JPH07250697A - 光学活性な側鎖エステルを有するセファロスポリン誘導体の新規製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】 不斉加水分解酵素を用いる不斉加水分解方法
により、従来の方法より後記一般式（１）で表される光
学活性な側鎖エステルを有するセファロスポリン誘導体
を簡便、且つ効率よく製造できる方法を提供する。 【構成】 一般式（２） 【化１】 （式中、Ｒ¹ は水素原子またはアシル基、Ｒ² は低級ア
ルキル基、Ｒ³ は低級アルキル基、シクロアルキル基、
アラルキル基または置換基を有していてもよいフェニル
基、Ｘは酸素原子または単結合を示し、Ｙは反応に関与
しない基を示す）で表される化合物の４位エステルのジ
アステレオマー混合物に水性媒体中一般式（２）で表さ
れる化合物の４位エステルのジアステレオマー混合物を
不斉加水分解する能力を有する酵素またはその含有物を
作用させることを特徴とする一般式（１） 【化２】 （式中、＊Ｃは不斉炭素原子を示し、Ｒ¹ 、Ｒ² 、
Ｒ³ 、ＸおよびＹは前記と同じ意味を有する）で表され
る光学活性な側鎖エステルを有するセファロスポリン誘
導体の製造法。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、酵素的不斉加水分解反
応により抗菌剤として有用な４位に光学活性な側鎖エス
テルを有するセファロスポリン誘導体の製造法に関す
る。

【０００２】

【従来の技術】セファロスポリン誘導体の４位エステル
のジアステレオマー混合物より光学活性な側鎖エステル
を有するセファロスポリン誘導体を得る方法としては、
カラムクロマトグラフィーもしくはジアステレオマー混
合物の結晶化等の物理化学的分離技術が知られている
（特開平５−１７８８６１号公報）。

【０００３】

【発明が解決しようとする課題】しかしながら、上記の
公知の方法では、大量合成を行う際には、反応の操作
性、収率および経済性等に問題があり、より効率よく簡
便に製造する方法が求められている。

【０００４】

【発明を解決するための手段】そこで、本発明者らは、
近年有機合成に微生物あるいは酵素を利用した反応を利
用する試みが盛んに行われ、特に医薬品およびその合成
中間体のような化学構造が複雑で、しかも光学活性な化
合物を得ることが必要な場合には、酵素の有する高い立
体選択性を利用する方法は非常に有効な方法であること
に着目し、上記の欠点を解決すべく種々研究を続けた結
果、ある特定の酵素源が、後記一般式（２）で表される
化合物の４位エステルのジアステレオマー混合物を不斉
加水分解する能力を有する作用を有することを見出し、
本発明を完成させたものである。

【０００５】すなわち、本発明は、一般式（２）

【０００６】

【化３】

【０００７】（式中、Ｒ¹ は水素原子またはアシル基、
Ｒ² は低級アルキル基、Ｒ³ は低級アルキル基、シクロ
アルキル基、アラルキル基または置換基を有していても
よいフェニル基、Ｘは酸素原子または単結合を示し、Ｙ
は反応に関与しない基を示す）で表される化合物の４位
エステルのジアステレオマー混合物に水性媒体中一般式
（２）で表される化合物の４位エステルのジアステレオ
マー混合物を不斉加水分解する能力を有する酵素または
その含有物を作用させることを特徴とする一般式（１）

【０００８】

【化４】

【０００９】（式中、＊Ｃは不斉炭素原子を示し、
Ｒ¹ 、Ｒ² 、Ｒ³ 、ＸおよびＹは前記と同じ意味を有す
る）で表される光学活性な側鎖エステルを有するセファ
ロスポリン誘導体の製造法を提供するものである。

【００１０】一般式（２）において定義される基Ｒ¹ と
しては水素原子またはアシル基が示される。このアシル
基としては、脂肪族アシル、芳香族アシルおよび複素環
アシル等のアシル基が挙げられる。脂肪族アシル基とし
ては、例えばホルミル、アセチル、サクシニル、ヘキサ
ノイル、ヘプタノイル、ステアロイル基等のアルカノイ
ル基、メトキシカルボニル、エトキシカルボニル、ｔ−
ブトキシカルボニル、ｔ−ペンチルオキシカルボニル、
ヘプチルオキシカルボニル基等のアルコキシカルボニル
基、メタンスルホニル、エタンスルホニル、ヘプタンス
ルホニル基等のアルカンスルホニル基が挙げられる。

【００１１】芳香族アシル基としては、例えばベンゾイ
ル、トルオイル、ナフトイル等のアロイル基、フェニル
アセチル、フェニルプロピオニル基等のアリール（低
級）アルカノイル基、フェノキシカルボニル、ナフトキ
シカルボニル基等のアリールオキシカルボニル基、フェ
ノキシアセチル、フェノキシプロピオニル基等のアリー
ルオキシ（低級）アルカノイル基、フェニルグリオキシ
ロイル、ナフチルグリオキシロイル基等のアリールグリ
オキシロイル基、ベンジルオキシカルボニル、ジフェニ
ルメトキシカルボニル基等のアリール（低級）アルコキ
シカルボニル基、ベンゼンスルホニル、ｐ−トルエンス
ルホニル基等のベンゼンスルホニル基等が挙げられる。

