JPH07327680A - 新規プラスミド及びそれを用いる変異株の取得方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【構成】 （ａ）コリネ型細菌内で自律複製できず、
（ｂ）指標遺伝子ＤＮＡの５’−側上流および３’−側
下流に、コリネ型細菌由来の挿入配列中のオープンリー
ディングフレームの５’−側上流および３’−側下流に
存在するインバーティッドリピートの少くとも一方のイ
ンバーティッドリピートを有するＤＮＡ領域と、（ｃ）
コリネ型細菌由来の挿入配列中のオープンリーディング
フレームを含むＤＮＡ領域を保有するプラスミドおよび
これを用いるコリネ型細菌変異株の取得方法。 【効果】 本発明ので得られる変異株を用いて、例え
ば、各種アミノ酸要求株を単離し、これらの変異株の染
色体ＤＮＡを抽出し、指標遺伝子の発現を指標にしてア
ミノ酸生合成系に関与する遺伝子を簡便に単離すること
ができる。また、蛋白質分解活性が低下した株を選出
し、これを宿主としてさまざまの酵素を細胞内発現させ
れば、野性型の宿主に比べて酵素が安定に保持され、物
質生産を効率よく行わせることが可能になる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、新規なプラスミドに関
し、さらに詳しくはコリネ型細菌由良の挿入配列のＤＮ
Ａ領域を保有する組換えプラスミド及びそれを用いるコ
リネ型細菌変異株の取得方法に関する。挿入配列やトラ
ンスポゾンのような転位因子は、原核細胞、真核細胞に
おいて見いだされる遺伝因子である。転位因子は、それ
自体を染色体上のいろいろな部位に転位・挿入できる能
力を有しており、細菌の育種改良等に利用可能な、産業
上有用性の高い遺伝因子である。

【０００２】

【従来の技術】微生物における転位配列の１つである挿
入配列には、いくつかの特徴がある。およそ１〜２ｋｂ
の大きさを有しており、その両端にはインヴァーテッド
リピート（逆方向反復配列）が存在している。また、微
生物染色体に挿入されるときには、ターゲットとなる配
列の重複が生じる。

【０００３】微生物の挿入配列は、大腸菌由来のもの
〔Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．ｖｏｌ．１２２，２６
７〜２７７（１９７３）〕、赤痢菌由来のもの〔Ｊ．Ｂ
ａｃｔｅｒｉｏｌ．ｖｏｌ．１７２，４０９０〜４０９
９（１９９０）〕、酢酸菌由来のもの〔Ｍｏｌ．Ｍｉｃ
ｒｏｂｉｏｌ．ｖｏｌ．９，２１１〜２１８（１９９
３）〕、マイコプラズマ由来のもの〔Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒ
ｏｂ．ｖｏｌ．７，５７７〜５８４（１９９３）〕、等
において良く研究されているが、コリネ型細菌由来の挿
入配列に関する従来の知見はなかった。

【０００４】本発明者等は先に、ある種のコリネ型細菌
から新たに挿入配列が単離可能なことを見い出し、その
塩基配列を決定し、提案した（特願平５−２４８４５９
明細書参照）。転位因子を用いる各種変異株の作製及び
遺伝子機能の解析法は、大腸菌において良く研究されて
いるが、コリネ型細菌での研究は遅れており、その手法
の確立が求められている。

【０００５】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、産業上重要
なコリネ型細菌において、転位因子を利用して、簡便に
変異株を作成する手法の開発を目的としてなされたもの
である。

【０００６】

【課題を解決するための手段】本発明者等は、上記課題
を解決すべく鋭意研究を重ねた結果、本発明者らが先に
提案したコリネ型細菌由来の挿入配列を用いてプラスミ
ドを造成し、このプラスミドを用いてコリネ型細菌を形
質転換することにより、簡便に変異株が取得可能なこと
を見い出し、本発明を完成するに至った。

【０００７】かくして本発明によれば、 （１）（ａ）コリネ型細菌内で自律複製できず、（ｂ）
指標遺伝子ＤＮＡの５′-側上流および３′-側下流に、
コリネ型細菌由来の挿入配列中のオープンリーディング
フレームの５′-側上流および３′-側下流に存在するイ
ンバーティッドリピートの少くとも一方のインバーティ
ッドリピートを有するＤＮＡ領域と、（ｃ）コリネ型細
菌由来の挿入配列中のオープンリーディングフレームを
含むＤＮＡ領域を保有することを特徴とするプラスミド （２）このプラスミドを用いてコリネ型細菌を形質転換
し、形質転換株の指標遺伝子の発現を指標として、指標
遺伝子の発現株を分離することを特徴とする変異株の取
得方法が提供される。

【０００８】以下、本発明についてさらに詳細に説明す
る。本発明で用いる「挿入配列」とは、コリネ型細菌染
色体上に存在しており、染色体上もしくはプラスミド上
に転位することが可能なＤＮＡ塩基配列を意味するもの
である。本発明で用いる挿入配列（以下、これを「Ａ断
片」と略称することがある）を、供給源微生物であるコ
リネ型細菌から調製するための基本操作の一例を述べれ
ば次のとおりである：

【０００９】Ａ断片は、上記コリネ型細菌、例えばコリ
ネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ３１８３１株の
染色体上に存在し、本菌株を、枯草菌由来のｓａｃＢ遺
伝子を有しコリネ型細菌内で複製可能なプラスミド、例
えばプラスミドｐＣＲＹ３０−ｓａｃＢを用いて形質転
換し、シュークロースを含有するプレート上に塗抹し、
生育してくるシュークロース耐性株よりプラスミドを抽
出することにより、分離取得することができる。

【００１０】先ず、枯草菌、例えばマールバーグ（Ｍａ
ｒｂｕｒｇ）株〔Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒ
ｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，Ｖｏｌ．１１９，７９５〜８０
０（１９８４）〕の培養物から染色体ＤＮＡを抽出す
る。この染色体ＤＮＡを鋳型として、既知のｓａｃＢお
よびｓａｃＲ（ｓａｃＢ遺伝子の発現制御遺伝子）遺伝
子を含む領域をＰＣＲ法〔Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈ
ａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ法；Ｍｉｃｈａｅｌ Ａ．Ｉ
ｎｎｉｓ，ＰＣＲプロトコールズ（ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏ
ｃｏｌｓ），Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ Ｉｎｃ．
刊（１９９０）〕により増幅単離する。該増幅ＤＮＡ断
片を大腸菌−コリネ型細菌のシャトルベクターに導入
し、このベクターを用いて大腸菌（エシェリヒア・コ
リ）ＪＭ１０９（宝酒造社製）を形質転換し、形質転換
体を取得する。

【００１１】得られる形質転換体よりプラスミドＤＮＡ
を抽出し、本プラスミドを用いてコリネ型細菌、例えば
コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ３１８３１
を形質転換し、シュークロースを含有するプレート上に
生育してくるシュークロース耐性株よりプラスミドを抽
出する。これらのプラスミドのうち、もとのプラスミド
よりサイズが大きくなっているものを選択し、本プラス
ミドのｓａｃＢおよびｓａｃＲ遺伝子領域に挿入されて
いるＤＮＡ断片を単離することにより、Ａ断片を分離取
得することができる。

【００１２】ここで、本発明のＡ断片の機能について
は、例えば、もともとコリネ型細菌染色体上に存在し、
形質転換に用いたプラスミド上には存在しなかったＤＮ
Ａ断片が、ある条件下において、染色体上からプラスミ
ド上に転位してくる現象を観察することによって確認で
きる。また逆に、プラスミド上に転位した挿入配列を染
色体上に転位させることによってＡ断片の機能をさらに
確認することができる。

【００１３】このようにして得られるＡ断片の一つとし
ては、上記コリネ型細菌、例えばコリネバクテリウム・
グルタミカムＡＴＣＣ３１８３１株の染色体ＤＮＡ上に
存在し、大きさが約１．５ｋｂの断片を挙げることがで
きる。この約１．５ｋｂの挿入配列を、各種の制限酵素
で切断したときの認識部位数および切断断片の大きさを
下記第１表に示す。

【００１４】

【表１】 第１表 制限酵素 認識部位数 切断断片の大きさ（ｋｂ） ＢａｍＨＩ ２ ０．９、 ０．５、 ０．１ ＨｉｎｄIII ２ １．０、 ０．４、 ０．１ ＮｃｏＩ １ ０．８、 ０．７ Ｎｓｐ（７５２４）Ｉ １ １．１、 ０．４

【００１５】なお、本明細書において、制限酵素による
「認識部位数」は、ＤＮＡ断片又はプラスミドを制限酵
素で完全消化し、それらの消化物をそれ自体既知の方法
に従って１％アガロースゲル電気泳動および４％ポリア
クリルアミドゲル電気泳動に供し、分離可能な断片の数
から決定した値を採用した。

【００１６】また、「切断断片の大きさ」およびプラス
ミドの大きさは、アガロースゲル電気泳動を用いる場合
には、大腸菌のラムダファージ（λ ｐｈａｇｅ）のＤ
ＮＡを制限酵素ＨｉｎｄIII で切断して得られる分子量
既知のＤＮＡ断片の同一アガロースゲル上での泳動距離
で描かれる標準線に基づき、また、ポリアクリルアミド
ゲル電気泳動を用いる場合には、大腸菌のファイ・エッ
クス１７４ファージ（φ×１７４ ｐｈａｇｅ）のＤＮ
Ａを制限酵素ＨａｅIII で切断して得られる分子量既知
のＤＮＡ断片の同一ポリアクリルアミドゲル上での泳動
距離で描かれる標準線に基づき、切断ＤＮＡ断片又はプ
ラスミドの各ＤＮＡ断片の大きさを算出する。プラスミ
ドの大きさは、切断断片のそれぞれの大きさを加算して
求める。なお、各ＤＮＡ断片の大きさの決定において、
１ｋｂ以上の断片の大きさについては、１％アガロース
ゲル電気泳動によって得られる結果を採用し、約０．１
ｋｂから１ｋｂ未満の断片の大きさについては４％ポリ
アクリルアミドゲル電気泳動によって得られる結果を採
用した。

