JPH07291862A

JPH07291862A - 抗腫瘍剤及びその製造法

Info

Publication number: JPH07291862A
Application number: JP9180194A
Authority: JP
Inventors: Kazuo Kaminakai; 和男上中居; Yoshiki Hayashi; 芳樹林; Nobuhiro Ishihara; 伸浩石原; Motonao Takahashi; 源尚高橋; Kazunari Yamada; 一成山田
Original assignee: Tamanoi Vinegar Co Ltd
Current assignee: Tamanoi Vinegar Co Ltd
Priority date: 1994-04-28
Filing date: 1994-04-28
Publication date: 1995-11-07

Abstract

(57)【要約】【目的】この発明は、人体に副作用の少ない抗腫瘍剤
を得ることを目的としたものである。【構成】ハイドロキシリノール酸を有効成分とする抗
腫瘍剤。リノール酸に植物性リポキシゲナーゼを作用さ
せて得られるハイドロキシリノール酸を有効成分とする
抗腫瘍剤。リノール酸に植物性リポキシゲナーゼを加え
て反応させ、この反応液をＰＨ調整し、沈澱物を濾過し
た後、有機溶媒を加えてその抽出液を減圧濃縮後、順層
シリカゲルカラムにかけ、溶出液は適当量づつ分取し、
各画分毎に薄層クロマトを行い、ハイドロキシリノール
酸の画分を集めて沈澱させ、該沈澱物を減圧下で乾燥す
ることを特徴とした抗腫瘍剤の製造法。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】この発明は、人体に副作用の少な
い抗腫瘍剤を得ることを目的とした抗腫瘍剤及びその製
造法に関する。

【０００２】

【従来の技術】従来、抗腫瘍剤に関する研究の主流は、
より抗腫瘍活性の高い物質、例えばアドリアマイシンの
如きものを求めてきたが、実際には有効性の向上に伴っ
て副作用も強くなる傾向がある。そこで副作用の少ない
不飽和脂肪酸の抗腫瘍活性が注目されるようになった。
例えばリノール酸、オレイン酸等の不飽和結合を含む脂
肪酸を利用する発明（例えば特開昭６２−１２７１６
号）、あるいはその誘導体であるケトール型不飽和脂肪
酸を利用する発明（例えば特開平５−２７９２５２号）
などにより抗腫瘍効果を有する抗腫瘍剤が報告されてい
る。

【０００３】

【発明により解決すべき課題】前記各技術において、前
者は副作用が激しいので、副作用の少ない後者について
提案されたのであるが、未だ実用の域に達していない。
そこで後者の方向性を保ち乍ら、更に副作用が少なく、
安全性を向上すると共に、安価で多量生産できる抗腫瘍
剤の速かな開発が要望されているが、未だ満足すべきも
のが見当らない。

【０００４】

【課題を解決するための手段】然るに、発明者らは、不
飽和脂肪酸の誘導体に関し、鋭意研究を重ねた結果、抗
腫瘍活性が優れ、しかも副作用が少なく安全性の高いハ
イドロキシリノール酸を有効成分とする抗腫瘍剤の開発
に成功したのである。

【０００５】即ちこの発明はハイドロキシリノール酸を
有効成分とする抗腫瘍剤である。

【０００６】また他の発明は、リノール酸に、植物性リ
ポキシゲナーゼを作用させて得られるハイドロキシリノ
ール酸を有効成分とする抗腫瘍剤である。

【０００７】次に製造法の発明はリノール酸に植物性リ
ポキシゲナーゼを反応させ、この反応液をＰＨ調整し、
沈澱物を濾過した後、有機溶媒を加えてその抽出液を減
圧濃縮後、順層シリカゲルカラムにかけ、溶出液は適当
量づつ分取し、各画分毎に薄層クロマトを行い、ハイド
ロキシリノール酸の画分を集めて沈澱させ、該沈澱物を
減圧下で乾燥することを特徴とした抗腫瘍剤の製造法で
ある。

