JPH0747586B2 - ジアリールイミダゾール類 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は、特に少なくとも１つのSH基含有物質の存在下
におけるレドックス指示薬としてのジアリールイミダゾ
ールの使用に関する。

また、本発明は、試料を１またはそれ以上のSH基含有物
質と混合し、試験薬と接触させ、試料中の測定しようと
する成分物質によって過酸化水素を形成させ、該過酸化
水素を比色的に測定することからなる試料成分物質の測
定方法に関する。

さらに、本発明は、１またはそれ以上のSH基含有物質、
過酸化水素の形成による試料成分物質検出のための試験
薬、およびペルオキシダーゼの存在下における過酸化水
素測定のためのレドックス指示薬を含有する試料成分物
質の測定用試薬に関する。

（従来の技術） 遊離SH基を有するいくつかの酵素がある。これらの酵素
は酸化されると、酵素活性が減少するかまたは酵素が完
全に不活性化される。このような酵素の例としては、ク
レアチンキナーゼが挙げられる。液体、特に血清中のク
レアチンキナーゼの存在およびその量の正確な測定は、
心筋梗塞および他の筋障害の予後に非常に重要である。

特にクレアチンキナーゼの場合、それが、例えば空気に
よって酸化されると、遊離SH基はジスルフィドに酸化さ
れ、故に、該酵素はその活性の一部分を失うことが知ら
れている。再活性化は、１またはそれ以上の遊離SH基を
含有する物質の添加によって行うことができる。このよ
うな再活性化作用性SH試薬としては、例えば、グルタチ
オン、Ｎ−アセチルシステイン、ジチオエリトリトー
ル、ジチオトレイトール、メルカプトエタノールおよび
チオグルコースのような物質が知られている。しかし、
一般に、測定しようとする酵素活性をレドックス指示
薬、すなわち、酸化または還元の結果として色が変化す
る物質によって測定することができる検出システムにお
いて、このような還元反応化合物の使用は、妨害および
誤った結果を導く。これは、検出反応に関して、過酸化
水素の酵素的形成およびペルオキシダーゼの存在下にお
けるレドックス指示薬による該過酸化水素の測定を利用
する場合であり、これはよくあるケースである。したが
って、これらの試みは、この点について妨害を及ぼさな
いこれらレドックス指示薬および試験薬を利用可能にす
ることを欠いていた。

公開された欧州特許出願明細書第Ａ−0,116,307号か
ら、公開されたドイツ連邦共和国特許出願明細書第Ａ−
2735690号によるトリアリールイミダゾールを含有する
クレアチンキナーゼの比色測定用として知られている試
薬がある。しかし、これらのイミダゾールは、酸性pH範
囲中でのみ安定であり、実験によって示されたように、
多くの酵素反応の場合に必要であるように弱酸性、中性
〜弱アルカリ性pH範囲に変化させると、これらのイミダ
ゾールは、非常に容易に酸化される。さらに、該トリア
リールイミダゾールは、SH基担持物質に関して非常に感
受性であるので、測定しようとする試験溶液中の濃度は
0.2ミリモル/lを越えてはならない。しかし、このよう
に低い濃度の、例えばＮ−アセチルシステインは、しば
しば、クレアチンキナーゼの完全な再活性化のために充
分ではない。

公開された欧州特許出願明細書第Ａ−0,122,641号にお
いて、過酸化水素の測定用レドックス指示薬として、ジ
アリールイミダゾールが推奨されている。開示されてい
る化合物は、イミダゾール環の２位のアリール基がアル
キル置換基を持つことができず、イミダゾール環の５位
のアルキル置換基の場合はより高いアルキル同族体だけ
しか考えられないということを特徴としている。

欧州特許明細書第Ｂ−0,161,436号には、弱酸性からア
ルカリ性の範囲において大気中の酸素によって自然には
酸化されず、血清中に含まれる物質と反応しないジアリ
ールイミダゾールが開示されている。検査しようとする
試料が初めから含有していないSH基担持物質の存在下に
おけるジアリールイミダゾールの特性については、全く
開示されていない。試験によって示されたように、２つ
の欧州特許出願において優れているものとして開示され
ているジアリールイミダゾールは、例えば、クレアチン
キナーゼの再活性化のために使用されるようなSH基担持
物質に対して感受性である。この優れているものとして
開示されているジアリールイミダゾールによるクレアチ
ンキナーゼの測定は、クレアチンキナーゼの完全な再活
性化に必要である種々の濃度のSH基担持物質の存在下で
妨害されずに行うことはできない。

（発明が解決しようとする課題） したがって、本発明の目的は、上記欠点を示さず、特に
SH基担持物質によって影響されない、試料成分物質、例
えばクレアチンキナーゼの測定方法および測定用試薬に
関する、特に過酸化水素または過酸化物活性物質の検出
のためのレドックス指示薬を提供することである。

（課題を解決するための手段） 驚くべきことに、本発明者等は、一般式［Ｉ］： ［式中、 R¹は、一般式［II］： （式中、R³およびR⁶は水素原子、R⁴およびR⁵は、同一ま
たは異なって、各々、低級アルキル基あるいはR³／R⁴お
よび／またはR⁵／R⁶は、それぞれが一緒になって低級ア
ルキレン基を意味する） で示される基、R²は低級アルキル基を意味する］ で示されるジアリールイミダゾールおよびその塩が上記
要求を満足することを見いだした。

したがって、本発明は、レドックス指示薬として、上記
一般式［Ｉ］で示されるジアリールイミダゾールの使用
を提供するものである。

上記一般式［Ｉ］において、R²、R⁴およびR⁵の定義にお
ける低級アルキル基とは、炭素原子を６個まで、好まし
くは４個まで含有する基を意味しており、特に好ましく
はメチル基である。

R³／R⁴およびR⁵／R⁶は、それぞれが一緒になっている場
合は低級アルキレン基を意味し、炭素原子を２個または
３個、好ましくは３個含有する基である。

本発明の特に好ましいジアリールイミダゾールは、R¹が
ｐ−ジメチルアミノフェニル基、ｐ−エメチルアミノフ
ェニル基、ｐ−ジ−ｎ−プロピルアミノフェニル基また
はユロリジン基であり、R²がメチル基である化合物であ
る。特に好ましい化合物は、２−［３′,5′−ジ−（te
rt−ブチル）−４′−ヒドロキシフェニル］−４（５）
−（９″−ユロリジル）−５（４）−メチル−（1H）−
イミダゾールである。

特に、溶液中で、一般式［Ｉ］で示されるジアリールイ
ミダゾールは、一般式［Ia］： ［式中、R¹およびR²は上記定義と同じである］ で示される対応する互変異性体と平衡状態である。本発
明において、一般式［Ｉ］の表現には、対応する互変異
性体を含むものである。本発明の特に好ましいジアリー
ルイミダゾールの名称において、かっこ書きで記した
（４）または（５）は、互変異性体イミダゾールの特定
の置換基の位置を表している。

本発明のジアリールイミダゾールは、遊離塩基または塩
として存在し得る。本発明者等は、遊離塩基よりも塩の
ほうがさらに一層高い安定性を示すことを見いだした。
塩としては、強酸の塩、例えば、塩酸塩、硫酸塩および
テトラフルオロホウ酸塩、ならびに芳香族スルホン酸の
塩、例えばｐ−トルエンスルホン酸塩およびナフタレン
−２−スルホン酸塩が特に好ましい。一般式［Ｉ］で示
されるジアリールイミダゾールの塩酸塩が特に好まし
い。

