JPH07194396A - 分析物の化学ルミネセンス検出のための乾式分析要素、試験デバイス、試験キットおよび方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】 ペルオキシダーゼの反応で発生した化学ルミ
ネセンス信号を検出するために使用でき、そして化学ル
ミネセンス検出系に使用できる取り外し可能な乾式分析
要素を提供する。 【構成】 前記分析要素は、少なくとも２つの層を有す
る。外側の層は不粘着性でありかつ水溶性もしくは透水
性であり、複数の分析物が存在するゲル・プレートもし
くはトランスブロッティング膜を接触せしめるために使
用される。得られた信号は、感光要素を用いて記録でき
る。試験キットは、分析物の検出に分析要素を使用する
のに必要とされる種々の包装された構成要素を含む。要
素の内部には、高感度で分析物を検出するために、臨界
量のオキシダーゼおよびオキシダーゼ基質が存在する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、臨床分析、または生物
学的もしくは生物医学的研究のための取り外し可能な乾
式分析要素および試験キットを用いた分析物の測定に関
する。詳細には、化学ルミネセンス試薬系を用いたペル
オキシダーゼ標識分析物を検出するための、取り外し可
能な乾式分析要素、試験デバイス、試験キットおよび検
出方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】種々の分析方法が、被検体中に存在する
異なる分子種の分離および同定について発展してきた。
分離は、一般的には、被検体を水含有固形媒体に塗布
し、そして媒体内で種の分子分離を誘導することにより
達成される。特に、クロマトグラフィーおよび電気泳動
が使用されてきた。これらは両方とも異なる分子種の分
離ができる。そのような方法では、分析物の分離もしく
は同定を助けるために分離工程の前に、その間にまたは
その後に、また被検体中の１つ以上の分析物と相互作用
する種々の試薬を媒体に適用してもよい。標識試薬（例
えば、標識プローブもしくは抗体）での分析物の検出
は、研究および臨床実験室で常用される方法である。磁
気粒子類、放射性同位体類および酵素類を包含する種々
の標識が使用されてきた。西洋ワサビペルオキシダーゼ
は最もよく常用される標識の１つである。ペルオキシダ
ーゼで標識された複数の分析物に応じて比色信号を発生
するのに有用な透明で取り外し可能な要素が、米国特許
第 5,047,322号明細書に記載されている。

【０００３】これらの要素が、標識として放射性同位体
類もしくは磁気粒子類の使用を越える多くの利点を提供
してきたとはいえ、感度のさらなる改良および発生した
信号（signal）の永久不変な記録を提供するための手段
についての要望が存在する。比色信号の使用は、即時的
評価には適するかもしれないが、色素は色があせてしま
い比較的永久不変な記録の形成を妨げがちである。化学
ルミネセンス・アッセイ系は高感度であるが、この系は
幾つかの欠点を有すると信じられている。それらは、酵
素反応を促進するため、湿式化学試薬の使用を必要とす
る。湿式化学は、試薬の希釈も必要とし、それによって
アッセイの感度は低減し、そして危険な化学薬品を取り
扱う可能性が存在する。

【０００４】米国特許第 4,231,754号明細書には、例え
ば、層の間でpH勾配が生じるように、それぞれ分離され
た複数の試薬層を有する化学ルミネセンス分析デバイス
が記載されている。このようなことが行われるのは、特
定の試薬が比較的低いpHで安定であり、一方化学ルミネ
センス信号を効果的に発生するためにはpH８を越えるpH
が望ましいからである。所定の緩衝剤を使用することな
く、流体試料もしくは湿式ブロット膜がデバイスに適用
される場合には、層を異なるpH値に維持することは非常
に難しい。しかしながら、そのような所定の試薬を有す
ると、特定のバインダーのみしかデバイスに使用できな
いために、デバイスの有用性は制限される。この特許に
記載されたデバイスが実際に役立つとは信じられていな
かった。つい最近では、米国特許第 4,808,529号明細書
に、酵素が適当な反応性基を有する多孔質膜に直接付着
せしめられた試験デバイスが記載されている。信号は、
反応が実施される試験デバイス自体の中ではなく、トラ
ンスブロッティング膜に移動される。

【０００５】

【発明が解決しようとする課題】乾式分析要素が複数の
分析物由来の化学ルミネセンス信号を提供するように設
計すべきであると考えられてきた。また、信号はそれほ
ど長期間存続する訳ではないので、そのような信号が永
久不変的な形で記録できることが望まれるだろう。さら
に、１回以上使用されるような、ペルオキシダーゼ標識
ゲル・プレートもしくはトランスブロッティング膜に応
じて、化学ルミネセンス信号を発生するであろう不粘着
性で取り外し可能な要素を得ることは望ましい。「不粘
着性」とは、要素がゲル・プレートもしくはトランスブ
ロッティング膜に固着しないこと、そしてそれ故に損傷
を与えることなくゲル・プレートもしくはトランスブロ
ッティング膜から容易に取り外すことができることを意
味する。また、長期保存について安定な試薬を有し、消
費者が使用し易くかつ試薬の処方を全く必要としない要
素を得ることも望ましいだろう。

【０００６】

【課題を解決するための手段】前記課題は、透明な非孔
質支持体の上に、順に、pH7.5 〜11に緩衝化されそして
１つ以上の親水性バインダーを含む、１つ以上の試薬
層、および不粘着性で水溶性もしくは透水性のカバー
層、を配置した支持体を含む取り外し可能な（removabl
e ）乾式分析要素であって、前記要素は、さらに、
（ａ）化学ルミネセンス組成物（chemiluminescent com
position）、（ｂ）化学ルミネセンス組成物の増強剤
（enhancer）、（ｃ）化学ルミネセンス組成物のミセル
形成性材料（micelle forming material）、（ｄ） 300
〜40,000I.U./m² のオキシダーゼ、および（ｅ）少なく
とも１g/m²のオキシダーゼの基質、を含み、前記成分
（ａ）〜（ｅ）は、オキシダーゼおよびオキシダーゼの
基質が別個の層にあることを条件として、いずれかの層
に配置されている、取り外し可能な乾式分析要素により
解決された。

【０００７】好ましい態様は、透明な非孔質支持体の上
に、順に、すべて親水性バインダー中に配置された、化
学ルミネセンス組成物、化学ルミネセンス組成物の増強
剤、化学ルミネセンス組成物のミセル形成性材料、pH7.
5〜11に緩衝化するための緩衝剤、および 300〜40,000
I.U./m² のオキシダーゼを含む試薬層、ならびに0.2〜
5.5 g/m²の水溶性もしくは透水性フィルム形成性ポリマ
ーに分散せしめた１〜20g/m²のオキシダーゼの基質を含
む、不粘着性で水溶性もしくは透水性のカバー層、を配
置した支持体を含む取り外し可能な乾式分析要素であ
る。

【０００８】また、本発明は、 ａ）前記取り外し可能な乾式分析要素のうちのいずれか
の要素、および ｂ）分析要素で発生した化学ルミネセンス信号を受信す
るように構成され、分析要素と物理的に関連している感
光要素、 を含んでなる試験デバイスを提供する。

【０００９】さらに、本発明は、１つ以上の分析物の測
定方法であって、 Ａ）ペルオキシダーゼで標識された１つ以上の分析物を
含むゲル・プレートもしくはトランスブロッティング膜
（transblotting membrane）を、前記取り外し可能な乾
式分析要素のうちのいずれかの要素の上に被覆すること
により一時的な積層体を形成して、ゲル・プレートもし
くはトランスブロッティング膜中のペルオキシダーゼ標
識分析物に応じて分析要素中で化学ルミネセンス信号を
発生させる工程、そして Ｂ）発生した化学ルミネセンス信号を検出する工程、を
含んでなる、１つ以上の分析物の測定方法を提供する。

