JPH07327669A - サルファ剤耐性株を用いるバクテリアセルロースの製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【構成】 セルロース生産性酢酸菌に属するサルファ剤
耐性株及び該耐性株を培養し、培地中にセルロース性物
質を生成蓄積させ、該物質を回収することから成る該セ
ルロース性物質の製造方法。 【効果】 セルロース性物質を高収率かつ経済的に生産
することができる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、アセトバクター属に属
しセルロース性物質を生産する能力を有する微生物（こ
の微生物を以後「セルロース生産性酢酸菌」と称する）
に属するサルファ剤耐性株及び該株を用いるセルロース
性物質（バクテリアセルロース：ＢＣ）の製造方法に関
する。

【０００２】

【従来の技術】セルロース性物質は可食性であり食品分
野で利用されるほか水系分散性に優れているので食品、
化粧品又は塗料等の粘度の保持、食品原料生地の強化、
水分の保持、食品安定性向上、低カロリー添加物又は乳
化安定化助剤としての産業上利用価値がある。また、該
セルロース性物質の離解物はミクロフィブリルの構造的
物理的特徴に基づき高分子、特に水系高分子用補強剤と
して各種の産業用用途がある。このようなセルロース性
離解物を紙状または固型状に固化した物質は高い引張弾
性率を示すので、ミクロフィブリルの構造的特徴に基づ
くすぐれた機械特性が期待され、各種産業用素材として
の応用がある。

【０００３】従来より、アセトバクター属に属する微生
物を培養して、セルロースを生産する方法は知られてい
る。例えば、特開昭６２−２６５９９０号公報、特開昭
６１−２２１２０１号公報等に、その記載がある。セル
ロース生産性酢酸菌の培養を行なう際に適当とされてい
る栄養培地としては、炭素源、ペプトン、酵母エキス、
燐酸ナトリウム及びクエン酸からなる Schramm／Hestri
n 培地（Schramm ら、J. General Biology, ll, pp.123
〜129, l954 ）が知られている。しかしながら、上記栄
養培地で振盪もしくは通気攪拌培養を行なった場合、得
られるセルロース生産量は低く、生成速度も必ずしも満
足のいくものではなかった。また、上記栄養培地の他
に、コーンスチープリカー（ＣＳＬ）や麦芽エキス等を
加えた培地が知られているが、これら天然栄養素（ペプ
トン、酵母エキス、ＣＳＬ、麦芽エキスなど）に含まれ
る特定成分がセルロース生成促進に関与していることは
知られていない。培地中の特定栄養素によるセルロース
生成促進因子として、現在知られているものにはイノシ
トール、フィチン酸及びピロロキノリンキノン（ＰＱ
Ｑ）（特公平５−１７１８号公報；高井光男，紙パ技協
誌，第４２巻，第３号，第２３７〜２４４頁）等がある
が、セルロース生成量はまだ不十分であり、またこれら
の振盪もしくは通気攪拌培養における効果も明確ではな
かった。また、本出願人は、カルボン酸又はその塩（特
願平５−１９１４６７号）、インベルターゼ（特願平５
−３３１４９１号）及びメチオニン（特願平５−３３５
７６４号）を培地中に添加することによって、セルロー
ス性物質の生産性が向上することを見い出している。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、セル
ロース生産性酢酸菌を用いて、経済的かつ高収率でセル
ロース性物質を生産させる新たな方法を提供することに
ある。

【０００５】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記の目
的を達成するために種々の研究を行なった。特に、ＢＣ
生合成に関与する酵素の菌体内濃度を増加させるか、又
は該酵素の基質の菌体内濃度を増加させることでＢＣ生
合成能が強化できるのではないかとの考えに基づき、こ
のような酵素を阻害する阻害剤の存在下でも生育するこ
とができるような耐性株をスクリーニングすることで、
所望の酵素又はその基質濃度が増加した菌株を得ようと
試みた。驚くべきことに、各種実験の結果、Ｐ−アミノ
安息香酸と拮抗阻害し、ＢＣの前駆体であるＵＤＰ−Ｇ
ｌｕｃｏｓｅ（糖核酸）の核酸の生合成に関与する葉酸
の前駆体であるジヒドロプテロイン酸を合成する酵素で
あるジヒドロプテロイン酸シンターゼ（ＥＣ２．５．
１．１５）の阻害剤の一種であるサルファ剤に対するセ
ルロース生産性酢酸菌の耐性株を取得することにより上
記課題を達成することができたのである。即ち、本発明
は、セルロース生産性酢酸菌に属するサルファ剤耐性
株、該耐性株を培養し、培地中にセルロース、セルロー
ス性物質を生成蓄積せしめ該物質を採取することから成
るセルロース性物質の製造方法及び該製造方法により得
ることのできるセルロース性物質を提供する。