本発明の一般式［Ｉ］で示されるジアリールイミダゾー
ルは、無色から薄いベージュ色または薄いピンク色の化
合物であり、酸化の後、濃い色になる。

一般式［Ｉ］で示されるジアリールイミダゾールは、弱
酸性からアルカリ性の範囲で非常に安定であるので、周
囲の酸素によって自然には酸化されない。さらに、本発
明の化合物を用いて、過酸化水素および過酸化物作用性
物質を、SH基担持物質、例えば、グルタチオン、Ｎ−ア
セチルシステイン、ジチオエリトリトール、ジチオトレ
イトール、メルカプトエタノールおよびチオグルコース
の存在下で検出することもできる。例えば、約25ミリモ
ル/lまでの濃度のＮ−アセチルシステインは、この検出
反応を妨害し得ない。したがって、一般式［Ｉ］で示さ
れるジアリールイミダゾールを、レドックス指示薬とし
て１またはそれ以上のSH基含有物質の存在下で好都合に
用いることができる。このため、好ましいものとして前
記したこれらの化合物を用いるのが特に好ましい。

上記の優れている特性に基づいて、一般式［Ｉ］で示さ
れるジアリールイミダゾールは、SH基含有試薬によって
再活性化される酵素クレアチンキナーゼの活性度の測定
に非常に適している。

本発明の一般式［Ｉ］で示される化合物および特に好ま
しいジアリールイミダゾールを用いて、試料を少なくと
も１つのSH基含有物質と混合し、試験薬と接触させ、該
試験薬と試料中で測定しようとする成分物質によって過
酸化水素が形成され、次いで、該過酸化水素を比色的に
測定することからなる試料成分物質の測定方法を好都合
に行うことができる。該本発明の測定方法において、例
えば、試料中の酸化された試料成分物質、例えばクレア
チンキナーゼを再活性化するために、検査しようとする
試料、例えば、体液、特に血液、血清、血漿または尿
に、少なくとも１つのSH基含有物質を添加する。SH基含
有物質として、例えば、グルタチオン、Ｎ−アセチルシ
ステイン、ジチオエリトリトール、ジチオトレイトー
ル、メルカプトエタノールまたはチオグルコースを用い
ることができ、Ｎ−アセチルシステインの使用が特に好
ましい。

試料成分物質の信頼できる測定に必要なSH基含有物質の
濃度は、測定しようとする物質に依存し、当業者には公
知であるかまたは簡単な実験によって測定し得る。例え
ば、血液試料中のクレアチンキナーゼの完全な再活性化
を達成するために、少なくとも１つのSH基担持物質を、
検査しようとする試料中の濃度が２〜20ミリモル/lとな
るほど多量に添加する。一般に、２ミリモル/l以下で完
全な酵素活性化を行うことはできない。

試料物質成分の測定に必要な試験薬は、個々の試料成分
物質に依存する。特に適切な試験薬は当業者には知られ
ている。例えば、クレアチンキナーゼの再活性化後の検
出方法の場合、一般に酵素反応による結合が使用され、
この方法で過酸化水素が最終的に形成され、その量およ
び単位時間当たりの反応からクレアチンキナーゼの量が
推測され得る。二価の金属陽イオンの存在下、クレアチ
ンキナーゼ活性によってクレアチンリン酸およびADPか
らクレアチンおよびATPを形成する試験薬が有用である
ことがわかった。次いで、グリセロールのホスホリル化
のために二価の金属陽イオンおよびグリセロキナーゼと
一緒にATPを使用することができる。その後の周囲の酸
素とグリセリン−３−リン酸オキシダーゼとによって形
成されたグリセリン−３−リン酸の酸化によって、過酸
化水素が形成される。

本発明において、形成された過酸化水素によって、ペル
オキシダーゼによって触媒された一般式［Ｉ］で示され
るジアリールイミダゾールの酸化が生じる。その結果、
主に試料成分物質の測定に使用することができる可視波
長範囲において吸収される色が形成され、その検出は、
過酸化水素の形成を介して行われるがクレアチンキナー
ゼの定量的測定のために特に好都合に使用することがで
きる。それによって、１またはそれ以上のSH基含有物質
の存在は妨害しない。本発明の方法、特にクレアチンキ
ナーゼの測定に関して、SH基担持物質としてのＮ−アセ
チルシステインと２−［３′,5′−ジ−（tert−ブチ
ル）−４′−ヒドロキシフェニル］−４（５）−（９″
−ユロリジル）−５（４）−メチル−（1H）−イミダゾ
ールとの組み合わせが特に優れていることが分かった。

本発明の方法は、例えばセル中、溶液中で行うが、担体
結合形態で特に好都合に行うこともできる。

この場合、本発明の方法に必要な試薬は、試薬担体とし
て当業者に知られている吸収性物質または膨潤可能な物
質、例えば紙、フリース、フィルムなどに塗布される。
該試薬担体は、体液中、例えば血液、血清または血漿中
の試料成分物質、例えばクレアチンキナーゼの直接測定
のための迅速な診断薬として用いることができる。この
ために、体液が試薬担体に直接塗布されるか、または試
薬担体が体液中に浸漬される。対照色と得られた色との
比較によって、半定量測定が可能である。定量的評価
は、当業者に知られている反射光度測定法（remission
photometric process）によって行うことができる。

１またはそれ以上のSH基担持物質、過酸化水素の形成に
よる試料成分物質、例えばクレアチンキナーゼ測定のた
めの試験薬、およびペルオキシダーゼの存在下における
過酸化水素測定のためのレドックス指示薬を含有する試
料成分物質、例えばクレアチンキナーゼの測定のための
本発明の試薬は、レドックス指示薬が一般式［Ｉ］で示
されるジアリールイミダゾールであることを特徴とす
る。このような試薬は、溶液中に存在するか、または凍
結乾燥物もしくは粉末混合物の形態であるか、または溶
液中で使用するための錠剤に打錠されていてよい。本発
明の試薬は、試験担体の形態が特に好都合である。この
場合、試料成分物質、例えばクレアチンキナーゼの測定
に必要な物質は、固体物質に塗布されている。このよう
な試験担体は、吸収性試薬支持物質、例えば濾紙、フリ
ース、または、例えばガラスもしくは合成物質、または
膨潤可能なもしくは吸収性試薬フィルムを含む。

