JPH0740933B2 - 組換えｄｎａ法、ベクター及び宿主細胞 - Google Patents
組換えｄｎａ法、ベクター及び宿主細胞Info
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Description
本発明は、組換えDNA技術による蛋白産生のために宿主
細胞として用いるリンパ系セルラインの改良法に関す
る。また本発明は、この改良法に用いるベクター及びこ
の改良法によつて得られる宿主細胞に関する。 現在ではリンパ系セルラインは、組換えDNA技術により
イムノグロブリン、関連ハイブリッドもしくはキメラ蛋
白質（Ig−タイプ分子）あるいは他の組換え蛋白を産生
する際の宿主細胞として使用できるとされている。リン
パ系細胞には、in vivoでIg分子を産生するＢセルと同
様にいくつかのジエネラルタイプを有するミエローマ細
胞などが含まれており、従つて、リンパ系細胞はIg−タ
イプ分子の正しい構築及び分泌を行なうのに必要な分子
内機構を元来有しているものと考えられる。このような
リンパ系細胞は、組換えDNA技術により非Ig−タイプ分
子を産生するに際しても使用できると思われる。 ミエローマセルライン、Ｔセルリンパ腫などの多くのリ
ンパ系セルラインは、グルタミン欠損培地ではin vitro
で生育できないことが知られている。リンパ系セルライ
ンを形質転換してグルタミン非依存性にすることが可能
となれば、これによって形質転換セルラインを選択する
有利な方法が提供されることになる。 従つてグルタミン非依存性にすることは極めて有用であ
ると考えられている。 このようなセルラインにグルタミンシンセターゼ（GS）
をコードする遺伝子を導入することによつてグルタミン
非依存性に形質転換できると推測されている。このよう
な示唆はEP−A0256055（Celltech）明細書に記載されて
いる。しかしながら、その後、トランスフエクト体の同
定が困難もしくは不可能な程度に高頻度で、グルタミン
欠損培地で生育できる変異体がハイブリドーマセルライ
ンによつて自然に産生されることが見出されている。ミ
エローマセルラインをGS遺伝子でトランスフエクトし、
グルタミン欠損培地で形質転換体を生育せしめても有意
な量で生存しつづけることができない。 従つて、本発明の目的は、リンパ系セルラインをグルタ
ミン非存在性に形質転換する方法を提供することにあ
る。 本発明によれば、リンパ系セルラインをグルタミン非依
存性に形質転換する方法であつて、 活性グルタミンシンセターゼ（GS）遺伝子を含むベクタ
ーでリンパ系セルラインを形質転換し； 形質転換セルラインをグルタミンを含む培地で生育し；
次いで グルタミンが順次減少していく培地あるいはグルタミン
欠損培地で該形質転換セルラインを生育し続づける； ことからなる上記方法が提供される。 リンパ系セルラインはミエローマセルラインが好まし
い。 グルタミン減少もしくは欠損培地はアスパラギンを含有
しているのが好ましい。あるいは、培地は、グルタミン
欠損培地で形質転換セルラインの生存を可能とするよう
な他の栄養素を含有していてもよい。このような栄養素
は、塩化アンモニウムなどのアンモニアドナーでもよ
い。 驚くべきことに、形質転換リンパ系セルラインを最初に
グルタミン含有培地で生育させない場合には、ベクター
によつて形質転換されていてもいなくてもいずれのセル
ラインも生育できないことが見出された。本発明の方法
を使用することにより、ベクターで形質転換されたリン
パ系セルラインを選択することが可能である。 あるいは、リンパ系セルラインは、gpt遺伝子などの他
の選択マーカーをコードする遺伝子と活性GS遺伝子とを
含有するベクターで形質転換してもよく、あるいは、GS
と選択マーカーをそれぞれコードする別別のベクターで
一緒に形質転換してもよい。次いで、培地中のグルタミ
ンを減少させる前に、選択マーカーを用いて形質転換宿
主細胞を選択することができる。 この方法の利点は、毒性薬剤を使用することなくベクタ
ーの選択が可能となることである。ベクターが除去され
た宿主細胞はグルタミン欠損培地では生存できない。 この方法の更に他の利点は、宿主細胞の内因性GS遺伝子
を増幅させることなく遺伝子増幅の選択が可能となるこ
とである。 培地中のグルタミンは、グルタミンを欠いたアスパラギ
ンを含有する培地で希釈することによつて順次減少させ
て行くのが好ましい。 リンパ系セルラインを形質転換するのに用いるベクター
は、リンパ系セルラインにとつて異種の蛋白をコードす
る活性遺伝子を含有しているのが好ましい。あるいは、
リンパ系セルラインを、異種蛋白をコードする活性遺伝
子を含む他のベクターと一緒に形質転換してもよい。 異種蛋白は一本鎖として発現される蛋白でもよい（それ
は発現後にマルチチエインに開裂されるかもしれない
が）。このような一本鎖発現生成物の例としては、組織
プラスミノーゲンアクチベーター（tPA）、ヒト成長ホ
ルモン（hGH）、メタロプロテイナーゼの組織抑制因子
（TIMP）などが挙げられる。 しかしながら、異種蛋白はIgタイプ分子が好ましい。こ
の分子の場合には、２つのペプチド鎖が別々に発現され
ることが必要であり、この２つのペプチド鎖は発現後は
一緒になつて完全な分子を形成する。従つて、セルライ
ンは、Ｈ鎖（もしくはＨ鎖アナログ）及びＬ鎖（もしく
はＬ鎖アナログ）を別々にコードする活性遺伝子で形質
転換する必要がある。 Ｈ鎖及びＬ鎖をコードする遺伝子はGS遺伝子と同様のベ
クター上に両者とも存在しているのが好ましい。あるい
は、GS遺伝子を含有するベクターが更にＨ鎖もしくはＬ
鎖遺伝子のいずれか１つを有し、他の遺伝子が別のベク
ター中に含まれていてもよい。あるいはまた、Ｈ鎖及び
Ｌ鎖遺伝子がGS遺伝子を含有するベクター中に存在せ
ず、両者は同じあるいは別々のベクター中に存在しても
よい。 このような異種蛋白の発現は、例えば選択剤としてメチ
オニンスルホキシミン（MSX）を用いたGS遺伝子の選択
的増幅によりかなり増加させることができる。 GS遺伝子は比較的弱いプロモーターを有し、異種蛋白を
コードする遺伝子は比較的強いプロモーターを有し形質
転換セルライン中での蛋白合成がGS蛋白の産生よりも異
種蛋白もしくはペプチドの産生に優先的に向けられるよ
うにするのが好ましい。更には、GS遺伝子が強いプロモ
ーターよりもむしも弱いプロモーターによつてコントロ
ールされている場合には、遺伝子の選択的増幅を行なう
には低濃度のMSXなどの選択剤を使用することが必要で
ある。 弱いプロモーターを使用することにより、GS遺伝子がゲ
ノム中の特に有利な位置に挿入された形質転換セルライ
ンを選択することが可能となると考えられる。これによ
つて、GS遺伝子といずれの異種遺伝子もが有効に転写さ
れることが保証される。 全ての遺伝子が同じベクター中に存在している場合に
は、これらの遺伝子を正しく発現させるためには注意深
くベクターをデザインする必要があることが見出され
た。 しかして、本発明の第２の局面によれば、リンパ系セル
ラインをグルタミン非依存性に形質転換し異種蛋白産性
を可能にするベクターであつて、GS遺伝子と異種蛋白を
コードする遺伝子を含有し、異種蛋白をコードする配列
を転写するプロモーター／エンハンサーからの転写イン
ターフエアレンスにより、GS遺伝子の発現がグルタミン
非依存性コロニーが産生されない程度には妨害されない
ようにアレンジされている上記ベクターが提供される。 ベクター中の遺伝子はこのような方向生でアレンジされ
ており、プロモーターは転写インターフエアレンスを実
質的に阻止するようにされているのが好ましい。例え
ば、GS遺伝子は比較的弱いプロモーターを有し、異種蛋
白をコードする遺伝子は比較的強いプロモーターを有
し、GS遺伝子のプロモーターは異種蛋白をコードする遺
伝子のプロモーターの上流に位置し、あるいはGS遺伝子
のプロモーターは異種蛋白をコードする遺伝子のプロモ
ーターとは逆の方向で発現を誘導するようにしてもよ
い。 驚くべきことに、上記のようにしてベクターをアレンジ
することによつて、GS遺伝子の発現が十分な量で行われ
て選択が可能となり、そして異種蛋白も他のベクターの
場合よりもより効果的に発現されることが見出された。 例えば、異なるプロモーターを用い、あるいは異なる順
序もしくは方向で遺伝子を用いてベクターをアレンジし
た場合には、GSもしくは異種蛋白の産生レベルは極めて
低くなるかあるいはゼロになることが観察された。強い
プロモーターを含む遺伝子を弱いプロモーターを含むGS
遺伝子の上流においた場合には、上流遺伝子の転写は下
流遺伝子にまで及び、下流プローモーターが閉塞される
ことが考えられる（本件出願人はこの考えに限定された
くないが）。形質転換コロニーの頻度はGS遺伝子の発現
レベルに依存しているため、このようなプロモーターの
閉塞によりトランスフエクト体の回収頻度が著しく減少
する。 弱いプロモーターと強いプロモーターとの組み合わせ
は、sv40初期領域とhCMV−MIEプロモーター（hCMV−MIE
＝ヒトサイトメガロウイルス主要即時初期遺伝子）との
組合わせが好ましい。しかしながら、他の適当なプロモ
ーターの組合わせも当業者には明らかであろう。 本発明のベクターの好ましい態様は、弱いプロモーター
を有するGS遺伝子の下流に強いプロモーターを有するＨ
鎖様遺伝子があり、GS遺伝子のプロモーター及びＨ鎖様
遺伝子のプロモーターと逆の方向で強いプロモーターを
有するＬ鎖様遺伝子が存在するベクターである。 あるいは、プロモーターの閉塞は、遺伝子の間に転写終
止シグナルを設けることによつて防ぐことができる。 あるいは、遺伝子の間に非反復制限酵素部位を設けても
よい。この場合には、ベクターを宿主細胞中に導入する
前に、この部位を利用してベクターを線状化する。これ
によつて、形質転換宿主細胞中にてプロモーターの閉塞
が起きないようにすることができる。 ベクター中に異種蛋白をコードする遺伝子が２つ以上あ
る場合には、これらの遺伝子が転写インターフエアレン
スを促進しないようにすることが必要である。例えば、
ベクターがGS遺伝子、Ｈ鎖遺伝子及びＬ鎖遺伝子を含有
する場合には、これら３つの遺伝子のいずれもが同じ方
向で転写されGS遺伝子は他の２つの遺伝子の上流にある
のが好ましく、あるいは、GS遺伝子と他の遺伝子の１つ
は同じ方向で転写されGS遺伝子は他の第１の遺伝子の上
流にあり第２の遺伝子は他の方向で転写されそして第２
の遺伝子のプロモーターはGS遺伝子のプロモーターに接
しているのが好ましい。 ベクターは、ラムダフアージなどのウイルスベクターか
らなるものでもよく、あるいは、例えば周知のpBR322プ
ラスミドに基づくプラスミドベクターからなるものでも
よい。しかしながら、当業界において周知のいずれのベ
クターも、慣用的組換えDNA技術を用いて本発明に採用
することができる。 また、本発明は、本発明の方法によつて産生される宿主
細胞もしくは本発明のベクターを含有する宿主細胞を包
含する。 特に本発明は、GS遺伝子を含むベクターと異種蛋白をコ
ードする遺伝子を含むベクターとで一緒に形質転換され
たリンパ系セルラインであつて、これらのベクターは、
グルタミン非依存性コロニーが産生できない程度にはGS
遺伝子が転写インターフエアレンスにより妨害されない
ようにアレンジされているベクターである上記リンパ系
セルラインを包含する。 以下に添付した図面を参照して例により本発明を説明す
る。 第１図は、プラスミドpAB2GSでトランスフエクトされた
NSO細胞から分泌される蛋白のウエスタンブロツトによ
る分析を示し、このウエスタンブロツトでは、培養上清
あるいはコントロール組織培養培地25μを10％SDS還
元ポリアクリルアミドゲルに付し、ニトロセルロースに
ブロツトし、ヒトIg鎖を認識する抗血清でプローブし、
次いで125I−ラベル化プロテインＡでプローブした。 第２図は、プラスミドpSV2GScLcの構造を示す。 第３図は、プラスミドpST6の構造を示す。 第４図は、セルラインSV2GSNSO及びCMGSNSOのゲノムDNA
のサザンブロツト分析を示す。 第１図では、レーン１は精製キメラ72.3抗体を示し、Ig
L鎖及びＨ鎖の位置を表わし、レーン２−５は異なるト
ランスフエクトクローンの培養上清を示し、レーン６は
ネガテイブコントロールの培養上清を示す。 第２図では、ＥはSV40初期領域プロモーター、GSはGScD
NAコード配列、イントロン＋PAはスモールｔ−イントロ
ンとSV40の初期領域ポリアデニル化シグナル、hCMVはhC
MV−MIEプロモーター−エンハンサー、cLcはB72.3とし
て知られているヒユーマナイズ抗体のキメラＬ鎖のコー
ド配列、pAはSV40初期ポリアデニル化シグナルを示す。 第３図では、hCMVはhCMV−MIEプロモーターエンハンサ
ー（2.1kb）フラグメント、CHCはB72.3抗体のキメラＨ
鎖コード配列、CLCはB72.3抗体のキメラＬ鎖コード配列
を示す。ポリＡはSV40初期ポリアデニル化シグナルを含
む。Ｉ＋PAはSV40のスモールｔイントロンと初期領域ポ
リアデニル化シグナルを含む。SVEはSV40初期プロモー
ターを示す。 バクテリアプラスミドの複製オリジン及びアンピミリン
耐性遺伝子はpBR322から得た。 第４図では、MSXで選択前及び選択後のNSO細胞中のGS−