【００１２】複素環アシル基としては、複素環カルボニ
ル基および複素環（低級）アルカノイル基が挙げられ
る。上記の複素環部分としては、窒素原子、硫黄原子お
よび酸素原子等から選ばれた少なくとも１つの複素原子
を含む飽和もしくは不飽和の３〜８員単環または多環複
素環式基が挙げられる。好ましいものとしては、例えば
チアゾリル基、イソチアゾリル基、１，２，３−チアジ
アゾリル、１，２，４−チアジアゾリル、１，３，４−
チアジアゾリル、１，２，５−チアジアゾリル等のチア
ジアゾリル基、ジヒドロチアジアジニル基等の複素原子
として１〜２個の硫黄原子および１〜３個の窒素原子を
有する５〜６員不飽和単環複素環式基、チエニル基、ジ
ヒドロジチイニル基、ジヒドロジチオニル基等の複素原
子として１〜２個の硫黄原子を有する５〜６員不飽和単
環複素環式基、フリル基、ピラニル基等の複素原子とし
て１〜２個の酸素原子を有する５〜６員不飽和単環複素
環式基、ピリジル基、ジヒドロピリジル基、ピリミジル
基、イミダゾリル基、ピラゾリル基、テトラゾリル基等
の複素原子として１〜４個の窒素原子を有する５〜６員
不飽和単環複素環式基等が挙げられる。また、低級アル
カノイル部分としては、アセチル基、プロピオニル基等
のアルカノイル基が挙げられる。

【００１３】上記のアシル部分は、さらに、例えばメチ
ル、エチル等の低級アルキル基、メトキシ、エトキシ、
プロポキシ等の低級アルコキシ基、メチルチオ、エチル
チオ等の低級アルキルチオ基、塩素原子、臭素原子、弗
素原子等のハロゲン原子、アミノ基、シアノ基、ニトロ
基、イミノ基、オキソ基、カルボキシル基、式＝Ｎ−Ｏ
−Ｒ⁴ （式中、Ｒ⁴ は水素原子、メチル、エチル、プロ
ピル、イソプロピル、ブチル、ペンチル、ヘキシルなど
の低級アルキル基、ビニル、アリル、２−ブテニル等の
低級アルケニル基、エチニル、２−プロピニル等の低級
アルキニル基、メトキシカルボニルメチル、エトキシカ
ルボニルメチル、プロポキシカルボニルメチル、ｔ−ブ
トキシカルボニルメチル、１−ｔ−ブトキシカルボニル
エチル等の低級アルコキシカルボニル（低級）アルキル
基のような保護されたカルボキシ（低級）アルキル基、
カルボキシメチル、カルボキシエチル等のカルボキシ
（低級）アルキル基等を示す）で表される基等のような
適当な置換基を有していてもよい。

【００１４】上記の如く定義されるアシル基のより好ま
しい例としては、下記式

【００１５】

【化５】

【００１６】（式中、Ｒ⁴¹は水素原子または低級アルキ
ル基を示す）で表される基が挙げられる。

【００１７】一般式（２）において定義される基Ｒ² と
しては低級アルキル基が示される。例えば、メチル、エ
チル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル等
の直鎖もしくは分鎖状の低級アルキル基が挙げられる。

【００１８】一般式（２）において定義される基Ｒ³ と
しては低級アルキル基、シクロアルキル基、アラルキル
基または置換基を有していてもよいフェニル基が示され
る。上記の低級アルキル基としては、例えば、メチル、
エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチ
ル、ｔ−ブチル等の直鎖もしくは分鎖状の炭素数１〜６
個のアルキル基が挙げられる。シクロアルキル基として
は、例えばシクロペンチル、シクロヘキシル基等の炭素
数３〜８個のシクロアルキル基が挙げられる。アラルキ
ル基としては、例えばベンジル、２−フェニルエチル、
２−フェニルプロピル等のフェニル−炭素数１〜４個の
低級アルキル基が挙げられる。置換基を有していてもよ
いフェニル基である場合の置換基としては、塩素原子、
臭素原子等のハロゲン原子、メチル、エチル等の低級ア
ルキル基、メトキシ、エトキシ等の低級アルコキシ基、
カルボキシル基、低級アルコキシカルボニル基、シアノ
基、ニトロ基等が挙げられる。上記基Ｒ³ は基Ｘ（式
中、Ｘは酸素原子または単結合を示す）を介して−Ｏ−
ＣＯ−のＣＯに結合する。

【００１９】一般式（２）において定義される基Ｙは反
応に関与しない基が示される。反応に関与しない基と
は、本法の反応に関与せず、且つ実質的に反応を妨げな
い基を意味する。例えば、水素原子、水酸基、メトキシ
メチル基、低級アルキル基で置換されていてもよいカル
バモイルオキシメチル基、適当な置換基で置換されてい
てもよい複素環チオメチル基等が挙げられる。

