JPH0740941B2 - 植物ゲノムへの外来性ｄｎａの導入方法 - Google Patents

植物ゲノムへの外来性ｄｎａの導入方法

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JPH0740941B2
JPH0740941B2 JP60118982A JP11898285A JPH0740941B2 JP H0740941 B2 JPH0740941 B2 JP H0740941B2 JP 60118982 A JP60118982 A JP 60118982A JP 11898285 A JP11898285 A JP 11898285A JP H0740941 B2 JPH0740941 B2 JP H0740941B2
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Description

【発明の詳細な説明】 アグロバクテリウム（Agrobacterium）のTi（腫瘍誘
発）−及びRi（根誘発）−プラスミドのＴ−領域は高等
植物の細胞に自然に移行し、ここでこのDNAはゲノムに
導入され、そして発現される。このＴ−領域又は任意の
人工的Ｔ−領域の移行はまた、前記細菌中でVir−領域
に本質的ビルレンス（virulence）遺伝子を含有するプ
ラスミドに近接した別のプラスミド上に前記領域が存在
する場合にも生ずる（いわゆる２連ベクター系、オラン
ダ特許出願No.8300698;及び単子葉植物の遺伝的操作に
ついてのオランダ特許出願No.8401048）。ここに記載す
る驚くべき新規な発明はこの２連ベクター系の延長上に
基礎を置いており、この方法においては無傷のＴ−領域
又は人工的Ｔ−領域がトランスポゾン（Tn1882）の部分
としてアグロバクテリウムの染色体に導入され、そして
Vir−領域が補助プラスミド上に存在する。この方法に
よって細菌染色体中に導入されたＴ−領域は植物細胞に
効果的に移行し、ここで植物ゲノムに組み込まれそして
発現されるようである。この発明はまた、Vir−領域が
アグロバクテリウムの細菌染色体に導入されそしてＴ−
領域がプラスミド上に存在するか、又はVir−領域及び
Ｔ−領域がアグロバクテリウムの細胞染色体に導入され
ていれば、やはり２連系を使用することができることを
記録する。この新規な発明を用いて、双子葉植物及び単
子葉植物の細胞の遺伝的操作のための新規な方法を開発
することができる。外来性DNAを双子葉植物又は単子葉
植物の細胞に導入する新規な可能性；成分の１方又は両
方が細菌中にもはやルーズなレプリコンとして存在しな
い、アグロバクテリウムにおいて使用することができる
２連ベクター系が提供される。
この発明は、高等植物の細胞の遺伝的操作のために適切
なアグロバクテリウム系統の改良に関する。
アグロバクテリウム・チュメファシエンス（Agrobacter
ium tumefaciens）の腫瘍形成株中に自然に存在する大
プラスミド（Ti−プラスミド）は、双子葉植物上での腫
瘍形成を相当する〔ファンラレベック等，ネイチュアー
（Nature）（ロンドン）252,169−170（1974）；ザエネ
ン等,F.モル．ビオロ．（F.Mol.Biol.）86,109−127（1
974）〕。Ｔ−領域と称されるTi−プラスミドの特異的
部分が細菌により植物細胞に移行し、そしてコアDNAに
組み込まれる〔チルトン等，セル（Cell）11,263−271
（1977）〕。
組み込まれたDNAは発現され〔ウイルミッチェル等，モ
レキュラー・アンド・ゼネラルゼネティクス（Mol.Gen.
