JPH0740025B2 - アフィニティクロマトグラフィー用ポリマー粒子 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ 本発明は特定の数平均粒径を有し、粒径分布がせまく、
かつ粒子の内部が三次元網目状組織となっているアフィ
ニティクロマトグラフィー用ポリマー粒子に関する。

［従来の技術・発明が解決しようとする課題］ 従来よりポリマー粒子が製造され、クロマトグラフィー
用の充填材、酵素固定用の担体、アフィニティークロマ
トグラフィー用の担体、イオン交換樹脂用母材などとし
て利用されている。

球状ポリマー粒子の製造方法として分散法とスプレー法
が知られている。

分散法では、界面活性剤を含む分散媒体中に小滴状に分
散させたポリマーの希薄溶液からその溶剤を揮発させる
ことによって固化させるか（特開昭56−24430号公報参
照）、この分散液に小滴の凝固剤を徐々に加えて固化さ
せるかする（特開昭57159801号公報参照）ことによって
ポリマー粒子がえられる。この方法では広い粒径分布を
有する粒子がえられる上、固化した小滴から溶剤、分散
媒体および界面活性剤を除くための水だけでなく有機溶
剤による洗浄が必要である。

また分散法の別法として重合性モノマーを分散媒体中に
分散させたのち重合させることによってポリマー粒子を
うる方法も知られており、かかる方法によってえられた
粒子も広い粒径分布を有している。この粒子を電子顕微
鏡で拡大して観察するとさらに微小な球状粒子が凝集し
て粒子を形成している状態が見受けられる。この構造が
原因だと思われるが、この方法でえられた粒子の懸濁液
をマグネチックスターラーなどで撹拌すると微小なポリ
マークズが多量に生じる。

スプレー法では、ポリマー溶液を凝固剤中に噴霧するこ
とによってポリマー粒子がえられる。この粒子も広い粒
径分布を持ち、また粒径も比較的大きい（特開昭52−12
9788号公報参照）。

ところが、ポリマー粒子に粒径の小さいものが多く含ま
れると、吸着効率の良好なカラム状の吸着体として用い
たばあいに圧力損失が大きくなる、とくに血液中から血
漿蛋白質などを選択的に除去するというような用途に用
いると溶血などの問題が生ずる、分画分子量がシャープ
でなくなるので選択性がわるくなるなどの問題が生ず
る。

前記圧力損失に関する問題を改善するためにポリマー粒
子の粒径を大きくすると、比表面積（単位体積当りの粒
子の総表面積）が小さくなり、吸着速度が低下する問題
が生ずる。

ポリマー粒子の粒径分布を狭くして前記のごとき問題の
少ないものも製造されているが（特開昭57−102905号公
報）、この粒子は三次元網目構造ではなく、微小な一次
粒子が集合した粒子であり、機械的強度が必ずしも充分
でなく、一次粒子が脱離するという問題がある。

［課題を解決するための手段］ 本発明は前記諸問題の原因であるポリマー粒子の粒径分
布が広いなどの問題を解消するためになされたものであ
り、数平均粒径が300〜600μｍの範囲にあり、すべての
粒子が数平均粒径の±10％以内にあり、粒子の内部が三
次元網目状組織となっているアフィニティクロマトグラ
フィー用ポリマー粒子に関する。

［実施例］ 本発明のアフィニティクロマトグラフィー用ポリマー粒
子を構成するポリマーの種類などにはとくに限定はな
く、ポリマー粒子を製造しうるものであるかぎりいかな
るものも使用しうる。

このようなポリマーの具体例としては、たとえばセルロ
ース、セルロース誘導体、再生セルロースなどのセルロ
ース系ポリマー、絹フィブロインなどの絹系ポリマー、
キトサンなどのキチン系ポリマー、コラーゲン、アガロ
ース、アルギン酸塩、カラギーナン、ゼラチン、デンプ
ンのごとき天然系ポリマー；ポリアクロニトリル、アク
ロニトリル−スチレン共重合体、アクリロニトリル−ビ
ニルスルホン酸共重合体などのアクリロニトリル系ポリ
マー；ポリメチルメタクリレート、メチルメタクリレー
ト−ヒドロキシエチルメタクリレート共重合体、ポリメ
チルメタクリレートステレオコンプレックス、ヒドロキ
シエチルメタクリレート−スチレン共重合体などの（メ
タ）アクリレート系ポリマー；ポリスチレン、スチレン
−ブタジエン共重合体、スチレン−クロロメチルスチレ
ン共重合体などのスチレン系ポリマー；ポリビニルアル
コール、エチレン−ビニルアルコール共重合体などのビ
ニルアルコール系ポリマー；その他ポリアミド、ポリエ
ステル、ポリエーテル、ポリウレタン、ポリスルホンな
どの縮合系ポリマーなど、それぞれのポリマーに適した
溶剤に溶解させてポリマー溶液を製造しうる合成系ポリ
マーなどがあげられる。

