝子座に集積させた。このようにして得られた
ボルデテラ・ペルツシス１０９１−１０７株（ＡＴＣＣ
登録番号５５，３１３）は野生型ＰＴおよびパ−タクチ
ンを過剰生産し、１０９１−３５９株（ＡＴＣＣ登録番
号５５，３１２）はＬｙｓ９ＧＧｌｙ１２９ ＰＴ類縁
体およびパ−タクチンを過剰発現する。図１２および１
３に１０９１−１０７株および１０９１−３５９株を１
０リットルのファ−メンタ−で培養した場合の抗原生産
量を示す。
【００４８】ＴＯＸオペロンの改良が効果的であること
を実証する例として、表１（Ａ）、（Ｂ）に数種のボル
デテラ・ペルツシス株によるＰＴおよびＦＨＡ生産の詳
細を示す。複数の遺伝子コピーが存在することにより、
抗原の生産が効果的に行われることがこれらのデ−タか
ら明らかでである（実施例７および実施例８を参照）。
表１においては、菌株は野生型ＴＯＸオペロンまたはＴ
ＯＸまたはＦＨＡ遺伝子座に位置する遺伝学的に無毒化
したＬｙｓ９Ｇｌｙ１２９対立形質を含む。菌株は表１
（Ａ）においては１０ｍｌの振とうフラスコで、表１
（Ｂ）においては１０リットルのバイオリアクターで培
養した。培養上清中の抗原は該抗原に特異的なＥＬＩＳ
Ａによって定量した。
を実証する例として、表１（Ａ）、（Ｂ）に数種のボル
デテラ・ペルツシス株によるＰＴおよびＦＨＡ生産の詳
細を示す。複数の遺伝子コピーが存在することにより、
抗原の生産が効果的に行われることがこれらのデ−タか
ら明らかでである（実施例７および実施例８を参照）。
表１においては、菌株は野生型ＴＯＸオペロンまたはＴ
ＯＸまたはＦＨＡ遺伝子座に位置する遺伝学的に無毒化
したＬｙｓ９Ｇｌｙ１２９対立形質を含む。菌株は表１
（Ａ）においては１０ｍｌの振とうフラスコで、表１
（Ｂ）においては１０リットルのバイオリアクターで培
養した。培養上清中の抗原は該抗原に特異的なＥＬＩＳ
Ａによって定量した。
【００４９】
【表１】
【００５０】
【表２】 数種のボルデテラ・ペルツシス菌株について、生物学的
特性の詳細を表２に示す。すなわち、ＰＴを過剰に生産
するボルデテラ・ペルツシス菌株から得られたＰＴアナ
ログの生物学的特性を調べた。
特性の詳細を表２に示す。すなわち、ＰＴを過剰に生産
するボルデテラ・ペルツシス菌株から得られたＰＴアナ
ログの生物学的特性を調べた。
【００５１】
【表３】 ＰＲＮオペロンの改良が効果的であったことを実証する
ために、数種のボルデテラ・ペルツシス株について、Ｐ
ＴおよびＦＨＡ生産の詳細を表３に示す。すなわち、Ｐ
ＲＮ遺伝子座にハイブリッドＰＲＮ対立形質の１または
２個のコピーを含むボルデテラ・ペルツシス菌株による
ＰＴ、ＦＨＡ及びペルタクチンの生産を調べた。これら
のデ−タから、複数のハイブリッド遺伝子が存在するこ
とによって、抗原の生産が効果的に行われることが明ら
かである（実施例１１参照）。菌株は１０ｍｌの振とう
フラスコで培養した。培養上清中の抗原のレベルは該抗
原に特異的なＥＬＩＳＡによって定量した。
ために、数種のボルデテラ・ペルツシス株について、Ｐ
ＴおよびＦＨＡ生産の詳細を表３に示す。すなわち、Ｐ