【００１７】一方、上記のコリネバクテリウム・グルタ
ミカムＡＴＣＣ３１８３１の染色体ＤＮＡ由来の挿入配
列の塩基配列は、プラスミドｐＵＣ１１８またはｐＵＣ
１１９（宝酒造社製）を用いるジデオキシヌクレオチド
酵素法〔ｄｉｄｅｏｘｙ ｃｈａｉｎ ｔｅｒｍｉｎａ
ｔｉｏｎ法、Ｓａｎｇｅｒ，Ｆ．ｅｔ．ａｌ．，Ｐｒｏ
ｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，Ｖｏｌ．７
４，５４６３（１９７７）〕により決定することができ
る。このようにして決定した上記約１．５ｋｂのＤＮＡ
断片の塩基配列を有する挿入配列は、後記配列表の配列
番号１に示す配列を有するものである。

【００１８】上記の塩基配列を包含する本発明で用いる
挿入配列は、天然のコリネ型細菌染色体ＤＮＡから分離
されたもののみならず、通常用いられるＤＮＡ合成装
置、例えばアプライド・バイオシステムズ（Ａｐｐｌｉ
ｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）社製、モデル３９４ＤＮ
Ａ／ＲＮＡシンセサイザーを用いて合成されたものであ
ってもよい。

【００１９】また、前記の如くコリネバクテリウム・グ
ルタミカムＡＴＣＣ３１８３１の染色体ＤＮＡから取得
される本発明で用いる挿入配列は、前記挿入配列の機能
を実質的に損なうことがない限り、塩基配列の一部の塩
基が他の塩基と置換されていてもよく又は削除されてい
てもよく、或いは新たに塩基が挿入されていてもよく、
さらに塩基配列の一部が転位されているものであっても
よく、これらの誘導体のいずれもが、本発明で用いる挿
入配列に包含されるものである。

【００２０】ここで、本発明のＡ断片の単離に用いる枯
草菌由来のｓａｃＢ遺伝子を有しコリネ型細菌内で複製
可能なプラスミド、例えばプラスミドｐＣＲＹ３０−ｓ
ａｃＢの構築方法、該プラスミドで形質転換しうるコリ
ネ型細菌、該形質転換体の培養法等について述べる。

【００２１】先ず、ｓａｃＢおよびｓａｃＲ遺伝子領域
が導入可能な大腸菌−コリネ型細菌のシャトルベクター
としては、例えば、特開平３−２１０１８４号公報に記
載のプラスミドｐＣＲＹ３０；特開平２−２７６５７５
号公報に記載のプラスミドｐＣＲＹ２１、ｐＣＲＹ２Ｋ
Ｅ、ｐＣＲＹ２ＫＸ、ｐＣＲＹ３１、ｐＣＲＹ３ＫＥお
よびｐＣＲＹ３ＫＸ；特開平１−１９１６８６号公報に
記載のプラスミドｐＣＲＹ２およびｐＣＲＹ３；特開昭
５８−６７６７９号公報に記載のｐＡＭ３３０；特開昭
５８−７７８９５号公報に記載のｐＨＭ１５１９；特開
昭５８−１９２９００号公報に記載のｐＡＪ６５５、ｐ
ＡＪ６１１およびｐＡＪ１８４４；特開昭５７−１３４
５００号公報に記載のｐＣＧ１；特開昭５８−３５１９
７号公報に記載のｐＣＧ２；特開昭５７−１８３７９９
号公報に記載のｐＣＧ４およびｐＣＧ１１等を用いるこ
とができる。

【００２２】上記プラスミドベクターｐＣＲＹ３０を調
製する方法としては、ブレビバクテリウム・スタチオニ
ス（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｔａｔｉｏｎｉ
ｓ）ＩＦＯ１２１４４（ＦＥＲＭ ＢＰ−２５１５）か
らプラスミドｐＢＹ５０３（特開平１−９５７８５号公
報参照）ＤＮＡを抽出し、制限酵素ＸｈｏＩでプラスミ
ドの複製増殖機能を司る遺伝子を含む大きさが約４．０
ｋｂのＤＮＡ断片（複製機能領域）を切り出し、制限酵
素ＥｃｏＲＩおよびＫｐｎＩで大きさが約２．１ｋｂの
プラスミドの安定化機能を司る遺伝子を含むＤＮＡ断片
（安定化機能領域）を切り出す。これらの両断面をプラ
スミドｐＨＳＧ２９８（宝酒造社製）のＥｃｏＲＩ−Ｋ
ｐｎＩ部位およびＳａｌＩ部位に組み込むことにより、
プラスミドベクターｐＣＲＹ３０を調製することができ
る。

【００２３】次に、上記大腸菌−コリネ型細菌のシャト
ルベクターへのｓａｃＢおよびｓａｃＲ遺伝子領域の導
入は、例えば、プラスミドベクター中に１個所だけ存在
する制限酵素部位を該制限酵素で開裂し、前記Ａ断片お
よび開裂したシャトルベクターを必要に応じてＳ１ヌク
レアーゼで処理して平滑末端とするか、または適当なア
ダプターＤＮＡの存在下で、ＤＮＡリガーゼ処理でそれ
らを連結させることにより行うことができる。

【００２４】例えば、上記プラスミドｐＣＲＹ３０への
ｓａｃＢおよびｓａｃＲ遺伝子領域を含むＤＮＡ断片の
導入は、該遺伝子領域を切断しない制限酵素、例えばＢ
ａｍＨＩサイトを、ＰＣＲ法により該遺伝子領域を増幅
させるときに使用するプライマーの末端にこの制限酵素
部位を付加しておき、該遺伝子領域の増幅ＤＮＡ断片を
制限酵素ＢａｍＨＩで処理したものと、プラスミドｐＣ
ＲＹ３０を制限酵素ＢａｍＨＩで開裂させたものをＤＮ
Ａリガーゼで連結させることにより行うことができる。

【００２５】このプラスミドを用いて、前記のとおり大
腸菌（エシェリヒア・コリ）ＪＭ１０９（宝酒造社製）
を形質転換し、形質転換体を取得し、該形質転換体から
プラスミドＤＮＡを抽出することにより、本発明のＡ断
片の単離に用いる枯草菌由来のｓａｃＢ遺伝子を有しコ
リネ型細菌内で複製増殖可能なプラスミドを構築するこ
とができる。

【００２６】このようにして構築される、プラスミドｐ
ＣＲＹ３０に大きさが約２．０ｋｂのｓａｃＢおよびｓ
ａｃＲ遺伝子領域が導入された組換えプラスミドを、ｐ
ＣＲＹ３０−ｓａｃＢと命名した。プラスミドｐＣＲＹ
３０−ｓａｃＢの作製方法の詳細については、後記実施
例１で説明する。

【００２７】上記枯草菌由来のｓａｃＢ遺伝子を有しコ
リネ型細菌内で複製増殖可能なプラスミドで形質転換し
うる宿主コリネ型細菌としては、コリネバクテリウム・
グルタミカムＡＴＣＣ３１８３１、ブレビバクテリウム
・フラバムＭＪ−２３３（ＦＥＲＭ ＢＰ−１４９７）
およびその由来株、ブレビバクテリウム・アンモニアゲ
ネス（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｍｍｏｎｉａ
ｇｅｎｅｓ）ＡＴＣＣ６８７１、同ＡＴＣＣ１３７４
５、同ＡＴＣＣ１３７４６；ブレビバクテリウム・デバ
リカタム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｄｉｖａｒ
ｉｃａｔｕｍ）ＡＴＣＣ１４０２０；ブレビバクテリウ
ム・ラクトファーメンタム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉ
ｕｍ ｌａｃｔｏｆｅｒｍｅｎｔｕｍ）ＡＴＣＣ１３８
６９等を宿主コリネ型細菌として用いることができる。
これらコリネ型細菌は、本発明で用いる挿入配列の供給
源微生物としても用いることができる。本発明のＡ断片
の単離には、上記コリネ型細菌の中でコリネバクテリウ
ム・グルタミカムＡＴＣＣ３１８３１を供給源微生物及
び宿主として用いるのが最も好ましい。

【００２８】上記宿主コリネ型細菌の前記組換えプラス
ミドによる形質転換は、それ自体既知の方法、例えばＣ
ａｌｖｉｎ，Ｎ．Ｍ．ａｎｄ Ｈａｎａｗａｌｔ，Ｐ．
Ｃ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇ
ｙ，Ｖｏｌ．１７０，２７９６（１９８８）；Ｉｔｏ，
Ｋ．，Ｎｉｓｈｉｄａ，Ｔ．ａｎｄ Ｉｚａｋｉ．
Ｋ．，Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ ａｎｄ Ｂｉｏｌｏ
ｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，５２，２９３（１９
８８）等の文献に記載の方法により、例えば宿主微生物
にパルス波を通電〔Ｓａｔｏｈ，Ｙ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ
ｏｕｒｎａｌ ｏｆＩｎｄｕｓｔｒｉａｌ Ｍｉｃｒｏ
ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．５，１５９（１９９０）参
照〕することにより行うことができる。

【００２９】かくして得られる形質転換体を、前記のと
おり、シュークロースを２〜１５％含有するプレート上
に塗抹して培養し、生育してくる各シュークロース耐性
株を液体培養し、培養物よりそれ自体既知の通常用いら
れる方法、例えばアルカリ−ＳＤＳ法等によりプラスミ
ドを抽出し、該プラスミドを適当な制限酵素により解析
し、もとのプラスミドよりサイズが大きいプラスミドを
選択し、該プラスミドのｓａｃＢおよびｓａｃＲ遺伝子
領域に挿入されているＤＮＡ断片を単離することにより
本発明で用いるＡ断片を分離取得することができる。

