JPH07218506A - 免疫反応用媒体及びそれを用いる免疫測定方法 - Google Patents
免疫反応用媒体及びそれを用いる免疫測定方法Info
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- JPH07218506A JPH07218506A JP2737394A JP2737394A JPH07218506A JP H07218506 A JPH07218506 A JP H07218506A JP 2737394 A JP2737394 A JP 2737394A JP 2737394 A JP2737394 A JP 2737394A JP H07218506 A JPH07218506 A JP H07218506A
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Abstract
(57)【要約】
【目的】 長期保存してもブロッキング効果の低下が従
来のものよりも有意に小さな免疫反応用媒体を提供する
こと。 【構成】 フェノール誘導体及びカゼインを含む免疫反
応用媒体を提供した。
来のものよりも有意に小さな免疫反応用媒体を提供する
こと。 【構成】 フェノール誘導体及びカゼインを含む免疫反
応用媒体を提供した。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、免疫反応用媒体及びそ
れを用いる免疫測定方法に関する。
れを用いる免疫測定方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】免疫分析に供する試料を希釈する希釈液
等として用いられる免疫反応用媒体に、ウシ血清アルブ
ミン（ＢＳＡ）やカゼインのような不活性タンパク質を
共存させることにより、免疫反応時の非特異的反応を抑
制することが行われている（ブロッキング効果）。
等として用いられる免疫反応用媒体に、ウシ血清アルブ
ミン（ＢＳＡ）やカゼインのような不活性タンパク質を
共存させることにより、免疫反応時の非特異的反応を抑
制することが行われている（ブロッキング効果）。
【０００３】しかしながら、このような免疫反応用媒体
を長期保存すると、不活性タンパク質を含むがために沈
殿の発生、微生物の増繁殖等の問題が生じ、その結果、
ブロッキング効果が低下する場合があった。ブロッキン
グ効果が低下すると測定のバックグランドレベルが上昇
し、高感度の免疫測定が困難になる。
を長期保存すると、不活性タンパク質を含むがために沈
殿の発生、微生物の増繁殖等の問題が生じ、その結果、
ブロッキング効果が低下する場合があった。ブロッキン
グ効果が低下すると測定のバックグランドレベルが上昇
し、高感度の免疫測定が困難になる。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】従って、本発明の目的
は、長期保存してもブロッキング効果の低下が従来のも
のよりも有意に小さな免疫反応用媒体を提供することで
ある。
は、長期保存してもブロッキング効果の低下が従来のも
のよりも有意に小さな免疫反応用媒体を提供することで
ある。
【０００５】
【課題を解決するための手段】本願発明者らは、鋭意研
究の結果、不活性タンパク質としてカゼインを含み、か
つフェノール誘導体を含む免疫反応用媒体が、長期間保
存してもブロッキング効果がほとんど低下しないことを
見出し本発明を完成した。
究の結果、不活性タンパク質としてカゼインを含み、か
つフェノール誘導体を含む免疫反応用媒体が、長期間保
存してもブロッキング効果がほとんど低下しないことを
見出し本発明を完成した。
【０００６】すなわち、本発明は、フェノール誘導体及
びカゼインを含む免疫反応用媒体を提供する。また、本
発明は、上記本発明の免疫反応用媒体を免疫反応時に用
いる免疫測定方法を提供する。
びカゼインを含む免疫反応用媒体を提供する。また、本
発明は、上記本発明の免疫反応用媒体を免疫反応時に用
いる免疫測定方法を提供する。
【０００７】以下、本発明を詳細に説明する。
【０００８】本発明において、「免疫反応用媒体」と
は、最終的に、これを単独あるいは他のものと混合する
ことにより免疫反応を行う場を与える液状組成物を意味
する。すなわち、免疫分析に供される検体を希釈するた
めの希釈液、抗体液の媒体、抗原標準液の媒体等を包含
する。
は、最終的に、これを単独あるいは他のものと混合する
ことにより免疫反応を行う場を与える液状組成物を意味
する。すなわち、免疫分析に供される検体を希釈するた
めの希釈液、抗体液の媒体、抗原標準液の媒体等を包含
する。
【０００９】本発明の免疫反応用媒体は、従来から用い
られている水系緩衝液をその基本とするものであってよ
い。
られている水系緩衝液をその基本とするものであってよ
い。
【００１０】上述のように、本発明の免疫反応用媒体に
は、カゼインとフェノール誘導体とが含まれる。これら
の濃度は、特に限定されないが、通常それぞれ0.005%〜
1.0%及び0.001%〜1.0%、好ましくはそれぞれ0.01% 〜0.
8%及び0.01% 〜0.8%である。
は、カゼインとフェノール誘導体とが含まれる。これら
の濃度は、特に限定されないが、通常それぞれ0.005%〜
1.0%及び0.001%〜1.0%、好ましくはそれぞれ0.01% 〜0.
8%及び0.01% 〜0.8%である。
【００１１】フェノール誘導体としてはｐ−ヒドロキシ
安息香酸エステルが好ましく、特にｐ−ヒドロキシ安息
香酸メチル及びｐ−ヒドロキシ安息香酸エチルが好まし
い。
安息香酸エステルが好ましく、特にｐ−ヒドロキシ安息
香酸メチル及びｐ−ヒドロキシ安息香酸エチルが好まし
い。
【００１２】本発明は、上記本発明の免疫反応用媒体を
用いる免疫測定方法をも提供する。免疫測定方法自体は
何ら限定されるものではなく、従来の免疫測定方法のい
ずれであってもよい。免疫測定方法に供される検体も何
ら限定されるものではなく、血液、血清、尿、髄液等を
挙げることができるがこれらに限定されるものではな
い。また、測定対象となる物質も全く限定されない。後
述の実施例ではα1 −アンチキモトリプシンを測定して
いるがもちろんこれに限定されるものではない。
用いる免疫測定方法をも提供する。免疫測定方法自体は
何ら限定されるものではなく、従来の免疫測定方法のい
ずれであってもよい。免疫測定方法に供される検体も何
ら限定されるものではなく、血液、血清、尿、髄液等を
挙げることができるがこれらに限定されるものではな
い。また、測定対象となる物質も全く限定されない。後
述の実施例ではα1 −アンチキモトリプシンを測定して
いるがもちろんこれに限定されるものではない。
【００１３】
【発明の効果】本発明の免疫反応用媒体は、長期保存後
も、そのブロッキング効果がほとんど低下しない。
も、そのブロッキング効果がほとんど低下しない。
【００１４】
【実施例】以下、本発明を実施例に基づきより具体的に
説明する。もっとも、本発明は下記実施例に限定される
ものではない。
説明する。もっとも、本発明は下記実施例に限定される
ものではない。
【００１５】免疫反応用媒体としての保存安定性を以下
の方法で確認した。
の方法で確認した。
【００１６】１．測定原理と測定法の概略 ２ステップサンドイッチアッセイを利用した酵素免疫測
定法（ＥＩＡ）により検体中のアンチキモトリプシン
（ＡＣＴ）濃度を測定するものである。
定法（ＥＩＡ）により検体中のアンチキモトリプシン
（ＡＣＴ）濃度を測定するものである。
【００１７】反応チューブに検体及びバッファーを分注
し、抗ＡＣＴ抗体結合ビーズを加え反応後、未反応物質
を洗浄し酵素標識抗ＡＣＴ抗体を加え、ＡＣＴと抗体の
サンドイッチ複合体を形成させる。さらに洗浄後、発色
剤及び基質を加えると標識した酵素により発色する。そ
の発色の度合いは波長４９２nmの吸光度を測定すること
により数値化出来る。
し、抗ＡＣＴ抗体結合ビーズを加え反応後、未反応物質
を洗浄し酵素標識抗ＡＣＴ抗体を加え、ＡＣＴと抗体の
サンドイッチ複合体を形成させる。さらに洗浄後、発色
剤及び基質を加えると標識した酵素により発色する。そ
の発色の度合いは波長４９２nmの吸光度を測定すること
により数値化出来る。
【００１８】２．材料の調製 ａ．〈抗体固定化ビーズ〉 ポリスチレン製のビーズ（d;1/4inch)を適当数用意し
た。これをマヨネーズ瓶にいれ、エタノールを適当量加
え１５分置き、軽く振盪して油分など汚れを除去した。
蒸留水でよくビーズを洗いエタノールを完全に除いた。
さらに、０．２Ｍ炭酸バッファー；pH９．１で数回濯
ぎ、抗ＡＣＴ関連物抗体を２０μg/mlの濃度で含有する
上記炭酸バッファーをビーズが浸る量加えた。４℃温度
条件下で２４±２時間静置し、上記抗体を該ビーズに固
定化させた。燐酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で数回ビー
ズを洗い、０．５％のカゼインを含むＰＢＳ中に抗体を
固定化したビーズを置いた（ブロッキング反応）。この
反応は３７℃の温度条件下で１８±２時間である。その
後、該ビーズをＰＢＳで数回洗い、余分なタンパク質成
分を除いた。ついで、ｐ−ヒドロキシ安息香酸メチルを
０．０５％の濃度で含むＰＢＳ中に該ビーズを移し、４
℃で保管した。
た。これをマヨネーズ瓶にいれ、エタノールを適当量加
