JPH01280252A - イムノアッセイによる配糖化した低分子化合物の検出方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は配糖化した低分子化合物を免疫測定法（イムノ
アッセイ）によって検出する方法及びこれを定量する方
法に関する。

〔従来の技術〕

高感度、高精度に定量できる特徴を持つ免疫測定法は医
薬、臨床検査の分野では重要な技術である。ハプテンと
呼ばれる低分子化合物の従来からの検出および定量法と
しては、低分子化合物の支持体への定量的吸着が困難で
あったためにハプテンに対する抗体を支持体に吸着させ
た後、その低分子化合物に酵素でラベルした標識抗原と
、サンプル中の低分子化合物と競合させ、標識抗原を定
量することによって、間接的にサンプル中の低分子化合
物の検出および定量を行うＥＬＩＳＡ法と呼ばれる方法
が一般的に行われている。なお、上記した従来公知のＥ
ＬＩＳＡ法に関しては、例えば北用、南原、辻、石川編
集の「酵素免疫測定法」　（蛋白質核酸酵素別冊Ｎｏ、
３１，１９８７年、井守出版）に記載されている。

免疫分析（イムノアッセイ）において、本発明のように
、ハプテン（配糖化した低分子化合物）を蛋白質を介し
て担体に吸着せしめること、そしてその際に架橋剤を用
いることについては、従来よりそのような技術について
の知見はなく、新規である。

すなわち、ハプテンは、抗体との結合能は有するが、単
独では免疫応答を誘導する能力（免疫原性）は有しない
比較的低分子量の物質をいうものであり、イムノアッセ
イは、この抗体との結合能を専ら利用する技術であるか
ら、免疫原性をハプテンに付与するための蛋白質との結
合は全くその必要がなく、また、特に酵素免疫分析法（
ＥＴＡ）はデリケートな酵素を用いるものであるから、
ハプテンに免疫原性を付与するために行う蛋白質との結
合処理によってデリケートな酵素活性が影響を受けるこ
とが充分に予想されるため、イムノアッセイにおいて、
ハプテンと蛋白質との結合は全く予想されていない、と
いうよりむしろ排除されているのが技術の現状である。

〔発明が解決しようとする課題］ 上記のＥＬＩＳＡ法が現在低分子化合物を検出する一般
的な方法として用いられているが、ＥＬＩＳＡ法を実施
する際には、低分子化合物を酵素でラベルした標識抗原
を作製し、さらに標識抗原の濃度設定を検討せねばなら
ないというように煩雑な操作が必要であった。

〔課題を解決するための手段〕 本発明は、上記した欠点を解決するためになされたもの
であって、従来からのＥＬＩＳＡ法の改良では決定的な
解決策にはならないとの観点にたち、従来不可能とさえ
考えられていたところのハプテンを担体に直接吸着せし
めるという最も基本的な技術に着目し、その実現を目的
としてなされたものである。

そこで、標識抗原作製などの煩雑な行程を省略するため
に本発明者らは、支持体に測定する配糖化した低分子化
合物を定量的に結合させた後、免疫測定を行う方法につ
いて研究した結果、蛋白質を介してハプテン（配糖化し
た低分子化合物）を担体に結合させると両者の結合がス
ムースに行われること、そして更に、その際架橋剤を使
用すれば更によい結果が得られることを見出し、この新
規な知見を基礎として更に研究をすすめ、そして遂に本
発明が完成されたのである。

すなわち、マイクロタイタープレート、ビーズ、膜など
の支持体に直接、低分子化合物を吸着させた後、イムノ
アッセイを行って該低分子化合物を検出、定量を行うこ
とは従来よりきわめて困難ないし不可能とさえいわれて
いたのであるが、発想を転換して鋭意検討の結果、前記
した技術の現状に敢えて抗して、蛋白質との結合に着目
した。そして更に研究を行った結果、上記支持体に蛋白
質を吸着させた後、配糖化した低分子化合物と蛋白質を
結合させる架橋剤と共に該配糖化低分子化合物を含む試
料を添加することによって支持体に吸着した蛋白質に該
配糖化低分子化合物を結合させた後、イムノアッセイを
行うことによって該配糖化低分子化合物の検出および定
量が可能となることを見い出し、この新知見を基礎とし
て本発明を完成するに到った。