添付した第１図、第２図および第３図には、試料成分物
質の測定のために、特に血液中のクレアチンキナーゼの
測定のために使用し得る３種類の試験担体の断面図を示
す。これらは、一方では、全血から血清または血漿を分
離を可能にし、他方では、試薬およびアジュバンド物質
層もしくは担体の特定の構造または配置に基づいて、予
備反応を適度に調節し、主反応を正確に開始するのを可
能にする。個々の試験担体は、本質的には、SH基含有物
質を含有する試薬担体の配置、および試験薬の試薬が存
在する手段によってのみ異なる。さらに詳細には、該装
置は以下のとおり構成される： 第１図 不活性支持フィルム（４）、例えば合成物質のフィルム
上に、試料塗布ゾーン（11）から検出領域（12）へ試料
液を運搬する運搬層（３）が装着されている。運搬層と
しては、主に、試料塗布ゾーン（11）から検出領域（1
2）に検査しようとする液を運搬することができ、それ
を変化させないあらゆる物質を使用することができる。
運搬層としてガラス繊維フリースを用いるのが特に好都
合である。該層（３）は、部分的に、試料液から微粒子
成分を分離するための層（１）と重なっている。主に、
このために、試料液から微粒子成分、特に血球および血
液からの赤血球を分離することができ、それらを検出反
応の妨害を生起し得る検出領域（12）に移行させない如
何なる物質をも使用し得る。他方、層（１）に関する物
質は、所望の試料成分物質の測定が妨害されるかまたは
間違われてしまうほど試料液に影響を及ぼす必要はな
い。層（１）に関して、例えば、欧州特許明細書第Ｂ−
0,045,476号において記載されているようなガラス繊維
フリースが特に好ましい。検出領域（12）において、運
搬層（３）と支持フィルム（４）との間に活性化層
（２）が配置されており、該活性化層（２）は少なくと
も１つのSH基担持物質を含有している。活性化層（２）
は、好ましくは薄い吸収性物質、マルチフィラー（mult
ifilar）繊維からなっており、活性化物質をしみ込ませ
ている。さらに、該活性化層は、他の物質、例えば、検
査しようとする液から妨害物質を除去する物質を含有す
ることもできる。例えば、ビタミンＣの除去のためにア
スコルビン酸オキシダーゼを活性化層中に存在させるこ
ともできる。運搬層（３）から側方に、接着部（７）を
介して、透明な合成物質からなる支持フィルム（５）を
装着している。支持フィルム（５）の下に、試料成分物
質の測定に必要な試薬を有する試薬ゾーン（６）があ
る。支持フィルム（４）に向けて支持フィルム（５）を
押し下げると、液を移動させることができる運搬層
（３）と試薬ゾーン（６）とを接触させることができる
ように、該試薬ゾーン（６）を設置する。該試薬ゾーン
（６）は、測定反応に必要な試薬を含有する膨潤可能な
および／または吸収性のフィルムからなっているのが好
ましい。クレアチンキナーゼの検出に関して、これら
は、クレアチンリン酸、アデノシン−５′−二リン酸
（ADP）、二価の金属陽イオン、グリセロール、グリセ
ロールキナーゼ、グリセリンリン酸オキシダーゼ、ペル
オキシダーゼ、一般式［Ｉ］で示される化合物、緩衝
液、および血清ミオキナーゼの阻害物質、例えばP¹，P⁵
−ジ−（アデノシン−５′）五リン酸であってよい。特
に全血からのクレアチンキナーゼの測定に関して、活性
化層（２）が少なくとも１つのSH基を含有する活性化物
質は別としてクレアチンリン酸を含有し、試薬ゾーン
（６）が測定のために必要な残りの試薬を含有する場合
が非常に優れていることが分かった。

本発明の、一般式［Ｉ］で示されるジアリールイミダゾ
ールによる血液、血清または血漿中のクレアチンキナー
ゼの測定に関して、酵素検出に必要な試験薬が洗浄剤
（detergent）を含有する場合が非常に優れていること
が分かった。非イオン性または陰イオン性湿潤剤を用い
るのが好ましい。陰イオン性湿潤剤、例えば、硫酸ドデ
シル、硫酸テトラデシルおよび硫酸ヘキサデシルまたは
対応するスルホナート、例えばスルホコハク酸ジアミル
が特に好ましい。しかし、湿潤剤の代わりに、好ましく
は強酸の、容量の大きい陰イオン、例えば、ナフタレン
−1,5−ジスルホナート、テトラフルオロボラートまた
はパークロラート、特に好ましくは、ナフタレン−1,5
−ジスルホナートを含む他の物質を使用することもでき
る。

また、クレアチンキナーゼの測定に必要な試験薬は、他
の物質、例えば、アデニレートキナーゼ阻害剤および／
または錯化剤、例えばエチレンジアミン−四酢酸（EDT
A）またはエチレングリコールビス−（β−アミノエチ
ルエーテル）−四酢酸（EGTA）を含有することもでき
る。

第２図 これは、試料塗布ゾーンにおいて、試料液から微粒子成
分を分離するための層（１）と運搬層（３）との間に活
性化層（２）を設置したことが第１図と異なっている。

第３図 これは、異なる担体（８）、（９）および（10）上にし
み込ませたクレアチンキナーゼの検出に必要な試薬を含
有すること以外は、第２図の装置と類似の構造をしてい
る試験担体を示している。担体（10）は、第１図および
第２図における試薬ゾーン（６）に対応している。担体
（８）および（９）は、薄い吸収性物質、例えばマルチ
フィラー繊維または紙からなっているのが好ましい。

各図面に示された試験担体による本発明の方法を行うた
めに、検査しようとする試料を液体状態で層（１）に塗
布する。微粒子成分、例えば血液の場合の赤血球は実質
的に該層（１）に保持される。第２図および第３図の試
験担体の場合、該液は活性化層（２）に通される。該活
性化層に含まれるSH基担持化合物によって、試料成分物
質、例えばクレアチンキナーゼが再活性化される。次
に、活性化された物質、例えばクレアチンキナーゼを含
有する液が運搬層（３）を満たす。第１図の試験担体の
場合、試料液は層（１）を介して運搬層（３）に通され
る。該運搬層（３）から、毛管力によって、運搬層
（３）と支持フィルム（４）の間に位置する活性化層
（２）に通される。層（３）に向けて支持フィルム
（５）を押すことによって、測定反応は開始され得る。
該液は、圧力接触によって、試薬ゾーン（６）（第１図
および第２図）、または試薬層（８）、（９）および
（10）（第３図）に透過される。該反応は、試薬層にお
ける色に基づいて、支持フィルム（５）を介して観察さ
れる。

既述の試薬担体によって、クレアチンキナーゼ再活性化
のための少なくとも１つのSH基含有化合物と血清との予
備反応が行われ、この場合、予備反応を検出カスケード
の“ラグフェーズ（lagphase）”にすることもできる。
この活性化およびクレアチンキナーゼの検出が同時に起
こることもあり得る。層（２）は省略することができ、
SH基担持物質を試薬ゾーン（６）（第１図および第２
図）または試薬層（８）、（９）もしくは（10）のいず
れか１つ（第３図）に設置してもよい。

第１図、第２図および第３図の試験担体の種々の層にお
ける試薬の代表的な濃度は以下のとおりである： Ｎ−アセチルシステイン0.01〜0.8マイクロモル／cm²、
好ましくは0.02〜0.4マイクロモル／cm² クレアチンリン酸0.2〜４マイクロモル／cm²、好ましく
は0.4〜2.4マイクロモル／cm² グリセロールキナーゼ0.1〜15U/cm²、好ましくは３〜5U
/cm² グリセリンリン酸オキシダーゼ0.1〜10U/cm²、好ましく
は0.6〜2U/cm² 西洋ワサビ根（horse radish）ペルオキシダーゼ0.1〜2
0U/cm²、好ましくは２〜10U/cm² ADP 0.002〜0.1マイクロモル／cm²、好ましくは0.007〜
0.05マイクロモル／cm² グリセロール0.01〜0.5マイクロモル／cm²、好ましくは
0.08〜0.1マイクロモル／cm² 本発明のジアリールイミダゾール0.01〜１マイクロモル
／cm²、好ましくは0.04〜0.2マイクロモル／cm² 洗浄剤 0.01〜8.0マイクロモル／cm²、好ましくは0.015
〜0.8マイクロモル／cm² 第１図〜第３図の試験担体によって本発明の方法を行う
に際し、SH基担持物質の濃度が高いにもかかわらず、酸
化された一般式［Ｉ］で示されるジアリールイミダゾー
ルのフェーディングが生じないことが確認された。