【０００６】本発明において使用されるサルファ剤耐性
株は、セルロース生産性酢酸菌、例えば、アセトバクタ
ー・スピーシーズ（Acetobacter sp. ）ＢＰＲ２００
１、アセトバクター・キシリナム（Acetobacter xylinu
m ）ＡＴＣＣ２３７６８、アセトバクター・キシリナム
ＡＴＣＣ２３７６９、アセトバクターパスツリアヌス
（A.pasteurianus）ＡＴＣＣ１０２４５、アセトバクタ
ーキシリナムＡＴＣＣ１４８５１、アセトバクターキシ
リナムＡＴＣＣ１１１４２及びアセトバクター・キシリ
ナムＡＴＣＣ１０８２１等、並びにそれらの菌株より各
種突然変異処理及び遺伝子組み換え技術などによって誘
導・育種して得られた菌株等にＮＴＧ（ニトロソグアニ
ジン）を用いた公知の方法によって化学的変異処理する
ことにより創製することができる。この中でも、アセト
バクター・スピーシーズＢＰＲ２００１（Acetobacter
sp. BPR2001)株と命名された株の分類学的性質は、形態
は桿菌、グラム染色性は陰性、胞子形成能は陰性、酸素
に対する態度は好気性、カタラーゼ反応陽性、オキシダ
ーゼ反応陰性、エタノールからの酢酸生成は陽性、酢酸
塩の酸化は陽性、乳酸塩の酸化は陽性であり、本発明の
サルファ剤耐性株の創製に好適である。従って、アセト
バクター・スピーシーズに属するサルファ剤耐性株が本
発明の好ましい態様の一つである。尚、アセトバクター
・スピーシーズＢＰＲ２００１株は、平成５年２月２４
日に通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所特許
微生物寄託センターに寄託され（受託番号ＦＥＲＭ Ｐ
−１３４６６）、その後１９９４年２月７日付で特許手
続上の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約に基づ
く寄託（受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−４５４５）に移管さ
れている。

【０００７】ＮＴＧ等の変異剤を用いての化学的変異処
理方法には、例えば、Bio Factors,Vol. l, p.297−302
(1988), J. Gen. Microbiol, Vol. 135, p.2917−292
9 (1989) 及び FEMS Microbiol Lett., Vol. 71, p.33
7−343 (1990)等に記載されているものがある。従っ
て、当業者であればこれら公知の方法に基づき本発明の
サルファ剤耐性株を得ることができる。本発明のサルフ
ァ剤耐性株は、他の変異方法、例えば放射線照射等によ
っても得ることができる。本発明で用いることのできる
サルファ剤の例としては、スルフィンキサゾール、スル
ファメチゾール、スルファジメトキシン、スルファモノ
メトキシン、スルファメトキサゾール及びサルファグア
ニジン等がある。この中でもサルファグアニジン（Ｓ
Ｇ）が好適に用いられる。該サルファ剤耐性株の一例で
あるＢＰＲ３００１Ｄ株は１９９４年５月２５日付で通
商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所特許微生物
寄託センターに寄託され、受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１４
３３０を付されている。尚、本発明の範囲が寄託された
この菌株に限定されないことは言うまでもない。ＢＰＲ
３００１Ｄ株は本発明の一具体例にすぎないものであ
り、セルロース生産性酢酸菌に属し、サルファ剤のみな
らずジヒドロプテロイン酸シンターゼを阻害する薬剤に
対して実質的に耐性を示す株であれば、本発明の「セル
ロース生産性酢酸菌に属するサルファ剤耐性株」に包含
されるものである。その他の例として、例えば同様にＢ
ＰＲ２００１株から得られたＢＰＲ３００１Ｅ及びＢＰ
Ｒ３００１Ｆ株がある。

【０００８】本発明の製造方法に用いる培地の組成物
中、炭素源としてはシュクロース、グルコース、フラク
トース、マンニトール、ソルビトール、ガラクトース、
マルトース、エリスリット、ガドニット、グリセリン、
エチレングリコール、エタノール等を単独或いは併用し
て使用することができる。更にはこれらのものを含有す
る澱粉水解物、シトラスモラセス、ビートモラセス、ビ
ート搾汁、サトウキビ搾汁、柑橘類を始めとする果汁等
をシュークロスに加えて使用することもできる。また、
窒素源としては硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、
リン酸アンモニウム等のアンモニウム塩、硝酸塩、尿素
等有機或いは無機の窒素源を使用することができ、或い
はＢａｃｔ−Ｐｅｐｔｏｎｅ、Ｂａｃｔ−Ｓｏｙｔｏｎ
ｅ、Ｙｅａｓｔ−Ｅｘｔｒａｃｔ、豆濃などの含窒素天
然栄養源を使用してもよい。有機微量栄養素としてアミ
ノ酸、ビタミン、脂肪酸、核酸、２，７，９−トリカル
ボキシ−１Ｈピロロ〔２，３−５〕−キノリン−４，５
−ジオンを添加してもよい。生育にアミノ酸等を要求す
る栄養要求性変異株を使用する場合には、要求される栄
養素を補添することが必要である。無機塩類としてはリ
ン酸塩、マグネシウム塩、カルシウム塩、鉄塩、マンガ
ン塩、コバルト塩、モリブデン酸塩、赤血塩、キレート
金属類等が使用される。

【０００９】培養のｐＨは３ないし７に、好ましくは５
付近に制御する。培養温度は１０〜４０℃、好ましくは
２５〜３５℃の範囲で行う。培養槽に供給する酸素濃度
は１〜１００％、望ましくは２１〜８０％であれば良
い。これら培地中の各成分の組成割合及び培地に対する
菌体の接種等は培養方法に応じて当業者が適宜選択し得
るものである。本発明の製造方法に於いてサルファ剤耐
性株を使用することにより、従来の方法と比較してセル
ロース性物質の収率が向上することが判明した。本発明
方法では、培養方法に制限を受けず、静置、振盪もしく
は通気攪拌培養のいずれでもよい。振盪もしくは通気攪
拌下での培養であってもセルロース生産性に影響を及ぼ
さないことも本発明方法の特徴の１つである。また、い
わゆる回分発酵法、フィード回分発酵法、反復回分発酵
法及び連続発酵法のいずれも使用することができる。更
に攪拌手段としては従来公知の手段、例えばインペラ
ー、エアーリフト発酵槽、発酵ブロスのポンプ駆動循
環、及びこれら手段の組合せ等から任意に選択すること
ができる。

【００１０】本発明の方法によって生成されるセルロー
ス性物質はそのまま回収してもよく、さらに本物質中に
含まれる菌体を始めとするセルロース性物質以外の物質
を取り除く処理をほどこしてもよい。不純物を取り除く
ためには水洗、加圧脱水、希酸洗浄、アルカリ洗浄トル
エン及び酢酸エチルなどの極性有機溶媒による処理、次
亜塩素酸ソーダ及び過酸化水素などの漂白剤による処
理、リゾチームなどの菌体溶解酵素による処理、ラウリ
ル硫酸ソーダ、デオキシコール酸などの界面活性剤によ
る処理、常温から２００℃の範囲の加熱洗浄などを単独
及び併用してほどこすことによりセルロース性物質から
不純物を除去することができる。このようにして得られ
た本発明でいうセルロース性物質とは、セルロース及
び、セルロースを主鎖としたヘテロ多糖を含むもの及び
β−１，３、β−１，２等のグルカンを含むものであ
る。ヘテロ多糖の場合のセルロース以外の構成成分はマ
ンノース、フラクトース、ガラクトース、キシロース、
アラビノース、ラムノース、グルクロン酸等の六炭糖、
五炭糖及び有機酸等である。なおこれ等の多糖が単一物
質である場合もあるし２種以上の多糖が水素結合等によ
り混在してもよい。