【００２０】一般式（２）で表される化合物の４位エス
テルのジアステレオマーの混合物〔以下、単に「化合物
（２）」と称する〕のうち、最適な化合物の一例として
は、（６Ｒ，７Ｒ）−７−アミノ−３−メトキシメチル
−３−セフェム−４−カルボン酸ピバロイルオキシエチ
ルエステル、７β−［２−（２−アミノチアゾール−４
ーイル）−（Ｚ）−２−（メトキシイミノ）アセタミ
ド］−３−メトキシメチル−３−セフェム−４−カルボ
ン酸イソプロポキシカルボニルオキシエチルエステル、
７−［（Ｚ）−２−（２−フリル）−２−メトキシイミ
ノアセタミド］−３−カルバモイルオキシメチル−３−
セフェム−４−カルボン酸アセトキシエチルエステル、
７β−［２−（２−アミノチアゾール−４ーイル）アセ
タミド］−３−［［［１−（２−ジメチルアミノエチ
ル）−１Ｈ−テトラゾール−５−イル］チオ］メチル］
−３−セフェム−４−カルボン酸シクロヘキシルオキシ
カルボニルオキシエチルエステル等が挙げられる。これ
らの製法は特開昭５８−１８９１８６号公報、特開昭５
９−１９０９９５号公報、特開平１−２４９７７８号公
報等に記載されている。

【００２１】本発明においては、化合物（２）に水性媒
体中一般式（２）で表される化合物の４位エステルのジ
アステレオマー混合物を不斉加水分解する能力を有する
酵素またはその含有物を作用させ不斉加水分解反応さ
せ、その反応混合物から生成物および未反応物とを各々
分離採取することにより、目的の一般式（１）で表され
る光学活性な側鎖エステルを有するセファロスポリン誘
導体〔以下、単に「目的化合物（１）」と称する〕が得
られる。

【００２２】上記の不斉加水分解反応に使用する酵素源
としては、一般式（２）で表される化合物の４位エステ
ルのジアステレオマー混合物を不斉加水分解する能力を
有する酵素〔以下、単に「不斉加水分解酵素」と称する
ことがある〕またはその含有物が挙げられる。不斉加水
分解酵素とは、該酵素自体を指し、実質的に精製された
形態をいうが、例えば、リパーゼ、エステラーゼ等の酵
素活性を有する酵素が挙げられる。不斉加水分解酵素の
含有物とは、該酵素活性を有するものであれば、いずれ
の形態でもよく、例えば、不斉加水分解酵素生産菌の培
養物、培養濾液、培養濾液から分離した粗酵素剤、菌
体、菌体破砕物、菌体破砕物から分離抽出した粗酵素
剤、該酵素を支持体に固定化した固定化酵素等が挙げら
れる。

【００２３】不斉加水分解酵素の具体例としては、市販
酵素としてモノグリセライドリパーゼ（バチルス属由
来、旭化成工業社製）、コレステロールエステラーゼ
（膵臓由来、オリエンタル酵母社製）等が挙げられる。
また、本発明者らにより新たに見出された新規なエステ
ラーゼであるエステラーゼＭＳを挙げることができる。

【００２４】エステラーゼＭＳは、次の酵素学的性質を
有する。 （１）作用 本酵素は少なくとも下記の反応に示す通り、化合物Ａよ
り化合物Ｂを生成する反応を触媒する。

【００２５】

【化６】

【００２６】（式中、＊Ｃは不斉炭素原子を示し、
（Ｒ）は絶対配置がＲ配置であることを示す）

【００２７】（２）基質特異性 式

【００２８】

【化７】

【００２９】で表される化合物Ｃの４位エステルのジア
ステレオマー混合物５ｍＭを含む１０％メタノール／
０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に種々の酵素を添
加し、３２℃で２時間反応を行った後、残存する基質量
を高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）にて測定し
た。ＨＰＬＣ分析条件は、下記の酵素活性の測定法にお
いて示すＨＰＬＣ分析条件で定量を行った（流速１ｍｌ
／分のときのＲ体およびＳ体の保持時間は、各々１６
分、１７．９分）。結果は表１の通りである。

【００３０】

【表１】

【００３１】以上の測定結果から、エステラーゼＭＳは
化合物Ｃのジアステレオマー混合物よりＲ体のみを特異
的に加水分解してＳ体を生成せしめるという基質特異性
を有する。また、エステラーゼＭＳは４−ニトロフェニ
ルアセテートおよびα−ナフチルアセテートにも作用す
る。

【００３２】（３）酵素活性の測定法 化合物Ａを２０ｍＭ含むメタノール溶液０．１ｍｌに
０．２５Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）０．４ｍｌを加
え、３０℃に加温した後、これに酵素溶液０．５ｍｌを
混合し、３０℃で３０分間反応させる。反応液にメタノ
ール１ｍｌを加えて反応を停止させ、遠心分離およびメ
ンブラン濾過により固形物を除去した後、生成した化合
物ＡをＨＰＬＣにより定量し、酵素活性を求める。

