JPH07500486A - ウロキナーゼレセプターに対する抗体とその用途 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】

ウロキナーゼレセプターに対する抗体とその用途発明の分野 本発明は、国際特許出願第ＰＣＴ／ＤＫ９０１００９０およびアメリカ特許出願 第３３４６１３号および第３７４，８５４号に開示された発明の成る面における 更なる展開、特に特定のタイプの抗体、就中モノクローナル抗体、ならびにその ような特定のタイプの抗体の用途、就中ｕ−ＰＡＲを検出、定量したり、治療の ために使用したり、医療のスクリーニングに使用することに関する。 一般的背景 文献によると、ウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子（ｕ−ＦＡ）は、こ れまでに調査されたあらゆる種類のは乳類から見出されている。幾つかの発見は 、ｕ−ＰＡが、他の蛋白質分解酵素をプラスミンと一緒に用いた場合に誘発され る、恐らくは細胞外マトリックスの分解による組織分解および／または細胞移動 に関係あることを示している。この関係は、乳腺や前立腺の泌乳後退縮および子 宮における受精卵着床後の栄養芽層侵入の初期においてほぼ充分に研究されてき た。 組織分解および細胞移動におけるｕ−ＰＡの役割に関する仮説は、退縮している 乳腺の上皮細胞、乾せんでの組織分解を伴う領域、精子形成中の精器細胞の放出 との関連、および創傷治癒中の上皮生長のケラチン生成細胞におけるｕ−ＰＡの 免疫細胞化学的発見により可能となったより正確な位置測定によりさらに支持さ れている（ダノ等（１９８８，１９９０）、グロンダルーハンセン等（１９８８ ）、アントレーセン等（１９９０）参照）。 また、ｕ−ＰＡが炎症の退化相においである役割を演じていることが考えられ、 また、ｕ−ＰＡが様々な細胞に対するリンパ球介在細胞毒性を妨害するという報 告も存在し、天然キラー細胞の細胞毒性作用におけるｕ−ＰＡの直接的役割が提 案されている。ｕ−ＰＡの役割は、血管形成および上皮細胞移動、すなわち腫よ う増大における重要なプロセスにおいて提案されている。 ｕ−ＰＡは、新生物由来の多くの培養細胞型により産生される。腫よう組織の外 植体は、対応する正常組織よりも多くのｕ−ＰＡを放出することが見出された。 ｕ−ＰＡは、ヒト肺、結腸、子宮内膜、胸部、前立腺および腎臓癌腫、ヒト・メ ラノーマ、ネズミ乳癌、ネズミ・ルイス肺腫ようからの抽出物およびヒト腹膜癌 腫症からの腹水において同定された。マウスにおいて侵襲的に増大および転移し ているルイス腹癌腫に関する免疫組織化学試験は、ｕ−ＰＡの存在を一貫して示 したが、また、個々の腫ようの異なる部分におけるｕ−ＰＡの含有量の顕著な不 均一性をも示した。高いｕ−ＰＡ含有量は周囲の正常組織の侵襲的増大および分 解を伴う領域で見出されたが、他の領域は検出可能なｕ−ＰＡを欠いていた。Ｕ −ＰＡは、腫よう細胞の細胞質および正常細胞の周囲に細胞外的に局在していた 。 周囲正常組織の分解は、悪性腫ようの侵襲性の中心的特徴である。悪性腫ように おけるｕ−ＰＡの定常的発見およびｕ−ＰＡが正常な生理学的事象における組織 分解である役割を演じていることを示す発見により、ｕ−ＰＡは癌発生において も似た役割を演じていることが仮定される。ｕ−ＰＡが組織破壊においである役 割を演じているという仮説は、プラスミンが他の蛋白質分解酵素と一緒になって 細胞外マトリックスを分解するという仮定を含む。この状況では、細胞外マトリ ックスの大部分の成分がプラスミンにより分解され得ることに注目すべきである 。これらには、ラミニン、フィブロネクチン、プロテオグリカン、および全部で はないが、恐らくは幾つかのタイプのコラーゲンが含まれる。さらに、バエスお よび共同研究者により最初に報告された通り、プラスミンは、一方で他のタイプ のコラーゲンを分解し得る潜在コラゲナーゼを活性化し得る（ダノ等、（１９８ ８，１９９０）参照）。 