特に、試験担体を使用して行われる方法によって、約56
0と680nm間の可視波長で記録され得る色の変化によって
信頼される正確な結果が得られる。

特に試験担体によって行う場合、本発明の方法の他の長
所は、 試験担体以外で試料の予備キンキュベーションを行う必
要がないこと、 特に血液検査の場合、血漿または血清を予め分離する必
要がないこと、 非常に短時間、例えば、クレアチンキナーゼに関しては
３分以内で測定を行うことができること、 非常に少量、約30μｌの試料でさえも検査することがで
きること、 血液または血漿もしくは血清の使用の場合、一致する結
果が得られること、および 高濃度のSH基担持物質の存在下、安定な発色が生じるこ
と である。

２−［３′,5′−ジ−（tert−ブチル）−４′−ヒドロ
キシフェニル］−４（５）−（４″−ジメチルアミノフ
ェニル）−５（４）−メチル−（1H）−イミダゾール・
塩酸塩を除く、一般式［Ｉ］： ［式中、 R¹は、一般式［II］： （式中、R³およびR⁶は水素原子、R⁴およびR⁵は、同一ま
たは異なって、各々、低級アルキル基あるいはR³／R⁴お
よび／またはR⁵／R⁶は、それぞれが一緒になって低級ア
ルキレン基を意味する） で示される基、R²は低級アルキル基を意味する］ で示されるジアリールイミダゾールおよびその塩は、酸
性溶液中、アンモニアと一緒に、一般式［III］： ［式中、R¹およびR²は一般式［Ｉ］における定義と同じ
である］ で示されるα−ジケトンを式［IV］： で示されるアルデヒドと縮合させ、次いで、本発明化合
物の塩を得る場合には酸で後処理することによって製造
することができる。該縮合反応は、酢酸溶液中で行うの
が好ましく、この場合、反応混合液を還流まで加熱する
ことができる。

以下に実施例を挙げて、本発明をさらに詳細に説明す
る。

（実施例） 実施例１ ２−［３′,5′−ジ−（tert−ブチル）−４′−ヒドロ
キシフェニル］−４（５）−（９″−ユロリジニル）−
５（４）−メチル−（1H）−イミダゾール1.1.ユロリジ
ン： 2,3,6,7−テトラヒドロ−1H,5H−ベンゾ［i,j］キノリ
ジン 該化合物はオーガニック・シンセンス（Organic Synthe
sis）、III、504に記載された方法で製造した。

1.2.9−ユロリジンカルバルデヒド： １−（2,3,6,7−テトラヒドロ−1H,5H−ベンゾ［i,j］
キノリジン−９−イル）−カルバルデヒド ピー・エイ・エス・スミス（P.A.S.Smith）およびタン
・イン・ユ（Tung Yin Yu）［ジャーナル・オブ・オー
ガニック・ケミストリー（J.Org.Chem.）、17、1281/19
52］と同様に該化合物の合成を行った。しかし、フィル
スマイヤー反応において、Ｎ−メチル−ホルムアニリド
の代わりにジメチルホルムアミドを用いた。

スターラー、還流冷却器、滴下漏斗および塩化カルシウ
ム管を装着した１の３つ口フラスコにユロリジン220g
（1.32モル）を入れ、溶融するまで、水浴上で60℃に加
熱した。次いで、新しく蒸留したジメチルホルムアミド
296mlを添加して溶解し、次に氷を用いて20〜30℃に冷
却しつつ、1.5時間かけて、攪拌しながら、新しく蒸留
した塩化ホスホリル（オキシ塩化リン）120ml（約226
g、1.31モル）を滴下した。10分間攪拌した後、反応混
合液を100℃に３時間加熱した。得られた茶色の油状反
応混合物を温室に冷却し、攪拌しながら、氷1.36kgに注
いだ。反応混合物をさらに１時間攪拌し、次いで、冷凍
機中に一晩放置した。分離した結晶を吸引濾過し、氷水
100mlで洗浄した。次いで、黄味緑色の残渣を、真空
下、温室で、水酸化カリウムによって、一定重量に至る
まで乾燥した。所望の生成物255g（理論値の96％）を得
た；融点:80℃。

TLC:シリカゲル F 254［イー・メルク（E.Merck）、ダ
ルムスタット、ドイツ連邦共和国］；溶離剤：クロロホ
ルム：メタノール（9:1、v/v）；検出：臭素蒸気。R
_f値:0.89。

該生成物は、さらに精製せずに次工程に用いた。エタノ
ール水溶液からの再結晶によって、融点83℃の生成物が
得られた。

1.3.1−（９−ユロリジル）−プロパン−１−オール： １−（2,3,6,7−テトラヒドロ−1H,5H−ベンゾ［i,j］
キノリジン−９−イル）−プロパン−１−オール スターラー、冷却器および塩化カルシウム管を装着した
4lの３つ口フラスコにマグネシウム［削りくず（turnin
gs）］32.64g（1.34グラム原子）を入れ、無水ジエチル
エーテル231mlで覆い、これに、攪拌せずに、ジエチル
エーテル100mlにブロモエタン100.3ml（147g、1.34モ
ル）を溶解した溶液のうち10mlを滴下した。徐々に温め
ると、グリニヤール反応が始まった。その後、攪拌しな
がら、ジエチルエーテルを沸点に維持する方法で、残り
のブロモエタン溶液を添加し、次いで反応混合液を、還
流下、さらに30分間加熱した。その後、ジエチルエーテ
ルを沸点に維持するように滴下速度を調節して、テトラ
ヒドロフラン1.25lに９−ユロリジンカルバルデヒド135
g（0.67モル）を溶解した溶液を滴下した。次いで、反
応混合液を、還流下、さらに１時間加熱し、次いで、室
温に冷却し、攪拌しながら、氷191gを滴加すると、起泡
した。その後、2N水酸化ナトリウム水溶液382mlを滴下
し、５分間攪拌し、放置した。次いで、該溶媒をデカン
トして除去し、ジエチルエーテル−テトラヒドロフラン
相を無水硫酸ナトリウムで乾燥した。活性炭の添加の
後、吸引濾過し、濾液を蒸発乾固した。油状残留物をリ
グロイン１と一緒に攪拌し、始まった結晶化を完了さ
せるために、冷凍機中に一晩放置した。吸引濾過し、結
晶物を冷リグロイン100mlで洗浄した後、真空下、モレ
キュラーシーブで数時間乾燥した後、ベージュ色のカル
ビノール209gを得た；融点:74℃。母液を後処理して、
同一生成物をさらに11.75g得ることができた。合計収率
は理論値の71％であった。

TLC:シリカゲル F 254（イー・メルク、ダルムスタッ
ト、ドイツ連邦共和国）；溶離剤：トルエン：メタノー
ル（5:1、v/v）。R_f値＝0.3。

1.4.1−（９−ユロリジル）−プロパン−１−オン： １−（2,3,6,7−テトラヒドロ−1H,5H−ベンゾ［i,j］
キノリジン−９−イル）−プロパン−１−オン スターラー、温度計および乾燥管を装着した6lの３つ口
フラスコ中で、アセトン3.4lに１−（９−ユロリジル）
−プロパン−１−オール208.4g（0.9モル）を溶解し
た。アルミニウムトリイソプロピラート294.3g（1.44モ
ル）を添加し、還流下、強く攪拌しながら反応混合液を
４時間沸騰させ、その後、回転エバポレーターで蒸発乾
固した。酢酸エチル2lおよび2N水酸化ナトリウム水溶液
１の添加の後、15〜20分間、反応混合液を強く攪拌
し、放置し、水酸化アルミニウム沈澱物の水性スラリー
からデカントして除去した。分液漏斗中で酢酸エチル相
を分離し、水性相を、各回、酢酸エチル１と一緒に15
分間、２回攪拌した。酢酸エチル相を合わせて、無水硫
酸ナトリウムで乾燥し、真空下、40℃で蒸発させた。茶
色の油状物305gを得た。これをトルエン−酢酸エチル
（1:1、v/v）500mlに溶解し、シリカゲルカラム［メル
ク（Merck）60］（高さ120cm、直径11cm）に入れ、トル
エン−酢酸エチル（15:1、v/v）で分別した。500mlの画
分35個および１の画分４個を回収した。画分１〜13を
廃棄し、画分14〜33を蒸発させ、画分34〜39を廃棄し
た。真空下、40℃で、画分14〜33を蒸発させた後、茶色
の油状物101gを得、これをリグロイン500mlと一緒に粉
砕して結晶化した。該物質を吸引濾過し、残渣を冷リグ
ロイン100mlで洗浄し、五酸化リン−モレキュラーシー
ブで乾燥した後、１−（９−ユロリジル）−プロパン−
１−オンの薄黄色結晶67g（理論値の31.2％）を得た；
融点:69〜70℃。

