JPS6070080A - 双子葉植物の染色体への外来性dνaの組込方法 - Google Patents

双子葉植物の染色体への外来性dνaの組込方法

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JPS6070080A
JPS6070080A JP59031539A JP3153984A JPS6070080A JP S6070080 A JPS6070080 A JP S6070080A JP 59031539 A JP59031539 A JP 59031539A JP 3153984 A JP3153984 A JP 3153984A JP S6070080 A JPS6070080 A JP S6070080A
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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 (発明の分野) この発明は、1又は複数のプラスミドを含有す感染せし
めることにより、又は該細菌と共に植物細胞をインキュ
ベートすることにより外来性DNAを双子葉植物のゲノ
ムに組み込む方法に関する。
以下余白 (発明の背景) 入・ヱノクj野夕[4色のTiプラスミドが、この細菌
が双子葉植物にいわゆる「クラウン・ゴール(Crou
n gall) J腫瘍の形成を惹起するのに必須であ
るととが知られている[: Van Larebeke
等、Nature (oンドン)252,169〜17
0(1974) :Watson等、J 、 Bact
eriol。
123.255〜264 (1975) : Zaen
en等、J、 Mo1. Biol、86 、109〜
127(1974))。とのプラスミドのT−領域と称
される部分は、腫瘍誘発の間に、T −DNAとして植
物ゲノムに組み込まれ[Chilton等、Ce111
1.263〜261(1977):Chilton等、
Proc、 Nat、 Acad、Set、 USA7
7 m4060〜4064 (1980) : Tho
mashow等、 Pro。
Nat、 Acad、Sc1. TJSA 77 、6
448〜6452(1980) : Wl11ml’t
zer等、Nature (oンドン)287,259
〜361 (1980))、そして種々のRNA転写に
おいて発現される[ Drummond等、Natur
e (ロンドン)269゜(3) 535〜536(1977):Ledeboer。
thesis 5tate University o
f Leyden(1978) : Gurley等N
 Proc、 Nat−Acod。
Sc1.USA76.2828〜2832(1979)
ニアVI 11mi tzer等、Mo1. Gen、
 Genet、 182 +255〜262(1981
))。この腫瘍細胞は植物ホルモン非依存性増殖を示し
、そしてオパイン(opine) として知られている
1種類又は複数種類の普通でないアミノ酸誘導体を含有
し、この内オクトビン(octoplne)及びツノや
リン(nopal 1ne)が最もよく知られている。
オクトビンTiプラスミド由来のT −DNAはg素+
J ソヒンテヒドロケ9ナーゼ(1ysopine d
ehydrogenase)(LpDH)又はオクトビ
ンシンサーゼ(octoplnesynthase) 
(OC8)についてコードする遺伝子を担持しており、
この酵素は腫瘍細胞がオクトビンを合成するために必要
である( 5chroeder等、FEBS Letl
、129.1 66〜1 68 (1981ン〕。
さらに、このプラスミドは、細菌によるこれらのオパイ
ンの使用のだめの遺伝子を含有する(4) [Bomhoff等、Mo1. Gen、Genet、
 145 + 177〜181 (1976) : M
ontoya等、J。
Bacteriol、 129 、101〜107 (
1,977)’:l。
プラスミドのT−領域が欠失して込る場合、腫瘍は誘発
されない(Koekman等、Plasmid 2 +
347〜357(1979):)。T−領域のほかに、
Tlプラスミドの他の領域が細菌の腫瘍誘発能のために
必須のようであるC Garf 1nke 1等、J。
