JPS6310953B2 - - Google Patents
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- JPS6310953B2 JPS6310953B2 JP55031514A JP3151480A JPS6310953B2 JP S6310953 B2 JPS6310953 B2 JP S6310953B2 JP 55031514 A JP55031514 A JP 55031514A JP 3151480 A JP3151480 A JP 3151480A JP S6310953 B2 JPS6310953 B2 JP S6310953B2
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- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
- A61P37/02—Immunomodulators
- A61P37/04—Immunostimulants
-
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- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
- C07D305/00—Heterocyclic compounds containing four-membered rings having one oxygen atom as the only ring hetero atoms
- C07D305/02—Heterocyclic compounds containing four-membered rings having one oxygen atom as the only ring hetero atoms not condensed with other rings
- C07D305/10—Heterocyclic compounds containing four-membered rings having one oxygen atom as the only ring hetero atoms not condensed with other rings having one or more double bonds between ring members or between ring members and non-ring members
- C07D305/12—Beta-lactones
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
- C12N1/205—Bacterial isolates
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
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- C12P17/02—Oxygen as only ring hetero atoms
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
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Description
【発明の詳細な説明】
本発明はエステラーゼならびにホルミルメチオ
ニンアミノペプチダーゼに対して阻害活性を示す
新規生理活性物質エベラクトン（Ebelactone）
及びその製造法ならびにそれを有効成分として含
有する薬剤、特に免疫増強剤に係るものである。 本発明者らは熊谷市、立正大学構内の土壤より
分離した放線菌MG7−G1株を培養して得られる
培養物中にエステラーゼならびにホルミルメチオ
ニンアミノペプチダーゼ阻害活性を有する物質の
存在することを見出し、その物質の採取方法につ
いて検討し、本発明を完成した。 本阻害物質は新規な構造を有する物質であり、
エベラクトン（Ebelactone）と命名されたが、
このエベラクトンは後記のごとく２種類の物質、
即ちエベラクトンＡとＢから構成されており、そ
れらの物性値と構造式はそれぞれ後記の通りであ
る。 以下の説明において、本物質又はエベラクトン
とはエベラクトンＡ又はＢ又はこれらの混合物を
意味するものとする。 本発明者らはさらに本物質の医薬としての有用
性について検討した結果、本物質が細胞性免疫に
対して増強作用を有すること及びさらに抗炎症作
用をもかね備えていることを見出した。 以上の状況から判断して、本物質は癌免疫療法
やブレオマイシンなどの制癌物質の増強作用を介
して種々の医薬用途の開発が期待できる物質であ
る。 本物質は、本発明者らがパラニトロフエニルア
セテートのエステラーゼによる分解ならびにＮ−
ホルミルメチオニンβ−ナフチルアミドのホルミ
ルメチオニンアミノペプチダーゼによる分解を阻
止する効力について調べた結果、後述の試験例に
示されるごとく、抗エステラーゼ活性と抗ホルミ
ルメチオニンアミノペプチダーゼ活性を有するこ
とを確認した。 第１の本発明の要旨は、次の構造を有する抗エ
ステラーゼ、抗ホルミルメチオニンアミノペプチ
ダーゼ活性物質エベラクトンＡならびにＢに関す
るものである。 エベラクトンＡ及びＢは、後記の実施例に示す
ごとく、エベラクトン生産菌の培養液の溶媒抽
出物をシリカゲルクロマトグラフイー等で分画す
ることにより、いずれも無色の結晶として取得で
きる。その物性は次の通りである。 即ち、エベラクトンＡは紫外部吸収スペクトル
でλMeOH nax291nｍ（ε311）、比旋光度〔α〕20 D−221
゜
（ｃ＝１、MeOH）、融点86℃、質量分析法で得
られる分子量338、元素分析値：C70.97％、
H10.20％、O19.07％であり、C20H34O4の分子式
を得る。赤外部吸収スペクトル（臭化カリウム
錠）で3500、2950、1825、1695、1460、1385、
1125、980、870cm-1に特異吸収帯を有し、かつ核
磁気共鳴吸収スペクトル（重クロロホルム溶液、
δppm）で、1.38（２−CH3）、3.29（２位CH）、
3.88（３位CH）、0.87（４−CH3）〜1.99（４位
CH）、〜1.7および2.35（５位CH2）、1.73（６−
CH3）、5.04（７位CH）、1.12（８−CH3）、3.59（８
位CH）、1.10（10−CH3）、2.86（10位CH）、3.50
（11位CH）、3.03（11−OH）、0.79（12−CH3）、〜
1.41（12位CH）、〜1.71（13位CH2）、0.87（14位
CH3）に吸収を示す。 エベラクトンＢは紫外部吸収スペクトルで
λMeOH nax291nｍ（ε479）、比旋光度〔α〕26 D−203゜
（ｃ
＝1.0、MeOH）、融点77℃、質量分析法で得られ
る分子量352、元素分析値：C71.72％、H10.31
％、O18.37％であり、C21H36O4の分子式を得る。
赤外線吸収スペクトル（臭化カリウム錠）で
3500、2960、1825、1700、1465、1390、1125、
1000、970、870cm-1に特異吸収帯を有し、かつ核
磁気共鳴吸収スペクトル（重クロロホルム溶液、
δppm）で、1.06（2′位CH3）、〜1.86（1′位CH2）、
3.20（２位CH）、3.92（３位CH）、0.86（４−CH3）、
〜２（４位CH）、〜1.86および2.38（５位CH2）、
1.73（６−CH3）、5.04（７位CH）、1.12（８−
CH3）、3.58（８位CH）、1.10（10−CH3）、2.86（10
位CH）、3.51（11位CH）、3.04（11−OH）、0.78
（12−CH3）、〜1.43（12位CH）、〜1.73（13位
CH2）、0.87（14位CH3）に吸収を示す。 また、第２の本発明の要旨はストレプトミセス
属に属するエベラクトン生産菌を培養した本物質
を培養物中に生産、蓄積させ、さらにそれより本
物質を採取することを特徴とする新規生理活性物
質エベラクトンの製造方法にある。 以下本物質の製造方法について具体的に説明す
る。 本発明の方法で使用されるエベラクトン生産菌
株の例としては、本発明者らによつて熊谷市、立
正大学構内の土壤中から分離されたストレプトミ
セスMG7−G1株がある。本菌株の菌学的性状は
次の通りである。 〔MG7−G1の菌学的性状〕 １ 形態 MG7−G1株は顕微鏡下で分枝した基中菌糸
より比較的長い真直ぐな（Rectiflexibilis）気
菌糸を形成し螺旋形成及び輪生枝はみとめられ
ない。成熟した胞子鎖は10個以上の胞子の連鎖
をみとめ、胞子大きさは0.6〜0.8×0.8〜1.2ミ
クロン位で胞子の表面は平滑である。 ２ 各種培地における生育状態 色の記載について〔 〕内に示す標準はコン
テイナー・コーポレーシヨン・オブ・アメリカ
のカラー・ハーモニー・マニユアル
（Container Corporation of AmericaのColor
harmony manual）を用いた。 (1) シユクロース・硝酸塩寒天培地（27℃培
養） 無色〜うす黄〔2ec、Biscuit〕〜うす黄茶
〔2gc、Bamboo〕の発育上に茶白〔3ec、
Light Beige〕〜茶灰〔3ig、Beige Brown〕
の気菌糸を着生し、溶解性色素はみとめられ
ない。 (2) グルコース・アスパラギン寒天培地（27℃
培養） 無色〜うす黄〜うす黄茶〔2nl、Covert
Brown〕の発育上に茶白〜明るい茶灰
〔3ml、Beaver、Gray〕〜明るい灰〔2fe、
Covert Gray〕の気菌糸を着生し、培養後14
日目ごろからわずかに茶色味をおびた溶解性
