JPH11103863A - マレイン酸異性化酵素遺伝子 - Google Patents

マレイン酸異性化酵素遺伝子

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JPH11103863A
JPH11103863A JP9276261A JP27626197A JPH11103863A JP H11103863 A JPH11103863 A JP H11103863A JP 9276261 A JP9276261 A JP 9276261A JP 27626197 A JP27626197 A JP 27626197A JP H11103863 A JPH11103863 A JP H11103863A
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JP
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ala
val
leu
ser
glu
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JP9276261A
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English (en)
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Masaharu Mukoyama
正治 向山
Shinzo Yasuda
信三 安田
Toshimi Komatsuzaki
聡美 小松崎
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Nippon Shokubai Co Ltd
Original Assignee
Nippon Shokubai Co Ltd
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/90—Isomerases (5.)

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Abstract

(57)【要約】 【解決手段】 本発明は、優れた安定性を有するマレイ
ン酸異性化酵素の遺伝子、及び該遺伝子を含有する組換
えべクター、該組換えべクターで形質転換された形質転
換体を提供する。 【効果】 本発明により、優れた安定性を有するマレイ
ン酸異性化酵素を効率よく大量に生産することが可能と
なる。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明はマレイン酸異性化酵
素をコードする遺伝子、該遺伝子を含む組換えＤＮＡ、
該組換えＤＮＡを有する形質転換体及び該形質転換体を
用いたマレイン酸異性化酵素の製造方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】マレイン酸とアンモニアからＬ−アスパ
ラギン酸を生産する微生物としては、アルカリゲネス
属、シュードモナス属、アクロモバクター属、アエロバ
クター属、バチルス属、プレビバクテリウム属に属する
微生物が知られており、これらの幾つかについては、既
に特許出願されている（特公昭38-2793号公報、特公昭4
2-11993号公報、特公昭42-11994号公報、および特公昭4
3-8710号公報）。
【０００３】マレイン酸アンモニウムがＬ−アスパラギ
ン酸に変換される際には、マレイン酸異性化酵素とアス
パルターゼの２種の酵素が関与しているが、アスパルタ
ーゼが比較的安定なのに対して、マレイン酸異性化酵素
は不安定であり、特に酸素によって活性が低下しやすい
特徴を有している。また、このマレイン酸異性化酵素の
安定性は菌株によっても異なっており、菌体を固定化し
て用いた場合に、活性半減期が短く、満足する生産量が
得られていないのが現状である。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、優れ
た安定性を有するマレイン酸異性化酵素の遺伝子、及び
該遺伝子を含有する組換えべクター、該組換えべクター
で形質転換された形質転換体を提供することである。
【０００５】
【課題を解決するための手段】すなわち、本発明は以下
の（ａ）又は（ｂ）のタンパク質をコードするＤＮＡで
ある。 （ａ）配列番号１又は配列番号２で表されるアミノ酸配
列からなるタンパク質。 （ｂ）アミノ酸配列（ａ）においてアミノ酸が欠失、置
換若しくは付加されたアミノ酸配列からなる、マレイン
酸異性化酵素活性を有するタンパク質。
【０００６】上記ＤＮＡの具体例としては、例えば配列
番号３又は配列番号４で表されるＤＮＡが挙げられる。
（ｂ）において欠失、置換若しくは付加されるアミノ酸
の数については、該タンパク質がマレイン酸異性化酵素
活性を有する限り特に制限はないが、好ましくは１若し
くは数個である。さらに、本発明は、上記ＤＮＡのいず
れかを含む組換えベクターである。さらに、本発明は、
上記組換えベクターにより形質転換された形質転換体で
ある。さらに、本発明は、上記形質転換体を培地中で培
養して培養物からマレイン酸異性化酵素を採取すること
を特徴とするマレイン酸異性化酵素の製造方法である。
【０００７】上記のアミノ酸の付加、欠失又は置換は出
願前周知の技術である部位特定変異誘発（例えば、Nucl
eic Acid Reserch, Vol.10,No.20, p 6487〜6500参照の
こと) により実施することができ、アミノ酸の付加、欠
失又は置換に関し、１又は数個のアミノ酸とは、部位特
定変異誘発法により付加、欠失又は置換できる程度のア
ミノ酸である。
【０００８】
【発明の実施の形態】以下、本発明を詳細に説明する。