処置失敗群における癌患者の大多数は、転移の直接作用または転移の処置に伴う 合併症で死亡する。従って、多くの研究は、診断的または治療的ストラテン−に 関する基礎であり得る特異的な生化学的因子の同定に集中してきた。細胞外マト リックスは、糖蛋白質、例えばフィブロネクチンおよびラミニン、コラーゲンお よびプロテオグリカンにより構成される。細胞外マトリックスは、組織治癒およ び改造、炎症および新生組織形成中のみ細胞の動きに対して集中的に透過性にな る。リオッタ（１９８６）は三段階仮説を提案した。第一段階は、細胞表面レセ プターによる腫よう細胞の結合である。次に、固定された腫よう細胞は、マトリ ックスを局所的に分解し得る（結合成分の分解を含む）加水分解酵素を分泌する （または宿主細胞を誘導して酵素を分泌させる）。マド１ルツクス溶解は、はぼ 確実に腫よう細胞表面に近い高局在領域で行なわれると思われる。第三段階は、 蛋白質分解により修飾されたマトリックス領域への腫よう細胞の移動である。す なわち、マトリックスの侵襲性は、受動的生長圧に起因するだけでなく、能動的 生化学機構を必要とする。 多くの研究グループは、侵襲性態よう細胞がマトリックス分解性プロテイナーゼ を分泌することを提案した。セリンプロテアーゼおよびチオールプロテアーゼを 含むプロテアーゼのカスケードは全て、腫よう侵襲の容易化の一因となっている 。重大なカスケードの一つは、プラスミノーゲン活性化システムである。蛋白質 分解の調節は、腫よう細胞−宿主細胞相互作用および宿主または腫よう細胞その ものにより産生されるプロテアーゼ阻害物質を含め、多くのレベルで行なわれ得 る。マトリックス分解酵素の発現は、腫よう細胞特異的ではなＬ％０活動的侵襲 性態よう細胞は、単にそれらの非侵襲性対照細胞と比べて異なる調節シグナルに 応答し得る（リオッタ、１９８６）。 プラスミノーゲン活性化システムが、細胞外マトリ・ノクス蛋白質の分解を通し て、悪性腫ようの増大中に正常組織の侵襲および破壊においである役割を演じて いるという仮定は、様々な発見により支持されている。これらの発見には、発癌 性ウィルスによる細胞の形質転換およびｕ−ＰＡの合成間の密接な関係、ｕ−Ｐ Ａが多くの非悪性状態における組織破壊に関与するという発見、および腫ようの 侵襲領域におけるｕ−ＰＡの免疫組織化学的位置測定が含まれる（概説としてダ ノ等（１９８５）、サクセラ（１９８５）参照）。 この仮説を支持する別の発見は、侵襲および転移のモデルシステムにおけるＵ− ＰＡに対する抗触媒的抗体による試験から生まれている。上記抗体は、チキン胚 芽のしょう尿膜へ移植されたヒトｕ−ＰＡ産生腫よう、ＨＥｐ−３から肺への転 移（オッソブスキーおよびライヒ、１９８３、オツソブスキー、１９８８）、Ｂ １６メラノーマ細胞による羊膜の浸透（ミグナラティ等、１９８６）、新生物に 由来する幾つかのヒトおよびネズミセルラインによる基底膜侵襲（ライヒ等、１ ９８８）およびマウスにおけるＢ１６メラノーマ細胞の静脈内注射後の肺転移の 形成（ヒアリング等、１９８８）を減少させることが見出された。これらの試験 の中には（ミグナラティ等、１９８６、ライヒ等、１９８８）、プロコラゲナー ゼのプラスミン触媒による活性化（トリグベーソン等（１９８７）参照）は、プ ラスミノーゲン活性化作用の重大な部分であると思われるものがあった。 細胞外プロセスにおける蛋白質分解カスケード・システムの調節に関する必要条 件は、その開始および進行の正確な位置測定である。例えば、補体および凝結シ ステムでは、様々な成分に対する細胞レセプターが公知であり、それらは反応連 鎖を促進または終結させる反応の位置測定に役立っている（ミューラーーエーベ ルハルト、１９８８、マン等、１９８８）。プラスミノーゲン活性化システムで は、組織型プラスミノーゲン活性化因子Ｑ−ＰＡ）により触媒されたプラスミノ ーゲン活性化の位置決定におけるフィブリンの役割がよ（知られている（トール セン等、１９７２、ホイラーツ等、１９８２）。 