前記ポリマー粒子を構成するポリマーが、たとえばセル
ロース系ポリマーのばあいには、血球成分や血漿蛋白質
の非特異吸着が比較的少ないなどの特徴を有するポリマ
ー粒子がえられるため、血液中から血漿蛋白質などを選
択的に除去するというような用途に好適に使用されうる
粒子がえられる。また、スチレン−ブタジエン共重合体
やスチレン−クロロメチルスチレン共重合体などのよう
に、他の基、たとえばイオン交換性基を導入したり架橋
させたりしうるポリマーを使用したばあいには、アフィ
ニティクロマトグラフィー用充填材の担体である本発明
のアフィニティクロマトグラフィー用ポリマー粒子とし
て使用しうる粒子や、イオン交換樹脂用母材や機械的強
度の大きい粒子や機械的強度の大きいイオン交換樹脂用
母材などに使用しうる粒子がえられる。さらにポリビニ
ルアルコール、エチレン−ビニルアルコール共重合体な
どのように活性水酸基を有するポリマーを使用したばあ
いには、圧力損失の小さいアフィニティークロマトグラ
フィー用担体などに使用しうる粒子がえられる。

本発明のポリマー粒子は、球状（ほぼ真球のもののみな
らず、短径／長径が0.8程度までの楕円状のものの回転
体などをも含む概念である）の粒子であり、数平均粒径
（楕円状回転体のばあいには体積平均粒径、すなわち長
径の２乗に短径を乗じた値の３乗根として求める）が30
0〜600μｍの範囲にあり、すべての粒子が数平均粒径の
±10％以内のものである。

前記数平均粒径が300μｍ未満になると、たとえば血液
中から血漿蛋白質を選択的に除くための吸着体用のポリ
マー粒子として、とくに血漿蛋白質を直接血液潅流法に
よって吸着除去するための吸着材として使用したばあい
などの圧力損失が大きくなり、溶血がおこりやすくなる
などの問題が生じやすくなる。また600μｍをこえると
比表面積が小さくなり、吸着速度が遅くなり、血液の循
環量の割に不要物の吸着除去量が少なくなる。

また、前記数平均粒径の±10％以内の粒子の割合がすべ
てでないばあいには、前記のごとき吸着体用の吸着材と
して使用したばあいには圧力損失が大きくなったり、溶
血がおこりやすくなったりしやすくなる。

本発明のポリマー粒子の表面の状態にはとくに限定はな
く、スキン層が存在していてもよく、網目状組織となっ
ていてもよく、スキン層と網目状組織との中間の状態で
あってもよいが、その内部は三次元網目状組織となって
いる。

三次元網目状組織とは、前記のように重合性モノマーの
液滴を重合させた粒子がさらに微小な粒子の重合体（重
合体）であるのに対して、文字通り、海綿のように有孔
面が三次元的に連続した構造または繊維が三次元的に連
続した構造となっている組織を意味する。

ポリマー粒子内部の三次元網目状組織を構成する網目の
大きさ、空孔率などにもとくに限定はしないが、網目の
大きさは0.1〜10μｍ程度が好ましく、また内部に直径
が10μｍを越える空洞部分を局部的に有してもよい。空
孔率は50〜95％程度が好ましい。

前記網目状組織の網目の大きさが0.1μｍ未満になる
と、吸着体用の吸着材として用いたばあいに血液中の前
記不要物の吸着速度が小さくなるのみならず、これら不
要物の吸着除去が充分行なわれなくなるなどの傾向が生
じる。また10μｍをこえると、カラムに充填して使用す
る際などの輸送時や充填時などに粒子が変形したり、破
砕したりしやすくなる傾向が生じ、粒子の機械的強度が
充分でなくなる傾向にある。