Baaterlol、 144 、732〜743 (
1980):Ooma等、 J、Baateriol、
 144 + 82〜91(1980):lが、この部
分は植物腫瘍細胞中にまだ見出されてい々い。約20M
dのサイズを有するこの領域〔ここでの変異はトランス
的に(intrana)相補的である〕はvlr (v
lrulence)領域と称される(Hllle等、P
lasmid 6 * 151〜154(1981);
Hllle等、Plasmid 7 e107〜118
(1982):に1ae等、J。
Bacterlol、 150 、327〜331 (
1982))。
上記のことから、原核性細菌A、ツメファシエ72が、
天然に存在する真核性植物の遺伝的操作のための系を有
することが明らかであろう。TiプラスミドのT−領域
は、外来性DNA、特に特定の望ましい性質についてコ
ードする遺伝子を植物細胞のゲノムに組み込むために適
当であシ、さらに原理的には、新遺伝子の導入を同時的
に遮断することなく腫瘍の原因である遺伝子を除去する
ことが可能である。第1の可能性は、T−領域が希望通
りに操作されているTiプラスミドを1又は複数含有す
るA、ツメファシェンス細菌を植物に感染せしめること
である。植物プロトプラストを前記のA。ツメファシェ
ンス細菌と共にインキュペーエセリヒアe ニア !J
 (Escherichia co旦)において行うの
が好ましい。しかしながら、Tiプラスミドは通常、互
、1」中で維持されない(Tiプラスミドは互、−三辺
宿主中で複製しない)。このため現行の方法においては
、E 、 j IJ−及び人・ツメファシェンス中で複
製するいわゆるシャトルベクターが使用され、これにT
−領域が導入される。そして次にこのT−領域に新遺伝
子が導入される。
しかしながら、人、ツメファシェンスを介して細胞を形
質転換するためには完全なTiプラスミドが必要である
。この理由は、T−領域を選択しくおそらくT−領域の
末端の塩基配列を認識することによシ)そして植物に移
入(transfer)する遺伝子を担持している必須
の1団−領域をTiプラスミドが含有しているためであ
る。
現行の方法においてはTf7’ラスミドは乱、三斐中に
維持されないので、操作されたT−領域を有するシャト
ルベクターが、このシャトルベクターと共存し得る完全
Tiプラスミドを含有するA、7メフアシエンスに移入
される。シャトルベクターはT−領域の部分金含有し、
この部分はTiプラスミドのT−領域中にも存在するか
ら、両T−領域の相同性部分の間で二重乗換(doub
le crossing−over)が生ずる。これに
よシ、無傷の(intacすTiプラスミドのT−領域
に新遺伝子が導入される。
Tiプラスミドの部位特定変異(site 1ocat
iondlrected mutation)の方法が
Leemans等、(7) The Embo Journal 1 + 147〜
152 (1982):Matzke等、J、 Mo1
. Appl、 Genet、 1 、3 ’J〜49
(1981)に記載されている。これらの技法の基礎と
なる一般的原理についてはRuvkun等、Natur
e (o ンドン)、289,85〜88(1981)
を参照のこと。Tiプラスミド変異の最終段階は常にア
グロバクテリウムそれ自体において行われる。なぜなら
、Tiプラスミドの宿主範囲はりゾビアセ−(Rhiz
obiaceae)に限られているからである。E、:
ffυ中のTiプラスミドのクローン断片を、例えばト
ランスポゾンの挿入によって変異せしめた後、との変異
を受けた断片を広い宿主範囲を有するベクター上でサブ
クローニングし、そしてTiプラスミドを含有するアグ
ロバクテリウムの菌株に移入する。ここで、挿入された
DNAが、二重乗換を介する相同的組換によってTiプ
ラスミド中に導入され、この後、広い宿主範囲を有する
プラスミドが不和合プラスミドによシー破壊され、ある
いはTiプラスミドが接合にょシ他のアグロバクテリウ
ムに移送される。被接合体(8) (transconjugant) の試験によシ、T
iプラスミドの正しい変異が生じたか否かを点検する。
これらの公知の方法は面倒であり、そして技術的な問題
点を有する。これらの問題点は、旦。ユリにおいて直接
性いうる。Tlプラスミド自体の部位特定変異によシ回