ベクターのコピー数分析を示す。DNAサンプルはBgl IBg
l IIで消化し、１％アガロースゲル上で電気泳動し、ニ
トロセルロースにトランスフアーし、GScDNAから単離さ
れたpGSC45〔11〕の0.5kb5′PstlDNAフラグメントでプ
ローブした。 DNAサンプルは以下の通りである。 レーン1:100コピー／セルに相当するプラスミドpSV2GS; レーン2:10コピー／セルに相当するプラスミドpSV2GS; レーン3:1コピー／セルに相当するプラスミドpSV2GS; レーン4:10μgNSOゲノムDNA; レーン5:10μgSV2GSNSOゲノムDNA; レーン6:10μgSV2GSNSO（100μMMSX耐性）ゲノムDNA; レーン7:100コピー／セルに相当するプラスミドpCMGS; レーン8:10コピー／セルに相当するプラスミドpCMGS; レーン9:1コピー／セルに相当するプラスミドpCMGS; レーン10:10μgCMGSNSOゲノムDNA; レーン11:10μgCMGSNSO（100μMMSX耐性）ゲノムDNA; m.w.:Cla Iで消化したλフアージDNA;分子量マーカー。 引用文献のリストは最後に示した。以下では引用文献は
カギカツコで囲つた番号で示した。 ベクター 以下の例では、比較のためにEP−Ａ−0256055に記載さ
れた２つのプラスミドを用いた。これらはプラスミドpS
VLS1とpSV2GSである。プラスミドpSVLGS1はGSミニ遺伝
子を含んでおり、SV40後期領域プロモーターのコントロ
ール下にcDNAとゲノムDNA配列を有している。プラスミ
ドpSV2GSはSV40初期領域プロモーターのコントロール下
にGSをコードするcDNA配列を含有している。 合成オリゴヌクレオチドリンカーを付加してpSV2GSの非
反復pvu II部位をBam H I部位に変換することによりベ
クターpSV2BamGSを得た。 合成オリゴヌクレオチドリンカーを用いて、主要即時初
期遺伝子プロモーター、エンハンサー及びヒトサイトメ
ガロウイルス（hCMV−MIE）の完全５′−非翻訳配列
（残りの５′非翻訳配列を再構築するために合成オリゴ
ヌクレオチドとともにPs−1mフラグメント〔１〕）をpS
V2GSのNco I部位の間に挿入して、hCMV−MIEプロモータ
ーがGSコード配列の発現を誘導するようにした。得られ
るプラスミドをpCMGSとした。 プラスミドpSV2BamGSをBam H Iで消化し、転写カセツト
を含む2.1kbフラグメントを得た。 他の発現プラスミドを構築を容易に行なうために基本ベ
クターpEE6を用いた。プラスミドpEE6には、プラスミド
pCT54〔２〕のXmn I−Bcl Iフラグメント、及びHind II
IとEcoR I部位との間に挿入されたプラスミドpSP64
〔３〕のポリリンカーが含まれており、Bam H IとSAl I
部位とはこのポリリンカーによつて除かれている。Bcl
I−Bam H Iフラグメントは237bpSV40初期遺伝子のポリ
アデニル化シグナル（SV40ヌクレオチド2770−2533）で
ある。Bam H I−Bgl IフラグメントはプラスミドpBR322
〔４〕（ヌクレオチド275−2422）から得られらたもの
であるが、Sal IとAva I部位との間（ヌクレオチド651
−1425）は欠失しており、Ava I部位にSal Iリンカーが
付加されている。Bal I部位からXmn I部位までの配列は
プラスミドpSP64〔３〕のβ−ラクタマーゼ遺伝子から
のものである。 プラスミドpEE6gptには、プラスミドpSV2gpt〔５〕のシ
ングルPvu II部位にBam H Iリンカーを付加してBam H I
フラグメントとしてプラスミドpEE6中にクローン化され
たプラスミドpSV2gptから得たキサンチン−グアニンホ
スホリボシルトランスフエラーゼ（gpt）をコードする
転写ユニットが含まれている。同様にして、pEE6gptか
らキサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフエラ
ーゼ（gpt）の転写カセツトを含有するプラスミドpCMGS
の誘導体を構築した。このプラスミドをpCMGSgptとし
た。 プラスミドpEE6hCMVには、オリゴヌクレオチドリンカー
によつてプラスミドpEE6のHind III部位に挿入されたhC
MV−MIEプロモーター−エンハンサーと完全５′非翻訳
配列が含有されている。 プラスミドpEE6 hCMV Bgl IIはpEE6hCMVの誘導体であつ
て、hCMVエンハンサーの上流のHind III部位が、ブラン
ト末端化及び合成オリゴヌクレオチドリンカーの付加に
よりBgl II部位に変換されている。 プラスミドpEE6HCLCBgは、B72.3抗体〔６〕のマウス−
ヒトキメラIgL鎖をコードする配列がhCMV−MIEプロモー
ター−エンハンサーのコントロール下に該Ｌ鎖が位置す
るようにpEE6hCMVのEcoR I部位に挿入されたpEE6hCMVか
ら得られるベクターである（上流のHind III部位はスタ
ンダード法によつてBgl II部位に変換されている）。pS
V2BamGSの2.1kb Bam H IフラグメントをpEE6HCLCBgに挿
入し、プラスミドpcLc2GSを得た。このプラスミドで
は、Ｌ鎖遺伝子の下流のGS遺伝子とともにIgL鎖とGS遺
伝子とが同じ方向で転写される。 pEE6HCHHCLは、hCMV−MIEプロモーター−エンハンサー
のコントロール化にキメラB72.3抗体〔６〕のＨ鎖及び
Ｌ鎖の両者をコードする配列を含有するベクターであ
る。pSV2BamGSの2.1kbBam H I断片をpEE6HCHHCLに挿入
して、Ｈ鎖、Ｌ鎖及びGS遺伝子がこの順序で同じ方向で
転写されるプラスミドpAb2GSを得た。 pEE6HcLcBgの3.1kb Bgl II−Bam H IフラグメントをpSV
2GSのBam H I部位へ挿入し、Ｌ鎖遺伝子の上流のGS遺伝
子とともにキメラＬ鎖遺伝子とGS遺伝子とが同じ方向で
転写されるプラスミドpSV2GScLcが得られた。 同様にして、pEE6HCLCBgの3.1kbのBgl II−Bam H I断片
をpCMGSのBam H I部位へ挿入して、両者の遺伝子が再び
同じ方向のプラスミドpCMGS.CLCを得た。 pEE6CHCBgは、hCMV−MIEプローマーター−エンハンサー
コントロール下のキメラB72.3抗体〔６〕のＨ鎖遺伝子
及びSV40ポリアデニル化シグナルを含有するプラスミド
である。このプラスミドから、hCMV−MIE鎖終止ユニツ
トを4.7kb部分Hind III−Bam H Iフラグメントとして切
出し、Hind III−Bam H Iオリゴヌクレオチドアダプタ
ーによりpSV2GScLcのシングルBamI部位に挿入してpSV2G
ScLccHcを得た。pSV2GScLccHcのhCMV−MIE−cH鎖転写ユ
ニットの上流のBam H I部位をBam H Iの部分消化により
除去し、DNAポリメラーゼＩで充填し再連結してpST6を
得た。 分子量90kDの新しい繊維素溶解酵素をコードする遺伝子
を2.5kb Hind III−Bgl IIフラグメントとして単離し
た。次いでこれを発現プラスミドpEE6hCMVBgl IIのHind
IIIとBcl I部位との間に適当な方向で挿入し、hCMVプ
ロモーターがこの遺伝子の転写を誘導するようにした。
SV40初期−GS転写ユニットをpSV2GSからBam H Iフラグ
メントとして切り出し、pEE6hCMVBgl IIのhCMV配列の
５′末端のBgl II部位に適当な方向で挿入し、hCMVプロ
モーターとSV40初期プロモーターとからの転写が同じ方
向となるようにした。これによりプラスミドpEE690KGS
が得られた。 セルライン 例では以下のセルラインを用いた。 NSOとP3−X63Ag8.653:マウスp3マウスプラズマサイトー
マラインの非産生変異体； Sp2/0:非産生マウスハイブリドーマセルライン； YB2/0:非産生ラツトハイブリドーマセルライン。 培 地 2mMグルタミン、100μＭ非必須アミノ酸、10％胎児ウシ
血清及びストレプトマイシン／ペニシリンを含有する非
選択培地ダルベツコ最小必須培地（DMEM）；グルタメー
ト及びアスパラギンをそれぞれ500μｍ、アデノシン、
グアノシン、シチジン及びウリジンをそれぞれ30μｍ、
10μＭチミジン、100μＭ非必須アミノ酸、10％透析胎
児ウシ血清及びストレプトマイシン／ペニシリンを含有
するグルタミンフリーDMEN（Ｇ−DMEM）；あるいはこれ
ら各種の添加物を欠いたＧ−DMEM誘導培地で全ての細胞
を生育させた。 あるいは、以下の濾過滅菌ストツク溶液を用いて作成さ
れるgpt選択培地で細胞を培養した。 （１）ヒポキサンチン及びチミジンをそれぞれ50X; （２）50Xキサンチン（0.2M NaOH中12.5mg/ml）； （３）マイコフエノール酸（MPA,0.1M NaOH中250μg/m
l）； （４）1M HCl。 gpt選択培地は、上記した非選択培地93ml、溶液（１）2
ml、溶液（３）2ml及び溶液（４）0.6mlを混合して作成
した。２×gptは、非選択培地86mlと、上記した量の２
倍の溶液（１）−（４）とを混合して作成した。 プラスミドの線状化 プラスミドを細胞に導入するために、全てのプラスミド
を、プラスミド中のシングル部位で切断する制限酵素従
つて哺乳動物細胞中の遺伝子の転写に妨害を与えない適
当な制限酵素を用いて消化して線状化した。 典型的には、40μｇの環状のプラスミドを400μの制
限酵素バツフアーで消化した。プラスミドの線状化に用
いた酵素は表１に示した。 表１ プラスミドの線状化を用いた酵素 プラスミド 制限酵素 pSVLGS.1 Pvu I pSV2.GS Pvu I pSV2.Bam GS Pvu I pCMGS Pvu I pCMGS.gpt Pvu I pEE6.gpt Sal I pcLc2GS Sal I pAb2GS Sal I pSV2・GScLc Tth III pCMGS・cLc Tth III pST6 Bam H I pEE690KGS Sal I 細胞のエレクトロポレーション 指数関数的に増殖する時期の細胞を採取し、リン酸緩衝
化食塩水（PBS）中でベンチ遠心機で1200rpmで遠心して
１回洗浄し、新鮮な氷冷PBS中に107セル/mlの密度で懸
濁した。細胞懸濁液1mlを消化したプラスミドDNA（制限
酵素バツフアー溶液0.4ml）に加え、氷上で５−10分間
インキユベートした。次いで、14μＦのキヤパシタンス
を有する通常のエレクトロポレーシヨン装置を用いて約
1cm離れたアルミニウム電極の間の2000ボルトの２パル
スに細胞−DNA混合物を付した。次いで細胞を氷に５−1
0分間もどし、非選択培地（DMEM）に懸濁し、24ウエル
カルチヤートレー中に分注した。次いで、以下に記述す
るように選択培地（Ｇ−DMEM）を添加した。 例１ CHO−K1細胞中で選択マーカーとして有効に使用できる
プラスミドpSVGS1（EP−Ａ−0256055号明細書参照）
は、予備実験では、NSO細胞中に導入されて有効な割合
いでグルタミン非依性を有するコロニーを与えないこと
が示された。107細胞について約６個のトランスフエク
トコロニーという極めて低頻度でしか目的とするコロニ
ーは得られなかつた。これは、pEE6gptのキサンチン−
グアニンホスホリボシルトランスフエラーゼ（gpt）選
択マーカーを用い、キサンチン、ヒポキサンチン及びチ
ミジンを含有する培地でマイコフエノール酸に対する耐
性によつて選択される1/104トランスフエクト細胞以上
のトランスフエクト頻度に匹敵する。 GScDNAがhCMV−MIEプロモーターから発現されるpCMGSを
用いた予備実験ではずつと高い頻度でグルタミン非依存
性コロニーを得、SV40初期領域プロモーターを利用した
pSV2GSでは中程度の頻度でトランスフエクト体を得た。 選択に用いるための適当なプロトコールを確立するため
に、線状化pCMGS20μｇと線状化pEE6gpt20μｇとを混合
し、ともに107個のNSO細胞に導入した。107個の細胞の
別のマリコートをDNAを添加せずにエレクトロポレーシ
ヨンにより“偽りの（Mock）”トランスフエクトを行な
つた。 細胞を、上記した0.5ml非選択培地（DMEM）中の24ウエ
ルプレートにプレートし、24時間後に、“Mock"トラン
スフエクトプレートとDNAトランスフエクトプレートの
ウエルについて以下のようにして選択を行なつた。 A:G−DMEM1mlを添加し、プレートを調べる前に７日間放
置した； B:1日目にＧ−DMEM1mlを添加し、２日目に吸引し新鮮な
Ｇ−DMEMで置換した； C:1日目に200μＭグルタミンを含むＧ−DMEM1mlを加
え、更に２日間放置し次いで吸引してＧ−DMEMで置換し
た； D:1日目に放置し、２日目にＧ−DMEM1mlを加えた。３日
目に吸引し新鮮なＧ−DMEMで置換した； E:1日目に放置し、２日目に吸引しＧ−DMEM1mlで置換し
た。ウエルを４日目に再び吸引し、新鮮なＧ−DMEMで置
換した； F:マイコフエノール酸選択:gpt選択培地0.5mlを加え、
２日目に２×gpt選択培地0.5mlを加えた。 それぞれの選択プロトコールについて少なくも３つのウ