【００１１】

【実施例】以下の実施例により、本発明をさらに詳細に
説明する。実施例１ 以下に記載する方法で、ＢＰＲ２００１株を用いて本発
明のサルファ剤耐性株を創製した。ＢＰＲ２００１株の変異処理 菌体をＣＳＬ−Ｆｒｕ培地⁽¹⁾ で２８℃、３時間培養
し、菌体を増した。この前培養液を集菌後、１０mM燐酸
緩衝液（ｐＨ６．０）で洗浄し、１０μｇNTG/ml（１０
mM燐酸緩衝液）中で３０℃、３０分間で変異処理した。
変異処理した菌体を集菌し、前記のように洗浄し、次に
ＣＳＬ−Ｆｒｕ培地で２８℃、一夜培養し変異を固定化
した。この結果、生存率約０．２４％で変異株を得た。サルファグアニジン（ＳＧ）耐性株の取得 上記で変異処理したＢＰＲ２００１株（約５０００コロ
ニー）を最小培地⁽²⁾１ml当たりＳＧ５００μｇを含む
プレートに塗抹した。（約３３０コロニー／プレート） ２８℃、７日間培養し出現したコロニーのうち、明らか
に生育の悪いもの（コロニーの小さいもの）、ＢＣの生
産の低いもの（副生多糖を多量に生産しコロニーが透明
なもの）を除き、４１株を得た。

【００１２】実施例２ 実施例１で得られた４１株につき、以下の方法で培養を
行ない、ＢＣ蓄積量及び対消費糖収率を求めた。前培養
として、５０mlＣＳＬ−Ｆｒｕ培地の入った２５０ml容
ルーフラスコに菌株を植菌し、２８℃、３日間静置培養
した。次に、ルーフラスコを良く振り菌膜から菌体を剥
し、この菌液を６８mlＣＳＬ−Ｆｒｕ培地の入った３０
０ml容三角フラスコ（バッフル付き）に７．５ml植菌し
た。２８℃、４日間、１５０rpm で振盪することによっ
て本培養した。この結果、以下に示すように、特にサル
ファ剤耐性株３株がＢＰＲ２００１株に較べて優れたＢ
Ｃ生産性を示すことが判った。

【００１３】

【表１】

【００１４】

【表２】

【００１５】

【表３】ビタミン混合物 化 合 物 ｍｇ／Ｌ イノシトール ２００ ナイアシン ４０ ピリドキシンＨＣｌ ４０ チアミンＨＣｌ ４０ パントテン酸カルシウム ２０ リボフラビン ２０ ｐ−アミノ安息香酸 ２０ 葉 酸 ０．２ ビオチン ０．２

【００１６】

【表４】 上記の無機培地１００mlに当たり２．０ｇの寒天を加え
た物をプレートとする。

【００１７】尚、上の表１中、ＢＣ蓄積量（ｇ／ｌ）
は、培養終了後、培養液中の固形物を集積し、水洗して
培地成分を除去した後、１ＮＮａＯＨ水溶液中で８０
℃、２０分間処理して菌体を除去した。さらに、洗浄液
が中性付近になるまで生成セルロースを水洗した後、８
０℃で１２時間真空乾燥して乾燥重量を測定することで
求めた。また収率（％）は以下のようにして求めた。 対消費糖収率（％）の計算 対消費糖収率は、対消費糖収率として以下のように計算
した。

【数１】Ｙ_BC＝ＢＣ／（ＲＣ_MF−ＲＣ_BF）＊１００ Ｙ_BC ：対消費糖収率（％） ＢＣ ：ＢＣ蓄積量（ｇ／ｌ） ＲＣ_MF：培地の糖濃度（ｇ／ｌ） ＲＣ_BF：培養後の培地の糖濃度（ｇ／ｌ）

【００１８】

【発明の効果】本発明方法によるセルロース性物質の生
産において、セルロース生産性酢酸菌のサルファ剤耐性
株を用いることによって、セルロース性物質の生産性が
従来法と比べて著しく向上する。このことは、本発明方
法がセルロース性物質を効率よくかつ安価に製造できる
ことを示している。

Claims (4)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 セルロース生産性酢酸菌に属するサルフ
   ァ剤耐性株。
2. 【請求項２】 セルロース生産性酢酸菌に属するサルフ
   ァグアニジン耐性株。
3. 【請求項３】 請求項１又は２に記載の耐性株を培養
   し、培地中にセルロース性物質を生成蓄積させ、該物質
   を回収することから成る該セルロース性物質の製造方
   法。
4. 【請求項４】 請求項３の方法によって得ることのでき
   るセルロース性物質。