JPH07270424A - ラテックス免疫凝集分析方法 - Google Patents

ラテックス免疫凝集分析方法

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JPH07270424A
JPH07270424A JP8748694A JP8748694A JPH07270424A JP H07270424 A JPH07270424 A JP H07270424A JP 8748694 A JP8748694 A JP 8748694A JP 8748694 A JP8748694 A JP 8748694A JP H07270424 A JPH07270424 A JP H07270424A
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JP
Japan
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absorbance
time
concentration
wavelength light
sample
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JP8748694A
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English (en)
Inventor
Kiyokazu Nakano
清和 中野
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Shimadzu Corp
Original Assignee
Shimadzu Corp
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Publication date
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  • Investigating Or Analysing Materials By The Use Of Chemical Reactions (AREA)
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Abstract

(57)【要約】 【目的】 ラテックス免疫凝集分析方法において正確な
定量結果を得る。 【構成】 標準液について抗原抗体反応初期段階の第1
の時刻と同反応の後期段階の第2の時刻において、それ
ぞれ主波長λ1と副波長λ2とで吸光度を測定し、各標準
試料について次数nを仮定し、それぞれの修正吸光度
[A1StiE]’及び吸光度比[A1StiE/A2StiE]を計
算する。濃度Cと修正吸光度の関係が直線となる濃度区
間の第2の時刻における吸光度比の区間と、そのときの
次数nを選択する。この選択した吸光度比と次数nごと
に濃度Cと修正吸光度[A1StiE]’との一次式を算出
する。未知試料についても第1の時刻における主波長光
での主及び副の2波長での吸光度(A1SF,A2SF)と、
第2の時刻における主波長光での主及び副の2波長での
吸光度(A1SE,A2SE)を測定し、吸光度比(A1SE
2SE)を計算して、それから次数nを決定する。次
に、修正吸光度[A1SE]’を計算し、次数nに該当す
る検量線の一次式から試料中の抗原又は抗体の濃度を計
算し、出力する。

Description

【発明の詳細な説明】
【0001】
【産業上の利用分野】本発明は医療機関などで使用され
る生化学自動分析装置に適用可能なラテックス免疫凝集
方法による抗原抗体成分の定量方法に関するものであ
る。
【0002】
【従来の技術】臨床化学分析で用いられる吸光度法で
は、多くの場合、吸光度と濃度の間に直線的な比例関係
が成り立つが、免疫比濁法ではそのような直線関係は成
り立たず、検量線は非直線検量線になることが知られて
いる。そこで、免疫比濁法では検量線として幾つかのパ
ラメータをもつ関数を仮定し、そのパラメータを実験的
に求めている(日本臨床検査自動化学会会誌、第16巻
第6号、671〜674頁(1991年)参照)。他に
も、例えば次に示される式 y=K1s+Axs-1+……N (s=2又は3、yは吸光度、xは濃度である)や、折
れ線検量線を用いて免疫比濁法による定量を行なってい
る。
【0003】ラテックス免疫凝集(LIA)反応による
測定は、ポリスチレン微粒子(粒径0.05〜1μm程
度)などのラテックスの表面に測定したい項目(抗原)
に対する抗体を吸着させたラテックス試薬を用い、試料
中にその抗体と反応する抗原が存在したときに抗原抗体
反応によりラテックスが凝集する現象を利用して、抗原
濃度を測定しようとするものである。ラテックスの凝集
を利用すると、免疫比濁法に比べて検出感度が10〜1
00倍に上がるため、微量成分の測定に適する。
【0004】
【発明が解決しようとする課題】ラテックス免疫凝集分
析方法においてもその検量線は非直線状であり、S字型
となる。そのため、検量線関数方程式は濃度に対して測
定値(吸光度)を多項式や対数化した関数で表してい
る。そのため、低濃度域での定量結果の正確さが問題に
なる。また、標準試料の濃度比は一般に0,1,2,
4,8,16というような2のべき乗の比率で作成され
ることが多いため、高濃度領域では標準試料濃度間隔が
広くなり、高濃度領域でも定量結果の正確さが問題にな
る。
【0005】また、種々の関数方程式を用いた場合、そ
の解を求める段階で発散してしまい、計算不能になるこ
ともある。本発明はラテックス免疫凝集分析方法におい
て正確な定量結果を得ることのできる方法を提供するこ
とを目的とするものである。
【0006】
【課題を解決するための手段】本発明のラテックス免疫
凝集分析方法は、標準試料について、抗原−抗体反応初
期段階の第1の時刻及び同反応の後期段階の第2の時刻
においてそれぞれ主波長光と副波長光とで吸光度を測定
し、第1の時刻における主波長光での吸光度に第1の時
刻における主・副の2波長光での[吸光度比]mを乗じ
た補正吸光度と、第2の時刻における主波長光での吸光
度に第2の時刻における主・副の2波長光での[吸光度
比]nを乗じた補正吸光度との差から求めた修正吸光度
を用い、次数m及びnに対して濃度と修正吸光度との関
係を示す検量線を作成するステップと、次数m及びnに
対し、第2の時刻における主・副の2波長光での吸光度
比の区間のうち、検量線が直線となる区間を選択するス
テップと、未知試料について第1及び第2の時刻におけ
る主・副の2波長での吸光度を測定し、第2の時刻にお
ける主・副の2波長光での吸光度比によって次数m及び
nを決定し、その次数m及びnを用いて修正吸光度を算
出し、その次数m及びnによる検量線を用いて試料中の
抗原又は抗体の濃度を算出するステップとを備えてい
る。
【0007】図1から図3により本発明をさらに詳しく
説明する。図1は検量線を作成するステップを表したも
のである。濃度(C)=0〜各標準液(St)について
LIA反応液を調整し、抗原抗体反応初期段階の第1の
時刻と同反応の後期段階の第2の時刻において、それぞ
れ主波長λ1と副波長λ2とで吸光度を測定する。それぞ
れの吸光度は記号で示すと表1のようになる。
【0008】
【表1】
【0009】次に、各標準試料について次数n=0〜N
を仮定し、それぞれの修正吸光度[A1StiE]’(i=
1〜6)及び吸光度比[A1StiE/A2StiE]を計算し図
示する。ここで、修正吸光度は次数m及びnについて次
の(1)式のように定義される。
【0010】 [A1StiE]’ =A1StiE{(A1BE/A2BE)/(A1StiE/A2StiE)}n −A1StiF{(A1BF/A2BF)/(A1StiF/A2StiF)}m (1) ただし、第1の時刻を抗原−抗体反応初期段階に選んだ
場合は、A1BF≒A1StiF及びA2BF≒A2StiFとなるた
め、m=0と置くことができる。一般的に、LIA反応
の測定では反応開始後の2測定時刻間の吸光度差を高感
度に測定する必要があり、第1時刻はできるだけ反応初
期に指定されるため、(1)式では常時m=0と考えて
よい。
【0011】修正吸光度[A1StiE]’と吸光度比(A
1StiE/A2StiE)を図示したものが図3である。次に、
図3から、濃度Cと修正吸光度の関係が直線となる濃度
区間の第2の時刻における吸光度比の区間と、そのとき
の次数n(第1の時刻は反応初期(20秒)であるので
m=0とする)を選択する。図3の結果では、吸光度比
がa1〜a2の区間では次数n=0とすれば濃度領域c0
〜c2で検量線が直線となり、吸光度比区間a2〜a4
はn=Mとすれば濃度領域c2〜c4で検量線が直線とな
り、吸光度比a3〜a5ではn=Nとすれば濃度領域c3
〜c5で検量線が直線となる。
【0012】次に、この選択した吸光度比と次数nごと
に濃度Cと修正吸光度[A1StiE]’との一次式を算出
する。図3の例では次のようになる。 n=0ではc0〜c2で、 [A1St0E]’=a0C+b0 n=Mではc2〜c4で、 [A1StME]’=aMC+bM n=Nではc3〜c5で、 [A1StNE]’=aNC+bN 未知試料での試料濃度(Csp)算出に便利なように、
一次式を Csp=([A1SE]’−a)/b の形に変形しておけばよい。
【0013】図2は未知試料を分析するためのステップ
である。試料のLIA反応液について第1の時刻におけ
る主波長光での主及び副の2波長での吸光度(A1SF
2SF)と、第2の時刻における主波長光での主及び副
の2波長での吸光度(A1SE,A2SE)を測定する。第2
の時刻における主波長光での吸光度と副波長光での吸光
度比(A1SE/A2SE)を計算し、それが図3のどの区間
に該当するかをみて次数nを決定する。
【0014】次に、修正吸光度[A1SE]’を計算す
る。 [A1SE]’ =A1SE{(A1BE/A2BE)/(A1SE/A2SE)}n −A1SF{(A1BF/A2BF)/(A1SF/A2SF)}m
【0015】次に、検量線で求められた次数nに該当す
る一次式 Csp=([A1SE]’−a)/b に修正吸光度[A1SE]’を代入して試料濃度Cspを
計算し、出力する。
【0016】
【実施例】図4は一実施例として、試薬として栄研化学
社のCRP EAテストを用い、測定項目CRP(C反
応性蛋白)を測定する場合の検量線を表したものであ
る。分析装置は株式会社島津製作所の自動生化学分析装
置CL−7200を用い、分析条件としては試料を3μ
l、第1試薬を280μl、第2試薬を70μlとし、
測定波長は主波長λ1を510nm、副波長λ2を700
nmとした。第1の時刻は反応開始後20秒後、第2の
時刻は反応開始後300秒(5分)後とした。図4の横
軸はCRP濃度、上図の縦軸は吸光度比(A1SE
2SE)=(A510/A700)、下図の縦軸は修正吸光度
である。吸光度比によって検量線が直線となる次数nを
定めて用いる。
【0017】図5は図4の実施例と同じ反応条件で測定
を行なったものであるが、測定波長としてはλ1=60
0m、λ2=900nmとした。この場合も吸光度比A
600/A900に対し、検量線が直線となる次数nを選択し
て使用する。
【0018】なお、図3の説明で、検量線を作成する標
準試料濃度はC1〜C6の6種類としているが、2回目以
降の検量線作成では直線領域となる濃度値が分かってい
るので、この例ではC0,C2,C4,C5の4点の試料を
作成すればすみ、C1,C3,C6の試料作成は省略する
ことができる。
【0019】ラテックス免疫凝集分析方法で測定可能な
項目(成分)は実施例に挙げたCRPの他、AFP、β
2m、CEA、CEA−D、フェリチン、IgE、CR
P、CRP−H、ASO、RF、IgG、IgA、Ig
M、C9、C4、FDP−E、FDP、ATIII、PLG
などがある。
【0020】
【発明の効果】本発明の方法では検量線で定めるべきパ
ラメータは実質的に2波長吸光度比に対応する次数nの
みであるため、検量線関数が簡略化される。検量線の直
線領域を用いて定量を行なうので、定量精度が高まり、
分析結果の正確さが高まる。一度検量線を作成すれば直
線関係が成り立つ修正吸光度と濃度間の関係が分かるの
で、2回目以降の検量線作成においてはその直線関係が
成り立つ濃度範囲の標準試料の作成を省略することがで
きる。これに対し、従来の多項式を用いた検量線関数や
対数化した検量線関数の場合は、少なくとも6種類程度
の濃度既知の標準試料が必要であった。免疫項目の標準
試料は高価であり、本発明ではこの点でコスト低下にも
つながる。
【図面の簡単な説明】
【図1】本発明の検量線作成ステップを示すフローチャ
ート図である。
【図2】本発明での試料分析のステップを示すフローチ
ャート図である。
【図3】本発明における検量線を示す図である。
【図4】一実施例における検量線図である。
【図5】同実施例において測定波長を変えた場合の検量
線図である。

Claims (1)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項1】 表面に抗体又は抗原を固定した不溶性担
    体微粒子を分散させてなる液体試薬と、試料中の抗原又
    は抗体とを反応させて生成した抗原−抗体複合体を測定
    する方法において、 標準試料について、抗原−抗体反応初期段階の第1の時
    刻及び同反応の後期段階の第2の時刻においてそれぞれ
    主波長光と副波長光とで吸光度を測定し、第1の時刻に
    おける主波長光での吸光度に第1の時刻における主・副
    の2波長光での[吸光度比]mを乗じた補正吸光度と、
    第2の時刻における主波長光での吸光度に第2の時刻に
    おける主・副の2波長光での[吸光度比]nを乗じた補
    正吸光度との差から求めた修正吸光度を用い、次数m及
    びnに対して濃度と修正吸光度との関係を示す検量線を
    作成するステップと、 次数m及びnに対し、第2の時刻における主・副の2波
    長光での吸光度比の区間のうち、検量線が直線となる区
    間を選択するステップと、 未知試料について前記第1及び第2の時刻における主・
    副の2波長での吸光度を測定し、第2の時刻における主
    ・副の2波長光での吸光度比によって次数m及びnを決
    定し、その次数m及びnを用いて修正吸光度を算出し、
    その次数m及びnによる検量線を用いて試料中の抗原又
    は抗体の濃度を算出するステップと、を備えたことを特
    徴とするラテックス免疫凝集分析方法。
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