Genet.）182,255−262（1981）、そしてこの発現が植物
病クラウンゴール（Crown Gall）の分子的基礎を形成す
る。生成した腫瘍細胞は、正常な植物細胞と異り、植物
ホルモンであるオーキシン及びサイトカイニンを添加す
ることなく合成培地上で増殖することができる〔ユブラ
ウム，プロシーディングス・オブ・ザ・ナシュナル・ア
カデミー・オブ・サイエンシス（Nat.Acad.Sci.）44,34
4:349（1958）〕。腫瘍細胞はさらに、オパインと称さ
れる特異的化合物を含有し、このオパインは正常細胞中
には存在せずそしてその遺伝情報は移行したＴ−DNA上
にコードされている〔ボムホフ等、モレキュラー・アン
ド・ゼネラルゼネティクス（Mol.Gen.Genet）145,177:1
81（1976）；シュレーダー等,FEBSレター（FEBS Lett）
129,166−168（1981）〕。
植物細胞中に見出されるＴ−領域のほかに、Ｔ−プラス
ミドは細菌の毒性（virulence quality）に必須である
第２領域を含有する〔オムス等，ジャーナル・オブ・バ
クテリオロジー（J.Bacteriol.）144,82−91（1980）；
ガーフィンケル等，ジャーナル・オブ・バクテリオロジ
ー（J.Bacteriol.）144,732−743（1980）〕。この領域
は腫瘍細胞中には見出されておらず、そして遺伝的分析
により、この領域の変異（非常に弱い毒性又は完全な無
毒化を導く）はクローン又はＲプライムプラスミド上に
存在する野性形遺伝子により補完され得るイントランス
（intrans）であることが示された〔ハイル等、プラス
ミド（Plasmid）7,197−118（1982）；クレー等，ジャ
ーナル・オブ・バクテリオロジー（J.Bacteriol.）150,
327−331）〕。このVir（毒性）領域中には７個の遺伝
子座、すなわちVir A、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、及びＧが
存在する〔クレー等，ジャーナル・オブ・バクテリオロ
ジー（J.Bacteriol.）150,327−331（1982）；ハイル
等，プラスミド（Plasmid）7,107−118（1982）；ホー
イカース等，印刷中〕。
Vir−領域及びＴ−領域は、２つの適合性プラスミド上
に相互に物理的に分離されていてもよく、これによって
Ｔ−領域又は人工的Ｔ−領域を植物細胞に導入するアグ
ロバクテリウムの能力に対して負の影響はなんら与えら
れない〔ヘケマ等，ネイチュアー（Nature）（ロンド
ン）303,179−180（1983）〕。この発明を基礎にする２
連ベクター系は、植物細胞の遺伝的操作のために使用す
ることができる。（オランダ特許出願No.8300698及びヨ
ーロッパ特許出願No.842002396、並びにオランダ特許出
願No.8401048に記載されている）。
ここに記載する結果は２連系の成分がプラスミド上に存
在することが必須要件ではないことを示す。成分（Ｔ−
又はVir−領域）は別々に又は両者ともアグロバクテリ
ウムの染色体中に組み込まれることができ、これによっ
て、Ｔ−領域又は人工的Ｔ−領域が植物細胞に移行しそ
して次に植物ゲノムに組み込まれることに対する負の効
果が生じない。この発明は、細菌がDNAを植物細胞に移
行させることを可能にする分子的操作に強力な光を投ず
るのみならず、２連系によりもたらされる高等植物の遺
伝的操作の可能性の明らかな拡大を意味する。
Ti−プラスミドのＴ−領域を異る位置においてアグロバ
クテリウムのゲノムに挿入する目的で、その上に完全な
Ｔ−領域が存在するトランスポゾンTn1882をイン−ビト
ロ造成した。一緒になって完全なＴ−領域を構成する３
種の制限酵素断片、すなわちEcoRI断片10a、BamHI断片1
7a及びKpnI断片９を別々にクローニングし、そしてトラ
ンスポゾンTn3（Δ５−65）中の後記の無傷のＴ−領域
を構成するための３段階クローニングにおいて使用し
た。使用されたこのトランスポゾン〔コストリケン等，
プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミ
ー・オブ・サイエンシス（Proc.Natl.Acad.Sci.78,4041
−4045）は、トランスポザンの移動又はそのアンピシリ
ン耐性のために必須でない位置にIcoRI部位が導入され
たTn3の誘導体である。次に、このトランスポゾンを、E
coRI部位を含有しないE.コリベクタープラスミドpTR262
〔ロバート等，ジーン（Gene）12,123−127（1980）〕
に挿入した。得られたプラスミドpRAL3103のユニークEc
oRI部位にpTiB6のEcoRI断片をクローン化した。次の段
階において、EcoRI断片10aと部分的にオーバーラップす
るBamHI断片17aを天然BamHI部位〔バーカー等，プラン
ト・モレキュラー・バイオロジー（Plant.Mol.Biol.）
2,335−350（1983）による位置13.774〕に配置した。こ
の目的のために、EcoRI断片を有するTn3由来トランスポ
ゾンを、イン−ビトロ除去によりBamHI部位が除去され
たプラスミドであるpRAL3102に伝達した。これに達する
ため、プラスミドpRAL3102をpAL1155（R772:Tn1880）が
存在するE.コリ株に形質転換した。得られた株を空のE.