本発明の遺伝子を得るための微生物は、マレイン酸異性
化酵素を生産するものであればいずれのものでもよい
が、好ましくはシトロバクター・アマロナティカス（Ci
trobacter ama1onaticus）又はシュードモナス・フルオ
レセンス（Pseudomonas fluorescens ）、より好ましく
はシトロバクター・アマロナティカスNSM-10株（Citrob
acter ama1onaticus NSM-10 ）（FERM P-16142）又はシ
ュードモナス・フルオレセンスNSM-4株（Pseudomonas f
luorescens NSM-4 ）（FERM BP-6037）を用いることが
できる。これら2つの菌株は、優れた安定性を有するマ
レイン酸異性化酵素を生産し、且つその生産能の活性半
減期が長いという特徴を有している。尚、NSM-4株につ
いては既に特許出願されている（特願平8-155833号）。
【０００９】まず、微生物から染色体ＤＮＡを単離す
る。染色体ＤＮＡの単離は、公知の方法、例えばSDS
法、リゾチームSDS法またはCTAB法を用いて行うことが
できる。好ましくはリゾチームSDS法を用いる。次に、
染色体ＤＮＡを常法に従って適切な制限酵素で切断し、
得られるＤＮＡ断片を、公知のベクターにライゲーショ
ンして組換えＤＮＡ分子を作成する。該ＤＮＡ分子を宿
主菌に形質導入することによりクローニングする。ベク
ターとしてはpUC18が挙げられるが、特に限定しない。
宿主菌としては、組み込んだ遺伝子が安定に保持できる
ものであればいかなる微生物も使用できる。例えば、大
腸菌ではDH10B株が挙げられる。組換えＤＮＡ分子によ
る宿主菌の形質転換の方法としては、公知の方法を使用
できる。例えば、in vitroパッケージングを用いること
ができる。
【００１０】次いで、このようにして得られる組換え微
生物のうち、マレイン酸異性化酵素遺伝子を含むものを
スクリーニングする。このスクリーニングは、組換え微
生物を適当な倍地を用いて培養し、マレイン酸を異性化
する酵素活性を測定することにより行うことができる。
このようにして選択される組換え微生物から組換えＤＮ
Ａ分子を抽出する。この抽出は、通常のプラスミド調製
法やファージＤＮＡ調製法を用いて行うことができる。
この組換えＤＮＡ分子の各種制限酵素による切断パター
ンを電気泳動法等を用いて解析する。
【００１１】また、上述の組換えＤＮＡ分子を各種制限
酵素を用いて切断し、マレイン酸異性化酵素遺伝子の検
出用プローブとハイブリダイズする断片を検出する。検
出用プローブとしては、マレイン酸異性化酵素を常法に
より分析して得られるＮ末端アミノ酸配列又は中間アミ
ノ酸配列に対応するコドンから、数種のＤＮＡオリゴマ
ーを合成し、標識したものを用いる。ＤＮＡオリゴマー
の合成は、公知の方法を用いて行うことができる。標識
としては公知のものを用いることができるが、好ましく
はFluorescein-11・ｄＵＴＰを用いる。検出される断片
のうち、適切なものを選んでベクターにライゲーション
し、組換えベクターを作製する。これを用いて微生物を
形質転換し、形質転換体を得る。
【００１２】この形質転換体を得るまでの手順として
は、上述のものに限定されるものではない。例えば、上
述のようにゲノムＤＮＡを単離した後、各種制限酵素で
消化して得られる断片について前記ＤＮＡプローブによ
るサザンハイブリダイゼーション解析を行い、選択され
る断片を含むベクターを用いて適当な宿主を形質転換す
る。こうして得られる形質転換体を適当な培地を用いて
培養し、マレイン酸異性化酵素活性を測定することによ
り、該酵素生産能を有する形質転換体を選択することが
できる。この形質転換体は、本発明のＤＮＡを含んでお
り、マレイン酸異性化酵素を効率よく生産する菌株であ
る。
【００１３】この菌株を培養した後、プラスミドを抽出
する。微生物としては、例えば大腸菌が挙げられる。プ
ラスミドの抽出には、公知の方法を用いることができ
る。このプラスミドの挿入断片の塩基配列を解析し、こ
の配列をもとに、上述の組換えＤＮＡ分子のうちのマレ
イン酸異性化酵素全領域の配列を決定する。本発明の二
つのＤＮＡは前記寄託微生物からＰＣＲ法により増幅す
ることができる。上記で得られた遺伝子の配列の上流側
20塩基程度を有するオリゴヌクレオチドと、下流側20塩
基程度に対して相補的なオリゴヌクレオチドを用い、こ
れらをプライマーとしてゲノムＤＮＡを鋳型とし、ＰＣ
Ｒ法により増幅できる。特に、上述のシトロバクター・
アマロナティカスNSM-10株又はシュードモナス・フルオ
レセンスNSM-4株のマレイン酸異性化酵素遺伝子を増幅
する場合には、以下のプライマーセットを用いることが
できる。
【００１４】シトロバクター・アマロナティカスNSM-10株 フォワード側 5'-ATGAAAAGTTTTCGAATCGGCCAAATCGTTCCCAGCTCC-3' （配列番号５） リバース側 5'-TTAGTAAGCGCCCGAGAGGAGATGGCCCGG-3'（配列番号６）シュードモナス・フルオレセンスNSM-4株 フォワード側 5'-ATGACCAAGCCCTACCGTATCGGCCAGATCGTGC-3' （配列番号７） リバース側 5'-TCAGTAGGCGCCCGACAGCAAGGCGCC-3' （配列番号８）
【００１５】
〔実施例１〕
（１）染色体ＤＮＡの単離とクローニング マレイン酸異性化酵素生産菌シュードモナス・フルオレ
センスNSM-4株（Pseudomonas fluorescens NSM-4 ）か
ら全ＤＮＡを単離した。ＤＮＡの単離は、シュードモナ
スについて用いられているMarmurら（J. Mol. Bio1.,
3, 208 (1961)）の方法を改変した方法によって行っ
