JPH0739442B2 - 新規ヘパリン誘導体およびその製造法 - Google Patents

新規ヘパリン誘導体およびその製造法

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JPH0739442B2
JPH0739442B2 JP1148211A JP14821189A JPH0739442B2 JP H0739442 B2 JPH0739442 B2 JP H0739442B2 JP 1148211 A JP1148211 A JP 1148211A JP 14821189 A JP14821189 A JP 14821189A JP H0739442 B2 JPH0739442 B2 JP H0739442B2
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Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ 本発明は、任意にアルカリまたはアルカリ土類金属塩お
よび還元剤を存在させて、種々の起源のヘパリンを塩基
性触媒（basic medium）で処理してえられる、抗血栓作
用を有し、出血性作用および抗擬血作用を減少させた新
規ヘパリン誘導体に関する。
［従来の技術および発明が解決しようとする課題］ 塩基性媒体中で処理することにより、種々の方法でヘパ
リン性の構造をモディファイできることは、すでに知ら
れている。
マルジグイアン・ジェー・エス （Mardiguian J.S）の欧州公開公報第0133078号明細書
中で、0.1〜0.6モル濃度の、有機または無機塩基を用い
て、20〜80℃温度で、ヘパリンのベンジルエステルを処
理することにより、ヘパリンを４〜20糖単位を含むオリ
ゴ糖分画に解重合（depolymerize）している。該解重合
（depolymerization）は、230nmにおけるUV吸収で検出
できる、ウロン酸の４、５位炭素間における二重結合の
形成を伴なう。
ヒラノ・エス（Hirano S.）［コネクティブ・ティシュ
ー・リサーチ（Conn.Tissue Res.）、３巻、73〜79頁
（1975年）参照］は、２〜10モル濃度の水酸化ナトリウ
ムまたは水酸化バリウムを用いて、強塩基性触媒で、80
℃以上の温度でヘパリンおよび他のグリコサミノグリカ
ン類を解重合している。該方法では、グルコサミン単位
の１位と隣りあうウロン酸単位の４位とのグリコシド結
合の開裂に続く強い開重合を生じ、さらに該開重合は、
UVスペクトルにおける225〜230nmでの吸収により検出で
きる、ウロン酸の４、５位炭素間における二重結合の形
成を伴なう。
サンプソン・ピー（Sampson P.）およびメイヤー・ケー
（Meyer K.）［プロシーディング・オブ・ナショナル・
アカデミー・オブ・サイエンス・オブ・ジ・ユナイテッ
ド・ステイツ・オブ・アメリカ（Proc.Nat.Acad.Sci.US
A）、68巻、2329〜2331頁（1971年）参照］は、水素化
ホウ素ナトリウムの存在下80℃で７時間、1N水酸化ナト
リウムでヘパリンを処理することにより、3,6−アンヒ
ドログルコサミンの形成を伴うグルコサミンにおける構
造上のモディフィケーションを行なった。
本発明のヘパリン誘導体は、従来技術に記載されている
ものとは全く異なる。その理由を以下に示す。実際に本
発明のヘパリン誘導体は、マルジグイアン・ジェー・エ
スおよびヒラノ・エスらがえた化合物の物理化学的特性
を示さない。本発明の化合物については実質的に平均分
子量が不変であることで、解重合していないことが示さ
れる点、ならびに225〜230nmでのUV吸収および13C−NMR
における二重結合の共鳴に対応するピークが存在しない
ことでウロン酸の４、５位炭素間の二重結合の欠如の指
標となる点があげられる。
さらにサンプソン・ピーおよびメイヤー・ケーが単離し
