JPH0724585B2 - 放線菌プロモーターｄｎａ配列 - Google Patents
放線菌プロモーターｄｎａ配列Info
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- JPH0724585B2 JPH0724585B2 JP63088156A JP8815688A JPH0724585B2 JP H0724585 B2 JPH0724585 B2 JP H0724585B2 JP 63088156 A JP63088156 A JP 63088156A JP 8815688 A JP8815688 A JP 8815688A JP H0724585 B2 JPH0724585 B2 JP H0724585B2
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- JP
- Japan
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- gene
- promoter
- dna
- actinomycetes
- protein
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-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/74—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora
- C12N15/76—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora for Actinomyces; for Streptomyces
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Description
【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は放線菌の遺伝子操作技術における新規なプロモ
ーター遺伝子に関する。
ーター遺伝子に関する。
（従来の技術及び発明が解決しようとする課題） 大腸菌を宿主とする遺伝子操作技術における発現に関す
るプロモーター遺伝子に関しては既にかなり研究されて
きている。しかし放線菌を宿主とする遺伝子操作に関し
てはプロモーター遺伝子の研究は殆ど進んでいない。
るプロモーター遺伝子に関しては既にかなり研究されて
きている。しかし放線菌を宿主とする遺伝子操作に関し
てはプロモーター遺伝子の研究は殆ど進んでいない。
インターフェロン等の有用蛋白質を遺伝子操作の手法を
用いて微生物に産生させる場合、目的産物が微生物にと
って有害な場合が多い。制御できないプロモーターを用
いて外来遺伝子を発現させると、微生物の増殖期に目的
産物を作り続けるため自己防衛ができず、宿主菌は死滅
し目的産物を多量に作らしめる事が困難である。
用いて微生物に産生させる場合、目的産物が微生物にと
って有害な場合が多い。制御できないプロモーターを用
いて外来遺伝子を発現させると、微生物の増殖期に目的
産物を作り続けるため自己防衛ができず、宿主菌は死滅
し目的産物を多量に作らしめる事が困難である。
もし人為的に外からのシグナルで発現を制御できれば、
目的とする時期、例えば微生物の成育が終了した時期よ
り有用産物を産生させる事が可能となる。
目的とする時期、例えば微生物の成育が終了した時期よ
り有用産物を産生させる事が可能となる。
このような例として最近ストレプトミセス・リビダンス
（Streptomyces Iividans）のガラクトースオペロンの
プロモーター（gal P1）を用いた研究が発表されている
（Proc.Natl.Acad.Sci.USA,Vol84,2130〜2134,1987）。
しかしながら放線菌の遺伝子操作分野において、より有
用なプロモーターが求められていた。
（Streptomyces Iividans）のガラクトースオペロンの
プロモーター（gal P1）を用いた研究が発表されている
（Proc.Natl.Acad.Sci.USA,Vol84,2130〜2134,1987）。
しかしながら放線菌の遺伝子操作分野において、より有
用なプロモーターが求められていた。
（課題を解決するための手段及び作用） 本発明者らは放線菌の遺伝子操作でプラスミドの選択に
広く用いられているチオストレプトンを遺伝子発現のイ
ンデューサーとして発現を制御できる特殊なプロモータ
ー遺伝子を見付けた。
広く用いられているチオストレプトンを遺伝子発現のイ
ンデューサーとして発現を制御できる特殊なプロモータ
ー遺伝子を見付けた。
即ち本発明はチオストレプトンにより発現が誘導される