た。シュードモナス・フルオレセンスNSM-4株をＬＢ培
地で一夜培養し、培養液から菌体を遠心分離によって回
収した。これをリゾチームとＳＤＳで溶菌させたのち、
フェノール抽出、エタノール沈殿によって全ＤＮＡを分
離した。分離した全ＤＮＡを制限酵素Sau3AIで適当な時
間切断処理し、アガロースゲル電気泳動によって3000か
ら9000塩基対の範囲の断片を回収した。この回収したSa
u3AI処理断片を公知のベクターpUC18のBamHIサイトにク
ローニングした。このベクターを用いて常法により大腸
菌DH10B株を形質転換し、シュードモナス・フルオレセ
ンスNSM-4株の遺伝子ライブラリーを作成した。ライブ
ラリーとしてアンピシリン耐性形質転換体を取得した。
【００１６】（２）形質転換体の選択 形質転換体の選択は、アンピシリン耐性形質転換体菌体
を用いて、マレイン酸を異性化する酵素活性を測定する
ことによって行った。アンピシリン100γを添加したマ
レイン酸培地（表１）３mlにアンピシリン耐性形質転換
体菌体１白金耳を接種し、一夜培養後、その培養液１．
５m1を遠心して菌体を回収した。回収した菌体を２０％
マレイン酸基質液（表２）１mlに懸濁後、３０℃で一夜
反応させた。この基質液には大腸菌から調製したアスパ
ルターゼを添加してあり、マレイン酸から異性化して生
成したフマル酸がＬ−アスパラギン酸に変換されるよう
にしてある。反応終了後、反応液の一部を蒸留水で４０
０倍に希釈して、以下の条件でのＨＰＬＣ分析によって
生成したＬ−アスパラギン酸を測定した。 カラム：カプセルパックC18 UG120S-5（シセイドー社
製） 温 度：４０℃ 溶離液：３０ｍＭ ＮＨ４Ｈ２ＰＯ４ （ｐＨ ２．
５） 流 速：１ ｍｌ／ｍｉｎ 検出器：ＵＶ (210nm)
【００１７】
【表１】
【００１８】
【表２】
【００１９】約2000の形質転換体について上述の反応を
行ったところ、そのうちの１株がＬ一アスパラギン酸を
生成していた。この形質転換体からアルカリSDS法によ
ってプラスミドを回収し、各種制限酵素で処理した後、
アガロースゲル電気泳動を行い、ＤＮＡフラグメントの
解析を行った。その結果、プラスミドに挿入されたＤＮ
Ａ断片は５．６kbからなり、SacI、XbaIで１ケ所切断さ
れ、さらにKpnI、NcoIで２ケ所、SmaI、SphIで３ケ所切
断されるが、BamHI 、HindIII 、EcoRIでは切断されな
いことが判明した。このプラスミドをpMI503と命名し
た。
【００２０】（３）ＤＮＡプローブの調製 シュードモナス・フルオレセンスNSM-4株のマレイン酸
異性化酵素のＮ末端アミノ酸配列をプロテインシーケン
サ(Applied Biosystems社 477A)を用いて分析した。そ
の結果、Ｎ末端配列として、 Met Thr Lys Pro Tyr Arg Ile Gly Gln Ile Val Pro Ser Ser Asn Thr Thr Met Glu Thr Glu （配列番号９） からなるアミノ酸配列を得た。このアミノ酸配列の一部
に対応する Val Pro Ser Ser Asn Thr Thr Met Glu Thr Glu （配列番号１０） の部分について、そのアミノ酸に対応するコドンから、 5'-GTICCIAGCTCIAACACIACIATGGAAACIGA-3'（配列番号１１） の３２個の塩基からなる１２種のＤＮＡオリゴマーをホ
スホアミダイド法により合成した。ここでIはイノシン
（任意の塩基に対応）、Rはプリン塩基のA又はG、Yはピ
リミジン塩基のC又はTを示す。この配列中、CIATGGにNc
oI制限サイトの存在が推測された。この合成ＤＮＡオリ
ゴマーをFluorescein-11・ｄＵＴＰとターミナルデオキ
シヌクレオチジルトランスフェラーゼを用いて標識し、
マレイン酸異性化酵素遺伝子の検出用プローブとして用
いた。
【００２１】（４）サザンハイブリダイゼーション 前述の制限酵素とNcoIで切断したＤＮＡ断片をアガロー
スゲル電気泳動によって分離したのち、ナイロンメンブ
レンにうつし、先に作製した検出用プローブを用いてサ
ザンハイブリダイゼーションを行い、ハイブリダイズす
る断片が存在するかどうかを調べた。その結果、KpnIで
切断した４kb断片、SmaIで切断した１．４kb断片、SphI
で切断した３kb断片、NcoIで切断した２．６kb断片、Xb
aIで切断した４．１kb断片にハイブリダイズした。
【００２２】（５）クローニング （４）で得られた断片のうち、NcoIで切断した２．６kb
断片の末端をＤＮＡBluntingKit （宝酒造製）を用いて
平滑化し、pUC18のSmaIサイトにサブクローニングし
た。このプラスミドを用いて大腸菌を形質転換し、これ
を培養したのちに、大腸菌菌体からアルカリSDS法によ
りプラスミドを抽出した。このプラスミドをpPM503と命
名した。このプラスミドの挿入断片のＤＮＡ塩基配列を
ジデオキシ法により解析したところ、マレイン酸異性化
酵素のＮ末端アミノ酸配列に相当する 5'-ATGACCAAGCCTACCGTATCGGCCAGATCGTGCCGAGTTCGAACACCACCA-3' （配列番号１２） の塩基配列が見いだされた。この配列をもとに次のシー
ケンス用プライマーを作製し、１回あたり250塩基の解
析を行うことを繰り返した。合計4回の解析によって、
プラスミドpMI503からマレイン酸異性化酵素全領域の配
列を決定した。
【００２３】（６）大腸菌におけるマレイン酸異性化酵
素遺伝子の発現 前述のpMI503プラスミドを有する大腸菌及びpUC18プラ
スミドを有する大腸菌をそれぞれ、表１に示す培地５ml
に１白金耳接種し、３７℃で一夜振盪培養を行った。培
養液１．５m1を遠心分離して菌体を回収し、表２に示す
マレイン酸基質液０．５mlに菌体を懸濁させて３０℃で
