JPH0728742B2 - エラスタ−ゼの安定化法 - Google Patents
エラスタ−ゼの安定化法Info
- Publication number
- JPH0728742B2 JPH0728742B2 JP60173946A JP17394685A JPH0728742B2 JP H0728742 B2 JPH0728742 B2 JP H0728742B2 JP 60173946 A JP60173946 A JP 60173946A JP 17394685 A JP17394685 A JP 17394685A JP H0728742 B2 JPH0728742 B2 JP H0728742B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- elastase
- added
- crystals
- sucrose
- freeze
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
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- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
Description
【発明の詳細な説明】 本発明はエラスターゼ結晶をスクロースと共に凍結乾燥
する事により、エラスターゼの活性の低下を防ぐ方法に
関する。
する事により、エラスターゼの活性の低下を防ぐ方法に
関する。
産業上の利用分野 エラスターゼは水に不溶性の硬蛋白質エラスチンを特異
的に分解する酵素であり、動脈硬化症の治療あるいは血
清脂質異常の改善に使用される。
的に分解する酵素であり、動脈硬化症の治療あるいは血
清脂質異常の改善に使用される。
従来の技術 エラスターゼは、通常ブタ膵臓よりエラスターゼ複合体
結晶として製造される。代表的な製造法としては、ルイ
スらの方法（ジャーナル オブ バイオロジカル ケミ
ストリ（Journal of Biological Chemistry）、222巻、
705−720ページ（1956年））があり、これを改良した方
法がいくつか報告されている（たとえば、特公昭50−21
557、特開昭52−61287、特公昭57−9356、特開昭58−51
892、特開昭58−101693）。これらの方法により得られ
るエラスターゼ結晶は、塩基性蛋白質であるエラスター
ゼと酸性蛋白質の結合したものである。
結晶として製造される。代表的な製造法としては、ルイ
スらの方法（ジャーナル オブ バイオロジカル ケミ
ストリ（Journal of Biological Chemistry）、222巻、
705−720ページ（1956年））があり、これを改良した方
法がいくつか報告されている（たとえば、特公昭50−21
557、特開昭52−61287、特公昭57−9356、特開昭58−51
892、特開昭58−101693）。これらの方法により得られ
るエラスターゼ結晶は、塩基性蛋白質であるエラスター
ゼと酸性蛋白質の結合したものである。
このエラスターゼは熱に対して不安定なため、乾燥する
際には凍結乾燥法を通常用いるが、凍結乾燥法によって
もかなり活性が低下する。エラスターゼの活性の低下を
防ぐ従来の技術としては、特開昭52−47984に示されて
いるように、デキストランのような多糖類を添加する方
法があるが，この方法によってもなおエラスターゼの安
定性は充分とはいいがたく，試験例に示すように40℃,1
ケ月間の保存により、約10〜20％もの活性低下がさけら
れない現状にある。
際には凍結乾燥法を通常用いるが、凍結乾燥法によって
もかなり活性が低下する。エラスターゼの活性の低下を
防ぐ従来の技術としては、特開昭52−47984に示されて
いるように、デキストランのような多糖類を添加する方
法があるが，この方法によってもなおエラスターゼの安
定性は充分とはいいがたく，試験例に示すように40℃,1
ケ月間の保存により、約10〜20％もの活性低下がさけら
れない現状にある。
発明が解決しようとする問題点 エラスターゼを治療剤として供する場合、安定性が良好
であることが望ましいことは言うまでもない。本発明が
解決しようとするところは、エラスターゼ結晶を凍結乾
燥する時およびその後のエラスターゼの活性の低下を防
ぐことである。
であることが望ましいことは言うまでもない。本発明が
解決しようとするところは、エラスターゼ結晶を凍結乾
燥する時およびその後のエラスターゼの活性の低下を防
ぐことである。
問題点を解決するための手段・作用 本発明者らは以上の点を考慮して、エラスターゼの活性
の低下を防ぐ事を目的として研究した結果スクロースの
存在下に凍結乾燥を行なえば、エラスターゼの活性の低
下を防げる事を見出し、本発明を完成した。即ち、本発
明はエラスターゼ結晶をスクロースと共に凍結乾燥する
エラスターゼの安定化法である。
の低下を防ぐ事を目的として研究した結果スクロースの
存在下に凍結乾燥を行なえば、エラスターゼの活性の低
下を防げる事を見出し、本発明を完成した。即ち、本発
明はエラスターゼ結晶をスクロースと共に凍結乾燥する
エラスターゼの安定化法である。
以下、本発明につき詳述する。
エラスターゼ結晶は、通常ブタの生膵臓またはバンクレ
アチンより得る。精製法の例は試験例・実施例に示され
ているが、本発明はエラスターゼ結晶の精製法には限定
されないことはいうまでもない。
アチンより得る。精製法の例は試験例・実施例に示され
ているが、本発明はエラスターゼ結晶の精製法には限定
されないことはいうまでもない。
また本発明に用いるスクロースとは、サッカロース，シ
ョ糖，白糖，精製白糖，グラニュー糖等の名称で呼ばれ
るもので、医薬品製剤または食品用原料として許容され
る品質のものであれば特に限定するものではない。
ョ糖，白糖，精製白糖，グラニュー糖等の名称で呼ばれ
るもので、医薬品製剤または食品用原料として許容され
る品質のものであれば特に限定するものではない。
スクロース添加量は、エラスターゼ結晶の固形重に対し
て20％以上あればよく、通常は等量で充分である。また
スクロース以外の安定化剤を併用する事を妨げるもので
はない。
て20％以上あればよく、通常は等量で充分である。また
スクロース以外の安定化剤を併用する事を妨げるもので
はない。
エラスターゼ結晶は水に対する溶解性が低いため懸濁液
の状態で凍結乾燥するため、スクロース添加後充分に混
合し均一化することが望ましい。凍結乾燥は通常の方法
で行なえばよく、特別な条件は必要とはしない。
の状態で凍結乾燥するため、スクロース添加後充分に混
合し均一化することが望ましい。凍結乾燥は通常の方法
で行なえばよく、特別な条件は必要とはしない。
試験例 次に試験例を示し本発明の効果を説明する。
エラスターゼの活性は、ロビンスらの方法（アーカイブ
ズ オブ バイオケミストリ アンド バイオフィジク
ス（Archives of Biochemistry and Biophysics）、66
巻、396−403ページ（1957年））の改良法により測定
し、エラスチンが分解された結果生ずる可溶性エラスチ
ンの１分間当りの生成量をチロシン量（μｇ）に換算し
て表示した。
ズ オブ バイオケミストリ アンド バイオフィジク
ス（Archives of Biochemistry and Biophysics）、66
巻、396−403ページ（1957年））の改良法により測定
し、エラスチンが分解された結果生ずる可溶性エラスチ
ンの１分間当りの生成量をチロシン量（μｇ）に換算し
て表示した。
試験例１ ブタのパンクレアチン5kgを４℃に冷却した0.1M酢酸緩
衝液（pH4.5）201に加え４時間撹拌後濾過した。濾液を
硫安を加え45％飽和とし沈殿物を得た。集めた沈殿を0.
1M炭酸緩衝液（pH8.8）51に溶解し、低温で水に対して
透析を行なった。生じた沈殿を集め、水51に懸濁した後
硫安を加えて35％飽和とした。沈殿を集め21の0.1M炭酸
緩衝液（pH8.8）に溶解した後、エラスターゼ種結晶を
加えて結晶を析出させた。
衝液（pH4.5）201に加え４時間撹拌後濾過した。濾液を
硫安を加え45％飽和とし沈殿物を得た。集めた沈殿を0.
1M炭酸緩衝液（pH8.8）51に溶解し、低温で水に対して
透析を行なった。生じた沈殿を集め、水51に懸濁した後
硫安を加えて35％飽和とした。沈殿を集め21の0.1M炭酸
緩衝液（pH8.8）に溶解した後、エラスターゼ種結晶を
加えて結晶を析出させた。
得られたエラスターゼ結晶に対して第１表に示す各種の
物質を、エラスターゼ結晶の固形重と等量となるように
各々添加し凍結乾燥した。得られた粉末について、凍結
乾燥直後および40℃,RH75％開放下で保存後のエラスタ
ーゼの活性および波長280nmにおける吸光度（A280）を
測定した。結果を第１表に示す。
物質を、エラスターゼ結晶の固形重と等量となるように
各々添加し凍結乾燥した。得られた粉末について、凍結
乾燥直後および40℃,RH75％開放下で保存後のエラスタ
ーゼの活性および波長280nmにおける吸光度（A280）を
測定した。結果を第１表に示す。
第１表に示すように、スクロースを添加して凍結乾燥し
たものは、他の添加物を用いた場合よりも活性が高く、
またその後の保存期間中の活性の低下率も低い。
たものは、他の添加物を用いた場合よりも活性が高く、
またその後の保存期間中の活性の低下率も低い。
試験例２ 試験例１で得たエラスターゼ結晶に、スクロースまたは
デキストランをエラスターゼ結晶の固形重に対して、10
％,20％,40％,80％,120％になるように、それぞれの10
％水溶液を添加し（対照には何も添加しない）凍結乾燥
した。得られた粉末について、凍結乾燥直後および40℃
気密下で保存後のエラスターゼの活性および波長280nm
における吸光度（A280）を測定した。結果を第２表に示
す。
デキストランをエラスターゼ結晶の固形重に対して、10
％,20％,40％,80％,120％になるように、それぞれの10
％水溶液を添加し（対照には何も添加しない）凍結乾燥
した。得られた粉末について、凍結乾燥直後および40℃
気密下で保存後のエラスターゼの活性および波長280nm
における吸光度（A280）を測定した。結果を第２表に示
す。
第２表に示すように、スクロースを添加して凍結乾燥し
たものは、添加物の量に関係なくデキストランを用いた
場合よりも活性が高く、またその後の保存期間中の活性
の低下率も低い。
たものは、添加物の量に関係なくデキストランを用いた
場合よりも活性が高く、またその後の保存期間中の活性
の低下率も低い。
実施例 次に実施例を示し本発明をさらに詳細に説明す る。
実施例１ ブタの生膵臓5kgをミンチした後201のアセトンを加え１
時間撹拌し、アセトン層を除き沈殿物を得る。この沈殿
物に水101を加えて２時間撹拌した後濾過する。濾液に
アセトンを加えて70％とし、生じた沈殿物を取る。沈殿
物はさらに101のアセトンで洗浄した後、真空乾燥し乾
燥物をえた。
時間撹拌し、アセトン層を除き沈殿物を得る。この沈殿
物に水101を加えて２時間撹拌した後濾過する。濾液に
アセトンを加えて70％とし、生じた沈殿物を取る。沈殿
物はさらに101のアセトンで洗浄した後、真空乾燥し乾
燥物をえた。
この乾燥物に４℃に冷却した水51を加え２時間撹拌後、
撹拌しながら1M酢酸を加えてpH4.5とした。更に１時間
撹拌した後、遠心分離した。得られた上清を、予め0.02
M酢酸緩衝液（pH4.5）で平衡化させたCM−セルロファイ
ンCH（チット（株）製）を詰めたカラム（10×30cm）に
負荷し、0.02M酢酸緩衝液（pH4.5）201で洗浄した。次
に0.5M硫安溶液で溶出し、溶出液に硫安を加えて40％飽
和とした。沈殿を取り81の水を加えて溶かした後、1M水
酸化ナトリウム溶液を加えてpH8.0とし、エラスターゼ
種結晶を加え５℃に放置し結晶を析出させた。
撹拌しながら1M酢酸を加えてpH4.5とした。更に１時間
撹拌した後、遠心分離した。得られた上清を、予め0.02
M酢酸緩衝液（pH4.5）で平衡化させたCM−セルロファイ
ンCH（チット（株）製）を詰めたカラム（10×30cm）に
負荷し、0.02M酢酸緩衝液（pH4.5）201で洗浄した。次
に0.5M硫安溶液で溶出し、溶出液に硫安を加えて40％飽
和とした。沈殿を取り81の水を加えて溶かした後、1M水
酸化ナトリウム溶液を加えてpH8.0とし、エラスターゼ
種結晶を加え５℃に放置し結晶を析出させた。
得られたエラスターゼ結晶に10％スクロース溶液100ml
を添加し充分混合したのち、凍結乾燥機（共和真空技術
（株）製）により凍結乾燥を行ない、安定性のよいエラ
スターゼ粉末25gを得た。エラスターゼ活性84単位/mg。
を添加し充分混合したのち、凍結乾燥機（共和真空技術
（株）製）により凍結乾燥を行ない、安定性のよいエラ
スターゼ粉末25gを得た。エラスターゼ活性84単位/mg。
実施例２ ブタのパンクレアチン20kgを４℃に冷却した0.1M酢酸緩