【００３０】ここで上記形質転換体の培養は炭素源、窒
素源、無機塩等を含む通常の栄養培地で行うことがで
き、炭素源としては、シュークロースを用いる。窒素源
としては、例えばアンモニア、硫酸アンモニウム、塩化
アンモニウム、硝酸アンモニウム、尿素等をそれぞれ単
独もしくは混合して用いる。また、無機塩としては、例
えばリン酸−水素カリウム、リン酸二水素カリウム、硫
酸マグネシウム等を用いる。この他にペプトン、肉エキ
ス、酵母エキス、コーンスティープリカー、カザミノ
酸、ビオチン等の各種ビタミン等の栄養素を培地に添加
することができる。

【００３１】培養は、通常、通気攪拌や振盪等（液体培
養の場合）の好気条件下に、約２５℃〜約３５℃の温度
で行うことができる。培養途中のｐＨは７〜８付近とす
ることができ、培養中のｐＨ調整は酸又はアルカリを添
加して行うことができる。培養開始等の炭素源濃度は、
５〜１２容量％である。かくして得られる培養物を、前
記のとおりシュークロースを２〜１５％含有するプレー
ト上に塗抹して３３℃で１〜３日間培養することによ
り、Ａ断片が導入されたシュークロース耐性株を取得す
ることができ、このシュークロース耐性株より、前記し
たとおりＡ断片を分離取得し、その塩基配列を決定する
ことができる。

【００３２】かくして決定された塩基配列（例えば、配
列番号１に示される塩基配列）に基づき、その配列の中
で転位機能を司るオープンリーディングフレーム（以下
これを「ＯＲＦ」と略称することがある）部分（例え
ば、配列番号４に示される塩基配列）を含むＤＮＡ領域
（ｃ）と、ＯＲＦの５′-側上流および３′-側下流に存
在するインヴァーテッドリピート（例えば、配列番号２
および３に示される塩基配列）の少くとも一方のインヴ
ァーテッドリピートを指標遺伝子ＤＮＡの５′-側上流
および３′-側下流に結合したＤＮＡ領域（ｂ）とを、
コリネ型細菌内で複製増殖可能を司る遺伝子を保有しな
い適当なクローニングベクターに導入することにより、
本発明のプラスミドを造成することができる。

【００３３】このプラスミドを用いてコリネ型細菌を形
質転換し、指標遺伝子の発現株を分離すれば、指標遺伝
子が宿主コリネ型細菌染色体上に挿入・転位した変異株
を取得することができる。本発明のプラスミドの造成に
用いるコリネ型細菌由来の挿入配列中のインヴァーテッ
ドリピートおよびＯＲＦとしては、それぞれ配列番号２
又は３、および４に示される配列のみならず、前記した
とおり、挿入配列のインヴァーテッドリピート又はＯＲ
Ｆの機能を実質的に損なうことがない限り、塩基配列の
一部の塩基が他の塩基と置換されていてもよく又は削除
されていてもよく、或いは新たに塩基が挿入されていて
もよく、さらに塩基配列の一部が転位されているもので
あってもよく、これらの誘導体のいずれもが、本発明プ
ラスミドの造成に用いることができる。

【００３４】また、指標遺伝子としては、その遺伝子の
発現により、指標遺伝子の宿主への導入の指標（マーカ
ー）となり得る遺伝子であれば特に制限はなく、例え
ば、各種の薬剤耐性遺伝子、β−ガラクトシダーゼ遺伝
子（ファルマシア社製）等を挙げることができる。さら
に薬剤耐性遺伝子の具体例としては、カナマイシン耐性
遺伝子（ファルマシア社製）、クロラムフェニコール耐
性遺伝子（ファルマシア社製）等があげられる。

【００３５】上記指標遺伝子の発現は、次の通り確認す
ることができる。指標遺伝子が薬剤耐性遺伝子である場
合はその薬剤を含有する選択培地で培養し、形質転換株
の薬剤感受性を調べることで容易に行うことができる。
また形質転換株を通常用いられる培地で培養し、培地中
の指標遺伝子の発現産物を、指標遺伝子の発現産物の性
質を利用して調べることもできる。例えば、指標遺伝子
がβ−ガラクトシダーゼである場合は、β−ガラクトシ
ダーゼの基質となる５−ブロモ−４−クロロ−３−イン
ドリル−β−Ｄ−ガラクトシダーゼ（Ｘ−ｇａｌ）を含
有する選択培地で培養し、形質転換株の形成するコロニ
ーの色、即ち、β−ガラクトシダーゼの発現によりＸ−
ｇａｌが分解され、コロニーが青色を呈色することによ
り判別することができる。

【００３６】上記した各ＤＮＡ領域〔（ｂ）および
（ｃ）〕を導入することができるクローニングベクター
としては、エシェリヒア・コリ内で複製増殖機能を司る
遺伝子を保有し、コリネ型細菌内で複製増殖機能を司る
遺伝子を保有しないプラスミドであれば特に制限がな
く、例えばプラスミドｐＨＳＧ３９８（宝酒造社製）、
ｐＭＷ２１８（日本ジーン社製）等を用いることができ
る。

【００３７】次に、上記した本発明のプラスミドの一例
を述べる。先ず、コリネ型細菌より単離し、その塩基配
列を決定した前記挿入配列（配列番号１）の５′-側上
流および３′-側下流に存在するインヴァーテッドリピ
ートのうちどちらか一方の２４ｂｐの配列を有するプラ
イマーにより、挿入配列をＰＣＲ法により増幅する。増
幅した挿入配列は末端に完全なインヴァーテッドリピー
トを有している。これをプラスミドｐＨＳＧ３９８（宝
酒造社製）のＳｍａＩサイトに挿入した後、挿入配列上
のＯＲＦを制限酵素ＮｈｅＩおよびＮａｅＩにより欠失
させ、代わりに、指標遺伝子として用いるカナマイシン
耐性遺伝子カセット（ファルマシア製）で置き換える。

【００３８】一方、挿入配列上のＯＲＦを含みインヴァ
ーテッドリピートより内側の部分をＰＣＲにより増幅さ
せ、プラスミドｐＨＳＧ３９８のＳｍａＩサイトにｌａ
ｃプロモーターと同じ向きに挿入したプラスミドを作製
する。このプラスミドのＸｂａＩサイトに、先のプラス
ミド由来のＸｂａＩ−ＳａｃＩ断片を挿入すると、図３
に示す、ｌａｃプロモーター下流に、挿入配列上のＯＲ
Ｆと、両端にインヴァーテッドリピートを有するカナマ
イシン耐性遺伝子が、同じ方向に挿入されたプラスミド
ｐＭＶ２３が作製できる。

【００３９】このプラスミドｐＭＶ２３を用いて形質転
換を行うと、ＯＲＦにコードされる蛋白質の機能によ
り、その５′-側上流および３′-側下流にインヴァーテ
ッドリピートを有する指標遺伝子（カナマイシン耐性遺
伝子）が宿主コリネ型細染色体上のさまざまな位置に転
位可能になる。さらにこの指標遺伝子は、染色体上に挿
入された後、ＯＲＦをもたないため、それ以上転位挿入
を繰り返すことができず、安定に染色体上に保持され
る。

【００４０】本発明のプラスミドを用いて形質転換しう
る宿主コリネ型細菌としては、前記したものを挙げるこ
とができる。これらコリネ型細菌の中で、染色体・プラ
スミドの複製・修復・組み換えに関与するｒｅｃＡ遺伝
子欠損株を用いると、変異株取得率が向上し、特に宿主
として好ましい。上記ｒｅｃＡ遺伝子欠損株は、コリネ
型細菌由来のｒｅｃＡ遺伝子部分断片を用いて、次のと
おり作製することができる。

【００４１】ｒｅｃＡ遺伝子は、上記コリネ型細菌、例
えばブレビバクテリウム・フラバム（Ｂｒｅｖｉｂａｃ
ｔｅｒｉｕｍ ｆｌａｖｕｍ）ＭＪ−２３３（ＦＥＲＭ
ＢＰ−１４９７）株の染色体上に存在し、この染色体
の中から、以下に述べる方法で分離・取得することがで
きる。先ず、ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ−２３
３株の培養物から染色体ＤＮＡを抽出する。この染色体
を鋳型として、エシェリヒア・コリ及び枯草菌由来ｒｅ
ｃＡ遺伝子の共通領域配列をプライマーとして用いる前
記ＰＣＲ法で該遺伝子断片を増幅する。

【００４２】プライマーは、エシェリヒア・コリ及び枯
草菌由来のｒｅｃＡ遺伝子共通領域配列の中から１８〜
２７ｍｅｒ、好ましくは２０〜２３ｍｅｒの塩基配列を
選択し合成することができる。合成は、通常用いられる
ＤＮＡ合成機、例えばアプライドバイオシステムズ（Ａ
ｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）社製、モデル３
９４ＤＮＡ／ＲＮＡシンセサイザーを用いて行うことが
できる。

【００４３】ＰＣＲにおけるプライマーの量は反応当た
り、０．０５〜０．５μＭ、好ましくは０．２５μＭを
用いる。ＰＣＲの条件は、デナチュレーション工程が９
４℃で３０〜６０秒、好ましくは６０秒、アニーリング
工程が５５℃で３０〜１２０秒、好ましくは５５℃で１
２０秒、エクステンション工程は７２℃で６０〜１８０
秒、好ましくは７２℃で１２０秒であり、これらの工程
を１サイクルとして、２５〜４０サイクル、好ましくは
３０サイクル行い、大きさが約０．３ｋｂのＤＮＡ断片
を増幅することができる。増幅ＤＮＡ断片は、前記アガ
ロースゲル電気泳動法で確認することができる。