マレイン酸の変換反応を行った。基質液に大腸菌から調
製したアスパルターゼを添加することにより、生成した
フマル酸をＬ−アスパラギン酸として検出した。この分
析は上記（２）の記載に従って行った。１６時間の反応
で、pMI503プラスミドを有する大腸菌DH10B-503株では
マレイン酸変換率９０％であったのに対して、挿入断片
のないpUC18プラスミドを有するDH10B株では変換率０％
であった。
【００２４】〔実施例２〕 （１）ＤＮＡプローブの調製 マレイン酸異性化酵素生産菌シトロバクター・アマロナ
ティカスNSM-10株（Citrobacter ama1onaticus NSM-10
）のマレイン酸異性化酵素のＮ末端アミノ酸配列をプ
ロテインシーケンサ(Applied Biosystems社 477A)を用
いて分析した。その結果Ｎ末端構造として、 Met Lys Ser Phe Arg Ile Gly Gln Ile Val Pro Ser Ser Asn Thr Thr Met Glu Thr Glu （配列番号１３） からなるアミノ酸配列を得た。このアミノ酸配列の一部
に対応する Val Pro Ser Ser Asn Thr Thr Met Glu Thr Glu （配列番号１０） の部分について、そのアミノ酸に対応するコドンから、 5'-GTICCIAGCTCIAACACIACIATGGAAACIGA-3'（配列番号１１） の３２個の塩基からなる１２種のＤＮＡオリゴマーをホ
スホアミダイド法により合成した。ここでIはイノシン
（任意の塩基に対応）、Rはプリン塩基のA又はG、Yはピ
リミジン塩基のC又はTを示す。この合成ＤＮＡオリゴマ
ーをFluorescein-11・ｄＵＴＰとターミナルデオキシヌ
クレオチジルトランスフェラーゼを用いて標識し、マレ
イン酸異性化酵素遺伝子の検出用プローブとして用い
た。
【００２５】（２）染色体ＤＮＡの単離 マレイン酸異性化酵素生産菌シトロバクター・アマロナ
ティカスNSM-10株から全ＤＮＡを単離した。ＤＮＡの単
離は、シュードモナスについて用いられているMarmurら
（J. Mo1. Bio1., 3, 208 (1961)）の方法を改変した方
法によって行った。シトロバクター・アマロナティカス
NSM-10株をＬＢ培地で一夜培養し、培養液から菌体を遠
心分離によって回収した。これをリゾチームとＳＤＳで
溶菌させたのち、フェノール抽出、エタノール沈殿によ
って全ＤＮＡを分離した。
【００２６】（３）サザンハイブリダイゼーション 分離した全ＤＮＡを制限酵素BamHI，EcoRI，SacI，Kpn
I，SmaI，XbaI，SalI，PstI，HindIIIで切断処理し、ア
ガロースゲル電気泳動によって断片を分離した。分離し
た断片を、アガロースゲルから＋電荷を持ったナイロン
メンブレンに移した。このＤＮＡ断片を移したブロット
に対し、先に作製した検出用プローブを用いてサザンハ
イブリダイゼーションを行い、ハイブリダイズする断片
を調べた。この結果、シトロバクター・アマロナティカ
スNSM-10株の全ＤＮＡを制限酵素PstIで切断した１．２
kbpの断片に強くハイブリダイズすることがわかった。
【００２７】（４）クローニング シトロバクター・アマロナティカスNSM-10株の全ＤＮＡ
を制限酵素PstIで切断した１．２ kbpの断片を電気泳動
によって分離し、アガロースゲルから回収して、公知の
ベクターpUC18のPstIサイトにクローニングした。この
ベクターを用いて常法により大腸菌DH10B株を形質転換
し、シトロバクター・アマロナティカスNSM-10株の遺伝
子ライブラリーを作成した。ライブラリーとしてアンピ
シリン耐性形質転換体を取得した。
【００２８】（５）形質転換体の選択 形質転換体の選択は、アンピシリン耐性形質転換体菌体
を用いて、マレイン酸を異性化する酵素活性を測定する
ことによって行った。アンピシリン100γを添加したマ
レイン酸培地（表１）３mlにアンピシリン耐性形質転換
体菌体1白金耳を接種し、一夜培養した後、その培養液
１．５mlを遠心して菌体を回収した。回収した菌体を20
％マレイン酸基質液（表２）１mlに懸濁後、30℃で一夜
反応させた。この基質液には大腸菌から調製したアスパ
ルターゼを添加してあり、マレイン酸から異性化して生
成したフマル酸がＬ−アスパラギン酸に変換されるよう
にしてある。一夜の反応の後、反応液の一部を蒸留水で
400倍に希釈してＨＰＬＣ分析によって生成したＬ−ア
スパラギン酸を測定した。ＨＰＬＣ分析の条件は実施例
１（2）に記載した通りであった。１０株の形質転換体
を反応させたところ、そのうちの６株がＬ−アスパラギ
ン酸を生成していた。この形質転換体の一つからアルカ
リSDS法によりプラスミドを回収し、pMI10aと命名し
た。このプラスミドの挿入断片のＤＮＡ塩基配列をジデ
オキシ法により解析したところ、マレイン酸異性化酵素
のＮ末端アミノ酸配列に相当する 5'-ATGAAAAGTTTTCGAATCGGCCAAATCGTTCCCAGCTCCAATACTACAATGGAGACAGAA-3' （配列番号１４） の塩基配列が見いだされ、250アミノ酸をコードする750
bpのマレイン酸異性化酵素の全領域を含んでいることが
わかった。
【００２９】（６）大腸菌におけるマレイン酸異性化酵
素遺伝子の発現 前述のpMI10aプラスミドを有する大腸菌とpUC18プラス
ミドを有する大腸菌を表１に示す培地５m1に１白金耳接
種し、３７℃で一夜振盪培養を行った。培養液１．５ml
を遠心分離して菌体を回収し、表２に示すマレイン酸基
質液０．５mlに菌体を懸濁させて３０℃でマレイン酸の
変換反応を行った。基質液には大腸菌から調製したアス
パルターゼを添加することにより、生成したフマル酸を