ＲＮ遺伝子座にハイブリッドＰＲＮ対立形質の１または
２個のコピーを含むボルデテラ・ペルツシス菌株による
ＰＴ、ＦＨＡ及びペルタクチンの生産を調べた。これら
のデ−タから、複数のハイブリッド遺伝子が存在するこ
とによって、抗原の生産が効果的に行われることが明ら
かである（実施例１１参照）。菌株は１０ｍｌの振とう
フラスコで培養した。培養上清中の抗原のレベルは該抗
原に特異的なＥＬＩＳＡによって定量した。
【００５２】
【表４】 ここに記載したコピー数の異なるボルデテラ菌株の創製
に使用したプラスミッドを図１〜５示す。図２、３、４
および５にそれらの構造を示す。ｐＧＺ７１は、米国特
許５，０８５，８６２に記載されているように、ＦＨＡ
遺伝子フランキング部位の間にはさまれた大腸菌Ｓ１２
およびテトラサイクリン耐性遺伝子カセットを含んでい
る。プラスミッドＳ−３７４１−２（ＡＴＣＣ登録番号
７５０３１）は、５’−と３’−ＦＨＡ遺伝子フランキ
ング部位の間にはさまれたＴＯＸ遺伝子の単一コピーを
含んでいる。プラスミッドＳ−３８２２−１０はＦＨＡ
フランキング部位の間にはさまれ、Ｌｙｓ９Ｇｌｙ１２
９ ＰＴ類縁体をコード化した突然変異ＴＯＸオペロン
（ＴＯＸ*）の縦列コピーを含んでいる。プラスミッド
Ｓ−３９８０−９およびＳ−４０００−５は、５’と
３’ＴＯＸフランキング部位の間に、それぞれＴＯＸま
たはＴＯＸ *の縦列コピーを含んでいる。
に使用したプラスミッドを図１〜５示す。図２、３、４
および５にそれらの構造を示す。ｐＧＺ７１は、米国特
許５，０８５，８６２に記載されているように、ＦＨＡ
遺伝子フランキング部位の間にはさまれた大腸菌Ｓ１２
およびテトラサイクリン耐性遺伝子カセットを含んでい
る。プラスミッドＳ−３７４１−２（ＡＴＣＣ登録番号
７５０３１）は、５’−と３’−ＦＨＡ遺伝子フランキ
ング部位の間にはさまれたＴＯＸ遺伝子の単一コピーを
含んでいる。プラスミッドＳ−３８２２−１０はＦＨＡ
フランキング部位の間にはさまれ、Ｌｙｓ９Ｇｌｙ１２
９ ＰＴ類縁体をコード化した突然変異ＴＯＸオペロン
（ＴＯＸ*）の縦列コピーを含んでいる。プラスミッド
Ｓ−３９８０−９およびＳ−４０００−５は、５’と
３’ＴＯＸフランキング部位の間に、それぞれＴＯＸま
たはＴＯＸ *の縦列コピーを含んでいる。
【００５３】プラスミッドｐＲＹ４６−１０は、５’と
３’ＰＲＮフランキング部位の間にＳ１２／ＴｅｔRカ
セットを含んでいる。パータクチンの生産量を増加させ
るため、ヨーロッパ特許出願番号４５３，２１６に記載
されているように、天然のプロモーターをＦＨＡプロモ
ーターで置換し、ハイブリッド遺伝子ＦＨＡｐＰＲＮを
得た。プラスミッドＳ−４２５８−７はＦＨＡｐＰＲＮ
ハイブリッド遺伝子の縦列コピーを含んでいる。
３’ＰＲＮフランキング部位の間にＳ１２／ＴｅｔRカ
セットを含んでいる。パータクチンの生産量を増加させ
るため、ヨーロッパ特許出願番号４５３，２１６に記載
されているように、天然のプロモーターをＦＨＡプロモ
ーターで置換し、ハイブリッド遺伝子ＦＨＡｐＰＲＮを
得た。プラスミッドＳ−４２５８−７はＦＨＡｐＰＲＮ
ハイブリッド遺伝子の縦列コピーを含んでいる。
【００５４】図２は実施例４および５に記載したプラス
ミッドｐＧＺ７１およびＳ−３７４１−２の構造を示し
ている。図３は実施例６および７に記載したプラスミッ
ドＳ−３８２２−１０およびＳ−４０００−５の構造を
示している。図４は実施例１０に記載したプラスミッド
ｐＲＹ４６−１０の構造を示している。図５は実施例１
１に記載したプラスミッドＳ−４２５８−７の構造を示
す。制限酵素による分解部位は、Ｂ、ＢａｍＨＩ；Ｂａ
ｌ、ＢａｌＩ;Ｂｇ、ＢｇｌＩＩ; Ｃ、ＣｌａＩ;Ｈ、Ｈ
ｉｎｄＩＩＩ；Ｋ、ＫｐｎＩ;Ｎｃｏ、ＮｃｏＩ;Ｒ、Ｅ
ｃｏＲＩ; Ｓ、ＳａｌＩ;Ｓｍ、ＳｍａＩ;およびＳｕ、
Ｓａｕ３Ａである。
ミッドｐＧＺ７１およびＳ−３７４１−２の構造を示し
ている。図３は実施例６および７に記載したプラスミッ
ドＳ−３８２２−１０およびＳ−４０００−５の構造を
示している。図４は実施例１０に記載したプラスミッド
ｐＲＹ４６−１０の構造を示している。図５は実施例１
１に記載したプラスミッドＳ−４２５８−７の構造を示
す。制限酵素による分解部位は、Ｂ、ＢａｍＨＩ；Ｂａ
ｌ、ＢａｌＩ;Ｂｇ、ＢｇｌＩＩ; Ｃ、ＣｌａＩ;Ｈ、Ｈ
ｉｎｄＩＩＩ；Ｋ、ＫｐｎＩ;Ｎｃｏ、ＮｃｏＩ;Ｒ、Ｅ
ｃｏＲＩ; Ｓ、ＳａｌＩ;Ｓｍ、ＳｍａＩ;およびＳｕ、
Ｓａｕ３Ａである。
【００５５】図６はボルデテラ・ペルツシス１０５３
６、９８９−５６、１９１−１３４および８９０−３９
３株のＴＯＸおよびＦＨＡ遺伝子座に存在する遺伝子の
模式図およびサザーンブロット分析の結果を示す。Ｌａ
ｎｅ １は親株の野生型（ｗｔ）１０５３６株；Ｌａｎ
ｅ ２はＴＯＸ * コピー１個を有する９８９−５６株；
Ｌａｎｅ ３はＴＯＸ遺伝子座にＴＯＸ * の縦列コピー
を有する１９１−１３４株；Ｌａｎｅ ４はＴＯＸ遺伝
子座に１個およびＦＨＡ遺伝子座に縦列コピー、計３個
のＴＯＸ * を有する８９０−３９３株である。ＤＮＡは
ＢｇｌＩＩおよびＣｌａＩで消化し、完全なＴＯＸオペ
ロンを有するＴＯＸ特異性ＤＮＡフラグメントで実証し
た。野生型のパターンに重なるように新しいＴＯＸ特異
性ハイブリッドフラグメントがみられることから、さら
にＴＯＸオペロンが集積していることが判る。制限分解
部位は、Ｂｇ、ＢｇｌＩＩ;Ｃ,ＣｌａＩ;およびＲ、Ｅ
ｃｏＲＩである。
６、９８９−５６、１９１−１３４および８９０−３９
３株のＴＯＸおよびＦＨＡ遺伝子座に存在する遺伝子の
模式図およびサザーンブロット分析の結果を示す。Ｌａ
ｎｅ １は親株の野生型（ｗｔ）１０５３６株；Ｌａｎ
ｅ ２はＴＯＸ * コピー１個を有する９８９−５６株；
Ｌａｎｅ ３はＴＯＸ遺伝子座にＴＯＸ * の縦列コピー
を有する１９１−１３４株；Ｌａｎｅ ４はＴＯＸ遺伝
子座に１個およびＦＨＡ遺伝子座に縦列コピー、計３個
のＴＯＸ * を有する８９０−３９３株である。ＤＮＡは
ＢｇｌＩＩおよびＣｌａＩで消化し、完全なＴＯＸオペ
ロンを有するＴＯＸ特異性ＤＮＡフラグメントで実証し
た。野生型のパターンに重なるように新しいＴＯＸ特異