た化合物の物理化学的特性も全く示していない。本発明
の化合物の13C−NMRスペクトルにおいては、グルコサミ
ンの６位の炭素原子のシグナルの位置および強度が不変
である点、ならびに無水誘導体形成に硫酸化された６位
の炭素原子が関与するため、3,6−アンヒドログルコサ
ミンの形成時に変化する硫酸化された６位の炭素原子お
よび硫酸化されていない６位の炭素原子の強度比が不変
である点がみとめられる。
［課題を解決するための手段］ 本発明は、新規ヘパリン誘導体、誘導体の血栓性病状
（thrombotic pathologies）における治療的用途ならび
に塩基性水性媒体中で、任意に塩および還元剤を存在さ
せて、種々の起源の（市販の、適当な処理で精製したま
たは解重合した）ヘパリンに化学的なモディフィケーシ
ョンを行なうことを特徴とする前記誘導体を製造法に関
する。
本発明のヘパリン誘導体は、13C−NMRにおいて約53およ
び約54ppm付近に新しいシグナルをもち、出発物質であ
るヘパリン（starting heparin）と比較して＋50〜＋90
゜まで比旋光度が増加している、という固有の物理化学
的特性を示す。
このような構造上のモディフィケーション（modificati
on）により、抗血栓作用を充分維持したまま、イン・ビ
ボ（in vivo）で出血作用およびイン・ビトロ（in vitr
o）で抗擬血作用を減少させる、というヘパリンの生物
学的特性の改良がなされた。
換言すれば、モディファイされたヘパリン性の構造（he
parinic structure）をもつ新規化合物は、出発化合物
のものとは異なる、特異な比旋光度および13C−NMRピー
クを示すという物理化学的特性を有し、ならびに出血性
作用および抗擬血力（anticoagulant power）を低下さ
せながら抗血栓性の性質は実質上維持するという、より
優れた作用特異性（action specificity）を示すという
異なる生物学的活性をも示す。実際に、該化合物は、13
C−NMRスペクトルにおいて約53および54ppm付近に２つ
の新しいシグナルをもち、比旋光度は水溶液において＋
50〜＋90゜と、出発物質としてのヘパリンと比較して高
い比旋光度を示すことを特徴とする。
すなわち、本発明は13C−NMRスペクトルにおいて53およ
び54ppm付近にシグナルをもち、水溶液における比旋光
度が＋50〜＋90゜であり、イオウ含量が８〜11％であ
り、およびカルボキシル基に対する硫酸基の比率が1.50
〜2.2であることを特徴とする新規ヘパリン誘導体およ
びヘパリン性の物質の水溶液に0.01〜1Nのアルカリまた
はアルカリ土類金属の塩基を存在させ、0.5〜24時間、3
5〜70℃で処理し、中性付近のpHで炭素数１〜３のアル
コールを２〜４倍量加えて、モディファイされた構造を
もつ化合物を沈殿させることを特徴とする、13C−NMRス
ペクトルにおいて53および54ppm付近にシグナルをも
ち、水溶液における比旋光度が＋50〜＋90゜であり、イ
オウ含量が８〜11％であり、およびカルボキシル基に対
する硫酸基の比率が1.50〜2.20であることを特徴とする
新規ヘパリン誘導体の製造法に関する。
［実施例］ ヘパリン性の構造の化学的なモディフィケーションは、
塩基、好ましくはアルカリままたはアルカリ土類金属の
水酸化物の存在下、任意にアルカリまたはアルカリ土類
金属の塩、および還元剤、好ましくは水酸化ホウ素ナト
リウムを存在させて、中性より高いpHの水性媒体で行な
われる。
反応は、0.5〜24時間、約35〜70℃の温度で、約0.01〜1
Nの濃度の塩基および０〜約1Nの濃度の塩を用いて、任
意に還元剤、たとえば水素化ホウ素ナトリウムなどを存
在させて行なわれる。
アルカリまたはアルカリ土類金属の塩基および塩は、好
ましくは主にナトリウム、カリウム、カルシウム、マグ
ネシウムおよびバリウムの塩基および塩が用いられる。