すなわち、本発明方法の重要なポイントは、支持体に蛋
白質を吸着させ検出しようとする配糖化低分子化合物を
含む試料を添加し、蛋白質と該配糖化低分子化合物を架
橋する架橋剤で処理することによって、支持体に該配糖
化低分子化合物を間接的に結合させ、その後、イムノア
ッセイを行い、該配糖化低分子化合物の検出および定量
を行う点にある。

本発明において、支持体としてはマイクロタイタープレ
ート、ビーズ、膜などが例示され、材質としては、ポリ
エステル、ポリスチレン、ポリエチレン、塩化ビニル、
ニトロセルロース、ナイロン、ガラス、紙などが例示さ
れる。また、更に、シリコンラバー、ポリスチレンボー
ル、赤血球、不活性化アルブミン粒子等も使用すること
ができるほか、イムノアッセイにおいて用いられる担体
であればすべてのものが自由に使用できる。

支持体の内、マイクロタイタープレートは、その上でハ
プテンの固定、サンプルの添加、抗原抗体反応、酵素反
応、分光分析、比色定量等がすべて実施できるので、イ
ムノアッセイの機械化ないし、自動化に通している。

このような支持体に吸着する蛋白質としては、ＢＳＡ（
牛血清アルブミン）、サイログロブリン、合成ポリリジ
ン、アルブミン、赤血球等が広く例示される。さらに支
持体に固定化させる配糖化した低分子化合物とは、ハプ
テンとして抗体を作製することのできるすべての化合物
を指すものである。

蛋白質を介して配糖化した低分子化合物を支持体に結合
するには、配糖化低分子化合物と蛋白質を架橋剤で結合
せしめた後に支持体に吸着させる方法、又は、支持体に
蛋白質を吸着せしめた後に架橋剤を用いて配糖化した低
分子化合物を結合させる方法のいずれの方法も採用しう
るちのであり、使用する支持体、蛋白質、架橋剤、配糖
化した低分子化合物の種類に応じて、蛋白変性や標識と
して用いる酵素の変性等のない最適な方法を選択使用す
ればよい。

本発明において、蛋白質と配糖化した低分子化合物を結
合させる架橋剤としては、当技術分野において常用され
る架橋剤が適宜使用されるが、例えばメタ過ヨウ素酸を
使用するのが好適である。

メタ過ヨウ素酸は、配糖化した低分子化合物の糖の部分
に作用して、ジアルデヒドを生成し、タンパクのε−ア
ミノ基と５ｃｈｉｆｆ　ｂａｓｅを形成し、配糖化した
化合物と蛋白質の複合体となるのである。

配糖化化合物と蛋白質との架橋方法としては、常法が適
宜使用され、例えば渡辺慶−１中根−穂編集「改訂版酵
素抗体法」（学際企画）Ｐ３２〜Ｐ３４、及び、勝見光
行、増田芳ｍｉ集「実験生物学講座１５植物生理学［１
）　Ｊ　Ｐ７５〜Ｐ７６等に記載されている方法が適宜
利用される。

本発明によれば、各種の配糖化した低分子化合物を広く
測定することができる。これらの配糖化低分子化合物の
例としては、具体的には次の化合物が例示されるニア−
クチイン、バニリンなどのフェノール配糖体；アミグダ
リン、サンプニグリンなどのニトリル配糖体；エスクリ
ン、ケニリンなどのクマリン配糖体；クリソファネイン
、センノシドなどのアントラセン配糖体；ステビオシト
、ベルベナリンなどのテルペン配糖体；ゲンチオピタリ
ン、コンズランギンなどの苦味配糖体；アカジイン、ア
ビインなどのフラボン配糖体；イリジン、オノニンなど
のイソフラボン配糖体；アビクラリン、アビクラリンな
どのフラボノール配糖体；エリオジクチン、サフラニン
などのフラバノン配糖体；イブイン、クリサンチミンな
どのシアニジン配糖体；エニン、デルフィニンなどのデ
ルフィニジン配糖体；オスラジン、ジギトゲニンなどの
ステロイド配糖体；アシアチコシド、グリチルリチンな
どのトリテルペノイド配糖体；ジギトキシン、ジゴキシ
ンなどの強心配糖体；その他、インドキシル配糖体、ア
ゾキシ配糖体；アルカロイド配糖体；ジベレリン配糖体
、リグナン配糖体；などをあげることができる。また、
これらのグリコシドのほか、Ｎ−グリコシド（窒素配糖
体）も配糖化低分子化合物に包含される。