【００３３】酵素活性の表示は、上記の酵素反応条件下
で１分間に１μＭの化合物Ｂを生成する酵素量を１単位
とする。ＨＰＬＣ分析条件は次の通りである。 カラム；イナートシルＯＤＳ−２ ４．６×１５０ｍｍ
（ＧＬサイエンス社製） 移動層；５ｍＭテトラブチルアンモニウム ブロマイド
を含む０．０２Ｍリン酸ナトリウム／メタノール＝４
０：６０の混合液 検出波長；２５４ｎｍ

【００３４】（４）至適ｐＨ 前記活性測定における緩衝液として下記の各種ｐＨの緩
衝液を用いて、本酵素の活性に及ぼすｐＨの影響を調べ
た結果、本酵素の至適ｐＨはｐＨ８付近と認められた。 ｐＨ３〜６；クエン酸緩衝液 ｐＨ６〜８；リン酸緩衝液 ｐＨ７〜９；トリス−塩酸緩衝液 ｐＨ９〜１０；グリシン緩衝液

【００３５】（５）ｐＨ安定性 上記の各種ｐＨの緩衝液にて５０℃、３０分間加熱した
後、本酵素の活性を前記活性測定法に従って測定してｐ
Ｈの影響を調べた結果、本酵素はｐＨ６〜８で安定であ
る。

【００３６】（６）至適温度 ０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）で前記活性測定法
における反応液および方法を用いて種々の温度における
影響を調べた結果、本酵素の至適温度は４０℃付近であ
ると認められる。

【００３７】（７）熱安定性 酵素溶液（ｐＨ８）を５〜７０℃の各温度で１時間処理
した後、前記酵素活性測定法に従ってその残存活性を測
定した結果、本酵素の熱安定性はｐＨ８において４５℃
付近まで安定であることが認められた。

【００３８】（８）金属イオンの影響 前記酵素活性測定法において、各種金属塩を１０ｍＭ添
加し、酵素活性を測定した結果、本酵素はＣｕ^--、Ｆｅ
^--、Ｆｅ^--- で５０％以上の阻害が見られるが、Ｍ
ｎ^--、Ｍｇ^--、Ｚｎ^--、Ｎｉ^--、Ｃａ^--、Ｂａ^--および
Ｃｏ^--では８０％以上の活性が残存していた。

【００３９】（９）分子量約５００００ダルトン〔プロ
テインパック３００（ウォーターズ社製）を用いるゲル
濾過法により測定〕

【００４０】上記の酵素学的性質の観察から、エステラ
ーゼＭＳは、既知のエステラーゼおよびリパーゼと比較
して非常に特異な性質、特に化合物Ｃのジアステレオマ
ー混合物よりＲ体のみを特異的に加水分解してＳ体を生
成せしめるという特異的な性質を有する新規酵素であ
る。

【００４１】本エステラーゼＭＳを製造するには、スフ
ィンゴモナス属に属するエステラーゼＭＳ生産菌を培地
に培養し、培養物より該エステラーゼＭＳを採取すれば
よい。該エステラーゼＭＳ生産菌としては、例えば、本
発明者らにより新たに土壌から分離されたスフィンゴモ
ナス・エスピー（Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ ｓｐ．）
Ｎｏ．ＡＳ−０１３を用いるのが好適である。本菌株の
菌学的性質は次の通りである。

【００４２】（ａ）形態 肉汁寒天培地で培養した細胞は０．５〜１．０×３〜５
ミクロンの桿菌であり、周毛性のべん毛で運動する。胞
子は作らず、多形性も示さない。グラム染色性、抗酸性
は共に陰性である。

【００４３】（ｂ）培養的性質 １）肉汁寒天培養；菌体はクリーム色の円形のコロニー
を作る。遊走性は認められず、拡散性色素の生産も認め
られない。 ２）肉汁培養；培地全体が濁り成育する。液面での菌膜
の形成は認められない。

【００４４】３）肉汁ゼラチン穿刺培養；ゼラチンの液
化は認められない。 ４）リトマスミルク培養；顕著な変化は認められない。

【００４５】（ｃ）生理学的性質 １）硝酸塩の還元； 陰性 ２）脱窒反応； 陰性 ３）ＭＲテスト； 陰性 ４）ＶＰテスト； 陰性 ５）インドールの生成； 陰性 ６）硫化水素の生成； 陰性 ７）澱粉の加水分解； 陽性 ８）クエン酸の利用； 陰性 ９）無機窒素源の利用；アンモニウム塩を唯一の窒素源
として利用する １０）色素の生成； なし １１）ウレアーゼ； 陽性 １２）オキシダーゼ； 陽性 １３）カタラーゼ； 陽性 １４）生育温度；１５〜３７℃でよく生育するが、４２
℃では生育しない １５）生育ｐＨ；ｐＨ６〜８ではよく生育するが、ｐＨ
４．５では生育しない １６）嫌気下の増殖；認められない １７）Ｏ−Ｆテスト（ヒューレイフソン法）；陰性 １８）糖からの酸の生成（指示薬フェノールレッド） ガラクトース ＋ グルコース ＋ アラビノース ＋ フラクトース ＋ キシロース ＋ ラムノース − シュークロース ＋ Ｌ−アラビノース ＋ メリビオース ＋ トレハロース ＋ ラクトース ＋ ラフィノース ＋ マンノース ＋ マルトース ＋ セロビオース ＋ メレジトース − アドニトール − イノシトール − マンニトール ＋ ズルシトール − ソルビトール − エリスリトール − サリシン ＋ グリセリン ＋ 澱粉 ＋ １９）β−ガラクトシダーゼ； 陽性 ２０）エスクリンの分解； 陽性 ２１）アルギニンの分解； 陰性 ２２）リジンの脱炭酸反応； 陰性 ２３）オルニチンの脱炭酸反応； 陰性 ２４）マロン酸の利用； 陰性 ２５）Ｔｗｅｅｎ８０の加水分解； 陽性 ２６）ＭａｃＣｏｎｋｅｙ寒天培地生育； なし ２７）溶血性； なし ２８）ポリミキシンＢ生育； なし（３
００μｇ／ｍｌ） ２９）３％ＫＯＨによる溶菌； 陽性