塩基としては、ナトリウム、カリウムおよびバリウムの
水酸化物を有利に用いることができる。
塩としては、ナトリウム、カリウム、バリウム、カルシ
ウムおよびマグネシウムの酢酸塩および塩化物ならびに
ナトリウム、カリウムおよびマグネシウムの硫酸塩を有
利に用いることができる。
ヘパリン性の構造のモディフィケーションの方法は、任
意に1N以下の濃度のアルカリまたはアリカリ土類金属の
塩および触媒量の還元剤を存在させ、約0.01〜1Nのアル
カリまたはアルカリ土類金属の塩基を含有する水溶液に
ヘパリン性の物質（heparinic material）を溶かし、約
0.5〜24時間、約35〜70℃に温度調節をすることによっ
て行なう。
反応終了後、溶液を室温まで冷やし、pHを中性にする。
任意に、たとえばイオン交換樹脂、透析などで精製し、
最後に約２〜４倍量、好ましくは2.5倍量のたとえばエ
チルアルコールのような炭素数１〜３のアルコールを加
えて、モディファイされたヘパリン誘導体を沈殿させ
る。
前記の製造法でえたモディファイされたヘパリンは、従
来技術で知られているアルカリ処理によるヘパリンと
は、全く異なる固有の物理化学的特性を示す。これは、
主に塩基の濃度、温度および任意に用いる塩に関するパ
ラメーターの値などの本発明に用いられる反応条件によ
るもので、この反応条件は、以前に用いられたものとは
有意に異なるものである。新規ヘパリン誘導体の構造上
の変化は、主には13C−NMRにおける共鳴の位置および相
対的な強度から、ならびに電気泳動での挙動（electrop
horetic behaviour）、比旋光度の増加、イオウ含量の
減少および硫酸基／カルボキシル基（カルボキシル基含
量は不変）の比率の減少からも示される。
新規ヘパリン誘導体の構造におけるより特徴的な変化
は、13C−NMRスペクトルにおいて生じる大きな変化を調
べることで確認される。これらの変化は、スペクトルの
特有のゾーン（zone）に関連し、新しいピークの出現お
よび他のピークの変化をともに含む。注目すべき点は、
約53および約54ppm付近に２つの新しいシグナルが出現
すること、ならびにイズロンおよびグルコサミン単位の
１位炭素原子に対応するピークが、92〜102ppmのゾーン
にシフトすることである。新規化合物およびその出発化
合物の13C−NMRスペクトルの比較チェックにより、スペ
クトルゾーンのいくつかは変化していないことが確認で
き、その結果、ヘパリン性の構造のいくつかの部分は全
くモディファイされていないことが確認できる。とく
に、硫酸化されたまたは硫酸化されていないグルコサミ
ン単位の６位炭素に関連するシグナルは変化していな
い。さらにヘパリン形態においてウロン残基の平均20％
である、イズロン酸のカルボキシル基に、グルクロン酸
単位に、硫酸化またはアセチル化されたグルコサミン単
位の２位炭素に、関連したピークは、変化していないこ
とがわかる。
それらに限定されないが、後記する実施例の記載から判
断できるように反応条件をより激しくするほど、新規ヘ
パリン誘導体の物理化学的特性はより変化をうける。し
たがって、反応のパラメーターの調整により、構造にお
いて巧妙に（more or less deeply）モディファイされ
た化合物がえられることを可能にする。
化学的なモディフィケーションの量は、約53および約54
ppm付近のピークのイテグラルの和ならびにグルコサミ
ン単位の６位炭素原子の約62.5および約69ppm付近のピ
ークのインテグラルの和の比を用いて計算する。後者が
便宜上のリファレンスとして選ばれるのは、それらの強
度は安定に保たれ、かつ該ピークが他のピークのないス
ペクトルゾーンに現われるからである。約53および約54
ppm付近での共鳴が増すのに並行して、589nm（ナトリウ
ムのＤ線）における旋光度は増加するので、比旋光度の
測定をヘパリン性の構造において生じる化学的なモディ
フィケーションの程度の評価に直接利用することができ