プロモーター遺伝子に関する。更に詳しく述べれば第７
図に含まれるチオストレプトンにより誘導される19kd蛋
白質のプロモーター領域のDNA配列の中の実質的にプロ
モーターとしての役目を果たす部分の遺伝子に関する。
プロモーター遺伝子に関する。更に詳しく述べれば第７
図に含まれるチオストレプトンにより誘導される19kd蛋
白質のプロモーター領域のDNA配列の中の実質的にプロ
モーターとしての役目を果たす部分の遺伝子に関する。
更に本発明はこのプロモーター遺伝子を組み込むことに
よるヒト由来インターフェロン等、種々の外来有用物質
をコードする遺伝子の発現の利用にも関する。
よるヒト由来インターフェロン等、種々の外来有用物質
をコードする遺伝子の発現の利用にも関する。
本発明の経緯は次の通りである。ストレプトミセス・リ
ビダンス（Streptomyces Iividans）66にプラスミドpIJ
702を導入した株（FERM BP−739）を培養しておき、生
育期又は定常期にチオストレプトンを添加すると、添加
後数時間で多量の蛋白質（19kd）がストレプトミセス・
リビダンス66（pIJ702）の染色対から誘導的に発現して
くることを見出だした。この蛋白質がコードされる遺伝
子をクローニングし、その遺伝子の発現制御部位（プロ
モーター領域）を有用遺伝子を放線菌で発現させる場合
の道具として用いれば、目的とする遺伝子をチオストレ
プトンの添加というスイッチで目的とする時期に発現さ
せる事が可能となる。
ビダンス（Streptomyces Iividans）66にプラスミドpIJ
702を導入した株（FERM BP−739）を培養しておき、生
育期又は定常期にチオストレプトンを添加すると、添加
後数時間で多量の蛋白質（19kd）がストレプトミセス・
リビダンス66（pIJ702）の染色対から誘導的に発現して
くることを見出だした。この蛋白質がコードされる遺伝
子をクローニングし、その遺伝子の発現制御部位（プロ
モーター領域）を有用遺伝子を放線菌で発現させる場合
の道具として用いれば、目的とする遺伝子をチオストレ
プトンの添加というスイッチで目的とする時期に発現さ
せる事が可能となる。
このため前述の19kdの蛋白質がコードされる遺伝子をク
ローニングし、そのプロモーター領域を決定した。さら
にこのプロモーター領域を用いた場合E.coli由来のアミ
ノグリコシドリン酸化酵素（aph II）がチオストレプト
ン添加時にのみ発現されうる事を証明した（表１）。こ
れは外来遺伝子の発現にも本発明のプロモーター遺伝子
が利用できることを示している。
ローニングし、そのプロモーター領域を決定した。さら
にこのプロモーター領域を用いた場合E.coli由来のアミ
ノグリコシドリン酸化酵素（aph II）がチオストレプト
ン添加時にのみ発現されうる事を証明した（表１）。こ
れは外来遺伝子の発現にも本発明のプロモーター遺伝子
が利用できることを示している。
実施例１ （１）19kd蛋白質の精製 pIJ702の導入されたストレプトミセス・リビダンス66
（St.Iividans）（FERM BP−739）を20μg/mlのチオス
トレプトンを含むYEME培地（80ml/坂口フラスコ,31℃,4
8時間）で培養した。3gの菌体の粗抽出液より、ファル
マシア製FPLCを用いて19kd蛋白質を分離、精製した。用
いたカラム、溶出バッファーは次の通りである。
（St.Iividans）（FERM BP−739）を20μg/mlのチオス
トレプトンを含むYEME培地（80ml/坂口フラスコ,31℃,4
8時間）で培養した。3gの菌体の粗抽出液より、ファル
マシア製FPLCを用いて19kd蛋白質を分離、精製した。用
いたカラム、溶出バッファーは次の通りである。
第１工程：カラムMonoQ（ファルマシア製）、 溶出バッファー、50mM Tris−HCl（pH7.0） NaCl 0〜1Mグラジュエント 第２工程：カラムSuperose12（ファルマシア製）、 溶出バッファー、50mM Tris−HCl（pH7.0） 100mM NaCl 第３工程：カラムProRPC（ファルマシア製）、 溶出バッファー、H2O（0.1％トリフルオロ酢酸を含む）
→80％アセトニトリル（0.1％トリフルオロ酢酸を含
む） 19kdの蛋白質の検出はファルマシア製ファーストフロー
システムを用い、SDSポリアクリルアマイドゲルで分子
量をマーカーとして検出した。
→80％アセトニトリル（0.1％トリフルオロ酢酸を含
む） 19kdの蛋白質の検出はファルマシア製ファーストフロー
システムを用い、SDSポリアクリルアマイドゲルで分子
量をマーカーとして検出した。
（２）19kd蛋白質のＮ末端アミノ酸配列の分析 精製した19kd蛋白質はアミノ酸発列分析器（アプライド