【００１０】さらに、１つ以上の分析物の測定を記録す
る方法は、 Ａ）ペルオキシダーゼで標識された１つ以上の分析物を
含むゲル・プレートもしくはトランスブロッティング膜
を、前記取り外し可能な乾式分析要素のうちのいずれか
の要素の上に被覆することにより一時的な積層体を形成
して、ゲル・プレートもしくはトランスブロッティング
膜中のペルオキシダーゼ標識分析物に応じて分析要素中
で化学ルミネセンス信号を発生させる工程、 Ｂ）乾式分析要素中で発生した化学ルミネセンス信号に
対して感光要素を露光して、潜像を形成させる工程、そ
して Ｃ）露光された感光要素の潜像由来の化学ルミネセンス
信号の永久不変な記録を生成する工程、を含んでなる。

【００１１】さらに、１つ以上の分析物を測定するため
の試験キットは、 ａ）前記取り外し可能な乾式分析要素のうちのいずれか
の要素、ならびに ｂ）下記 ｉ）トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンおよび無
機酸の塩を含む緩衝溶液、 ii） 0.5〜５重量％のカゼインを含む緩衝化遮断性溶
液、 iii)ペルオキシダーゼ標識特異的バインディング試薬、 iv）ペルオキシダーゼで直接的または間接的に標識され
たオリゴヌクレオチド、 ｖ）トランスブロッティング膜、 vi）ゲル・プレート、および vii)感光要素、からなる群より選ばれる１つ以上の別個
に包装された成分、を含んでなる。

【００１２】

【具体的な態様】本発明は、医学、免疫学、分子生物
学、生化学、臨床化学およびあまりに多すぎて記載でき
ない別の分野を包含する種々の分野における努力活動に
利用できる。タンパク質、核酸、そのままの細胞（もし
くはそれらの成分）および直接的にまたは間接的にペル
オキシダーゼで標識できる別の生物学的分析物が、本発
明を用いて測定できる。さらに、本発明を用いて、過酸
化性物質（peroxidative substance）、例えば、ペルオ
キシダーゼを測定できる。詳細には、本発明は、電気的
に誘導されて水性媒体を介して移動し、そして分子の電
荷に基づいて互いに分離した、タンパク質もしくは核酸
を検出するのに有用である。さらにまた、それは、誘導
されて親水性媒体を介して移動し、そして分子量、等電
点もしくは両方に基づいて互いに分離した、タンパク質
もしくは核酸を検出するのに有用である。

【００１３】分析要素の使用は、化学ルミネセンス信号
を発生する種々の試薬の拡散性により、極めて簡単であ
る。要素のカバー層を湿ったゲル・プレートもしくはト
ランスブロッティング膜と接触するように置くと、試薬
の拡散ならびに化学反応および酵素反応が起こる。オキ
シダーゼもしくはその基質は、それらが互いに遭遇する
まで要素内に拡散し、そして反応して過酸化水素を生成
する。この酸化体および増強剤は要素からゲル・プレー
トもしくは膜の中へ拡散し、ここで分析物上のペルオキ
シダーゼ標識が過酸化水素の解離を触媒する。過酸化物
由来の活性酸素は、増強剤の存在下、化学ルミネセンス
組成物（例えば、ルミノール）と反応して、光を放射さ
せる。この信号の位置およびレベルは、標識分析物の存
在もしくは量の測度として記録できる。これらの重要な
反応すべてが必要であるため、オキシダーゼ基質および
増強剤は要素内で非常に移動し易いことが重要である。

【００１４】この出願に関しては、「タンパク質」に
は、ペプチド類、ポリペプチド類、酵素類、リポタンパ
ク質類、糖タンパク質類、および別のタンパク質類、な
らびにそれらの断片もしくは遺伝子工学構造物が包含さ
れる。「核酸」とは、一本鎖および二本鎖核酸の両方な
らびにそれらの成分を意味する。多数のそのような分析
物が通常試験しようとする生物学的被検体中に存在す
る。一般的には、本発明の一態様では、既知方法、試薬
および緩衝液を用いて、そのような被検体を電気泳動プ
レートもしくは電気集束プレートと接触させ、そこで分
析物を誘導して電気的に移動させる。一旦プレート中で
分離すると、分析物は直接的にまたは間接的にペルオキ
シダーゼで標識でき（下記）、次いで本発明の要素をプ
レートと積層して化学ルミネセンス信号を発生させるこ
とができる。そのような信号は、化学ルミネセンス信号
が感光層もしくは感光要素に潜像を形成するような、適
当な方法で化学ルミネセンス信号に対して露光される適
当な感光層もしくは感光要素により記録することもでき
る。例えば、感光要素を、本発明の要素と接触するよう
に置くことができ、または単に周囲の光から感光要素を
保護する適当なカセットに近接して置くこともできる。
別の態様では、化学ルミネセンス信号は、カメラもしく
は適当な写真フィルムを含有する別の光学デバイスを用
いて記録することができる。

【００１５】有用な電気泳動プレートもしくは電気集束
プレートは周知であり、そしてそれらの多くは幾つかの
販売元から市販されている。別のものが、米国特許第
3,975,162号および同第 5,047,322号明細書に記載され
ている。別の態様では、当該技術分野で周知であるウェ
スタン、サザン、ノーザン、スロット、サーマル、リフ
トおよびドット・ブロッティング法に有用であるトラン
スブロッティング膜に、被検体を塗布または移動でき
る。前記のように、分離された分析物がペルオキシダー
ゼで適当に標識でき、そして本発明の分析要素をトラン
スブロッティング膜と積層することにより検出できる。
従って、発生した化学ルミネセンス信号を、記録するこ
ともできる。

【００１６】本発明の要素は、透明な非孔質支持体の上
に複数の層を配置している。別の層の付着性を改良する
ために、従来の材料の透明な下塗り層を支持体に塗布し
てもよい。１つ以上の層に、ペルオキシダーゼの存在下
で、酸化体、例えば、過酸化水素、過酸化尿素もしくは
過ホウ酸ナトリウムの反応に応じて化学ルミネセンス信
号を発生できる化学ルミネセンス組成物が存在する。化
学ルミネセンス組成物は、単一の試薬化合物であるかま
たは所望の信号を発生する試薬化合物の組み合わせであ
ることができる。多くのアッセイでは、過酸化水素が、
オキシダーゼとその基質との反応により生成される。そ
のようなオキシダーゼ−基質ペアとしては、グルコース
オキシダーゼ−グルコース、サルコシンオキシダーゼ−
サルコシン、コレステロールオキシダーゼ−コレステロ
ール、Ｄ−ガラクトースオキシダーゼ−Ｄ−ガラクトー
スおよびＬ−グリセロール−３−リン酸オキシダーゼ−
Ｌ−グリセロール−３−リン酸が挙げられる。好ましく
は、グルコースおよびグルコースオキシダーゼが本発明
の要素に使用される。

【００１７】有用な化学ルミネセンス組成物は、テトラ
ビス（ジメチルアミノ）エチレン、ルシフェリン、ルシ
ゲニンおよび塩化オキサリルを含む。特に有用な化学ル
ミネセンス信号発生性組成物は、２，３−ジヒドロ−
１，４−フタラジンジオン（本明細書中では、「ＤＰ
Ｄ」と示される）を含む。化学ルミネセンス反応中に励
起状態に変換され、次いで光の放射を伴って非励起状態
に戻ることのできる遊離もしくは接合２，３−ジヒドロ
−１，４−フタラジンジオンのいずれかが、本発明の実
施に際して有用である。かなりの数のそのような化合物
が当該技術分野で既知であり、それらとしては、米国特
許第 4,598,044号明細書および有機化学における化学ル
ミネセンス（Chemiluminescence in OrganicChemistry,
Gundermann and McCapra, Springer-Verlag, Berlin,
1987, 204〜207 ページ，に記載されているものが挙げ
られる。そのような化合物は、一般的には「ルミノール
型ヒドラジド」として既知であり、それらとしては、フ
タル酸ヒドラジド類、ナフタレン−１，２−ジカルボン
酸ヒドラジド類、アントラセン−２，３−ジカルボン酸
ヒドラジド類、フェナントレン−１，２−ジカルボン酸
ヒドラジド類、フルオレン−１，２−ジカルボン酸ヒド
ラジド類、ベンゾ〔ｇ，ｈ，ｉ〕ペリレン−１，２−ジ
カルボン酸ヒドラジド類、コロネン−１，２−ジカルボ
ン酸ヒドラジド類、および当業者に容易に明らかである
別のものが挙げられる。