色素を産生する。 (3) グリセリン・アスパラギン寒天培地（ISP
−培地５、27℃培養） 発育はうす黄〜うす黄茶〔2ie、Light
Mustard Tan〕〜灰味黄茶〔2li、Covert
Brown〕〜暗い茶〔3nl、Dark Brown〕、
気菌糸は灰白〔2dc、Natural〕〜明るい灰
〔2fe、Covert Gray〕〜茶灰〔3ig、Beige
Brown〕を呈し、培養後10日目ごろからわ
ずかに茶色味をおびた溶解性色素を産生す
る。 (4) スターチ・無機塩寒天培地（ISP−倍地
４、27℃培養） うす黄〜うす黄茶〔2ie、Light Mustard
Tan〕〜黄茶〔3li、Beaver〕の発育上に茶
白〜明るい灰〔2fe、Covert Gray〕〜茶灰
〔3ih、Beige Gray〕の気菌糸を着生し、培
養後10日目ごろからわずかに茶色味をおびた
溶解性色素を産生する。 (5) チロシン寒天培地（ISP−培地７、27℃培
養） うす黄茶〜黄茶〔2ni、Mustard Brown〕
の発育上に黄味灰〜明るい灰〔2fe、Covert
Gray〕の気菌糸を着生し、培養後５日目ご
ろからわずかに茶色味をおびた溶解性色素を
産生する。 (6) 栄養寒天培地（27℃培養） 発育はうす黄茶〜明るい茶〔3lg、Light
Brown〕、気菌糸は着生しないかあるいはわ
ずかにうつすらと茶白を呈し、茶色の溶解性
色素を産生する。 (7) イースト・麦芽寒天培地（ISP−培地２、
27℃培養） うす黄茶〜灰味黄茶〔2nl、Covert
Brown〕の発育上に灰白〜明るい灰〔2fe、
Covert Gray〕〜茶灰〔2ih、Dark Covert
Gray〕の気菌糸を着生し、茶色の溶解性色
素を産生する。 (8) オートミル寒天培地（ISP−培地３、27℃
培養） うす黄茶〔2ie、Light Mustard Tan〕の
発育上に黄味灰〜明るい灰〔2fe、Covert
Gray〕〜茶灰〔2ih、Dark Covert Gray〕
の気菌糸を着生し、培養後21日目ごろにわず
かに茶色味をおびた溶解性色素を産生する。 (9) グリセリン・硝酸塩寒天培地（27℃培養） うす黄〜うす黄茶〜黄茶〔3li、Beaver〕
の発育上に灰白〜明るい灰〔2li、Covert
Brown〕〜灰色〔3ih、Beige Gray〕の気菌
糸を着生し、培養後６日目ごろからわずかに
茶色味をおびた溶解性色素を産生する。 (10) スターチ寒天培地（27℃培養） 無色〜うす黄〜黄茶〔2lg、Mustard
Tan〕の発育上に灰白〜明るい灰〔3fe、
Silver Gray〕〜茶灰〔3ih、Beige Gray〕
の気菌糸を着生し、培養後10日目ごろからわ
ずかに茶色味をおびた溶解性色素を産生す
る。 (11) リンゴ酸石灰寒天培地（27℃培養） うす黄の発育上に灰白〜茶灰〔3ig、
Beige Brown〕の気菌糸を着生し、溶解性
色素は認められない。 (12) セルロース（27℃培養） 発育は無色、気菌糸は着生せず、溶解性色
素もみとめられない。 (13) ゼラチン穿刺培養 単純ゼラチン培地（20℃培養）では、うす
黄〜うす黄茶の発育上にわずかな茶白の気菌
糸を着生し、茶色の溶解性色素を産生する。 グルコース・ペプトン・ゼラチン培地（27
℃培養）では、発育はうす黄茶、気菌糸は着
生せず、わずかに茶色味をおびた溶解性色素
を産生する。 (14) 脱脂牛乳（37℃培養） 発育はうす黄〜うす茶〜黄茶、気菌糸は着
生せず、わずかに茶色味をおびた溶解性色素
を産生する。 ３ 生理的性質 (1) 生育温度範囲 グルコース・アスパラギン寒天を用い、20
℃、24℃、27℃、30℃、37℃、50℃の各温度
で試験の結果、50℃を除いて、そのいずれの
温度でも生育するが、最適温度は24℃〜30℃
付近と思われる。 (2) ゼラチンの液化 （15％単純ゼラチン、20℃培養及びグルコ
ース・ペプトン・ゼラチン、27℃培養） いずれの場合も、培養後６日目ごろから液
化が始まり、その作用は中程度である。 (3) スターチの加水分解 （スターチ無機塩寒天培地及びスターチ寒
天培地いずれも27℃培養） いずれの場合も、培養後６日目ごろから水
解性がみとめられ、その作用は中程度から強
い方である。 (4) 脱脂牛乳の凝固・ペプトン化（脱脂牛乳、
37℃培養） 培養後５日目頃から凝固が始まり、７日目
で完了と同時にペプトン化が始まる。ペプト
ン化は14日目で完了した。その作用は中程度
から強い方である。 (5) メラニン様色素の生成（トリプトン・イー
スト・ブロス、ISP−培地１；ペプトン・イ
ースト・鉄寒天、ISP−培地６；チロシン寒
天、ISP−培地７、いずれも27℃培養） トリプトン・イースト・ブロス及びチロシ
ン寒天培地ではメラニン様色素の生成がみと
められる。ペプトン・イースト、鉄寒天培地
ではこの菌株は生育しないが、この培地成分
の一つであるクエン酸鉄アンモニウムを除い
た培地には生育し、メラニン様色素の生成が
みとめられた。 (6) 炭素源の利用性（プリドハム・ゴトリーブ
寒天培地、ISP−培地９、27℃培養） グルコースを利用して発育し、Ｌ−アラビ
ノ−ス、Ｄ−キシロース、Ｄ−フルクトー
ス、シユクロース、イノシトール、Ｌ−ラム
ノース、ラフイノース、Ｄ−マンニトールは
利用しない。 (7) リンゴ酸石灰の溶解（リンゴ酸石灰寒天、
27℃培養） 培養後６日目ごろから発育周辺のリンゴ酸
石灰を溶解し、その作用は中程度〜強い方で
ある。 (8) 硝酸塩の還元反応（1.0％硝酸カリ含有ペ
プトン水、ISP−培地８、27℃培養） 陰性である。 以上の性状を要約するとMG7−G1株はストレ
プトミセス属に属し、気菌糸は輪生枝、螺旋形成
ともにみられず、胞子の表面は平滑である。 種々の培地上でうす黄〜うす黄茶〜黄茶の発育
上に灰白〜明るい灰〜茶灰の気菌糸を着生し、溶
解性色素はわずかに茶色を呈する程度である。メ
ラニン様色素は陽性、蛋白分解力は中程度、スタ
ーチの水解性は中程度から強い方である。 これらの性状より既知菌種を検索するとストレ
プトミセス・アブラビエンシス〔Streptomyces
aburaviensis：文献1Nishimura、H.et al.、
Journal of Antibiotics、Ser.A、10巻、205頁、
1957年：2Bergey´s Manual of Determinative
Bacteriology、8th Edition、761頁：
3International Journal of Systematic
Bacteriology、18巻、No.４、284頁、1968年：
4The Actinomycetes2巻、166頁〕がもつとも近
縁の種としてあげられる。 次に実際にこの菌株を入手し、MG7−G1株と
比較検討した結果は次の通りである。 【表】 ＋
＊；IJSB(International Journal of
Systematic Bacteriology)の記載では＋、
表にみられるように、MG7−G1株とストレプ
トミセス・アブラビエンシスISP5033株とは、次
の点で異なつている。(1)ISP−培地１及び７にお
けるメラニン様色素生産性において前者は陽性で
あるのに後者は陰性である。(2)ISP−培地６に前
者は生育しないが培地成分のクエン酸鉄アンモニ
ウムを除けば生育し、メラニン様色素を生産す
る。一方、後者はISP−培地６に生育し、メラニ
ン様色素は生産しない。 MG7−G1株は上記の点においてストレプトミ
セス・アブラビエンシスISP5033株と異なつた性
状を示すが、その他の点では一致した成績を示
し、両者は極めて近縁の種と考えられる。なおス
トレプトミセスMG7−G1株は工業技術院微生物
工業技術研究所に、昭和55年１月18日付で保管委
託申請し、その微生物受託番号は微工研菌寄第
5363号（FERM−Ｐ No.5363）である。 本物質生産菌を培養するに用いる栄養源として
は、放線菌の栄養源として公知のものを適宜使用
することができる。例えば市販されているグリセ
リン、グルコース、ラクトース、シユクロース、
デンプン、マルトース、糖蜜などの炭水化物、脂
肪、マロン酸及びマレイン酸等の低級脂肪酸の塩
等を炭素源として、市販されているペプトン、肉
エキス、綿実粉（フアルマメデイア）、落花生粉、
大豆粉、酵母エキス、Ｎ−Ｚアミン、カゼイン、
Ｌ−アスパラギン、魚粉、硝酸ソーダ、硝酸アン
モニウム、硫酸アンモニウムなどを窒素源とし
て、食塩、燐酸塩、炭酸カルシウム、硫酸マグネ
シウムなどを無機の栄養源としてそれぞれ使用で
きる。その他必要に応じて微量の金属塩を添加す
る。これらのものは本物質生産菌が利用し、また
本物質の生産を妨害しないものであればよい。公
知の放線菌の培養材料はすべて使用できる。特に
好ましい培地成分としては、炭素源としてグリセ
リンン、窒素源として魚粉などがある。グリセリ
ン3.0％、魚粉2.0％、炭酸カルシウム0.2％を含む
組成の培地を用いるのが好ましい。 本物質の大量生産には液体培養が好ましい。培
養温度としては本物質生産菌が発育し、本物質を
生産する範囲の温度を適用し得るが、特に好まし
い培養温度は27℃である。培養は普通は本物質が
培養物中に生産され、充分に蓄積するまで継続さ
れる。例えば、グリセリン3.0％、魚粉2.0％、炭
酸カルシウム0.2％を含む培地を滅菌したのち、
これに本物質生産菌の斜面培養から胞子及び菌糸
を接種し、27℃で好気的に振盪培養を行なつたと
ころ、培養１日目から３日目に本物質の蓄積が認
められた。 本物質の培養ならびに精製工程での追跡は、次
の方法による抗エステラーゼ活性ならびに抗ホル
ミルメチオニンアミノペプチダーゼ活性の測定に
基づいて行なつた。 まず抗エステラーゼ活性の測定はC.