・バイオシステム社製モデル470A）を用いてエドマン分
解し、Ｎ末端からのアミノ酸配列を14種決定した。第１
図に示すように、グリシン−イソロイシン−アスパラギ
ン酸−ロイシン−スレオニン−プロリン−グルタミン酸
−グルタミン酸−リジン−フェニルアラニン−グルタミ
ン酸−バリン−フェニルアラニン−グリシンであった。
・バイオシステム社製モデル470A）を用いてエドマン分
解し、Ｎ末端からのアミノ酸配列を14種決定した。第１
図に示すように、グリシン−イソロイシン−アスパラギ
ン酸−ロイシン−スレオニン−プロリン−グルタミン酸
−グルタミン酸−リジン−フェニルアラニン−グルタミ
ン酸−バリン−フェニルアラニン−グリシンであった。
（３）合成プローブの作成 19kd蛋白質をコードする遺伝子をクローニングするた
め、Ｎ末端より６番目のアミノ酸（プロリン）から14番
目のアミノ酸（グリシン）に対応する、DNA配列を求
め、DNA合成器（アプライドバイオシステム社製モデル3
80A）を用いて27ベースのオリゴヌクレオチドを合成し
た（第２図）。
め、Ｎ末端より６番目のアミノ酸（プロリン）から14番
目のアミノ酸（グリシン）に対応する、DNA配列を求
め、DNA合成器（アプライドバイオシステム社製モデル3
80A）を用いて27ベースのオリゴヌクレオチドを合成し
た（第２図）。
（４）19kd蛋白質をコードするDNAのクローニング ストレプトミセス・リビダンス66（FERM BP−737）染色
体DNAを制限酵素Sau3AIを用いて部分分解しておき、あ
らかじめBamHIで分解したλファージベクターEMBL3（ST
RATA GENE製）に結合させた。
体DNAを制限酵素Sau3AIを用いて部分分解しておき、あ
らかじめBamHIで分解したλファージベクターEMBL3（ST
RATA GENE製）に結合させた。
これをエシェリヒア・コリJM101株（東洋紡製）に導入
しプラークを形成させた。プラークをニトロセルロース
膜に移し取り、先の27ベースの合成DNAを32Pでラベルし
プローブとして用いハイブリダイズするクローン５個を
取得した。
しプラークを形成させた。プラークをニトロセルロース
膜に移し取り、先の27ベースの合成DNAを32Pでラベルし
プローブとして用いハイブリダイズするクローン５個を
取得した。
（５）ファージDNAの調製 グロスバーガー（Grossbergar）等の手法（Nucleic Aci
ds Research Vol 15,No16,1987）により合成プローブが
ハイブリダイズしたファージプラークより、DNAを精製
した。クローニングされたDNAの制限酵素地図（第３
図）を作成すると同時に、先の32Pでラベルした27ベー
スの合成プローブを用いて、サザン（Southern）法によ
って、ハイブリダイズする領域を決定したところ第３図
に示すPstI（Ｃ）−SstI（Ｄ）領域であった。
ds Research Vol 15,No16,1987）により合成プローブが
ハイブリダイズしたファージプラークより、DNAを精製
した。クローニングされたDNAの制限酵素地図（第３
図）を作成すると同時に、先の32Pでラベルした27ベー
スの合成プローブを用いて、サザン（Southern）法によ
って、ハイブリダイズする領域を決定したところ第３図
に示すPstI（Ｃ）−SstI（Ｄ）領域であった。
（６）DNA塩基配列の決定 M13ファージによるクローニングとDideoxyシーケンス法
（Proc.Natl.Acad.Sci.USA,1977,74;5463−5467）を用
いた塩基配列決定法を用いユナイテッド・ステイツ・バ
イオケミカル社のシーケーゼキットによりPstI（Ｃ）−
SstI（Ｄ）領域のDNA塩基配列を決定したところ、先に
分析した19kd蛋白質のＮ末端アミノ酸配列14個に対応す
るDNA配列（第４図）が存在した。
（Proc.Natl.Acad.Sci.USA,1977,74;5463−5467）を用
いた塩基配列決定法を用いユナイテッド・ステイツ・バ
イオケミカル社のシーケーゼキットによりPstI（Ｃ）−
SstI（Ｄ）領域のDNA塩基配列を決定したところ、先に
分析した19kd蛋白質のＮ末端アミノ酸配列14個に対応す
るDNA配列（第４図）が存在した。
（７）S1マッピングによるmRNA開始点の決定 YEME培地（80ml/坂口フラスコ,31℃）にpIJ702の導入さ
れたストレプトミセス・リビダンス66（FERM BP−739）
を植菌し、24時間後に20μg/mlのチオストレプトンを添
加した。さらに24時間培養後菌体を集めホップウッド
（Hopwood）等の方法（Genetic Manipulation of Strep