【００４６】以上の菌学的性質より、本菌株はグラム陰
性好気性桿菌で、胞子を作らず、周毛によって運動する
という形態的特徴を有している。また、本菌株は通常の
ヒューレイフソン試験法によるＯ−Ｆテストでは、酸化
・発酵いずれも陰性であるが、指示薬としてクレゾール
レッド、フェノールレッド等を用いると多くの炭水化物
より酸の産生が認められる。また、本菌株は微弱ではあ
るが、炭水化物からの酸産生能を有している。従って、
本菌株の生理学的性質を基にＢｅｒｇｙ’ｓＭａｎｕａ
ｌ ｏｆ Ｓｙｓｔｅｍｉｃ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇ
ｙ，第１巻（１９８６）、Ｃｏｗａｎ ａｎｄ Ｓｔｅ
ｅｌ’ｓ Ｍａｎｕａｌ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｉｄｅｎｔ
ｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｂａｃｔ
ｅｒｉａ，第３版（１９９３）に基づいて分類学上の位
置について検索すると、本菌株はスフィンゴモナス・ア
ドヘシバ（Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ ａｄｈａｅｓｉ
ｖａ）に近いと同定されるが、一致する菌種はなかった
ので、取敢えず、本菌株をスフィンゴモナス・エスピー
（Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ ｓｐ．）Ｎｏ．ＡＳ−０
１３と命名した。本菌株は微工研菌寄第１４１１８号
（ＦＥＲＭ Ｐ−１４１１８）として、微生物工業技術
研究所に寄託されている。

【００４７】エステラーゼＭＳの生産に使用されるスフ
ィンゴモナス属に属するエステラーゼＭＳ生産菌として
は、上記のスフィンゴモナス・エスピーＮｏ．ＡＳ−０
１３はその一例であって、この菌株に限らず、スフィン
ゴモナス属に属し、エステラーゼＭＳを生産する微生物
であれば、野性株、変異株、または細胞融合もしくは遺
伝子操作法等の遺伝的手法により誘導される組換え株
等、いずれの株でも使用することができる。

【００４８】エステラーゼＭＳを製造するには、先ずエ
ステラーゼＭＳ生産菌を適当な培地で培養される。培養
の形態は、通常液体培地で通気攪拌培養するのが望まし
い。培地の栄養源としては、微生物の培養に通常使用さ
れるものが広く使用することができる。炭素源としては
同化可能な炭素化合物であればよく、例えばマルトー
ス、ラクトース等の糖類、窒素源としては利用可能な窒
素化合物であればよく、例えばペプトン、肉エキス、酵
母エキス、蛋白質加水分解物、硫酸アンモニウム等が使
用でき、その他無機塩、微量金属塩、ビタミン類等が必
要に応じて適宜使用される。

【００４９】上記微生物の培養は、常法によればよく、
エステラーゼＭＳ生産菌が生育し、本エステラーゼＭＳ
を生産する範囲内で適宜変更し得るが、通常２０〜３２
℃、ｐＨ６〜８の範囲で好気的に１〜３日間培養すれば
よい。

【００５０】かくして得られた培養物から本エステラー
ゼＭＳを採取するのであるが、本エステラーゼＭＳは、
通常、菌体内に含有されるので、得られた培養物から濾
過または遠心分離等の手段により集菌した菌体を機械的
破砕手段やリゾチーム等の酵素的破壊手段等の菌体処理
手段により菌体破砕物とし、これから公知の酵素を分離
・精製する手段を使用して、目的のエステラーゼＭＳを
種々の精製段階の酵素製剤を得ることができる。

【００５１】本発明の不斉加水分解反応は、水性媒体中
前記化合物（２）と不斉加水分解酵素またはその含有物
を混合し、攪拌または振盪することにより行われる。水
性媒体としては、水、水とメタノール、エタノール、ア
セトニトリル等の水と自由に混和できる有機溶媒との混
合物が挙げられる。上記の不斉加水分解反応の反応温度
は１０〜４０℃、好ましくは２０〜３０℃の範囲で、反
応ｐＨは７〜８の範囲で行うのが好ましい。反応時間は
基質濃度、不斉加水分解酵素またはその含有物の濃度な
らびにその他の反応条件等により左右されるが、反応経
過を高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）等により
追跡できるので、目的化合物（１）が最大に生成される
のを待って適宜反応を終了すればよいが、通常は１〜２
時間程度で終了するように反応条件を設定するのが好ま
しい。