る。光学活性試薬を反応媒体中に用いていないので、比
旋光度の測定を反応の進行を調べるために直接利用する
ことができる。13 C−NMRにおけるピークのインテグラルの比および出発
物質と比較した比旋光度の増加を第１表に示す。
前記のモディファイされたヘパリンはさらに、pH5.8の
0.1M酢酸バリウムバッファー中で高い易動度を示す［ピ
ー・オレステ（P.Oreste）およびジー・トリー（G.Torr
i）、ジャーナル・オブ・クロマトグラフィー（J.Chro
m.）、195巻、398頁（1980年）参照］という、出発物質
とは異なる電気泳動での挙動を示し、イオウ含量が約８
〜11％、硫酸基／カルボキシル基の比率が約1.50〜2.20
および比旋光度▲［α］20 D▼が＋50〜＋90゜であると
いう特性を示す。そのデータを第２表に示す。カッコ内
に対応する出発物質の値を示す。
本発明の目的である新規ヘパリン誘導体は、著しい抗血
栓作用をもつとともに、出発物質としてのヘパリンと比
較して低い出血作用および抗擬血作用を示す。これらの
生物学的作用は、ヘパリンの多くの典型的なテストで評
価した。具体的には、抗Xa因子、APTT、出血時間および
実験的な血栓症からの保護の試験を行なった。APTT活性
は、ラリュー・エム・ジェイ（LarrieuM.J.）およびウ
ェイランド・ジー（Weiland G.）の方法［ルビュー・デ
マトロジー（Revue d′Hematologie）、12巻、199頁（1
957年）参照］にしたがって測定し、一方抗Xa活性は、
イン・イー・ティー（Yin E.T.）およびウェスラー・エ
ス（Wessler S.）の方法（バイオケミカ・エト・バイオ
フィジカ・アクタ（Biochem.Biophys.Acta）、201巻、3
87頁（1970年）参照］にしたがって測定した。
すべての試験化合物は絶食ラットから採った血漿中に溶
解し、比例した希釈溶液 （proportional dilutions）を調整して方法に供給する
濃度をえた。それぞれの化合物について、両方の活性に
ついて10回測定し、対応する試験において、より有意な
変化をみせた量をmcg/mlで示した。とくに、それぞれの
生成物の活性は、APTT活性に関してはAPTT時間をそれぞ
れ２倍にする、また抗Xa活性に関しては抗Xa量を30％増
加させる濃度をmcg/mlで表した。
２つの試験でえられた数値（第３表参照）により、新規
化合物が抗擬血力の低下を示すことが確認される。
出血時間は、デジャーナ・イー（Dejana E.）らによる
方法（［トロンボシス・ヒモスタシス（Thromb.Haemos
t.）、48巻、108頁（1982年）参照］でラットを用いて
測定され、結果は対応する出発物質としてのヘパリンで
処理したラットにおいて出血が延長した時間を100％と
して、新規ヘパリンで処理したラットにおいて出血が延
長した時間をパーセントで表した。モディファイされた
ヘパリン性の構造をもつすべての本発明の新規誘導体に
おいて、対応する出発物質としてのヘパリンと比較し
て、出血時間の減少がみられ、あるものは極めて著し
い。
抗血栓活性はレヤーズ・エス（Reyers S.）らの方法
［トロンボシス・リサーチ（Thromb.Res.）、18巻、669
〜74頁（1980年）参照］にしたがって、うっ血性静脈血
栓症（stasis venous thrombosis）の試験を行なった。
新規化合物による保護は、出発物質としてのヘパリンに
よる血栓形成からの保護 （antitrombotic protection）を100としてパーセント
で表した。
えられた結果から、抗血栓作用の本試験に関して、２つ
の系の実質的な同等性が示された。
前記の生物学的試薬の値を以下の第３表に示す。抗Xa活
性およびAPTT活性に関して、対応する出発物質としての
ヘパリンにおける値をカッコ内に示す。
前記の薬理学的特性により、本新規ヘパリン誘導体は、