性ハイブリッドフラグメントがみられることから、さら
にＴＯＸオペロンが集積していることが判る。制限分解
部位は、Ｂｇ、ＢｇｌＩＩ;Ｃ,ＣｌａＩ;およびＲ、Ｅ
ｃｏＲＩである。
【００５６】図７は、１０リットルのバイオリアクタ−
を用いた場合の１０５３６株（ｗｔ）および８９０−３
９３株（３ ＴＯＸ * ）によるＰＴおよびＰＴ類縁体の
発現速度を示す。
を用いた場合の１０５３６株（ｗｔ）および８９０−３
９３株（３ ＴＯＸ * ）によるＰＴおよびＰＴ類縁体の
発現速度を示す。
【００５７】図８は、９８９−５６株（ＴＯＸ * ）およ
び８９０−３９３株（３ ＴＯＸ *）の培地上清から精
製したペルツシス毒素類縁体（Ｓ１Ｌｙｓ９Ｇｌｙ１２
９）が構造的に異なることを示す逆相ＨＰＬＣおよびＳ
ＤＳ−ＰＡＧＥによる分析結果の比較を示す。
び８９０−３９３株（３ ＴＯＸ *）の培地上清から精
製したペルツシス毒素類縁体（Ｓ１Ｌｙｓ９Ｇｌｙ１２
９）が構造的に異なることを示す逆相ＨＰＬＣおよびＳ
ＤＳ−ＰＡＧＥによる分析結果の比較を示す。
【００５８】図９は、１０リットルの培養槽で培養した
場合の１０５３６株のＰＴ発現に及ぼすヘプタキス
（２，６−ｏ−ジメチル）β−シクロデキストリンの影
響を示す。図１０は、１０リットルの培養槽で培養した
場合の１１９０−７４（２ ＴＯＸ）株に及ぼすβ−シ
クロデキストリンの影響を示す。
場合の１０５３６株のＰＴ発現に及ぼすヘプタキス
（２，６−ｏ−ジメチル）β−シクロデキストリンの影
響を示す。図１０は、１０リットルの培養槽で培養した
場合の１１９０−７４（２ ＴＯＸ）株に及ぼすβ−シ
クロデキストリンの影響を示す。
【００５９】図１１は、ＰＲＮ遺伝子座およびＦＨＡｐ
ＰＲＮハイブリッド遺伝子の模式図およびボルデテラ・
ペルツシス１０５３６、１０９０−１０８−３、５９１
−４７３および１０９１−２９７株のサザ−ンブロット
分析の結果を示す。Ｌａｎｅ１および３はそれぞれＤｄ
ｅ ＩおよびＳａｌＩで消化した野生型親株の１０５３
６株；Ｌａｎｅ ２および５はＤｄｅＩおよびＳａｌＩ
で消化したＦＨＡｐＰＲＮ遺伝子の１個のコピーを含む
５９１−４７３株；Ｌａｎｅ ４はＳａｌＩで消化した
Ｓ１２／ＴｅｔRカセットを含む１０９０−１０８−３
株；Ｌａｎｅ ６はＳａｌＩで消化したＦＨＡｐＰＲＮ
ハイブリッド遺伝子のコピーを２個含む１０９１−２９
７株である。制限分解ＤＮＡは完全なＰＲＮ遺伝子を含
むＰＲＮ特異性ＤＮＡフラグメントで実証した。野生型
のパターンに重なるように新しいＰＲＮ特異性ハイブリ
ッドフラグメントがみられることから、ＦＨＡｐＰＲＮ
ハイブリッド遺伝子が集積していることが判る。制限分
解部位は、Ａ、Ａｐａ Ｉ;Ｃ、ＣｌａＩ;Ｄ、Ｄｄｅ;お
よびＳ、ＳａｌＩである。
ＰＲＮハイブリッド遺伝子の模式図およびボルデテラ・
ペルツシス１０５３６、１０９０−１０８−３、５９１
−４７３および１０９１−２９７株のサザ−ンブロット
分析の結果を示す。Ｌａｎｅ１および３はそれぞれＤｄ
ｅ ＩおよびＳａｌＩで消化した野生型親株の１０５３
６株；Ｌａｎｅ ２および５はＤｄｅＩおよびＳａｌＩ