【０００８】前記ハイドロキシリノール酸とは、水酸基
を１個有し、不飽和結合を２個有し、炭素数が１８であ
る直鎖状の脂肪酸をいう。

【０００９】またハイドロキシリノール酸を生成するに
は、植物性リポキシゲナーゼを用いて、リノール酸の炭
素鎖に水酸基を１個付加させて得ることができる。前記
リポキシゲナーゼは、植物の種実中に含まれているのが
知られており、稲由来リポキシゲナーゼ、じゃがいも由
来のリポキシゲナーゼ、トマト由来のリポキシゲナーゼ
等があり、これらを単離、精製したものを用いることが
できるし、種実を粉砕した状態でその中に含まれるリポ
キシゲナーゼを反応に利用することもできる。また市販
されているリポキシゲナーゼを用いても同様の効果があ
る。

【００１０】次にリポキシゲナーゼの反応経路を表す
と、第１図の通りである。図中の数字はリノール酸のカ
ルボキシル炭素から数えた炭素数を表している。例え
ば、前記稲のリポキシゲナーゼは、リノール酸の９位の
炭素に酸素１分子を付加し、主生成物としてハイドロパ
ーオキシリノール酸を生じる。その後、還元されてハイ
ドロキシリノール酸が生成する。生成したハイドロキシ
リノール酸は９−ハイドロキシ−１０（Ｅ）−１２
（Ｚ）−オクタデカジエン酸である。また、前記大豆の
リポキシゲナーゼは、リノール酸の１３位の炭素に酸素
１分子を付加し、主生成物としてハイドロパーオキシリ
ノール酸を生じる。その後、還元されてハイドロキシリ
ノール酸を生成する。生成したハイドロキシリノール酸
は１３−ハイドロキシ−９（Ｚ）−１１（Ｅ）−オクタ
デカジエン酸である。

【００１１】この反応系は酵素反応であり、また、基質
特異性であるため、未反応物を除くだけで反応後の分離
精製が容易であり、かつ大量生産し得るものである。ま
た酵素利用にあたっては、廃棄物として出る米糠、トマ
トの皮などを水抽出することにより利用できるので、ハ
イドロキシリノール酸を簡単に製造できることになり、
安価かつ安定して大量生産できることにより工業的に有
利である。さらにこの反応は、化学合成ではなく、植物
種実中に広く存在している酵素反応系を応用しているた
め、人の生体に与える影響も低く、いわゆる副作用を少
なくすることができる。

【００１２】この発明のハイドロキシリノール酸は、試
験管内及び動物試験に於いて抗腫瘍作用を示すので、抗
腫瘍剤として期待される。

【００１３】この発明のハイドロキシリノール酸は、人
間及び動物に経口的、または非経口的に投与され、この
経口的投与は舌下投与を包含する。また非経口的投与は
注射投与（例えば皮下、筋肉、静脈注射、点滴）、直腸
投与等を含むものであり、塗布も有効である。

【００１４】投与時の製剤形態としては、経口用として
乳剤、錠剤、散剤、カプセル剤、顆粒剤、シロップ剤、
懸濁剤、液剤など、非経口用としては注射液などの形態
もあり、更に座剤、軟膏の形態も可能であるので、現用
薬剤との差異はない。

【００１５】以下に、実施例、及び使用例を挙げてさら
に詳細に説明するが、この発明はその要旨を越えない限
り、以下の実施例及び使用例に制約されるものではな
い。

【００１６】

【実施例１】米糠２kgを水８リットルに混合し、４℃で
３時間撹拌した。濾布濾過後この反応液を濃塩酸にてpH
３に調整した。生成した沈殿物を濾過し、１０００mlの
有機溶媒（ヘキサン：酢酸エチルの割合が１：１）で抽
出した。得た有機溶媒層を減圧濃縮後、順層シリカゲル
カラム（ワコーゲルｃ３００、和光純薬製）にかけた。
順層シリカゲルクロマトはヘキサン：酢酸エチルの割合
が７：３の単一溶媒で溶出した。溶出液は適当量づつ分
取し、各画分毎に薄層クロマトを行い、ハイドロキシリ
ノール酸のスポットのある画分を集めた。これをヘキサ
ン：酢酸エチルの割合が、１０：１などの適当な有機溶
媒下で低温にするとハイドロキシリノール酸は白色の結
晶として沈殿してくるので、これを集め減圧下で乾燥し
た。このようにして精製物を０．２ｇ得た。