避することができよう。しかしながう、Tlプラスミド
はE。コリ中で機能し得る複製開始点を有しない。
驚くべきことに、必要なりir−領域及びT−領域が2
つの異なるプラスミド上に位置する場合にも、A6ツメ
7アシエンスから植物細胞へのDNAの望ましい伝達(
伝達されたDNAは植物細胞中でゲノムに組込まれる)
が達成され得ることが見出された。
(発明の構成) 上のプラスミドと、導入された外来性DNAと共にT−
領域を有するがvir−領域を有しない1以上の7’ラ
スミドとを含有するアグロバクテリウム細菌を使用する
ことを特徴とする。
腫瘍性を有する植物細胞を得ることが必要でない隼1合
には、T−領域が−ダー(border)配列間に外来
性DNAを含む人工的T−領領域残して野性型T−領領
域ボーダー配列間の腫瘍遺伝子(one−遺伝子)及び
他の配列を除去することができる。
ここで、?−ダー配列は、アグロバクテリウムを介する
T −DNAの移入及び植物染色体への組込みに必要と
されるT−領域の宋端の配列と定義される。
この発明は、上記のこの発明の方法において使用するの
に適する新規なアグロバクテリウムの菌株を提供し、こ
の細菌は、Ti(腫瘍誘発)プラスミドの中領域を有す
るがT−領域を有し々い1球上のプラスミドと、導入さ
れた外来性DNAと共にT−領域を有するがvlr領域
を有し々い1以上の他のプラスミドとを含有することを
特徴とする。
ここで、T−領域とは、移入されそして植物の染色体D
NAに組込まれる任意のDNAを意味する。
エセリヒア・三ユにおいて、T−領域と広い宿主範囲を
有する複製開始点とを含有するプラスミドのT−領域に
外来性DNAを導入し、ぞして得られたプラスミドを、
TIシラスミドのvir−領域を有するがT−領域を有
し々い1以上のプラスミドを含有するアグロバクテリウ
ム細菌に導入することによシ製造することができる。
この発明はさらに、この発明の方法を適用、してもとの
植物細胞の遺伝的性質を変化せしめた後に得られる植物
又は植物細胞を提供する。
変性された遺伝情報を有する植物又は植物細胞を得るた
めのこの発明の方法は、植物の改良(例えば農薬に対す
る一層高い耐性を有する改良された品種の栽培)、及び
特定の望ましい翻訳生産物、例えば酵素、又は植物細胞
の2次代謝産物を大量に製造するために植物細胞を発酵
に使用するための・ぐイオリアクタ−(場合によっては
これに植物細胞が固定されている)の実用化において使
用することができる。
従ってこの発明の方法は、他の変化しないバックグラウ
ンドの中で非常に明確な遺伝的に改良された、すなわち
変化した性質を有する高等植物の変種の製造を可能にす
る。すでに記載したようにこの方法は植物育種産業にお
いて有用であり、この発明の方法を適用して得られた組
織系(tissueline)から形質転換後の早い段
階において得られる。さらに、この発明の方法を適用し
て得られた自家栄養増殖性細胞、例えばクラウン・コ9
−ル細胞は、発酵槽中での良好な増殖のために非常に簡
単な合成培地を必要とするのみであり、この培地には植
物ホルモンを加える必要がない。外来性DNAが導入さ
れたこうして得られた細胞は、外来性DNAによってコ
ードされる物質、例えばアルカロイド、アミノ酸、炭化
水素、蛋白質、酵素、ステロイド等の製造のために大規
模に培養することができる[ Impact of A
pplied Ganatice、Mlero−Org
anisms、Plantg and Animals
:OTA Repart。
Congress of the United 5t
ates 0ffice of Tecbnology
Assessment、ワシントン、1981参照〕。
この発明に従えば、2つの異なる和合性プラスミドを含
有するアグロバクテリウムの菌株が使用され、製造され
る。一方のプラスミドはvir−領域を含有するがT−
領域を有し々いためそれ自体としては肺癌誘発能力を有
し力い。仙方のプラスミドは操作されたT−領域を担持
しておシ、やはりそれ自体としては腫瘍誘発能力を有し
ない。しかし力から、両プラスミドを収容するアグロバ
クテリウムの菌株は正常力腫瘍誘発能力を有し、又はさ
らに一般的にはDNAを双子葉植物、例えばトマト、タ
ノ々コ、ベチーニア、バレイショ、甜菜、サンフラワー