で消化したＦＨＡｐＰＲＮ遺伝子の１個のコピーを含む
５９１−４７３株；Ｌａｎｅ ４はＳａｌＩで消化した
Ｓ１２／ＴｅｔRカセットを含む１０９０−１０８−３
株；Ｌａｎｅ ６はＳａｌＩで消化したＦＨＡｐＰＲＮ
ハイブリッド遺伝子のコピーを２個含む１０９１−２９
７株である。制限分解ＤＮＡは完全なＰＲＮ遺伝子を含
むＰＲＮ特異性ＤＮＡフラグメントで実証した。野生型
のパターンに重なるように新しいＰＲＮ特異性ハイブリ
ッドフラグメントがみられることから、ＦＨＡｐＰＲＮ
ハイブリッド遺伝子が集積していることが判る。制限分
解部位は、Ａ、Ａｐａ Ｉ;Ｃ、ＣｌａＩ;Ｄ、Ｄｄｅ;お
よびＳ、ＳａｌＩである。
【００６０】図１２は、１０リットルのバイオリアクタ
−を用いた場合のボルデテラ・ペルツシス１０９１−１
０７株の抗原発現速度を示す。１０９１−１０７株はＴ
ＯＸ遺伝子座に集積した２個の野生型ＴＯＸオペロンと
ＰＲＮ遺伝子座に集積した１個のＦＨＡｐＰＲＮハイブ
リッド遺伝子のコピーを含む。図１３は、１０リットル
のバイオリアクタ−を用いた場合のボルデテラ・ペルツ
シス１０９１−３５９株の抗原発現速度を示す。１０９
１−３５９株はＴＯＸ遺伝子座にＬｙｓ９Ｇｌｙ１２９
ＰＴ類縁体をコード化している２個のＴＯＸオペロン
コピーとＰＲＮ遺伝子座に集積しているＦＨＡｐＰＲＮ
ハイブリッド遺伝子１個のコピーを含んでいる。
−を用いた場合のボルデテラ・ペルツシス１０９１−１
０７株の抗原発現速度を示す。１０９１−１０７株はＴ
ＯＸ遺伝子座に集積した２個の野生型ＴＯＸオペロンと
ＰＲＮ遺伝子座に集積した１個のＦＨＡｐＰＲＮハイブ
リッド遺伝子のコピーを含む。図１３は、１０リットル
のバイオリアクタ−を用いた場合のボルデテラ・ペルツ
シス１０９１−３５９株の抗原発現速度を示す。１０９
１−３５９株はＴＯＸ遺伝子座にＬｙｓ９Ｇｌｙ１２９
ＰＴ類縁体をコード化している２個のＴＯＸオペロン
コピーとＰＲＮ遺伝子座に集積しているＦＨＡｐＰＲＮ
ハイブリッド遺伝子１個のコピーを含んでいる。
【図１】コピー数の異なる菌株の創製に使用したプラス
ミッドの構築過程を示す図である。
ミッドの構築過程を示す図である。
【図２】ｐＧＺ７１およびＳ−３７４１−２の構築過程
を示す図である。
を示す図である。
【図３】Ｓ−３８２２−１０およびＳ−４０００−５の
構築過程を示す図である。
構築過程を示す図である。
【図４】ｐＲＹ４６−１０の構築過程を示す図である。
【図５】Ｓ−４２５８−７の構築過程を示す図である。
【図６】複数ＴＯＸコピーを有する株のサザ−ンブロッ
ト分析の結果を示す図である。
ト分析の結果を示す図である。
【図７】ＰＴの過剰生産速度を示すグラフである。
【図８】ＴＯＸ単一コピーおよびコピー数３の株により
生産されたＬｙｓ９Ｇｌｙ１２９の逆相ＨＰＬＣおよび
ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分析結果の比較を示す図であ
る。
生産されたＬｙｓ９Ｇｌｙ１２９の逆相ＨＰＬＣおよび
ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分析結果の比較を示す図であ
る。
【図９】ボルデテラ・ペルツシス１０５３６（ｗｔ）株
によるＰＴ生産に及ぼすβ−シクロデキストリンの影響
を示すグラフである。
によるＰＴ生産に及ぼすβ−シクロデキストリンの影響
を示すグラフである。
【図１０】ボルデテラ・ペルツシス１１９０−７４（２
ＴＯＸ ｗｔＦＨＡ+）株の抗原生産に及ぼすシクロ
デキストリンの影響を示すグラフである。
ＴＯＸ ｗｔＦＨＡ+）株の抗原生産に及ぼすシクロ
デキストリンの影響を示すグラフである。
【図１１】複数ＰＲＮ遺伝子を有する菌株のサザーンブ
ロット分析を示す図である。
ロット分析を示す図である。
【図１２】ボルデテラ・ペルツシス１０９１−１０７
（２ＴＯＸｗｔ ＦＨＡｐＰＲＮ）株の抗原生産速度を
示すグラフである。
（２ＴＯＸｗｔ ＦＨＡｐＰＲＮ）株の抗原生産速度を
示すグラフである。
【図１３】ボルデテラ・ペルツシス１０９１−３５９
（２ＴＯＸＬｙｓ９Ｇｌｙ１２９ＦＨＡｐＰＲＮ）株の
抗原生産速度を示すグラフである。
（２ＴＯＸＬｙｓ９Ｇｌｙ１２９ＦＨＡｐＰＲＮ）株の
抗原生産速度を示すグラフである。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｒ 1:01） (72)発明者 ガヴィン ズィーリー カナダ国 エル４ジェイ ６エイチ７ オ ンタリオ州 ソーンヒル チャールトン アヴェニュー 348 (72)発明者 レイザー ヤコーブ カナダ国 エル５エイ ２エス１ オンタ リオ州 ミシソーガ オールド フィーサ ント ロード 2354 (72)発明者 マイケル クライン カナダ国 エム２ピー １ビー９ オンタ リオ州 ウィロウダール マンロー ブー ルヴァード 16
Claims (4)
- 【請求項１】 ゲノムからＦＨＡ遺伝子が欠失してお
り、かつ遺伝子的に無毒化された変異ＴＯＸ*遺伝子を
有することを特徴とする遺伝子的に改変されたボルデテ
ラ菌株。 - 【請求項２】 前記遺伝子的に無毒化された変異ＴＯＸ
*遺伝子が、ペルツシス毒素のＳ１サブユニットにおい
てＧｌｕ１２９→Ｇｌｙ１２９及びＡｒｇ９→Ｌｙｓ９
の変異を有するペルツシス毒素アナログをコ−ドしてい
る請求項１に記載のボルデテラ菌株。 - 【請求項３】 ボルデテラ・ペルツシス ４９０−３２
４株である請求項１に記載のボルデテラ菌株。 - 【請求項４】 ＦＨＡプロモーターによって制御される
ＰＲＮ構造遺伝子を有するハイブリッド遺伝子のコピー
を１つ有することを特徴とするボルデテラ・ペルツシス
５９１−４７３株（ＡＴＣＣ ５５３２１）。
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Cited By (2)
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|---|---|---|---|---|
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