免疫細胞化学試験は、腫ようの侵襲性領域では、ｕ−ＰＡが腫よう細胞の膜に位 置することを示唆しており（スフリバー等、１９８４）、最近の発見は、細胞表 面において、ｕ−ＰＡが一般的に特異的レセプターに結合していること、および この局在性は、時間および空間の点でｕ−ＰＡ触媒プラスミノーゲン活性化の調 節に重大であり得ることを示している（ブラシ等（１９８７）、ダノー等（１９ ９０）参照）。予備報告は、ｔ−ＰＡもまた、細胞表面レセプターに結合し、そ の酵素活性を保持し得ることを示唆している（ベーベ、１９８７、バルナーサン 等、１９８８、バジャーおよびナハマン、１９８訳クイパー等、１９８８）。し かしながら、この現象は、結合部位の性質に関するさらに明確な説明を要する。 ｕ−ＰＡに対する表面レセプター ｕ−ＰＡに対する細胞レセプター（ｕ−ＰＡＲ）は、最初、血液単核白血球およ び単核白血球様Ｕ９３７セルラインにおいて同定され（バッサ−り等、１９８５ ）、その存在は、幾つかの型の悪性細胞（ストッページ等、１９８５、バッサ− り等、１９８５、プロー等、１９８６、ボイド等、１９８８ａ、ニールセン等、 １９８８）、ヒト線維芽細胞（バジバイおよびベーカー、１９８５）を含む様々 な培養細胞およびヒト胸部癌腫組織に−ドハム等、１９８７）において立証され ている。 レセプターは、活性５４ｋＤ　ｕ−ＰＡ、その−ポリペプチド鎖プロ酵素、プロ ーＵ−ＰＡ（下記参照）および活性部位試薬ＤＦＰにより阻害された５４ｋＤｕ −ＰＡに結合するが、活性ｕ−ＰＡの低分子量（３３ｋＤ）形態の結合性は全く 示さない（バッサーリ等、１９８５、タペンス等、１９８６）。すなわち、レセ プターへの結合はｕ−ＰＡの触媒部位を必要とせず、これらの発見に従って、ｕ −ＰＡの結合決定基は、−次構造が触媒部位とは大きく異なる領域である酵素の アミノ末端部分において同定された。レセプター結合ドメインは、ｕ−ＰＡ分子 の１５ｋＤアミノ末端フラグメント（ＡＴＦ、残基１−１３５）、より正確には 、表皮成長因子（ＥＧＦ）レセプターへの結合に関与するＥＧＦの部分と相同性 を示す領域であるため成長因子領域と呼ばれるシスティン濃厚域内に位置する。 結合に非常に重要であると思われるアミノ酸残基は、配列１２−３２内に位置す る（アラペラ等、１９８７）。非常に低濃度（１００ナノモル）の結合を阻害す る合成ペプチドが構築された。ネズミおよびヒトペプチド間の交差反応性の欠如 は、ｕ−ＰＡおよびｕ　−。 ＰＡＲ間の結合が強度に種特異的であることを示す。 ｕ−ＰＡＲへのｕ−ＰＡの結合は、ｔ−ＰＡおよびプラスミノーゲンを含むｕ− ＰＡに構造上関連した幾つかの蛋白質について試験されたにせよ（ストッパーり 等、１９８５、バッサーリ等、１９８５、ニールセン等、１９８８）、レセプタ ーへの結合についてきっ抗する他の蛋白質がまだ全く見出されていないという意 味では特異的である。レセプター結合ドメインのみを含むｕ−ＰＡのフラグメン ト、例えばＡＴＦは、ｕ−ＰＡと結合し得る他の分子（プロテアーゼ・ネキシン およびプラスミノーゲン活性化因子阻害物質ＦＡＩ−１およびＦＡＩ−２）が触 媒活性領域を認識するため、レセプターへの結合特異性を確実にする（ストッパ ーり等、１９８５、ニールセン等、１９８８）。ＰＡＩ−１は、ｕ−ＰＡとは共 有結合複合体を形成し得るが、プローｕ−ＰＡとは形成し得ない（アンドレアー ゼン等、１９８６）。 報告されたレセプターの数は、正常単核白血球では１細胞当たり数十個の分子（ マイルズおよびプロー、１９８７）からある種の結腸癌腫セルラインでは３Ｘ１ ０’（ボイド等、１９８８ａ）といった範囲で、試験された細胞型間で強度に変 動し、また、結合親和力については０．１−１０ナノモルの範囲で見かけ上ある 程度の変動が生じる（概説については、ブラシ（１９８８）、ダノー等（１９９ ０）参照）。 