血栓性の症状に有用である。好ましい投与方法は、無菌
水溶液の形態で、非経口および皮下投与で行なわれ、任
意に溶液の等張化のための塩および保存剤を加えてもよ
い。
投与範囲は、用いられる製剤形態および患者の状態によ
るが、好ましくは、抗Xa因子の単位（U.A.Xa）で5,000
〜20,000U.A.Xaと同等の本発明のヘパリン誘導体の量を
１日１回またはそれ以上投与する。
出発物質として、異なる起源のヘパリン性の物質を用い
ることができる。たとえば、従来技術として知られてい
る方法にしたがって解重合してえた低分子量ヘパリンは
もちろん、市販のヘパリンおよび市販のヘパリンを処理
して精製したヘパリンを、本発明のモディファイされた
ヘパリン性の物質をえるために用いた。
以下に本発明で用いた出発物質としてのヘパリン性の物
質の製造法を示す。
ヘパリンナトリウム ALFA 87−78 市販のヘパリンナトリウム25gを水2000mlに溶解し、水2
000mlに溶解させた酢酸カリシウム−水和物111.2g、酢
酸57mlおよびエチルアルコール600mlを含有する溶液中
に、前記水溶液を温度を８〜10℃に保ちながら、約30分
間かけて注いだ。５℃で15時間放置したのち、えられた
懸濁液をろ過し、ろ液にエチルアルコール1000mlを加え
る。５℃で３時間放置したのち、えられた沈殿をろ過し
た。沈殿物を水200mlに溶解し、1N水酸化ナトリウム溶
液を用いてpH7.0にした。そののち、Dowex 50 WX8（ナ
トリウム型）樹脂100mlおよび水70mlを用いて20分間処
理した。溶液および樹脂を、同じ樹脂80mlをつめたクロ
マトグラフィー用のカラム（直径:1.6cm、長さ:10cm）
に移した。溶液を浸出し、全溶液量が400mlになるまで
蒸留水で溶出したのち、この溶液と、酢酸ナトリウム三
水和物12gおよびエチルアルコール1000mlとを合わせ
た。沈殿をろ過し、真空下で乾燥して、精製されたヘパ
リンナトリウムを19.2gえ、ALFA 87−78とした。以下に
物理化学的特性を示す。
S:10.09％、 硫酸基／カルボキシル基の比率:2.13、 ▲［α］20 D▼：＋43゜（Ｃ＝１％、水中）13 C−NMRスペクトル δ（ppm）:177.3、104.7、102.
0、99.4、80.0、78.6、72.3、71.9、69.0、62.5、60.6 ヘパリンナトリウム ALFA 87−81 出発物質としてALFA 87−78と同じ市販のヘパリンナト
リウムを50g用い、同様の方法で精製し、ヘパリンナト
リウムALFA 87−81を36.5gえた。以下にその物理化学的
特性を示す。
S:10.56％、 硫酸基／カルボキシル基の比率:2.20、 ▲［α］20 D▼：＋47゜（Ｃ＝１％、水中）13 C−NMRスペクトル δ（ppm）:177.3、104.7、102.
0、99.5、80.1、78.6、72.4、72.0、69.1、62.1、60.7 市販のヘパリンナトリウム 以下に物理化学的特性を示す。
S:11.0％、 硫酸基／カルボキシル基の比率:2、 ▲［α］20 D▼：＋44゜（Ｃ＝１％、水中）13 C−NMRスペクトル δ（ppm）:177.4、104.6、101.
9、99.8、79.9、78.6、72.2、71.8、69.0、62.6、60.6 低分子量ヘパリンナトリウム LMW ALFA 86−02 低分子量ヘパリンナトリウム LMW ALFA 86−02は、国
際特許公開公報（international patent publication）
第86/06729号明細書記載の方法にしたがって、銅イオン
の存在下、過酸化水素を用いた解重合反応によってえ
た。以下に物理化学的特性を示す。
平均分子量:4200ダルトン、 S:11.40％、 硫酸基／カルボキシル基の比率:2.27、 ▲［α］20 D▼：＋45゜（Ｃ＝１％、水中）13 C−NMRスペクトル δ（ppm）:177.4、104.6、101.