本発明においては、上に例示したような配糖体ないしＮ
−配糖体を直接測定するほか、測定対象としての低分子
化合物を−Ｈグリコシル化しておき、得られた配糖体を
本発明方法によって測定し、もって目的低分子化合物を
グリコシドを介して間接的に測定することもできる。

この場合は、例えば、該低分子化合物を配糖体化するこ
とにより、低分子化合物を直接測定する場合に比して、
更に安定化せしめたり、分析精度を更に高めたり、また
分析時間を更に短縮したりするのに特に有用である。ま
た更に場合によっては、それ自体をそのまま用いたので
は分析不可能ないし分析困難な低分子化合物であっても
、これを配糖体とすることによって分析可能ないし分析
精度を向上せしめることが可能であり、このような場合
には配糖体化する方法は特に有用である。

目的低分子化合物を配糖体とするには、常用されるグリ
コシドの合成法が適宜利用でき、例えば、Ｍｉｃｈａｅ
ｌ法、Ｆｉｓｃｈｅｒ法、Ｋ；ｎ１ｇ５−Ｋｎｏｒｒ法
、Ｈｅ１ｆｅｒｉｃｈ法、メルカプクール法、トランス
グリコジル化法、その他既知のグリコシド合成法を利用
すればよい。

本発明を実施するには、前記した方法にしたがって、架
橋剤を用いて、被検試料中の配糖化低分子化合物を蛋白
質を介して支持体に結合せしめた後、該配糖化低分子化
合物に対する抗体を作成し、これを利用してイムノアッ
セイの常法にしたがって処理操作を行えばよい。

標識抗体に用いる標識としては、一般に用いられている
、酵素、螢光物質、フェリチン、ラジオアイソトープ等
が用いられ、上記配糖化低分子化合物との免疫反応の後
に、ラベルの特性を利用して測定を行えばよいものであ
る（酵素の場合には、基質から生成物への変化；螢光物
質やフェリチンにあっては、螢光やフェリチンの存在；
放射性同位元素にあっては、放射能；等の測定）。

本発明において、酵素標識抗体法を利用する場合、酵素
としては、例えばβ−ガラクトシダーゼ、ペルオキシダ
ーゼ、グルコースオシキダーゼ、アルカリホスファター
ゼ、グルコース−６−リン酸脱水素酵素等が用いられ、
これらの酵素を用いて、グルタルアルデヒド法、過ヨウ
素酸法、マレイミド法、ピリジル・ジスルフィド法等公
知の方法によって、酵素ラベルした抗体を作成しておく
。次いで、配糖化した低分子化合物と抗原抗体反応を行
わしめ、酵素の基質を加えて生成物を生成せしめ、例え
ば発色性（ないしは退色性、変色性）生成物にあっては
、吸光光度法、螢光光度法、化学発色法等によって測定
を行うのである。

次に本発明の実施例及び比較例について述べる。

〔実施例〕

以下、本発明の方法を更に具体的に説明する。

実施例１ 強心配糖体の一種であるジギトキシンの検出を行った。

以下順を追って説明する。

（１）抗体の作製 Ｓｍ１ｔｈ、Ｔ、Ｗ、らの方法［Ｊ、Ｐｈａｒｍａｃａ
ｌ、Ｅｘｐ、Ｔｈｅｒ、　＋１７５　３５２（１９７０
）　）に従ってジギトキシン抗体を作製した。イムノア
ッセイには１％ＢＳＡを含む生理食塩水で１０００倍に
希釈して使用した。

（２）　　ジギトキシンの検出操作 ■　ジギトキシンを含む試料溶液にＢＳＡ（牛血清アル
ブミン）１０■／ｍ／、メタ過ヨウ素酸ナトリウム２■
／ｒｎ１の濃度になるようにＢＳＡ、メタ過ヨウ素酸ナ
トリウムを添加し、４°Ｃ３０分間反応させた。