【００４４】上記のブレビバクテリウム・フラバムＭＪ
−２３３の染色体ＤＮＡをＰＣＲ法で増幅することによ
り得られる大きさが約０．３ｋｂのｒｅｃＡ遺伝子部分
断片については、その塩基配列をプラスミドｐＧＥＭ−
Ｔベクター（ＰＲＯＭＥＧＡ製）を用いる前記ジデオキ
シヌクレオチド酵素法により決定することができる。こ
のようにして決定した上記約０．３ｋｂのＤＮＡ断片の
塩基配列について他種の微生物の遺伝子のアミノ酸配列
との相同性から推定したアミノ酸配列は、後記配列表の
配列番号５に示す配列を有するものであり、１０６個の
アミノ酸をコードする３１８の塩基対から構成されるｒ
ｅｃＡ遺伝子の部分断片である。

【００４５】次に該ＤＮＡ断片をプラスミドｐＨＳＧ３
９８（宝酒造社製）のＢａｍＨＩサイトにサブクローニ
ングし、このプラスミドを用いて、ブレビバクテリウム
・フラバムＭＪ−２３３を形質転換する。これを、クロ
ラムフェニコール３μｇ／ｍｌを含むＡ寒天培地に塗抹
し、生育してくる形質転換体を取得する。該菌株は、プ
ラスミド上にあるｒｅｃＡ断片の相同性を用いて染色体
上にプラスミドが組換えにより挿入されたものであり、
形質転換体は、染色体上のｒｅｃＡ遺伝子が破壊されて
いる。

【００４６】上記宿主コリネ型細菌の前記本発明プラス
ミドによる形質転換は、前記したそれ自体既知の方法に
より行うことができる。かくして得られる形質転換体
を、前記した培地で培養し、前記した方法により指標遺
伝子の発現株を分離することにより、コリネ型細菌変異
株の集団を取得することができる。 これらの変異株の
集団の中から、例えば、各種アミノ酸要求株を単離し、
これらの変異株の染色体ＤＮＡを抽出し、指標遺伝子の
発現を指標にしてアミノ酸生合成系に関与する遺伝子を
簡便に単離することができる。また、蛋白質分解活性が
低下した株を選出し、これを宿主としてさまざまの酵素
を細胞内発現させれば、野生型の宿主に比べて酵素が安
定に保持され、物質生産を効率よく行わせることが可能
になる。

【００４７】

【実施例】以上に本発明を説明してきたが、下記の実施
例によりさらに具体的に説明する。 実施例１ コリネ型細菌由来の挿入配列の単離及び塩基
配列の決定 （１）ｓａｃＢおよびｓａｃＲ遺伝子領域を有するコリ
ネ型細菌内で複製可能なプラスミドの構築

【００４８】（Ａ）枯草菌の全ＤＮＡの抽出 半合成培地Ａ培地〔組成：尿素 ２ｇ、（ＮＨ₄ ）₂ Ｓ
Ｏ₄ ７ｇ、Ｋ₂ ＨＰＯ₄ ０．５ｇ、ＫＨ₂ ＰＯ₄
０．５ｇ、ＭｇＳＯ₄ ０．５ｇ、ＦｅＳＯ₄・７Ｈ₂
Ｏ ６ｍｇ、ＭｎＳＯ₄ ・４〜６Ｈ₂ Ｏ ６ｍｇ、酵母
エキス ２．５ｇ、カザミノ酸 ５ｇ、ビオチン ２０
０μｇ、塩酸チアミン ２００μｇ、グルコース ２０
ｇ、蒸留水１リットル〕１リットルに、前記枯草菌マー
ルバーグ（Ｍａｒｂｕｒｇ）株を対数増殖期前期まで培
養し、菌体を集めた。得られた菌体を、１０ｍｇ／ｍｌ
のリゾチームを含む１０ｍＭ ＮａＣｌ−２０ｍＭ ト
リス緩衝液（ｐＨ８．０）−１ｍＭ ＥＤＴＡ・２Ｎａ
溶液１５ｍｌに懸濁した。次にプロテナーゼＫを、最終
濃度が１００μｇ／ｍｌになるように添加し、３７℃で
１時間保温した。さらにドデシル硫酸ナトリウムを最終
濃度が０．５％になるように添加し、５０℃で６時間保
温して溶菌した。この溶菌液に、等量のフェノール／ク
ロロホルム溶液を添加し、室温で１０分間ゆるやかに振
盪した後、全量を遠心分離（５，０００×ｇ、２０分
間、１０〜１２℃）し、上清画分を分取し、酢酸ナトリ
ウムを０．３Ｍとなるように添加した後、２倍量のエタ
ノールをゆっくりと加えた。水層とエタノール層との間
に存在するＤＮＡをガラス棒でまきとり、７０％エタノ
ールで洗浄した後、風乾した。得られたＤＮＡに１０ｍ
Ｍトリス緩衝液（ｐＨ７．５）−１ｍＭ ＥＤＴＡ−２
Ｎａ溶液５ｍｌを加え、４℃で一晩静置し、鋳型ＤＮＡ
として、ＰＣＲに使用した。

【００４９】（Ｂ）プライマーの選択 枯草菌のｓａｃＢおよびｓａｃＲ遺伝子領域の塩基配列
は既に決定されている〔Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．
Ｖｏｌ．２００，２２０〜２２８（１９８５）〕。この
配列をもとに、ｓａｃＢおよびｓａｃＲ全遺伝子領域を
含むＤＮＡ断片を増幅可能な下記の１対のプライマーを
選択し、アプライド・バイオシステムズ（Ａｐｐｌｉｅ
ｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）社製、モデル３９４ＤＮＡ
／ＲＮＡシンセサイザーを用いて合成した。なお、これ
らのプライマーの末端には、制限酵素ＢａｍＨＩの認識
部位を付加してある。

【００５０】（ａ−１）５′−ＣＣＡＧＧＡＴＣＣＧ
ＡＴＣＣＴＴＴＴＴＡ ＡＣＣＣＡＴＣＡＣ−３′ （ｂ−１）５′−ＣＣＣＧＧＡＴＣＣＡ ＡＡＡＧＧＴ
ＴＡＧＧ ＡＡＴＡＣＧＧＴＴ−３′ （上記配列中、Ａはアデニン、Ｇはグアニン、Ｃはシト
シン、Ｔはチミンを示す。）

【００５１】このプライマーを用いて上記（Ａ）で調製
した染色体ＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行うと、ｓａｃ
ＢおよびｓａｃＲ遺伝子領域が存在する限り、約２．０
ｋｂの反応産物が得られる。

【００５２】（Ｃ）ＰＣＲ反応（ｓａｃＢおよびｓａｃ
Ｒ遺伝子領域の増幅） 実際のＰＣＲ反応は、パーキンエルマーシータス社製の
ＤＮＡサーマルサイクラーを用いて下記の条件で行っ
た。 反応液： ５０ｍＭ ＫＣｌ １０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．４） １．５ｍＭ ＭｇＣｌ₂ 鋳型ＤＮＡ ５μｌ 上記（Ｂ）で作製したプライマー 各々０．２５μＭ ｄＮＴＰｓ 各々２００μＭ ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（宝酒造社製） ２．５ｕｎ
ｉｔｓ 以上を混合し、１００μｌとした。 ＰＣＲサイクル： デナチュレーション過程：９４℃ ６０秒 アニーリング過程：３７℃ １２０秒 エクステンション過程：７２℃ １８０秒 以上を１サイクルとし、３０サイクル行った。

【００５３】（Ｄ）反応物の検出 上記（Ｃ）で生成した反応液１０μｌを２％アガロース
ゲルにより電気泳動を行って大きさが約２．０ｋｂの増
幅ＤＮＡ断片の検出を行った。

【００５４】（Ｅ）ｐＣＲＹ３０の構築 プラスミドベクターｐＣＲＹ３０は、特開平３−２１０
１８４号公報に記載の方法により調製した。

【００５５】（Ｆ）ｐＣＲＹ３０−ｓａｃＢの構築 上記（Ｃ）で得た大きさが約２．０ｋｂの増幅ＤＮＡ断
片を含む反応液１０μｌと上記（Ｅ）で得たｐＣＲＹ３
０ ０．５μｇを混合し、制限酵素ＢａｍＨＩ５ｕｎｉ
ｔｓを混合し、３７℃で１時間反応させて完全に消化し
た。６５℃で１５分間処理し、酵素を失活させた後、５
０ｍＭ トリス緩衝液（ｐＨ７．６）、１０ｍＭ ジチ
オスレイトール、１ｍＭ ＡＴＰ、１０ｍＭ ＭｇＣｌ
₂ およびＴ４ＤＮＡリガーゼ １ｕｎｉｔの各成分を添
加し（各成分の濃度は最終濃度である）、４℃で１５時
間反応させ、結合させた。

【００５６】得られたプラスミド混液を用い、塩化カル
シウム法〔Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，Ｖｏｌ．５３，１
５９（１９７０）〕によりエシェリヒア・コリＪＭ１０
９（宝酒造社製）を形質転換し、カナマイシン５０ｍｇ
を含む培地〔トリプトン １０ｇ、イーストエキストラ
クト ５ｇ、ＮａＣｌ ５ｇおよび寒天 １６ｇを蒸留
水１リットルに溶解〕に塗抹した。

【００５７】この培地上の生育株を常法により液体培養
し、培養液よりプラスミドＤＮＡを抽出し、該プラスミ
ドを制限酵素ＢａｍＨＩにより切断し、挿入断片を確認
した。この結果、プラスミドｐＣＲＹ３０の長さ８．６
ｋｂのＤＮＡ断片に加え、大きさが約２．０ｋｂの挿入
断片が認められた。この組換えプラスミドをｐＣＲＹ３
０−ｓａｃＢと命名した。プラスミドｐＣＲＹ３０−ｓ
ａｃＢの制限酵素切断点地図を図１に示す。

【００５８】（２）コリネバクテリウム・グルタミカム
由来の挿入配列の単離 （Ａ）ｓａｃＢ耐性株の単離 上記（１）で調製したプラスミドＤＮＡをコリネ型細菌
に導入し、該細胞を形質転換した。用いた宿主コリネ型
細菌は、コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ３
１８３１、ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ−２３３
（ＦＥＲＭ ＢＰ−１４９７）のプラスミドｐＢＹ５０
２除去株である。

【００５９】形質転換には電気パルス法を用いた。前記
コリネ型細菌を１００ｍｌのＡ培地〔組成：尿素 ２
ｇ、硫酸アンモニウム ７ｇ、リン酸一カリウム ０．
５ｇ、リン酸二カリウム ０．５ｇ、ＭｇＳＯ₄ ・７Ｈ
₂ Ｏ ０．５ｇ、ＭｎＳＯ₄ ・４〜６Ｈ₂ Ｏ ６ｍｇ、
ＦｅＳＯ₄ ・７Ｈ₂ Ｏ ６ｍｇ、酵母エキス １ｇ、カ
ザミノ酸 １ｇ、ビオチン ２００μｇ、塩酸チアミン
１００μｇを脱イオン水に溶解して１リットルとする
（ｐＨ７．４）〕で対数増殖初期まで培養した後、ペニ
シリンＧを１ｕｎｉｔ／ｍｌとなるように添加してさら
に２時間振盪培養した。培養菌体を遠心分離にて集め、
２０ｍｌのパルス用溶液〔組成：２７２ｍＭ シューク
ロース、７ｍＭ ＫＨ₂ ＰＯ₄ 、１ｍＭ ＭｇＣｌ₂ ；
ｐＨ７．４〕にて洗浄した。再度、遠心分離にて菌体を
集め、５ｍｌのパルス用溶液に懸濁し、０．７５ｍｌの
細胞と上記（Ａ）で得られたプラスミド溶液５０μｌと
を混合し、氷中にて２０分間静置した。ジーンパルサー
（バイオラド社製）を用いて、２５００ボルト２５μＦ
に設定し、パルスを印加後氷中に２０分間静置した。全
量を３０℃にて１時間培養した後、１０％シュークロー
ス、カナマイシン５０μｇ／ｍｌを含むＡ寒天培地に塗
抹した。３０℃で２日間培養した。

【００６０】（Ｂ）挿入配列の単離 出現したシュークロース耐性およびカナマイシン耐性株
より、プラスミドを特開平１−９５７８５号公報記載の
方法にて調製した。このプラスミドを各種制限酵素で切
断し、その大きさを確認したところ、２株において、形
質転換に用いたプラスミドより約１．５ｋｂ大きくなっ
たプラスミドが存在した。また、制限酵素による解析に
より、該大きさが約１．５ｋｂの挿入配列は、ｓａｃＢ
遺伝子の中に存在しており、ｓａｃＢ遺伝子産物を不活
性化していることが判明した。

【００６１】（３）コリネバクテリウム・グルタミカム
由来の挿入配列の塩基配列決定 上記（２）で得られた大きさが約１．５ｋｂの挿入配列
を特定するために、その塩基配列を、ｐＵＣ１１８また
はｐＵＣ１１９（宝酒造社製）を用いるジデオキシヌク
レオチド法により図２に示した戦略図に従って決定し
た。

【００６２】この結果、配列番号１に記載の配列が明ら
かとなった。本配列上には、４３６アミノ酸からなるオ
ープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）が存在した。こ
の挿入配列の両端には２４ｂｐからなるインヴァーテッ
ドリピート、およびターゲット配列である８ｂｐのダイ
レクトリピートが存在した。この大きさが約１．５ｋｂ
の挿入配列を、各種の制限酵素で切断したときの認識部
位数および切断断片の大きさは、前記第１表のとおりで
あった。その制限酵素切断点地図を図２に示す。

【００６３】実施例２ ｒｅｃＡ遺伝子欠損変異株の作
製 ｒｅｃＡ遺伝子は大腸菌、枯草菌由来のものがよく研究
されており、塩基配列が決定されている。これら２種の
微生物間で保存されている領域、特にＤＮＡ塩基配列に
おいても特に保存されている領域を検討し、下記の１対
のプライマーを選択し、アプライド・バイオシステムズ
（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）社製、モデ
ル３９４ＤＮＡ／ＲＮＡシンセサイザー（ｓｙｎｔｈｅ
ｓｉｚｅｒ）を用いて合成した。なお、これらのプライ
マーの末端には、制限酵素ＢａｍＨＩの認識部位を付加
してある。

【００６４】（ａ−１）５′−ＡＡＴ ＧＧＡ ＴＣＣ
ＴＴＹ ＡＴＩ ＧＡＩ ＧＣＩＧＡＲ ＣＡＹ Ｇ
ＣＩ ＹＴ−３′ （ｂ−１）５′−ＡＡＴ ＧＧＡ ＴＣＣ ＣＣＩ Ｃ
ＣＩ ＧＴＩ ＧＴＩＧＴＩ ＴＣＩ ＧＧ−３′ （上記配列中、ＲはＡ又はＧ、ＹはＣ又はＴを示し、こ
こでＡはアデニン、Ｇはグアニン、Ｃはシトシン、Ｔは
チミン、Ｉはデオキシイノシンを示す。）

【００６５】このプライマーを用いてブレビバクテリウ
ム・フラバムＭＪ−２３３染色体を鋳型としてＰＣＲを
行うと、ｒｅｃＡ遺伝子が存在する限り、約０．３ｋｂ
の反応産物が得られると期待される。上記実施例１記載
の条件でＰＣＲ反応を行い、反応液１０μｌを２％アガ
ロースゲルにより電気泳動を行い約０．３ｋｂの断片の
増幅を確認した。

【００６６】得られた大きさが約０．３ｋｂの増幅ＤＮ
Ａ断片について、その塩基配列をジデオキシヌクレオチ
ド酵素法（ｄｉｄｅｏｘｙｃｈａｉｎ ｔｅｒｍｉｎａ
ｔｉｏｎ法）（Ｓａｎｇｅｒ，Ｆ．ｅｔ ａｌ．，プロ
シーデフィング・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ
・サイエンス・オブ・ユナイテッド・ステイツ・オブ・
アメリカ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳ
Ａ），Ｖｏｌ．７４，５４６３，１９７７）により決定
した。

【００６７】塩基配列決定の結果、後記配列表の配列番
号５に示される配列が明かとなった。該挿入ＤＮＡ断片
は大腸菌、枯草菌由来のｒｅｃＡ断片の一部（ＰＣＲに
使用したプライマーによって挟まれる領域）と高いホモ
ロジーを示し、ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ−２
３３由来のｒｅｃＡ遺伝子ＤＮＡ断片の一部をクローニ
ングしたことを確認した。

【００６８】ＰＣＲ反応終了液に１０μｌの３Ｍ Ｎａ
ＯＡｃ（ｐＨ５．５）を加え、２５０μｌの９９．５％
エタノールを加え、−２０℃で２０分間放置した後、１
２，０００ｒｐｍで１５分間遠心分離し、沈澱（増幅Ｄ
ＮＡ断片）を回収した。沈澱を５０μｌの水に懸濁し、
制限酵素ＢａｍＨＩで切断した。これと、プラスミドｐ
ＨＳＧ３９８（宝酒造社製）を制限酵素ＢａｍＨＩで切
断した後、脱リン酸化処理したものを混合し、５０ｍＭ
トリス緩衝液（ｐＨ７．６）、１０ｍＭ ジチオスレ
イトール、１ｍＭ ＡＴＰ、１０ｍＭ ＭｇＣｌ ₂ およ
びＴ４ＤＮＡリガーゼ １ｕｎｉｔの各成分を添加し
（各成分の濃度は最終濃度である）、４℃で１５時間反
応させ、結合させた。

【００６９】上記で得られたプラスミド混液を用い、塩
化カルシウム法（Ｊｏｕｒｎａｌｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌ
ａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．５３，１５９，１９７
０）によりエシェリヒア・コリＪＭ１０９（宝酒造社
製）を形質転換し、クロラムフェニコール５０ｍｇを含
む培地〔トリプトン １０ｇ、イーストエキストラクト
５ｇ、ＮａＣｌ ５ｇおよび寒天 １６ｇを蒸留水１
リットルに溶解〕に塗抹した。

【００７０】この培地上の生育株を常法により液体培養
し、培養液よりプラスミドＤＮＡを抽出し、制限酵素Ｂ
ａｍＨＩで切断することにより、プラスミドｐＨＳＧ３
９８に０．３ｋｂのＤＮＡ断片が挿入されていることを
確認した。次に、このプラスミドを用いてブレビバクテ
リウム・フラバムＭＪ−２３３を形質転換した。

【００７１】形質転換には電気パルス法を用いた。前期
コリネ型細菌を１００ｍｌのＡ培地〔組成：尿素 ２
ｇ、硫酸アンモニウム ７ｇ、リン酸−カリウム ０．
５ｇ、リン酸二カリウム ０．５ｇ、ＭｇＳＯ₄ ・７Ｈ
₂ Ｏ ０．５ｇ、４〜６Ｈ₂ Ｏ６ｍｇ、ＦｅＳＯ₄ ・７
Ｈ₂ Ｏ ６ｍｇ、酵母エキス １ｇ、カザミノ酸 １
ｇ、ビオチン ２００μｇ、塩酸チアミン １００μｇ
を脱イオン水に溶解して１リットルとする（ｐＨ７．
４）〕で対数増殖初期まで培養した後、ペニシリンＧを
１ｕｎｉｔ／ｍｌとなるように添加してさらに２時間振
盪培養した。培養菌体を遠心分離にて集め、２０ｍｌの
パルス用溶液〔組成：２７２ｍＭ シュークロース、７
ｍＭ ＫＨ₂ ＰＯ₄ 、１ｍＭ ＭｇＣｌ₂ ；ｐＨ７．
４〕にて洗浄した。再度、遠心分離にて菌体を集め、５
ｍｌのパルス用溶液に懸濁し、０．７５ｍｌの細胞と上
記で得られたプラスミド溶液５０μｌとを混合し、氷中
にて２０分間静置した。ジーンパルサー（バイオラド社
製）を用いて、２５００ボルト２５μＦに設定し、パル
スを印加後氷中に２０分間静置した。全量を３０℃にて
１時間培養した後、クロラムフェニコール３μｇ／ｍｌ
を含むＡ寒天培地に塗抹し、３０℃で２日間培養した。

【００７２】得られた形質転換体は、クロラムフェニコ
ール耐性遺伝子を有しており、コリネ型細菌内で複製で
きないプラスミドが、プラスミド上にあるｒｅｃＡ遺伝
子断片の相同性を用いて組み換えにより染色体上に挿入
されたものであり、形質転換体は、染色体上のｒｅｃＡ
遺伝子が破壊されていると考えられる。これをｒｅｃＡ
遺伝子欠損株と命名した。

【００７３】実施例３ 変異株取得用プラスミドの作製 単離した挿入配列の５′-側上流および３′-側下流に存
在するインヴァーテッドリピートのうちいづれか一方の
２４ｂｐ（配列番号２または３）を有するプライマーに
より、挿入配列を上記実施例１記載のＰＣＲ法により増
幅した。

【００７４】ＰＣＲ反応終了液に１０μｌの３Ｍ Ｎａ
ＯＡｃ（ｐＨ５．５）を加え、２５０μｌの９９．５％
エタノールを加え、−２０℃で２０分間放置した後、１
２，０００ｒｐｍで１５分間遠心し、沈澱を回収した。
沈澱を５０μｌの水に懸濁し、末端を平滑化した。これ
と、クローニングベクターｐＨＳＧ３９８（宝酒造社
製）を制限酵素ＳｍａＩで切断した後、脱リン酸化処理
したものを混合し、５０ｍＭ トリス緩衝液（ｐＨ７．
６）、１０ｍＭ ジチオスレイトール、１ｍＭ ＡＴ
Ｐ、１０ｍＭＭｇＣｌ₂ およびＴ４ＤＮＡリガーゼ １
ｕｎｉｔの各成分を添加し（各成分の濃度は最終濃度で
ある）、４℃で１５時間反応させ、結合させた。

【００７５】得られたプラスミド混液を用い、塩化カル
シウム法（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆＭｏｌｅｃｕｌａｒ
Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．５３，１５９，１９７０）に
よりエシェリヒア・コリＪＭ１０９（宝酒造社製）を形
質転換し、クロラムフェニコール５０ｍｇを含む培地
〔トリプトン １０ｇ、イーストエキストラクト ５
ｇ、ＮａＣｌ ５ｇおよび寒天 １６ｇを蒸留水１リッ
トルに溶解〕に塗抹した。

【００７６】この培地上の生育株を常法により液体培養
し、培養液よりプラスミドＤＮＡを抽出し、制限酵素Ｅ
ｃｏＲＩおよびＨｉｎｄIII で切断することにより、ｐ
ＨＳＧ３９８に、挿入配列が挿入されていることを確認
した。このプラスミドをｐＭＶ１０と命名した。制限酵
素ＮｈｅＩおよびＮａｅＩを用いて本プラスミドｐＭＶ
１０を切断し、プラスミド上に存在する挿入配列上のＯ
ＲＦを制限酵素ＮｈｅＩおよびＮａｅＩにより欠失させ
た。これにカナマイシン耐性遺伝子カセット（ファルマ
シア社製）を加え、５０ｍＭ トリス緩衝液（ｐＨ７．
６）、１０ｍＭ ジチオスレイトール、１ｍＭ ＡＴ
Ｐ、１０ｍＭ ＭｇＣｌ₂ およびＴ４ＤＮＡリガーゼ
１ｕｎｉｔの各成分を添加し（各成分の濃度は最終濃度
である）、４℃で１５時間反応させ、結合させた。

【００７７】得られたプラスミド混液を用い、塩化カル
シウム法（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆＭｏｌｅｃｕｌａｒ
Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．５３，１５９，１９７０）に
よりエシェリヒア・コリＪＭ１０９（宝酒造社製）を形
質転換し、カナマイシン５０ｍｇを含む培地〔トリプト
ン １０ｇ、イーストエキストラクト ５ｇ、ＮａＣｌ
５ｇおよび寒天 １６ｇを蒸留水１リットルに溶解〕
に塗抹した。

【００７８】この培地上の生育株を常法により液体培養
し、培養液よりプラスミドＤＮＡを抽出し、制限酵素Ｅ
ｃｏＲＩおよびＨｉｎｄIII で切断することにより、カ
ナマイシン耐性遺伝子カセットが挿入されていることを
確認した。このプラスミドをｐＭＶ１２と命名した。一
方、挿入配列上のＯＲＦ（配列番号４）を含みインヴァ
ーテッドリピートより内側の部分をＰＣＲ法により増幅
させ、プラスミドｐＨＳＧ３９８のＳｍａＩサイトにｌ
ａｃプロモーターと同じ向きに挿入したプラスミドを作
製した。本プラスミドをｐＭＶ１７と命名した。

【００７９】このプラスミドｐＭＶ１７を制限酵素Ｘｂ
ａＩで切断した後平滑末端化したものに、先のプラスミ
ドｐＭＶ１２由来のＸｂａＩ−ＳａｃＩ断片を切り出
し、平滑末端化したものを挿入し、プラスミドｐＭＶ２
３を作製した。この結果、図３に示されるように、ｌａ
ｃプロモーター下流に、挿入配列上のＯＲＦと、両端に
インヴァーテッドリピートを有するカナマイシン耐性遺
伝子が、同じ方向の挿入されたプラスミドｐＭＶ２３が
作製できた。

【００８０】このプラスミドを各種の制限酵素で切断し
たときの認識部位数および切断断片の大きさを下記第２
表に示す。

【００８１】

【表２】 第２表 制限酵素 認識部位数 切断断片の大きさ（ｋｂ） ＨｉｎｄIII ２ ４．８、 ０．４ ＳｍａＩ １ ５．２ ＮａｅＩ １ ５．２ ＮｈｅＩ １ ５．２ ＫｐｎＩ １ ５．２ ＥｃｏＲＩ １ ５．２

【００８２】このプラスミドｐＭＶ２３を用いて形質転
換を行うと、ＯＲＦにコードされる蛋白質の機能によ
り、カナマイシン耐性遺伝子が挿入配列と同様に、染色
体上のさまざまに位置に転位挿入可能になる。さらにこ
の人工ミニ挿入配列は、染色体上に挿入された後、ＯＲ
Ｆをもたないため、それ以上転位挿入を繰り返すことが
できず、安定に保持されるものと考えられる。

【００８３】実施例４ 変異株の作製 作製したプラスミドｐＭＶ２３を用いて、野生株ブレビ
バクテリウム・フラバムＭＪ−２３３および実施例２で
作製したｒｅｃＡ遺伝子欠損株を形質転換した。

【００８４】形質転換には電気パルス法を用いた。これ
らのコリネ型細菌を各々１００ｍｌのＡ培地〔組成：尿
素 ２ｇ、硫酸アンモニウム ７ｇ、リン酸−カリウム
０．５ｇ、リン酸二カリウム ０．５ｇ、ＭｇＳＯ₄
・７Ｈ₂ Ｏ ０．５ｇ、４〜６Ｈ₂ Ｏ ６ｍｇ、ＦｅＳ
Ｏ₄ ・７Ｈ₂ Ｏ ６ｍｇ、酵母エキス １ｇ、カザミノ
酸 １ｇ、ビオチン ２００μｇ、塩酸チアミン １０
０μｇを脱イオン水に溶解して１リットルとする（ｐＨ
７．４）〕で対数増殖初期まで培養したあと、ペニシリ
ンＧを１ｕｎｉｔ／ｍｌとなるように添加してさらに２
時間振盪培養した。培養菌体を遠心分離にて集め、２０
ｍｌのパルス用溶液〔組成：２７２ｍＭシュークロー
ス、７ｍＭ ＫＨ₂ ＰＯ₄ 、１ｍＭ ＭｇＣｌ₂ ；ｐＨ
７．４〕にて洗浄した。再度、遠心分離にて菌体を集
め、５ｍｌのパルス用溶液に懸濁し、０．７５ｍｌの細
胞と上記実施例３で得られたプラスミド溶液５０μｌと
を混合し、氷中にて２０分間静置した。ジーンパルサー
（バイオラド社製）を用いて、２５００ボルト２５μＦ
に設定し、パルスを印加後氷中に２０分間静置した。全
量を３０℃にて１時間培養した後、カナマイシン５０μ
ｇ／ｍｌを含むＡ寒天培地に塗抹し、３０℃で２日間培
養した。

【００８５】得られた形質転換体は、カナマイシン耐性
遺伝子を有している。コリネ型細菌内で複製できない本
プラスミド上のカナマイシン耐性遺伝子が、本プラスミ
ド上に存在する挿入配列由来のＯＲＦにコードされる蛋
白質の機能により、カナマイシン耐性遺伝子が挿入配列
と同様に、染色体上のさまざまに位置に転位したもので
ある。

【００８６】この結果、下記第２表に示したように、野
生株（ＭＪ−２３３）に比べて、ｒｅｃＡ遺伝子欠損株
は、１０倍以上の効率で、カナマイシン耐性株が得ら
れ、各種の変異株作製において、より有用であることが
示された。

【００８７】

【表３】 第３表 宿 主 形質転換率（個／μｇＤＮＡ） 野生株（ＭＪ−２３３） ８．２×１０³ ｒｅｃＡ遺伝子欠損株 ９．２×１０⁴

【００８８】

【配列表】

配列番号：１ 配列の長さ：1469 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Genomic DNA 起源 生物名：コリネバクテリウム・グルタミカム(Corynebac
terium glutamicum) 株名：ATCC 31831 配列の特徴 特徴を表す記号：Insertion Seq 存在位置：1-1469 特徴を決定した方法：E