ポリマー粒子表面にスキン層が存在するばあい、スキン
層の厚さとして0.1〜10μｍ程度のものが通常えられ
る。このようにポリマー粒子表面にスキン層のあるポリ
マー粒子は、表面の孔径が比較的小さいので、排除限界
分子量がおよそ100万以下のクロマトグラフィー用粒
子、またはイオン交換樹脂用母材粒子として適したもの
になる。

またポリマー粒子表面が網目状組織のばあい、網目状組
織には通常0.01〜５μｍの孔径の孔が存在する。このよ
うにポリマー粒子表面が網目状組織のばあいには排除限
界分子量がおよそ100万以上のクロマトグラフィー用粒
子、あるいは固定化酵素の担体として適したものにな
る。

つぎに本発明のポリマー粒子の製造をセルロース系ポリ
マーを用いたばあいについて説明する。

本発明のポリマー粒子の１種であるセルロース系粒子
は、セルロース、セルロース誘導体などを溶解させたセ
ルロース系溶液を、たとえば特開昭62−191033号公報に
記載の装置および方法（振動法と乾湿式凝固法とを組合
わせた方法）を適用することにより製造されうる。

前記セルロース系溶液を調製する際に用いる溶剤として
は、セルロースの溶剤となる、たとえば銅アンモニア水
溶液、ジメチルスルホキシドとパラホルムアルデヒドと
の混合液、チオシアン酸カルシウム水溶液など、また代
表的なセルロース誘導体である酢酸セルロースの溶剤と
なる、たとえばジメチルスルホキシド、ジメチルホルム
アミド、ジメチルアセトアミド、Ｎ−メチル−２−ピロ
リドン、アセトなどがあげられる。

これらの溶剤には、えられるセルロース系粒子の表面に
スキン層を形成するか否か、スキン層を形成するばあい
にはその厚さをどの程度にするか、内部の網目状組織の
孔の大きさをどの程度にするかなどを調節するために、
メタノール、エタノール、エチレングリコール、プロピ
レングリコール、グリセリン、水、無機塩類、ポリエチ
レングリコール、ポリビニルピロリドンなどを加えても
よい。

このようにして調製された５〜20％（重量％、以下同
様）程度のセルロース系溶液は、たとえば特開昭62−19
1033号公報に記載のごとき装置を用いてほぼ均一な大き
さの小液滴として気相中に噴出せしめられ、ほぼ球形に
なる飛行距離以上を飛行せしめられたのち凝固剤と接触
せしめられる。このようにして製造されるセルロース系
粒子はほぼ真球の粒子である。

前記凝固剤はポリマーの非溶剤からなるが、小滴を構成
する溶剤と溶けあい、小滴が自然にぬれるような表面張
力を有するものが好ましい。このような凝固剤の具体例
として、たとえば水、水と前記良溶剤または非溶剤との
混合液、水と界面活性剤との混合液などがあげられる。

一般にポリマー溶液中のポリマーの濃度が高く、非溶剤
の割合が少なく、水のように凝固力の強い凝固液を使用
するとスキン層を形成させることができ、また凝固を遅
くして、ポリマーを密に凝集させることによって粒子内
部の網目状組織の網目の大きさを小さくすることができ
る。

ポリマー溶液中のポリマー濃度が低く、非溶剤の割合が
設く、凝固力の比較的弱い凝固液を使用すると、表面ま
で網目状組織を有する粒子を形成させることができる。

前記説明においてはセルロース系ポリマーを用いてポリ
マー粒子を製造したが、他のポリマーを用いるばあいに
も上記のように適当な溶剤にポリマーを溶解させたポリ
マー溶液を用い、該ポリマーの非溶剤を凝固液として使
用し、前記と同様の方法でポリマー粒子を製造しうる。

ポリマーの溶剤、非溶剤および凝固剤は、たとえば「日
本化学会編，化学便覧，丸善（株）（1984）」、「J.Br
andrup ＆ E.M.Immergut,editors:John Wily ＆ Sons,N
ew York,ポリマー ハンドブック（Polymer Handbook）
（1975）」などにより選択することができる。