【００５２】上記の不斉加水分解反応においては、不斉
加水分解によって生成する一般式（３）

【００５３】

【化８】

【００５４】（式中、Ｒ¹ およびＹは前記と同じ意味を
有する）で表されるカルボン酸を中和し、反応液のｐＨ
を一定に保つためにリン酸ナトリウム、リン酸カリウム
などの無機塩の緩衝液の使用もしくは水酸化ナトリウ
ム、水酸化カリウム等の塩基を添加することが望まし
い。

【００５５】反応液中の基質濃度は特に制限するもので
はないが、通常は０．１〜１０（Ｗ／Ｖ）％程度が好ま
しい。不斉加水分解酵素またはその含有物は、通常、基
質の重量に対して０．１〜５０（Ｗ）％程度で使用され
る。この際、基質である化合物（２）を反応液中によく
分散させるために、水と混合する溶媒、例えばメタノー
ル、エタノール、アセトニトリル等を添加してもよい。

【００５６】本発明においては、使用する不斉加水分解
酵素またはその含有物の種類により不斉加水分解の選択
性が異なるので、目的化合物（１）を所望する光学活性
体として得たい場合には、使用する不斉加水分解酵素ま
たはその含有物を選択すればよい。

【００５７】このようにして反応混合物中に生成された
目的化合物（１）は、反応混合物から生成物であるカル
ボン酸（３）および未反応物である目的化合物（１）と
を各々分離精製することにより目的の光学活性体である
目的化合物（１）を得ることができる。分離精製する方
法としては、セファロスポリン化学において使用される
公知の方法により行うことができる。例えば、反応混合
物から不斉加水分解酵素またはその含有物を遠心分離、
濾過等により分離した後、反応濾液を適当な溶媒による
精製、減圧濃縮、結晶化、凍結乾燥、再結晶化、アニオ
ンまたはカチオン交換樹脂、マクロポーラス非イオン性
吸着樹脂等を用いるクロマトグラフィー等の方法が挙げ
られる。

【００５８】上記の不斉加水分解反応の結果、得られた
目的化合物（１）は精々基質である化合物（２）の半量
しか得られないが、生成物であるカルボン酸（３）を相
当するエステルにエステル化することによりジアステレ
オマー混合物である化合物（２）に変換できるので、こ
の操作を繰り返し行うことにより、カルボン酸（３）を
廃棄することなく、効率よく目的化合物（１）を得るこ
とができる。

【００５９】

【発明の効果】不斉加水分解酵素またはその含有物を使
用する酵素的不斉加水分解方法による本発明方法によれ
ば、従来の方法より一般式（１）で表される光学活性な
側鎖エステルを有するセファロスポリン誘導体が簡便、
且つ効率よく得られる。

【００６０】

【実施例】次に、実施例および参考例を挙げて本発明の
製造例について具体的に説明するが、これにより本発明
を限定するものではない。

【００６１】

【実施例１】 （６Ｒ，７Ｒ）−７−アミノ−３−メトキシメチル−３
−セフェム−４−カルボン酸ピバロイルオキシエチルエ
ステルジアステレオマー混合物（化合物Ｃ）のＡＳ−０
１３株菌体懸濁液による不斉加水分解 ペプトン０．５％、肉エキス０．３％、酵母エキス０．
１％、硫酸マグネシウム７水塩０．０１％を含む液体培
地（ｐＨ７．０）１０Ｌを２０Ｌ容ジャーファーメンタ
ーに仕込み、加熱殺菌後、これに上記と同一組成培地で
培養したスフィンゴモナス・エスピーＡＳ−０１３株の
培養液５００ｍｌを植菌し、３２℃で４８時間通気攪拌
培養した。培養物を遠心分離により菌体を分離し、該菌
体を水１００ｍｌに懸濁した。

【００６２】一方、（６Ｒ，７Ｒ）−７−アミノ−３−
メトキシメチル−３−セフェム−４−カルボン酸ピバロ
イルオキシエチルエステルジアステレオマー混合物のｐ
−トルエンスルホン酸塩１０ｇをメタノール１２０ｍｌ
に溶解した溶液を水５８０ｍｌに加え、水酸化ナトリウ
ム水溶液でｐＨを８．０に調節した後、この溶液に前記
菌体懸濁液１００ｍｌを加え、２５℃でｐＨを８．０に
保ちながら２時間反応させた。反応終了後、菌体を分離
し、反応濾液を酢酸エチル８００ｍｌで抽出した。有機
層を分液後、減圧濃縮した。これにｐ−トルエンスルホ
ン酸１水和物０．９４ｇを酢酸エチル８ｍｌに溶解した
溶液を滴下し、１０分間攪拌した。反応物にジエチルエ
ーテル６ｍｌを加え３０分間攪拌した後、生じた結晶を
濾取した。得られた結晶を酢酸エチル６ｍｌ、ジエチル
エーテル６ｍｌの順で洗浄した後、減圧乾燥して白色粉
末３．２ｇ（収率３２％）を得た。この白色粉末をメタ
ノールに溶解し、ＨＰＬＣにより分析した結果、得られ
た生成物はＳ体の保持時間と一致し、下記の物性を有す
ることから（１Ｓ）−（２，２−ジメチルプロピオニル
オキシ）エチル−７−アミノ−３−メトキシメチル−３
−セフェム−４−カルボキシレート ｐ−トルエンスル
ホン酸塩であると同定した。