、豆科植物、及びこれらに類するものの染色体に組み込
む能力を有する。
この発明は、T−領域を有するがヱむ−領域を有し々い
プラスミドの構成のために、亙旧」宿主中で目的の遺伝
的操作を容易に達成することができる程度に小サイズの
イクタープラスミドの使用を可能にする。こうして得ら
れたプラスミドが、vlr−領域を有するがT−領域を
有しないプラスミドを収容するアグロバクテリウムの菌
株に導入された場合、操作されたT−領域を植物細胞に
組み込むh]能性が開かれる。従って、植物細胞の遺伝
的掃作のためのこの発明の2々クター系により、無傷の
Tiプラスミドを使用する必要性、及びそれに関連する
すべての欠点が除去される。さらに、この発明に従えば
複雑さをもたらす無理な乗換がもはや必要でなくなる。
1個又は複数個の新規な遺伝子を無傷のTiプラスミド
のT−領域に導入するために無理な乗換を用いる必要性
が無くなることによI)、2村クター系はさらに、1又
は複数の新規方遺伝子と一緒に不所望の遺伝子(例えば
幻匹−遺伝子又はその部分を含む)を植物染色体に導入
する必要がもはや存在しないという利点を有する。2ベ
クター系を用いて、例えば第5図に記載するよう完全な
「人工的」T−領域を構成し、そしてこのDNAを染色
体に組み込むことが可能となる。
さらに実験例を記載する。この例においてはすでに記載
したこの発明を実際に用いて、T−領域において新遺伝
子を操作しそして植物細胞に移入し、そして同じ目的で
完全「人工的」T−領域を用いた。
オクトピンT1プラスミドpTiAch5の無傷のT−
領域を含有し、そしてA、ツメファシェンス及びE、コ
リのいずれにおいても自律複製することができるプラス
ミドを得るために、組換プラスミドPO’l’Y8を使
用した。このシラスミドはプラスミドT)JDB207
 [Bsggs lMo1ee、Genet、 in 
Yeast 。
AlfredBensonSymp、 16 、383
〜389 (1981))の誘導体でアシ、テトラサイ
クリン耐性座にpTIAah 5のT−領域を挿入する
ことにより得られたものである。このプラスミドPOT
Y8はさらに遺伝マーカーとしてプラスミドPAT]5
3 [Twlgg等、Nature 283.216〜
218(1980)’)のアンピシリン耐性遺伝子(A
p)及びLEU −2遺伝子を含有する。シラスミドP
OTY 8の概略を第1図に示す。制限酵素旦す−■及
びBamT(Iの認識部位をこの図中に示す。
このシラスミドは人、ツメファシェンス細菌中で複製す
ることができないため、このプラスミドをIncPシラ
スミドR772との融合によシ広い宿主範囲を有するプ
ラスミドに転換した。この目的のため(15) に、R772を接合Cconjugation )によ
pHB101株(プラスミドPOTY 8を有する)に
導入し、次にこの交雑による被接合体を供与体として用
いてA、7メフアシ工ンスLBA202株とさらに交雑
を行った。
この被接合体をPOTY8のアンピシリン耐性マーカー
の存在について選択した。予想としてはこれらの株けP
OTY8とR772との相互統合プラスミド(coln
tegrate plasmid)を含有するはずであ
る。々ぜならPOTY 8自体は接合性を有さすそして
アグロバクテリウム中で複製することができないからで
ある。R772の導入はPOTY 8の々フタ一部分及
びT−領域のいずれにおいても起こり得る。補完実験が
可能であるために、無傷のT−領域を含有する相互統合
プラスミドのみが重要である。このため次に、30個の
被接合体をE、コ1JJA221株[C6(10trp
Fl: 1euB、Beggs、Nature275 
、104〜109(197,8)参照のこと〕と接合せ
しめ、そしてその子孫をロイシン要求性について試験し
た。
30個の被接合体株の内の1つけロイシンを添加し々い
最少培地において増殖しなかった。おそら(16) く、この菌株は、 R772の導入により遺伝子LEU
−2の発現が不活性化されているR772 :: PO
TY8相互統合プラスミドを含有する。pAL1050
と称するR772 :: POTY8プラスミドの制限
酵素パターンの分析により、シラスミドpAL1050
はPOTY 8のpJDB207部分にR772の挿入
を有し、T−領域は変化を受け力いで維持されているこ
とが示された。