このようにしてえられたポリマー粒子にイオン交換性基
などの他の基を導入したり架橋させたりするサイトが存
在するばあいには、そののち他の基を導入したり架橋さ
せたりすればよい。

このようにしてえられた本発明のポリマー粒子は特定の
平均粒径および特定の粒径分布を有し、かつ粒子内部が
三次元網目状組織を有するため、アフィニティクロマト
グラフィー用担体として好適に使用することができ、こ
の用途に使用したばあいには圧力損失、吸着速度、分離
速度、選択性などの点で優れたものとなる。

なお、前記ポリマー粒子は、クロマトグラフィー用充填
材、酵素固定用担体、イオン交換樹脂用母材などの用途
に使用したばあいにも、前記優れた特徴が発現する。

つぎに本発明のポリマー粒子を実施例に基づき説明する
が、本発明がこれら実施例に限定されないことは勿論で
ある。

実施例１ 二酢酸セルロースを濃度が12.5％となるようにジメチル
スルホキシド／プロピレングリコールが重量比で4/6の
混合液に溶解させた。

ノズルの前方5mmのところに2cmの間隔を離して、巾5c
m、液滴の進行方向の長さ25cmの大きさの平均平板状の
電極を設置し、該電極のノズルとの間に800Vの直流電圧
を印加した。このノズルに設けた直径250μｍのオリフ
ィスから、145℃に保持した前記溶液を7.8m/secの線速
で3850Hzの振動を加えながら吐出させ、該溶液の均一な
液滴を形成させ、空気中を約3m飛行させたのち、23℃の
10％メタノール水溶液中へ侵入させて凝固させ、二酢酸
セルロースの粒子をえた。

えられた二酢酸セルロース粒子を50℃、0.6％のカ性ソ
ーダ水溶液に投入して、２時間撹拌したのち回収し、中
和・水洗して、ほぼ100％再生された再生セルロース粒
子をえた。

えられた再生セルロース粒子の数平均粒径を下記方法に
より測定したところ、430μｍであり、粒子がすべて平
均粒径±５％以内にあった。

えられた再生セルロース粒子内の液体をエタノールで置
換してから炭酸ガス臨界点乾燥（（株）日立製作所製の
臨界点乾燥器HCP−２を使用）させ、金を蒸着させたの
ち走査型電子顕微鏡で観察したところ、表面に厚さ約0.
2μｍのスキン層があり、内部は孔径が約0.2〜２μｍの
多孔質三次元網目状組織であった。

前記再生セルロース粒子を内径14mm、長さ7cmのカラム
に充填し、ヘパリンを30ユニット/ml加えた牛の新鮮血
を37℃に保温して流し、徐々に流量を大きくして圧力損
失を測定したところ、線速の増加と伴にほぼ直線的に圧
力損失が大きくなったが、8cm/minのときでも50mmHg
で、そのまま１時間連続運転してもこの値はほとんど変
わらず、直接血液潅流可能であった。

前記再生セルロース粒子をエピクロルヒドリンと反応さ
せ、ついでｎ−ヘキシルアミンと反応させて、ｎ−ヘキ
シルアミン固定化セルロース粒子をえた。この粒子の選
択性を下記方法により測定したところ、リゾチーム、ア
ルブミンに対する吸着率はそれぞれ73％および８％であ
った。

（数平均粒径および粒径分布） 数百個（約500〜1000個）の粒子の光学顕微鏡像を画像
処理装置（（株）ニレコ製のルーゼックスII）を使用し
て処理して求める。

（選択性） pH7.4に調整した0.025Mリン酸緩衝液にリゾチームおよ
びアルブミンをそれぞれ3mg/mlおよび7.3mg/mlの濃度に
なるように溶解させた各々の液６溶量に対し、沈降体積
として１容量の割合になるようにセルロース系粒子に血
漿淡白質に吸着性を有するリガンドを固定したものを加
え、37℃で２時間振盪したのち、上澄液の濃度を測定し
てそれぞれの吸着率を求める。

（直接血液潅流の可能性の判定） ヘパリンを30ユニット/ml加えた牛の新鮮血を37℃に保
温して、粒子を充填した長さ7cm、内径14mmφのカラム
に徐々に流量を増加させながら線速度が8cm/minにある
まで流して、この間に圧力損失が100mmHgをこえないも
のを直接血液潅流が可能であると判定した。