HUGGINS and J.LAPIDES、J.Biol.Chem.、
170、467（1947）記載の方法の改良法を使用した。
即ち米国シグマ社より市販されているブタの肝臓
より得たエステラーゼを水で1000倍に希釈し、こ
の酵素溶液を0.025ml、0.06％トライトン
（Triton）Ｘ−100含有0.1M燐酸緩衝液（PH7.0）
１ml、および定量されるべき検体を含む溶液0.95
mlを混合した溶液（1.975ml）に40mMのパラ−
ニトロフエニルアセテートのメタノール溶液
0.025mlを加えることにより反応を開始させる。
室温で20分間反応させた後、反応液の400nｍに
おける吸光度(a)を測定した。同時に本物質を含ま
ない緩衝液のみを用いた盲検の吸光度(b)を測定し
た。エステラーゼ阻害率は式〔（ｂ−ａ）／ｂ〕×
100により計算した。この定量法で0.056μｇ／ml
のエベラクトンＡ及び0.00035μｇ／mlのエベラク
トンＢはエステラーゼ活性を50％阻害（IC50）し
た。 次に、ホルミルメチオニンアミノペプチダーゼ
に対する阻害活性は以下の方法で測定された。基
質としてのＮ−ホルミルメチオニンβ−ナフチル
アミドは５％（Ｗ／Ｖ）トウイーン（Tween）
20を含むメタノールに溶かし、20mM溶液を用い
た。ホルミル−メチオニンアミノペプチダーゼは
ラツトの肝臓より調製した。基質溶液0.005ml、
0.1Mtris−塩酸緩衝液（PH7.8）および水または
検体を含む溶液を加え、全量を0.95mlとする。こ
の反応に基質溶液0.05mlを加え、37℃で25分間反
応したのちフアスト ガーネツト（Fast
Garnet）GBC（米国シグマ社製、10％トウイーン
20を含む1M酸酸緩衝液（PH4.2）に溶かし、濃度
１mg／mlの溶液としたもの）１mlを加え反応を止
める。室温に15分間放置したのち、525nｍの吸
光度を測定する。検体の阻害活性は前述のエステ
ラーゼの阻害活性測定法に準じて算出することが
できる。ホルミルメチオニンアミノペプチダーゼ
に対する50％阻害濃度はエベラクトンＡが0.08μ
ｇ／ml、またエベラクトンＢが0.02μｇ／mlであ
る。 本物質はタンク培養法でも振盪培養法と同様に
よく生産される。例えば2000の醗酵槽に1000
の培地を入れて滅菌し、毎分800の無菌空気を
通気し、毎分240回転で撹拌した。この条件で本
物質の生産は37時間で最高に達した。本物質は生
産菌の培養液中及び菌体中に存在する。培養液及
び菌体中の本物質は培養終了後の培養液に同量の
酢酸ブチル・ブタノール等の水と混和しない有機
溶媒を加え、数時間撹拌することにより有機溶剤
中に抽出される。又、本物質は培養液からブタ
ノール・酢酸ブチル等の水と混和しない有機溶剤
で、又菌体からはメタノール、エタノール等の有
機溶剤で抽出することもできる。本物質はこれを
含む溶液から吸着剤に吸着および脱離することに
より好収率に採取することができる。吸着剤とし
ては活性炭、アンバーライトXAD等の有機吸着
剤、アルミナ、シリカゲル、フロリジル等の無機
性吸着剤が使用できる。例えば本物質はシリカゲ
ルで吸着され、ｎ−ヘキサン、クロロホルムの混
合溶液で溶出される。 又、シリカゲルの表面にシランを結合させた逆
相用シリカゲルを用いるクロマトグラフイーが特
に有効であり、メタノール−水の混合溶媒で溶出
させることにより、エベラクトンＡとＢを相互に
分離することができる。例えば培養液を有機溶
剤、例えば酢酸ブチルで抽出して得た油状物質を
シリカゲルクロマトグラフイーにかけて精製した
後、さらにシリカゲルクロマトグラフイーにか
け、適当な溶媒系を用いて溶出し、エベラクトン
Ａを含有するフラクシヨンとエベラクトンＢを含
むフラクシヨンを採取し、それからエベラクトン
ＡとＢをそれぞれ単離する。 本物質の最終的な精製は結晶化によつて行なう
ことができる。エベラクトンＡ、Ｂ共に良好なる
結晶性を有するので、メタノール−水の系から針
状結晶として析出させることができる。 このようにして得られるエベラクトンについて
その薬理作用の検討を行なつた。その結果、本物
質が細胞性免疫に対する増強効果と抗炎症作用を
有していることが見出された。それらについて以
下説明する。 細胞性免疫増強効果について 試験方法： 細胞性免疫に対する本物質の作用は羊赤血球を
抗原に用い、これをマウス足蹠に接種して得られ
る遅延型過敏反応（D.T.H）を指標〔P.H.
Lagrange、G.B.Mackaness and T.E.Mille：J.