え１５分置き、軽く振盪して油分など汚れを除去した。
蒸留水でよくビーズを洗いエタノールを完全に除いた。
さらに、０．２Ｍ炭酸バッファー；pH９．１で数回濯
ぎ、抗ＡＣＴ関連物抗体を２０μg/mlの濃度で含有する
上記炭酸バッファーをビーズが浸る量加えた。４℃温度
条件下で２４±２時間静置し、上記抗体を該ビーズに固
定化させた。燐酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で数回ビー
ズを洗い、０．５％のカゼインを含むＰＢＳ中に抗体を
固定化したビーズを置いた（ブロッキング反応）。この
反応は３７℃の温度条件下で１８±２時間である。その
後、該ビーズをＰＢＳで数回洗い、余分なタンパク質成
分を除いた。ついで、ｐ−ヒドロキシ安息香酸メチルを
０．０５％の濃度で含むＰＢＳ中に該ビーズを移し、４
℃で保管した。
【００１９】また、免疫反応が行われる際、直接のビー
ズへの非特異吸着の程度を調べるため、抗体を添加する
工程を除いた上記方法により、抗体の固定化されていな
いビーズも同時に用意した。
ズへの非特異吸着の程度を調べるため、抗体を添加する
工程を除いた上記方法により、抗体の固定化されていな
いビーズも同時に用意した。
【００２０】ｂ．〈酵素標識抗体液〉 市販のウサギ抗ヒトａ１−アンチキモトリプシン抗体を
ＡＣＴを固定化したアフィニティーカラムクロマトグラ
フィーにより精製した。ついで過ヨウ素酸法（石川栄治
ら；酵素免疫測定法(1987)）に従い、ペルオキシダーゼ
（西洋わさび）を上記抗体に結合させ酵素標識化を行っ
た。それを不溶化タンパク質として０．０５％のカゼイ
ンを含有するＰＢＳに適当量加えて希釈し、酵素標識抗
体液を調製した。酵素標識抗体液には０．０５％のｐ−
ヒドロキシ安息香酸、０．１％のｐ−ヒドロキシ安息香
酸メチルを加え、４℃で保存した。
ＡＣＴを固定化したアフィニティーカラムクロマトグラ
フィーにより精製した。ついで過ヨウ素酸法（石川栄治
ら；酵素免疫測定法(1987)）に従い、ペルオキシダーゼ
（西洋わさび）を上記抗体に結合させ酵素標識化を行っ
た。それを不溶化タンパク質として０．０５％のカゼイ
ンを含有するＰＢＳに適当量加えて希釈し、酵素標識抗
体液を調製した。酵素標識抗体液には０．０５％のｐ−
ヒドロキシ安息香酸、０．１％のｐ−ヒドロキシ安息香
酸メチルを加え、４℃で保存した。
【００２１】ｃ．〈発色剤、基質液〉 発色剤は、オルトフェニレンジアミン二塩酸塩を使い、
安定化剤として０．０５％トリポリ燐酸を含む溶液に規
定量（使用濃度3mg/ml）溶かした後、凍結乾燥させた。
基質液は０．０２％過酸化水素水を含む溶液を用い、使
用時に双方を混ぜ合わせ発色液として用いた。
安定化剤として０．０５％トリポリ燐酸を含む溶液に規
定量（使用濃度3mg/ml）溶かした後、凍結乾燥させた。
基質液は０．０２％過酸化水素水を含む溶液を用い、使
用時に双方を混ぜ合わせ発色液として用いた。
【００２２】ｄ．〈反応停止液〉 発色反応停止は１Ｎ硫酸を用いた。
【００２３】ｅ．〈免疫反応用緩衝液〉 免疫反応の際、検体希釈等に用いる本発明の免疫反応用
媒体として次にある緩衝液を調製した。ＰＢＳに含有量
０．５％となるようにカゼインを溶解し、該緩衝液とし
た。比較例にＰＢＳに含有量１％となるようにＢＳＡを
溶解した。さらにフェノール誘導体として０．０５％ｐ
−ヒドロキシ安息香酸メチルまたは０．０５％ｐ−ヒド
ロキシ安息香酸エチルを添加した。また、比較対照とし
て無添加のものも用意した。
媒体として次にある緩衝液を調製した。ＰＢＳに含有量
０．５％となるようにカゼインを溶解し、該緩衝液とし
た。比較例にＰＢＳに含有量１％となるようにＢＳＡを
溶解した。さらにフェノール誘導体として０．０５％ｐ
−ヒドロキシ安息香酸メチルまたは０．０５％ｐ−ヒド
ロキシ安息香酸エチルを添加した。また、比較対照とし
て無添加のものも用意した。
【００２４】各調製した緩衝液は４℃で保存した。実施
例ではこれを免疫一次反応時の検体の希釈液に用い、下
記の強制劣化試験の対照とした。
例ではこれを免疫一次反応時の検体の希釈液に用い、下
記の強制劣化試験の対照とした。
【００２５】〈免疫反応用媒体として上記緩衝液の強制