構造的編成をさらに、R772及びPOTY 8のうR
ルしたプラスミドI)NAを用いるサザンプロット法[
5outhern + J、Mo1. BIol、98
 + 503〜518(1975))によるハイブリダ
イゼーション実験により確認した。プラスミドpAL1
050及びその調製方法の概要を第1図に示す。この図
においてT−領域が描影されている。挿入配列l570
の2コピーの内の1つが部分的に欠々われ、これが相互
統合プラスミドpAL1050の驚くべき安定性の理由
である。
プラスミドpAL1050を非−腫瘍形成性アグロバク
テリウム株(そのTiプラスミドが除去されている)に
導入し、そしてpAt、1050のこの導入により前記
の菌株の腫瘍誘発能力が回復するか否かを試験した。予
想通シ←に一領域が欠失している)、下の表に示す通り
回復しなかった。
pAL]050を接合により非−腫瘍形成性アグロバク
テリウムLBA4404株(Ooms等、Gene 1
4 * 33〜50(1981);この株は大きく減縮
されたT1プラスミドを含有し、このプラスミドは全ニ
ー領域を欠失しているが無傷のヱ堕−領域を有する(第
2図参照)〕に移入した。第2図はプラスミドpTIA
eh 5のカードを示し、ここではpAI、1050上
に存在するT−領域が黒く示されておυ、そしてpAL
4404上に存在するvir−領域を含有する部分がハ
ツチングで示されている。
T−領域を有するプラスミドpAL1050及び土−領
域を有するプラスミドpAL4404の両者を含有する
被接合法LBA 4434の腫瘍誘発能力を、種々の植
物種を用いて試験した。LBA 4434株は試験した
すべての植物に正常々腫瘍を誘発し、この腫瘍中にはオ
クトビンが検出された(表参照)。
以下余白 植物腫瘍誘発試験 注*:ocs=腫瘍中でのオクトビン合成。0tten
及び5chilperoort + Biochem、
 Blophys。
Acta527,497〜500(1978)K従って
検出。
** : Cr=A、ツメファシェンスAch5株の大
潜在シラスミド。
***:カランコ=リュウキュウペンケイ属植物。
(19) これらの実験は、細菌の腫瘍誘発能力に影醤を与えるこ
となく、オクトビンTIプラスミドのvir−領域及び
T−領域を異るプラスミドに物理的に分離することがで
きることを示している。グラスミドpAL 1050の
みを有するA−ツメファシエ4うは腫瘍を誘発すること
ができないから、この結果は、吋−一領域のこれらの遺
伝子は、植物細胞にT−領域全移入する間に機能するこ
とを示している。
アグロバクテリウムLBA 4434株の腫瘍形成性は
細菌の一部分においてpAL 4404及び1)Al5
O12間で相互統合シラスミドが形成されることによっ
て生ると考えることもできよう。しかしながらこれは次
の理由によシ否定されよう。まず第1に、サザンプロッ
ト上のハイブリダイゼーション実験によシ、この2つの
プラスミド間に相同性がないことが示された。従って、
両プラスミド間の相同性組換により相互統合体が形成さ
れることは排除される。第2に、LBA 4434 (
シラスミドpAL 1050及びpAL 4404を有
する)と(20) 受容細菌としてのLBA 4078 (Tiシラスミド
が除去されておシ、そしてエリスロマイシン耐性でおる
()−ツメファシェンス株)との交雑により、非接合性
シラスミドpAL 4404とInc −P fラスミ
ドpAL 1050との同時移入(cotrancfe
r )が検出されなかった(10−4未満の頻度であっ
た)。
このことから、非正統的(non−1egitimat
e )組換による相互統合体の形成は起らず、起ったと
してもその頻度は非常に低かったことになる。このこと
は、たとえ相互統合体の形成が起ったとしても、腫瘍誘
発に有意に寄与し得なかったことを意味す創傷感染は、
植物細胞上の限られた数の結合部位に対する細菌間の競
争の結果として、腫瘍形成を誘導しない(Lippin
cott等r J −Baa 197 +620〜62
8(1969)。しかしながらLBA4434によシ誘
発された腫瘍は、野性型Ach 5株により誘発された
それと同様に大きい。このことから、LBA 4434
による腫瘍誘発が、非−膳扁形成性細胞から実質上成り