Ｌ−アスパラギン酸として検出した。この分析は上記
（５）の記載に従って行った。１６時間の反応で、pMI1
0aプラスミドを有する大腸菌DH10B-10a株ではマレイン
酸変換率９５％であったのに対して、挿入断片のないpU
C18プラスミドを有するDH10B株では変換率０％であっ
た。
【００３０】
【発明の効果】本発明により、マレイン酸異性化酵素を
コードする遺伝子、該遺伝子を含む組換えＤＮＡ、及び
該組換えＤＮＡを有する形質転換体を提供することがで
きる。そして、かかる形質転換体を用いることによりマ
レイン酸異性化酵素を効率的に生産することができる。
【００３１】
【配列表】
配列番号：１ 配列の長さ：250 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：タンパク質 起源： 生物名：Pseudomonas fluorescens 株名：NSM-4 配列 Met Thr Lys Pro Tyr Arg Ile Gly Gln Ile Val Pro Ser Ser Asn Thr 1 5 10 15 Thr Met Glu Thr Glu Ile Pro Ala Met Leu Leu Ala Arg Gln Ala Ile 20 25 30 Arg Pro Glu Arg Phe Thr Phe His Ser Ser Arg Met Arg Met Lys Gln 35 40 45 Val Lys Lys Glu Glu Leu Ala Ala Met Asp Gly Glu Ser Asp Arg Cys 50 55 60 Ala Val Glu Leu Ser Asp Ala Lys Val Asp Val Leu Gly Tyr Ala Cys 65 70 75 80 Leu Val Ala Ile Met Ala Met Gly Leu Gly Tyr His Arg Gln Ser Glu 85 90 95 Lys Arg Leu Gln Lys Ala Thr Ala Asp Asn Asp Ala Leu Ala Pro Val 100 105 110 Ile Thr Ser Ala Gly Ala Leu Val Glu Ala Leu His Val Met Lys Ala 115 120 125 Lys Arg Ile Ala Ile Val Ala Pro Tyr Met Lys Pro Leu Thr Glu Leu 130 135 140 Val Val Asn Tyr Ile Arg Glu Glu Gly Phe Glu Val Gln Asp Trp Arg 145 150 155 160 Ala Leu Glu Ile Pro Asp Asn Leu Ala Val Ala Arg His Asp Thr Ala 165 170 175 Asn Leu Pro Gly Ile Val Ala Gly Met Asn Leu Glu Gly Val Asp Val 180 185 190 Val Val Leu Ser Ala Cys Val Gln Met Gln Ser Leu Pro Ala Val Ala 195 200 205 Lys Val Glu Ala Gln Thr Gly Lys Pro Val Val Thr Ala Ala Ile Ala 210 215 220 Thr Thr Tyr Ala Met Leu Lys Ala Leu Asp Leu Glu Pro Val Val Pro 225 230 235 240 Gly Ala Gly Ala Leu Leu Ser Gly Ala Tyr 245 250
【００３２】配列番号：２ 配列の長さ：250 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：タンパク質 起源： 生物名：Citrobacter ama1onaticus 株名：NSM-10 配列 Met Lys Ser Phe Arg Ile Gly Gln Ile Val Pro Ser Ser Asn Thr Thr 1 5 10 15 Met Glu Thr Glu Ile Pro Ala Met Leu Thr Ser Arg Tyr Ser Met Tyr 20 25 30 Pro Asp Glu Gln Phe Thr Phe His Ser Ser Arg Met Arg Met Met His 35 40 45 Val Ser Pro Glu Glu Leu Lys Lys Met Asp Ile Asp Ser Asp Arg Cys 50 55 60 Ala Leu Glu Leu Ser Asp Ala Arg Val Asp Val Met Ala Tyr Ala Cys 65 70 75 80 Leu Val Ala Ile Met Cys Gln Gly Ala Gly Tyr His Lys Val Ser Gln 85 90 95 Glu Arg Leu Gly Lys Ala Val Ala Ser Asn Asn Ser Ser Ser Pro Val 100 105 110 Leu Ser Ser Ala Gly Ala Leu Ile Asp Ser Leu Ala Met Leu Glu Tyr 115 120 125 Lys Lys Ile Ser Ile Ile Thr Pro Tyr Met Lys Pro Leu Thr Gln Gln 130 135 140 Val Ile Asp Tyr Ile Glu Ala Ala Gly Ile Glu Val Val Asp Ser Ile 145 150 155 160 Ser Leu Glu Val Ser Asp Asn Leu Glu Val Gly Arg Leu Asp Pro Met 165 170 175 Asn Leu Val Gly His Ala Asp Lys Leu Lys Ile Gly Gln Ala Asp Gly 180 185 190 Val Val Leu Ser Cys Cys Val Gln Met Pro Ser Leu Pro Ala Ile His 195 200 205 Leu Val Gln Asp Arg Leu Asp Lys Pro Val Leu Ser Ala Ser Val Ala 210 215 220 Thr Val Tyr Gln Met Leu Lys Ala Leu Gly Leu Lys Ala His Val Ser 225 230 235 240 Asn Ala Gly His Leu Leu Ser Gly Ala Tyr 245 250