実施例２ ポリアクリロニトリルを濃度が９％となるようにジメチ
ルスルホキシド／プロピレングリコールが重量比で70/3
0の混合液に溶解させた。

ノズルの前方5mmのところに2cmの間隔を離して、巾が5c
m、液滴の噴出方向の長さが10cmの大きさの平行平板状
の電極を設置し、該電極とノズルとの間に800Vの直流電
圧を印加した。このノズルに設けた直径120μｍのオリ
フィスから、103℃に保持した前記溶液を6m/secの線速
で1000Hzの振動を加えながら吐出させ、該溶液の均一な
液滴を形成させ、空気中を約3m飛行させたのち、23℃の
0.1％中性洗剤（ポリオキシエチレンソルビタンモノラ
ウレート）水溶液中へ侵入させて凝固させ、ポリアクリ
ロニトリルの粒子をえた。

えられたポリアクロニトリル粒子の数平均粒径を実施例
１と同様の方法により測定したところ、460μｍで、粒
子がすべて平均粒径±６％以内にあった。

えられたポリアクリロニトリル粒子を室温で真空乾燥さ
せ、金を蒸着させたのち走査型電子顕微鏡で観察したと
ころ、表面に厚さ約0.1μｍのスキン層があり、内部は
孔径が約0.2〜１μｍの均一な多孔質三次元網目状組織
であった。

前記ポリアクロニトリル粒子を用いて実施例１と同様に
て圧力損失を測定したところ、線速の増加と共にほぼ直
線的に圧力損失が大きくなったが、8cm/minのときでも3
0mmHgで、そのまま１時間連続運転してもこの値はほと
んど変わらず、直接血液潅流可能であった。

実施例３ ポリメチルメタクリレートを、濃度が約17％となるよう
にジメチルスルホキシド／プロピレングリコールが重量
比で68/32の混合液に溶解させた。

ノズルの前方5mmのとこり2cmの間隔を離して、巾5cm、
液滴の噴出方向の長さが10cmの大きさの平均平板状の電
極を設置し、該電極とノズルとの間に800Vの直流電圧を
印加した。このノズルに設けた直径120μｍのオリフィ
スから、101℃に保持した前記溶液を7.1m/secの線速で9
30Hzの振動を加えながら吐出させ、該溶液の均一な液滴
を形成させ、空気中を約3m飛行させたのち、23℃の0.1
％中性洗剤（ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレ
ート）水溶液中へ侵入させて凝固させ、ポリメチルメタ
クリレートの粒子をえた。

えられたポリメチルメタクリレート粒子の数平均粒径を
実施例１と同様の方法により測定したところ、470μｍ
で、粒子がすべて平均粒径±８％以内にあった。

えられたポリメチルメタクリレート粒子を室温で真空乾
燥させ、金を蒸着させたのち走査型電子顕微鏡で観察し
たところ、表面に厚さ約0.2μｍのスキン層があり、内
部は孔径が約0.2〜0.5μｍの均一な多孔質三次元網目状
組織であった。

前記ポリメチルメタクリレート粒子を用いて実施例１と
同様にして圧力損失を測定したところ、線速の増加と共
にほぼ直線的に圧力損失が大きくなったが、8cm/minの
ときでも30mmHgで、そのまま１時間放置してもこの値は
ほとんど変わらず、直接血液潅流可能であった。

実施例４ ポリスチレンを、濃度が15％となるようにＮ−メチル−
２−ピロリドン／プロピレングリコールが重量比で68/3
2の混合液に溶解させた。

ノズルの前方5mmのところに2cmの間隔を離して、巾5c
m、液滴の噴出方向の長さが10cmの大きさの平均平板状
の電極を設置し、該電極とノズルとの間に800Vの直流電
圧を印加した。このノズルに設けた直径100μｍのオリ
フィスから、124℃に保持した前記溶液を7.6m/secの線
速で850Hzの振動を加えながら吐出させ、該溶液の均一
な液滴を形成させ、空気中を約3m飛行させたのち、23℃
の0.1％中性洗剤（ポリオキシエチレンソルビタンモノ
ラウレート）水溶液中へ侵入させて凝固させ、ポリスチ
レンの粒子をえた。

