JPH0743364B2 - イムノアッセイによる強心配糖体の分析方法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は強心配糖体を免疫測定法によって分析する方法
に関する。

〔従来の技術〕 高感度に分析できる特徴を持つ免疫測定法は医薬、臨床
検査の分野では重要な技術である。強心配糖体の従来か
らのイムノアッセイによる検出法としては、RIA法やELI
SA法が一般的に用いられてきた。なお、従来公知のRIA
法に関して、The Journal of Clinical Investigation
（vol 47,1968,p1035−1042,George C.Oliver et al.）
やPhytochemistry（vol 15,1976,p1537−1545,Elmar W.
Weiler）に記載されており、また、ELISA法に関して、1
989年の日本薬学会で池田らが発表している（要旨:5J,1
0−３）。このような強心配糖体のイムノアッセイによ
る分析技術は通常の機器分析よりも高感度であり、さら
に精製しなくても分析が可能であることから一般的に利
用されている。しかし、このような免疫測定法は、類似
化合物とも交差反応し、物質の同定が必要な場合は、多
量のサンプルから分画や濃縮を行なった後、薄層クロマ
トグラフィーや液体クロマトグラフィーなどによって識
別する必要があった。このため、各々類似する強心配糖
体間の識別には煩雑な操作と時間を要していた。

〔発明が解決しようとする課題〕

そこで本発明の課題は、分析試料中の強心配糖体を単に
検出するのみでなく、互いに類似する強心配糖体が混在
していたとしてもその各々を正確かつ簡便に識別、同定
できる強心配糖体の新たな分析方法を提供しようとする
ものである。

〔課題を解決するための手段〕

上記課題を解決するため本発明者等は、まず強心配糖体
やその類似化合物を含む試料を薄層クロマトグラフィー
やペーパークロマトグラフィーで展開した後、イムノア
ッセイにより検出できれば、強心配糖体やその類似化合
物の識別や同定が容易に行なえると考え、研究を行なっ
た。その結果、薄層クロマトグラフィーやペーパークロ
マトグラフィー上で直接、イムノアッセイを行なうこと
は困難であったが、これらクロマトグラフィー上の展開
パターンを一旦支持膜上に転写した後、該支持膜上でイ
ムノアッセイを行なうことにより、強心配糖体を検出す
ることができるとともに、その検出されたスポットの移
動度から強心配糖体を識別、同定できることを見い出し
本発明を完成するに至ったものである。

以下、本発明を更に詳述する。

本発明の分析対象となる強心配糖体とは、心筋に直接作
用して、強心作用を呈する成分で一般的構造はステロイ
ド核を母体とした化合物に様々な糖が配糖化した化合物
であり、代表的な化合物として、ジギトキシン、ジゴキ
シン、ギトキシン、ストロファンチンなどが例示でき
る。これらの化合物はいずれもステロイド骨格を持った
配糖体であるため、これらの化合物を抗原とした抗体を
作製しても、ジギトキシン、ジゴキシン、ギトキシン、
ストロファンチンなどを特異的に識別する抗体を作製す
ることは困難であり、一般的に他の強心配糖体と交差反
応することが知られている。そのため、従来用いられて
いるELISA法やRIA法では強心配糖体の総量を推定出来て
も、含まれる強心配糖体の成分を同定するのは困難であ
った。

しかしながら、本発明の分析法によれば、強心配糖体含
有試料を薄層クロマトグラフィーやペーパークロマトグ
ラフィーで展開した後、該展開パターンとニトロセルロ
ース膜等の支持膜に転写し、イムノアッセイを行なうこ
とにより強心配糖体を検出すのみでなく、検出されたス
ポットの移動度によって又強心配糖体を識別、同定する
ことができる。

すなわち、本発明においては、まず、薄層クロマトグラ
フィーやペーパークロマトグラフィーによって、強心配
糖体含有試料を展開した後、好ましくは、タンパク質と
過ヨウ素酸等の架橋剤を含む生理食塩水等の溶液に浸し
たニトロセルロース膜を密着させることによって、展開
パターンをニトロセルロース膜に転写させ、固定化させ
る。

使用するタンパク質としては、牛血清アルブミン、イム
ノグロブリン、サイログロブリン、合成ポリリジン、ア
ルブミン等を挙げることができ、上記試料中の強心配糖
体等の低分子化合物は、架橋剤によりこれらタンパク質
と結合し、間接的にニトロセルロースで膜上に吸着さ
れ、これにより：上記強心配糖体等の低分子化合物を支
持膜上に直接吸着させるよりも安定して固定化すること
ができる。