9、99.8、79.9、78.6、72.6、72.2、71.9、69.1、62.
7、60.7 低分子量ヘパリンナトリウム LMW ALFA 87−198 低分子量ヘパリンナトリウムLMW ALFA 86−02と同様の
方法にしたがって、解重合反応により低分子量ヘパリン
ナトリウムLMW ALFA 87−198をえた。以下にその物理化
学的特性を示す。
S:11.60％、 硫酸基／カルボキシル基の比率:2.32、 ▲［α］20 D▼：＋47゜（Ｃ＝１％、水中）13 C−NMRスペクトル δ（ppm）:177.7、104.8、102.
0、99.6、80.2、78.6、72.4、71.9、69.2、62.7、60.6 比旋光度▲［α］20 D▼は、水性触媒中、１％の濃度で
測定した。
硫酸基／カルボキシル基の比率は、電位差法で測定し
た。
イオウ含量のパーセンテージの測定は、電位差法および
シェニーゲル（Schoeniger）法の二法で行なった。13 C−NMRスペクトルは、バリアンCFT−75スペクトロメ
ーター（Varian CFT−75 spectrometer）を用いて、75.
47MHzにおいて、溶媒としてD20を、関連内部標準として
は３−トリメチルシリルプロパンスルホン酸ナトリウム
を用いて測定した。
つぎに実施例にもとづいて本発明をさらに詳しく説明す
るが、本発明はもとよりこれらに限られるものではな
い。
実施例１ ヘパリンALFA 87−81 1.8gを水酸化ナトリウム0.4g（0.
225N）、酢酸ナトリウム2.3g（0.625N）および水素化ホ
ウ素ナトリウム10mgを含有する水溶液45mlに加えた。3.
5時間60℃に保温したのち、室温まで冷やし、氷酢酸を
用いて中性にし、エタノールを2.5倍量加えた。沈殿を
ろ過し、フィルター上においてエタノール６に対して水
１の割合の混合液で洗浄したのち、乾燥し、生成物を1.
7gえた。以下に特徴的なシグナルをもつ13C−NMRスペク
トルを示す。
δ（ppm）:177.3、104.3、101.9、99.4、98.4、97.2、9
6.8、79.7、79.1、78.5、72.1、71.8、71.2、68.8、62.
4、60.6、60.3、54.1、53.1 実施例２ ヘパリンALFA 87−78 1.8gを水酸化ナトリウム0.4g（0.
225N）、酢酸ナトリウム2.3g（0.625N）および水素化ホ
ウ素ナトリウム10mgを含有する水溶液45mlに加えた。15
時間60℃に保温し、冷却したのち、酢酸で中性にした。
Dowex 1 X2（塩素型）アニオン樹脂をつめたカラム（直
径:1.2cm、長さ:8cm）を通して浸出した。浸出液および
洗液を共にし、エタノールを2.5倍量加えた。沈殿をろ
過し、エタノール６に対して水１の割合の混合液で洗浄
し、乾燥して生成物1.65gをえた。以下に特徴的なシグ
ナルをもつ13C−NMRスペクトルを示す。
δ（ppm）:177.4、104.6、101.8、98.6、97.2、96.8、7
9.6、79.1、78.9、72.2、71.5、71.2、68.8、62.5、60.
3、54.1、53.1 実施例３ ヘパリンALFA 87−78 1.8gを水酸化ナトリウム4.8g（1
N）を含有する水溶液120mlに加えた。3.5時間60℃に保
温し、酢酸で中性にしたのち、流水で一夜、および蒸留
水で６時間透析した。溶液に酢酸ナトリウム3.5gを加
え、酢酸で中性にし、エタノールを2.5倍量加えた。沈
殿をろ過し、エタノール６に対し水１の割合の混合液で
洗浄したのち、乾燥して生成物を1.7gえた。以下に特徴
的なシグナルをもつ13C−NMRスペクトルを示す。
δ（ppm）:177.4、104.6、101.7、98.6、98.4、97.2、9
6.8、79.7、79.1、78.6、73.5、72.5、72.3、72.1、71.