エル中のそれぞれの生存コロニー数をトランスフエクシ
ヨン７−10日後に記録し、得られる平均値を表２に示し
た。 これらの結果から、プロトコールＡ（トランスフエクシ
ヨン１日後にＧ−DMEM1mlを添加）により、トランスフ
エクトコロニーの最も高い生存数が得られ、GS遺伝子を
導入した場合の選択について得られた頻度は、gpt遺伝
子の選択について測定されたトランスフエクシヨン効果
（プロトコールＦ）と同じであることが判る。少量のグ
ルタミンを添加し２日以上後に吸引しＧ−DMEMのみで置
換した場合には（プロトコールＣ）、２番目に高い頻度
でグルタミン非依存性コロニーが得られる。しかなが
ら、吸引により培地を除去した場合には従つてグルタミ
ンを完全に除去した場合（プロトコールB,D及びＥ）に
は、生存コロニー数は著しく減少した。従つて、培地中
のグルタミンを徐徐に除くことによつて、選択が促進さ
れることが判る。従つて、以下の全ての実験ではプロト
コールＡを用いた。 hCMV−MIEプロモーターなどの強いプロモーターにより
高レベルのGS発現が達成され、従つて選択的遺伝子増幅
のために高レベルのMSXが必要となる。 GScDNAを発現させてグルタミン非依存性形質転換体を得
るのにhCMV−MIEプロモーター−エンハンサーよりも弱
いプロモーターを用いることができるかどうかを調べる
ため、GS発現用にSV40初期領域プロモーターを用いた線
状化pSV2BamGS40μｇをNSO細胞に導入し、プロトコール
Ａを用いて選択した。得られる結果は表３に示した。 これらの結果から、pSV2BamGSでのGS−転写ユニツトはN
SO細胞での選択マーカーとして使用できるが、pCMGSよ
りも低頻度でしかグルタミ非依存性コロニーが得られな
いことが判る。 異種DNAをNSO細胞へ導入するための選択マーカーとして
pSV2BamGS中のGS遺伝子が使用できるかどうかをテスト
するために、hCMVMIEプロモーター−エンハンサーのコ
ントロール下にある異なる非選択性連結遺伝子を含有す
る３つの異なるプラスミドを構築した。これらは、キメ
ラB72.3イムノグロブリンＬ鎖遺伝子を含有するPcLc2G
S;メタロプロテイナーゼの組織抑制因子の遺伝子（TIM
P）を含有するpTIMPGS;及びキメラB72.3モノクローナル
抗体のＨ鎖及びＬ鎖遺伝子の両方を含有するpAb2GSであ
る。PcLc2GS40μｇ、pTIMPGS40μgpAb2GS80μｇをそれ
ぞれ107個トランスフエクト細胞当り用いて、線状、化
プラスミドとしてNSO細胞に導入した。トランスフエク
シヨン頻度はpAb2GSでは4/107セルであり、他の２つの
プラスミドについてはいずれもコロニーは得られなかつ
た。pAb2GSでトランスフエクトされたうちの４個のコロ
ニーを大量培養により生育せしめ、その培養上清を用い
て、抗Ｈ鎖抗体及び抗Ｌ鎖抗体によるウエスタンブロツ
ト分析を行なつた。この結果を第１図に示した。４つの
全てのコロニーはＨ鎖及びＬ鎖の両者を分泌したが非常
に低レベルでしか分泌しなかつた（酵素連結イムノ吸着
アツセイにより検出されず）。しかして、pSV2BamGSのG
S−転写ユニットは、異種遺伝子をNSO細胞に導入するた
めの選択マーカーとして使用できるが、これらの特定の
プラスミド構築体中のこのような遺伝子の存在によつ
て、トランスフエクトコロニーが単離される頻度はかな
り減少すると思われる。これはプラスミド中の各種転写
ユニツト間のインターフエアレンスによるものと考えら
れる。従つて、GS転写ユニツトの上流の遺伝子が何んら
かの理由で例外的にわずかにしか発現されないほんのわ
ずかのコロニーしか生存するに十分なGSを産生すること
ができなかつた。 ベクター中の遺伝子の位置によつてグルタミン非依存性
への形質転換頻度が著しく減少するのか否かをテストす
るために、上記の実験とは相違してGS遺伝子転写ユニッ
トがcL鎖遺伝子の上流にあるプラスミドを構築した。２
つのプラスミドとして、GS遺伝子がhCMV−MIEプロモー
ターのコントロール下にあるPCMGScLcとpSV2GScLcとを
選択した。これらのプラスミドをNSO細胞に導入し、プ
ロトコールＡを用いてトランスフエクト体を選択した。
得られるコロニー数は表４に示した通りである。 表４ プラスミド コロニー数/106セル pCMGS 250 pCMGS.cLc 300 pSV2.GS 18 pSV2GS.cLc 9 pcLc2GS 0 これらの結果により、GS遺伝子がcLc遺伝子の下流にあ
るpcLc2GSによつてはグルタミン非依存性コロニーは得
られなかつたが、これとは逆にGS遺伝子が上流にあるプ
ラスミドpSV2GScLcによつて、GS遺伝子のみを用いて（p
SV2GS）得られる形質転換頻度に匹敵する形質転換頻度
が得られることが判つた。 これにより、GS発現に用いたSV40初期プロモーターによ
るインターフエアレンスはその下流に強いhCME−MIEプ
ロモーターを置くことによつて減少することが示唆され
る。表４の結果から、PCMGSに比べてpCMScLcによつて得
られる形質転換効果は有意な相違を有していないことが
判り、このことはGS発現によつてインターフエアレンス
を受けないことを示している。 プラスミドpCMGScLc及びpSV2GScLcを用いて得られるト
ランスフエクト体について、消費培養培地中のヒトカツ
パ鎖抗原活性用のELISAアツセイによりcL鎖分泌をアツ
セイした。pCMGScLcトランスフエクト体の全ての培養ウ
エルはそれぞれ多くのトランスフエクトコロニーを含有
しており、有意量の抗原を実際に分泌した。pSV2GScLc
トランスフエクト体の10個のウエルのうち７個のウエル
が多くのコロニーを含有し、検出可能なレベルでＬ鎖を
分泌した。 これは、hCMV−MIEプロモーターによつてコントロール
されている第２の遺伝子の下流にGS遺伝子があるプラス
ミドの結果とは対照的であり、このことは、プラスミド
が適当にデザインされる限りGS遺伝子はこのタイプの細
胞の有効な選択マーカーとして使用可能であることを示
している。 pSV2GSは異種遺伝子を挿入するのに特に好適なベクター
であり、pSV2GScLcを第２図に示した。 GSトランスフエクト体の生育にとつてＧ−DMEM培地中に
いずれの添加物が存在していることが必須であるかをテ
ストするために、プラスミドpCMGScLcを含有するトラン
スフエクト細胞をプールし、10％透析胎児ウシ血清及び
以下のＧ−DMEM中の添加物を可能な組合わせで含有すDM
EMを含む24ウエル組織培養トレーに分注した。 （ａ）非必須アミノ酸； （ｂ）グルタメート； （ｃ）アスパラギン： （ｄ）アデノシン、グアノシン、シチジン、ウリジン及
びチミジン。 ４日後の生育を記録し、結果を表５に示した。 表５ 培地添加物 生育 なし − abcd ＋＋ abc ＋＋ abd ＋＋ ab ＋＋ ac ＋＋ ad ＋＋ a ＋＋ b − bc ＋＋ bd − bcd ＋＋ c ＋＋ cd ＋＋ d − bx4 − これらの結果から、500μＭアスパラギンが、Ｇ−DMEM
中の他の添加物の非存在下でGSトランスフエクト体の生
育意地に十分であることが判る。驚くべきことに、GSの
基質であるグルタメートによつては、その濃度が2mMに
上昇してもこれらの細胞の生育を維持できない。これら
のトランスフエクア体の生育をサポートするために、50
0μＭアスパラギンの代わりに非必須アミノ酸を用いる
ことができる。しかしながらこの添加物は100μＭアス
パラギンを含有しているため、アスパラギンのこの濃度
で十分に生育をサポートするのが可能である。 NSOセルラインは、グルタミンフリー倍地中で生育でき
るためには不十分な活性GS酵素を含有していなければな
らず、pCMGSなどのプラスミドはこれらの細胞中で発現
される時にはグルタミン非依存性コロニーを生育させる
のに十分なGSを産生することが明らかである。SV40初期
プロモーターなどの弱いプロモーターのコントロール下
でGS遺伝子を発現するクローンは、平均してわずかのGS
酵素しか発現できず、わずかの割合いのトランスフエク
ト体しかグルタミンフリー倍地中で生存できない。 GS−ベクターを用いて他のリンパ細胞をグルタミ非依存
性で生育できるようにすることができるかどうかをテス
トするために、グルタミンフリー倍地中で更に他の３つ
のセルラインの生育を調べた。 P3−X63Ag8.653（マウスミエローマ）はＧ−DMEM倍地中
では全く生育できないことが見出された。107個細胞を2
4ウエルプレートにプレートしプロトコールＡにより選
択した時に、グルタミン非依存性変異体は単離されなか
つた。これに対し、非分泌性マウスハイブリドーマSP2/
0により、約1/105プレートセルの頻度でＧ−DMEM倍地中
で生育できる変異体が得られた。このセルラインでのト
ランスフエクシヨン頻度（pEE6gptを用いて）は約1/105
プレートセルであるので、このセルラインはこのプロト
コールろ用いた選択用の宿主としては不適当である。ラ
ツト非分泌性ハイブリドーマYB2/0も1/102の高い頻度で
グルタミン非依存性変異体を与えたため、このセルライ
ンも上記の開発されたGS−選択プロトロールを使用する
のに不適当である。YB2/06のグルタミン非依存性変異体
をクローン化し、YOG−F10と命名したクローナルセルラ
インを大量培養により生育せしめ、液体窒素中で凍結ス
トツクとして保存した。SPG2−E4と命名された同様のセ
ルライン、即ちSP2/0のグルタミン非依存性変異体も液
体窒素中で保存した。このようなセルラインは、EP−Ａ
−0256055明細書に記載された方法によつてGS遺伝子を
含有するベクターの導入に好適なものである プラスミドベクターをP3−X63Ag8.653に導入するために
グルタミ非依存性形質転換体選択を用いることができる
かどうかをテストするために、40μｇの線状化pCMGSgpt
（pCMGSのGS−転写ユニットとpEE6gptのgpt遺伝子を含
有するベクター）をエレクトロポレーシヨンにより107
個のP3−X63Ag8.653細胞に導入した。結果を表６に示し
た。 かくして、hCMV−GS転写ユニツトとNSO細胞の選択プロ
トコールＡを用いて、gpt選択を用いて得られるのと同
じ大きさ（より高い可能性あり）の頻度で少なくともグ
ルタミン非依存性P3−X63Ag8.653を得ることができる。
２つの転写ユニット間でのインターフエアレンス（“プ
ロモーター閉塞”）はgpt選択コロニーが低頻度で生ず
る程度であることは注目すべきである。 GS−発現プラスミドによるトラスフエクシヨンにより、
ミエローマセルラインNSOとP3−X63Ag8.653が形質転換
されてグルタミン非依存性となつて生育できた。これに
体して、ハイブリドーマセルラインYB2/0及びSP2/0によ
り、GS−プラスミドがこれらの細胞中で選択マーカーと
してこの方法で使用できる程度に高頻度でグルタミン非
依存性変異体が産生された。また、pSV2GSなどのGS−発
現プラスミドを用いて、B72.3キメラ抗体をコードする
遺伝子などの非選択性遺伝子をNSO細胞に導入できるこ
とも証明された。プラスミド中での遺伝子のアレンジに
より、これら遺伝子によつて達成される発現レベルが著
しい影響を受ける。従つて、最適発現ベクターをデザイ
ンするに際してはこのことを考慮するのが重要である。
hCMV−MIEプロモーターなどの強いプロモーターからの
転写は、両者の遺伝子が例えば転写終止シグナルによつ
て分離されていない限り、SV40初期プロモーターなどの
弱いプロモーターから発現される遺伝子にまで進行しな
い。 例２ pCMGS及びpSV2BamGSなどのプラスミドにおけるGS−転写
ユニットがミエローマセルライン中で増幅可能な選択マ
ーカーとして使用できることを確認するために、エレク
トロポレーシヨンによつてNSO細胞へ導入されたベクタ
ーDNAのコピー数を、メチオニンスルホキシイミン（MS
X）を用いたGS−遺伝子増幅の選択前及び後で分析し
た。 NSO細胞をpSV2BamGS又はpGMGSで上記したようにしてト
ランスフエクトし、トランスフエクトコロニーをプール
し（それぞれのトラスフエクシヨンから少なくとも20コ
ロニー）、培養液中に広げ、セルラインSV2GSNSOとCMGS
NSOとを形成した。これら２つの細胞プールを、Ｇ−DME
M倍地中約105セル／ウエルの細胞密度で24−ウエル細胞
培養トレー中に分注した。MSXを、終濃度20/80μＭでウ
エルに添加した。数日間インキユベーシヨン後、全ての
ウエルについて細胞の死亡を観察し、２−３終間後に、
SV2GSNSOセルラインでは60μＭまでの濃度MSXで、CMGSN
SOセルラインでは80μＭまでの濃度のMSXで、MSX耐性コ
ロニーが観察された。これらの濃度のMSXで単離された
細胞を24−ウエルトレー中に約105セル／ウエルの濃度
で再びプレートし、100μＭまでの濃度で選択を再び行
なつた。両者の場合において、100μＭでかなりの細胞
が生存していた。100μMMSX耐性細胞プールを培養液に
広げ、最初のトランスフエクト体及び100μMMSXに耐性
の細胞プールから全ゲノムDNAを調製した。 DNAサンプルをBgl I及びBgl II制限酵素で消化し、DNA