【００８９】 配列 CCTTTTGCGG CCCTTCCGGT TTTGGGGTAC ATCACAGAAC CTGGGCTAGC GGTGTAGACC 60 CGAAAATAAA CGAGCCTTTT GTCAGGGTTA AGGTTTAGGT ATCTAAGCTA ACCAAACACC 120 AACAAAAGGC TCTACCC ATG AAG TCT ACC GGC AAC ATC ATC GCT GAC ACC 170 Met Lys Ser Thr Gly Asn Ile Ile Ala Asp Thr 1 5 10 ATC TGC CGC ACT GCG GAA CTA GGA CTC ACC ATC ACC GGC GCT TCC GAT 218 Ile Cys Arg Thr Ala Glu Leu Gly Leu Thr Ile Thr Gly Ala Ser Asp 15 20 25 GCA GGT GAT TAC ACC CTG ATC GAA GCA GAC GCA CTC GAC TAC ACC TCC 266 Ala Gly Asp Tyr Thr Leu Ile Glu Ala Asp Ala Leu Asp Tyr Thr Ser 30 35 40 ACC TGC CCA GAA TGC TCC CAA CCT GGG GTG TTT CGT AAT CAC ACC CAC 314 Thr Cys Pro Glu Cys Ser Gln Pro Gly Val Phe Arg Asn His Thr His 45 50 55 CGG ATG CTC ATT GAT TTA CCC ATC GTC GGG TTT CCC ACC AAA CTG TTT 362 Arg Met Leu Ile Asp Leu Pro Ile Val Gly Phe Pro Thr Lys Leu Phe 60 65 70 75 ATC CGT CTA CCT CGC TAC CGC TGC ACC AAC CCC ACA TGT AAG CAA AAG 410 Ile Arg Leu Pro Arg Tyr Arg Cys Thr Asn Pro Thr Cys Lys Gln Lys 80 85 90 TAT TTC CAA GCA GAA CTA AGC TGC GCT GAC CAC GGT AAA AAG GTC ACC 458 Tyr Phe Gln Ala Glu Leu Ser Cys Ala Asp His Gly Lys Lys Val Thr 95 100 105 CAC CGG GTC ACC CGC TGG ATT TTA CAA CGC CTT GCT ATT GAC CGG ATG 506 His Arg Val Thr Arg Trp Ile Leu Gln Arg Leu Ala Ile Asp Arg Met 110 115 120 AGT GTT CAC GCA ACC GCG AAA GCA CTT GGG CTA GGG TGG GAT TTA ACC 554 Ser Val His Ala Thr Ala Lys Ala Leu Gly Leu Gly Trp Asp Leu Thr 125 130 135 TGC CAA CTA GCC CTC GAT ATG TGC CGT GAG CTG GTC TAT AAC GAT CCT 602 Cys Gln Leu Ala Leu Asp Met Cys Arg Glu Leu Val Tyr Asn Asp Pro 140 145 150 155 CAC CAT CTT GAT GGA GTG TAT GTC ATT GGG GTG GAT GAG CAT AAG TGG 650 His His Leu Asp Gly Val Tyr Val Ile Gly Val Asp Glu His Lys Trp 160 165 170 TCA CAT AAT AGG GCT AAG CAT GGT GAT GGG TTT GTC ACC GTG ATT GTC 698 Ser His Asn Arg Ala Lys His Gly Asp Gly Phe Val Thr Val Ile Val 175 180 185 GAT ATG ACC GGG CAT CGG TAT GAC TCA CGG TGT CCT GCC CGG TTA TTA 746 Asp Met Thr Gly His Arg Tyr Asp Ser Arg Cys Pro Ala Arg Leu Leu 190 195 200 GAT GTC GTC CCA GGT CGT AGT GCT GAT GCT TTA CGG TCT TGG CTT GGC 794 Asp Val Val Pro Gly Arg Ser Ala Asp Ala Leu Arg Ser Trp Leu Gly 205 210 215 TCC CGC GGT GAA CAG TTC CGC AAT CAG ATA CGG ATC GTG TCC ATG GAT 842 Ser Arg Gly Glu Gln Phe Arg Asn Gln Ile Arg Ile Val Ser Met Asp 220 225 230 235 GGA TTC CAA GGC TAC GCC ACA GCA AGT AAA GAA CTC ATT CCT TCT GCT 890 Gly Phe Gln Gly Tyr Ala Thr Ala Ser Lys Glu Leu Ile Pro Ser Ala 240 245 250 CGT CGC GTG ATG GAT CCA TTC CAT GTT GTG CGG CTT GCT GGT GAC AAG 938 Arg Arg Val Met Asp Pro Phe His Val Val Arg Leu Ala Gly Asp Lys 255 260 265 CTC ACC GCC TGC CGG CAA CGC CTC CAG CGG GAG AAA TAC CAG CGT CGT 986 Leu Thr Ala Cys Arg Gln Arg Leu Gln Arg Glu Lys Tyr Gln Arg Arg 270 275 280 GGT TTA AGC CAG GAT CCG TTG TAT AAA AAC CGG AAG GCT TTG TTG ACC 1034 Gly Leu Ser Gln Asp Pro Leu Tyr Lys Asn Arg Lys Ala Leu Leu Thr 285 290 295 ACG CAC AAG TGG TTG AGT CCT CGT CAG CAA GAA AGC TTG GAG CAG TTG 1082 Thr His Lys Trp Leu Ser Pro Arg Gln Gln Glu Ser Leu Glu Gln Leu 300 305 310 315 TGG GCG TAT GAC AAA GAC TAC GGG GTG TTA AAG CTT GCG TGG CTT GCG 1130 Trp Ala Tyr Asp Lys Asp Tyr Gly Val Leu Lys Leu Ala Trp Leu Ala 320 325 330 TAT CAG GCG ATT ATT GAT TGT TAT CAG ATG GGT AAT AAG CGT GAA GCG 1178 Tyr Gln Ala Ile Ile Asp Cys Tyr Gln Met Gly Asn Lys Arg Glu Ala 335 340 345 AAA AAG AAA ATG CGG ACC ATT ATT GAT CAG CTT CGG GTG TTG AAG GGG 1226 Lys Lys Lys Met Arg Thr Ile Ile Asp Gln Leu Arg Val Leu Lys Gly 350 355 360 CCG AAT AAG GAA CTC GCG CAG TTG GGT CGT AGT TTG TTT AAA CGA CTT 1274 Pro Asn Lys Glu Leu Ala Gln Leu Gly Arg Ser Leu Phe Lys Arg Leu 365 370 375 GGT GAT GTG TTG GCG TAT TTC GAT GTT GGT GTC TCC AAC GGT CCG GTC 1322 Gly Asp Val Leu Ala Tyr Phe Asp Val Gly Val Ser Asn Gly Pro Val 380 385 390 395 GAA GCG ATC AAC GGA CGG TTG GAG CAT TTG CGT GGG ATT GCT CTA GGT 1370 Glu Ala Ile Asn Gly Arg Leu Glu His Leu Arg Gly Ile Ala Leu Gly 400 405 410 TTC CGT AAT TTG AAC CAC TAC ATT CTG CGG TGC CTT ATC CAT TCA GGG 1418 Phe Arg Asn Leu Asn His Tyr Ile Leu Arg Cys Leu Ile His Ser Gly 415 420 425 CAG TTG GTC CAT AAG ATC AAT GCA CTC TAA AA CAGGAAGAGC CCCTTTTGC 1469 Gln Leu Val His Lys Ile Asn Ala Leu Stop 430 435

【００９０】配列番号：２ 配列の長さ：24 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Genomic DNA 起源 生物名：コリネバクテリウム・グルタミカム(Corynebac
terium glutamicum) 株名：ATCC 31831 配列の特徴 特徴を表す記号：Inverted Repeat 存在位置：1-24 特徴を決定した方法：E 配列 GGCCCTTCCG GTTTTGGGGT ACAT 24

【００９１】配列番号：３ 配列の長さ：24 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Genomic DNA 起源 生物名：コリネバクテリウム・グルタミカム(Corynebac
terium glutamicum) 株名：ATCC 31831 配列の特徴 特徴を表す記号：Inverted Repeat 存在位置：1-24 特徴を決定した方法：E 配列 GGCTCTTCCT GTTTTAGAGT GCAT 24

【００９２】配列番号：４ 配列の長さ：1311 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Genomic DNA 起源 生物名：コリネバクテリウム・グルタミカム(Corynebac
terium glutamicum) 株名：ATCC 31831 配列の特徴 特徴を表す記号：CDS 存在位置：1-1311 特徴を決定した方法：E