5、68.8、62.6、60.4、60.2、54.0、53.1 実施例４ ヘパリンALFA 87−81 4gを、水酸化ナトリウム4.8g（1
N）、酢酸ナトリウム6.2g（0.625N）および水素化ホウ
素ナトリウム25mgを含有する水溶液120mlに加えた。3.5
時間60℃に保温し、酢酸で中性したのち、流水で24時間
透析した。Dowex 1 X4（塩素型）アニオン樹脂をつめた
カラム（直径:1.6cm、長さ:15cm）を通して浸出した。
浸出液および洗液、ならびに酢酸ナトリウム4gを合わせ
たのち、エタノールを2.5倍量加えた。沈殿をろ過し、
フィルター上においてエタノール６に対して水１の割合
の混合液で洗浄したのち、乾燥して生成物3.55gをえ
た。特徴的なピークを示す13C−NMRスペクトルを以下に
示す。
δ（ppm）:177.4、104.5、101.8、99.4、98.7、97.1、7
9.5、78.6、73.5、71.8、68.8、62.4、60.3、54.0、53.
1 実施例５ ヘパリンLMW ALFA 86−02 1.8gを、水酸化ナトリウム0.
08g（0.04N）、酢酸ナトリウム2.6g（0.625N）および水
素化ホウ素ナトリウム10mgを含有する水溶液50mlに加え
た。210分間60℃に保温し、室温に冷却したのち、まず
アニオン樹脂Dowex 1 X4（OH-型）をつめたカラム（直
径:1.2cm、長さ:10cm）で、次にカチオン樹脂Dowex 50
WX8（H+型）をつめたカラムで浸出を行なった。浸出液
および洗液を2N水酸化ナトリウム水溶液で中性にしたの
ち、酢酸ナトリウム4gを加えて、エタノールを2.5倍量
加えた。えられた沈殿を、エタノール６に対して水１の
割合で混合液で洗浄したのち、乾燥して生成物1.4gをえ
た。特徴的なピークを示す13C−NMRスペクトルを以下に
示す。
δ（ppm）:177.4、104.6、101.9、99.4、98.6、98.4、9
7.2、96.8、79.9、78.6、72.3、71.9、68.8、62.6、60.
3、54.1、53.1 実施例６ ヘパリン LMW ALFA 87−198 10gを、水酸化ナトリウム
2.7g（0.225N）、酢酸ナトリウム15g（0.625N）および
水素化ホウ素ナトリウム60mgを含有する水溶液300mlを
加えた。50分間60℃に保温し、室温に冷却したのち、蒸
留水で500mlに希釈した。まずアニオン樹脂Dowex 1 X2
（OH-型）をつめたカラム直径:2cm、長さ:15cm）で浸出
し、つぎにカチオン樹脂Dowex 50 WX8（H+型）をつめた
カラム（直径:2cm、長さ:15cm）で、浸出を行なった。
浸出液および洗液を4N水酸化ナトリウム水溶液を用いて
中性にしたのち、酢酸ナトリウム20gを加えて、エタノ
ールを2.5倍量加えた。えられた沈殿をエタノール６に
対して水１の割合で混合液で洗浄したのち、乾燥して生
成物9.1gをえた。以下に特徴的なピークを示す13C−NMR
スペクトルを示す。
δ（ppm）:177.4、104.6、101.9、99.8、98.6、98.4、9
7.2、96.8、79.8、78.6、72.2、71.8、68.9、62.5、60.