【００６３】融点；１７５℃（分解）¹ Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）δ；１．１５（ｓ，９
Ｈ）、１．４８（ｄ，３Ｈ）、２．２９（ｓ，３Ｈ）、
３．２１（ｓ，３Ｈ）、３．６９（ＡＢｑ，２Ｈ）、
４．１７（ｓ，２Ｈ）、５．２〜５．３（ｍ，２Ｈ）、
６．８８（ｑ，１Ｈ）、７．１１（ｄ，２Ｈ）、７．４
８（ｄ，２Ｈ） 光学純度；９７％ｅ．ｅ．

【００６４】ＨＰＬＣ分析条件； カラム：イナートシルＯＤＳ−２ ４．６×１５０ｍｍ
（ＧＬサイエンス社製） 移動相：５ｍＭテトラブチルアンモニウムブロマイドを
含む０．２Ｍリン酸ナトリウム／メタノール＝４０：６
０の混合液 検出波長：２５４ｎｍ 流速：１ｍｌ／分 保持時間：Ｒ体；１６分、Ｓ体；１７．９分

【００６５】

【実施例２】 （６Ｒ，７Ｒ）−７−アミノ−３−メトキシメチル−３
−セフェム−４−カルボン酸ピバロイルオキシエチルエ
ステルジアステレオマー混合物（化合物Ｃ）のモノグリ
セライドリパーゼによる不斉加水分解 （６Ｒ，７Ｒ）−７−アミノ−３−メトキシメチル−３
−セフェム−４−カルボン酸ピバロイルオキシエチルエ
ステルジアステレオマー混合物のｐ−トルエンスルホン
酸塩０．５ｇをメタノール１０ｍｌに溶解し、これに
０．１Ｍリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）９ｍｌを
加え、さらにモノグリセライドリパーゼ１００ｍｇを添
加し、３０℃で２時間攪拌した。反応液を実施例１に記
載のＨＰＬＣ分析条件により分析した結果、（１Ｒ）−
（２，２−ジメチルプロピオニルオキシ）エチル−７−
アミノ−３−メトキシメチル−３−セフェム−４−カル
ボキシレートが収率４５％（５０％×９０％）、光学純
度９９％ｅ．ｅ．で生成した。

【００６６】

【実施例３】 （６Ｒ，７Ｒ）−７−アミノ−３−メトキシメチル−３
−セフェム−４−カルボン酸ピバロイルオキシエチルエ
ステルジアステレオマー混合物（化合物Ｃ）のコレステ
ロールエステラーゼによる不斉加水分解 （６Ｒ，７Ｒ）−７−アミノ−３−メトキシメチル−３
−セフェム−４−カルボン酸ピバロイルオキシエチルエ
ステルジアステレオマー混合物のｐ−トルエンスルホン
酸塩０．５ｇをメタノール１０ｍｌに溶解し、これに
０．１Ｍリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）９ｍｌを
加え、さらにコレステロールエステラーゼ１０ｍｇを添
加し、３２℃で２時間攪拌した。反応液を実施例１に記
載のＨＰＬＣ分析条件により分析した結果、（１Ｒ）−
（２，２−ジメチルプロピオニルオキシ）エチル−７−
アミノ−３−メトキシメチル−３−セフェム−４−カル
ボキシレートが収率３０％（５０％×６０％）、光学純
度９６％ｅ．ｅ．で生成した。

【００６７】

【実施例４】 ７β−［２−（２−アミノチアゾール−４−イル）−
（Ｚ）−２−（メトキシイミノ）アセタミド］−３−メ
トキシメチル−３−セフェム−４−カルボン酸イソプロ
ポキシカルボニルオキシエチルエステルジアテレオマー
混合物のＡＳ−０１３株菌体懸濁液による不斉加水分解 ７β−［２−（２−アミノチアゾール−４−イル）−
（Ｚ）−２−（メトキシイミノ）アセタミド］−３−メ
トキシメチル−３−セフェム−４−カルボン酸イソプロ
ポキシカルボニルオキシエチルエステルジアテレオマー
混合物１０ｍｇをメタノール２ｍｌに溶解し、これに
０．５Ｍリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ８．０）５ｍｌを
加え、さらに実施例１に記載のＡＳ−０１３株の菌体懸
濁液３ｍｌを加え、３２℃で２時間攪拌した。反応液を
下記のＨＰＬＣ分析条件で分析した結果、ジアステレオ
マー２が収率４２．５％（５０％×８０％）、光学純度
９５％ｅ．ｅ．で得られた。