サンプルのサザンブロツトをpGSc45〔７〕の0.5kb5′ps
t I GS−cDNAフラグメントでプローブした。サザンブロ
ツト分析を第３図に示した。DNAプローブは、NSO細胞の
内因性マウスGS−遺伝子と交差ハイブリダイズし、これ
は、非トランスフエクトNSOコントロールDNAと同様に全
てのトランスフエクトセルライン中の約6kbの１つのフ
ラグメント及び約2.8kbのフラグメントと考えられる。
これらのバンドは、ゲル上のそれぞれのトラツク中の同
量のDNAを負荷するための内部コントロールとなる。pSV
2BamGSでトランスフエクトされた細胞では、ベクターDN
Aについて予想されるサイズの1.2kbBgl II断片（SV40プ
ロモーターのBgl I部位からGScDNAの３′末端のBgl II
部位まで）も検出された。隣接するトラツク中に負荷さ
れた既知の量のベクターDNAと比較することにより、SV2
GSNSOプール中の平均ベクターコピー数は約１コピー／
セルであると評価された。100μMMSXで選択後、コピー
数は平均約５コピー／セルまで上昇した。 同様に、NSO細胞にpGMGSを導入することにより、約１コ
ピー／セルの平均レベルでCMGSNSODNAのサザンブロツト
分析において2.1kbベクターフラグメントが観察され
た。100μMMSXで選択することにより約10コピー／セル
までコピー数が上昇した。 この実験により、NSO細胞へ導入されたpCMGSとpSV2BamG
SはMSXによる選択により増幅されることが判る。内因性
マウスGS遺伝子の増幅は観察されなかつた。 例３ 例１に記載したMSX選択法の組換え生成物についての過
剰生産の効果をテストするために、GS選択を用いたNSO
細胞へ導入されたB72.3cL鎖の発現を、MSXによる選択前
及び後で測定した。pSV2GScLcではトランスフエクシヨ
ン頻度は約２×10-5コロニー／トランスフエクト細胞で
あり、pCMGScLcでは約10-3であつた。 pSV2GScLcでトランスフエクトされた２つNSO誘導セルラ
イン及びpCMGScLcでトランスフエクトされた２つのセル
ラインは全て高レベルでcL鎖を分泌し、これらを限界希
釈法により最初に再クローン化した。最も高い４つの産
生非依存性コロニーからのcL鎖の発現を、光学密度（OD
280）測定法により定量したB72.3cL鎖の精製標準調製物
と比較してELISA法により測定した。これらの結果を、
例１に記載したようにして得られるこれらのクローン化
セルラインから得られるようにMSX耐性プールの産生割
合いとともに表７に示した。耐性コロニープールは、３
つのセルラインについては40μMMSXで、セルラインC2−
27については100μMMSXで単離した。 MSXに対する耐性に基づき選択した結果、４つのセルラ
インのうち３つについて生産性が有意に上昇したことが
判る。 最も高い分泌割合いを有する細胞プールB4.24（40μ
Ｍ）を限界希釈法によりクローン化し、20pg/セル／日
の割合いでcL鎖を分泌するクローナルセルラインを単離
した。これはもとのトランスフエクト細胞の発現レベル
にて４倍高い発現レベルを示し、これによつて、GS遺伝
子の増幅に基づく選択により、目的とする組換え生成物
の改良された生産法が可能となることが判る。 例４ ミエローマセルラインから完全なイムノグロブリン分子
を発現させるさせるために、B72.3抗体のcH及びcL鎖の
遺伝子を含有すGS−ベクターでNSO細胞をトランスフエ
クトした。 プラスミドsST6はcH及びcL鎖コード配列をそれぞれhcMV
プロモーターのコントロール下に含有し更にpSV2BamGS
のSV40ポリＡシグナル及びSV40初期GS−転写ユニットを
含有する。このプラスミドをSal Iで線状化し、上記し
たようにしてエレクトロポレーシヨンによりNSO細胞に
導入した。トランスフエクシヨン頻度は約２×10-5コロ
ニー／トランスフエクト細胞であつた。トランスフエク
トラインについて、抗体コートプラスチツクプレートを
用いた結合アツセイにより機能的抗体の分泌をスクリー
ニングした。 次いで分泌された抗体量を、意図するイムノグロブリン
のみを検出するようにデザインされたELISAにより定量
した。３つの最も高い発現を有するクローン化セルライ
ン及びこれらから得られた耐性プールの抗体分泌割合い
を表８に示した。 かくして、分析した３つのセルラインの１つにおいて、
抗体の発現がGS遺伝子増幅による選択により有意に上昇
した。プラスミドpST−６を用いて得られる表８の結果
は、例１のpAb2GSを用いて得られる結果と著しく相違し
ている。例１では、トランスフエクトコロニーが単離さ
れる頻度はプロモーターインターフエアレンスにより著
しく減少する。pAb2GSによるトランスフエクシヨンで
は、GS遺伝子の上流のイムノグロブリン遺伝子が例外的
にわずかに発現されるわずかのコロニーによつてのみ、
十分な生存のためのGSが得られる。従つて、単離された
形質転換体は、わずかの抗体しか産生しない。pST−６
を用いて、より高い抗体を分泌するセルラインを単離す
ることが可能である。ベクター中の遺伝子のアレンジを
更に変更することによつて、転写インターフエアレンス
を更に減少させて抗体の発現を更に有利にすることが当
業者には明らかであろう。 例５ 例１と同様にして、エレクトロポレーシヨンによりpEE6
90KGSをミエローマセルラインNSOに導入した。96ウエル
プレートにプレート後、グルタミンフリー培地（Ｇ−DM
EM）で生育させてトランスフエクト体を選択した。トラ
ンスフエクシヨン効果は、105トランスフエクト細胞に
ついて約１個であつた。 シングルコロニーを含有する細胞培養トレーのウエルに
ついて、フイブリンアガーアツセイ〔８〕により90KDの
繊維素溶解酵素の分泌を分析した。アツセイした33個の
ウエルのうち、26個のウエルが繊維素溶解活性が明らか
にポジテイブであつた。ポジテイブトランスフエクト体
を培養液に広げ、生産物分泌割合いの分析に付した。 この方法によつて単離されたセルラインは、組織プラス
ミノーゲン活性化因子（tpA）と比較してフイブリンプ
レートアツセイにより評価した所、0.02−3.75pg/セル
／日で分泌していた。最も高い分泌割合いを示す６個の
セルラインを表９に示した。繊維素溶解活性は、Doddの
方法
細胞として用いるリンパ系セルラインの改良法に関す
る。また本発明は、この改良法に用いるベクター及びこ
の改良法によつて得られる宿主細胞に関する。 現在ではリンパ系セルラインは、組換えDNA技術により
イムノグロブリン、関連ハイブリッドもしくはキメラ蛋
白質（Ig−タイプ分子）あるいは他の組換え蛋白を産生
する際の宿主細胞として使用できるとされている。リン
パ系細胞には、in vivoでIg分子を産生するＢセルと同
様にいくつかのジエネラルタイプを有するミエローマ細
胞などが含まれており、従つて、リンパ系細胞はIg−タ
イプ分子の正しい構築及び分泌を行なうのに必要な分子
内機構を元来有しているものと考えられる。このような
リンパ系細胞は、組換えDNA技術により非Ig−タイプ分
子を産生するに際しても使用できると思われる。 ミエローマセルライン、Ｔセルリンパ腫などの多くのリ
ンパ系セルラインは、グルタミン欠損培地ではin vitro
で生育できないことが知られている。リンパ系セルライ
ンを形質転換してグルタミン非依存性にすることが可能
となれば、これによって形質転換セルラインを選択する
有利な方法が提供されることになる。 従つてグルタミン非依存性にすることは極めて有用であ
ると考えられている。 このようなセルラインにグルタミンシンセターゼ（GS）
をコードする遺伝子を導入することによつてグルタミン
非依存性に形質転換できると推測されている。このよう
な示唆はEP−A0256055（Celltech）明細書に記載されて
いる。しかしながら、その後、トランスフエクト体の同
定が困難もしくは不可能な程度に高頻度で、グルタミン
欠損培地で生育できる変異体がハイブリドーマセルライ
ンによつて自然に産生されることが見出されている。ミ
エローマセルラインをGS遺伝子でトランスフエクトし、
グルタミン欠損培地で形質転換体を生育せしめても有意
な量で生存しつづけることができない。 従つて、本発明の目的は、リンパ系セルラインをグルタ
ミン非存在性に形質転換する方法を提供することにあ
る。 本発明によれば、リンパ系セルラインをグルタミン非依
存性に形質転換する方法であつて、 活性グルタミンシンセターゼ（GS）遺伝子を含むベクタ
ーでリンパ系セルラインを形質転換し； 形質転換セルラインをグルタミンを含む培地で生育し；
次いで グルタミンが順次減少していく培地あるいはグルタミン
欠損培地で該形質転換セルラインを生育し続づける； ことからなる上記方法が提供される。 リンパ系セルラインはミエローマセルラインが好まし
い。 グルタミン減少もしくは欠損培地はアスパラギンを含有
しているのが好ましい。あるいは、培地は、グルタミン
欠損培地で形質転換セルラインの生存を可能とするよう
な他の栄養素を含有していてもよい。このような栄養素
は、塩化アンモニウムなどのアンモニアドナーでもよ
い。 驚くべきことに、形質転換リンパ系セルラインを最初に
グルタミン含有培地で生育させない場合には、ベクター
によつて形質転換されていてもいなくてもいずれのセル
ラインも生育できないことが見出された。本発明の方法
を使用することにより、ベクターで形質転換されたリン
パ系セルラインを選択することが可能である。 あるいは、リンパ系セルラインは、gpt遺伝子などの他
の選択マーカーをコードする遺伝子と活性GS遺伝子とを
含有するベクターで形質転換してもよく、あるいは、GS
と選択マーカーをそれぞれコードする別別のベクターで
一緒に形質転換してもよい。次いで、培地中のグルタミ
ンを減少させる前に、選択マーカーを用いて形質転換宿
主細胞を選択することができる。 この方法の利点は、毒性薬剤を使用することなくベクタ
ーの選択が可能となることである。ベクターが除去され
た宿主細胞はグルタミン欠損培地では生存できない。 この方法の更に他の利点は、宿主細胞の内因性GS遺伝子
を増幅させることなく遺伝子増幅の選択が可能となるこ
とである。 培地中のグルタミンは、グルタミンを欠いたアスパラギ
ンを含有する培地で希釈することによつて順次減少させ
て行くのが好ましい。 リンパ系セルラインを形質転換するのに用いるベクター
は、リンパ系セルラインにとつて異種の蛋白をコードす
る活性遺伝子を含有しているのが好ましい。あるいは、
リンパ系セルラインを、異種蛋白をコードする活性遺伝
子を含む他のベクターと一緒に形質転換してもよい。 異種蛋白は一本鎖として発現される蛋白でもよい（それ
は発現後にマルチチエインに開裂されるかもしれない
が）。このような一本鎖発現生成物の例としては、組織
プラスミノーゲンアクチベーター（tPA）、ヒト成長ホ
ルモン（hGH）、メタロプロテイナーゼの組織抑制因子
（TIMP）などが挙げられる。 しかしながら、異種蛋白はIgタイプ分子が好ましい。こ
の分子の場合には、２つのペプチド鎖が別々に発現され
ることが必要であり、この２つのペプチド鎖は発現後は
一緒になつて完全な分子を形成する。従つて、セルライ
ンは、Ｈ鎖（もしくはＨ鎖アナログ）及びＬ鎖（もしく
はＬ鎖アナログ）を別々にコードする活性遺伝子で形質
転換する必要がある。 Ｈ鎖及びＬ鎖をコードする遺伝子はGS遺伝子と同様のベ
クター上に両者とも存在しているのが好ましい。あるい
は、GS遺伝子を含有するベクターが更にＨ鎖もしくはＬ
鎖遺伝子のいずれか１つを有し、他の遺伝子が別のベク
ター中に含まれていてもよい。あるいはまた、Ｈ鎖及び
Ｌ鎖遺伝子がGS遺伝子を含有するベクター中に存在せ
ず、両者は同じあるいは別々のベクター中に存在しても
よい。 このような異種蛋白の発現は、例えば選択剤としてメチ
オニンスルホキシミン（MSX）を用いたGS遺伝子の選択
的増幅によりかなり増加させることができる。 GS遺伝子は比較的弱いプロモーターを有し、異種蛋白を
コードする遺伝子は比較的強いプロモーターを有し形質
転換セルライン中での蛋白合成がGS蛋白の産生よりも異
種蛋白もしくはペプチドの産生に優先的に向けられるよ
うにするのが好ましい。更には、GS遺伝子が強いプロモ
ーターよりもむしも弱いプロモーターによつてコントロ
ールされている場合には、遺伝子の選択的増幅を行なう
には低濃度のMSXなどの選択剤を使用することが必要で
ある。 弱いプロモーターを使用することにより、GS遺伝子がゲ
ノム中の特に有利な位置に挿入された形質転換セルライ
ンを選択することが可能となると考えられる。これによ
つて、GS遺伝子といずれの異種遺伝子もが有効に転写さ
れることが保証される。 全ての遺伝子が同じベクター中に存在している場合に
は、これらの遺伝子を正しく発現させるためには注意深
くベクターをデザインする必要があることが見出され
た。 しかして、本発明の第２の局面によれば、リンパ系セル
ラインをグルタミン非依存性に形質転換し異種蛋白産性
を可能にするベクターであつて、GS遺伝子と異種蛋白を
コードする遺伝子を含有し、異種蛋白をコードする配列
を転写するプロモーター／エンハンサーからの転写イン
ターフエアレンスにより、GS遺伝子の発現がグルタミン