相互統合プラスミドを有する非常に限られた数の細胞を
単に含有する混合細胞集団により惹起されることはほと
んど考えられない。
第3図は、腫瘍誘発に寄与する部分と、オクトビン及び
アルギニンの分解代諭に寄与する部分(それぞれ、オク
トビン分解代謝遺伝子Oce、及びアルギニン分解代謝
遺伝子Arc )とに亜分割されたオクトビンTiシラ
スミドの図を示す。Tra、Inc及びRepは、それ
ぞれ接合、不和合性及び複製のために機能する。kux
s CYt及びOcsは、それぞれ腫瘍細胞中でのオー
キシン及びサイトカイニン様効果、並びにオクトビン合
成のための座である。
第4図aは、無傷のTiプラスミドを含有する戊。
?−ムスエY玉Z冬細菌を植物に感染せしめることによ
り、又は該細菌と植物ゾロトゾラストとをインキュベー
トすることによシ惹起される腫瘍誘発の概略を示す。
第4図す及びCは、T−領域を有しないプラスミドAの
み全含有する一A 、 7 、Jファシェンス細菌(b
)、及びvir−領域を有しないプラスミドBを含有す
る人、□Yノ≦ケ1多2七4?ユ細菌(c)が腫瘍誘発
能力を有しないことを示す。
第4図dは、両プラスミドを同時に含有する細菌は腫瘍
誘発が可能であることを示す。
第4図eは、vlr−領域を有するがT−領域を有しな
いプラスミドA、及び遺伝的に操作されたT−領域を有
するがvir−領域を有しないプラスミドBの両者を含
有する人、ツメファシェンス細菌を使用し、遺伝的に操
作されたT−領域を処理される植物細胞の染色体に組み
込むこの発明の方法を示す。
第5図は 植物ゲノムに組込まれた後のオクトビンTi
シラスミドのT−領域の構造をさらに詳細に示す。T−
領域の末端に、T −DNAの移入と植物rツムへの組
込みに関与する約23塩基対(bp)の特別の塩基配列
が存在する。さらに、植物ゲノムに組込まれた、l又は
複数の目的遺伝子と形質転換体を選択するためのマーカ
ー遺伝子とを含有する「人工的J T −DNA i示
す。植物細胞中でのこれらの遺伝子の発現を可能にする
ために、RNAの転写のための出発点としての植物プロ
モーター(P、)を含む特別な塩基配列(→)(これら
は真核生物における遺伝子発現の制御のために必要であ
る)が存在する。
牲 今まで記載したこの発明が適当であることを実際に試験
するため、2ベクター系を用いて細菌遺伝子を植物細胞
に移入する実験を行った。細菌中で発現し、そして抗生
物質クロラムフェニコールに対する耐性を宿主に付与す
る酵素クロラムフェニコールトランスアセチラーゼにつ
いてコードする遺伝子を選択した。この耐性遺伝子はプ
ラスミドpAL 1050において操作されたDNA断
片上に位置しており、このものの処理を宿主エセリヒア
・コリにおいて実施した。こうして得られたPAL10
50由米のプラスミド(今やクロラムフェニコール耐性
についての遺伝情報を担持する)を、接合(交配)によ
り、−アグロバクテリウムX玄人77シエンスLBA 
4404株(この株は非常に減縮されたTiプラスミド
を含有し、このプラスミドは全ニー領域を欠失している
が無傷の曳−領域を含有する;第2図参照)に移入した
。こうして得られた、T−領域及びvir−領域を別々
のプラスミド上に有するA、ツメファシェンスを用いて
植物への感染を行い、この結果として、既知の場所にお
いて外来性DNA断片が操作されているT−DNAを有
する腫瘍細胞の存在を特徴付ける腫瘍が形成されるよう
に細胞が変性されたか否かを試験することができた。プ
ラスミドpAL 1050のT−領域の前述のDNA断
片が組み込まれた場所を、すでに知られているデータを
基礎にして、植物細胞への操作されたT−領域の移入に
より、こうし+71−−タパクス(N1aotiana
 tabacus )の根の極端な後天的(adven
titious)発達の特徴的形態を現わすことが期待
されるように選択した。実施した感染試験の結果は、期
待した腫瘍形態を確かに現わし、従ってこのことから、
ここに記載したこの発明により前記の外来性DNA断片
が植物ゲノムに組込まれたことが結論付けられる。この
ことはさらに、前記の外来性DNAが植物DNAに組込
まれたことを示すサザンブロットハイプリダイゼーショ
ン実験によって確認された。
さらに、第5図に示すように、多数の「人工的」T −
DNAを構成した。この場合、植物マーカーとしてリソ