【００１８】代表的な有用なＤＰＤ化合物としては、限
定されるものではないが、ルミノール、イソルミノー
ル、Ｎ−（４−アミノブチル）−Ｎ−エチルイソルミノ
ールヘミスクシンイミド、Ｎ−（６−アミノヘキシル）
−Ｎ−エチルイソルミノール、Ｎ−エチルイソルミノー
ル、および７−ジメチルアミノナフタレン−１，２−ジ
カルボン酸ヒドラジドが挙げられる。ルミノール（５−
アミノ−２，３−ジヒドロ−１，４−フタラジンジオ
ン）およびイソルミノール（６−アミノ−２，３−ジヒ
ドロ−１，４−フタラジンジオン）が好ましく、そして
ルミノールが最も好ましい。ＤＰＤ化合物の別の有用な
クラスとしては、置換もしくは非置換のフタル酸ヒドラ
ジド類、アントラセン−２，３−ジカルボン酸ヒドラジ
ド類、フェナントレンジカルボン酸ヒドラジド類、フル
オレン−１，２−ジカルボン酸ヒドラジド類、ベンゾ
〔ｇ，ｈ，ｉ〕ペリレン−１，２−ジカルボン酸ヒドラ
ジド類およびコロネン−１，２−ジカルボン酸ヒドラジ
ド類が挙げられる。

【００１９】化学ルミネセンス信号の発生を増強する化
合物は、「増強剤」として既知であり、それらは電子移
動剤として作用すると信じられている。そのような目的
に関して既知のいずれかのものが、本発明の実施に際し
て使用できる。また、混合物が使用できる。特に有用な
増強剤が、例えば、米国特許第 4,598,044号、同第 4,7
29,950号および同第 4,828,983号明細書に記載されてお
り、それらとしては、ｐ−ヨードフェノール、１，６−
ジブロモナフト−２−オール、１−ブロモナフト−２−
オール、６−ヒドロキシベンゾチアゾール、２，４−ジ
クロロフェノール、ｐ−ヒドロキシケイ皮酸、ジヒドロ
ルシフェリン、Ｎ，Ｎ，Ｎ′，Ｎ′−テトラメチルベン
ジジン、ｐ−ブロモフェノール、ｐ−クロロフェノール
を初めとする化合物類が挙げられる。

【００２０】また、下記構造式のいずれかで示される化
合物が増強剤として有用である。

【化１】 上式中、Ｒ¹ は、水素もしくは炭素原子数１〜４個のア
ルキル（例えば、メチル、エチル、イソプロピル、ヒド
ロキシメチル、アミノメチルおよびメトキシメチル）で
ある。好ましくは、Ｒ¹ が水素である。

【００２１】構造式（Ｉ）、（II）、（III)および（I
V）中、Ｒ² は水素、炭素原子数１〜４個のアルキル
（例えば、メチル、エチル、イソプロピル、ｔ−ブチル
およびイソブチル）、炭素原子数１〜４個のアルコキシ
アルキル（例えば、メトキシメチルおよびメトキシエチ
ル）、炭素原子数１〜４個のヒドロキシアルキル（例え
ば、ヒドロキシメチル、１−ヒドロキシエチル、２−ヒ
ドロキシエチルおよび２，３−ジヒドロキシプロピ
ル）、炭素原子数１〜４個のアミノアルキル（例えば、
アミノメチル、２−アミノエチル、３−アミノプロピ
ル、２，４−ジアミノブチル、メチルアミノメチル、
２，２−ジメチルアミノエチルおよび４−アミノブチ
ル）、炭素原子数１〜４個のハロアルキル（例えば、ク
ロロメチル、ブロモメチル、２−クロロエチル、１，１
−ジクロロメチル、１，１，１−トリクロロメチル、
２，２，２−トリクロロエチルおよび３−クロロプロピ
ル）、または炭素原子数２〜５個のアルケニル（例え
ば、エテニル、１−プロペニル、イソプロペニルおよび
２−ブテニル）である。好ましくは、Ｒ² が水素、メチ
ルもしくはエテニルである。

【００２２】Ｒ³ は、水素もしくは炭素原子数１〜４個
のアルキル（例えば、メチル、エチル、イソプロピル、
ｔ−ブチル、ｎ−ブチルおよびイソブチル）である。好
ましくは、Ｒ³ が水素もしくはメチルである。Ｒ⁴ およ
びＲ⁵ は、独立して、水素、もしくはハメット・シグマ
値（Hammettsigma value)が少なくとも0.01であり、そ
して好ましくは少なくとも 0.3である電子求引性基であ
る。ハメット・シグマ値は、例えば、有機化学における
立体効果（Steric Effects in Organic Chemistry), Jo
hn Wiley & Sons, Inc., 1956,570〜574 ページ，およ
び物理的有機化学における発展（Progress in Phvsical
Organic Chemistry), Vol.2, Interscience Publisher
s, 1964, 333〜339 ページ，に記載される標準方法に従
って計算される。正のハメット・シグマ値を有する代表
的な電子求引性基としては、シアノ、カルボキシ、ニト
ロ、ハロ（フルオロ、ブロモ、クロロもしくはヨー
ド）、トリハロメチル（例えば、トリフルオロメチルも
しくはトリクロロメチル）、カルボニル、カルバモイ
ル、スルホニル、スルファモイル、エステル類および当
業者に容易に明らかである別のものが挙げられる。好ま
しい電子求引性基は、ハロ（例えば、クロロもしくはブ
ロモ）およびシアノである。クロロおよびシアノはより
好ましい電子求引性基であり、そしてＲ⁴ およびＲ⁵ の
いずれかがクロロであることが最も好ましい。

【００２３】前記構造式（Ｉ）中、好ましくはＲ⁴ およ
びＲ⁵ の少なくとも一方が前記電子求引性基である。最
も好ましい増強剤は、ｐ−ヒドロキシケイ皮酸、４′−
ヒドロキシアセトアニリドおよび３′−クロロ−４′−
ヒドロキシアセトアニリドである。また、要素が化学ル
ミネセンス組成物のための「ミセル形成性材料」を含む
ことが重要である。そのような材料は、典型的には、酸
化体とペルオキシダーゼとの反応生成物と、化学ルミネ
センス試薬との反応の際に、非イオン性疎水性環境を提
供する。ミセル形成性材料は望ましくないバックグラウ
ンド信号を低減することが見出されている。

【００２４】特に有用なミセル形成性材料としては、カ
チオン界面活性剤類（例えば、セチルトリメチルアンモ
ニウムブロミド、セチルトリメチルアンモニウムクロリ
ド、ドデシルトリメチル−アンモニウムクロリドおよび
ジドデシルジメチルアンモニウムクロリド）、非イオン
性の部分的に水素化された植物油（例えば、商標MYVACE
T でEastman Chemical Co.より市販されているもの）、
ならびにオリーブ油およびアラビアゴムの乳剤が挙げら
れる。