非依存性コロニーが産生されない程度には妨害されない
ようにアレンジされている上記ベクターが提供される。 ベクター中の遺伝子はこのような方向生でアレンジされ
ており、プロモーターは転写インターフエアレンスを実
質的に阻止するようにされているのが好ましい。例え
ば、GS遺伝子は比較的弱いプロモーターを有し、異種蛋
白をコードする遺伝子は比較的強いプロモーターを有
し、GS遺伝子のプロモーターは異種蛋白をコードする遺
伝子のプロモーターの上流に位置し、あるいはGS遺伝子
のプロモーターは異種蛋白をコードする遺伝子のプロモ
ーターとは逆の方向で発現を誘導するようにしてもよ
い。 驚くべきことに、上記のようにしてベクターをアレンジ
することによつて、GS遺伝子の発現が十分な量で行われ
て選択が可能となり、そして異種蛋白も他のベクターの
場合よりもより効果的に発現されることが見出された。 例えば、異なるプロモーターを用い、あるいは異なる順
序もしくは方向で遺伝子を用いてベクターをアレンジし
た場合には、GSもしくは異種蛋白の産生レベルは極めて
低くなるかあるいはゼロになることが観察された。強い
プロモーターを含む遺伝子を弱いプロモーターを含むGS
遺伝子の上流においた場合には、上流遺伝子の転写は下
流遺伝子にまで及び、下流プローモーターが閉塞される
ことが考えられる（本件出願人はこの考えに限定された
くないが）。形質転換コロニーの頻度はGS遺伝子の発現
レベルに依存しているため、このようなプロモーターの
閉塞によりトランスフエクト体の回収頻度が著しく減少
する。 弱いプロモーターと強いプロモーターとの組み合わせ
は、sv40初期領域とhCMV−MIEプロモーター（hCMV−MIE
＝ヒトサイトメガロウイルス主要即時初期遺伝子）との
組合わせが好ましい。しかしながら、他の適当なプロモ
ーターの組合わせも当業者には明らかであろう。 本発明のベクターの好ましい態様は、弱いプロモーター
を有するGS遺伝子の下流に強いプロモーターを有するＨ
鎖様遺伝子があり、GS遺伝子のプロモーター及びＨ鎖様
遺伝子のプロモーターと逆の方向で強いプロモーターを
有するＬ鎖様遺伝子が存在するベクターである。 あるいは、プロモーターの閉塞は、遺伝子の間に転写終
止シグナルを設けることによつて防ぐことができる。 あるいは、遺伝子の間に非反復制限酵素部位を設けても
よい。この場合には、ベクターを宿主細胞中に導入する
前に、この部位を利用してベクターを線状化する。これ
によつて、形質転換宿主細胞中にてプロモーターの閉塞
が起きないようにすることができる。 ベクター中に異種蛋白をコードする遺伝子が２つ以上あ
る場合には、これらの遺伝子が転写インターフエアレン
スを促進しないようにすることが必要である。例えば、
ベクターがGS遺伝子、Ｈ鎖遺伝子及びＬ鎖遺伝子を含有
する場合には、これら３つの遺伝子のいずれもが同じ方
向で転写されGS遺伝子は他の２つの遺伝子の上流にある
のが好ましく、あるいは、GS遺伝子と他の遺伝子の１つ
は同じ方向で転写されGS遺伝子は他の第１の遺伝子の上
流にあり第２の遺伝子は他の方向で転写されそして第２
の遺伝子のプロモーターはGS遺伝子のプロモーターに接
しているのが好ましい。 ベクターは、ラムダフアージなどのウイルスベクターか
らなるものでもよく、あるいは、例えば周知のpBR322プ
ラスミドに基づくプラスミドベクターからなるものでも
よい。しかしながら、当業界において周知のいずれのベ
クターも、慣用的組換えDNA技術を用いて本発明に採用
することができる。 また、本発明は、本発明の方法によつて産生される宿主
細胞もしくは本発明のベクターを含有する宿主細胞を包
含する。 特に本発明は、GS遺伝子を含むベクターと異種蛋白をコ
ードする遺伝子を含むベクターとで一緒に形質転換され
たリンパ系セルラインであつて、これらのベクターは、
グルタミン非依存性コロニーが産生できない程度にはGS
遺伝子が転写インターフエアレンスにより妨害されない
ようにアレンジされているベクターである上記リンパ系
セルラインを包含する。 以下に添付した図面を参照して例により本発明を説明す
る。 第１図は、プラスミドpAB2GSでトランスフエクトされた
NSO細胞から分泌される蛋白のウエスタンブロツトによ
る分析を示し、このウエスタンブロツトでは、培養上清
あるいはコントロール組織培養培地25μを10％SDS還
元ポリアクリルアミドゲルに付し、ニトロセルロースに
ブロツトし、ヒトIg鎖を認識する抗血清でプローブし、
次いで125I−ラベル化プロテインＡでプローブした。 第２図は、プラスミドpSV2GScLcの構造を示す。 第３図は、プラスミドpST6の構造を示す。 第４図は、セルラインSV2GSNSO及びCMGSNSOのゲノムDNA
のサザンブロツト分析を示す。 第１図では、レーン１は精製キメラ72.3抗体を示し、Ig
L鎖及びＨ鎖の位置を表わし、レーン２−５は異なるト
ランスフエクトクローンの培養上清を示し、レーン６は
ネガテイブコントロールの培養上清を示す。 第２図では、ＥはSV40初期領域プロモーター、GSはGScD
NAコード配列、イントロン＋PAはスモールｔ−イントロ
ンとSV40の初期領域ポリアデニル化シグナル、hCMVはhC
MV−MIEプロモーター−エンハンサー、cLcはB72.3とし
て知られているヒユーマナイズ抗体のキメラＬ鎖のコー
ド配列、pAはSV40初期ポリアデニル化シグナルを示す。 第３図では、hCMVはhCMV−MIEプロモーターエンハンサ
ー（2.1kb）フラグメント、CHCはB72.3抗体のキメラＨ
鎖コード配列、CLCはB72.3抗体のキメラＬ鎖コード配列
を示す。ポリＡはSV40初期ポリアデニル化シグナルを含
む。Ｉ＋PAはSV40のスモールｔイントロンと初期領域ポ
リアデニル化シグナルを含む。SVEはSV40初期プロモー
ターを示す。 バクテリアプラスミドの複製オリジン及びアンピミリン
耐性遺伝子はpBR322から得た。 第４図では、MSXで選択前及び選択後のNSO細胞中のGS−
ベクターのコピー数分析を示す。DNAサンプルはBgl IBg
l IIで消化し、１％アガロースゲル上で電気泳動し、ニ
トロセルロースにトランスフアーし、GScDNAから単離さ
れたpGSC45〔11〕の0.5kb5′PstlDNAフラグメントでプ
ローブした。 DNAサンプルは以下の通りである。 レーン1:100コピー／セルに相当するプラスミドpSV2GS; レーン2:10コピー／セルに相当するプラスミドpSV2GS; レーン3:1コピー／セルに相当するプラスミドpSV2GS; レーン4:10μgNSOゲノムDNA; レーン5:10μgSV2GSNSOゲノムDNA; レーン6:10μgSV2GSNSO（100μMMSX耐性）ゲノムDNA; レーン7:100コピー／セルに相当するプラスミドpCMGS; レーン8:10コピー／セルに相当するプラスミドpCMGS; レーン9:1コピー／セルに相当するプラスミドpCMGS; レーン10:10μgCMGSNSOゲノムDNA; レーン11:10μgCMGSNSO（100μMMSX耐性）ゲノムDNA; m.w.:Cla Iで消化したλフアージDNA;分子量マーカー。 引用文献のリストは最後に示した。以下では引用文献は
カギカツコで囲つた番号で示した。 ベクター 以下の例では、比較のためにEP−Ａ−0256055に記載さ
れた２つのプラスミドを用いた。これらはプラスミドpS
VLS1とpSV2GSである。プラスミドpSVLGS1はGSミニ遺伝
子を含んでおり、SV40後期領域プロモーターのコントロ
ール下にcDNAとゲノムDNA配列を有している。プラスミ
ドpSV2GSはSV40初期領域プロモーターのコントロール下
にGSをコードするcDNA配列を含有している。 合成オリゴヌクレオチドリンカーを付加してpSV2GSの非
反復pvu II部位をBam H I部位に変換することによりベ
クターpSV2BamGSを得た。 合成オリゴヌクレオチドリンカーを用いて、主要即時初
期遺伝子プロモーター、エンハンサー及びヒトサイトメ
ガロウイルス（hCMV−MIE）の完全５′−非翻訳配列
（残りの５′非翻訳配列を再構築するために合成オリゴ
ヌクレオチドとともにPs−1mフラグメント〔１〕）をpS
V2GSのNco I部位の間に挿入して、hCMV−MIEプロモータ
ーがGSコード配列の発現を誘導するようにした。得られ
るプラスミドをpCMGSとした。 プラスミドpSV2BamGSをBam H Iで消化し、転写カセツト
を含む2.1kbフラグメントを得た。 他の発現プラスミドを構築を容易に行なうために基本ベ
クターpEE6を用いた。プラスミドpEE6には、プラスミド
pCT54〔２〕のXmn I−Bcl Iフラグメント、及びHind II
IとEcoR I部位との間に挿入されたプラスミドpSP64
〔３〕のポリリンカーが含まれており、Bam H IとSAl I
部位とはこのポリリンカーによつて除かれている。Bcl
I−Bam H Iフラグメントは237bpSV40初期遺伝子のポリ
アデニル化シグナル（SV40ヌクレオチド2770−2533）で
ある。Bam H I−Bgl IフラグメントはプラスミドpBR322
〔４〕（ヌクレオチド275−2422）から得られらたもの
であるが、Sal IとAva I部位との間（ヌクレオチド651
−1425）は欠失しており、Ava I部位にSal Iリンカーが
付加されている。Bal I部位からXmn I部位までの配列は
プラスミドpSP64〔３〕のβ−ラクタマーゼ遺伝子から
のものである。 プラスミドpEE6gptには、プラスミドpSV2gpt〔５〕のシ
ングルPvu II部位にBam H Iリンカーを付加してBam H I
フラグメントとしてプラスミドpEE6中にクローン化され
たプラスミドpSV2gptから得たキサンチン−グアニンホ
スホリボシルトランスフエラーゼ（gpt）をコードする
転写ユニットが含まれている。同様にして、pEE6gptか
らキサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフエラ
ーゼ（gpt）の転写カセツトを含有するプラスミドpCMGS
の誘導体を構築した。このプラスミドをpCMGSgptとし
た。 プラスミドpEE6hCMVには、オリゴヌクレオチドリンカー
によつてプラスミドpEE6のHind III部位に挿入されたhC
MV−MIEプロモーター−エンハンサーと完全５′非翻訳
配列が含有されている。 プラスミドpEE6 hCMV Bgl IIはpEE6hCMVの誘導体であつ
て、hCMVエンハンサーの上流のHind III部位が、ブラン
ト末端化及び合成オリゴヌクレオチドリンカーの付加に
よりBgl II部位に変換されている。 プラスミドpEE6HCLCBgは、B72.3抗体〔６〕のマウス−
ヒトキメラIgL鎖をコードする配列がhCMV−MIEプロモー
ター−エンハンサーのコントロール下に該Ｌ鎖が位置す
るようにpEE6hCMVのEcoR I部位に挿入されたpEE6hCMVか
ら得られるベクターである（上流のHind III部位はスタ
ンダード法によつてBgl II部位に変換されている）。pS
V2BamGSの2.1kb Bam H IフラグメントをpEE6HCLCBgに挿
入し、プラスミドpcLc2GSを得た。このプラスミドで
は、Ｌ鎖遺伝子の下流のGS遺伝子とともにIgL鎖とGS遺
伝子とが同じ方向で転写される。 pEE6HCHHCLは、hCMV−MIEプロモーター−エンハンサー
のコントロール化にキメラB72.3抗体〔６〕のＨ鎖及び
Ｌ鎖の両者をコードする配列を含有するベクターであ
る。pSV2BamGSの2.1kbBam H I断片をpEE6HCHHCLに挿入
して、Ｈ鎖、Ｌ鎖及びGS遺伝子がこの順序で同じ方向で
転写されるプラスミドpAb2GSを得た。 pEE6HcLcBgの3.1kb Bgl II−Bam H IフラグメントをpSV
2GSのBam H I部位へ挿入し、Ｌ鎖遺伝子の上流のGS遺伝
子とともにキメラＬ鎖遺伝子とGS遺伝子とが同じ方向で
転写されるプラスミドpSV2GScLcが得られた。 同様にして、pEE6HCLCBgの3.1kbのBgl II−Bam H I断片
をpCMGSのBam H I部位へ挿入して、両者の遺伝子が再び
同じ方向のプラスミドpCMGS.CLCを得た。 pEE6CHCBgは、hCMV−MIEプローマーター−エンハンサー
コントロール下のキメラB72.3抗体〔６〕のＨ鎖遺伝子
及びSV40ポリアデニル化シグナルを含有するプラスミド
である。このプラスミドから、hCMV−MIE鎖終止ユニツ
トを4.7kb部分Hind III−Bam H Iフラグメントとして切
出し、Hind III−Bam H Iオリゴヌクレオチドアダプタ
ーによりpSV2GScLcのシングルBamI部位に挿入してpSV2G
ScLccHcを得た。pSV2GScLccHcのhCMV−MIE−cH鎖転写ユ
ニットの上流のBam H I部位をBam H Iの部分消化により
除去し、DNAポリメラーゼＩで充填し再連結してpST6を
得た。 分子量90kDの新しい繊維素溶解酵素をコードする遺伝子
を2.5kb Hind III−Bgl IIフラグメントとして単離し
た。次いでこれを発現プラスミドpEE6hCMVBgl IIのHind
IIIとBcl I部位との間に適当な方向で挿入し、hCMVプ