コリ系統への交差導入（cross−fertilization）におけ
る供与体として使用した。pAL1155によるpRAL3102の変
性についての選択により、２つのタイプのトランス接合
体（transconjugant）が得られた。Tn1880がpRAL3102に
移行したトランス接合体を、プラスミドDNAを単離しそ
してpRAL3102及びTn1880のマーカーのために空のE.コリ
を再び形質転換するためにこのDNAを使用することによ
り精製した。こうして、トランスポゾンTn1880が存在す
るpRAL3955を得た。プラスミド3955上のTn1880のユニー
クBam部位中にBamHI断片17aを正しい位置にクローン化
した（第１図）。こうして得られたプラスミドpRAL3956
は今やＴ−領域遺伝子３、6a、6b及び遺伝子４の右側部
分を、移動因子上に存在する中断されていないDNA片と
して含有する。次に、KpnI断片９をpRAL3956のユニーク
KpnI部位中の自然の位置（位置9834）に正しい方向にク
ローン化した。こうして得られたプラスミドpRAL3597は
TiB6プラスミドの無傷のＴ−領域を含んで成るトランス
ポゾンTn1882を含有する。
Tn1882が確かに機能的Ｔ−領域を含有するか否かを点検
するため、ビルレンスプラスミドpAL4404及びこれと適
合性の、Tn1882が存在するプラスミドを含有するアグロ
バクテリウムを造成した。このため、Tn1882をプラスミ
ドR772に挿入した。プラスミドR772を、pRALを含有する
E.コリ中に交差導入した。Tn1882のApRの伝達について
の選択を伴う空の細菌への交差導入は２種類のトランス
接合体をもたらす。このことは、プラスミドR772が低頻
度でpRAL3957と共に移行された表示中にpRALが存在する
他の表示、又は転移によってTn1882がR772上に着くこと
ができることから説明される。２種類のトランス接合体
の１つ中にトランスポゾンR772が存在することは、制限
酵素により処理されたプラスミドDNAの電気泳動により
確立された。Tn1882を有するR772プラスミドをpAL1157
と称する。次に、プラスミドpAL1157を接合によりLBA44
04（pAL4404）に入れた。LBA4404（Pal4404,pLA1157）
の腫瘍原性は、試験されたすべての宿主植物について野
性型A.チュメファシエンス（A.tumefaciens）LBA1010株
のそれと同じであった。この結果は、トランスポゾンTn
1882が正常に機能するＴ−領域を含有することを示し
た。
Tn1882をA.チュメファシエンスの染色体に挿入するた
め、種々の方法が使用された。第１の方法はプラスミド
pRAL3958のE.コリ内での造成を含む。このプラスミド
は、A.チュメファシエンス中で複製することができない
接合プラスミドpRK2013から誘導された。これは、原理
的に“自滅プラスミド”としてpRAL3958（pRK2013:Tn18
82）を使用することができ、そしてTn1882はアグロバク
テリウム株のゲノムに転移することにより保持されるこ
とができ、他方pRAL3958それ自体は消滅することを意味
する。これを達成するため、pRAL3958を有するE.コリ株
を、Ti−プラスミドを含有しないA.チュメファシエンス
株LBA288を用いる交差導入において１つの供与体として
使用した。
Tn1882の耐性マーカー（ApR）はLBA288中で非常によく
発現されるが、ApRの伝達は見出されなかった。E.コリ
中でのpRAL3958の接合伝達は受容体当り30％の頻度で生
じた。アグロバクテリウムについて見出された負の結果
は、Tn1882がA.チュメファシエンスのゲノム中に“飛び
込ま”ないか又はほとんど飛び込まないことを示す。発
明者等はこの問題を、A.チュメファシエンスのDNAのゲ
ノム片をTn1882のための“自滅”供与体プラスミドに適
用することによって回避した。この方法は３段階（第２
図）から成る。
ｉ）LBA288から分離したA.チュメファシエンスのゲノム
DNAをE.コリベクターpACYC184にクローン化し； ii）クローンの１つ、すなわちpRAL3305にTn1882をE.コ
リ中での転移により導入し；そして、 iii）こうして作成したプラスミドpRAL3959はA.チュメ
ファシエンス中で複製することができず、そしてそのた
めにアグロバクテリウム中でTn1882のための“自滅”供