【００３３】配列番号：３ 配列の長さ：750 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：genomicDNA 起源： 生物名：Pseudomonas fluorescens 株名：NSM-4 配列 ATG ACC AAG CCC TAC CGT ATC GGC CAG ATC GTG CCG AGT TCG AAC ACC 48 Met Thr Lys Pro Tyr Arg Ile Gly Gln Ile Val Pro Ser Ser Asn Thr 1 5 10 15 ACC ATG GAA ACC GAG ATC CCG GCG ATG CTC CTG GCC CGC CAG GCG ATC 96 Thr Met Glu Thr Glu Ile Pro Ala Met Leu Leu Ala Arg Gln Ala Ile 20 25 30 CGC CCG GAG CGC TTC ACC TTC CAC TCC AGC CGC ATG CGC ATG AAG CAG 144 Arg Pro Glu Arg Phe Thr Phe His Ser Ser Arg Met Arg Met Lys Gln 35 40 45 GTG AAG AAG GAA GAA CTG GCG GCG ATG GAC GGC GAG TCC GAC CGC TGC 192 Val Lys Lys Glu Glu Leu Ala Ala Met Asp Gly Glu Ser Asp Arg Cys 50 55 60 GCA GTG GAA CTG TCA GAC GCC AAG GTG GAC GTG CTC GGC TAT GCC TGC 240 Ala Val Glu Leu Ser Asp Ala Lys Val Asp Val Leu Gly Tyr Ala Cys 65 70 75 80 CTG GTG GCG ATC ATG GCC ATG GGG CTG GGG TAC CAC CGC CAG TCA GAG 288 Leu Val Ala Ile Met Ala Met Gly Leu Gly Tyr His Arg Gln Ser Glu 85 90 95 AAG CGG TTG CAA AAA GCC ACT GCT GAC AAC GAC GCA CTG GCG CCG GTC 336 Lys Arg Leu Gln Lys Ala Thr Ala Asp Asn Asp Ala Leu Ala Pro Val 100 105 110 ATC ACC AGT GCC GGT GCG CTG GTG GAA GCC CTG CAC GTG ATG AAG GCC 384 Ile Thr Ser Ala Gly Ala Leu Val Glu Ala Leu His Val Met Lys Ala 115 120 125 AAG CGC ATC GCC ATC GTC GCG CCC TAC ATG AAG CCG TTG ACC GAA CTG 432 Lys Arg Ile Ala Ile Val Ala Pro Tyr Met Lys Pro Leu Thr Glu Leu 130 135 140 GTG GTC AAC TAC ATC CGT GAG GAA GGC TTC GAG GTG CAG GAC TGG CGC 480 Val Val Asn Tyr Ile Arg Glu Glu Gly Phe Glu Val Gln Asp Trp Arg 145 150 155 160 GCG CTG GAA ATC CCC GAC AAC CTC GCC GTG GCC CGT CAC GAC ACG GCC 528 Ala Leu Glu Ile Pro Asp Asn Leu Ala Val Ala Arg His Asp Thr Ala 165 170 175 AAC CTG CCG GGC ATC GTC GCC GGC ATG AAC CTT GAG GGC GTC GAT GTG 576 Asn Leu Pro Gly Ile Val Ala Gly Met Asn Leu Glu Gly Val Asp Val 180 185 190 GTG GTG CTT TCA GCC TGC GTG CAG ATG CAG TCG CTG CCG GCA GTC GCC 624 Val Val Leu Ser Ala Cys Val Gln Met Gln Ser Leu Pro Ala Val Ala 195 200 205 AAG GTC GAG GCG CAA ACC GGC AAA CCG GTG GTC ACC GCT GCC ATC GCC 672 Lys Val Glu Ala Gln Thr Gly Lys Pro Val Val Thr Ala Ala Ile Ala 210 215 220 ACC ACC TAC GCC ATG CTC AAG GCG CTG GAC CTG GAA CCG GTG GTT CCG 720 Thr Thr Tyr Ala Met Leu Lys Ala Leu Asp Leu Glu Pro Val Val Pro 225 230 235 240 GGC GCT GGC GCC TTG CTG TCG GGC GCC TAC 750 Gly Ala Gly Ala Leu Leu Ser Gly Ala Tyr 245 250