tomyces,The John Innes Foundation,England 1985）に
従いmRNAを分離した。一方第３図に示すSmaI（Ａ）−Ss
tI（Ｄ）のDNA領域をM13ファージにクローニングしたシ
ングルストランドDNAを鋳型に用い、27ベースの合成DNA
をプライマーとしてα−32P−dATPを用いてDNAを合成し
た。このDNAと先のmRNAを用い前記のホップウッド等の
方法に従いS1マッピングを行なったところ、19kd蛋白質
のコードされるmRNAの開始点は第３図に示す★にある事
が明らかとなった。
れたストレプトミセス・リビダンス66（FERM BP−739）
を植菌し、24時間後に20μg/mlのチオストレプトンを添
加した。さらに24時間培養後菌体を集めホップウッド
（Hopwood）等の方法（Genetic Manipulation of Strep
tomyces,The John Innes Foundation,England 1985）に
従いmRNAを分離した。一方第３図に示すSmaI（Ａ）−Ss
tI（Ｄ）のDNA領域をM13ファージにクローニングしたシ
ングルストランドDNAを鋳型に用い、27ベースの合成DNA
をプライマーとしてα−32P−dATPを用いてDNAを合成し
た。このDNAと先のmRNAを用い前記のホップウッド等の
方法に従いS1マッピングを行なったところ、19kd蛋白質
のコードされるmRNAの開始点は第３図に示す★にある事
が明らかとなった。
（８）プロモーター検索試験 次に放線菌で通常用いられるプロモーター検索用ベクタ
ーpIJ486（John Innes Culture Collection）を用い
て、プロモーター領域をクローニングした。先のS1マッ
ピングの結果より判断し第３図に示すSmaI（Ａ）−NaeI
（Ｂ）領域にプロモーター活性があると推定し、この領
域をE.coliベクターpUC13（ファルマシア製）のSmaI側
にサブクローニングした。次にこのプラスミドをEcoRI
とHind IIIでダブルダイジェストしたものと同じくpIJ4
86をEcoRIとHind IIIでダブルダイジェストしたものと
を結合させ、放線菌遺伝子操作で通常用いられる方法で
ストレプトミセス・リビダンスのプロトプラストに導入
した。R2YE培地上で再生した株の胞子をカナマイシン30
μg/ml、チオストレプトン2.5μg/mlを含むニュートリ
エントアガー（nutrient agar）（Difco社製）培地にレ
プリカし、成育する株を得、ここからプラスミドを分離
した。これらの株は第６図に示すように19kd蛋白質をコ
ードする遺伝子のプロモーター領域、SmaI（Ａ）−NaeI
（Ｂ）領域がアミノグリコシドリン酸化酵素遺伝子の上
流に挿入されたプラスミドpAK114プラスミドを保持して
いた。
ーpIJ486（John Innes Culture Collection）を用い
て、プロモーター領域をクローニングした。先のS1マッ
ピングの結果より判断し第３図に示すSmaI（Ａ）−NaeI
（Ｂ）領域にプロモーター活性があると推定し、この領
域をE.coliベクターpUC13（ファルマシア製）のSmaI側
にサブクローニングした。次にこのプラスミドをEcoRI
とHind IIIでダブルダイジェストしたものと同じくpIJ4
86をEcoRIとHind IIIでダブルダイジェストしたものと
を結合させ、放線菌遺伝子操作で通常用いられる方法で
ストレプトミセス・リビダンスのプロトプラストに導入
した。R2YE培地上で再生した株の胞子をカナマイシン30
μg/ml、チオストレプトン2.5μg/mlを含むニュートリ
エントアガー（nutrient agar）（Difco社製）培地にレ
プリカし、成育する株を得、ここからプラスミドを分離
した。これらの株は第６図に示すように19kd蛋白質をコ
ードする遺伝子のプロモーター領域、SmaI（Ａ）−NaeI
（Ｂ）領域がアミノグリコシドリン酸化酵素遺伝子の上
流に挿入されたプラスミドpAK114プラスミドを保持して
いた。
pAK114を保持するストレプトミセス・リビダンス66とpI
J1486を保持するストレプトミセス・リビダンス66のチ
オストレプトンの有無によるカナマイシン耐性の発現を
調べたところ、表１に示すようにpAK114を保持するスト
レプトミセス・リビダンス66はチオストレプトンが添加
された時のみカナマイシン耐性を示した。
J1486を保持するストレプトミセス・リビダンス66のチ
オストレプトンの有無によるカナマイシン耐性の発現を
調べたところ、表１に示すようにpAK114を保持するスト
レプトミセス・リビダンス66はチオストレプトンが添加
された時のみカナマイシン耐性を示した。