与体として使用することができる。従って、pRAL3959が
LBA288に移行した。
今、Tn1882のApRは可能な転移によりアグロバクテリウ
ム中に保持され得るのみならず、完全なプラスミドがク
ローン化されたA.チュメファシエンスゲノムDNA断片と
の相同組換によりゲノムに入ることもできる。LBAへの
移行は受容体当たり10-7の頻度で生ずるが、E.コリでの
このプラスミドの移行は受容体当り10-4の頻度で生じ
た。これらの結果から、pRAL3959はA.チュメファシエン
ス中で確かに複製し得ないことが明らかである。アグロ
バクテリウムトランス接合体の１つLBA1160を詳細に分
析して、Tn1882が本当にアグロバクテリウムの染色体に
導入されたか否かを確定した。
アグロバクテリウム株LBA288からクローン化されたゲノ
ムDNA（pRAL3305）の断片はおそらく染色体、又はLBA28
8中に存在する隠れたプラスミドpAtC58から生じたもの
である。従って、LBA1160中でpRAL3959と染色体及びpAt
C58との組換が生ずる可能性がある。LBA1160株を遺伝的
に特徴付け（ｉ及びii）、そしてこの株のDNAをサザン
ブロットハイブリダイゼーション（iii）により分析し
て両可能の間の区別を可能にした。
ｉ）ランダムなトランスポゾン変異により隠れたプラス
ミドpAtC58に選択マーカーを付した。この目的のため、
リゾビウム・レグミノサルム（Rhizobium legminosaru
m）の変異について〔ベーリンガー等，ネイチュアー（N
ature）（ロンドン）,276,633−634〕に記載されている
ようにして、LBA288のためのTn5供与体として“自滅”
プラスミドpJB4JIを使用した。接合実験により、多くの
場合に、Tn5はLBA288中自己伝達性プラスミド上に存在
することが証明された。このプラスミドがpAtC58である
ことが明らかになった（伝達頻度受容体当り10-7）。自
己伝達するというpAtC58のこの新しく見出された性質
が、Tn1882がLBA1160中pAtC58上に存在するか否かを決
定するために使用された。この目的のため、LBA1160及
びLBA1201（pAtC58::Tn5）の両者を、相互比較のためLB
A385との交差導入において供与体として使用した。トラ
ンス接合体pAtC58::Tn5上での選択の後、予想通り、受
容体当り10-7の頻度をもって移動したことが明らかとな
った。しかしながら、Tn1882のApRの伝達は示されなか
った。このことは、供与体株LBA1160中の隠れたプラス
ミドpAtC58上に存在しないとする推定を強く示唆した。
ii）選択圧が発揮されなければ１個の細菌細胞中に安定
に保持され得ない複数のプラスミドは同一の不適合クラ
ス（inc.）に属する。従って、フォルティオリ（fortio
ri）はそれ自体と不適合のプラスミドである。Tn5でマ
ークされたpAtC58（KmR）がTn1831でマークされたpAtC5
8（SpS）を有するA.チュメファシエンス株に導入され、
そして入るプラスミド（KmR）が選択されれば、不適合
性によりSpRマーカーの喪失が生じ、これはトランス接
合体の最も大きな部分において、すでに存在したプラス
ミドが除去されたことを意味する。従って、LBA1160
が、供与体としてのLBA1201（pAtC58::Tn5）との交差導
入における受容体として使用される。入るプラスミドpA
tC58::Tn5がトランス接合体中及びその上で選択され、T
n1882に由来するApRが不適合性により失われたか否かが
チェックされた。すべてのKmRトランス接合体がそのApR
を保持していることが明らかであった。これもまた、Tn
1882がLBA中でpAtC58上に位置していないことを強く示
唆した。
iii）Tn1882のLBA1160中での位置の明確な証明がサザン
ブロットハイブリダイゼーション実験によって得られ
た。この実験によりLBA228、LB1201及びLBA1160の材料
プラスミド調製物を分析した。原料プラスミド調製物
〔カッセ等，ジャーナル・オブ・ゼネラル・マイクロバ
イオロジー（J.Gen.Microbiol.）113,229−242（1979）
に従って単離したもの〕をアガロースゲル上でその構成
成分に分離した。ゲル中にバンドとして存在する成分を
ゲルから直接ニトロセルロースフィルターに移し（いわ
ゆるブロット法）、そして次に多数の特異的放射性ラベ