えられたポリスチレン粒子の数平均粒径を実施例１と同
様の方法により測定したところ、440μｍで、粒子がす
べて平均粒径±５％以内にあった。

えられたポリスチレン粒子を室温で真空乾燥させ、金を
蒸着させたのち走査型電子顕微鏡で観察したところ、表
面に厚さ約0.2μｍのスキン層があり、内部は孔径が約
0.2〜２μｍの多孔質三次元網目状組織で、かつ約20μ
ｍの空洞を局部的に有していた。

前記ポリスチレン粒子を用いて実施例１と同様にして圧
力損失を測定したところ、線速の増加と共にほぼ直線的
に圧力損失が大きくなったが、8cm/minのときでも25mmH
gで、そのまま１時間連続運転してもこの値はほとんど
変わらず、直接血液潅流可能であった。

比較例１ 均一な液滴の形成条件を変更して実施例１と同様にし
て、数平均粒径が290μｍで100％の粒子が数平均径の±
５％以内にある実施例１とほぼ同じ断面構造の再生セル
ロース粒子をえた。この粒子を用いて実施例１と同様に
して圧力損失を測定したところ、線速が5cm/minのとこ
ろですでに100mmHgをこえていた。

比較例２ 均一な液滴の形成条件を変更して実施例２と同様にし
て、数平均粒径が290μｍで100％の粒子が数平均粒径の
±５％以内にある実施例２とほぼ同じ断面構造のポリア
クリロニトル粒子をえた。この粒子を用いて実施例１と
同様にして圧力損失を測定したところ、線速が5cm/min
のところですでに100mmHgをこえていた。

比較例３ 均一な液滴の形成条件を変更して実施例３と同様にし
て、数平均粒径が274μｍで100％の粒子が数平均粒径の
±７％以内にある実施例３とほぼ同じ断面構造のポリメ
チルメタクリレート粒子をえた。この粒子を用いて実施
例１と同様にして圧力損失を測定したところ、線速が5c
m/minのところですでに100mmHgをこえていた。

比較例４ 均一な液滴の形成条件を変更して実施例４と同様にし
て、数平均粒径が280μｍで100％の粒子が数平均粒径の
±５％以内にある実施例４とほぼ同じ断面構造のポリス
チレン粒子をえた。この粒子を用いて実施例１と同様に
して圧力損失を測定したところ、線速が5cm/minのとこ
ろですでに100mmHgをこえていた。

比較例５ 数平均粒径が450μｍで、89％の粒子が数平均粒径の10
％以内にある市販の再生セルロース粒子を用いて実施例
１と同様にして圧力損失を測定したところ、線速が2cm/
minですでに圧力損失が100mmHgをこえ、そののちさらに
圧力損失が大きくなったので実験を中止した。

以上の結果から、直接血液潅流時の圧力損失に関係する
のはポリマーの種類というよりはポリマー粒子の粒径お
よびその分布であることがわかる。この結果はポリマー
粒子の表面エネルギーが大きいポリマー（セルロース）
では圧力損失が小さくなり、表面エネルギーの小さいポ
リマー（ポリメチルメタクリレートやポリスチレン）で
は圧力損失が大きくなるという従来からの通説と異なっ
た結果であり、表面エネルギーの小さいポリマー粒子で
も直接血液潅流用吸着体粒子として使用しうることを示
すものである。

［発明の効果］ 本発明のアフィニティクロマトグラフィー用ポリマー粒
子は特定の数平均粒径および特定の粒径分布を有し、か
つ粒子内部が三次元網目状組織であるため、アフィニテ
ィクロマトグラフィー用充填材にしてたとえば血液中か
ら血漿蛋白質を選択的に直接血液潅流法によって吸着除
去するなどの用途に用いたばあいには、微粒子の発生が
なく、圧力損失が小さく、溶血などの問題が生じにくく
なるなどの効果が達成される。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】数平均粒径が300〜600μｍの範囲にあり、
   すべての粒子が数平均粒径の±10％以内にあり、粒子の
   内部が三次元網目状組織となっているアフィニティクロ
   マトグラフィー用ポリマー粒子。