衝液（pH4.8）801に加え、４時間撹拌後濾過した。濾液
に硫安を加えて45％飽和とし沈殿物を得た。この沈殿を
401の0.1Mリン酸緩衝液（pH7.2）に溶解した。53℃で３
分間加熱した後、濾過し清澄濾液を得た。濾液に硫安の
加えて35％飽和とした。沈殿を取り81の水を加え溶かし
た後、エラスターゼ種結晶を加えて結晶を析出させた。
衝液（pH4.8）801に加え、４時間撹拌後濾過した。濾液
に硫安を加えて45％飽和とし沈殿物を得た。この沈殿を
401の0.1Mリン酸緩衝液（pH7.2）に溶解した。53℃で３
分間加熱した後、濾過し清澄濾液を得た。濾液に硫安の
加えて35％飽和とした。沈殿を取り81の水を加え溶かし
た後、エラスターゼ種結晶を加えて結晶を析出させた。
得られたエラスターゼ結晶に20％スクロース溶液500ml
を添加し充分混合したのち、凍結乾燥機（共和真空技術
（株）製）により凍結乾燥を行ない、安定性のよいエラ
スターゼ粉末230gを得た。エラスターゼ活性79単位/m
g。
を添加し充分混合したのち、凍結乾燥機（共和真空技術
（株）製）により凍結乾燥を行ない、安定性のよいエラ
スターゼ粉末230gを得た。エラスターゼ活性79単位/m
g。
発明の効果 本発明によれば、不安定で長期の保存に耐えられなかっ
たエラスターゼを長期間安定に保存できしかもそこに使
用するスクロースが人体に対して安全性が高く、かつ低
価格で原料供給もきわめて容易である等、医薬品業界を
はじめとする産業界に大いに貢献するものである。
たエラスターゼを長期間安定に保存できしかもそこに使
用するスクロースが人体に対して安全性が高く、かつ低
価格で原料供給もきわめて容易である等、医薬品業界を
はじめとする産業界に大いに貢献するものである。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (56)参考文献 特開 昭52−47984（ＪＰ，Ａ)
Claims (1)
- 【請求項１】エラスターゼ結晶をスクロースと共に凍結
乾燥することを特徴とする、エラスターゼの安定化法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP60173946A JPH0728742B2 (ja) | 1985-08-07 | 1985-08-07 | エラスタ−ゼの安定化法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP60173946A JPH0728742B2 (ja) | 1985-08-07 | 1985-08-07 | エラスタ−ゼの安定化法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS6236189A JPS6236189A (ja) | 1987-02-17 |
| JPH0728742B2 true JPH0728742B2 (ja) | 1995-04-05 |
Family
ID=15969996
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP60173946A Expired - Lifetime JPH0728742B2 (ja) | 1985-08-07 | 1985-08-07 | エラスタ−ゼの安定化法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH0728742B2 (ja) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH07100035B2 (ja) * | 1987-04-27 | 1995-11-01 | 藤本製薬株式会社 | 安定性に優れたエラスターゼ製剤 |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS5247984A (en) * | 1975-10-15 | 1977-04-16 | Eisai Co Ltd | Stabilization of elastase |
| JPS57118790A (en) * | 1981-01-14 | 1982-07-23 | Takeda Chem Ind Ltd | Freeze-dried substance containing beta-d-galactosidase |
-
1985
- 1985-08-07 JP JP60173946A patent/JPH0728742B2/ja not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS6236189A (ja) | 1987-02-17 |
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