ルDNAプローブとハイブリダイズさせた。Tn5でプローブ
された対照はpAtC58::Tn5のいわゆるスーパーコイル及
び線状DNAバンドとハイブリダイズした。この場合、組
み込まれない染色体DNAのほかにブロットの組み込まれ
ないpAtC58::Tn5 DNAが同様に存在する。Rn1882のため
の出発材料であるTn3を放射性プローブとして使用した
場合、LBA1160中に存在するpAtC58とのハイブリダイゼ
ーションは見られなかった。
従って、発明者等は、上記のことから、Tn1882そして従
ってpTiB6の完全Ｔ−領域がLBA1160の染色体中に存在す
ると結論した。LBA1160の全DNAが存在するブロットを用
いて、多数の制限酵素により断片化され、そしてラベル
されたプローブとしてpRAL3305及びpOTY8が使用された
サザンブロットハイブリダイゼーションにより、LBA116
0へのTn1182のＴ−領域の挿入の正しい内部組織が確認
された（第３図に示された構造）。
Tn1882がその上に位置するpRAL3959のLBA1160の染色体
への挿入の安定性を、選択圧を伴わないで細菌を約100
世代増殖せしめ、そしてpRAL3959の耐性マーカー（TcR
及びApR）が維持されているか否かをチェックすること
により試験した。マーカーの喪失は検出されなかった。
従って、LBA1160は染色体に安定に組み込まれたＴ−領
域を含有する。発明者等によって得られた全く新しい構
成物の腫瘍原性を試験することにより、同様に必要なビ
ルレンス機能（Vir−領域）がＲ−プライムプラスミド
（pAL1818及びpAL1819）によりLBA1160株に導入され
た。プラスミドpAL1818はVir遺伝子Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、及
びＯを含有し、そしてpAl1819はＡからＦまで及びＯを
含むVir遺伝子を含有する。LBA1160とＲ−プライムを含
有する株との接合及びトランス接合体の選択の後、LBA1
161〔すなわち、LBA1160（pAL1818）〕、及びLBA1162
〔すなわち、LBA1160（pAL1819）〕が生成した。これら
の株及び親株LBA1160及びLBA1818（pAL1818）及びLBA18
19（pAL1819）を多くの異る種類の植物に対するそれら
の腫瘍誘発能力について試験した。
LBA1160並びにLBA1818及び1819のみが２連系の構成成分
の１方を含有し、そしてそのために腫瘍への機会を与え
なかった。しかしながら、LBA1160株は、ビルレンスプ
ラスミド（Ｒ−プライム）と共に、処理されたすべての
植物上に驚く程腫瘍を生じさせた。腫瘍の挙動及び大き
さは野性形のアグロバクテリウム株により誘発される腫
瘍のそれに相当した。従って、TiプラスミドのＴ−領域
はVir−領域によってアグロバクテリウムの染色体から
高等植物細胞のゲノムに正常に導入され得る。
上記の観察は、アグロバクテリウムがそのＴ−領域を植
物細胞に移行させる機作を理解する上で非常に重要であ
る。Ｔ−領域がアグロバクテリウムの染色体に存在する
場合でさえ、これが正常に移送されるという驚くべき発
見は、従来予想されていたように、完全なTiプラスミド
が感染中に植物細胞に導入され、そしてそこでＴ−DNA
の組込みのために「加工」されるということはないこと
を意味する。さらに、これらの結果に基いて、発明者等
は、毒性遺伝子によるＴ−DNAの認識及び切り取りは、
腫瘍誘発過程の初期段階の１つとして細菌中で行われる
と推定する。Ｔ−領域を画するいわゆる境界配列（bord
er sequence）は認識シグナルとして作用し得るかもし
れない。
この基本的な科学的重要性とは別に、この新規な発明
は、高等生物の細胞の遺伝的操作のための新しい展望を
開く。この発明の新しさ及びその利用可能性は第4A図か
ら第4F図において最もよく知らされる。２個の別々のプ
ラスミド上に分かれて存在するＴ−領域及びVir−領域
はなおＴ−領域又は人工的Ｔ−領域（及びこれに挿入さ
れた外来性DNA）を植物細胞に移行せしめることがで
き、ここでこの領域はゲノムに組み込まれ、そして発現
される。このいわゆる２連ベクター系を用いて、双子葉
植物及び単子葉植物の細胞に新しい遺伝物質を与えるこ
とができる（第4A図）。
プラスミド上に（第4B図）又は染色体中に（第4C図）Vi