TLC:シリカゲル F 254（イー・メルク、ダルムスタッ
ト、ドイツ連邦共和国）；溶離剤：トルエン：メタノー
ル（5:1、v/v）。R_f値＝0.6。

カラムクロマトグラフ分離の後、母液（10g）から、さ
らに純製のケトン2.7g（理論値の1.26％）が得られた；
融点:68〜69℃。合計収率は理論値の33.7％であった。

1.5.1−（９−ユロリジル）−２−ブロモプロパン−１
−オン： ２−ブロモ−１−（2,3,6,7−テトラヒドロ−1H,5H−ベ
ンゾ［i,j］キノリジン−９−イル）−プロパン−１−
オン（分子量308.2） 47％臭化水素酸417mlに１−（９−ユロリジル）−プロ
パン−１−オン67g（0.29モル）を懸濁させ、60℃に加
熱すると、部分的に溶解された。次に、攪拌しながら、
20分間以内で、47％臭化水素酸87mlに臭素15.8mlを溶解
した溶液を滴下した。これによって出発物質は完全に溶
液になった。60℃で１時間攪拌し続け、20℃に冷却し、
強く攪拌しながら、反応混合液を、酢酸エチル900mlと
水1.9lとの混合液中に注いだ。10分間攪拌した後、分液
漏斗で相を分離し、水性相を、各回、酢酸エチル700ml
で、再度２回振盪し、溶媒抽出物を合わせて、これを無
水硫酸ナトリウムで乾燥し、吸引濾過し、真空下、回転
エバポレーターで蒸発させた。得られた茶色の油状体の
粗生成物102gを熱イソプロパノール400mlに溶解し、氷
浴中で冷却して結晶化した。冷凍機中に14時間放置した
後、形成された結晶を吸引濾過し、五酸化リンで24時間
乾燥し、黄味緑色のブロモケトン83.5g（理論値の93.4
％）を得た；融点:83〜84℃。

TLC:シリカゲル F 254（イー・メルク、ダルムスタッ
ト、ドイツ連邦共和国）；溶離剤：トルエン：酢酸エチ
ル（5:1、v/v）。R_f値＝0.31。

1.6.1−（９−ユロリジル）−プロパン−1,2−ジオン： １−（2,3,6,7−テトラヒドロ−1H−ベンゾ［i,j］キノ
リジン−９−イル）−プロパン−1,2−ジオン 温度計および還流冷却器を装着した１の３つ口フラス
コに、ジメチルスルホキシド112ml（1.58モル）、ヨウ
化カリウム46.5g（0.28モル）および無水炭酸ナトリウ
ム29.7g（0.28モル）を入れた。攪拌しながら、混合液
を120℃に加熱し、１−（９−ユロリジル）−２−ブロ
モプロパン−１−オン86.3g（0.28モル）を添加した。
この溶液を120℃で１時間攪拌すると、黄色がかった溶
液が赤褐色になった。20℃に冷却した後、この反応液を
塩化ナトリウム飽和水溶液2.8lに注いだ。氷で冷却しな
がら、得られた懸濁液をジエチルエーテル2lと一緒に15
分間攪拌した。エーテル相を分離し、水性相を、各回、
ジエチルエーテル１で、２回抽出した。ジエチルエー
テル抽出物を合わせて、これを、塩化ナトリウム飽和水
溶液１、５％炭酸水素ナトリウム水溶液１および水
１と一緒に１回振盪し、エーテル相を無水硫酸ナトリ
ウムで乾燥し、活性炭で処理し、吸引濾過し、真空下、
回転エバポレーターで蒸発乾固した。赤味茶色の油状体
の粗生成物64gを熱イソプロパノール300mlに溶解し、冷
却し、シーディングおよび冷凍機中で48時間放置するこ
とによって結晶化した。橙色の結晶形態のジケトン18.1
gを得た。母液を蒸発させ、得られた粗生成物30gをカラ
ムクロマトグラフィーによって精製した。シリカゲルカ
ラム（メルク60）（高さ11cm、直径7.5cm）を用いて、
トルエン−酢酸エチルで溶離した。80lの画分70個を回
収した。

画分１〜43と57〜70を廃棄した。画分44〜56を後処理し
て、橙色の油状物8gを得た。これを熱イソプロパノール
40mlに溶解し、この溶液を冷却し、氷で冷却した後、吸
引濾過した。橙色のジケトン5.2gを得た。２つの結晶物
を合わせて、イソプロパノール150mlから再結晶した。
吸引濾過し、濾過ケーキを少量の冷イソプロパノールで
洗浄した後、橙色の結晶形態の１−（９−ユロリジル）
−プロパン−1,2−ジオン22.7g（理論値の33.3％）を得
た；融点:111〜113℃。

TLC:シリカゲル F 254（イー・メルク、ダルムスタッ
ト、ドイツ連邦共和国）；溶離剤：トルエン：メタノー
ル（5:1、v/v）。R_f値＝0.32。

1.7.2−［３′,5′−ジ−（tert−ブチル）−４′−ヒ
ドロキシフェニル］−４（５）−（９″−ユロリジル）
−５（４）−メチル−（1H）−イミダゾール： 2,6−ビス−（1,1−ジメチルエチル）−４−［５−メチ
ル−４−（2,3,6,7−テトラヒドロ−1H,5H−ベンゾ［i,
j］キノリジン−９−イル）−イミダゾール−２−イ
ル］−フェノール スターラー、冷却器および温度計を装着した１の３つ
口フラスコ中で、分析学的に純粋な氷酢酸300mlに入れ
た１−（９−ユロリジル）−プロパン−1,2−ジオン32.
7g（0.13モル）、3,5−ジ−（tert−ブチル）−４−ヒ
ドロキシベンズアルデヒド30.5g（0.13モル）および酢
酸アンモニウム100.2g（1.3モル）の混合物を、保護ガ
スとしてアルゴンまたは窒素雰囲気下、還流下で３時
間、油浴上で加熱した。その後、反応混合液を20℃に冷
却し、該反応混合液を強く攪拌しながら氷水2lに滴下し
た。黄土色の残渣を吸引濾過した後、濾過ケーキを水１
で洗浄し、五酸化リンおよび水酸化カリウムによって
生成物を室温で24時間乾燥した。（全ての操作は、暗い
室内で、アルミホイルで覆われた装置を用いて行われ
た）。黄土色の残留物である粗生成物60gを、還流下、
攪拌しながらアセトン1.8lと一緒に加熱し、冷却して得
た結晶を吸引濾過し、アセトン200mlで洗浄し、真空下
で16時間、モレキュラーシーブおよび五酸化リンによっ
て乾燥した。残存するアセトンを除去するために、生成
物をリグロイン500mlと一緒に攪拌し、吸引濾過し、ラ
ンニング油ポンプを用いて、40℃で、モレキュラーシー
ブおよび五酸化リンによって一定重量に至るまで乾燥し
た。２−［３′,5′−ジ−（tert−ブチル）−４′−ヒ
ドロキシフェニル］−４（５）−（９″−ユロリジル）
−５（４）−メチル−（1H）−イミダゾールの薄いベー
ジュ色の結晶31g（理論値の52％）を得た；融点：＞260
℃（300℃から分解）。