【００１７】

【実施例２】米糠２kgを水２０リットルに混合し、リノ
ール酸２ｇを加え４℃で３時間撹拌した。濾布濾過後、
この反応液を濃塩酸にてpH３に調整した。生成した沈殿
物を濾過し、１０００mlの有機溶媒（ヘキサン：酢酸エ
チルの割合が１：１）で抽出して得た有機溶媒層を減圧
濃縮後、順層シリカゲルカラム（ワコーゲルｃ３００、
和光純薬製）にかけた。順層シリカゲルクロマトはヘキ
サン：酢酸エチルの割合が７：３の単一溶媒で溶出し
た。溶出液は適当量づつ分取し、各画分毎に薄層クロマ
トを行い、ハイドロキシリノール酸のスポットのある画
分を集めた。これをヘキサン：酢酸エチルの割合が、１
０：１などの適当な有機溶媒下で低温にするとハイドロ
キシリノール酸は白色の結晶として沈殿してくるので、
これを集め減圧下で乾燥した。このようにして精製物を
０．５ｇ得た。

【００１８】

【実施例３】ミキサーで破砕したトマト１．５kgを界面
活性剤入りのリン酸バッファー３．５リットルに混合
し、リノール酸１５ｇを加え４℃で７時間撹拌した。濾
布濾過後この反応液を濃塩酸にてpH３に調整した。生成
した沈殿物を濾過し、１０００mlの有機溶媒（ヘキサ
ン：酢酸エチルの割合が１：１）で抽出した。得た有機
溶媒層を減圧濃縮後、順層シリカゲルカラム（ワコーゲ
ルｃ３００、和光純薬製）にかけた。順層シリカゲルク
ロマトはヘキサン：酢酸エチルの割合が７：３の単一溶
媒で溶出した。溶出液は適当量づつ分取し、各画分毎に
薄層クロマトを行い、ハイドロキシリノール酸のスポッ
トのある画分を集めた。これをヘキサン：酢酸エチルの
割合が、１０：１などの適当な有機溶媒下で低温にする
とハイドロキシリノール酸は白色の結晶として沈殿して
くるので、これを集め減圧下で乾燥した。このようにし
て精製物を０．１ｇ得た。

【００１９】かくして得られた目的物の性質は次に示し
た通りである。

【００２０】（１）分子量２９６（２）紫外部吸収スペクトル（アセトニトリル）：２３
４ｎｍ付近に極大吸収を示した。（３）赤外吸収スペクトル νｍａｘ（ｃｍ、液膜
法）：３６２６，３０１２，２９６２，１７１４，１４
７０，１４３５，１４１３，１０６４，１０４９，９８
１，９４７に吸収が観察された。（４）プロトンＮＭＲスペクトルは第２図に示した。（５）溶媒に対する溶解性：メタノール、酢酸エチル、
クロロホルム、アセトニトリルに可容。水に不容。（６）色および形状：無色油状

【００２１】

【使用例１】目的物のインビトロ（ｉｎｖｉｔｒｏ）
における抗腫瘍活性は、以下のように検討した。正常細
胞としてＢＡＬＢ／ｃ３Ｔ３細胞（マウス胚繊維芽細
胞）を、腫瘍細胞として、前記正常細胞をＳＶ４０ウイ
ルスで形質転換したＳＶ−ｆＨ細胞を用いた。継代培養
した細胞を１０％牛胎児血清含有イーグルＭＥＭ培地に
懸濁し、２．５×１０⁴個／mlとなるように３cmシャー
レに２mlづつ播種した。これを３７℃、５％ＣＯ₂存在
下で培養し、２４時間後さらに同培地に溶解し、濾過滅
菌した薬剤０．５mlを添加した。さらに上記と同様の条
件で９６時間培養した後細胞数を数え、薬剤無添加のも
のに対する生育率を測定した。結果を表１に示した。

【００２２】

【表１】

【００２３】表１よりこの発明物質は腫瘍細胞の増殖は
顕著に抑制するが、正常細胞に対しては毒性はないこと
が明らかである。

【００２４】

【使用例２】目的物のインビトロ（ｉｎｖｉｔｒｏ）
における抗腫瘍活性は、リノール酸と比較して、細胞生
育阻止率５０％濃度（ＩＣ₅₀）を求めた。腫瘍細胞とし
てＰ３８８（マウス白血病細胞）、Ｓａｒｃｏｍａ−１
８０（マウス肉腫）、ＫＢ（ヒト鼻咽頭癌）、ＳＶ−ｆ
Ｈ（ＳＶ４０形質転換細胞）を用いた。Ｐ３８８は１０
％牛胎児血清含有ＲＰＭＩ培地に懸濁し、その他の細胞
は１０％牛胎児血清含有イーグルＭＥＭ培地に懸濁し、
細胞数が２．５×１０⁴個／mlとなるように３cmシャー
レに２mlづつ播種した。これを３７℃、５％ＣＯ₂存在
下で培養し、Ｐ３８８とＳａｒｃｏｍａ−１８０は３時
間後に、ＫＢとＳＶ−ｆＨは２４時間後にさらに同培地
に溶解し、濾過滅菌した薬剤０．５mlを添加した。さら
に上記と同様の条件で、Ｐ３８８とＳａｒｃｏｍａ−１
８０は７２時間、ＫＢとＳＶ−ｆＨは９６時間培養した
後細胞数を数え、薬剤無添加のものに対し細胞生育阻止
率５０％濃度（ＩＣ₅₀）を求めた。結果を表２に示し
た。

【００２５】

【表２】

【００２６】表２より本発明物質は基質であるリノール
酸より抗腫瘍活性が７倍乃至は２０倍と大幅に向上し、
多くの種類の癌に優れた抗腫瘍効果を有することが明ら
かである。

【００２７】

【使用例３】目的物のインビボ（ｉｎｖｉｖｏ）にお
ける抗腫瘍活性は、以下のように検討した。

【００２８】ＩＣＲ系マウス（雌性、８週齢、体重２８
±１ｇ）を用い、１群を５匹とし、Ｓａｒｃｏｍａ−１
８０（マウス肉腫）を１×１０⁶個腹腔内に移植した。
移植翌日より連続して３日間、０．５％ＣＭＣ（カルボ
キシメチルセルロース）に懸濁した試料を投与し、６０
日目にマウスの生存数及び延命率（Ｔ／Ｃ）より抗腫瘍
活性を検討した。対照は、０．５％ＣＭＣのみを投与し
たものである。結果を表３に示した。

【００２９】ＭＳＤ：平均延命日数Ｔ／Ｃ：延命率Ｔ／Ｃ（％）＝（Ｔ／Ｃ）×１００Ｔ：治療群のＭＳＤＣ：対照群のＭＳＤ生存数：１群５匹中６０日以上生存しているマウス数

【００３０】

【表３】

【００３１】表３より、本発明物質はインビボ（ｉｎ
ｖｉｖｏ）においても顕著な抗腫瘍活性を有することが
明らかである。

【００３２】

【発明の効果】この発明物質は、腫瘍細胞に特異的に増
殖抑制効果を示し、正常細胞に対しては毒性がほとんど
無いので実用性において極めて優れている。

【００３３】また、この発明物質の製造法によれば、精
米時に生じる不要物などを簡単に利用できるため、この
発明物質の大量供給を安価にできる効果がある。

【図面の簡単な説明】

【図１】この発明の製造時におけるハイドロキシリノー
ル酸の生成過程を示す。

【図２】この発明の９−ハイドロキシ−１０（Ｅ）−１
２（Ｚ）−オクタデカジエン酸のプロトンＮＭＲスペク
トルを示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者高橋源尚大阪府堺市車之町西１丁１番32号タマノ井酢株式会社第二研究所内 (72)発明者山田一成大阪府堺市車之町西１丁１番32号タマノ井酢株式会社第二研究所内

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】ハイドロキシリノール酸を有効成分とす
る抗腫瘍剤。
【請求項２】リノール酸に、植物性リポキシゲナーゼ
を作用させて得られるハイドロキシリノール酸を有効成
分とする抗腫瘍剤。
【請求項３】リノール酸に植物性リポキシゲナーゼを
反応させ、この反応液をＰＨ調整し、沈澱物を濾過した
後、有機溶媒を加えてその抽出液を減圧濃縮後、順層シ
リカゲルカラムにかけ、溶出液は適当量づつ分取し、各
画分毎に薄層クロマトを行い、ハイドロキシリノール酸
の画分を集めて沈澱させ、該沈澱物を減圧下で乾燥する
ことを特徴とした抗腫瘍剤の製造法。