■　■で作製した反応液５μｌをニトロセルロース膜に
滴下し乾燥させた。

■　１０■／ｍ／ＢＳＡを含む生理食塩水にニトロセル
ロース膜を浸し、３０分間放置した。

■　ニトロセルロース膜を取り出し、（１）で記載した
ジギトキシン抗体に浸し、３０分間反応させた。

■　ジギトキシン抗体で反応させたニトロセルロース膜
を生理食塩水に浸し十分に洗浄した。

■　パーオキシダーゼを標識した２次抗体（和光純薬製
、３００倍希釈）にニトロセルロース膜を浸し、３０分
間反応させた。

■　３，３′−ジアミノベンチジンと過酸化水素水を含
む発色液にニトロセルロース膜を浸し、室温で２０分間
反応させた。なお、発色液については、渡辺慶−１中根
−穂編集「改訂版酵素抗体法」　（学際企画）Ｐ２Ｏの
記載にしたがって調製した。

■　ニトロセルロース膜を水洗して乾燥させる。

■　上記の操作で発色させたニトロセルロース膜を第１
図に示した。

比較例１ 実施例１において、架橋剤であるメタ過ヨウ素酸ナトリ
ウムを添加しない以外は該実施例と同様に行った結果を
第１図において比較例１の欄に示した。

〔発明の効果〕

本発明のイムノアッセイに従えば、ハプテンとなる配糖
化低分子化合物の検出定量が標識抗原を使用せずともは
じめて可能となった。また末法は免疫平衡状態の一部を
測定するＥＬＩＳＡ法の競合型の測定法とは異なり、免
疫反応した対象物の全量を測定するので、検出しようと
する配糖化低分子化合物の検出限界濃度が向上するとい
う著効も得られる。

特に、天産医薬はその大部分がグリコシドであるので、
天産医薬の量を測定することは、最適用量の決定、臨床
検査、代謝の研究等において重要であり、今回、本発明
によってそれがはじめて工業的に可能となったのである
。

また、従来測定不可能ないし測定困難であった低分子化
合物であっても、これを配糖体化することにより測定が
可能となる場合があり、本発明はこの点でも非常にすぐ
れている。

【図面の簡単な説明】

第１図は、実施例１及び比較例１で得られた結果を図示
したものである。 出願人　株式会社ビーシーシーテクノロジー代理人　弁
理士　平　木　祐　輔 代理人　弁理士　石　井　貞　次 手続補正書 昭和６３年１２月２８日 特許庁長官　吉　１）文　毅　　殿 １、事件の表示 特願昭６３−１０７５１０号 ２、発明の名称 イムノアンセイによる配糖化した低分子化合物の検出方
法 ３、補正をする者 事件との関係　　　特許出願人 住　所　東京都渋谷区渋谷２丁目８番７号名　称　株式
会社ピーシ−シーテクノロジー代表者　加　Ｂ　幹　夫 ４、代　理　人 住　所　東京都港区虎ノ門１丁目１５番７号６、補正の
対象 明細書の発明の詳細な説明の欄 ７、補正の内容 明細書第１３頁第１１〜１９行目 「■　３．　３′−ジアミノベンチシンと過酸化水素水
・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・
・・　したがって調製した。 ■　ニトロセルロース・・・・・・・・・・・・・・・
・・・乾燥させる。 ■　上記の操作で発色・・・・・・・・・・・・・・・
・第１図に示した。」とあるを、 「■　２次抗体で反応させたニトロセルロース膜を生理
食塩水に浸し十分に洗浄した。 ■　３．３′−ジアミノベンチシンと過酸化水素水を含
む発色液にニトロセルロース膜を浸し、室温で２０分間
反応させた。なお、発色液については、渡辺慶−１中根
−穂編集「改訂版酵素抗体法」　（学際企画）ｐ７０の
記載にしたがって調製した。 ■　ニトロセルロース膜を水洗して乾燥させる。 ［相］　上記の操作で発色させたニトロセルロース膜を
第１図に示した。Ｊと補正する。

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. （１）支持体に蛋白質を吸着させ、検出しようとする配
   糖化した低分子化合物を含有するサンプルを添加し、架
   橋剤で処理することを特徴とする免疫検定法によって配
   糖化した低分子化合物を検出する方法。
2. （２）該架橋剤としてメタ過ヨウ素酸を使用することを
   特徴とする請求項１記載の方法。