【００９３】 配列 ATG AAG TCT ACC GGC AAC ATC ATC GCT GAC ACC ATC TGC CGC ACT GCG 48 Met Lys Ser Thr Gly Asn Ile Ile Ala Asp Thr Ile Cys Arg Thr Ala 1 5 10 15 GAA CTA GGA CTC ACC ATC ACC GGC GCT TCC GAT GCA GGT GAT TAC ACC 96 Glu Leu Gly Leu Thr Ile Thr Gly Ala Ser Asp Ala Gly Asp Tyr Thr 20 25 30 CTG ATC GAA GCA GAC GCA CTC GAC TAC ACC TCC ACC TGC CCA GAA TGC 144 Leu Ile Glu Ala Asp Ala Leu Asp Tyr Thr Ser Thr Cys Pro Glu Cys 35 40 45 TCC CAA CCT GGG GTG TTT CGT AAT CAC ACC CAC CGG ATG CTC ATT GAT 192 Ser Gln Pro Gly Val Phe Arg Asn His Thr His Arg Met Leu Ile Asp 50 55 60 TTA CCC ATC GTC GGG TTT CCC ACC AAA CTG TTT ATC CGT CTA CCT CGC 240 Leu Pro Ile Val Gly Phe Pro Thr Lys Leu Phe Ile Arg Leu Pro Arg 65 70 75 80 TAC CGC TGC ACC AAC CCC ACA TGT AAG CAA AAG TAT TTC CAA GCA GAA 288 Tyr Arg Cys Thr Asn Pro Thr Cys Lys Gln Lys Tyr Phe Gln Ala Glu 85 90 95 CTA AGC TGC GCT GAC CAC GGT AAA AAG GTC ACC CAC CGG GTC ACC CGC 336 Leu Ser Cys Ala Asp His Gly Lys Lys Val Thr His Arg Val Thr Arg 100 105 110 TGG ATT TTA CAA CGC CTT GCT ATT GAC CGG ATG AGT GTT CAC GCA ACC 384 Trp Ile Leu Gln Arg Leu Ala Ile Asp Arg Met Ser Val His Ala Thr 115 120 125 GCG AAA GCA CTT GGG CTA GGG TGG GAT TTA ACC TGC CAA CTA GCC CTC 432 Ala Lys Ala Leu Gly Leu Gly Trp Asp Leu Thr Cys Gln Leu Ala Leu 130 135 140 GAT ATG TGC CGT GAG CTG GTC TAT AAC GAT CCT CAC CAT CTT GAT GGA 480 Asp Met Cys Arg Glu Leu Val Tyr Asn Asp Pro His His Leu Asp Gly 145 150 155 160 GTG TAT GTC ATT GGG GTG GAT GAG CAT AAG TGG TCA CAT AAT AGG GCT 528 Val Tyr Val Ile Gly Val Asp Glu His Lys Trp Ser His Asn Arg Ala 165 170 175 AAG CAT GGT GAT GGG TTT GTC ACC GTG ATT GTC GAT ATG ACC GGG CAT 576 Lys His Gly Asp Gly Phe Val Thr Val Ile Val Asp Met Thr Gly His 180 185 190 CGG TAT GAC TCA CGG TGT CCT GCC CGG TTA TTA GAT GTC GTC CCA GGT 624 Arg Tyr Asp Ser Arg Cys Pro Ala Arg Leu Leu Asp Val Val Pro Gly 195 200 205 CGT AGT GCT GAT GCT TTA CGG TCT TGG CTT GGC TCC CGC GGT GAA CAG 672 Arg Ser Ala Asp Ala Leu Arg Ser Trp Leu Gly Ser Arg Gly Glu Gln 210 215 220 TTC CGC AAT CAG ATA CGG ATC GTG TCC ATG GAT GGA TTC CAA GGC TAC 720 Phe Arg Asn Gln Ile Arg Ile Val Ser Met Asp Gly Phe Gln Gly Tyr 225 230 235 240 GCC ACA GCA AGT AAA GAA CTC ATT CCT TCT GCT CGT CGC GTG ATG GAT 768 Ala Thr Ala Ser Lys Glu Leu Ile Pro Ser Ala Arg Arg Val Met Asp 245 250 255 CCA TTC CAT GTT GTG CGG CTT GCT GGT GAC AAG CTC ACC GCC TGC CGG 816 Pro Phe His Val Val Arg Leu Ala Gly Asp Lys Leu Thr Ala Cys Arg 260 265 270 CAA CGC CTC CAG CGG GAG AAA TAC CAG CGT CGT GGT TTA AGC CAG GAT 864 Gln Arg Leu Gln Arg Glu Lys Tyr Gln Arg Arg Gly Leu Ser Gln Asp 275 280 285 CCG TTG TAT AAA AAC CGG AAG GCT TTG TTG ACC ACG CAC AAG TGG TTG 912 Pro Leu Tyr Lys Asn Arg Lys Ala Leu Leu Thr Thr His Lys Trp Leu 290 295 300 AGT CCT CGT CAG CAA GAA AGC TTG GAG CAG TTG TGG GCG TAT GAC AAA 960 Ser Pro Arg Gln Gln Glu Ser Leu Glu Gln Leu Trp Ala Tyr Asp Lys 305 310 315 320 GAC TAC GGG GTG TTA AAG CTT GCG TGG CTT GCG TAT CAG GCG ATT ATT 1008 Asp Tyr Gly Val Leu Lys Leu Ala Trp Leu Ala Tyr Gln Ala Ile Ile 325 330 335 GAT TGT TAT CAG ATG GGT AAT AAG CGT GAA GCG AAA AAG AAA ATG CGG 1056 Asp Cys Tyr Gln Met Gly Asn Lys Arg Glu Ala Lys Lys Lys Met Arg 340 345 350 ACC ATT ATT GAT CAG CTT CGG GTG TTG AAG GGG CCG AAT AAG GAA CTC 1104 Thr Ile Ile Asp Gln Leu Arg Val Leu Lys Gly Pro Asn Lys Glu Leu 355 360 365 GCG CAG TTG GGT CGT AGT TTG TTT AAA CGA CTT GGT GAT GTG TTG GCG 1152 Ala Gln Leu Gly Arg Ser Leu Phe Lys Arg Leu Gly Asp Val Leu Ala 370 375 380 TAT TTC GAT GTT GGT GTC TCC AAC GGT CCG GTC GAA GCG ATC AAC GGA 1200 Tyr Phe Asp Val Gly Val Ser Asn Gly Pro Val Glu Ala Ile Asn Gly 385 390 395 400 CGG TTG GAG CAT TTG CGT GGG ATT GCT CTA GGT TTC CGT AAT TTG AAC 1248 Arg Leu Glu His Leu Arg Gly Ile Ala Leu Gly Phe Arg Asn Leu Asn 405 410 415 CAC TAC ATT CTG CGG TGC CTT ATC CAT TCA GGG CAG TTG GTC CAT AAG 1296 His Tyr Ile Leu Arg Cys Leu Ile His Ser Gly Gln Leu Val His Lys 420 425 430 ATC AAT GCA CTC TAA 1311 Ile Asn Ala Leu Stop 435

【００９４】配列番号 ：５ 配列の長さ：318 配列の型 ：核酸 鎖の数 ：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Genomic DNA 起源 生物名：ブレビバクテリウム フラバム 株名 ：MJ-233 配列の特徴 特徴を表す記号：CDS(peptide) 存在位置 ：1-318 特徴を決定した方法：E

【００９５】 配列 GAT CCA GAT TAT GCT CGC AAG CTT GGT GTA GAT ACT GAT GCG CTT CTG 48 Asp Pro Asp Tyr Ala Arg Lys Leu Gly Val Asp Thr Asp Ala Leu Leu 1 5 10 15 GTT TCG CAG CCA GAC ACT GGT GAG CAA GCA CTA GAA ATC GCC GAC ATG 96 Val Ser Gln Pro Asp Thr Gly Glu Gln Ala Leu Glu Ile Ala Asp Met 20 25 30 CTG GTT CGT TCC GGC GCA ATC GAC ATC ATC GTG ATT GAC TCG GTG GCT 144 Leu Val Arg Ser Gly Ala Ile Asp Ile Ile Val Ile Asp Ser Val Ala 35 40 45 GCG CTG ACA CCA AAG GCT GAA ATT GAA GGC GAA ATG GGC GAT AGC CAC 192 Ala Leu Thr Pro Lys Ala Glu Ile Glu Gly Glu Met Gly Asp Ser His 50 55 60 GTT GGT CTT CAG GCC CGC CTC ATG AGC CAG GCG CTT CGT AAG ATG ACA 240 Val Gly Leu Gln Ala Arg Leu Met Ser Gln Ala Leu Arg Lys Met Thr 65 70 75 80 GGT GCG CTG TAC AAC TCG GGT ACC ACC GCG ATC CTC ATT AAC CAG CTG 288 Gly Ala Leu Tyr Asn Ser Gly Thr Thr Ala Ile Leu Ile Asn Gln Leu 85 90 95 CGT GAA AAG ATC GGT GTG ATG TTC GGT TCC 318 Arg Glu Lys Ile Gly Val Met Phe Gly Ser 100 105

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明で挿入配列の単離に用いるプラスミドｐ
ＣＲＹ３０−ｓａｃＢの制限酵素切断点地図。

【図２】本発明で用いる挿入配列の制限酵素切断点地図
及び塩基配列決定のための戦略図。

【図３】本発明のプラスミドｐＭＶ２３の制限酵素切断
点地図。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:13） (72)発明者 湯川 英明 茨城県稲敷郡阿見町中央８丁目３番１号 三菱油化株式会社筑波総合研究所内

Claims (7)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 （ａ）コリネ型細菌内で自律複製でき
   ず、（ｂ）指標遺伝子ＤＮＡの５′-側上流および３′-
   側下流に、コリネ型細菌由来の挿入配列中のオープンリ
   ーディングフレームの５′-側上流および３′-側下流に
   存在するインバーティッドリピートの少くとも一方のイ
   ンバーティッドリピートを有するＤＮＡ領域と、（ｃ）
   コリネ型細菌由来の挿入配列中のオープンリーディング
   フレームを含むＤＮＡ領域を保有することを特徴とする
   プラスミド。
2. 【請求項２】 指標遺伝子が、薬剤耐性遺伝子である請
   求項１記載のプラスミド。
3. 【請求項３】 インバーティッドリピートが、配列番号
   ２又は３で示される塩基配列である請求項１記載のプラ
   スミド。
4. 【請求項４】 オープンリーディングフレームが、配列
   番号４で示される塩基配列である請求項１記載のプラス
   ミド。
5. 【請求項５】 指標遺伝子が薬剤耐性遺伝子であり、イ
   ンバーティッドリピートが配列番号２又は３で示される
   塩基配列であり、且つオープンリーディングフレームが
   配列番号４で示される塩基配列である請求項１記載のプ
   ラスミド。
6. 【請求項６】 請求項１〜５のいずれかに記載のプラス
   ミドを用いてコリネ型細菌を形質転換し、形質転換株の
   指標遺伝子の発現を指標として、指標遺伝子の発現株を
   分離することを特徴とする変異株の取得方法。
7. 【請求項７】 コリネ型細菌が、組換え能欠損コリネ型
   細菌である請求項６記載の方法。