3、54.1、53.1 実施例７ 市販のヘパリンナトリウム15gを、水酸化ナトリウム5.4
g（0.225N）、酢酸ナトリウム30g（0.625N）および水素
化ホウ素ナトリウム120mgを含有する水溶液600mlに加え
た。４時間42℃に保温し、室温で冷却したのち、酢酸で
中性にした。一夜、流水で透析したのち、アニオン樹脂
Dowex 1 X2（塩素型）をつめたカラム（直径:2.8cm、長
さ:15cm）で浸出を行なった。浸出液および洗液と酢酸
ナトリウム10gを合わせ、2N水酸化ナトリウム水溶液を
用いてpH7に調整し、エタノールを2.5倍量加えた。えら
れた沈殿をエタノール６に対して水１の割合の混合液を
洗浄したのち、乾燥して生成物を13.9gえた。特徴的な
ピークを示す13C−NMRスペクトルを以下に示す。
δ（ppm）:177.3、104.6、101.9、99.8、98.6、98.4、9
7.2、96.8、79.9、78.6、72.2、71.8、69.0、62.5、60.
3、54.1、53.1 実施例８ 非経口用途のための１バイアル中の含量： 実施例１でモディファイされたヘパリン 10000 U.A.Xa F.U.塩化ナトリウムF.U. 5mg B.Pベンジルアルコール 8mg 無菌蒸留水 1ml （注）F.U.:薬局方［ファルマコポエイアウフィシアレ
（Farmacopoeia Ufficiale）］ B.P:英国薬局方 ［発明の効果］ 本発明によれば、抗血栓作用を充分維持し、出血作用お
よび抗擬血作用を減少させたヘパリン誘導体をうること
ができる。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 ラウール・ロベルト・アルピーノ イタリア共和国、40127 ボローニャ、ビ ア デラ トレッタ、18 (72)発明者 マリア・リタ・ミラーニ イタリア共和国、40060 トレッボ ジレ ーノ（ボローニャ）、ビア ラーメ、71 (72)発明者 マリネラ・ファンツツ イタリア共和国、40133 ボローニャ、ビ ア ボルゲーゼ、15

Claims (9)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】13C−NMRスペクトルにおいて53および54pp
    m付近にシグナルをもち、水溶液における比旋光度が＋5
    0〜＋90゜であり、イオウ含量が８〜11％であり、およ
    びカルボキシル基に対する硫酸基の比率が1.50〜2.20で
    あることを特徴とする新規ヘパリン誘導体。
  2. 【請求項２】ヘパリン性の物質の水溶液に0.01〜1Nのア
    ルカリまたはアルカリ土類金属の塩基を存在させ、0.5
    〜24時間、35〜70℃で処理し、中性付近のpHで炭素数１
    〜３のアルコールを２〜４倍量加えて、モディファイさ
    れた構造をもつ化合物を沈殿させることを特徴とする、
    13C−NMRスペクトルにおいて53および54ppm付近にシグ
    ナルをもち、水溶液における比旋光度が＋50゜〜＋90゜
    であり、イオウ含量が８〜11％であり、およびカルボキ
    シル基に対する硫酸基の比率が1.50〜2.20であることを
    特徴とする新規ヘパリン誘導体の製造法。
  3. 【請求項３】０〜1Nの濃度のアルカリまたはアルカリ土
    類金属の塩を存在させて行なう請求項２記載の製造法。
  4. 【請求項４】触媒量の還元剤を存在させて行なう請求項
    ２または３記載の製造法。
  5. 【請求項５】沈殿させる前に、イオン交換樹脂を用いる
    パーコレーションまたは透析により精製を行なう請求項
    ２、３または４記載の製造法。
  6. 【請求項６】塩基が、水酸化ナトリウム、水酸化カリウ
    ムおよび水酸化バリウムからなる群より選ばれたもので
    ある請求項２、３、４または５記載の製造法。
  7. 【請求項７】塩が、ナトリウム、カリウム、バリウム、
    カルシウムおよびマグネシウムの塩化物および酢酸塩な
    らびにナトリウム、カリウムおよびマグネシウムの硫酸
    塩からなる群より選ばれたものである請求項３、４また
    は５記載の製造法。
  8. 【請求項８】還元剤が水素化ホウ素ナトリウムである請
    求項４または５記載の製造法。
  9. 【請求項９】エチルアルコールを2.5倍量加えることに
    よりモディファイされた化合物を沈殿させてなる請求項
    ２、３、４または５記載の製造法。
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