TLC:加工プレートシリカゲル F 254（イー・メルク、ダ
ルムスタット、ドイツ連邦共和国）；溶離剤：ジオキサ
ン／酢酸／トルエン（20:80:72、v/v/v）。R_f値＝0.3
5。検出：塩素／テトラメチルベンジジン−ヨウ化カリ
ウム。

実施例２ ２−［３′,5′−ジ−（tert−ブチル）−４′−ヒドロ
キシフェニル］−４（５）−（９″−ユロリジル）−５
（４）−メチル−（1H）−イミダゾール・塩酸塩： 2,6−ビス−（1,1−ジメチルエチル）−４−［５−メチ
ル−４−（2,3,6,7−テトラヒドロ−1H,5H−ベンゾ［i,
j］キノリジン−９−イル）−イミダゾール−２−イ
ル］−フェノール・塩酸塩 実施例１で得られたイミダゾール20g（0.437モル）をメ
タノール50mlに懸濁し、室温に冷却しながら、飽和エー
テル塩酸（ethereal hydrochloric acid）30mlを滴下し
て、塩基を溶液にした。その後、真空下、室温で蒸発さ
せ、油状残留物を酢酸エチル200mlでトリチュレートし
た。氷浴中に15分間放置した後、形成された結晶を素早
く吸引濾過し、少量の氷冷酢酸エチルで洗浄し、真空
下、室温で、一定重量に至るまで五酸化リンによって乾
燥した。ピンク色の結晶19.8g（理論値の87.1％）を得
た；融点:231℃（分解）。

溶離剤：トルエン：ジオキサン：氷酢酸（9:2.5:1v/v/
v）、シリカゲル60（イー・メルク、ダルムスタット、
ドイツ連邦共和国）によるR_f値＝0.38。

実施例３ ａ） ２−［３′,5′−ジ−（tert−ブチル）−４′−
ヒドロキシフェニル］−４（５）−（４″−ジエチルア
ミノフェニル）−５（４）−メチル−（1H）−イミダゾ
ール・塩酸塩 保護ガスとしてアルゴン下、還流下、氷酢酸100ml中、
１−（４′−Ｎ−ジエチルアミノフェニル）−プロパン
−1,2−ジオン（各々、１−［４−（ジエチルアミノ）
フェニル］−プロパン−1,2−ジオン）［油状物とし
て、実施例１における１−（９−ユロリジル）−プロパ
ン−1,2−ジオンと同様の方法で得た;TLC:シリカゲル60
（イー・メルク、ダルムスタット、ドイツ連邦共和
国）、溶離剤：トルエン／酢酸エチル（4:1、v/v）、R_f
値＝0.8］0.05モルを3,5−ジ−（tert−ブチル）−４−
ヒドロキシベンズアルデヒド11.72g（0.05モル）および
酢酸アンモニウム38.5g（0.5モル）と一緒に４時間加熱
した。室温で12時間攪拌した後、黒ずんだ反応混合液を
氷550gおよび濃アンモニア水溶液50mlに注ぎ、形成され
た沈澱物を素早く吸引濾過し、粗生成物を酢酸エチル中
に取った。乾燥および蒸発の後、生成物をメタノールに
溶解し、エーテル塩酸を添加して、塩酸塩に変化させ
た。イソプロパノールから再結晶した後、安定な最終生
成物を理論値の40％の収率で得た；融点220℃（分
解）。

λ_max672nm（ε＝21,758）。

TLC:シリカゲル60（イー・メルク、ダルムスタット、ド
イツ連邦共和国）；溶離剤トルエン／メタノール（5:
1、v/v）。R_f値＝0.33。

ジケトンの製造に必要な中間化合物： エイ・ダブリュ・ナインハム［A.W.Nineham,Soc.635（1
952）］と同様にGB−Ａ−911,342［ウエルカム（Wellco
me）］に従って得られた１−［４−（ジエチルアミノ）
フェニル］−プロパン−１−オン（４′−Ｎ−ジエチル
アミノ）プロピオフェノン：沸点:135〜155℃、融点:44
〜45℃，収率：理論値の55％;TLC:シリカゲル60（イー
・メルク、ダルムスタット、ドイツ連邦共和国）；溶離
剤トルエン／酢酸エチル（4:1、v/v）、R_f値＝0.6。

１−［４−（ジエチルアミノ）フェニル］−２−ブロモ
プロパン−１−オン：収率：理論値の98％、融点:50〜6
1℃;TLC:シリカゲル60（イー・メルク、ダルムスタッ
ト、ドイツ連邦共和国）、溶離剤：トルエン／酢酸エチ
ル（4:1、v/v）、R_f値＝0.7。

ｂ） ２−［３′,5′−ジ−（tert−ブチル）−４′−
ヒドロキシフェニル）−４（５）−（４″−Ｎ−ジ−ｎ
−プロピルアミノフェニル）−５（４）−メチル−（1
H）−イミダゾール・塩酸塩 実施例３のａ）と同様に、１−（４′−ジ−ｎ−プロピ
ルアミノフェニル）−プロパン−1,2−ジオン［各々、
１−（４−ジ−ｎ−プロピルアミノフェニル）−プロパ
ン−1,2−ジオン］［油状物として実施例１における１
−（９′−ユロリジル）−プロパン−1,2−ジオンと同
様の方法で得た;TLC:シリカゲル60（イー・メルク、ダ
ルムスタット、ドイツ連邦共和国）、溶離剤：塩化メチ
レン、R_f値＝0.4］から、融点33〜34℃を有する塩基と
して本化合物を得た（ｎ−ヘプタンからの再結晶の
後）;TLC:シリカゲル60（イー・メルク、ダルムスタッ
ト、ドイツ連邦共和国）；溶離剤：塩化メチレン、R_f値
＝0.2。収率は理論値の40％であった。実施例３と同様
に、塩基から塩酸塩を得た：融点246〜248℃。

λ_max＝667nm（ε＝20.700）。

TLC:シリカゲル60（イー・メルク、ダルムスタット、ド
イツ連邦共和国）；溶離剤：トルエン／メタノール（5:
1、v/v）。R_f値＝0.38。

ジケトンの製造に必要な中間化合物： デュフ・フルネス（Duff.Furness、Soc.1952、1162）に
従ってN,N−ジプロピルアニリンから生成した４−ジプ
ロピルアミノベンズアルデヒド：沸点（0.1torr）145〜
148℃、TLC:シリカゲル60（イー・メルク、ダルムスタ
ット、ドイツ連邦共和国）、溶離剤:n−ヘプタン／メチ
ルエチルケトン（2:1、v/v）、R_f値＝0.57。

１−［４−（ジ−ｎ−プロピルアミノ）フェニル］−プ
ロパン−１−オール：収率：理論値の90％、油状物。TL
C:シリカゲル60（イー・メルク、ダルムスタット、ドイ
ツ連邦共和国）、溶離剤：トルエン／酢酸エチル（4:
1、v/v）、R_f値＝0.46。