Expt.Med.、159、1529−1539（1974）〕として本
物質の効果を検討した。 即ち羊赤血球108個を0.05mlの生理的食塩水に
浮遊させ、CDF1雌性８週令ウスの後肢足蹠に皮
下注射して免疫を施し、同時に本物質を50mg／
Kg、12.5mg／Kg、3.125mg／Kg、0.781mg／Kgの各
用量で腹腔内注射した。また本物質0.5mg／Kgを
経口投与した。４日後、各マウスの他の一方の後
肢足蹠に羊赤血球108個を皮下注射して24時間後、
その足蹠にみられる腫張の程度（足蹠の厚さ）を
ノギスで測定することにより判定した。 結果： 試験の結果は表１に示す通りである。 【表】 【表】 本物質0.781〜50mg／Kgの腹腔注射あるいは0.5
mg／Kgの経口投与はD.T.Hに対し顕著な増強作用
のあることが認められた。 抗炎症作用について 方法： エベラクトンと対照薬エステラスチンとを経口
投与、腹腔内投与の二方法で投与し、カラゲニン
足浮腫に対する抑制効果を検討した（使用動物：
ウイスター系雄性ラツト、体重140〜150ｇ）。試
料はエタノールを約0.5c.c.、トウイーン（Tween）
80を１滴加えた後、アラビアゴム溶液にて各用量
に懸濁した。このようにして調製した試料を投与
後１時間後に、ラツト足蹠に１％カラゲニンを皮
下注射し、炎症を生ぜしめた。起炎後３時間と５
時間の２回にわたつてラツト足容積を測定した。 結果： 次の表２、３に示す通りである。 【表】 【表】 まず経口投与では、エベラクトンＢの場合、10
mg／Kgで３時間、５時間共：50mg／Kgで３時間：
100mg／Kgで５時間後の値に、コントロール群の
浮腫強度に対して有意な減少がみられる。 次に腹腔内投与であるが、エベラクトンＢにつ
いては５mg／Kgの５時間後、10mg／Kgの３時間後
の値を除いて、すべての試料がコントロール群の
浮腫強度に対して有意な減少を示した。 さらにエベラクトンＡについても同様の傾向が
認められた。 本物質は100μｇ／mlの濃度で組織培養細胞に
毒性を示さない。マウスに対する急性毒性は250
mg／Kg（i.p.）で全く毒性が認められない。 以上の結果、本物質は極めて安全に用いられ、
少なくとも細胞性免疫増強物質として有用であ
る。従つて、第３の本発明の要旨は、エベラクト
ンを有効成分として含有することを特徴とする免
疫増強剤である。 次に本発明のエベラクトンの製造に関して実施
例を示すが、本物質の理化学的性状ならびに生産
方法、その抽出精製法が本発明者らによつて明ら
かにされたので、本明細書に示された方法を修飾
することは容易であり、本発明は以下に記載する
実施例のみに限定されるものではない。 実施例 １ 本物質生産菌としてストレプトミセス・アブラ
ビエンシスに近縁のMG7−G1株（微工研菌寄第
5363号）の斜面培養から一白金耳量をとり、あら
かじめ120℃、20分間の条件で滅菌した500ml容量
のロータリーフラスコに110mlずつ分注したグリ
セリン3.0％、魚粉2.0％、炭酸カルシウム0.2％か
ら成る組成を有する培地に接種した。27℃におい
て毎分180回転の培養条件を用い、経時的に産生
量を検討したところ、培養２日目に産生量はピー
クに達した。培養３日目から阻害物質の濃度は
徐々に減少した。培養中の培地のPH変化は１日目
7.0、２日目6.6、３日目7.3、４日目7.8、５日目
8.2であつた。 実施例 ２ 実施例１と同様の培地と培養条件で、ストレプ
トミセス・アブラビエンシスに近縁なMG7−G1
株を培養して得られた培養液2.5に酢酸ブチル
2.5を加え、室温で２時間撹拌した。次に過
助剤（ハイフロスーパーセル）を加えて過を行
ない、得られた液を酢酸ブチル層と水層とに分
け、酢酸ブチル層を減圧下で濃縮し、本物質を含
む油状物質4.36ｇを得た。 実施例 ３ 実施例２において得られた本物質を含む油状物
質4.36ｇをシリカゲルカラム（ワコーゲルＣ−
200、2.5×35cm）にかけ、ｎ−ヘキサン−クロロ
ホルム−酢酸エチル（５：５：１容比）の混合溶
剤で溶出し、10ｇずつのフラクシヨンに分画して
とると、フラクシヨン41番から137番に活性物質
の存在が認められた。この活性分画を減圧濃縮乾
固することにより淡黄色の油状物質434mgが得ら
れた。 実施例 ４ 実施例３において得られた油状物質434mgを逆
相シリカゲルカラム（西独メルク社製、silicagel
60 silanized、1.2×47cm）にかけ、メタノール−
水（１：１容比）の混液で溶出し、10mlずつのフ
ラクシヨンに分画した。フラクシヨン38番から53
番にエベラクトンＡが、65番から81番にエベラク
トンＢが得られ、それぞれを減圧下で濃縮するこ
とにより、エベラクトンA20mg、エベラクトン
B10mgの白色粉末が得られた。これらはいずれも
ｎ−ヘキサン−クロロホルム−酢酸エチル（５：
５：１容比）の混合溶媒系を用いるシリカゲル薄
層クロマトグラフイーで単一スポツトを与えた。 実施例 ５ グルコース3.0％、魚粉2.0％、炭酸カルシウム
0.2％、消泡剤（アデカノール）0.01％から成る
培地1000を2000のステンレス製タンクに仕込
み、120℃、30分間滅菌後、ストレプトミセス・
アブラビエンシスに近縁のMG7−G1株（微工研
菌寄第5363号）の種培養液（通気撹拌培養２日）
50を植菌し、撹拌は毎分240回転、通気量は毎
分800で28℃、43時間培養を行なつた。この培
養液に酢酸ブチル350を加え、４時間撹拌した。
傾斜過及び過助剤（ハイフロスーパーセル）
を用いたバスケツト型遠心器による過により、
菌体を除き、酢酸ブチル層を分離し、減圧下で濃
縮して濃縮液1.9を得た。 実施例 ６ 実施例５において得られた本物質を含む濃縮液
1.9をシリカゲルカラム（ワコーゲルＣ−100、
10×60cm）にかけ、ｎ−ヘキサン７で洗つてか
らｎ−ヘキサン−クロロホルム（１：１容比）
4.5、ついでｎ−ヘキサン−クロロホルム−酢
酸エチル（５：５：１容比）10で溶出した。50
mlずつのフラクシヨンに分画したところ、フラク
シヨン81番から200番に活性が認められた。この
活性分画を濃縮したところ、150.9ｇの油状物質
が得られた。 実施例 ７ 実施例６において得られた本物質を含む濃縮液
71.6ｇを逆相用シリカゲルカラム（西独、メルク
社製、Silicagel 60、Silanized、5.5×17.5cm）に
かけ、メタノール−水（１：１容比）の混液で溶
出し、20mlずつのフラクシヨンに分画した。 薄層クロマトグラフイーで検定したところ、フ
ラクシヨン105番から147番は主としてエベラクト
ンＡを含み、エベラクトンＢは検出されなかつ
た。フラクシヨン148番から270番はエベラクトン
Ａ、Ｂ共に検出された。フラクシヨン271番から
443番は主としてエベラクトンＢを含み、エベラ
クトンＡは検出されなかつた。フラクシヨン105
番から147番、148番から270番、271番から443番
をそれぞれ集めて減圧下で濃縮し、それぞれから
392mg、974mg、518mgの黄色粉末を得た。 実施例 ８ 実施例７において得られたエベラクトンＡを主
として含む粉末392mgをシリカゲルカラム（ワコ
ーゲルＣ−300、1.3×48cm）にかけ、ｎ−ヘキサ
ン−クロロホルム（３：１容比）の混合溶媒で溶
出し、５ｇずつのフラクシヨンに分画した。フラ
クシヨン101番から130番を減圧下に濃縮し、薄層
クロマトグラフイーで単一スポツトを与えるエベ
ラクトンＡの無色粉末175mgを得た。これを少量
のメタノールに溶かし、水を加えていくとエベラ
クトンＡの一次針状結晶128mgが得られた。 実施例 ９ 実施例７において得られたエベラクトンＢを主
として含む粉末518mgをシリカゲルカラム（ワコ
ーゲルＣ−300、1.3×50cm）にかけ、ｎ−ヘキサ
ン−クロロホルム（３：１容比）の混合溶媒で溶
出し、10ｇずつのフラクシヨンに分画した。フラ
クシヨン49番から58番までを減圧下に濃縮し、薄
層クロマトグラフイーで単一スポツトを与えるエ