劣化処理〉上記にある各緩衝液のそれぞれ一部を長期保
存試験の代替となる様、３７℃温度条件下で７日間、イ
ンキュベター内に置いて強制劣化させた。
劣化処理〉上記にある各緩衝液のそれぞれ一部を長期保
存試験の代替となる様、３７℃温度条件下で７日間、イ
ンキュベター内に置いて強制劣化させた。
【００２６】実施例では、上記処理を施した緩衝液を一
次反応時の検体の希釈液として用い、保存安定性を調べ
た。
次反応時の検体の希釈液として用い、保存安定性を調べ
た。
【００２７】〈フェノール誘導体の添加量の調整〉フェ
ノール誘導体の添加濃度の該媒体の性能への影響を調べ
る目的で、カゼインを含むＰＢＳにｐ−ヒドロキシ安息
香酸メチルを0.0 〜0.40％の濃度で変化させた。添加量
は以下の通り。0.0, 0.001, 0.005, 0.01, 0.05, 0.10,
0.15,0.20, 0.40％
ノール誘導体の添加濃度の該媒体の性能への影響を調べ
る目的で、カゼインを含むＰＢＳにｐ−ヒドロキシ安息
香酸メチルを0.0 〜0.40％の濃度で変化させた。添加量
は以下の通り。0.0, 0.001, 0.005, 0.01, 0.05, 0.10,
0.15,0.20, 0.40％
【００２８】３．検体の準備 測定対象の検体として正常人血清プール、腹水、正常人
髄液プールを用いた。検体は上記２−ｅの条件で保存し
た各緩衝液でそれぞれ３００倍、１５００倍、２倍に希
釈した。また、バックグラウンドの測定として希釈液の
み（抗原なし）の検体を同時に用意した。また、フェノ
ール誘導体の添加濃度の検体への影響は血清において行
った。フェノール誘導体としてｐ−ヒドロキシ安息香酸
メチルを用いた。
髄液プールを用いた。検体は上記２−ｅの条件で保存し
た各緩衝液でそれぞれ３００倍、１５００倍、２倍に希
釈した。また、バックグラウンドの測定として希釈液の
み（抗原なし）の検体を同時に用意した。また、フェノ
ール誘導体の添加濃度の検体への影響は血清において行
った。フェノール誘導体としてｐ−ヒドロキシ安息香酸
メチルを用いた。
【００２９】４．具体的測定操作 標準液１００μｌ、次いで免疫反応用緩衝液１５０μｌ
をチューブ（トレイ）へ分注した。抗体結合ビーズをピ
ンセットで１個ずつ加えた。つぎにトレイにシールをか
ぶせて、３７℃水浴中、１．５時間静置した。その後、
１．５ml以上のＰＢＳで３回洗浄した。２５０μｌの酵
素標識抗体液を加え、室温（１５〜２５℃）で１．５時
間静置した。反応終了後、１．５ml以上のＰＢＳで４回
洗浄した。ビーズを別のチューブへ移動させ、３００μ
ｌの発色基質を加え、室温で３０分間静置した。１mlの
反応停止液を加えた。その溶液の波長４９２nmの吸光度
を測定した。
をチューブ（トレイ）へ分注した。抗体結合ビーズをピ
ンセットで１個ずつ加えた。つぎにトレイにシールをか
ぶせて、３７℃水浴中、１．５時間静置した。その後、
１．５ml以上のＰＢＳで３回洗浄した。２５０μｌの酵
素標識抗体液を加え、室温（１５〜２５℃）で１．５時
間静置した。反応終了後、１．５ml以上のＰＢＳで４回
洗浄した。ビーズを別のチューブへ移動させ、３００μ
ｌの発色基質を加え、室温で３０分間静置した。１mlの
反応停止液を加えた。その溶液の波長４９２nmの吸光度
を測定した。
【００３０】５．結果 結果は下記表１及び表２並びに図１及び図２に示す。
【００３１】
【表１】
【００３２】
【表２】
【００３３】
【表３】
【００３４】免疫反応用媒体の保存安定性に及ぼすフェ
ノール誘導体の作用 表１及び表２に示されるように、免疫一時反応における
媒体は４℃保存条件下では安定であった。強制劣化試験
を行うと、媒体に対しフェノール誘導体を含まないもの
はブロッキング能が著しく低下し、直接のビーズへの非
特異吸着の影響が見逃せないレベルまで上昇し、目視上
も白濁が確認された。フェノール誘導体添加媒体ではブ
ロッキング能の低下は殆ど無く、目視上の変化も見られ
なかった（表１）。比較例に用いた不活性タンパク質と
してＢＳＡを含有した媒体には先の効果はなかった（表
２）。また、安息香酸メチルの添加量の性能への影響
は、その濃度０．０１〜０．４０重量％の範囲で有効で
あった（表３並びに図１及び図２）。
ノール誘導体の作用 表１及び表２に示されるように、免疫一時反応における