１−［４−（ジ−ｎ−プロピルアミノ）フェニル］−プ
ロパン−１−オン：収率：理論値の48％、融点:41〜43
％、TLC:シリカゲル60（イー・メルク、ダルムスタッ
ト、ドイツ連邦共和国）、溶離剤：トルエン／酢酸エチ
ル（4:1、v/v）、R_f値＝0.7。

１−［４−（ジ−ｎ−プロピルアミノ）フェニル］−２
−ブロモプロパン−１−オール：収率：理論値の87％、
黄色油状物:TLC:シリカゲル60（イー・メルク、ダルム
スタット、ドイツ連邦共和国）、溶離剤：トルエン／酢
酸エチル（4:1、v/v）、R_f値＝0.8。

ｃ） １−［４−（ジアルキルアミノ）フェニル］−２
−ブロモプロパン−１−オンの対応する１−［４−（ジ
アルキルアミノ）フェニル］−プロパン−1,2−ジオン
への直接転換の代わりに、銅塩、特に酢酸銅による以下
の酸化によって、各々、対応する２−アセトキシー、２
−ヒドロキシ化合物を介する方法を選ぶことができる。
この方法を、以下の一般的な例によって説明する。

１−［４−（ジアルキルアミノ）フェニル］−２−ブロ
モプロパン−１−オンの１−［４−（ジアルキルアミ
ノ）フェニル］−プロパン−1,2−ジオンへの転換 無水酢酸ナトリウム0.8モルと一緒に氷酢酸170mlに入れ
た１−［４−（ジアルキルアミノ）フェニル］−２−ブ
ロモプロパン−１−オン0.1モルを130℃で３時間攪拌し
た。その後、900mlに至るまで水を添加し、得られた油
状物を、塩化メチレン200mlで３回振盪して分離した。
有機相を水で洗浄し、真空下で蒸発させた後、各アセト
キシ化合物を、ほぼ定量的収量で得た。

この粗生成物を2N塩酸88mlと一緒に80℃で２時間攪拌し
た。冷却した後、炭酸水素ナトリウム30gを注意深く添
加して、反応混合液を中和し、得られた１−［４−（ジ
アルキルアミノ）フェニル］−２−ヒドロキシ−プロパ
ン−１−オンを塩化メチレン100mlで３回振盪した。合
わせた有機相を水200mlと一緒に振盪し、乾燥し、蒸発
させた。収量は定量的であった。得られた生成物を酢酸
銅（II）・H₂O51g（0.25モル）、エタノール200mlおよ
び水100mlと一緒に、90℃で6.5時間攪拌した。沈殿物の
吸引濾過の後、残渣を少量のエタノール／水（2:1、v/
v）で洗浄した。濾液を水500mlで希釈し、分離した油状
物を塩化メチレン200mlと一緒に３回振盪した。合わせ
た有機相を水で洗浄し、乾燥し、蒸発させた後、残留物
を、塩化メチレンを用いて、シリカゲルカラム［600g、
シリカゲル60（イー・メルク、ダルムスタット、ドイツ
連邦共和国）、直径7.5cm、高さ45cm］によるクロマト
グラフィーにかけた。

各中間化合物は下記化合物である： aa） １−［４−（ジエチルアミノ）フェニル］−２−
アセトキシプロパン−１−オン：収率：理論値の90％、
融点:75〜77℃、TLC:シリカゲル60（イー・メルク、ダ
ルムスタット、ドイツ連邦共和国）、溶離剤：トルエン
／酢酸エチル（4:1、v/v）、R_f値＝0.5。

１−［４−（ジエチルアミノ）フェニル］−２−ヒドロ
キシプロパン−１−オン：収率：理論値の79.5％、アモ
ルファス、TLC:シリカゲル60（イー・メルク、ダルムス
タット、ドイツ連邦共和国）、溶離剤：トルエン／酢酸
エチル（4:1、v/v）、R_f値＝0.4。

bb） １−［４−（ジ−ｎ−プロピルアミノ）フェニ
ル］−２−アセトキシプロパン−１−オン：収率：理論
値の92.2％、茶色の油状物、TLC:シリカゲル60（イー・
メルク、ダルムスタット、ドイツ連邦共和国）、溶離
剤：トルエン／酢酸エチル（4:1、v/v）、R_f＝0.5。

１−［４−（ジ−ｎ−プロピルアミノ）フェニル］−２
−ヒドロキシプロパン−１−オン：収率：理論値の98.9
％、油状物、TLC:シリカゲル60（イー・メルク、ダルム
スタット、ドイツ連邦共和国）、溶離剤：トルエン／酢
酸エチル（4:1、v/v）、R_f＝0.42。

実施例４ クレアチンキナーゼ測定用試験担体 添付した第１図に従って、試験担体を製造した。層
（１）は、単位表面積当たりの重量50〜60g/m²および大
きさ6mm×6mmを有し、クウォリティー（quality）753タ
イプ108A［ジョーンズ・マンスビル（Johns Mansvill
e）、アメリカ合衆国］のガラスから製造した厚さ0.5mm
のガラス繊維フリースである。

運搬層（３）は、単位面積当たりの重量20〜25g/m²およ
び大きさ16mm×6mmを有し、品質753タイプ106［ジョー
ンズ・マンスビル、アメリカ合衆国］のガラスから製造
され、10％ポリエステル繊維で強化された厚さ0.15mmの
ガラス繊維フリースである。

活性化層（２）は、吸収許容量約55ml/m²および空気透
過性約5000l/m²秒を有するファーム（firm）SST/スイス
国のポリエステル繊維14/100からなっている。この物質
を、200ミリモル/lクレアチンリン酸、30ミリモル/lN−
アセチルシステインおよび0.05重量％トリトン（Trito
n）Ｘ−100を含有し、pH8.0に調節された水溶液中に浸
漬した。該織物の大きさは12mm×6mmである。

支持フィルム（５）は、透明であり、ポリカーボネート
からなっている。長さ15mmおよび幅6mmである。

試薬ゾーン（６）は、プロピオファン（Propiofan）［B
ASF、ルドヴィクシャフェン、ドイツ連邦共和国］、ケ
イソウ土（粒径分布:100％＜48μｍ、95％32μｍ、70
％16μｍ、25〜45％＜８μｍ）［イーグル・ピッカー
（Eagle Picker）、アメリカ合衆国］、高分散された二
酸化チタンタイプＰ−25［デグッサ（Degussa）、ドイ
ツ連邦共和国］およびキサンテン［ケルコ・オイル・イ
ンターナショナル（Kelco Oil International）、ハン
ブルグ、ドイツ連邦共和国］を重量比1:2:0.8:0.04で混
合して製造され、後処理によって粘稠性マスが得られ
る。ケイソウ土の量の２倍の量のリン酸塩緩衝液（pH7.
3）に以下の成分を溶解した： アスコルビン酸オキシダーゼ 200U/g グリセロールキナーゼ 300U/g α−グリセリンリン酸オキシダーゼ 50U/g 西洋ワサビ（forse radish）ペルオキシダーゼ 60U/g グリセロール ８マイクロモル/g アスパラギン酸マグネシウム 10マイクロモル/g アデノシン二リン酸 30マイクロモル/g アデノシン一リン酸 ２マイクロモル/g P¹，P⁵−ジ−（アデノシン−５′）−五リン酸 2.7ナノ
モル/g 硫酸ドデシルナトリウム ８マイクロモル/g トリトンＸ−100 ２重量％ ２−［３′,5′−ジ−（tert−ブチル）−４′−ヒドロ
キシフェニル）−４（５）−（９″−ユロリジル）−５
（４）−メチル−（1H）−イミダゾール・塩酸塩40マイ
クロモル/g。