【００３４】配列番号：４ 配列の長さ：750 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：genomicDNA 起源： 生物名：Citrobacter ama1onaticus 株名：NSM-10 配列 ATG AAA AGT TTT CGA ATC GGC CAA ATC GTT CCC AGC TCC AAT ACT ACA 48 Met Lys Ser Phe Arg Ile Gly Gln Ile Val Pro Ser Ser Asn Thr Thr 1 5 10 15 ATG GAG ACA GAA ATA CCG GCC ATG CTT ACT TCT CGA TAC TCG ATG TAC 96 Met Glu Thr Glu Ile Pro Ala Met Leu Thr Ser Arg Tyr Ser Met Tyr 20 25 30 CCT GAC GAA CAG TTC ACA TTC CAC TCC TCA CGA ATG CGC ATG ATG CAT 144 Pro Asp Glu Gln Phe Thr Phe His Ser Ser Arg Met Arg Met Met His 35 40 45 GTT AGT CCA GAG GAG CTG AAG AAA ATG GAT ATT GAC AGT GAT CGT TGT 192 Val Ser Pro Glu Glu Leu Lys Lys Met Asp Ile Asp Ser Asp Arg Cys 50 55 60 GCA CTT GAG TTG AGT GAC GCT CGC GTT GAC GTA ATG GCT TAC GCC TGC 240 Ala Leu Glu Leu Ser Asp Ala Arg Val Asp Val Met Ala Tyr Ala Cys 65 70 75 80 TTG GTA GCC ATA ATG TGT CAG GGT GCC GGG TAT CAC AAA GTA TCT CAG 288 Leu Val Ala Ile Met Cys Gln Gly Ala Gly Tyr His Lys Val Ser Gln 85 90 95 GAG CGC TTG GGG AAG GCA GTG GCT TCT AAT AAT TCA AGC TCT CCA GTG 336 Glu Arg Leu Gly Lys Ala Val Ala Ser Asn Asn Ser Ser Ser Pro Val 100 105 110 CTC AGT TCT GCG GGA GCC TTG ATC GAT AGC TTG GCC ATG TTG GAA TAC 384 Leu Ser Ser Ala Gly Ala Leu Ile Asp Ser Leu Ala Met Leu Glu Tyr 115 120 125 AAG AAG ATT TCA ATC ATC ACC CCC TAT ATG AAA CCG TTG ACT CAG CAA 432 Lys Lys Ile Ser Ile Ile Thr Pro Tyr Met Lys Pro Leu Thr Gln Gln 130 135 140 GTG ATC GAC TAT ATT GAG GCA GCA GGT ATC GAG GTG GTA GAT TCT ATC 480 Val Ile Asp Tyr Ile Glu Ala Ala Gly Ile Glu Val Val Asp Ser Ile 145 150 155 160 AGT CTC GAA GTG TCG GAC AAC CTT GAA GTT GGG CGA CTT GAT CCG ATG 528 Ser Leu Glu Val Ser Asp Asn Leu Glu Val Gly Arg Leu Asp Pro Met 165 170 175 AAT TTA GTA GGA CAT GCT GAT AAA CTG AAA ATC GGT CAG GCT GAT GGC 576 Asn Leu Val Gly His Ala Asp Lys Leu Lys Ile Gly Gln Ala Asp Gly 180 185 190 GTT GTG CTT TCG TGC TGC GTT CAA ATG CCC TCT TTG CCG GCG ATT CAT 624 Val Val Leu Ser Cys Cys Val Gln Met Pro Ser Leu Pro Ala Ile His 195 200 205 CTG GTC CAG GAT CGC CTA GAC AAA CCG GTT CTG TCA GCT TCT GTA GCT 672 Leu Val Gln Asp Arg Leu Asp Lys Pro Val Leu Ser Ala Ser Val Ala 210 215 220 ACT GTC TAC CAA ATG TTG AAA GCC CTT GGG CTG AAG GCC CAC GTC TCG 720 Thr Val Tyr Gln Met Leu Lys Ala Leu Gly Leu Lys Ala His Val Ser 225 230 235 240 AAT GCT GGC CAT CTC CTC TCG GGC GCT TAC 750 Asn Ala Gly His Leu Leu Ser Gly Ala Tyr 245 250