【００２５】オリーブ油およびアラビアゴムの乳剤は、
アラビアゴム（30ｇ）および安息香酸ナトリウム（ 0.4
ｇ）の混合物を蒸留水（ 160mL）に激しく攪拌しながら
溶解させることにより調製できる。最初に安息香酸塩を
溶解し、次いでアラビアゴムを少しずつ添加することが
最良である。次いで高精製のオリーブ油（30mL）および
アラビアゴム溶液（15g/100mL ，70mL）を、ガラス・ホ
モジナイザー・ジャーに移し、そして４℃で30分間冷却
した。３分間低速でブレンドした後、次いで10分間高速
でブレンドし、ホモジネートを再び30分間冷却し、その
後最終ホモジネーションを10分間行った。得られた乳剤
を使用するまで４℃で保管した。

【００２６】オリーブ油およびアラビアゴムの乳剤は、
ラテックス・ポリマーをも含有する層に常用され、付着
量１〜５g/m²で塗布される。そのようなラテックスとし
ては、乳化重合法により形成できるいずれかの水不溶性
付加重合体が挙げられる。特に有用なラテックス・ポリ
マーとしては、限定されるものではないが、ポリ（メチ
ルアクリレート−コ−２−アクリルアミド−２−メチル
プロパンスルホン酸，ナトリウム塩−コ−２−アセトア
セトキシエチルメタクリレート）、ポリ〔アクリルアミ
ド−コ−ビニルピロリドン−コ−Ｎ−（３−アセトアセ
トアミドプロピル）メタクリルアミド〕および類似ポリ
マー類が挙げられる。要素中のオキシダーゼは、アッセ
イに用いられるオキシダーゼ系に依存するであろう。有
用なオキシダーゼの具体例としては、グルコースオキシ
ダーゼ、コレステロールオキシダーゼ、サルコシンオキ
シダーゼ、Ｄ−ガラクトースオキシダーゼおよびＬ−グ
リセロール−３−リン酸オキシダーゼが挙げられる。グ
ルコースオキシダーゼが好ましい。

【００２７】１つ以上の試薬層中の試薬のすべてが、１
つ以上の親水性バインダー中に分散せしめられている。
前記親水性バインダーとしては、ゼラチンおよび別のコ
ロイド物質（好ましくは、従来の硬化剤で硬化されてい
る）、ポリアクリルアミド、ポリビニルピロリドン、ア
クリルアミドおよびビニルピロリドンのコポリマー、ゼ
ラチンおよびそのようなポリマーの混合物があげられ
る。ゼラチンが最も好ましい。試薬層の上に配置される
ものは不粘着性で水溶性もしくは透水性カバー層であ
る。「不粘着性」とは、要素がゲル・プレートもしくは
トランスブロッティング膜に固着せず、そしてゲル・プ
レートもしくはトランスブロッティング膜に損傷を与え
ることなく容易に取り外しができることを意味する。該
層は、アッセイに使用される流体および水溶性試薬の移
動を容易にする、１つ以上の水溶性もしくは透水性（例
えば、多孔質）材料から調製される。

【００２８】或る態様では、カバー層が、種々の刊行物
に記載されるように従来の多孔質「展開層」、特に、米
国特許第 3,992,158号、同第 4,258,001号、同第4,292,
272号および同第 4,430,436号明細書に記載されるよう
な無機もしくは有機の粒子、繊維もしくはセルロース系
材料からなる多孔質層を用いて調製される。好ましい態
様では、カバー層の不粘着性は、臨界量の１つ以上の水
溶性もしくは透水性の非架橋フィルム形成性ポリマー、
例えば、ビニルピロリドンポリマー類、アクリルアミド
ポリマー類および当業者に容易に明らかである別のもの
を用いることにより達成される。そのようなポリマーと
しては、ポリビニルピロリドン、ポリアクリルアミド、
アクリルアミドとビニルピロリドンのコポリマー類、ポ
リイソプロピルアクリルアミドおよび別の類似のホモポ
リマー類およびコポリマー類が挙げられる。ビニルピロ
リドンポリマー類、例えば、ポリビニルピロリドンがよ
り好ましい。当該技術分野で「ヒドロゲル」と称される
ものも、使用できる。一般的には、フィルム形成性ポリ
マー（もしくはそれらの混合物）は、 0.2〜5.5 g/m²の
量で存在し、 0.6〜２g/m²が好ましく、そして 0.6g/m²
が最も好ましい。 5.5g/m²を越える量は許容できる感度
を提供するが、しかしカバー層の粘着性が増大しすぎ
て、ゲル・プレートもしくはトランスブロッティング膜
からカバー層を容易に取り外せなくなるかもしれない。

【００２９】オキシダーゼを含有する層とは異なる層の
内部に、オキシダーゼの基質がある。特定の基質が使用
されるオキシダーゼに依存するだろう。従って、それら
は、グルコース、コレステロール、サルコシン、Ｄ−ガ
ラクトースおよびＬ−グリセロール−３−リン酸のよう
な物質でありうる。本発明の実施に際しては、グルコー
スが好ましい。試薬層と支持体の間に、もしくは試薬層
とカバー層の間に、下塗り層および接着剤層を包含する
別の層を、そのような層が試薬層とカバー層の間におけ
る試薬の移動を阻害しない限り挿入することができる。
所望であれば、洗浄コートを用いて試薬を組み入れても
よい。１つ以上の試薬層を存在させることができる。

【００３０】要素の試薬層は、適当な緩衝剤を用いてpH
7.5〜11の同じpHに緩衝化される。好ましくはpHが８〜
９であり、pH 8.5が最も好ましい。高精製トリス（ヒド
ロキシメチル）アミノメタンおよびその酸性塩が好まし
い。化学ルミネセンス化合物は、一般的には少なくとも
0.5mg/m² の量で存在し、２〜200 mg/m² の範囲内の量
が好ましい。増強剤は、一般的には少なくとも１mg/m²
の量で存在し、２〜100 mg/m² の範囲内の量が好まし
い。緩衝剤は、要素保存期間中およびアッセイ中に所望
の緩衝能を提供するのに十分な量で存在するだろう。ミ
セル形成性材料は、一般的には少なくとも 0.001g/m²の
量で存在し、 0.2〜２g/m²の量が好ましい。オリーブ油
およびアラビアゴムと共に使用されるいずれかのラテッ
クスは、１〜５g/m²の量で存在してもよい。

【００３１】要素中のオキシダーゼの量が 300〜40,000
I.U./m² の範囲内であることは、アッセイにおいて高感
度が得られる臨界である。好ましくはオキシダーゼが10
00〜10,000I.U./m² で存在し、2000〜6000I.U./m² が最
も好ましい。これらの範囲内の量は、用いられるオキシ
ダーゼにより変動するだろう。また、オキシダーゼ基質
の臨界量は少なくとも１g/m²であり、１〜20g/m²の量が
好ましく、５〜14g/m²の量がより好ましく、８〜13g/m²
の量が最長かつ最大強度の信号を得るのに最も好まし
い。好ましい態様では、グルコース対グルコースオキシ
ダーゼの比が2500I.U./m² ：12.2g/m²である。本明細書
で用いられる１I.U.は、酵素活性の国際単位を表し、そ
して標準pHおよび温度条件下で１分間あたり１マイクロ
モルの基質の変換を触媒するのに必要とされる酵素活性
の量として定義される。

【００３２】本発明の試験デバイスは、本明細書中に記
載される取り外し可能な乾式分析要素および前記分析要
素中で発生した化学ルミネセンス信号を受信して記録す
るように構成された感光要素を含んでなる。分析要素お
よび感光要素は、物理的に関連している、すなわち、物
理的接触状態であってもよく、または化学ルミネセンス
信号が感光要素により記録できるような透明な層もしく
は支持体により分離されていてもよい。ある態様では、
感光要素が、分析要素の支持体の裏面上に被覆された感
光層でありうる。あるいは、分析要素および感光層は物
理的接触状態ではないが、信号を記録できるように、例
えば、カメラもしく別の光学記録デバイスを用いて十分
に近接している。