なお、強心配糖体等をタンパク質と過ヨウ素酸により、
支持膜へ固定化する基本的な方法は本発明者により開発
され、すでに出願されている（特願昭63−107510号）。
そしてこの後、ニトロセルロース膜上でイムノアッセイ
を行なう。この際、試料中に互いに類似する強心配糖体
が混在し、使用抗体がこれら化合物と交差反応して両者
のスポットが検出されたとしてもこれらスポットは前記
クロマトグラフィーによる移動度に差異が生じており、
これがニトロセルロース膜にそのまま転写されているこ
とから、これら強心配糖体を各々識別できるとともに強
心配糖体の同定も行なうことができる。

したがって、強心配糖体の成分の分析を極めて簡便、正
確に行なうことが可能である。

イムノアッセイの手法については通常の手法を用いれば
よく、例えばP.Tijsen著、石川栄治監訳の「エンザイム
イムノアッセイ」（東京化学同人）や渡辺慶一、中根一
穂編集の「改訂版 酵素抗体法」（学際企画）に記載さ
れているイムノアッセイ等を用いることができる。

〔実施例〕

以下、本発明方法を更に具体的に説明する。

実施例１ 強心配糖体であるジギトキシンとジゴキシンの検出を行
なった。以下工程順に説明する。

（１） 抗体の作製 T.W.Smithらの方法（J.Pharmacol.Exp.Ther.,vol 175,p
352（1970））に従って牛血清アルブミンを結合させた
ジギトキシンをウサギに対して２週間ごと４回免疫し、
最終免疫の２週間後、全採血を行った。得られたウサギ
血清を生理食塩水で500倍に希釈した後、希釈した血清
と等量の煮沸固化させた５％牛血清アルブミンを加えホ
モゲナイズし、２日間４℃で放置した。

その後、不溶化させた牛血清アルブミンと牛血清アルブ
ミンに対する抗体を除去するために遠心した。遠心した
上清をジギトキシン抗体として、イムノアッセイに用い
た。

（２） 薄層クロマトグラフィー 薄層クロマトグラフィーのプレートとしてKieselge160F
254Art5715を用い、クロロホルム／ピリジン（6:1）の
溶媒で展開した。なお、この時の分析サンプルは、エタ
ノールに溶解させたジギトキシンとジゴキシンをそれぞ
れ10μｇとした。

（３） 薄層クロマトグラフィープレートから支持膜へ
の転写 サンプルを展開した薄層クロマトグラフィーのプレート
を30分間室温で乾燥させた後、１％の牛血清アルブミン
と2mg/mlのメタ過ヨウ素酸ナトリウムを含む生理食塩水
で濡らしたニトロセルロース膜を薄層クロマトグラフィ
ーのプレートに密着させ、室温で放置した。30分後、ニ
トロセルロース膜を薄層クロマトグラフィーのプレート
から剥がし、30分間室温で乾燥させ、サンプルの強心配
糖体をニトロセルロース膜に固定化させた。

（４） 支持膜の抗体処理 「エンザイムイムノアッセイ」に記載されている方法に
主に従った。強心配糖体を固定化させたニトロセルロー
ス膜を0.1％のTween20を含む生理食塩水で洗浄した後、
１％牛血清アルブミンを含む生理食塩水に４℃で一晩浸
した。その後、ニトロセルロース膜をジギトキシン抗体
に浸し、室温で２時間反応させ、再び洗浄し、未反応の
抗体を除いた。

次にウサギ抗体に反応するパーオキシダーゼを標識した
２次抗体（和光製、1000倍希釈）にニトロセルロース膜
を浸し、室温で２時間反応させた後、再び洗浄し、未反
応の２次抗体を除去した。

（５） 支持膜上での強心配糖体の発色反応 コニカ製イムノステインキットを用いて、発色させた。
発色させた結果を第１図に示す。

〔発明の効果〕

本発明によれば、以上述べた様に分析試料中に互いに極
めて類似する強心配糖体が混在していたとしても、その
各々の強心配糖体を正確かつ簡便に識別、同定すること
ができ、極めて有用かつ有効な強心配糖体の分析手法を
提供することができた。

【図面の簡単な説明】

第１図はニトロセルロース膜上において発色したジギト
キシンとジゴキシンに対応するスポットの位置を示す図
である。

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】強心配糖体を含む試料を薄層クロマトグラ
   フィー又はペーパークロマトグラフィーで展開した後、
   支持膜にこれらクロマトグラフィー上の展開パターンを
   転写し、その後、支持膜上でイムノアッセイを行ない、
   検出されるスポットの移動度により強心配糖体の分析を
   行なう分析方法。
2. 【請求項２】強心配糖体を支持膜に固定するために支持
   膜をタンパク質および、過ヨウ素酸を含む溶液で処理す
   ることを特徴とする請求項１の強心配糖体の分析方法。