【００６８】ＨＰＬＣ分析条件； カラム：イナートシルＯＤＳ−２ ４．６×１５０ｍｍ
（ＧＬサイエンス社製） 移動相：メタノール：水＝４５：５５ 検出波長：２５４ｎｍ 流速：１．５ｍｌ／分 保持時間：ジアステレオマー１；１６．４分、ジアステ
レオマー２；２１．８分

【００６９】

【実施例５】 ７β−［２−（２−アミノチアゾール−４−イル）−
（Ｚ）−２−（メトキシイミノ）アセタミド］−３−メ
トキシメチル−３−セフェム−４−カルボン酸イソプロ
ポキシカルボニルオキシエチルエステルジアテレオマー
混合物のモノグリセライドリパーゼによる不斉加水分解 ７β−［２−（２−アミノチアゾール−４−イル）−
（Ｚ）−２−（メトキシイミノ）アセタミド］−３−メ
トキシメチル−３−セフェム−４−カルボン酸イソプロ
ポキシカルボニルオキシエチルエステルジアテレオマー
混合物１０ｍｇをメタノール１ｍｌに溶解し、これに
０．１Ｍリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）９ｍｌを
加え、さらにモノグリセライドリパーゼ２０ｍｇを加
え、３２℃で２時間攪拌した。反応液を実施例４に記載
のＨＰＬＣ分析条件で分析した結果、ジアステレオマー
１が収率４６％（５０％×９０％）、光学純度９８％
ｅ．ｅ．で得られた。

【００７０】

【参考例１】 エステラーゼＭＳの製造 実施例１記載と同様の方法で得たスフィンゴモナス・エ
スピーＡＳ−０１３株の培養液１２５ｍｌを遠心分離
し、得られた湿菌体を０．０５Ｍリン酸塩緩衝液（ｐＨ
７．０）３０ｍｌに懸濁し、５℃で超音波破砕処理後、
固形物を除去し、無細胞酵素液を調製した。この酵素液
を予め０．０５Ｍリン酸塩緩衝液（ｐＨ７．０）で平衡
化したＤＥＡＥ−セファロースＣＬ−６Ｂ（ファルマシ
ア社製）１００ｍｌを充填したカラムに通し、実施例１
に記載の基質を用いて測定することにより酵素活性が吸
着されていることを確認した。溶出液としてカラム容量
の６倍量の０．０５Ｍリン酸塩緩衝液（ｐＨ７．０）を
使用し、食塩濃度を最終濃度０．５Ｍまで直線的に上昇
させる食塩濃度勾配溶出法により溶出した。その結果、
食塩濃度０．４２Ｍ付近で目的の酵素活性が溶出され
た。この活性部位のフラクションを集めて脱塩し、凍結
乾燥してエステラーゼＭＳを得た。

【００７１】

【実施例６】 ３−カルバモイルオキシメチル−７−［（Ｚ）−２−
（２−フリル）−２−メトキシイミノアセタミド］−３
−セフェム−４−カルボン酸アセトキシエチルエステル
ジアステレオマー混合物のエステラーゼＭＳによる不斉
加水分解 ３−カルバモイルオキシメチル−７−［（Ｚ）−２−
（２−フリル）−２−メトキシイミノアセタミド］−３
−セフェム−４−カルボン酸アセトキシエチルエステル
ジアステレオマー混合物１０ｍｇをメタノール１ｍｌに
溶解し、これに０．１Ｍリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ
７．０）８．５ｍｌを加え、さらに参考例１で得たエス
テラーゼＭＳの酵素液０．５ｍｌを加え、、３２℃で３
０分間攪拌した。反応液を下記のＨＰＬＣ分析条件で分
析した結果、ジアステレオマー２が収率４８％（５０％
×９６％）、光学純度９９％ｅ．ｅ．で得られた。

【００７２】ＨＰＬＣ分析条件； カラム：イナートシルＯＤＳ−２ ４．６×１５０ｍｍ
（ＧＬサイエンス社製） 移動相：メタノール：０．２Ｍリン酸２水素アンモニウ
ム水溶液＝３７．５：６２．５ 検出波長：２５４ｎｍ 流速：１．５ｍｌ／分 保持時間：ジアステレオマー１；１８．８分、ジアステ
レオマー２；２２．３分

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 一般式（２） 【化１】 （式中、Ｒ¹ は水素原子またはアシル基、Ｒ² は低級ア
   ルキル基、Ｒ³ は低級アルキル基、シクロアルキル基、
   アラルキル基または置換基を有していてもよいフェニル
   基、Ｘは酸素原子または単結合を示し、Ｙは反応に関与
   しない基を示す）で表される化合物の４位エステルのジ
   アステレオマー混合物に水性媒体中一般式（２）で表さ
   れる化合物の４位エステルのジアステレオマー混合物を
   不斉加水分解する能力を有する酵素またはその含有物を
   作用させることを特徴とする一般式（１） 【化２】 （式中、＊Ｃは不斉炭素原子を示し、Ｒ¹ 、Ｒ² 、
   Ｒ³ 、ＸおよびＹは前記と同じ意味を有する）で表され
   る光学活性な側鎖エステルを有するセファロスポリン誘
   導体の製造法。