【００３５】配列番号：５ 配列の長さ：39 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成オリゴヌクレオチド 配列 ATGAAAAGTT TTCGAATCGG CCAAATCGTT CCCAGCTCC 39
【００３６】配列番号：６ 配列の長さ：30 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成オリゴヌクレオチド 配列 TTAGTAAGCG CCCGAGAGGA GATGGCCCGG 30
【００３７】配列番号：７ 配列の長さ：34 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成オリゴヌクレオチド 配列 ATGACCAAGC CCTACCGTAT CGGCCAGATC GTGC 34
【００３８】配列番号：８ 配列の長さ：27 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成オリゴヌクレオチド 配列 TCAGTAGGCG CCCGACAGCA AGGCGCC 27
【００３９】配列番号：９ 配列の長さ：21 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド フラグメント型：Ｎ末端フラグメント 起源： 生物名：Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅ
ｎｓ 株名：ＮＳＭ−４ 配列 Met Thr Lys Pro Tyr Arg Ile Gly Gln Ile Val Pro Ser Ser Asn Thr 1 5 10 15 Thr Met Glu Thr Glu 20 21
【００４０】配列番号：１０ 配列の長さ：11 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド フラグメント型：中間部フラグメント 配列 Val Pro Ser Ser Asn Thr Thr Met Glu Thr Glu 1 5 10 11
【００４１】配列番号：１１ 配列の長さ：32 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成オリゴヌクレオチド 配列の特徴 存在位置：3 他の情報：N=i 存在位置：6 他の情報：N=i 存在位置：１２ 他の情報：Ｎ＝ｉ 存在位置：18 他の情報：N=i 存在位置：21 他の情報：N=i 存在位置：30 他の情報：N=i 配列 GTNCCNAGCT CNAACACNAC NATGGAAACN GA 32
【００４２】配列番号：１２ 配列の長さ：51 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：genomicDNA 起源： 生物名：Pseudomonas fluorescens 株名：NSM-4 配列 ATG ACC AAG CCT ACC GTA TCG GCC AGA TCG TGC CGA GTT CGA ACA CCA 48 CCA 51
【００４３】配列番号：１３ 配列の長さ：20 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド フラグメント型：Ｎ末端フラグメント 起源： 生物名：Citrobacter ama1onaticus 株名：NSM-10 配列 Met Lys Ser Phe Arg Ile Gly Gln Ile Val Pro Ser Ser Asn Thr Thr 1 5 10 15 Met Glu Thr Glu 20
【００４４】配列番号：１４ 配列の長さ：60 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：genomicDNA 起源： 生物名：Citrobacter ama1onaticus 株名：NSM-10 配列 ＡＴＧ ＡＡＡ ＡＧＴ ＴＴＴ ＣＧＡ ＡＴＣ ＧＧＣ ＣＡＡ ＡＴＣ
ＧＴＴ ＣＣＣ ＡＧＣ ＴＣＣ ＡＡＴ ＡＣＴ ＡＣＡ ４８ ＡＴＧ ＧＡＧ ＡＣＡ ＧＡＡ
６０
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 ＦＩ (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 9/90 Ｃ１２Ｒ 1:19）

Claims (5)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 以下の（ａ）又は（ｂ）のタンパク質を
    コードするＤＮＡ。 （ａ）配列番号１又は配列番号２で表されるアミノ酸配
    列からなるタンパク質。 （ｂ）アミノ酸配列（ａ）においてアミノ酸が欠失、置
    換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつマレ
    イン酸異性化酵素活性を有するタンパク質。
  2. 【請求項２】 ＤＮＡが配列番号３又は配列番号４で表
    される塩基配列であることを特徴とする請求項１記載の
    ＤＮＡ。
  3. 【請求項３】 請求項１又は２記載のＤＮＡのいずれか
    を含む組換えベクター。
  4. 【請求項４】 請求項３記載の組換えベクターにより形
    質転換された形質転換体。
  5. 【請求項５】 請求項４記載の形質転換体を培地中で培
    養して培養物からマレイン酸異性化酵素を採取すること
    を特徴とするマレイン酸異性化酵素の製造方法。
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