ベラクトンＢの無色粉末219mgを得た。これを少
量のメタノールに溶かし、水を加えていくとエベ
ラクトンＢの一次針状結晶129mgが得られた。
ニンアミノペプチダーゼに対して阻害活性を示す
新規生理活性物質エベラクトン（Ebelactone）
及びその製造法ならびにそれを有効成分として含
有する薬剤、特に免疫増強剤に係るものである。 本発明者らは熊谷市、立正大学構内の土壤より
分離した放線菌MG7−G1株を培養して得られる
培養物中にエステラーゼならびにホルミルメチオ
ニンアミノペプチダーゼ阻害活性を有する物質の
存在することを見出し、その物質の採取方法につ
いて検討し、本発明を完成した。 本阻害物質は新規な構造を有する物質であり、
エベラクトン（Ebelactone）と命名されたが、
このエベラクトンは後記のごとく２種類の物質、
即ちエベラクトンＡとＢから構成されており、そ
れらの物性値と構造式はそれぞれ後記の通りであ
る。 以下の説明において、本物質又はエベラクトン
とはエベラクトンＡ又はＢ又はこれらの混合物を
意味するものとする。 本発明者らはさらに本物質の医薬としての有用
性について検討した結果、本物質が細胞性免疫に
対して増強作用を有すること及びさらに抗炎症作
用をもかね備えていることを見出した。 以上の状況から判断して、本物質は癌免疫療法
やブレオマイシンなどの制癌物質の増強作用を介
して種々の医薬用途の開発が期待できる物質であ
る。 本物質は、本発明者らがパラニトロフエニルア
セテートのエステラーゼによる分解ならびにＮ−
ホルミルメチオニンβ−ナフチルアミドのホルミ
ルメチオニンアミノペプチダーゼによる分解を阻
止する効力について調べた結果、後述の試験例に
示されるごとく、抗エステラーゼ活性と抗ホルミ
ルメチオニンアミノペプチダーゼ活性を有するこ
とを確認した。 第１の本発明の要旨は、次の構造を有する抗エ
ステラーゼ、抗ホルミルメチオニンアミノペプチ
ダーゼ活性物質エベラクトンＡならびにＢに関す
るものである。 エベラクトンＡ及びＢは、後記の実施例に示す
ごとく、エベラクトン生産菌の培養液の溶媒抽
出物をシリカゲルクロマトグラフイー等で分画す
ることにより、いずれも無色の結晶として取得で
きる。その物性は次の通りである。 即ち、エベラクトンＡは紫外部吸収スペクトル
でλMeOH nax291nｍ（ε311）、比旋光度〔α〕20 D−221
゜
（ｃ＝１、MeOH）、融点86℃、質量分析法で得
られる分子量338、元素分析値：C70.97％、
H10.20％、O19.07％であり、C20H34O4の分子式
を得る。赤外部吸収スペクトル（臭化カリウム
錠）で3500、2950、1825、1695、1460、1385、
1125、980、870cm-1に特異吸収帯を有し、かつ核
磁気共鳴吸収スペクトル（重クロロホルム溶液、
δppm）で、1.38（２−CH3）、3.29（２位CH）、
3.88（３位CH）、0.87（４−CH3）〜1.99（４位
CH）、〜1.7および2.35（５位CH2）、1.73（６−
CH3）、5.04（７位CH）、1.12（８−CH3）、3.59（８
位CH）、1.10（10−CH3）、2.86（10位CH）、3.50
（11位CH）、3.03（11−OH）、0.79（12−CH3）、〜
1.41（12位CH）、〜1.71（13位CH2）、0.87（14位
CH3）に吸収を示す。 エベラクトンＢは紫外部吸収スペクトルで
λMeOH nax291nｍ（ε479）、比旋光度〔α〕26 D−203゜
（ｃ
＝1.0、MeOH）、融点77℃、質量分析法で得られ
る分子量352、元素分析値：C71.72％、H10.31
％、O18.37％であり、C21H36O4の分子式を得る。
赤外線吸収スペクトル（臭化カリウム錠）で
3500、2960、1825、1700、1465、1390、1125、
1000、970、870cm-1に特異吸収帯を有し、かつ核
磁気共鳴吸収スペクトル（重クロロホルム溶液、
δppm）で、1.06（2′位CH3）、〜1.86（1′位CH2）、
3.20（２位CH）、3.92（３位CH）、0.86（４−CH3）、
〜２（４位CH）、〜1.86および2.38（５位CH2）、
1.73（６−CH3）、5.04（７位CH）、1.12（８−
CH3）、3.58（８位CH）、1.10（10−CH3）、2.86（10
位CH）、3.51（11位CH）、3.04（11−OH）、0.78
（12−CH3）、〜1.43（12位CH）、〜1.73（13位
CH2）、0.87（14位CH3）に吸収を示す。 また、第２の本発明の要旨はストレプトミセス
属に属するエベラクトン生産菌を培養した本物質
を培養物中に生産、蓄積させ、さらにそれより本
物質を採取することを特徴とする新規生理活性物
質エベラクトンの製造方法にある。 以下本物質の製造方法について具体的に説明す
る。 本発明の方法で使用されるエベラクトン生産菌
株の例としては、本発明者らによつて熊谷市、立
正大学構内の土壤中から分離されたストレプトミ
セスMG7−G1株がある。本菌株の菌学的性状は
次の通りである。 〔MG7−G1の菌学的性状〕 １ 形態 MG7−G1株は顕微鏡下で分枝した基中菌糸
より比較的長い真直ぐな（Rectiflexibilis）気
菌糸を形成し螺旋形成及び輪生枝はみとめられ
ない。成熟した胞子鎖は10個以上の胞子の連鎖
をみとめ、胞子大きさは0.6〜0.8×0.8〜1.2ミ
クロン位で胞子の表面は平滑である。 ２ 各種培地における生育状態 色の記載について〔 〕内に示す標準はコン
テイナー・コーポレーシヨン・オブ・アメリカ
のカラー・ハーモニー・マニユアル
（Container Corporation of AmericaのColor
harmony manual）を用いた。 (1) シユクロース・硝酸塩寒天培地（27℃培
養） 無色〜うす黄〔2ec、Biscuit〕〜うす黄茶
〔2gc、Bamboo〕の発育上に茶白〔3ec、
Light Beige〕〜茶灰〔3ig、Beige Brown〕
の気菌糸を着生し、溶解性色素はみとめられ
ない。 (2) グルコース・アスパラギン寒天培地（27℃
培養） 無色〜うす黄〜うす黄茶〔2nl、Covert
Brown〕の発育上に茶白〜明るい茶灰
〔3ml、Beaver、Gray〕〜明るい灰〔2fe、
Covert Gray〕の気菌糸を着生し、培養後14
日目ごろからわずかに茶色味をおびた溶解性
色素を産生する。 (3) グリセリン・アスパラギン寒天培地（ISP
−培地５、27℃培養） 発育はうす黄〜うす黄茶〔2ie、Light
Mustard Tan〕〜灰味黄茶〔2li、Covert
Brown〕〜暗い茶〔3nl、Dark Brown〕、
気菌糸は灰白〔2dc、Natural〕〜明るい灰
〔2fe、Covert Gray〕〜茶灰〔3ig、Beige
Brown〕を呈し、培養後10日目ごろからわ
ずかに茶色味をおびた溶解性色素を産生す
る。 (4) スターチ・無機塩寒天培地（ISP−倍地
４、27℃培養） うす黄〜うす黄茶〔2ie、Light Mustard
Tan〕〜黄茶〔3li、Beaver〕の発育上に茶
白〜明るい灰〔2fe、Covert Gray〕〜茶灰
〔3ih、Beige Gray〕の気菌糸を着生し、培
養後10日目ごろからわずかに茶色味をおびた
溶解性色素を産生する。 (5) チロシン寒天培地（ISP−培地７、27℃培
養） うす黄茶〜黄茶〔2ni、Mustard Brown〕
の発育上に黄味灰〜明るい灰〔2fe、Covert
Gray〕の気菌糸を着生し、培養後５日目ご
ろからわずかに茶色味をおびた溶解性色素を
産生する。 (6) 栄養寒天培地（27℃培養） 発育はうす黄茶〜明るい茶〔3lg、Light
Brown〕、気菌糸は着生しないかあるいはわ
ずかにうつすらと茶白を呈し、茶色の溶解性
色素を産生する。 (7) イースト・麦芽寒天培地（ISP−培地２、
27℃培養） うす黄茶〜灰味黄茶〔2nl、Covert
Brown〕の発育上に灰白〜明るい灰〔2fe、
Covert Gray〕〜茶灰〔2ih、Dark Covert