ロモーターがこの遺伝子の転写を誘導するようにした。
SV40初期−GS転写ユニットをpSV2GSからBam H Iフラグ
メントとして切り出し、pEE6hCMVBgl IIのhCMV配列の
５′末端のBgl II部位に適当な方向で挿入し、hCMVプロ
モーターとSV40初期プロモーターとからの転写が同じ方
向となるようにした。これによりプラスミドpEE690KGS
が得られた。 セルライン 例では以下のセルラインを用いた。 NSOとP3−X63Ag8.653:マウスp3マウスプラズマサイトー
マラインの非産生変異体； Sp2/0:非産生マウスハイブリドーマセルライン； YB2/0:非産生ラツトハイブリドーマセルライン。 培 地 2mMグルタミン、100μＭ非必須アミノ酸、10％胎児ウシ
血清及びストレプトマイシン／ペニシリンを含有する非
選択培地ダルベツコ最小必須培地（DMEM）；グルタメー
ト及びアスパラギンをそれぞれ500μｍ、アデノシン、
グアノシン、シチジン及びウリジンをそれぞれ30μｍ、
10μＭチミジン、100μＭ非必須アミノ酸、10％透析胎
児ウシ血清及びストレプトマイシン／ペニシリンを含有
するグルタミンフリーDMEN（Ｇ−DMEM）；あるいはこれ
ら各種の添加物を欠いたＧ−DMEM誘導培地で全ての細胞
を生育させた。 あるいは、以下の濾過滅菌ストツク溶液を用いて作成さ
れるgpt選択培地で細胞を培養した。 （１）ヒポキサンチン及びチミジンをそれぞれ50X; （２）50Xキサンチン（0.2M NaOH中12.5mg/ml）； （３）マイコフエノール酸（MPA,0.1M NaOH中250μg/m
l）； （４）1M HCl。 gpt選択培地は、上記した非選択培地93ml、溶液（１）2
ml、溶液（３）2ml及び溶液（４）0.6mlを混合して作成
した。２×gptは、非選択培地86mlと、上記した量の２
倍の溶液（１）−（４）とを混合して作成した。 プラスミドの線状化 プラスミドを細胞に導入するために、全てのプラスミド
を、プラスミド中のシングル部位で切断する制限酵素従
つて哺乳動物細胞中の遺伝子の転写に妨害を与えない適
当な制限酵素を用いて消化して線状化した。 典型的には、40μｇの環状のプラスミドを400μの制
限酵素バツフアーで消化した。プラスミドの線状化に用
いた酵素は表１に示した。 表１ プラスミドの線状化を用いた酵素 プラスミド 制限酵素 pSVLGS.1 Pvu I pSV2.GS Pvu I pSV2.Bam GS Pvu I pCMGS Pvu I pCMGS.gpt Pvu I pEE6.gpt Sal I pcLc2GS Sal I pAb2GS Sal I pSV2・GScLc Tth III pCMGS・cLc Tth III pST6 Bam H I pEE690KGS Sal I 細胞のエレクトロポレーション 指数関数的に増殖する時期の細胞を採取し、リン酸緩衝
化食塩水（PBS）中でベンチ遠心機で1200rpmで遠心して
１回洗浄し、新鮮な氷冷PBS中に107セル/mlの密度で懸
濁した。細胞懸濁液1mlを消化したプラスミドDNA（制限
酵素バツフアー溶液0.4ml）に加え、氷上で５−10分間
インキユベートした。次いで、14μＦのキヤパシタンス
を有する通常のエレクトロポレーシヨン装置を用いて約
1cm離れたアルミニウム電極の間の2000ボルトの２パル
スに細胞−DNA混合物を付した。次いで細胞を氷に５−1
0分間もどし、非選択培地（DMEM）に懸濁し、24ウエル
カルチヤートレー中に分注した。次いで、以下に記述す
るように選択培地（Ｇ−DMEM）を添加した。 例１ CHO−K1細胞中で選択マーカーとして有効に使用できる
プラスミドpSVGS1（EP−Ａ−0256055号明細書参照）
は、予備実験では、NSO細胞中に導入されて有効な割合
いでグルタミン非依性を有するコロニーを与えないこと
が示された。107細胞について約６個のトランスフエク
トコロニーという極めて低頻度でしか目的とするコロニ
ーは得られなかつた。これは、pEE6gptのキサンチン−
グアニンホスホリボシルトランスフエラーゼ（gpt）選
択マーカーを用い、キサンチン、ヒポキサンチン及びチ
ミジンを含有する培地でマイコフエノール酸に対する耐
性によつて選択される1/104トランスフエクト細胞以上
のトランスフエクト頻度に匹敵する。 GScDNAがhCMV−MIEプロモーターから発現されるpCMGSを
用いた予備実験ではずつと高い頻度でグルタミン非依存
性コロニーを得、SV40初期領域プロモーターを利用した
pSV2GSでは中程度の頻度でトランスフエクト体を得た。 選択に用いるための適当なプロトコールを確立するため
に、線状化pCMGS20μｇと線状化pEE6gpt20μｇとを混合
し、ともに107個のNSO細胞に導入した。107個の細胞の
別のマリコートをDNAを添加せずにエレクトロポレーシ
ヨンにより“偽りの（Mock）”トランスフエクトを行な
つた。 細胞を、上記した0.5ml非選択培地（DMEM）中の24ウエ
ルプレートにプレートし、24時間後に、“Mock"トラン
スフエクトプレートとDNAトランスフエクトプレートの
ウエルについて以下のようにして選択を行なつた。 A:G−DMEM1mlを添加し、プレートを調べる前に７日間放
置した； B:1日目にＧ−DMEM1mlを添加し、２日目に吸引し新鮮な
Ｇ−DMEMで置換した； C:1日目に200μＭグルタミンを含むＧ−DMEM1mlを加
え、更に２日間放置し次いで吸引してＧ−DMEMで置換し
た； D:1日目に放置し、２日目にＧ−DMEM1mlを加えた。３日
目に吸引し新鮮なＧ−DMEMで置換した； E:1日目に放置し、２日目に吸引しＧ−DMEM1mlで置換し
た。ウエルを４日目に再び吸引し、新鮮なＧ−DMEMで置
換した； F:マイコフエノール酸選択:gpt選択培地0.5mlを加え、
２日目に２×gpt選択培地0.5mlを加えた。 それぞれの選択プロトコールについて少なくも３つのウ
エル中のそれぞれの生存コロニー数をトランスフエクシ
ヨン７−10日後に記録し、得られる平均値を表２に示し
た。 これらの結果から、プロトコールＡ（トランスフエクシ
ヨン１日後にＧ−DMEM1mlを添加）により、トランスフ
エクトコロニーの最も高い生存数が得られ、GS遺伝子を
導入した場合の選択について得られた頻度は、gpt遺伝
子の選択について測定されたトランスフエクシヨン効果
（プロトコールＦ）と同じであることが判る。少量のグ
ルタミンを添加し２日以上後に吸引しＧ−DMEMのみで置
換した場合には（プロトコールＣ）、２番目に高い頻度
でグルタミン非依存性コロニーが得られる。しかなが
ら、吸引により培地を除去した場合には従つてグルタミ
ンを完全に除去した場合（プロトコールB,D及びＥ）に
は、生存コロニー数は著しく減少した。従つて、培地中
のグルタミンを徐徐に除くことによつて、選択が促進さ
れることが判る。従つて、以下の全ての実験ではプロト
コールＡを用いた。 hCMV−MIEプロモーターなどの強いプロモーターにより
高レベルのGS発現が達成され、従つて選択的遺伝子増幅
のために高レベルのMSXが必要となる。 GScDNAを発現させてグルタミン非依存性形質転換体を得
るのにhCMV−MIEプロモーター−エンハンサーよりも弱
いプロモーターを用いることができるかどうかを調べる
ため、GS発現用にSV40初期領域プロモーターを用いた線
状化pSV2BamGS40μｇをNSO細胞に導入し、プロトコール
Ａを用いて選択した。得られる結果は表３に示した。 これらの結果から、pSV2BamGSでのGS−転写ユニツトはN
SO細胞での選択マーカーとして使用できるが、pCMGSよ
りも低頻度でしかグルタミ非依存性コロニーが得られな
いことが判る。 異種DNAをNSO細胞へ導入するための選択マーカーとして
pSV2BamGS中のGS遺伝子が使用できるかどうかをテスト
するために、hCMVMIEプロモーター−エンハンサーのコ
ントロール下にある異なる非選択性連結遺伝子を含有す
る３つの異なるプラスミドを構築した。これらは、キメ
ラB72.3イムノグロブリンＬ鎖遺伝子を含有するPcLc2G
S;メタロプロテイナーゼの組織抑制因子の遺伝子（TIM
P）を含有するpTIMPGS;及びキメラB72.3モノクローナル
抗体のＨ鎖及びＬ鎖遺伝子の両方を含有するpAb2GSであ
る。PcLc2GS40μｇ、pTIMPGS40μgpAb2GS80μｇをそれ
ぞれ107個トランスフエクト細胞当り用いて、線状、化
プラスミドとしてNSO細胞に導入した。トランスフエク
シヨン頻度はpAb2GSでは4/107セルであり、他の２つの
プラスミドについてはいずれもコロニーは得られなかつ
た。pAb2GSでトランスフエクトされたうちの４個のコロ
ニーを大量培養により生育せしめ、その培養上清を用い
て、抗Ｈ鎖抗体及び抗Ｌ鎖抗体によるウエスタンブロツ
ト分析を行なつた。この結果を第１図に示した。４つの
全てのコロニーはＨ鎖及びＬ鎖の両者を分泌したが非常
に低レベルでしか分泌しなかつた（酵素連結イムノ吸着
アツセイにより検出されず）。しかして、pSV2BamGSのG
S−転写ユニットは、異種遺伝子をNSO細胞に導入するた
めの選択マーカーとして使用できるが、これらの特定の
プラスミド構築体中のこのような遺伝子の存在によつ
て、トランスフエクトコロニーが単離される頻度はかな
り減少すると思われる。これはプラスミド中の各種転写
ユニツト間のインターフエアレンスによるものと考えら
れる。従つて、GS転写ユニツトの上流の遺伝子が何んら
かの理由で例外的にわずかにしか発現されないほんのわ
ずかのコロニーしか生存するに十分なGSを産生すること
ができなかつた。 ベクター中の遺伝子の位置によつてグルタミン非依存性
への形質転換頻度が著しく減少するのか否かをテストす
るために、上記の実験とは相違してGS遺伝子転写ユニッ
トがcL鎖遺伝子の上流にあるプラスミドを構築した。２
つのプラスミドとして、GS遺伝子がhCMV−MIEプロモー
ターのコントロール下にあるPCMGScLcとpSV2GScLcとを
選択した。これらのプラスミドをNSO細胞に導入し、プ
ロトコールＡを用いてトランスフエクト体を選択した。
得られるコロニー数は表４に示した通りである。 表４ プラスミド コロニー数/106セル pCMGS 250 pCMGS.cLc 300 pSV2.GS 18 pSV2GS.cLc 9 pcLc2GS 0 これらの結果により、GS遺伝子がcLc遺伝子の下流にあ
るpcLc2GSによつてはグルタミン非依存性コロニーは得
られなかつたが、これとは逆にGS遺伝子が上流にあるプ
ラスミドpSV2GScLcによつて、GS遺伝子のみを用いて（p
SV2GS）得られる形質転換頻度に匹敵する形質転換頻度
が得られることが判つた。 これにより、GS発現に用いたSV40初期プロモーターによ
るインターフエアレンスはその下流に強いhCME−MIEプ
ロモーターを置くことによつて減少することが示唆され
る。表４の結果から、PCMGSに比べてpCMScLcによつて得
られる形質転換効果は有意な相違を有していないことが
判り、このことはGS発現によつてインターフエアレンス
を受けないことを示している。 プラスミドpCMGScLc及びpSV2GScLcを用いて得られるト
ランスフエクト体について、消費培養培地中のヒトカツ
パ鎖抗原活性用のELISAアツセイによりcL鎖分泌をアツ
セイした。pCMGScLcトランスフエクト体の全ての培養ウ
エルはそれぞれ多くのトランスフエクトコロニーを含有
しており、有意量の抗原を実際に分泌した。pSV2GScLc
トランスフエクト体の10個のウエルのうち７個のウエル
が多くのコロニーを含有し、検出可能なレベルでＬ鎖を
分泌した。 これは、hCMV−MIEプロモーターによつてコントロール
されている第２の遺伝子の下流にGS遺伝子があるプラス
ミドの結果とは対照的であり、このことは、プラスミド
が適当にデザインされる限りGS遺伝子はこのタイプの細
胞の有効な選択マーカーとして使用可能であることを示
している。 pSV2GSは異種遺伝子を挿入するのに特に好適なベクター
であり、pSV2GScLcを第２図に示した。 GSトランスフエクト体の生育にとつてＧ−DMEM培地中に
いずれの添加物が存在していることが必須であるかをテ
ストするために、プラスミドpCMGScLcを含有するトラン
スフエクト細胞をプールし、10％透析胎児ウシ血清及び
以下のＧ−DMEM中の添加物を可能な組合わせで含有すDM
EMを含む24ウエル組織培養トレーに分注した。 （ａ）非必須アミノ酸； （ｂ）グルタメート； （ｃ）アスパラギン： （ｄ）アデノシン、グアノシン、シチジン、ウリジン及
びチミジン。 ４日後の生育を記録し、結果を表５に示した。 表５ 培地添加物 生育 なし − abcd ＋＋ abc ＋＋ abd ＋＋ ab ＋＋ ac ＋＋ ad ＋＋ a ＋＋ b − bc ＋＋ bd − bcd ＋＋ c ＋＋ cd ＋＋ d − bx4 − これらの結果から、500μＭアスパラギンが、Ｇ−DMEM
中の他の添加物の非存在下でGSトランスフエクト体の生
育意地に十分であることが判る。驚くべきことに、GSの
基質であるグルタメートによつては、その濃度が2mMに
上昇してもこれらの細胞の生育を維持できない。これら