媒体は４℃保存条件下では安定であった。強制劣化試験
を行うと、媒体に対しフェノール誘導体を含まないもの
はブロッキング能が著しく低下し、直接のビーズへの非
特異吸着の影響が見逃せないレベルまで上昇し、目視上
も白濁が確認された。フェノール誘導体添加媒体ではブ
ロッキング能の低下は殆ど無く、目視上の変化も見られ
なかった（表１）。比較例に用いた不活性タンパク質と
してＢＳＡを含有した媒体には先の効果はなかった（表
２）。また、安息香酸メチルの添加量の性能への影響
は、その濃度０．０１〜０．４０重量％の範囲で有効で
あった（表３並びに図１及び図２）。
【００３５】このように、本発明の免疫反応用媒体は、
強制劣化後も、そのブロッキング効果がほとんど減少せ
ず、長期保存に耐え得ることが実験的に確認された。
強制劣化後も、そのブロッキング効果がほとんど減少せ
ず、長期保存に耐え得ることが実験的に確認された。
【図１】カゼインと種々の濃度のｐ−ヒドロキシ安息香
酸メチルを含む、４℃で７日間保存した免疫反応用媒体
を用い、抗体を固定した又は固定しないビーズを用いて
免疫測定を行った結果を示す図である。
酸メチルを含む、４℃で７日間保存した免疫反応用媒体
を用い、抗体を固定した又は固定しないビーズを用いて
免疫測定を行った結果を示す図である。
【図２】カゼインと種々の濃度のｐ−ヒドロキシ安息香
酸メチルを含む、３７℃で７日間保存した免疫反応用媒
体を用い、抗体を固定した又は固定しないビーズを用い
て免疫測定を行った結果を示す図である。
酸メチルを含む、３７℃で７日間保存した免疫反応用媒
体を用い、抗体を固定した又は固定しないビーズを用い
て免疫測定を行った結果を示す図である。
Claims (7)
- 【請求項１】 フェノール誘導体及びカゼインを含む免
疫反応用媒体。 - 【請求項２】 フェノール誘導体及びカゼインの濃度が
それぞれ0.001%〜1.0%及び0.005%〜1.0%である請求項１
記載の免疫反応用媒体。 - 【請求項３】 フェノール誘導体がｐ−ヒドロキシ安息
香酸エステルである請求項１又は２記載の免疫反応用媒
体。 - 【請求項４】 フェノール誘導体がｐ−ヒドロキシ安息
香酸メチル又はｐ−ヒドロキシ安息香酸エチルである請
求項３記載の免疫反応用媒体。 - 【請求項５】 検体中の測定対象物質を免疫学的に測定
する際の検体の希釈液である請求項１ないし４のいずれ
か１項に記載の免疫反応用媒体。 - 【請求項６】 請求項１ないし５の免疫反応用媒体を免
疫反応時に用いる免疫測定方法。 - 【請求項７】 α1 −アンチキモトリプシンを測定する
請求項６記載の方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2737394A JPH07218506A (ja) | 1994-01-31 | 1994-01-31 | 免疫反応用媒体及びそれを用いる免疫測定方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2737394A JPH07218506A (ja) | 1994-01-31 | 1994-01-31 | 免疫反応用媒体及びそれを用いる免疫測定方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH07218506A true JPH07218506A (ja) | 1995-08-18 |
Family
ID=12219249
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2737394A Pending JPH07218506A (ja) | 1994-01-31 | 1994-01-31 | 免疫反応用媒体及びそれを用いる免疫測定方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH07218506A (ja) |
-
1994
- 1994-01-31 JP JP2737394A patent/JPH07218506A/ja active Pending
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