粘稠性マスとリン酸塩緩衝液を後処理して流動性マスを
得、傾斜塗布法（rake coating process）によって、こ
れをポリカービネートフィルムに層の厚さ200μで塗布
した。

添付した第１図に示すとおり、個々の層を支持フィルム
（４）に溶融接着によって固着させた。

血液中のクレアチンキナーゼの測定に関して、血液、血
漿または血清30μｌを分離層（１）に塗布した。60秒
後、試薬ゾーン（６）を有する支持フィルム（５）を運
搬層（３）に対して押圧し、次いで２分間、試薬ゾーン
（６）における色の変化を反射光によって光度的に測定
した。校正曲線からの測定された反射光の値によって、
測定しようとするクレアチンキナーゼ活性を読み取っ
た。

下記第１表からわかるように、ヘマトクリットは異なる
が同一量のクレアチンキナーゼを含有する血液試料に関
して、良好に一致するクレアチンキナーゼ活性が得られ
た。

下記第２表から、同一の患者からの試料の場合、血漿と
全血から、精密な測定誤差の範囲内で一致する結果を得
ることができることがわかった。それぞれの場合、ヘマ
トクリットは44％であった。

同量の血漿および血液を使用する場合、試薬担体上の血
液試料についてのヘマトクリットに基づいて、血漿につ
いては、Ｎ−アセチルシステイン濃度を４倍までに調節
した。第２表の結果から、試料液中のSH基含有物質の濃
度が増加しても、信頼できる結果が得られることがわか
った。種々の量の試料（血清）を試験担体に塗布し、ク
レアチンキナーゼ活性を測定した下記第３表の結果から
同じ結論が引き出される。

結果、クレアチンキナーゼの測定に関する本発明の試験
担体は広範にわたって量−非依存性であり、Ｎ−アセチ
ルシステイン濃度が低い場合だけでなく高い場合も一致
する結果が得られることがわかった。

実施例５ 第１図の試験担体におけるジアリールイミダゾールの比
較 Ａ）実施例４に記載の方法で試験担体を製造した。これ
らは、使用したジアリールイミダゾールについてのみ互
いに異なる。

試験担体１は２−（３′,5′−ジメトキシ−４′−ヒド
ロキシフェニル）−４（５）−（４″−ジメチルアミノ
フェニル）−５（４）−メチル−（1H）−イミダゾール
・塩酸塩を含有している。

試験担体２は２−［３′,5′−ジ−（tert−ブチル）−
４′−ヒドロキシフェニル）−４（５）−（４″−ジメ
チルアミノフェニル）−５（４）−メチル−（1H）−イ
ミダゾール・塩酸塩を含有している。

試験担体３は２−［３′,5′−ジ−（tert−ブチル）−
４′−ヒドロキシフェニル）−４（５）−（４″−ジエ
チルアミノフェニル）−５（４）−メチル−（1H）−イ
ミダゾール・塩酸塩を含有している。

試験担体４は２−［３′,5′−ジ−（tert−ブチル）−
４′−ヒドロキシフェニル）−４（５）−（４″−ジ−
ｎ−プロピルアミノフェニル）−５（４）−メチル−
（1H）−イミダゾール・塩酸塩を含有している。

試験担体５は２−［３′,5′−ジ−（tert−ブチル）−
４′−ヒドロキシフェニル］−４（５）−（４″−アミ
ノフェニル）−５（４）−メチル−（1H）−イミダゾー
ル・塩酸塩を含有している。

試験担体６は実施例４で製造した本発明の試験担体と同
一のものである。

各々、血清30μｌを使用する場合、下記第４表に示す結
果が得られた。

上記の結果から、試験担体２、３、４および６における
本発明のジアリールイミダゾールだけが、形成された指
示薬の酸化生成物がＮ−アセチルシステインによって漂
白される（担体１および５のように）ことなく使用し得
ることが明らかである。

Ｂ）上記Ａ）の記載に従って、Ｎ−アセチルシステイン
を含まない試験担体を製造した。各々、血清30μｌを使
用する場合、下記第５表に示す結果が得られた。

Ｎ−アセチルシステインを含有しない場合、酸化された
クレアチンキナーゼの再活性化は生じなかった。しか
し、試験担体１〜６は匹敵する結果を与えたか、前記第
４表で得られた結果よりも全て低かった。

第４表で得られた結果と比較すると、試験担体１および
５のジアリールイミダゾールがＮ−アセチルシステイン
によって明らかに妨害されていることが確認される。他
方、試験担体２、３、４および６における本発明のジア
リールイミダゾールは、Ｎ−アセチルシステインの存在
下での測定に非常によく適合している。

【図面の簡単な説明】

第１図、第２図および第３図は、それぞれ、本発明に係
る試験担体の断面図である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 ヴェルネル・ゲトライン ドイツ連邦共和国6800マンハイム24、イ ン・ゼンタイヒ31番 (72)発明者 ロルフ・ナゲル ドイツ連邦共和国6842ビュルスタット、ア ン・ビルトストック51番 (56)参考文献 特開 昭60−224677（ＪＰ，Ａ)

Claims (6)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】試料を少なくとも１つのSH基含有物質と混
   合し、試験薬と接触させて試料中の測定しようとする成
   分物質によって過酸化水素を形成させ、該過酸化水素を
   比色的に測定することからなる試料成分物質の測定方法
   において、形成された過酸化水素を、ペルオキシダーゼ
   および最初に添加した１つまたは複数のSH基含有物質の
   存在下、一般式［Ｉ］： ［式中、 R¹は、一般式［II］： （式中、R³およびR⁶は水素原子、R⁴およびR⁵は、同一ま
   たは異なって、各々、低級アルキル基あるいはR³／R⁴お
   よび／またはR⁵／R⁶は、それぞれが一緒になって低級ア
   ルキレン基を意味する） で示される基、R²は低級アルキル基を意味する］ で示されるジアリールイミダゾールおよび／またはその
   塩によって測定することを特徴とする試料成分物質の測
   定方法。
2. 【請求項２】クレアチンキナーゼの測定のための請求項
   （１）記載の測定方法。
3. 【請求項３】SH基含有物質としてＮ−アセチルシステイ
   ンを用い、ジアリールイミダゾールとしてR¹がｐ−ジメ
   チルアミノフェニル基、ｐ−ジエチルアミノフェニル
   基、ｐ−ジ−ｎ−プロピルアミノフェニル基またはユロ
   リジン基であり、R²がメチル基である請求項（１）記載
   の化合物を用いる請求項（１）または（２）記載の測定
   方法。
4. 【請求項４】少なくとも１つのSH基含有物質、過酸化水
   素の形成による試料成分物質検出のための試験薬、およ
   びペルオキシダーゼの存在下における過酸化水素測定の
   ためのレドックス指示薬を含有する試料成分物質の測定
   用試薬において、レドックス指示薬が一般式［Ｉ］： ［式中、 R¹は、一般式［II］： （式中、R³およびR⁶は水素原子、R⁴およびR⁵は、同一ま
   たは異なって、各々、低級アルキル基あるいはR³／R⁴お
   よび／またはR⁵／R⁶は、それぞれが一緒になって低級ア
   ルキレン基を意味する） で示される基、R²は低級アルキル基を意味する］ で示されるジアリールイミダゾールであることを特徴と
   する試料成分物質の測定用試薬。
5. 【請求項５】クレアチンキナーゼの測定のための請求項
   （４）記載の試薬。
6. 【請求項６】２−［３′,5′−ジ−（tert−ブチル）−
   ４′−ヒドロキシフェニル］−４（５）−（９″−ユロ
   リジル）−５（４）−メチル−（1H）−イミダゾールお
   よびその塩。