【００３３】感光要素の最も単純な形は、フィルムもし
くはバインダー材料の中に適当な感光試薬を分散して含
む自蔵式感光層でありうる。適当な感光試薬は周知であ
り、それらとしては「インスタント」写真ならびに非イ
ンスタント写真の両方についての黒白およびカラーハロ
ゲン化銀乳剤が挙げられるが、しかし本発明はそれらの
従来の試薬に限定されるものではない。感光要素は、化
学ルミネセンス信号と接触状態であるかまたはそれに近
接している「電荷結合素子」として既知であるものを初
めとする物理的要素であってもよい。感光試薬は、透明
な支持体の上の１つ以上の層の中に配置してもよい。感
光要素が、化学ルミネセンス信号を記録するために一時
的なオーバーレイとして使用される場合には、それを分
析要素から移動することができる。また任意に、感光層
は、周囲の光からそれを保護するための手段、例えば、
分析要素と物理的に関連していない表面を被覆する不透
明保護層を有することもできる。感光要素をカセットに
入れて供給し、分析物に対して暴露した後に分析要素を
そのカセットに置くことができ、またはアッセイ中にそ
れらの要素を一緒にカセットに挿入することもできる。

【００３４】潜像は、一般的には化学ルミネセンス信号
に応じて感光要素中に形成され、その潜像は使用される
特定の感光試薬に適する現像試薬を用いて現像される。
現像された感光要素上に得られた画像は、ゲル・プレー
トもしくはトランスブロッティング膜中の１つ以上の分
析物を測定する手段として観察および評価することがで
きる。多種多様な感光要素を現像するための試薬および
方法は周知である。ある特に有用な感光要素はEastman
Kodak Company より入手できるX-OMAT（商標）ARフィル
ムである。別の態様では、化学ルミネセンス信号は、燐
光体スクリーンを含む感光要素上に記録できる。記録さ
れた画像は、デジタル信号に変換され、次いでそれが評
価されるかまたはさらに磁気テープ、光学ディスクおよ
び当業者に既知である別の情報記録媒体を包含する多数
の方法で記録することができる。あるいは、化学ルミネ
センス信号由来の潜像を、電子光学的に形成または記録
することができる。

【００３５】本発明方法は、本発明の分析要素およびゲ
ル・プレートもしくはトランスブロッティング膜の一時
的な積層体を形成することにより、１つ以上の分析物を
測定するために提供される。この積層工程の前に、分析
物が標識されていない場合には、一旦それらは幾つかの
方法でゲル・プレートもしくはトランスブロッティング
膜中で分離または固定化され、それらは適当な方法でペ
ルオキシダーゼで標識される。分析物がタンパク質であ
る場合には、典型的には、タンパク質分析物と反応性で
あるペルオキシダーゼ標識抗体が、分析物との複合体化
反応を引き起こすために適用される。分析物が核酸であ
る場合には、分析物と相補的でありかつそれとハイブリ
ダイズできるペルオキシダーゼ標識プローブが同様に使
用される。分析物が既にペルオキシダーゼで標識されて
いる（例えば、分析物が酵素の形である）か、または分
離もしくはブロッティング法にかける前に直接的にもし
くは間接的に標識されている場合には、検出するために
分析要素を直接直ぐに使用できる。タンパク質を検出す
る幾つかのケースでは、タンパク質分析物と特異的に反
応するであろう標識していない抗体をゲル・プレートも
しくはトランスブロッティング膜に塗布し、続いてペル
オキシダーゼ標識抗抗体と接触させている。また別の態
様では、ストレプトアビジンで標識された抗体もしくは
プローブと分析物とを接触させ、次いでそれをペルオキ
シダーゼ−ビオチン接合体と接触させている。

【００３６】有用なペルオキシダーゼ標識抗体およびプ
ローブは、多数の販売元から容易に入手可能であり、ま
たは既知方法を用いて容易に調製できる。ペルオキシダ
ーゼ標識試薬は、当該技術分野で周知である緩衝液へ含
めた溶液として供給されうる。あるいは、ペルオキシダ
ーゼ標識試薬は、ペルオキシダーゼと特異的バインディ
ング部分、例えば、ストレプトアビジンもしくはビオチ
ンとの接合体である。また別の態様では、ペルオキシダ
ーゼとローダミン、フルオレセインもしくはヒドラジド
のいずれかとの接合体で前記抗抗体を標識して、増強さ
れ長期間持続性であるかまたは異なる化学ルミネセンス
信号を提供することができる。そのような接合体は、ペ
ルオキシダーゼがローダミン、フルオレセインもしくは
ヒドラジド分子と共有結合反応できるようにそれらを適
当に修飾することにより、容易に調製できる。当業者
は、この操作をどのように行えばよいか、そして適当な
試薬をどこで見出せばよいかは、分かるであろう。

【００３７】本明細書中の「ペルオキシダーゼ」とは、
基質の酸化を触媒して光を発生するいずれかの過酸化性
物質（酵素もしくは別のもの）を意味する。細菌、真菌
および植物のペルオキシダーゼが好ましく、西洋ワサビ
ペルオキシダーゼが最も好ましい。一般的には酸化体
が、前記ペルオキシダーゼおよび増強剤の存在下で所望
の信号を発生するために必要とされる。種々の有用な酸
化体が既知であるが、過ホウ酸イオンおよび過酸化水素
が好ましく、過酸化水素が最も好ましい。過酸化水素
は、典型的にはオキシダーゼとその基質の反応において
発生するが、しかし追加量の酸化体が所望により系に添
加できる。

【００３８】分析物を標識する前に、ゲル・プレートも
しくはトランスブロッティング膜を適当な緩衝溶液で洗
浄して、表面上に所望の水分およびpHを与えてもよい。
次いで分析物が核酸である場合には、それらは前記のご
とく適当に標識される。本発明の分析要素とゲル・プレ
ートもしくはトランスブロッティング膜を積層する前
に、未反応物質を除去するためにさらなる洗浄を行って
もよい。分析物がタンパク質である場合には、別の方法
を用いてもよい。例えば、ウェスタン・ブロットについ
ては、洗浄そして分析物に特異的な第一抗体の反応の
後、遮断性溶液（blocking solution)を塗布して未反応
部位を遮断してもよい。非常に有用な遮断性溶液は、高
精製カゼインもしくは別の非免疫反応性タンパク質を含
む。次いで標識抗抗体が添加され、続いてさらに洗浄さ
れ、その後に分析要素と接触せしめられる。

【００３９】ゲル・プレートもしくはトランスブロッテ
ィング膜および分析要素のカバー層は、界面で生じる気
泡の数を最低限に抑えるような方法で、一時的に積層体
として一体にされる。所望により、この時に感光要素を
分析要素に適用することができる。あるいは、分析要素
をゲル・プレートもしくはトランスブロッティング膜か
ら分離してから、感光要素で信号を記録することができ
る。水分が存在しなければ、試薬（例えば、酸化体およ
び増強剤）はゲル・プレートもしくはトランスブロッテ
ィング膜と分析要素の間を十分に移動することはない。
試薬の拡散およびペルオキシダーゼと試薬との反応が容
易に起こるように、ゲル・プレートもしくはトランスブ
ロッティング膜は、通常積層する前に湿潤せしめられ
る。湿潤処理は、数多くの緩衝剤、例えば、トリス（ヒ
ドロキシメチル）アミノメタンおよび無機塩、例えば、
塩化ナトリウムのいずれかを含有する緩衝溶液を用い
て、都合良く達成できる。