ビンデヒドロダナーゼ又はオクトビンシンサーゼと称す
る酵素についてコードする遺伝子を使用した。この酵素
は、植物細胞中に存在する場合にのみアルギニンとピル
ベートとの還元的縮合によるオクトピンの合成を触媒す
る。この発明の方法による植物感染により、オクトピン
を確かに合成する腫瘍が誘発された。
アグロバクテリウムLBA 4404株及びLBA10
50株は、1983年2月24日にオランダ。
パールン+ CantraaLbureau voor
 Schimelcultuesに寄託され、それぞれ
CBS 191.83 及びCB5192.83の番号
が付された。
以下余白
【図面の簡単な説明】
第1図はプラスミドpAL 1010の構成の概略を示
し、第2図はプラスミドpTiAch 5 の物理的カ
ードを示し、第3図はオクトビンTI7’ラスミドの概
略を示し、第4図はこの発明の概略を示し、そして第5
図は植物ゲノムに組み込まれた正常T−DNA及び操作
された「人工的J T −DNAの構造の概略を示す。 特許出願人 レイクスニベルシテイト ライデン (外1名) 特許出願代理人 弁理士 青 木 朗 弁理士 西 舘 和 之 弁理士 福 本 積 弁理士 山 口 昭 之 弁理士 西 山 雅 也 ■ ニ ーζQQ− 寸 ○ 口− 第1頁の続き ■Int、CI、’ 識別記号 庁内整理番号0発 明
 者 ポール ヤン ヤコブ オランダ国。 ホーイカース ラード 126

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 1.1又は複数のプラスミドを含有する工!」バクテリ
    ウム(Agrobacterlum)細菌を植物に感染
    せしめることによシ又は植物プロトプラストを該細菌と
    共にインキュベートすることによシ外来性DNAを双子
    葉植物の染色体に組み込む方法であっテ、Tl(腫瘍誘
    発)プラスミドのvir−領域を有するがT−領域を有
    しない1以上のプラスミPと、導入された外来性DNA
    と共にT−領域を有するがvir−領域を有しない1以
    上の他のプラスミドとを含有するアグロバクテリウム細
    菌を使用するととを特徴とする方法。 2、TI(MI[誘発)プラスミドのvir−領域を有
    するがT−領域を有しない1以上のプラスミドと、導入
    された外来性DNAと共に野性型のT−領域を有するが
    vir−領域を有しない1以上のプラスミドとを含有す
    ることを特徴とする特許請求の範囲第1項に記載の方法
    に使用するのに適するアグロバクテリウム細菌。 3、Tt(腫瘍誘発)プラスミドのvlr−領域を有す
    るがT−領域を有しない1以上のプラスミドと、導入さ
    れた外来性DNAを伴込μニー遺伝子を伴わない人工的
    T−領領域有するがリエー領域を有しない1以上のプラ
    スミドとを含有することを特徴とする特許請求の範囲第
    1項に記載の方法に使用するのに適するアグロバクテリ
    ウム細菌。 4.1又は複数のプラスミドを含有するアグロバクテリ
    ウム細菌の製造方法において、宿主としてのエセリヒア
    ・s IJ (Eseherlehlaと佳すにおいて
    、T−領域と広い宿主範囲を有する複製開始点とを含有
    するプラスミドのT−領域に外来性DNAを導入し、そ
    して得られたプラスミドを、Tiプラスミドの土−領域
    を有するがT−領域を有しない1以上のプラスミドを含
    有するアグロバクテリウム細菌に導入することによシ、
    特許請求r’77、−を製造することを特徴とする方法
    。 5 特許請求の範囲第1項に記載の方法を適用してもと
    の植物又は植物細胞を変性した後に得られる植物又は植
    物細胞。 6、特許請求の範囲第1項〜第4項のいずれかに記載の
    方法を適用して得た細胞を培養し、そして目的物質を分
    離することを特徴とする化学物質及び/又は医薬物質の
    製造方法。 7、培養を発酵及び場合によってはその後の固定化によ
    って行うことを特徴とする特許請求の範囲第6項記載の
    方法。
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