さらに、ある種のセルラインでは、レセプター数は、様々な薬剤、例えばＵ９３ ７細胞ではホルボール・ミリステート・アセテート（ＰＭＡＸストッペーり等、 １９８５、ニールセン等、１９８８）、Ａ４３１細胞（ブラシ等、１９８６）お よびヒーラ細胞（エストレイヒエル等、１９８９）では表皮成長因子並びに結腸 癌腫細胞ではジメチルホルムアミド（ボイド等、１９８８ｂ）を加えることによ り調節され得る。第一に述べたケースでは、リガンドに対する親和力が大きく減 少すると同時にレセプター数が増加する（ニールセン等、１９８８、ピコン等、 １９８９）。 ヒトｕ−ＰＡレセプターは最近、精製、特性化され（ベーレント等、１９９０） 、その全長ｃＤＮＡはクローン化された（ロダン等、１９９０）。ｕ−ＰＡＲは ５５〜６０ＫＤのグリコプロティンであり、その分子量はジスルフィド結合の開 裂後も変化が認められないので、一本鎖ポリペプチドから成るものと推定される 。同定された異なった電気泳動的運動性をもった若干の変種は、グリコジル化の 変種と思われる。全長ヒトｕ−ＰＡＲｃＤＮＡは、１３６３ｂｐの長さを持ち、 そのヌクレオチド配列を３１３残基長のｕ＝ＰＡＲ分子の推定アミノ酸配列と共 に以下に示す。シグナルペプチドにはアンダーラインを、精製タンパクについて 決定された配列である最初の３０アミノ酸にはオーバーラインを付しである。ス ター印は潜在的Ｎ−結合グリコシル化部位を示す。 ＡＧＡＧＭ　ＣＡＣｉにＣＡＧＧ　ＧｋＣＣＣＣＧＣＧＣＡＣＡＧにＡにＣＴＧ ＣＣＣＴＣにＣＧＡＣ４６ＡＴＧ　Ｇｌｌ；Ｔ　ＣＡＣＣＣＧ　ＣＣＧ　ＣＴ（ ：　ＣＴＣＣＣＧ　ＣＴに　ＣＴＧ　ＣＴＧ　ＣＴＧ　ＣＴＣＣＡＣＡＣＣＴに Ｃ９４にＴＣＣＣＡ　ＧＣＣＴＣＴ　ＴＧＧ　ＧＧＣＣＴＧ　ＣにＧ　ＴにＣＡ ＴＣＣＡＧ　ＴにＴ　ＡＡＧ　ＡＣＣＡＡＣＧＧＧ　１４２ＧＡττｃｃ　ｃｃ τＣｃ　ＧＡＡ　ＧＡＧ　ＴにＣｃｃｃ　ｃτＧ　ＧＧＡ　ＣＡＧ　ＧＡＣＣＴ ＣＴＧＣＡＧＯＡＣＣ１９０Ａｓｐ　Ｃｙｍ　Ａｒｇ　Ｖａｎ　Ｇｌｕ　Ｇｌｕ 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およびギュアウィッチ、１９８７）、それが巨大分子阻害物質（イートン等、１ ９８４、バッサ−り等、１９８５、アンドレアセン等、１９８６、ステフエンズ 等、１９８７）および合成阻害物質（ニールセン等、１９８２、スフリバー等、 １９８２、ラン等、１９８２、ギュアウィッチ等、１９８４、カサイ等、１９８ ５）との反応性をほとんどまたは全くもたないという発見において反映されてい る。 本質的不活性プロ酵素としての１本ｔＪｌｕ−ＰＡのこの概念は、数名の他の研 究者（コレン等、１９８６、リジネン等、１９８６、スタンプ等、１９８６ａ、 １９８６ｂ）が到達した解釈とは対立する。彼等は、幾つかの供給源から得られ た１本鎖ｕ−ＰＡがかなりのプラスミノーゲン活性化能力を有し、組換え１本鎖 ｕ−ＰＡが２本鎖ｕ−ＰＡの場合よりも一層高い活性を有するという結論に達し た。これらの試験を行うため、生成されたプラスミンの活性を色素原基質により 測定する結合プラスミノーゲン活性化検定を使用した。プローｕ−ＰＡに関する 上記検定は、自己活性的であり、少量の汚染性または生成された２末鎖ｕ−ＰＡ またはプラスミンにより強く影響される。従って、他の場所で詳細に検討されて いる通り（ベーターセン等、１９８８）、これらの試験で見出される１本鎖ｕ− ＰＡの高い活性は見かけ上のものであり、１本鎖ｕ−ＰＡの固有の活性によるも のではなかったといえる。部位突然変異によりプラスミン開裂に対する部分的耐 性が加えられた組換え１本鎖ｕ−ＰＡの変異体に関する報告は、この解釈と一致 する。１本鎖Ｕ−ＰＡのこの変異体は、結合検定において２末鎖ｕ−ＰＡの場合 よりも２００倍低い活性を有していた（ネレス等、１９８７）。 プローｕ−ＰＡに関する検定において自己活性化を阻止する方法を含む最近の動 力学試験は、プローