JPH07322879A - 新規ｄｎａ断片 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】 コリネ型細菌由来のＤＮＡの修復・組換え・
複製に関与する遺伝子を含むＤＮＡ断片の提供。 【構成】 コリネ型細菌由来のＲｅｃＡ蛋白質をコード
する遺伝子を含む、ＤＮＡ断片。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、コリネ型細菌由来のＤ
ＮＡの修復・組換え・複製に関与する遺伝子を含むＤＮ
Ａ断片に関し、さらに詳しくはＤＮＡの修復・組換え・
複製に関与する主要な蛋白質の１つであるＲｅｃＡ蛋白
質をコードする遺伝子（以下これを「ｒｅｃＡ遺伝子」
と称することがある）を含むＤＮＡ断片に関する。

【０００２】ｒｅｃＡ遺伝子は、染色体あるいはプラス
ミドＤＮＡの修復・組換え・複製の過程に関与する重要
な遺伝子の一つであり〔アニュアル・レヴュー・オブ・
ジェネティクス（Annual Review of Genetics)、１６、
４２５〜４３６（１９８２）参照〕、該遺伝子機能を解
析することにより、染色体あるいはプラスミドＤＮＡの
修復・組換え・複製の機構を解明することができる。ま
た、ｒｅｃＡ遺伝子を破壊することにより、プラスミド
の染色体上への組込みを抑制することができ、プラスミ
ドの安定性等を向上させることができる。

【０００３】

【従来の技術】染色体ＤＮＡの修復・組換え・複製に関
与する遺伝子は、エシェリヒア・コリ（Escherichia c
oli ）においてよく研究されており〔マイクロバイオロ
ジカル・レヴュー（Microbiological Review）、４８、
６０〜９３（１９８４）；モレキュラー・マイクロバイ
オロジー（Molecular Microbiology）、５、１２９５〜
１２９９（１９９１）等参照〕、様々な遺伝子が知られ
ている。その中で、ＤＮＡの修復・組換え・複製の過程
に関与する特に重要な遺伝子としてｒｅｃＡ遺伝子が知
られている。

【０００４】ｒｅｃＡ遺伝子はエシェリヒア・コリ（Es
cherichia coli）由来の遺伝子〔プロシーディング・オ
ブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス（Proc
eeding of National Academy of Science ）、７７、２
６１１〜２６１５（１９８０）参照〕、バチルス・サチ
ルス（Bacillus subtilis ）由来の遺伝子〔ヌクレイッ
ク・アシッド・リサーチ（Nucleic Acids Research）、
１８、４２４９（１９９０）参照〕等が単離されてい
る。しかしながら、産業上重要な細菌であるコリネ型細
菌由来のｒｅｃＡ遺伝子については、本発明者等の知る
限り従来の報告例はない。

【０００５】

【発明が解決しようとする課題】ＤＮＡの修復・組換え
・複製に関与する遺伝子の応用の１つとして、例えば、
組換え機構解析、あるいは、組換え能欠損株作製によ
る、プラスミドの染色体上への組込み抑制等が考えられ
る。ところが、コリネ型細菌由来のＤＮＡの修復・組換
え・複製に関与する遺伝子についての知見はなく、工業
的な組換菌への応用例はなかった。

【０００６】本発明は、コリネ型細菌由来の上記ＤＮＡ
を修飾・組換え・複製に関与する遺伝子の提供を目的と
してなされたものである。

【０００７】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記課題
を解決すべく、鋭意研究を重ねた結果、このＤＮＡの修
復・組換え・複製に関与する遺伝子の１つであるｒｅｃ
Ａ遺伝子を含むＤＮＡ断片がある種のコリネ型細菌から
単離可能であることを見い出し、本発明を完成するに至
った。

【０００８】かくして本発明によれば、コリネ型細菌由
来のＲｅｃＡ蛋白質をコードする遺伝子（ｒｅｃＡ遺伝
子）を含むＤＮＡ断片、が提供される。以下、本発明に
ついてさらに詳細に説明する。本発明の「ＲｅｃＡ蛋白
質をコードする遺伝子（ｒｅｃＡ遺伝子）」は、ＤＮＡ
の修復・組換え・複製に関与する遺伝子の１つであり、
遺伝子修復経路のＳＯＳ誘導を開始させるプロテアーゼ
活性を有し、染色体あるいはプラスミドの組換え修復に
必要なＤＮＡ鎖交換反応を行う蛋白質をコードする遺伝
子を意味するものである。

【０００９】ｒｅｃＡ遺伝子を含むＤＮＡ断片（以下、
これを「Ａ断片」と略称することがある）は、その塩基
配列が決定された後においては合成することも可能であ
るが、通常は微生物からクローニングされ、その供給源
となる微生物として、コリネ型細菌、例えば、ブレビバ
クテリウム・フラバム（Brevibacterium flavum ) ＭＪ
−２３３（ＦＥＲＭ ＢＰ−１４９８）、ブレビバクテ
リウム・アンモニアゲネス（Brevibacterium ammoniage
nes ）、ＡＴＣＣ６８７１、同ＡＴＣＣ１３７４５、同
ＡＴＣＣ１３７４６、ブレビバクテリウム・デバリカタ
ム（Brevibacterium devaricatum）ＡＴＣＣ１４０２
０、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム（Brev
ibacterium lactofermentum ）ＡＴＣＣ１３８６９、コ
リネバクテリウム・グルタミカム（Corynebacterium gl
utamicum）ＡＴＣＣ３１８３１等を用いることができ
る。

【００１０】これらの供給源微生物からＡ断片を調製す
るための基本操作の一例を述べれば次のとおりである。
Ａ断片は、上記コリネ型細菌、例えば、ブレビバクテリ
ウム・フラバム（Brevibacterium flavum ）ＭＪ−２３
３（ＦＥＲＭ ＢＰ−１４９７）株の染色体上に存在
し、この染色体の中から、以下に述べる方法で分離・取
得することができる。

【００１１】先ず、ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ
−２３３株の培養物から染色体ＤＮＡをそれ自体既知の
通常用いられる斉藤・三浦の方法〔バイオケミカ・バイ
オフィジカ・アクタ（Biochemica et Biophysica Acta
）７２、６１９〜６２９（１９６３）〕等で抽出す
る。この染色体を鋳型として、エシェリヒア・コリ及び
枯草菌由来ｒｅｃＡ遺伝子の共通領域配列をプライマー
として用いるＰＣＲ〔Polymerase Chain Reaction；Mi
chael A.Innis 、ＰＣＲ・プロトコールズ（PCR Protoc
ols ) (1990) Academic Press Inc.〕で該遺伝子断片を
増幅する。

【００１２】ＰＣＲとは、ＤＮＡポリメラーゼがプライ
マーを必要とすることを利用した特定ＤＮＡ断片の増幅
法である。その原理は、共通領域の塩基配列部に設定し
た２つのプライマー（オリゴヌクレオチド）と４つのデ
オキシヌクレオチド三りん酸〔dNTPS (dATP 、dCTP、dG
TP、dTTP〕を用い、二本鎖ＤＮＡの一鎖を鋳型として、
ＤＮＡポリメラーゼにより、２つのプライマーで挟まれ
た部分の二本鎖が合成されるというものである。実際の
方法は、各至適温度および時間の条件下で熱変性による
ＤＮＡの一本鎖化（デナチュレーション）、プライマー
の鋳型ＤＮＡへのアニーリング、ＤＮＡポリメラーゼに
よる相補鎖ＤＮＡの合成（エクステンション）を１サイ
クルとして、これを必要回数繰り返し特定のＤＮＡ断片
を増幅する。

【００１３】実際本発明においては、エシェリヒア・コ
リ及び枯草菌由来ｒｅｃＡ遺伝子の共通領域配列の中か
ら１８〜２７ｍｅｒ、好ましくは２０〜２３ｍｅｒの塩
基配列を選択しプライマーを合成する。プライマーは、
例えば、アプライト・バイオシステムズ（Applied Bios
ystems）社製３９４ DNA/RNA シンセサイザー(Synthes
izer）を用いて合成することができる。

【００１４】ＰＣＲにおけるプライマーの量は反応当た
り、０．０５〜０．５μＭ、好ましくは０．１０〜０．
３０μＭを用いる。ＰＣＲの条件は、デナチュレーショ
ン工程が９４℃で３０〜６０秒、好ましくは６０秒、ア
ニーリング工程が５５℃で６０〜１８０秒、好ましくは
５５℃で９０〜１５０秒、エクステンション工程は７２
℃で６０〜１８０秒、好ましくは７２℃で９０〜１２０
秒であり、これらの工程を１サイクルとして、２０〜４
０サイクル、好ましくは３０サイクル行う。

【００１５】かくして、大きさが約０．３ｋｂのｒｅｃ
Ａ遺伝子部分ＤＮＡ断片を増幅することができる。増幅
ＤＮＡ断片は、アガロースゲル電気泳動を用いて検出す
ることができる。また、増幅ＤＮＡ断片、制限酵素切断
ＤＮＡ断片等の各ＤＮＡ断片の大きさは、分子量マーカ
ーＤＮＡ断片との同一アガロースゲル上での泳動距離で
描かれる標準線に基づき、算出することができる。な
お、本発明における各ＤＮＡ断片の大きさの決定におい
て、１ｋｂ以上の断片の大きさについてはλ−Ｈｉｎｄ
ＩＩＩ ｄｉｇｅｓｔ（宝酒造製）をマーカーに用いて
１％アガロースゲル電気泳動によって得られる結果を採
用し、約０．１ｋｂから１ｋｂ未満の断片の大きさにつ
いてはｐＨＹ Ｍａｒｋｅｒ（宝酒造製）を用いて１〜
４％アガロースゲル電気泳動によって得られる結果を採
用した。

【００１６】一方、上記のブレビバクテリウム・フラバ
ムＭＪ−２３３の染色体ＤＮＡをＰＣＲで増幅すること
により得られる大きさが約０．３ｋｂのｒｅｃＡ遺伝子
部分ＤＮＡ断片については、その塩基配列をプラスミド
ｐＧＥＭ−Ｔベクター（PROMEGA 製）を用いるジデオキ
シヌクレオチド酵素法(dideoxy chain termination法)
〔Sanger F. et al. 、プロシーディング・オブ・ナシ
ョナル・アカデミー・オブ・サイエンス（Proceeding o
f National Academy of Science ）、７４、５４６３
（１９７７）〕により決定することができる。

【００１７】このようにして決定した上記約０．３ｋｂ
のＤＮＡ断片の塩基配列について他種の微生物、例え
ば、エシェリヒア・コリ（Escherichia coli) 、バチル
ス・サチルス(Bacillus subtilis) 等の遺伝子のアミノ
酸配列との相同性から推定したアミノ酸配列は、後記配
列表の配列番号１に示す配列を有するものであり、１０
６個のアミノ酸をコードする３１８の塩基対から構成さ
れるｒｅｃＡ遺伝子の部分ＤＮＡ断片である。

【００１８】次に、このｒｅｃＡ遺伝子部分ＤＮＡ断片
をプローブとして用い、ブレビバクテリウム・フラバム
ＭＪ−２３３染色体由来のＤＮＡバンクからハイブリダ
イゼーション法によりｒｅｃＡ全遺伝子をスクリーニン
グすることができる。まず、ブレビバクテリウム・フラ
バムＭＪ−２３３の培養物から染色体ＤＮＡを抽出す
る。この染色体ＤＮＡを適当な制限酵素、例えば、Ｓａ
ｕ３ＡＩを用いて部分分解する。得られる様々な大きさ
（９〜２３ｋｂ）のＤＮＡ断片をラムダファージベクタ
ー、例えば、λＦｉｘＩＩ（東洋紡績製）に挿入し、ラ
イブラリーを作成する。このファージベクターを用いて
エシェリヒア・コリ、例えば、エシェリヒア・コリＰ２
３９２〔Ausubel et al.、ヌクレイック・アシッド・リ
サーチ (Nucleic Acids Reserch)、７、１５１３−１５
２３〕に感染させプラークを作らせた後、上記ｒｅｃＡ
遺伝子部分ＤＮＡ断片をプローブとして用いるプラーク
ハイブリダイゼーションを行う。上記ハイブリダイゼー
ションによりｒｅｃＡ遺伝子部分ＤＮＡ断片とハイブリ
ダイズしたファージＤＮＡを抽出し、挿入ＤＮＡ断片を
制限酵素ＳａｌＩで切り出すことで大きさが３．０ｋｂ
のＡ断片を取得することができる。

【００１９】このようにして得られるＡ断片の１つは、
上記ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ−２３３の染色
体ＤＮＡを制限酵素ＳａｌＩの完全分解により切断して
得られる大きさが約３．０ｋｂのＤＮＡ断片を挙げるこ
とができる。この約３．０ｋｂのｒｅｃＡ遺伝子を含む
ＤＮＡ断片を、各種の制限酵素で切断したときの認識部
位数および切断断片の大きさを下記第１表に示す。

【００２０】

【表１】 第１表 制限酵素 認識部位数 切断断片の大きさ（ｋｂ） ＢａｍＨＩ ３ １．２、１．１、０．５、０．２ ＥｃｏＲＩ ２ １．３、１．１、０．６ ＨｉｎｃＩＩＩ ３ １．８、０．８、０．３、０．１ ＨｉｎｄＩＩＩ １ １．９、１．１ ＫｐｎＩ ２ １．４、０．９、０．７

【００２１】上記Ａ断片の塩基配列は、例えば、ジオキ
シヌクレオチド酵素法（dideoxychain termination法）
〔Sanger、F. et al. 、プロシーディング・オブ・ナシ
ョナル・アカデミー・オブ・サイエンス（Proceeding o
f National Academy of Science ）、７４、５４６３
（１９７７）〕を用いて決定することができ、その塩基
配列中に存在するオープンリーディングフレームからｒ
ｅｃＡ遺伝子を確認することができる。上記約３．０ｋ
ｂのＤＮＡ断片中に存在が確認されたｒｅｃＡ遺伝子の
塩基配列を後記配列表の配列番号２に示す。

【００２２】上記の塩基配列を包含する本発明のｒｅｃ
Ａ遺伝子を含むＤＮＡ断片は、天然のコリネ型細菌染色
体ＤＮＡから分離されたもののみならず、通常用いられ
るＤＮＡ合成装置、例えば、アプライド・バイオシステ
ムズ(Applied Biosystems)社製３９４ＤＮＡ／ＲＮＡシ
ンセサイザーを用いて合成されたものであってもよい。

【００２３】また、前記の如くブレビバクテリウム・フ
ラバムＭＪ−２３３の染色体ＤＮＡから取得される本発
明のｒｅｃＡ遺伝子を含むＤＮＡ断片は、該遺伝子によ
り発現されるＲｅｃＡ蛋白質の機能を実質的に損なうこ
とがない限り、塩基配列の一部の塩基が他の塩基と置換
されていてもよく又は削除されていてもよく、或いは新
たに塩基が挿入されていてもよく、さらに塩基配列の一
部が転位されているものであってもよく、これらの誘導
体のいずれもが、本発明のｒｅｃＡ遺伝子を含むＤＮＡ
断片に包含されるものである。

【００２４】本発明のｒｅｃＡ遺伝子を含むＤＮＡ断片
の機能発現は、該遺伝子により発現されるＲｅｃＡ蛋白
質のＤＮＡ修復機能、相同組換え能等を検討することに
より確認することができる。ＲｅｃＡ蛋白質のＤＮＡ修
復機能を確認は、例えば、ＵＶ照射に対する耐性、メチ
ルメタンスルホン酸耐性を指標にして次のとおり行うこ
とができる。本発明のｒｅｃＡ遺伝子を含むＤＮＡ断
片、例えば大きさが約３．０ｋｂのＤＮＡ断片を、プラ
スミドベクター、例えばｐＭＷ１１８（ニッポンジーン
製）に組込んだ前記組換えプラスミドをｒｅｃＡ欠損株
であるエシェリヒア・コリＨＢ１０１（宝酒造製）に形
質転換させたものと、プラスミドベクターｐＭＷ１１８
（ニッポンジーン製）のみをエシェリヒア・コリＨＢ１
０１（宝酒造製）に形質転換させたものとを用いてＵＶ
照射を行う、又は、メチルメタンスルホン酸を含む培地
上で生育を行う。ｒｅｃＡ遺伝子を組込んだプラスミド
を含有する株ではｒｅｃＡ遺伝子欠損株より多数の生菌
が観察されることからＲｅｃＡ蛋白質のＤＮＡ修復機能
を確認することができる。

【００２５】ＲｅｃＡ蛋白質の相同組換え能の確認は、
例えば、カナマイシン耐性を指標にして行うことができ
る。ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ−２３３の野生
株と、同株のｒｅｃＡ遺伝子欠損株とに、同株染色体上
のある遺伝子の一部、例えば、アスパルターゼをコード
するａｓｐＡ遺伝子を、カナマイシン耐性ベクター、例
えば、ｐＨＳＧ２９８（宝酒造製）に組込んだプラスミ
ドを形質転換させる。野生株にはｒｅｃＡ遺伝子が存在
するのでプラスミド上のｒｅｃＡ遺伝子断片と染色体上
へ相同部位とで組換えがおこり、プラスミドが染色体上
に組込まれ、カナマイシン耐性を有するようになる。一
方、ｒｅｃＡ欠損株では、プラスミドの染色体上への組
込みは抑制されるのでカナマイシン耐性は殆ど有さな
い。この両株をカナマイシン（５０μｇ／ｍｌ）を含ん
だＡ培地上に塗布すると、野生株由来の形質転換株はコ
ロニーの生成がみられるが、ｒｅｃＡ欠損株由来の形質
転換株では殆ど生育がみられない。これによりＲｅｃＡ
蛋白質の相同組換え能を確認することができる。

【００２６】ｒｅｃＡ遺伝子欠損株は、以下のようにし
て得ることができる。まず、本発明のｒｅｃＡ遺伝子
（後期配列表 配列番号２に示す）の一部をＰＣＲで増
幅させるか、又は、適当な長さで切り出したものを、例
えば、クラムフェニコール耐性を有するベクターｐＨＳ
Ｇ３９８（宝酒造製）に組込み、ブレビバクテリウム・
フラバムＭＪ−２３３の野生株に形質転換させる。これ
をクラムフェニコール（３μｇ／ｍｌ）を含んだＡ培地
上に塗布する。これよりｒｅｃＡ遺伝子部分にプラスミ
ドが組込まれて、クラムフェニコール耐性となったｒｅ
ｃＡ遺伝子欠損株を選択することができる。

【００２７】

【実施例】以上に本発明を説明してきたが、下記の実施
例によりさらに具体的に説明する。実施例１ ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ−２３３
由来のＡ断片のクローン化 （Ａ）ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ−２３３の全
ＤＮＡの抽出 ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ−２３３（ＦＥＲＭ
ＢＰ−１４９８）菌体を、白金耳にて１０ｍｌの半合
成培地Ａ培地〔組成：尿素 ２ｇ、（ＮＨ₄ ） ₂ ＳＯ₄
７ｇ、Ｋ₂ ＨＰＯ₄ ０. ５ｇ、ＫＨ₂ ＰＯ₄ ０．５ｇ、
ＭｇＳＯ₄ ０．５ｇ、ＦｅＳＯ₄ ・７Ｈ₂ Ｏ ６ｍｇ、
ＭｎＳＯ₄ ・４〜６Ｈ₂ Ｏ ６ｍｇ、酵母エキス ２.
５ｇ、カザミノ酸 ５ｇ、ビオチン ２００μｇ、塩酸
チアミン２００μｇ、及び、グルコース ２０ｇを蒸留
水 １ｌに溶解した〕に植菌し、３０〜３３℃で１２〜
１６時間振とう培養（前培養）した。次にＡ培地１００
ｍｌに前培養液を２％植菌し、３１℃で１０〜１６時間
振とうして対数増殖期後期まで培養した。この培養液を
遠心分離（５，０００×ｇ、１０分間、１５〜２０℃）
し菌体を集めた。

【００２８】得られた菌体を１０ｍｇ／ｍｌの濃度にな
るよう、１０μｇ／ｍｌ リゾチーム、ＮａＣｌ−２０
ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ８．０）及び１ｍＭ ＥＤＴＡ
・２Ｎａを含む水溶液（各成分の濃度は最終濃度であ
る）に懸濁した。次にプロテナーゼＫを最終濃度が１０
０μｇ／ｍｌになるように添加し、３７℃で１時間保温
した。さらにドデシル硫酸ナトリウムを終濃度が０．５
％になるように添加し、５０℃で６時間保温して溶菌し
た。この溶菌液に、等量のフェノール／クロロホルム溶
液を添加し、室温で１０分間ゆるやかに振盪した後、全
量を遠心分離（３，８００×ｇ、１５分間、１５〜２０
℃）し、上清画分を分取した。この上清に酢酸ナトリウ
ムを０．３Ｍとなるよう添加した後、２倍量のエタノー
ルをゆっくりと加えた。水層とエタノール層の間に存在
するＤＮＡをガラス棒でまきとり、７０％エタノールで
洗浄した後、風乾した。得られたＤＮＡに１０ｍＭ ト
リス緩衝液（ｐＨ７．５）、１ｍＭ ＥＤＴＡ・２Ｎａ
を含む水溶液５ｍｌを加え、４℃で一晩静置し、鋳型Ｄ
ＮＡとしてＰＣＲに使用した。

【００２９】（Ｂ）プライマーの選択 ｒｅｃＡ遺伝子はエシェリヒア・コリ、枯草菌由来のも
のがよく研究されており、塩基配列が決定されている。
これら２種の微生物間で保存されている領域、特にＤＮ
Ａ塩基配列においても特に保存されている領域を検討
し、下記の１対のプライマーを選択し、アプライド・バ
イオシステムズ（Applied Biosystems）社製３９４ Ｄ
ＮＡ／ＲＮＡシンセサイザー（synthesizer ）を用いて
合成した。 （ａ−１）5'-TTY ATI GAI GCI GAR CAY GCI YT-3' （ｂ−１）5'-CCI CCI GTI GTI GTI TCI GG-3' （配列中、ＲはＡ又はＧ、ＹはＣ又はＴを示し、ここで
Ａはアデニン、Ｇはグアニン、Ｃはシトシン、Ｔはチミ
ン、Ｉはデオキシイノシンを示す。）

【００３０】（Ｃ）ＰＣＲ 実際のＰＣＲは、パーキンエルマーシータス社製のＤＮ
Ａサーマルサイクラーを用い、反応試薬としてレコンビ
ナント・タックＤＮＡ・ポリメラーゼ・タカラ・タック
（Recombinant TaqDNA Polymerase TaKaRa Taq）（宝酒
造製）を用いて下記の条件で行った。 反応液： （１０×）ＰＣＲ緩衝液 １０μｌ １．２５ｍＭ ｄＮＴＰ混合液 １６μｌ 鋳型ＤＮＡ ＭｇＣｌ₂ １０μｌ（DNA 含有量 １μＭ以下） 上記（Ｂ）で作成したプライマー 各々１μｌ（最終濃度０．２５μＭ） レコンビナント・タックＤＮＡ・ポリメラーゼ ０．５μｌ 滅菌蒸留水 ６２．５μｌ 以上を混合し、この１００μｌの反応液をＰＣＲにかけ
た。 ＰＣＲサイクル： デナチュレーション過程：９４℃ ６０秒 アニーリング過程 ：３７℃ １２０秒 エクステンション過程 ：７２℃ １８０秒 以上を１サイクルとし、３０サイクル行った。

【００３１】（Ｄ）反応物の検出 上記（Ｃ）で生成した反応液１０μｌを２％アガロース
ゲルにより電気泳動を行い、約０．３ｋｂのＤＮＡ断片
が検出できた。

【００３２】（Ｅ）増幅断片のクローン化 上記（Ｃ）項で得た反応液４μｌとＰＣＲ産物クローニ
ングベクターｐＧＥＭ−Ｔベクター（ＰＲＯＭＥＧＡ社
より市販）１μｌを混合し、Ｔ4 ＤＮＡリガーゼ １０
×）緩衝液 １μｌ、Ｔ4 ＤＮＡリガーゼ１ｕｎｉｔの
各成分を添加し、滅菌蒸留水で１０μｌにして、１５℃
で３時間反応させ、結合させた。得られたプラスミド混
液を用い、塩化カルシウム法〔Journal of MolecularBi
ology、５３、１５９（１９７０）〕によりエシェリヒ
ア・コリＪＭ１０９（宝酒造製）を形質転換し、アンピ
シリン ５０ｍｇを含む培地〔トリプトン １０ｇ、イ
ーストエキストラクト ５ｇ、ＮａＣｌ ５ｇ及び寒天
１６ｇを蒸留水１１に溶解〕に塗抹した。

【００３３】この培地上の生育株を常法により液体培養
し、培養液よりプラスミドＤＮＡを抽出し、該プラスミ
ドを制限酵素により切断し、挿入断片を確認した。この
結果、プラスミドｐＧＥＭ−Ｔの長さ３．０ｋｂのＤＮ
Ａ断片に加え、長さ約０．３ｋｂの挿入ＤＮＡ断片が認
められた。

【００３４】実施例２ 増幅断片の塩基配列の決定 実施例１の（Ｅ）項で得られた大きさが約０．３ｋｂの
増幅断片について、その塩基配列をジデオキシヌクレオ
チド酵素法（dideoxychain termination法）〔Sanger、
F.et al.、プロシーディング・オブ・ナショナル・アカ
デミー・オブ・サイエンス（Proceeding of National A
cademy of Science ）、７４、５４６３（１９７７）〕
により決定した。塩基配列決定の結果、該挿入断片は大
腸菌、枯草菌由来のｒｅｃＡ遺伝子の一部（ＰＣＲに使
用したプライマーによって挟まれる領域）と高いホモロ
ジーを示し、ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ−２３
３由来のｒｅｃＡ遺伝子の一部をクローニングしたこと
を確認した。

【００３５】実施例３ ブレビバクテリウム・フラバム
ＭＪ−２３３由来のｒｅｃＡ遺伝子を含むＤＮＡ断片の
クローン化 上記実施例１（Ａ）項で得たブレビバクテリウム・フラ
バム ＭＪ−２３３の全ＤＮＡ溶液の９０μｌを、制限
酵素Ｓａｕ３ＡＩ ５ｕｎｉｔｓを用い、３７℃で１０
分間反応させ部分分解した。この分解ＤＮＡとλＦｉｘ
ＩＩ／ＸｈｏＩ パーシャルフィル−イン・ベクター・
キット（Partial Fill-In Vector Kit)及び、クレノウ・
フラグメント（Klenow fragment ）（東洋紡績製）を用
いて、プロトコールに従いライブラリーを作成した。次
に、λＤＮＡライブラリーファージ溶液（２〜５×１０
⁴ ｐｆｕ; ＳＭ緩衝液希釈）とエシェリヒア・コリＰ２
３９２（東洋紡績製）の培養液を当量混合し３７℃で１
５分間保温した。これに５０℃にて保温しておいた３〜
４ｍｌのλ培地（トリプトン １０ｇ、イーストエクス
トラクト ５ｇ、ＮａＣｌ ５ｇ、ＭｇＳＯ₄ ・７Ｈ₂
Ｏ ２ｇ、及び、寒天 ５ｇを蒸留水１ｌに溶解）を加
えλプレート（トリプトン １０ｇ、ＮａＣｌ ５ｇ、
ＭｇＳＯ₄ ・７Ｈ₂ Ｏ ２ｇ、及び、寒天 １０ｇを蒸
留水１ｌに溶解）に均一に塗布し、３７℃で１２〜１６
時間培養した。

【００３６】この培地上に形成されたプラークをニトロ
セルロースフィルター上に吸着させ、順次５分間ずつ以
下イ）及びロ） イ）ＮａＯＨ ２０ｇ及びＮａＣｌ ８７．５ｇを蒸留
水に溶解し、１ｌとした溶液、 ロ）トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン１２１．
２ｇ及びＮａＣｌ ３０ｇを蒸留水に溶解し、６ＮのＨ
ＣｌでｐＨ７．０に調整して１ｌとした溶液、の試薬に
浸した濾紙上にフィルターをのせて処理した。風乾後、
８０℃にて２時間乾熱処理を行いＤＮＡを固定した。

【００３７】上記ＰＣＲ法で得たｒｅｃＡ部分断片をプ
ローブとし、上記で作成したフィルターでプラークハイ
ブリダイゼーションを行った。この時プローブは、ラン
ダムラベリングキット（宝酒造製）を用いて作製した。
プラークハイブリダイゼーションは、常法〔モレキュラ
ー・クローニング（Molecular Cloning ）、コールド・
スプリング・ハーバー・ラボラトリー（Cold Spring Ha
rbor Laboratory ）刊（1989) 〕の通り行った。この結
果、陽性のプラークを選択することができ、そこからフ
ァージＤＮＡを抽出して、制限酵素ＳａｌＩより切り出
される大きさが約３．０ｋｂの挿入断片を確認した。こ
れを、プラスミドｐＭＷ１１８のＳａｌＩ部位に挿入
し、ｒｅｃＡ遺伝子全領域の確認に用いた。この大きさ
が約３．０ｋｂのＤＮＡ断片を各種の制限酵素で切断し
たときの認識部位数および切断断片の大きさは前記表１
に示したとおりであった。その制限酵素切断点地図を図
１に示す。

【００３８】実施例４ ｒｅｃＡ遺伝子全領域の確認 実施例３で得られた大きさが約３．０ｋｂのＤＮＡ断片
上に存在するｒｅｃＡ遺伝子の存在部位を特定するため
に、下記の操作により塩基配列を決定した。大きさが約
３．０ｋｂのＤＮＡ断片溶液１４μｌを、制限酵素Ｓａ
ｕ３ＡＩ５ｕｎｉｔｓを用い、３７℃で１〜５分間反応
させ部分分解した。一方クローニングベクターｐＵＣ１
１８（宝酒造より市販）を制限酵素ＢａｍＨＩで切断
し、脱リン酸化処理をした。このベクターと先程の部分
分解ＤＮＡ断片とを混合し、５０ｍＭトリス緩衝液（ｐ
Ｈ７．６）、１０ｍＭジチオスレイトール、１ｍＭＡＴ
Ｐ、１０ｍＭ ＭｇＣｌ₂ およびＴ４ＤＮＡリガーゼ
１ｕｎｉｔ の各成分（各成分の濃度は最終濃度であ
る）を添加し、１６℃で１０時間反応させ結合させた。
上記と同様に大きさが約３．０ｋｂのＤＮＡ断片溶液１
４μｌを、制限酵素ＴａｑＩ ５０ｕｎｉｔｓを用い、
５〜８分間反応させ部分分解した。クローニングベクタ
ーｐＵＣ１１８は制限酵素ＡｃｃＩで切断し、脱リン酸
化処理を行い上記と同様にして部分分解ＤＮＡ断片と結
合させた。

【００３９】上記で得られたプラスミド混液を用い、塩
化カルシウム法〔ジャーナル・オブ・モレキュラー・バ
イオロジー(Journal of Molecular Biology ) 、５３、
１５９（１９７０）〕によりエシェリヒア・コリＪＭ１
０９（宝酒造製）を形質転換し、アンピシリン ５０μ
ｇ／ｍｌを含む培地〔トリプトン１０ｇ、イーストエキ
ストラクト ５ｇ、ＮａＣｌ ５ｇおよび寒天１６ｇを
蒸留水１ｌに溶解〕に塗末した。

【００４０】この培地上の生育株を常法により液体培養
し、培養液よりプラスミドＤＮＡを抽出して、その塩基
配列を、ｐＵＣ１１８（宝酒造製）を用いるジデオキシ
ヌクレオチド法（dideoxy chain terminator法）〔Sang
er F. et al ．、プロシーディング・オブ・ナショナル
・アカデミー・オブ・サイエンス（Proceeding of Nati
onal Academy of Science ）、７４、５４６３（１９７
７）〕により次のとおり決定した。

【００４１】上記培養液より抽出したプラスミドＤＮＡ
をカタリスト８００モレキュラー・バイオロジー・ラボ
ステーション；アプライド・バイオシステム社製（CATA
LYST800 Moleculer Biology Labostation；Applied Bio
systems社製）を用いてプロトコールに従い反応させ、
３７３Ａ ＤＮＡシーケンサー（Applied Biosystems社
製）により各々のプラスミドの挿入ＤＮＡ断片の塩基配
列を決定した。そしてこれら個々の配列の連結はシーケ
ンス解析ソフト インヘリット（INHERIT；Applied Bios
ystems社製）を用いて行い全塩基配列を決めた。

【００４２】その塩基配列中のオープンリーディングフ
レームの存在から、ｒｅｃＡ遺伝子ＤＮＡは後期配列表
の配列番号２に示す塩基配列を有する３３８個のアミノ
酸をコードする１０１７塩基対より構成されることが明
かとなった。図１に、大きさが約約３．０ｋｂの本発明
のＤＮＡ断片の制限酵素切断点と共に、塩基配列を決定
した上記各プラスミドの挿入ＤＮＡ断片の塩基配列の向
き及びＲｅｃＡ遺伝子ＤＮＡの位置を示す。

【００４３】

【発明の効果】本発明のｒｅｃＡ遺伝子を含むＤＮＡ断
片を組込んだ形質転換株は、微生物の遺伝子組換能が向
上することにより、例えば、外部から形質転換などを導
入した遺伝子との相同部位での組換え頻度が増し、育種
の効率化が図られる。また、本発明のｒｅｃＡ遺伝子を
含むＤＮＡ断片を用いて宿主の組換能を欠損させるか又
は微弱化させることにより、人為的に導入するプラスミ
ドの染色体上への組込みを抑制することができ、宿主内
でのプラスミドの安定化に寄与すると期待される。

【００４４】

【配列表】

配列番号 ：１ 配列の長さ：３１８ 配列の型 ：核酸 鎖の数 ：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Genomic DNA 起源 生物名：ブレビバクテリウム フラバム 株名 ：MJ-233 配列の特徴 特徴を表す記号：ＣＤＳ 存在位置 ：１−３１８ 特徴を決定した方法：Ｅ 配列 GAT CCA GAT TAT GCT CGC AAG CTT GGT GTA GAT ACT GAT GCG CTT CTG GTT TCG Asp Pro Asp Tyr Ala Arg Lys Leu Gly Val Asp Thr Asp Ala Leu Leu Val Ser 1 5 10 15 CAG CCA GAC ACT GGT GAG CAA GCA CTA GAA ATC GCC GAC ATG CTG GTT CGT TCC Gln Pro Asp Thr Gly Glu Gln Ala Leu Glu Ile Ala Asp Met Leu Val Arg Ser 20 25 30 35 GGC GCA ATC GAC ATC ATC GTG ATT GAC TCG GTG GCT GCG CTG ACA CCA AAG GCT Gly Ala Ile Asp Ile Ile Val Ile Asp Ser Val Ala Ala Leu Thr Pro Lys Ala 40 45 50 GAA ATT GAA GGC GAA ATG GGC GAT AGC CAC GTT GGT CTT CAG GCC CGC CTC ATG Glu Ile Glu Gly Glu Met Gly Asp Ser His Val Gly Leu Gln Ala Arg Leu Met 55 60 65 70 AGC CAG GCG CTT CGT AAG ATG ACA GGT GCG CTG TAC AAC TCG GGT ACC ACC GCG Ser Gln Ala Leu Arg Lys Met Thr Gly Ala Leu Tyr Asn Ser Gly Thr Thr Ala 75 80 85 90 ATC CTC ATT AAC CAG CTG CGT GAA AAG ATC GGT GTG ATG TTC GGT TCC Ile Leu Ile Asn Gln Leu Arg Glu Lys Ile Gly Val Met Phe Gly Ser 95 100 105

【００４５】配列番号 ：２ 配列の長さ：１０１７ 配列の型 ：核酸 鎖の数 ：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Genomic DNA 起源 生物名：ブレビバクテリウム フラバム 株名 ：MJ-233 配列の特徴 特徴を表す記号：ＣＤＳ 存在位置 ：１−１０１７ 特徴を決定した方法：Ｅ 配列 ATG CGT CTG GGT GAT GAG AAT CGT CCG CCA ATC CAG ACC ATC TCA 45 Met Arg Leu Gly Asp Glu Asn Arg Pro Pro Ile Gln Thr Ile Ser 1 5 10 15 TCT GGT AAC ACC GCG ATT GAT ATC GCC TTG GGT ATC GGT GGA TTC 90 Ser Gly Asn Thr Ala Ile Asp Ile Ala Leu Gly Ile Gly Gly Phe 20 25 30 CCA CGT GGT CGA ATC GTT GAG GTG TAT GGC CCA GAA TCA TCA GGT 135 Pro Arg Gly Arg Ile Val Glu Val Tyr Gly Pro Glu Ser Ser Gly 35 40 45 AAA ACC ACC GTT GCA CTG CAC GCT ATT GCG CAG GCA CAA AAG GCC 180 Lys Thr Thr Val Ala Leu His Ala Ile Ala Gln Ala Gln Lys Ala 50 55 60 GGC GGC ATC GCT GCA TTC ATT GAC GCC GAG CAC GCG TTG GAT CCA 225 Gly Gly Ile Ala Ala Phe Ile Asp Ala Glu His Ala Leu Asp Pro 65 70 75 GAT TAT GCT CGC AAG CTT GGT GTA GAT ACT GAT GCG CTT CTG GTT 270 Asp Tyr Ala Arg Lys Leu Gly Val Asp Thr Asp Ala Leu Leu Val 80 85 90 TCG CAG CCA GAC ACT GGT GAG CAA GCA CTA GAA ATC GCC GAC ATG 315 Ser Gln Pro Asp Thr Gly Glu Gln Ala Leu Glu Ile Ala Asp Met 95 100 105 CTG GTT CGT TCC GGC GCA ATC GAC ATC ATC GTG ATT GAC TCG GTG 360 Leu Val Arg Ser Gly Ala Ile Asp Ile Ile Val Ile Asp Ser Val 110 115 120 GCT GCG CTG ACA CCA AAG GCT GAA ATT GAA GGC GAA ATG GGC GAT 405 Ala Ala Leu Thr Pro Lys Ala Glu Ile Glu Gly Glu Met Gly Asp 125 130 135 AGC CAC GTT GGT CTT CAG GCC CGC CTC ATG AGC CAG GCG CTT CGT 450 Ser His Val Gly Leu Gln Ala Arg Leu Met Ser Gln Ala Leu Arg 140 145 150 AAG ATG ACA GGT GCG CTG TAC AAC TCG GGT ACC ACC GCG ATC TTC 495 Lys Met Thr Gly Ala Leu Tyr Asn Ser Gly Thr Thr Ala Ile Phe 155 160 165 ATT AAC CAG CTG CGT GAA AAG ATC GGT GTG ATG TTC GGT TCC CCA 540 Ile Asn Gln Leu Arg Glu Lys Ile Gly Val Met Phe Gly Ser Pro 170 175 180 GAA ACC ACC ACC GGT GGT AAG GCC CTG AAG TTC TAC GCA TCT GTT 585 Glu Thr Thr Thr Gly Gly Lys Ala Leu Lys Phe Tyr Ala Ser Val 185 190 195 CGT TGT GAC ATT CGA CGA ATC CAG ACT CTG AAG GAC GGA CAG GAT 630 Arg Cys Asp Ile Arg Arg Ile Gln Thr Leu Lys Asp Gly Gln Asp 200 205 210 GCC ATT GGT AAC CGC ACC CGC TTG AAG GTC GTT AAG AAC AAG GTC 675 Ala Ile Gly Asn Arg Thr Arg Leu Lys Val Val Lys Asn Lys Val 215 220 225 TCC CCA CCG TTC AAG ATC GCT GAA TTC GAC ATC ATG TAC GGC GAA 720 Ser Pro Pro Phe Lys Ile Ala Glu Phe Asp Ile Met Tyr Gly Glu 230 235 240 GGC ATC TCC CGT GAA TCC TCC GTC ATT GAC TTG GCA GTG GAC AAC 765 Gly Ile Ser Arg Glu Ser Ser Val Ile Asp Leu Ala Val Asp Asn 245 250 255 GGC ATT GTG AAG AAG TCA GGT TCC TGG TTC ACC TAC GAG GGT GAA 810 Gly Ile Val Lys Lys Ser Gly Ser Trp Phe Thr Tyr Glu Gly Glu 260 265 270 CAG CTT GGT CAA GGT AAG GAA AAG GTG CGT CTT TCC CTC AAG GAG 855 Gln Leu Gly Gln Gly Lys Glu Lys Val Arg Leu Ser Leu Lys Glu 275 280 285 AAC CCT GAA CTC ACC GAT GAG CTG GAA GAT AAG ATC TTC AAG AAG 900 Asn Pro Glu Leu Thr Asp Glu Leu Glu Asp Lys Ile Phe Lys Lys 290 295 300 CTG GGA GTA GGC AAG TAC GCT GCA GCC TCA GAT GAA CTC ACC GAC 945 Leu Gly Val Gly Lys Tyr Ala Ala Ala Ser Asp Glu Leu Thr Asp 305 310 315 GAA CCA GTA GAG CTC GTG CCT AAC GTT GAC TTC GAT GAT GAA GCC 990 Glu Pro Val Glu Leu Val Pro Asn Val Asp Phe Asp Asp Glu Ala 320 325 330 GAC ACC GAA GCA GAC GCT GAA GAC TAA 1017 Asp Thr Glu Ala Asp Ala Glu Asp 335

【００４６】

【図面の簡単な説明】

【図１】大きさが約３．０ｋｂの本発明のＤＮＡ断片。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｒ 1:13） (72)発明者 湯川 英明 茨城県稲敷郡阿見町中央８丁目３番１号 三菱油化株式会社筑波総合研究所内

Claims (5)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 コリネ型細菌由来のＲｅｃＡ蛋白質をコ
   ードする遺伝子を含むＤＮＡ断片。
2. 【請求項２】 前記コリネ型細菌がブレビバクテリウム
   ・フラバム (Brevibacterium flavum)ＭＪ−２３３であ
   る請求項１記載のＤＮＡ断片。
3. 【請求項３】 両端に制限酵素ＳａｌＩ認識部位を有
   し、下記制限酵素により下記制限酵素部位数で下記切断
   断片の大きさに切断される請求項１または２記載のＤＮ
   Ａ断片。 制限酵素 認識部位数 切断断片の大きさ（ｋｂ） ＢａｍＨＩ ３ １．２、１．１、０．５、０．２ ＥｃｏＲＩ ２ １．３、１．１、０．６ ＨｉｎｃＩＩ ３ １．８、０．８、０．３、０．１ ＨｉｎｄＩＩＩ １ １．９、１．１ ＫｐｎＩ ２ １．４、０．９、０．７
4. 【請求項４】 配列表の配列番号２のアミノ酸配列で示
   されるＲｅｃＡ蛋白質をコードする遺伝子を含むＤＮＡ
   断片。
5. 【請求項５】 配列表の配列番号２の塩基配列で示され
   るＲｅｃＡ蛋白質をコードする遺伝子を含むＤＮＡ断
   片。