r−領域のみ又はＴ−領域のみを含有する株は植物細胞
を形質転換しない。この新しい発明により、染色体に挿
入されたＴ−領域がなお２連系において植物細胞に正常
に移送され、Vir−領域は別のプラスミド上に存在する
（第4D図）。この驚くべき発明により、次のように述べ
ることもできる。アグロバクテリウムのＴ−領域もしく
はVir−領域又は両者が染色体外レプリコン（プラスミ
ド）上に存在せず染色体に組み込まれている場合（第4
D、Ｅ、及びＦ図に示す状態）に、これらはＴ−領域又
は人工的Ｔ−領域を効率的に植物のゲノムに導入し、従
って、ヨーロッパ特許出願842002396及び8401048をこれ
らの新しい状態に適用することができる。このようなア
グロバクテリウムを双子葉植物及び単子葉植物の細胞の
遺伝的操作のために使用することができる（オランダ特
許出願No.8401048）。
【図面の簡単な説明】
第１図はプラスミドpRAL3957の造成を示す系統図であ
る。 第２図はプラスミドと染色体との交差組換によるLBA116
0洋の造成を示す系統図である。 第３図はTn1880の断片の関係を示す図である。 第4A図から第4F図はこの発明の高等植物の形質転換の原
理を示す図である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｎ 5/10 (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:01） (72)発明者 ポール ジエイ．ジエイ．ホーカス オランダ国，2317 アベ リーデン，コン ドールホルスト 126 (72)発明者 ジヤツク ヒレ オランダ国，6871 ハゲ バゲニンゲン, デ ドレイジエン 11 (72)発明者 ロベルタ ア．シユイルペロルト オランダ国，2334 シーデ リーデン，ア ンソニエ デユイクラン 10シー (56)参考文献 Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｖｏｌ．303（1983) Ｐ．179−180 Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ. １（1983）Ｐ．262−269

Claims (8)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】腫瘍形成に必要なビルレンス機能部及びＴ
    −領域を有するアグロバクテリウムを植物の外植体に感
    染せしめるか又は該アグロバクテリウムと共に植物プロ
    トプラストをインキュベートすることによりＴ−領域を
    植物のゲノムに導入する方法において、前記Ｔ−領域も
    しくは前記ビルレンス機能部又はその両者が前記アグロ
    バクテリウムの染色体上に存在することを特徴とする方
    法。
  2. 【請求項２】前記ビルレンス機能部が１又は複数のプラ
    スミド上に存在し、そして前記Ｔ−領域が染色体上に存
    在する、請求項１に記載の方法。
  3. 【請求項３】前記Ｔ−領域が人工的Ｔ−領域である、請
    求項１又は２に記載の方法。
  4. 【請求項４】前記ビルレンス機能部がプラスミドpAL440
    4,pAL1818又はpAL1819上に存在することを特徴とする請
    求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
  5. 【請求項５】DNA中に１又は複数のＴ−領域及びビルレ
    ンス機能部を有するアグロバクテリウムであって、少な
    くとも１つのＴ−領域もしくはビルレンス機能部又はそ
    の両者がアグロバクテリウムの染色体中に導入されてい
    ることを特徴とするアグロバクテリウム。
  6. 【請求項６】前記Ｔ−領域が染色体上に存在し、そして
    前記ビルレンス機能部が１又は複数のプラスミド上に存
    在することを特徴とする、請求項５に記載のアグロバク
    テリウム。
  7. 【請求項７】前記ビルレンス機能部がプラスミドpAL440
    4,pAL1818又はpAL1819上に存在する、請求項５又は６に
    記載のアグロバクテリウム。
  8. 【請求項８】前記Ｔ−領域が人工的Ｔ−領域である、請
    求項５又は６に記載のアグロバクテリウム。
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