のトランスフエクア体の生育をサポートするために、50
0μＭアスパラギンの代わりに非必須アミノ酸を用いる
ことができる。しかしながらこの添加物は100μＭアス
パラギンを含有しているため、アスパラギンのこの濃度
で十分に生育をサポートするのが可能である。 NSOセルラインは、グルタミンフリー倍地中で生育でき
るためには不十分な活性GS酵素を含有していなければな
らず、pCMGSなどのプラスミドはこれらの細胞中で発現
される時にはグルタミン非依存性コロニーを生育させる
のに十分なGSを産生することが明らかである。SV40初期
プロモーターなどの弱いプロモーターのコントロール下
でGS遺伝子を発現するクローンは、平均してわずかのGS
酵素しか発現できず、わずかの割合いのトランスフエク
ト体しかグルタミンフリー倍地中で生存できない。 GS−ベクターを用いて他のリンパ細胞をグルタミ非依存
性で生育できるようにすることができるかどうかをテス
トするために、グルタミンフリー倍地中で更に他の３つ
のセルラインの生育を調べた。 P3−X63Ag8.653（マウスミエローマ）はＧ−DMEM倍地中
では全く生育できないことが見出された。107個細胞を2
4ウエルプレートにプレートしプロトコールＡにより選
択した時に、グルタミン非依存性変異体は単離されなか
つた。これに対し、非分泌性マウスハイブリドーマSP2/
0により、約1/105プレートセルの頻度でＧ−DMEM倍地中
で生育できる変異体が得られた。このセルラインでのト
ランスフエクシヨン頻度（pEE6gptを用いて）は約1/105
プレートセルであるので、このセルラインはこのプロト
コールろ用いた選択用の宿主としては不適当である。ラ
ツト非分泌性ハイブリドーマYB2/0も1/102の高い頻度で
グルタミン非依存性変異体を与えたため、このセルライ
ンも上記の開発されたGS−選択プロトロールを使用する
のに不適当である。YB2/06のグルタミン非依存性変異体
をクローン化し、YOG−F10と命名したクローナルセルラ
インを大量培養により生育せしめ、液体窒素中で凍結ス
トツクとして保存した。SPG2−E4と命名された同様のセ
ルライン、即ちSP2/0のグルタミン非依存性変異体も液
体窒素中で保存した。このようなセルラインは、EP−Ａ
−0256055明細書に記載された方法によつてGS遺伝子を
含有するベクターの導入に好適なものである プラスミドベクターをP3−X63Ag8.653に導入するために
グルタミ非依存性形質転換体選択を用いることができる
かどうかをテストするために、40μｇの線状化pCMGSgpt
（pCMGSのGS−転写ユニットとpEE6gptのgpt遺伝子を含
有するベクター）をエレクトロポレーシヨンにより107
個のP3−X63Ag8.653細胞に導入した。結果を表６に示し
た。 かくして、hCMV−GS転写ユニツトとNSO細胞の選択プロ
トコールＡを用いて、gpt選択を用いて得られるのと同
じ大きさ（より高い可能性あり）の頻度で少なくともグ
ルタミン非依存性P3−X63Ag8.653を得ることができる。
２つの転写ユニット間でのインターフエアレンス（“プ
ロモーター閉塞”）はgpt選択コロニーが低頻度で生ず
る程度であることは注目すべきである。 GS−発現プラスミドによるトラスフエクシヨンにより、
ミエローマセルラインNSOとP3−X63Ag8.653が形質転換
されてグルタミン非依存性となつて生育できた。これに
体して、ハイブリドーマセルラインYB2/0及びSP2/0によ
り、GS−プラスミドがこれらの細胞中で選択マーカーと
してこの方法で使用できる程度に高頻度でグルタミン非
依存性変異体が産生された。また、pSV2GSなどのGS−発
現プラスミドを用いて、B72.3キメラ抗体をコードする
遺伝子などの非選択性遺伝子をNSO細胞に導入できるこ
とも証明された。プラスミド中での遺伝子のアレンジに
より、これら遺伝子によつて達成される発現レベルが著
しい影響を受ける。従つて、最適発現ベクターをデザイ
ンするに際してはこのことを考慮するのが重要である。
hCMV−MIEプロモーターなどの強いプロモーターからの
転写は、両者の遺伝子が例えば転写終止シグナルによつ
て分離されていない限り、SV40初期プロモーターなどの
弱いプロモーターから発現される遺伝子にまで進行しな
い。 例２ pCMGS及びpSV2BamGSなどのプラスミドにおけるGS−転写
ユニットがミエローマセルライン中で増幅可能な選択マ
ーカーとして使用できることを確認するために、エレク
トロポレーシヨンによつてNSO細胞へ導入されたベクタ
ーDNAのコピー数を、メチオニンスルホキシイミン（MS
X）を用いたGS−遺伝子増幅の選択前及び後で分析し
た。 NSO細胞をpSV2BamGS又はpGMGSで上記したようにしてト
ランスフエクトし、トランスフエクトコロニーをプール
し（それぞれのトラスフエクシヨンから少なくとも20コ
ロニー）、培養液中に広げ、セルラインSV2GSNSOとCMGS
NSOとを形成した。これら２つの細胞プールを、Ｇ−DME
M倍地中約105セル／ウエルの細胞密度で24−ウエル細胞
培養トレー中に分注した。MSXを、終濃度20/80μＭでウ
エルに添加した。数日間インキユベーシヨン後、全ての
ウエルについて細胞の死亡を観察し、２−３終間後に、
SV2GSNSOセルラインでは60μＭまでの濃度MSXで、CMGSN
SOセルラインでは80μＭまでの濃度のMSXで、MSX耐性コ
ロニーが観察された。これらの濃度のMSXで単離された
細胞を24−ウエルトレー中に約105セル／ウエルの濃度
で再びプレートし、100μＭまでの濃度で選択を再び行
なつた。両者の場合において、100μＭでかなりの細胞
が生存していた。100μMMSX耐性細胞プールを培養液に
広げ、最初のトランスフエクト体及び100μMMSXに耐性
の細胞プールから全ゲノムDNAを調製した。 DNAサンプルをBgl I及びBgl II制限酵素で消化し、DNA
サンプルのサザンブロツトをpGSc45〔７〕の0.5kb5′ps
t I GS−cDNAフラグメントでプローブした。サザンブロ
ツト分析を第３図に示した。DNAプローブは、NSO細胞の
内因性マウスGS−遺伝子と交差ハイブリダイズし、これ
は、非トランスフエクトNSOコントロールDNAと同様に全
てのトランスフエクトセルライン中の約6kbの１つのフ
ラグメント及び約2.8kbのフラグメントと考えられる。
これらのバンドは、ゲル上のそれぞれのトラツク中の同
量のDNAを負荷するための内部コントロールとなる。pSV
2BamGSでトランスフエクトされた細胞では、ベクターDN
Aについて予想されるサイズの1.2kbBgl II断片（SV40プ
ロモーターのBgl I部位からGScDNAの３′末端のBgl II
部位まで）も検出された。隣接するトラツク中に負荷さ
れた既知の量のベクターDNAと比較することにより、SV2
GSNSOプール中の平均ベクターコピー数は約１コピー／
セルであると評価された。100μMMSXで選択後、コピー
数は平均約５コピー／セルまで上昇した。 同様に、NSO細胞にpGMGSを導入することにより、約１コ
ピー／セルの平均レベルでCMGSNSODNAのサザンブロツト
分析において2.1kbベクターフラグメントが観察され
た。100μMMSXで選択することにより約10コピー／セル
までコピー数が上昇した。 この実験により、NSO細胞へ導入されたpCMGSとpSV2BamG
SはMSXによる選択により増幅されることが判る。内因性
マウスGS遺伝子の増幅は観察されなかつた。 例３ 例１に記載したMSX選択法の組換え生成物についての過
剰生産の効果をテストするために、GS選択を用いたNSO
細胞へ導入されたB72.3cL鎖の発現を、MSXによる選択前
及び後で測定した。pSV2GScLcではトランスフエクシヨ
ン頻度は約２×10-5コロニー／トランスフエクト細胞で
あり、pCMGScLcでは約10-3であつた。 pSV2GScLcでトランスフエクトされた２つNSO誘導セルラ
イン及びpCMGScLcでトランスフエクトされた２つのセル
ラインは全て高レベルでcL鎖を分泌し、これらを限界希
釈法により最初に再クローン化した。最も高い４つの産
生非依存性コロニーからのcL鎖の発現を、光学密度（OD
280）測定法により定量したB72.3cL鎖の精製標準調製物
と比較してELISA法により測定した。これらの結果を、
例１に記載したようにして得られるこれらのクローン化
セルラインから得られるようにMSX耐性プールの産生割
合いとともに表７に示した。耐性コロニープールは、３
つのセルラインについては40μMMSXで、セルラインC2−
27については100μMMSXで単離した。 MSXに対する耐性に基づき選択した結果、４つのセルラ
インのうち３つについて生産性が有意に上昇したことが
判る。 最も高い分泌割合いを有する細胞プールB4.24（40μ
Ｍ）を限界希釈法によりクローン化し、20pg/セル／日
の割合いでcL鎖を分泌するクローナルセルラインを単離
した。これはもとのトランスフエクト細胞の発現レベル
にて４倍高い発現レベルを示し、これによつて、GS遺伝
子の増幅に基づく選択により、目的とする組換え生成物
の改良された生産法が可能となることが判る。 例４ ミエローマセルラインから完全なイムノグロブリン分子
を発現させるさせるために、B72.3抗体のcH及びcL鎖の
遺伝子を含有すGS−ベクターでNSO細胞をトランスフエ
クトした。 プラスミドsST6はcH及びcL鎖コード配列をそれぞれhcMV
プロモーターのコントロール下に含有し更にpSV2BamGS
のSV40ポリＡシグナル及びSV40初期GS−転写ユニットを
含有する。このプラスミドをSal Iで線状化し、上記し
たようにしてエレクトロポレーシヨンによりNSO細胞に
導入した。トランスフエクシヨン頻度は約２×10-5コロ
ニー／トランスフエクト細胞であつた。トランスフエク
トラインについて、抗体コートプラスチツクプレートを
用いた結合アツセイにより機能的抗体の分泌をスクリー
ニングした。 次いで分泌された抗体量を、意図するイムノグロブリン
のみを検出するようにデザインされたELISAにより定量
した。３つの最も高い発現を有するクローン化セルライ
ン及びこれらから得られた耐性プールの抗体分泌割合い
を表８に示した。 かくして、分析した３つのセルラインの１つにおいて、
抗体の発現がGS遺伝子増幅による選択により有意に上昇
した。プラスミドpST−６を用いて得られる表８の結果
は、例１のpAb2GSを用いて得られる結果と著しく相違し
ている。例１では、トランスフエクトコロニーが単離さ
れる頻度はプロモーターインターフエアレンスにより著
しく減少する。pAb2GSによるトランスフエクシヨンで
は、GS遺伝子の上流のイムノグロブリン遺伝子が例外的
にわずかに発現されるわずかのコロニーによつてのみ、
十分な生存のためのGSが得られる。従つて、単離された
形質転換体は、わずかの抗体しか産生しない。pST−６
を用いて、より高い抗体を分泌するセルラインを単離す
ることが可能である。ベクター中の遺伝子のアレンジを
更に変更することによつて、転写インターフエアレンス
を更に減少させて抗体の発現を更に有利にすることが当
業者には明らかであろう。 例５ 例１と同様にして、エレクトロポレーシヨンによりpEE6
90KGSをミエローマセルラインNSOに導入した。96ウエル
プレートにプレート後、グルタミンフリー培地（Ｇ−DM
EM）で生育させてトランスフエクト体を選択した。トラ
ンスフエクシヨン効果は、105トランスフエクト細胞に
ついて約１個であつた。 シングルコロニーを含有する細胞培養トレーのウエルに
ついて、フイブリンアガーアツセイ〔８〕により90KDの
繊維素溶解酵素の分泌を分析した。アツセイした33個の
ウエルのうち、26個のウエルが繊維素溶解活性が明らか
にポジテイブであつた。ポジテイブトランスフエクト体
を培養液に広げ、生産物分泌割合いの分析に付した。 この方法によつて単離されたセルラインは、組織プラス
ミノーゲン活性化因子（tpA）と比較してフイブリンプ
レートアツセイにより評価した所、0.02−3.75pg/セル
／日で分泌していた。最も高い分泌割合いを示す６個の
セルラインを表９に示した。繊維素溶解活性は、Doddの
方法
〔９〕により実施した所、ザイモグラフイーにより
期待された90KDの分子量を示した。 最も高い分泌割合いを示す５つのセルラインについて、
例１と同様にして、20−80μＭの範囲のMSXを用いてGS
遺伝子増幅により選択を実施した。MSX耐性細胞プール
の比産生速度をフイブリンプレートアツセイにより測定
し結果を表10に示した。 例２に示されているように第１回目の増幅プールを用い
て更にMSXの濃度を上昇させて、第２回目のベクター増
幅の選択を実施した。再び比産生割合いを測定し、表11
に示した。この第２回目の選択により、テストしたそれ
ぞれのセルラインプールの生産性は上昇していた。しか
し、これらのラインのクローンを分析した所、最も高い
分泌割合いは、GS増幅の第１回目あるいは第２回目の選
択後に単離されてもいずれも約10pg/セル／日を示し
た。これにより、このセルラインについては分泌レベル
は飽和に達したことが判る。 これらの結果から、MSX耐性変異体の分泌により発現レ