（９）SmaI（Ａ）−NaeI（Ｂ）フラグメントのDNA塩基
配列 以上の結果より19kd蛋白質のプロモーター領域は第３図
に示すSmaI（Ａ）−NaeI（Ｂ）領域と判断されたのでこ
の領域をM13ファージによるクローニングとDideoxyシー
ケンス法によってDNA塩基配列を決定した。第７図に示
すように149塩基からなる領域であった。
配列 以上の結果より19kd蛋白質のプロモーター領域は第３図
に示すSmaI（Ａ）−NaeI（Ｂ）領域と判断されたのでこ
の領域をM13ファージによるクローニングとDideoxyシー
ケンス法によってDNA塩基配列を決定した。第７図に示
すように149塩基からなる領域であった。
（発明の効果） 放線菌の遺伝子操作分野において、本発明にかかわるプ
ロモーター遺伝子を利用する事により有用物質の生産に
役立てる事ができる。
ロモーター遺伝子を利用する事により有用物質の生産に
役立てる事ができる。
第１図:19kd蛋白質のＮ末端アミノ酸配列を示す。 第２図:19kd蛋白質のＮ末端６番目から14番目のアミノ
酸に対応するDNA配列（合成プローブ）を示す。 第３図：合成プローブがハイブリダイズしたファージプ
ラークDNAの制限酵素地図である。 第４図：第３図のpstI（Ｃ）−sstI（Ｄ）に対応するDN
A塩基配列を示す。 第５図：プロモーター検索用ベクターpIJ486の制限酵素
地図を示す。 第６図:pAK114のプロモーター部位の塩基配列を示す。p
IJ486のHind III−EcoRIサイトにSmaI（Ａ）−Nae
（Ｂ）領域が挿入されている。 第７図：第３図のSmaI（Ａ）−NaeI（Ｂ）領域のDNA塩
基配列を示す。
酸に対応するDNA配列（合成プローブ）を示す。 第３図：合成プローブがハイブリダイズしたファージプ
ラークDNAの制限酵素地図である。 第４図：第３図のpstI（Ｃ）−sstI（Ｄ）に対応するDN
A塩基配列を示す。 第５図：プロモーター検索用ベクターpIJ486の制限酵素
地図を示す。 第６図:pAK114のプロモーター部位の塩基配列を示す。p
IJ486のHind III−EcoRIサイトにSmaI（Ａ）−Nae
（Ｂ）領域が挿入されている。 第７図：第３図のSmaI（Ａ）−NaeI（Ｂ）領域のDNA塩
基配列を示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｒ 1:465） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:465） Ｃ１２Ｒ 1:465）
Claims (2)
- 【請求項１】チオストレプトンにより発現が誘導され
る、次の塩基配列を含んでなるプロモーター遺伝子。 - 【請求項２】有用遺伝子を放線菌で発現させるとき、特
許請求の範囲第１項記載のプロモーター遺伝子を利用し
有用物質を産生させる方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP63088156A JPH0724585B2 (ja) | 1988-04-12 | 1988-04-12 | 放線菌プロモーターｄｎａ配列 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP63088156A JPH0724585B2 (ja) | 1988-04-12 | 1988-04-12 | 放線菌プロモーターｄｎａ配列 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH01262796A JPH01262796A (ja) | 1989-10-19 |
| JPH0724585B2 true JPH0724585B2 (ja) | 1995-03-22 |
Family
ID=13935063
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP63088156A Expired - Lifetime JPH0724585B2 (ja) | 1988-04-12 | 1988-04-12 | 放線菌プロモーターｄｎａ配列 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH0724585B2 (ja) |
-
1988
- 1988-04-12 JP JP63088156A patent/JPH0724585B2/ja not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH01262796A (ja) | 1989-10-19 |
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