【００４０】分析要素中におけるペルオキシダーゼと試
薬の反応が十分に行われる時間、積層体を一体化した状
態に維持して所望の光信号を提供する。この時間は、分
析物の濃度および分析要素中の試薬の量により変化する
だろう。一般的には、反応は５〜37℃で実施され、20〜
25℃の温度が好ましい。本発明の分析要素は、いずれか
のアッセイ態様において本発明の分析要素を使用する際
に有用な１つ以上の別の個別に包装された成分と共に、
試験キットの一部として供給できる。そのような成分と
しては、ゲル・プレートもしくはトランスブロッティン
グ膜用の緩衝溶液、非免疫反応性遮断性タンパク質、例
えば、高精製カゼインを含有する遮断性溶液、ペルオキ
シダーゼ標識特異的バインディング分子（例えば、ペル
オキシダーゼ標識抗体類もしくはストレプトアビジ
ン）、直接的または間接的にペルオキシダーゼで標識さ
れたオリゴヌクレオチド類、ゲル・プレート、トランス
ブロッティング膜、電気泳動もしくは電気集束試薬およ
び緩衝剤、感光要素、感光要素現像剤、ならびに使用説
明書が挙げられる。

【００４１】好ましくは、本発明のキットは、本発明の
好ましい２層分析要素と共に１つ以上の以下の成分を含
む。 ｉ）トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンおよび無
機塩（例えば、アルカリ金属塩、アルカリ土類金属塩も
しくはアンモニウム塩）を含有する緩衝溶液、 ii） 0.5〜５重量％の非免疫反応性タンパク質（例え
ば、精製カゼイン、ウシ血清アルブミンもしくは脱脂粉
乳，３重量％が好ましい）を含む緩衝化された遮断性溶
液、 iii)ペルオキシダーゼ標識特異的バインディング試薬
（例えば、ペルオキシダーゼと抗体類、ストレプトアビ
ジンもしくはビオチンとの接合体）、 iv）直接的または間接的にペルオキシダーゼで標識され
たオリゴヌクレオチド、 ｖ）トランスブロッティング膜、 vi）ゲル・プレート、ならびに vii)感光要素。

【００４２】

【実施例】以下の実施例では、特に断らないかぎり、パ
ーセンテージはすべて重量％である。実施例についての材料および方法：アスペルギルス・ニ
ガー（Aspergillus niger) , タイプII由来のグルコース
オキシダーゼ（19,400I.U./mg ）は、Sigma Chemical C
ompanyより入手し、グルコン酸カリウムの添加により活
性を安定化させた。アルカリ性ホスファターゼに特異的
なFLAG（商標）ペプチド標識抗体は、L&RP(Kodak, New
Haven, Connecticut ）より入手した。ビオチニル化抗
−FLAG（商標）ペプチド抗体は、従来の方法および試薬
を用いて調製した。pFLAGMacプラスミドは、L&RP (Koda
k, New Haven, Connecticut ）より入手した。

【００４３】ビオチニル化hind III切断ラムダDNA サイ
ズ・マーカーは、United States Biochemicalsより入手
した。プラスミドのビオチニル化プローブは、サーマス
・サーモフィラス（Thermusthermophilusより得られたD
NA ポリメラーゼを用いて、ビオチニル化デオキシウリ
ジン三リン酸（Enzo Biochemical）を組み入れることに
より調製した。プラスミドの³²Ｐ標識プローブは、サー
マス・サーモフィラス（Thermus thermophilusより得ら
れたDNA ポリメラーゼを用いて、³²Ｐデオキシウリジン
三リン酸（Enzo Biochemical）を組み入れることにより
調製した。BIODYNE （商標）Ｂ微孔質ポリアミド膜は、
Pall Corp より入手した。

【００４４】実施例１ ２層分析要素の調製 本発明の好ましい分析要素は、以下の方法で調製でき
る。ゼラチン下塗りポリ（エチレンテレフタレート）支
持体の上に、以下の乾燥付着量：ルミノール（57mg/
m² ）、ｐ−ヒドロキシケイ皮酸増強剤（24.6mg/
m² ）、セチルトリメチルアンモニウムブロミド（49mg/
m² ）、グルコースオキシダーゼ（2500I.U./m² ）、ト
リス（ヒドロキシメチル）アミノメタン緩衝剤（0.16g/
m²，pH 8.5）および硬化ゼラチン（５g/m²）となるよう
に水性処方を被覆した。第１層を乾燥した後、第２処方
を水へ含めたものを、以下の乾燥付着量：グルコース
（ 12.19g/m²）およびポリビニルピロリドン・バインダ
ー（ 0.627g/m²）となるように被覆し、そして乾燥し
た。得られた本発明の要素は、下記実施例２に記載され
るように複数の分析物を検出するのに有用であった。

【００４５】実施例２ 複数の核酸の検出 本実施例は、伝統的なサザン・ブロット法を用いて分離
された複数の核酸を検出する際の、実施例１に記載した
分析要素の使用を具体的に説明するものである。詳細に
は、本実施例は、種々の濃度のプラスミドpFlagMacの検
出を具体的に説明するものである。アッセイに用いられ
るプローブは、検出しようとするプラスミドの配列に対
して相補的であるビオチニル化オリゴヌクレオチドであ
る。標準高融点アガロース電気泳動ゲルプレートに、異
なる濃度（ 100pg, 1ng および 10ng ）のプラスミド分
析物を、ビオチニル化サイズ・マーカー核酸と共に充填
した。核酸を、標準方法に従って異なる電圧にかけるこ
とにより、ゲル・プレート中で分離した。

【００４６】予め湿潤せしめたBIODYNE （商標）Ｂ膜を
ゲル・プレートに積層して個々の核酸を膜に移動させ
た。次いでビオチニル化プローブを膜に塗布し、そして
ハイブリダイゼーションが起こるように60〜65℃で一晩
穏やかに攪拌した。次いでその膜を、ドデシル硫酸ナト
リウムを含有する（ 0.1％）２×SSEPの加熱した（60
℃）溶液（２mL/cm²）で15分間かけて洗浄し、続いて別
のドデシル硫酸ナトリウムを含有する（ 0.1％） 0.5×
SSEPの加熱した溶液で15分間かけて洗浄した。トリス
（ヒドロキシメチル）アミノメタン（ 100ミリモル）お
よび塩化ナトリウム（ 150ミリモル）を含有する「TBS
」緩衝剤（pH 7.5）でその膜を速やかに洗浄した後、
高精製カゼイン（ 0.5％）を含有する遮断性溶液（ 0.5
mL/cm²）を30分間かけて42℃で穏やかに攪拌しながらそ
の膜に塗布した。その膜を再度「TBS 」で洗浄した。

【００４７】「TBS 」にストレプトアビジン−西洋ワサ
ビペルオキシダーゼ接合体（1:5000に希釈した，0.25mL
/cm²）をその膜に塗布し、そして室温で30分間インキュ
ベーションした。次いで各回室温で５分間、TRITON（商
標）X-100 非イオン界面活性剤（１％）を含有する「TB
S 」（２mL/cm²）でその膜を３回洗浄した。実施例１の
分析要素との積層の直前に、同様に「TBS 」（pH 8.5）
で最終洗浄を実施した。次いで湿潤せしめた膜を実施例
１の要素に積層し、そして周囲の光を排除できる従来の
フィルム・カセット中に入れた。次いでX-OMAT（商標）
ARフィルムを分析要素の支持体側に置き、カセットを閉
めて、１時間露光させた。化学ルミネセンス信号由来の
フィルム上に現像された画像を評価して、標識核酸分析
物の存在を明確に示すことを見出した。

【００４８】比較：分析物を分離した後、フィルムを膜
に対して直接積層したことを除いて、プラスミド分析物
のＰ³²標識プローブ（塩基 200）を用いて同様の実験を
実施した。許容される感度を得るために、感光フィルム
を得られた放射性信号に対して少なくとも24時間露光し
た。

【００４９】実施例３ 複数のタンパク質の検出 本実施例は、伝統的なウェスタン・ブロット法を用いて
分離された複数のタンパク質を検出する際の、実施例１
に記載した分析要素の使用を具体的に説明するものであ
る。FLAG（商標）ペプチド（Immunex Corp. およびEast
man Kodak Company Laboratory & Research Products D
ivision ）は、タンパク質の検出もしくはアフィニティ
ー精製を促進するのに有用な市販のタンパク質タグ（ta
g ）である。FLAG（商標）ペプチドは、従来の分子クロ
ーニング法によりタンパク質中へ導入することができ
る。本実施例では、４つの異なるタンパク質を、FLAG
（商標）ペプチドで標識した。それらには、分子の３つ
の異なる位置で標識されたアルカリ性ホスファターゼが
包含される。標識されたタンパク質の試料を発現性セル
ラインより単離し、そして従来の方法および緩衝剤を用
いて、従来のポリアクリルアミドゲル・プレートの上で
電気泳動的に分離した。次いでゲル・プレートを従来の
ニトロセルロース膜と接触せしめて、分離したタンパク
質をその膜に移動した。

【００５０】次いで、その膜を、37℃で１時間、高精製
カゼイン５（重量）％を含有する遮断性溶液と接触せし
めた。トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン緩衝剤
（ 100ミリモル）および塩化ナトリウム（ 150ミリモ
ル）を含有する緩衝液（「TBS」，pH 7.5）でその膜を
すすいだ後、それを「TBS 」緩衝剤（pH 7.8）中の従来
のビオチニル化抗−FLAG（商標）ペプチド抗体（10μg/
mL）と共に室温で30分間インキュベートした。数回「TB
S 」緩衝剤で洗浄した後、従来のストレプトアビジン−
西洋ワサビペルオキシダーゼ接合体（ 0.3μg/mL）と共
に22℃で30分間インキュベートした。次いで、「TBS 」
緩衝剤（pH 7.8，次いでpH 8.5）を用いてさらに２回洗
浄を行った。次いでその湿った膜を、実施例１に記載し
た分析要素と接触状態にし、得られた積層体を、周囲の
光から護られたカセット中に入れた。次いで写真要素
（Eastman Kodak Company 市販のX-OMAT（商標）ARフィ
ルム）を分析要素の透明な支持体側に置き、カセットを
閉めた。その後30分間に渡って得られた化学ルミネセン
ス信号をフィルム上に記録し、現像すると、それは個別
の標識タンパク質を明確に示した。

【００５１】実施例４ 多孔質カバー層を備えた２層分
析要素 本実施例は、カバー層として多孔質展開層を有する本発
明の２層分析要素を示すものである。ゼラチン下塗りポ
リ（エチレンテレフタレート）支持体の上に、ポリビニ
ルピロリドン（0.63g/m²）中グルコースオキシダーゼ
（20,000I.U./m² ）の乾燥付着量となるように水性処方
を被覆した。第１層を乾燥した後、第２処方を以下の乾
燥付着量：硫酸バリウム（94.8g/m²）、セチルトリメチ
ルアンモニウムブロミド（10mg/m² ）および酢酸セルロ
ース・バインダー（ 8.5g/m²）となるように被覆した。
一旦この層を乾燥させ、続いて水性洗浄コーティングを
以下の乾燥付着量：ルミノール（57mg/m² ）、トリス
（ヒドロキシメチル）アミノメタン緩衝剤（0.16g/m²，
pH 8.5）、グルコース（12.2mg/m²）、４′−ヒドロキ
シアセトアニリド増強剤（36.7mg/m² ）および塩化ナト
リウム（ 0.6g/m²）となるように塗布した。

【００５２】実施例５ 多孔質カバー層を備えた別の要
素 カバー層を、以下の乾燥付着量：硫酸バリウムの代わり
に二酸化チタン（57.8g/m²）、セチルトリメチルアンモ
ニウムブロミド（10mg/m² ）および酢酸セルロース・バ
インダー（ 7.7g/m²）となるように調製したことを除い
て、この要素は、実施例４に記載したものと同様であ
る。

【００５３】実施例６ ３層分析要素 本実施例は、本明細書中の教示に従って、複数の分析物
を検出するのに使用できる、本発明の３層分析要素を示
すものである。ゼラチン下塗りポリ（エチレンテレフタ
レート）支持体の上に、以下の乾燥付着量：硬化ゼラチ
ン（ 5.5g/m²）中グルコースオキシダーゼ（2500I.U./m
² ）となるように水性処方を被覆した。乾燥した後、ｐ
−ヒドロキシケイ皮酸増強剤（24.6mg/m² ）、セチルト
リメチルアンモニウムブロミド（49mg/m² ）、トリス
（ヒドロキシメチル）アミノメタン緩衝剤（0.16g/m²，
pH 8.5）および硬化ゼラチン（５g/m²）の水性処方を用
いて被覆した。第２層を乾燥した後、第３処方をエタノ
ールへ含めたものを、以下の乾燥付着量：グルコース
（12.2mg/m² ）およびポリビニルピロリドン・バインダ
ー（0.63g/m²）となるように被覆し、そして乾燥した。

【００５４】実施例７ さらに別の２層要素 本実施例は、実施例１、４および５に記載した要素とは
異なる本発明のさらにまた別の２層分析要素を示すもの
である。ゼラチン下塗りポリ（エチレンテレフタレー
ト）支持体の上に、水性処方を被覆して以下の乾燥付着
量：ｐ−ヒドロキシケイ皮酸増強剤（24.6mg/m² ）、セ
チルトリメチルアンモニウムブロミド（49mg/m² ）、ル
ミノール（57mg/m² ）、グルコース（12.2g/m²）、トリ
ス（ヒドロキシメチル）アミノメタン緩衝剤（0.16g/
m²，pH 8.5）および硬化ゼラチン（５g/m²）となるよう
にした。第１層を乾燥した後、第２処方を水へ含めたも
のを、以下の乾燥付着量：グルコースオキシダーゼ（25
00I.U./m² ）およびポリビニルピロリドン・バインダー
（0.63g/m²）となるように被覆し、そして速やかに乾燥
した。実施例４〜７に記載した要素のすべてを用いて、
前記実施例２および３に記載した試薬および方法と同様
のものを用いて、トランスブロッティング膜もしくはゲ
ル・プレートのいずれかの中のペルオキシダーゼ標識分
析物を首尾よく検出した。

【００５５】

【発明の効果】本発明は、複数の分析物、特に、ゲル・
プレートもしくは別の分離手段を用いて分離された分析
物、またはトランスブロッティング膜に固定化された分
析物を検出するための高感度な手段を提供する。分析要
素は、湿っているときに粘着性になり易いようなプレー
トもしくは膜から容易に取り外すことができ、それ故に
適当な感光要素を用いて発生した化学ルミネセンス信号
を永久不変的に記録できる。電気泳動プレートにおける
バンドは、別の既知酵素検出系に比べて本発明の要素を
用いる場合、より明確である。

【００５６】しかしながら、分析要素を用いて流動状被
検体中の分析物、ならびに伝統的な支持体、例えば、ゲ
ル・プレートおよびトランスブロッティング膜上に固定
化されたものを検出できるとはいえ、本発明はそのよう
な検出手段に限定されるものではない。前記方法は、比
較的安価で、使いやすく、高感度であり、かつ溶液の試
薬を回避する。結果は定性的かつ定量的でありうる。試
験された被検体は本方法では着色されないので、所望で
あれば複数の分析物のプローブを使用することができ
る。要素は不粘着性でありかつ膜もしくはゲル・プレー
トから剥離できるので、さらなる分析要素もしくは異な
る検出手段を用いて、膜もしくはゲル・プレートを１回
以上使用することができる。要素の試薬は、長期間低温
で保存する際に安定であり、そして要素は調製もしくは
活性化することなくいつでも使用される。

【００５７】本発明の分析要素は、１つ以上の水溶性も
しくは透水性材料を含む取り外し可能な不粘着性カバー
層により、これらの利点を提供する。特に有用なもの
は、水溶性もしくは透水性フィルム形成性ポリマー、例
えば、ビニルピロリドンポリマー類である。高感度は、
特定レベルのオキシダーゼおよびオキシダーゼ基質を用
いて達成される。さらに、試験キットは、ペルオキシダ
ーゼ標識反応体がゲル・プレートもしくはトランスブロ
ッティング膜中で検出されるときにバックグラウンドを
低減する、有用な緩衝液および遮断性溶液を含む。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 ポール ジェームス ヒーネイ アメリカ合衆国，コネチカット 06405, ブランフォード，ハーバー ビレッジ 12 ビー (72)発明者 ディートマー カール フレウンド アメリカ合衆国，ニューヨーク 11385, グレンデール，シックスティフォース ス トリート 78−13 (72)発明者 デビッド ブリュワー ラタート アメリカ合衆国，ニューヨーク 14617, ロチェスター，シンナバー ロード 285 (72)発明者 リチャード ジョージ チュベット アメリカ合衆国，コネチカット 06457, ミドルタウン，ティンバー リッジ ロー ド 87 (72)発明者 ダグラス リンカーン ビザード アメリカ合衆国，コネチカット 06410, チェシャー，サウス メリデン ロード 663

Claims (5)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 透明な非孔質支持体の上に、順に、 pH7.5 〜11に緩衝化されそして１つ以上の親水性バイン
   ダーを含む、１つ以上の試薬層、および不粘着性で水溶
   性もしくは透水性のカバー層、を配置した支持体を含む
   取り外し可能な乾式分析要素であって、 前記要素は、さらに、 （ａ）化学ルミネセンス組成物、 （ｂ）化学ルミネセンス組成物の増強剤、 （ｃ）化学ルミネセンス組成物のミセル形成性材料、 （ｄ） 300〜40,000I.U./m² のオキシダーゼ、および （ｅ）少なくとも１g/m²のオキシダーゼの基質、 を含み、 前記成分（ａ）〜（ｅ）は、オキシダーゼおよびオキシ
   ダーゼの基質が別個の層にあることを条件として、いず
   れかの層に配置されている、取り外し可能な乾式分析要
   素。
2. 【請求項２】 ａ）透明な非孔質支持体の上に、順に、 pH7.5 〜11に緩衝化されそして１つ以上の親水性バイン
   ダーを含む、１つ以上の試薬層、および不粘着性で水溶
   性もしくは透水性のカバー層、を配置した支持体を含む
   取り外し可能な乾式分析要素であって、 前記要素は、さらに、（ａ）化学ルミネセンス組成物、
   （ｂ）化学ルミネセンス組成物の増強剤、（ｃ）化学ル
   ミネセンス組成物のミセル形成性材料、（ｄ） 300〜4
   0,000I.U./m² のオキシダーゼ、および（ｅ）少なくと
   も１g/m²のオキシダーゼの基質、を含み、 前記成分（ａ）〜（ｅ）は、オキシダーゼおよびオキシ
   ダーゼの基質が別個の層にあることを条件として、いず
   れかの層に配置されている、取り外し可能な乾式分析要
   素、ならびに ｂ）分析要素で発生した化学ルミネセンス信号を受信す
   るように構成され、分析要素と物理的に関連している感
   光要素、を含んでなる試験デバイス。
3. 【請求項３】 １つ以上の分析物の測定方法であって、 Ａ）ペルオキシダーゼで標識された１つ以上の分析物を
   含むゲル・プレートもしくはトランスブロッティング膜
   を、 透明な非孔質支持体の上に、順に、 pH7.5 〜11に緩衝化されそして１つ以上の親水性バイン
   ダーを含む、１つ以上の試薬層、および不粘着性で水溶
   性もしくは透水性のカバー層、を配置した支持体を含む
   取り外し可能な乾式分析要素であって、 前記要素は、さらに、（ａ）化学ルミネセンス組成物、
   （ｂ）化学ルミネセンス組成物の増強剤、（ｃ）化学ル
   ミネセンス組成物のミセル形成性材料、（ｄ） 300〜4
   0,000I.U./m² のオキシダーゼ、および（ｅ）少なくと
   も１g/m²のオキシダーゼの基質、を含み、 前記成分（ａ）〜（ｅ）は、オキシダーゼおよびオキシ
   ダーゼの基質が別個の層にあることを条件として、いず
   れかの層に配置されている、取り外し可能な乾式分析要
   素、の上に被覆することにより一時的な積層体を形成
   し、 分析要素中で化学ルミネセンス信号を発生させる工程、
   そして Ｂ）１つ以上の分析物を検出するための手段として、発
   生した化学ルミネセンス信号を検出する工程、を含んで
   なる、１つ以上の分析物の測定方法。
4. 【請求項４】 １つ以上の分析物の測定方法であって、 Ａ）ゲル・プレートもしくはトランスブロッティング膜
   を、１つ以上の分析物を含むと予測される液体試料と、
   接触させる工程、 Ｂ）１つ以上の分析物が、まだペルオキシダーゼで標識
   されていない場合には、直接的または間接的にゲル・プ
   レートもしくはトランスブロッティング膜中の分析物を
   標識する工程、 Ｃ）ゲル・プレートもしくはトランスブロッティング膜
   を、 透明な非孔質支持体の上に、順に、 すべて親水性バインダー中に配置された、化学ルミネセ
   ンス組成物、化学ルミネセンス組成物の増強剤、化学ル
   ミネセンス組成物のミセル形成性材料、pH7.5〜11に緩
   衝化するための緩衝剤、および 300〜40,000I.U./m² の
   オキシダーゼを含む試薬層、および0.2〜5.5 g/m²の水
   溶性もしくは透水性フィルム形成性ポリマーに分散せし
   めた１〜20g/m²のオキシダーゼの基質を含む、不粘着性
   で水溶性もしくは透水性のカバー層、を配置した支持体
   を含む取り外し可能な乾式分析要素、の上に被覆するこ
   とにより一時的な積層体を形成して、 ゲル・プレートもしくはトランスブロッティング膜中の
   ペルオキシダーゼ標識分析物に応じて分析要素中で化学
   ルミネセンス信号を発生させる工程、そして Ｄ）１つ以上の分析物を検出するための手段として、分
   析要素と物理的に関連している感光要素を用いて、発生
   した化学ルミネセンス信号を検出する工程、を含んでな
   る、１つ以上の分析物の測定方法。
5. 【請求項５】 １つ以上の分析物を測定するための試験
   キットであって、 ａ）透明な非孔質支持体の上に、順に、 pH7.5 〜11に緩衝化されそして１つ以上の親水性バイン
   ダーを含む、１つ以上の試薬層、および不粘着性で水溶
   性もしくは透水性のカバー層、を配置した支持体を含む
   取り外し可能な乾式分析要素であって、 前記要素は、さらに、（ａ）化学ルミネセンス組成物、
   （ｂ）化学ルミネセンス組成物の増強剤、（ｃ）化学ル
   ミネセンス組成物のミセル形成性材料、（ｄ） 300〜4
   0,000I.U./m² のオキシダーゼ、および（ｅ）少なくと
   も１g/m²のオキシダーゼの基質、を含み、 前記成分（ａ）〜（ｅ）は、オキシダーゼおよびオキシ
   ダーゼの基質が別個の層にあることを条件として、いず
   れかの層に配置されている、取り外し可能な乾式分析要
   素、ならびに ｂ）下記 ｉ）トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンおよび無
   機酸の塩を含む緩衝溶液、 ii） 0.5〜５重量％のカゼインを含む緩衝化遮断性溶
   液、 iii)ペルオキシダーゼ標識特異的バインディング試薬、 iv）ペルオキシダーゼで直接的または間接的に標識され
   たオリゴヌクレオチド、 ｖ）トランスブロッティング膜、 vi）ゲル・プレート、および vii)感光要素、からなる群より選ばれる１つ以上の別個
   に包装された成分、を含んでなる、１つ以上の分析物を
   測定するための試験キット。