Gray〕の気菌糸を着生し、茶色の溶解性色
素を産生する。 (8) オートミル寒天培地（ISP−培地３、27℃
培養） うす黄茶〔2ie、Light Mustard Tan〕の
発育上に黄味灰〜明るい灰〔2fe、Covert
Gray〕〜茶灰〔2ih、Dark Covert Gray〕
の気菌糸を着生し、培養後21日目ごろにわず
かに茶色味をおびた溶解性色素を産生する。 (9) グリセリン・硝酸塩寒天培地（27℃培養） うす黄〜うす黄茶〜黄茶〔3li、Beaver〕
の発育上に灰白〜明るい灰〔2li、Covert
Brown〕〜灰色〔3ih、Beige Gray〕の気菌
糸を着生し、培養後６日目ごろからわずかに
茶色味をおびた溶解性色素を産生する。 (10) スターチ寒天培地（27℃培養） 無色〜うす黄〜黄茶〔2lg、Mustard
Tan〕の発育上に灰白〜明るい灰〔3fe、
Silver Gray〕〜茶灰〔3ih、Beige Gray〕
の気菌糸を着生し、培養後10日目ごろからわ
ずかに茶色味をおびた溶解性色素を産生す
る。 (11) リンゴ酸石灰寒天培地（27℃培養） うす黄の発育上に灰白〜茶灰〔3ig、
Beige Brown〕の気菌糸を着生し、溶解性
色素は認められない。 (12) セルロース（27℃培養） 発育は無色、気菌糸は着生せず、溶解性色
素もみとめられない。 (13) ゼラチン穿刺培養 単純ゼラチン培地（20℃培養）では、うす
黄〜うす黄茶の発育上にわずかな茶白の気菌
糸を着生し、茶色の溶解性色素を産生する。 グルコース・ペプトン・ゼラチン培地（27
℃培養）では、発育はうす黄茶、気菌糸は着
生せず、わずかに茶色味をおびた溶解性色素
を産生する。 (14) 脱脂牛乳（37℃培養） 発育はうす黄〜うす茶〜黄茶、気菌糸は着
生せず、わずかに茶色味をおびた溶解性色素
を産生する。 ３ 生理的性質 (1) 生育温度範囲 グルコース・アスパラギン寒天を用い、20
℃、24℃、27℃、30℃、37℃、50℃の各温度
で試験の結果、50℃を除いて、そのいずれの
温度でも生育するが、最適温度は24℃〜30℃
付近と思われる。 (2) ゼラチンの液化 （15％単純ゼラチン、20℃培養及びグルコ
ース・ペプトン・ゼラチン、27℃培養） いずれの場合も、培養後６日目ごろから液
化が始まり、その作用は中程度である。 (3) スターチの加水分解 （スターチ無機塩寒天培地及びスターチ寒
天培地いずれも27℃培養） いずれの場合も、培養後６日目ごろから水
解性がみとめられ、その作用は中程度から強
い方である。 (4) 脱脂牛乳の凝固・ペプトン化（脱脂牛乳、
37℃培養） 培養後５日目頃から凝固が始まり、７日目
で完了と同時にペプトン化が始まる。ペプト
ン化は14日目で完了した。その作用は中程度
から強い方である。 (5) メラニン様色素の生成（トリプトン・イー
スト・ブロス、ISP−培地１；ペプトン・イ
ースト・鉄寒天、ISP−培地６；チロシン寒
天、ISP−培地７、いずれも27℃培養） トリプトン・イースト・ブロス及びチロシ
ン寒天培地ではメラニン様色素の生成がみと
められる。ペプトン・イースト、鉄寒天培地
ではこの菌株は生育しないが、この培地成分
の一つであるクエン酸鉄アンモニウムを除い
た培地には生育し、メラニン様色素の生成が
みとめられた。 (6) 炭素源の利用性（プリドハム・ゴトリーブ
寒天培地、ISP−培地９、27℃培養） グルコースを利用して発育し、Ｌ−アラビ
ノ−ス、Ｄ−キシロース、Ｄ−フルクトー
ス、シユクロース、イノシトール、Ｌ−ラム
ノース、ラフイノース、Ｄ−マンニトールは
利用しない。 (7) リンゴ酸石灰の溶解（リンゴ酸石灰寒天、
27℃培養） 培養後６日目ごろから発育周辺のリンゴ酸
石灰を溶解し、その作用は中程度〜強い方で
ある。 (8) 硝酸塩の還元反応（1.0％硝酸カリ含有ペ
プトン水、ISP−培地８、27℃培養） 陰性である。 以上の性状を要約するとMG7−G1株はストレ
プトミセス属に属し、気菌糸は輪生枝、螺旋形成
ともにみられず、胞子の表面は平滑である。 種々の培地上でうす黄〜うす黄茶〜黄茶の発育
上に灰白〜明るい灰〜茶灰の気菌糸を着生し、溶
解性色素はわずかに茶色を呈する程度である。メ
ラニン様色素は陽性、蛋白分解力は中程度、スタ
ーチの水解性は中程度から強い方である。 これらの性状より既知菌種を検索するとストレ
プトミセス・アブラビエンシス〔Streptomyces
aburaviensis：文献1Nishimura、H.et al.、
Journal of Antibiotics、Ser.A、10巻、205頁、
1957年：2Bergey´s Manual of Determinative
Bacteriology、8th Edition、761頁：
3International Journal of Systematic
Bacteriology、18巻、No.４、284頁、1968年：
4The Actinomycetes2巻、166頁〕がもつとも近
縁の種としてあげられる。 次に実際にこの菌株を入手し、MG7−G1株と
比較検討した結果は次の通りである。 【表】 ＋
＊；IJSB(International Journal of
Systematic Bacteriology)の記載では＋、
表にみられるように、MG7−G1株とストレプ
トミセス・アブラビエンシスISP5033株とは、次
の点で異なつている。(1)ISP−培地１及び７にお
けるメラニン様色素生産性において前者は陽性で
あるのに後者は陰性である。(2)ISP−培地６に前
者は生育しないが培地成分のクエン酸鉄アンモニ
ウムを除けば生育し、メラニン様色素を生産す
る。一方、後者はISP−培地６に生育し、メラニ
ン様色素は生産しない。 MG7−G1株は上記の点においてストレプトミ
セス・アブラビエンシスISP5033株と異なつた性
状を示すが、その他の点では一致した成績を示
し、両者は極めて近縁の種と考えられる。なおス
トレプトミセスMG7−G1株は工業技術院微生物
工業技術研究所に、昭和55年１月18日付で保管委
託申請し、その微生物受託番号は微工研菌寄第
5363号（FERM−Ｐ No.5363）である。 本物質生産菌を培養するに用いる栄養源として
は、放線菌の栄養源として公知のものを適宜使用
することができる。例えば市販されているグリセ
リン、グルコース、ラクトース、シユクロース、
デンプン、マルトース、糖蜜などの炭水化物、脂
肪、マロン酸及びマレイン酸等の低級脂肪酸の塩
等を炭素源として、市販されているペプトン、肉
エキス、綿実粉（フアルマメデイア）、落花生粉、
大豆粉、酵母エキス、Ｎ−Ｚアミン、カゼイン、
Ｌ−アスパラギン、魚粉、硝酸ソーダ、硝酸アン
モニウム、硫酸アンモニウムなどを窒素源とし
て、食塩、燐酸塩、炭酸カルシウム、硫酸マグネ
シウムなどを無機の栄養源としてそれぞれ使用で
きる。その他必要に応じて微量の金属塩を添加す
る。これらのものは本物質生産菌が利用し、また
本物質の生産を妨害しないものであればよい。公
知の放線菌の培養材料はすべて使用できる。特に
好ましい培地成分としては、炭素源としてグリセ
リンン、窒素源として魚粉などがある。グリセリ
ン3.0％、魚粉2.0％、炭酸カルシウム0.2％を含む
組成の培地を用いるのが好ましい。 本物質の大量生産には液体培養が好ましい。培
養温度としては本物質生産菌が発育し、本物質を
生産する範囲の温度を適用し得るが、特に好まし
い培養温度は27℃である。培養は普通は本物質が
培養物中に生産され、充分に蓄積するまで継続さ
れる。例えば、グリセリン3.0％、魚粉2.0％、炭
酸カルシウム0.2％を含む培地を滅菌したのち、
これに本物質生産菌の斜面培養から胞子及び菌糸
を接種し、27℃で好気的に振盪培養を行なつたと
ころ、培養１日目から３日目に本物質の蓄積が認
められた。 本物質の培養ならびに精製工程での追跡は、次
の方法による抗エステラーゼ活性ならびに抗ホル
ミルメチオニンアミノペプチダーゼ活性の測定に
基づいて行なつた。 まず抗エステラーゼ活性の測定はC.
HUGGINS and J.LAPIDES、J.Biol.Chem.、
170、467（1947）記載の方法の改良法を使用した。
即ち米国シグマ社より市販されているブタの肝臓
より得たエステラーゼを水で1000倍に希釈し、こ
の酵素溶液を0.025ml、0.06％トライトン
（Triton）Ｘ−100含有0.1M燐酸緩衝液（PH7.0）
１ml、および定量されるべき検体を含む溶液0.95
mlを混合した溶液（1.975ml）に40mMのパラ−
ニトロフエニルアセテートのメタノール溶液
0.025mlを加えることにより反応を開始させる。
室温で20分間反応させた後、反応液の400nｍに
おける吸光度(a)を測定した。同時に本物質を含ま
ない緩衝液のみを用いた盲検の吸光度(b)を測定し
た。エステラーゼ阻害率は式〔（ｂ−ａ）／ｂ〕×
100により計算した。この定量法で0.056μｇ／ml
のエベラクトンＡ及び0.00035μｇ／mlのエベラク
トンＢはエステラーゼ活性を50％阻害（IC50）し
た。 次に、ホルミルメチオニンアミノペプチダーゼ
に対する阻害活性は以下の方法で測定された。基
質としてのＮ−ホルミルメチオニンβ−ナフチル
アミドは５％（Ｗ／Ｖ）トウイーン（Tween）
20を含むメタノールに溶かし、20mM溶液を用い
た。ホルミル−メチオニンアミノペプチダーゼは
ラツトの肝臓より調製した。基質溶液0.005ml、
0.1Mtris−塩酸緩衝液（PH7.8）および水または
検体を含む溶液を加え、全量を0.95mlとする。こ
の反応に基質溶液0.05mlを加え、37℃で25分間反
応したのちフアスト ガーネツト（Fast
Garnet）GBC（米国シグマ社製、10％トウイーン
20を含む1M酸酸緩衝液（PH4.2）に溶かし、濃度
１mg／mlの溶液としたもの）１mlを加え反応を止
める。室温に15分間放置したのち、525nｍの吸
光度を測定する。検体の阻害活性は前述のエステ
ラーゼの阻害活性測定法に準じて算出することが
できる。ホルミルメチオニンアミノペプチダーゼ
に対する50％阻害濃度はエベラクトンＡが0.08μ
ｇ／ml、またエベラクトンＢが0.02μｇ／mlであ
る。 本物質はタンク培養法でも振盪培養法と同様に
よく生産される。例えば2000の醗酵槽に1000
の培地を入れて滅菌し、毎分800の無菌空気を
通気し、毎分240回転で撹拌した。この条件で本
物質の生産は37時間で最高に達した。本物質は生
産菌の培養液中及び菌体中に存在する。培養液及
び菌体中の本物質は培養終了後の培養液に同量の
酢酸ブチル・ブタノール等の水と混和しない有機
溶媒を加え、数時間撹拌することにより有機溶剤
中に抽出される。又、本物質は培養液からブタ
ノール・酢酸ブチル等の水と混和しない有機溶剤
で、又菌体からはメタノール、エタノール等の有
機溶剤で抽出することもできる。本物質はこれを
含む溶液から吸着剤に吸着および脱離することに
より好収率に採取することができる。吸着剤とし
ては活性炭、アンバーライトXAD等の有機吸着
剤、アルミナ、シリカゲル、フロリジル等の無機
性吸着剤が使用できる。例えば本物質はシリカゲ
ルで吸着され、ｎ−ヘキサン、クロロホルムの混
合溶液で溶出される。 又、シリカゲルの表面にシランを結合させた逆
相用シリカゲルを用いるクロマトグラフイーが特
に有効であり、メタノール−水の混合溶媒で溶出
させることにより、エベラクトンＡとＢを相互に
分離することができる。例えば培養液を有機溶
剤、例えば酢酸ブチルで抽出して得た油状物質を
シリカゲルクロマトグラフイーにかけて精製した
後、さらにシリカゲルクロマトグラフイーにか
け、適当な溶媒系を用いて溶出し、エベラクトン
Ａを含有するフラクシヨンとエベラクトンＢを含
むフラクシヨンを採取し、それからエベラクトン
ＡとＢをそれぞれ単離する。 本物質の最終的な精製は結晶化によつて行なう
ことができる。エベラクトンＡ、Ｂ共に良好なる
結晶性を有するので、メタノール−水の系から針
状結晶として析出させることができる。 このようにして得られるエベラクトンについて
その薬理作用の検討を行なつた。その結果、本物
質が細胞性免疫に対する増強効果と抗炎症作用を
有していることが見出された。それらについて以
下説明する。 細胞性免疫増強効果について 試験方法： 細胞性免疫に対する本物質の作用は羊赤血球を
抗原に用い、これをマウス足蹠に接種して得られ
る遅延型過敏反応（D.T.H）を指標〔P.H.
Lagrange、G.B.Mackaness and T.E.Mille：J.
Expt.Med.、159、1529−1539（1974）〕として本
物質の効果を検討した。 即ち羊赤血球108個を0.05mlの生理的食塩水に
浮遊させ、CDF1雌性８週令ウスの後肢足蹠に皮
下注射して免疫を施し、同時に本物質を50mg／
Kg、12.5mg／Kg、3.125mg／Kg、0.781mg／Kgの各
用量で腹腔内注射した。また本物質0.5mg／Kgを
経口投与した。４日後、各マウスの他の一方の後
肢足蹠に羊赤血球108個を皮下注射して24時間後、
その足蹠にみられる腫張の程度（足蹠の厚さ）を
ノギスで測定することにより判定した。 結果： 試験の結果は表１に示す通りである。 【表】 【表】 本物質0.781〜50mg／Kgの腹腔注射あるいは0.5
mg／Kgの経口投与はD.T.Hに対し顕著な増強作用
のあることが認められた。 抗炎症作用について 方法： エベラクトンと対照薬エステラスチンとを経口
投与、腹腔内投与の二方法で投与し、カラゲニン
足浮腫に対する抑制効果を検討した（使用動物：
ウイスター系雄性ラツト、体重140〜150ｇ）。試
料はエタノールを約0.5c.c.、トウイーン（Tween）
80を１滴加えた後、アラビアゴム溶液にて各用量
に懸濁した。このようにして調製した試料を投与
後１時間後に、ラツト足蹠に１％カラゲニンを皮
下注射し、炎症を生ぜしめた。起炎後３時間と５
時間の２回にわたつてラツト足容積を測定した。 結果： 次の表２、３に示す通りである。 【表】 【表】 まず経口投与では、エベラクトンＢの場合、10
mg／Kgで３時間、５時間共：50mg／Kgで３時間：
100mg／Kgで５時間後の値に、コントロール群の
浮腫強度に対して有意な減少がみられる。 次に腹腔内投与であるが、エベラクトンＢにつ
いては５mg／Kgの５時間後、10mg／Kgの３時間後
の値を除いて、すべての試料がコントロール群の
浮腫強度に対して有意な減少を示した。 さらにエベラクトンＡについても同様の傾向が
認められた。 本物質は100μｇ／mlの濃度で組織培養細胞に
毒性を示さない。マウスに対する急性毒性は250
mg／Kg（i.p.）で全く毒性が認められない。 以上の結果、本物質は極めて安全に用いられ、
少なくとも細胞性免疫増強物質として有用であ
る。従つて、第３の本発明の要旨は、エベラクト
ンを有効成分として含有することを特徴とする免
疫増強剤である。 次に本発明のエベラクトンの製造に関して実施
例を示すが、本物質の理化学的性状ならびに生産
方法、その抽出精製法が本発明者らによつて明ら
かにされたので、本明細書に示された方法を修飾
することは容易であり、本発明は以下に記載する
実施例のみに限定されるものではない。 実施例 １ 本物質生産菌としてストレプトミセス・アブラ
ビエンシスに近縁のMG7−G1株（微工研菌寄第
5363号）の斜面培養から一白金耳量をとり、あら
かじめ120℃、20分間の条件で滅菌した500ml容量
のロータリーフラスコに110mlずつ分注したグリ
セリン3.0％、魚粉2.0％、炭酸カルシウム0.2％か
ら成る組成を有する培地に接種した。27℃におい
て毎分180回転の培養条件を用い、経時的に産生
量を検討したところ、培養２日目に産生量はピー
クに達した。培養３日目から阻害物質の濃度は
徐々に減少した。培養中の培地のPH変化は１日目
7.0、２日目6.6、３日目7.3、４日目7.8、５日目
8.2であつた。 実施例 ２ 実施例１と同様の培地と培養条件で、ストレプ
トミセス・アブラビエンシスに近縁なMG7−G1
株を培養して得られた培養液2.5に酢酸ブチル
2.5を加え、室温で２時間撹拌した。次に過
助剤（ハイフロスーパーセル）を加えて過を行
ない、得られた液を酢酸ブチル層と水層とに分
け、酢酸ブチル層を減圧下で濃縮し、本物質を含
む油状物質4.36ｇを得た。 実施例 ３ 実施例２において得られた本物質を含む油状物
質4.36ｇをシリカゲルカラム（ワコーゲルＣ−
200、2.5×35cm）にかけ、ｎ−ヘキサン−クロロ
ホルム−酢酸エチル（５：５：１容比）の混合溶
剤で溶出し、10ｇずつのフラクシヨンに分画して
とると、フラクシヨン41番から137番に活性物質
の存在が認められた。この活性分画を減圧濃縮乾
固することにより淡黄色の油状物質434mgが得ら
れた。 実施例 ４ 実施例３において得られた油状物質434mgを逆
相シリカゲルカラム（西独メルク社製、silicagel
60 silanized、1.2×47cm）にかけ、メタノール−
水（１：１容比）の混液で溶出し、10mlずつのフ
ラクシヨンに分画した。フラクシヨン38番から53
番にエベラクトンＡが、65番から81番にエベラク
トンＢが得られ、それぞれを減圧下で濃縮するこ
とにより、エベラクトンA20mg、エベラクトン
B10mgの白色粉末が得られた。これらはいずれも
ｎ−ヘキサン−クロロホルム−酢酸エチル（５：
５：１容比）の混合溶媒系を用いるシリカゲル薄
層クロマトグラフイーで単一スポツトを与えた。 実施例 ５ グルコース3.0％、魚粉2.0％、炭酸カルシウム
0.2％、消泡剤（アデカノール）0.01％から成る
培地1000を2000のステンレス製タンクに仕込
み、120℃、30分間滅菌後、ストレプトミセス・
アブラビエンシスに近縁のMG7−G1株（微工研
菌寄第5363号）の種培養液（通気撹拌培養２日）
50を植菌し、撹拌は毎分240回転、通気量は毎
分800で28℃、43時間培養を行なつた。この培
養液に酢酸ブチル350を加え、４時間撹拌した。
傾斜過及び過助剤（ハイフロスーパーセル）
を用いたバスケツト型遠心器による過により、
菌体を除き、酢酸ブチル層を分離し、減圧下で濃
縮して濃縮液1.9を得た。 実施例 ６ 実施例５において得られた本物質を含む濃縮液
1.9をシリカゲルカラム（ワコーゲルＣ−100、
10×60cm）にかけ、ｎ−ヘキサン７で洗つてか
らｎ−ヘキサン−クロロホルム（１：１容比）
4.5、ついでｎ−ヘキサン−クロロホルム−酢
酸エチル（５：５：１容比）10で溶出した。50
mlずつのフラクシヨンに分画したところ、フラク
シヨン81番から200番に活性が認められた。この
活性分画を濃縮したところ、150.9ｇの油状物質
が得られた。 実施例 ７ 実施例６において得られた本物質を含む濃縮液
71.6ｇを逆相用シリカゲルカラム（西独、メルク
社製、Silicagel 60、Silanized、5.5×17.5cm）に
かけ、メタノール−水（１：１容比）の混液で溶
出し、20mlずつのフラクシヨンに分画した。 薄層クロマトグラフイーで検定したところ、フ
ラクシヨン105番から147番は主としてエベラクト
ンＡを含み、エベラクトンＢは検出されなかつ
た。フラクシヨン148番から270番はエベラクトン
Ａ、Ｂ共に検出された。フラクシヨン271番から
443番は主としてエベラクトンＢを含み、エベラ
クトンＡは検出されなかつた。フラクシヨン105
番から147番、148番から270番、271番から443番
をそれぞれ集めて減圧下で濃縮し、それぞれから
392mg、974mg、518mgの黄色粉末を得た。 実施例 ８ 実施例７において得られたエベラクトンＡを主
として含む粉末392mgをシリカゲルカラム（ワコ
ーゲルＣ−300、1.3×48cm）にかけ、ｎ−ヘキサ
ン−クロロホルム（３：１容比）の混合溶媒で溶
出し、５ｇずつのフラクシヨンに分画した。フラ
クシヨン101番から130番を減圧下に濃縮し、薄層
クロマトグラフイーで単一スポツトを与えるエベ
ラクトンＡの無色粉末175mgを得た。これを少量
のメタノールに溶かし、水を加えていくとエベラ
クトンＡの一次針状結晶128mgが得られた。 実施例 ９ 実施例７において得られたエベラクトンＢを主
として含む粉末518mgをシリカゲルカラム（ワコ
ーゲルＣ−300、1.3×50cm）にかけ、ｎ−ヘキサ
ン−クロロホルム（３：１容比）の混合溶媒で溶
出し、10ｇずつのフラクシヨンに分画した。フラ
クシヨン49番から58番までを減圧下に濃縮し、薄
層クロマトグラフイーで単一スポツトを与えるエ
ベラクトンＢの無色粉末219mgを得た。これを少
量のメタノールに溶かし、水を加えていくとエベ
ラクトンＢの一次針状結晶129mgが得られた。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １ 次の一般式： （式中、ＲはCH3−又はCH3−CH2−を示す）で
表わされる抗エステラーゼならびに抗ホルミルメ
チオニンアミノペプチダーゼ活性を有する新生理
活性物質エベラクトン。 ２ ストレプトミセス属に属するエベラクトン生
産菌を培養してエベラクトンを培養液中に生産、
蓄積させ、それよりエベラクトンを採取すること
を特徴とする新生理活性物質エベラクトンの製造
方法。 ３ ストレプトミセス属に属するエベラクトン生
産菌株ストレプトミセスMG7−G1株（微工研菌
寄第5363号）を使用する特許請求の範囲第２項に
記載の製造方法。 ４ 新生理活性物質エベラクトンを有効成分とし
て含有することを特徴とする免疫増強剤。
Priority Applications (6)
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|---|---|---|---|
| JP3151480A JPS56128774A (en) | 1980-03-14 | 1980-03-14 | New physiologically active substance ebelactone and its preparation |
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| JP3151480A JPS56128774A (en) | 1980-03-14 | 1980-03-14 | New physiologically active substance ebelactone and its preparation |
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