ベルが上昇することが判る。80μMMSXに耐性として選択
されたライン９のクローンは、GS遺伝子増幅による選択
後に1.4pg/セル／日−10.5pg/セル／日の分泌割合いを
有しており、7.5培上昇した。 本発明は単に説明のために以上に説明されたものであつ
て、本発明の範囲内で詳細な修正が可能であることは当
業者には明らかであろう。 引用文献 1.Boshart,M,Weber,F.,Gerhard,J.,Dorsch−Hasler,K.,
Fleckenstein,B.and Schaffner,W.,Cell,41,521−530,
1985。 2.Emtage,J.S.,Angal,S.,Doel,M.T.,Harris,T.J.R.,Jen
kins,B.,Lilley,G.and Lowe,P.A.,PNAS−USA,80,3671
−3675,1983。 3.Mulligan,R.C.and Berg,P.,PNAS−USA,78,2072−207
6,1981。 4.Melton,D.A.,Krieg,P.A.,Rebagliati,M.R.,Maniatis,
T.,Zinn,K.and Green,M.R.,Nuc.Acid Res.,12,7035,1
984。 5.Soberon,X.,Covarrubias,L.and Bolivar,F.,Gene,
９,287−305,1980。 6.Whittle,N.,Adair,J.,Lloyd,C.,Jenkins,L.,Devine,
J.,Schlom,J.,Raubitschek,A.,Colcher,D.and Bodmer,
M.,Protein Engineering,１,499−505,1987。 7.Hayward.B.E.,Hussain,A.,Wilson,R.H.,Lyons,A.,Woo
dcock,V.,McIntosh,B.and Harris,T.J.R.,Nuc.Acids
Res.,14,999−1008,1986。 8.Bishop,R.,Ebert,H.,Gilchrist,G.,Shanbron,E.and
Fekete,L.,Thrombos.Diathes.Haemorrhagica,23,202−2
10,1970 9.Dodd,I.,Frars,R.and Robinson,J.H.,Thromb.Haemos
tas.55,94−97,1986。
期待された90KDの分子量を示した。 最も高い分泌割合いを示す５つのセルラインについて、
例１と同様にして、20−80μＭの範囲のMSXを用いてGS
遺伝子増幅により選択を実施した。MSX耐性細胞プール
の比産生速度をフイブリンプレートアツセイにより測定
し結果を表10に示した。 例２に示されているように第１回目の増幅プールを用い
て更にMSXの濃度を上昇させて、第２回目のベクター増
幅の選択を実施した。再び比産生割合いを測定し、表11
に示した。この第２回目の選択により、テストしたそれ
ぞれのセルラインプールの生産性は上昇していた。しか
し、これらのラインのクローンを分析した所、最も高い
分泌割合いは、GS増幅の第１回目あるいは第２回目の選
択後に単離されてもいずれも約10pg/セル／日を示し
た。これにより、このセルラインについては分泌レベル
は飽和に達したことが判る。 これらの結果から、MSX耐性変異体の分泌により発現レ
ベルが上昇することが判る。80μMMSXに耐性として選択
されたライン９のクローンは、GS遺伝子増幅による選択
後に1.4pg/セル／日−10.5pg/セル／日の分泌割合いを
有しており、7.5培上昇した。 本発明は単に説明のために以上に説明されたものであつ
て、本発明の範囲内で詳細な修正が可能であることは当
業者には明らかであろう。 引用文献 1.Boshart,M,Weber,F.,Gerhard,J.,Dorsch−Hasler,K.,
Fleckenstein,B.and Schaffner,W.,Cell,41,521−530,
1985。 2.Emtage,J.S.,Angal,S.,Doel,M.T.,Harris,T.J.R.,Jen
kins,B.,Lilley,G.and Lowe,P.A.,PNAS−USA,80,3671
−3675,1983。 3.Mulligan,R.C.and Berg,P.,PNAS−USA,78,2072−207
6,1981。 4.Melton,D.A.,Krieg,P.A.,Rebagliati,M.R.,Maniatis,
T.,Zinn,K.and Green,M.R.,Nuc.Acid Res.,12,7035,1
984。 5.Soberon,X.,Covarrubias,L.and Bolivar,F.,Gene,
９,287−305,1980。 6.Whittle,N.,Adair,J.,Lloyd,C.,Jenkins,L.,Devine,
J.,Schlom,J.,Raubitschek,A.,Colcher,D.and Bodmer,
M.,Protein Engineering,１,499−505,1987。 7.Hayward.B.E.,Hussain,A.,Wilson,R.H.,Lyons,A.,Woo
dcock,V.,McIntosh,B.and Harris,T.J.R.,Nuc.Acids
Res.,14,999−1008,1986。 8.Bishop,R.,Ebert,H.,Gilchrist,G.,Shanbron,E.and
Fekete,L.,Thrombos.Diathes.Haemorrhagica,23,202−2
10,1970 9.Dodd,I.,Frars,R.and Robinson,J.H.,Thromb.Haemos
tas.55,94−97,1986。
Claims (26)
- 【請求項１】グルタミン非依存性の形質転換リンパ系セ
ルラインの調製方法であって； （ａ）活性グルタミンシンセターゼ（GS）遺伝子及びリ
ンパ系セルラインにとって異種の蛋白質をコードする活
性遺伝子を含有するベクターでリンパ系セルラインを形
質転換し； （ｂ）形質転換セルラインを、グルタミンを含有する培
地で生育せしめ； （ｃ）グルタミンとアスパラギンもしくはアンモニアド
ナーを含有する選択培地であってグルタミンが順次減少
する選択培地で形質転換セルラインを生育し続け；次い
で （ｄ）グルタミン非依存性の形質転換リンパ形セルライ
ンを選択する； ことからなる上記方法。 - 【請求項２】グルタミン非依存性の形質転換リンパ系セ
ルラインの調製方法であって、 （ａ）活性グルタミンシンセターゼ（GS）遺伝子及びリ
ンパ系セルラインにとって異種の蛋白質をコードする活
性遺伝子を含有するベクターでリンパ系セルラインを形
質転換し； （ｂ）形質転換セルラインを、グルタミンを含有する培
地で生育せしめ； （ｃ）アスパラギンまたはアンモニアドナーを含むグル
タミンフリーの選択培地で形質転換セルラインを生育し
続け；次いで （ｄ）グルタミン非依存性の形質転換リンパ系セルライ
ンを選択する； ことからなる上記方法。 - 【請求項３】リンパ系セルラインがミエローマセルライ
ンである請求の範囲第１項または第２項の方法。 - 【請求項４】ベクターが更に、GS遺伝子以外の選択マー
カーをコードする遺伝子を含有する請求の範囲第１項ま
たは第２項の方法。 - 【請求項５】上記ベクターと、GS遺伝子以外の選択マー
カーをコードする遺伝子を含むベクターとで、リンパ系
セルラインを一緒に形質転換する請求の範囲第１項また
は第２項の方法。 - 【請求項６】該選択マーカーがgpt遺伝子である請求の
範囲第４項または第５項の方法。 - 【請求項７】培地中のグルタミンが、アスパラギンを含
むがグルタミンは含まない培地で希釈されて順次減少す
る請求の範囲第１項または第２項のいずれかの方法。 - 【請求項８】異種蛋白質がイムノグロブリン重鎖もしく
は軽鎖である請求の範囲第１項または第２項の方法。 - 【請求項９】GS遺伝子が比較的弱いプロモーターを有
し、異種蛋白をコードする遺伝子が比較的強いプロモー
ターを有し、形質転換セルラインにおいて、蛋白合成が
GS産生よりもむしろ異種蛋白の産生に優先的に向けられ
ている請求の範囲第１項または第２項のいずれかの方
法。 - 【請求項１０】グルタミン非依存性の形質転換リンパ軽
セルラインの調製方法であって； （ａ）活性グルタミンシンセターゼ（GS）遺伝子を含有
するベクターとリンパ系セルラインにとって異種の蛋白
質をコードする活性遺伝子を含有するベクターとでリン
パ系セルラインを一緒に形質転換し； （ｂ）形質転換セルラインを、グルタミンを含有する培
地で生育せしめ； （ｃ）グルタミンとアスパラギンもしくはアンモニアド
ナーを含有する選択培地であってグルタミンが順次減少
する選択培地で形質転換セルラインを生育し続け；次い
で （ｄ）グルタミン非依存性の形質転換リンパ形セルライ
ンを選択する； ことからなる上記方法。 - 【請求項１１】グルタミン非依存性の形質転換リンパ系
セルラインの調製法法であって、 （ａ）活性グルタミンシンセターゼ（GS）遺伝子を含有
するベクターとリンパ系セルラインにとって異種の蛋白
質をコードする活性遺伝子を含有するベクターとでリン
パ系セルラインを一緒に形質転換し； （ｂ）形質転換セルラインを、グルタミンを含有する培
地で生育せしめ； （ｃ）アスパラギンまたはアンモニアドナーを含むグル
タミンフリーの選択培地で形質転換セルラインを生育し
続け；次いで （ｄ）グルタミン非依存性の形質転換リンパ系セルライ
ンを選択する： ことからなる上記方法。 - 【請求項１２】リンパ系セルラインがミエローマセルラ
インである請求の範囲第10項または第11項の方法。 - 【請求項１３】ベクターが更に、GS遺伝子以外の選択マ
ーカーをコードする遺伝子を含有する請求の範囲第10項
または第11項の方法。 - 【請求項１４】上記ベクターと、GS遺伝子以外の選択マ
ーカーをコードする遺伝子を含むベクターとで、リンパ
系セルラインを更に一緒に形質転換する請求の範囲第10
項または第11項の方法。 - 【請求項１５】該選択マーカーがgpt遺伝子である請求
の範囲第13項の方法。 - 【請求項１６】該選択マーカーがgpt遺伝子である請求
の範囲第14項の方法。 - 【請求項１７】培地中のグルタミンが、アスパラギンを
含むがグルタミンは含まない培地で希釈されて順次減少
する請求の範囲第10項または第11項のいずれかの方法。 - 【請求項１８】異種蛋白質がイムグロブリン重鎖もしく
は軽鎖である請求の範囲10項または第11項の方法。 - 【請求項１９】GS遺伝子が比較駅弱いプロモーターを有
し、異種蛋白をコードする遺伝子が比較的強いプロモー
ターを有し、形質転換セルラインにおいて、蛋白合成が
GS産生よりもむしろ異種蛋白の産生に優先的に向けられ
ている請求の範囲第10項または第11項のいずれかの方
法。 - 【請求項２０】ベクターにおいて、異種蛋白質をコード
する遺伝子が比較的強いプロモーターを有し、GS遺伝子
は異種蛋白質をコードする遺伝子の上流に位置する比較
的弱いプロモーターを有するベクターである、請求の範
囲第１項の方法。 - 【請求項２１】ベクターにおいて、異種蛋白質をコード
する遺伝子は比較的強いプロモーターを有し、GS遺伝子
は異種蛋白質をコードする遺伝子のプロモーターとは逆
方向で発現を誘導する比較的弱いプロモーターを有する
ベクターである請求の範囲第１項の方法。 - 【請求項２２】比較的弱いプロモーターがSV40初期領域
プロモーターであり、比較的強いプロモーターがhCMV−
MIEプロモーターである請求の範囲第20項の方法。 - 【請求項２３】ベクターにおいて、GS遺伝子は弱いプロ
モーターを有し、異種蛋白質をコードする遺伝子は強い
プロモーターを持つイムノグロブリン重鎖遺伝子と強い
プロモーターを持つイムノグロブリン軽鎖遺伝子とを有
し、イムノグロブリン軽鎖遺伝子の強いプロモーターは
GS遺伝子及びイムノグロブリン重鎖遺伝子のプロモータ
ーとは逆方向に配置しており、イムノグロブリン重鎖遺
伝子はGS遺伝子の下流にあるベクターである請求の範囲
第１項の方法。 - 【請求項２４】ベクターにおいて、GS遺伝子は弱いプロ
モーターを有し、異種蛋白質をコードする遺伝子は強い
プロモーターを持つイムノグロブリン軽鎖遺伝子と強い
プロモーターを持つイムノグロブリン重鎖遺伝子とを有
し、イムノグロブリン軽鎖遺伝子と重鎖遺伝子とは同じ
方向で転写され、そしてGS遺伝子はイムノグロブリン軽
鎖遺伝子及び重鎖遺伝子の上流に位置しているベクター
である請求の範囲第１項の方法。 - 【請求項２５】比較的弱いプロモーターがSV40初期領域
プロモーターであり、比較的強いプロモーターがhCMV−
MIEプロモーターである請求の範囲第21項の方法。 - 【請求項２６】GS遺伝子は弱いプロモーターを有し、異
種蛋白質をコードする遺伝子は強いプロモーターを持つ
イムノグロブリン重鎖遺伝子と強いプロモーターを持つ
イムノグロブリン軽鎖遺伝子とを有し、該軽鎖遺伝子の
強いプロモーターはGS遺伝子と該重鎖遺伝子のプロモー
ターとは逆方向に配置されており、そしてイムノグロブ
リン重鎖遺伝子はGS遺伝子の下流にある請求の範囲第21
項の方法。
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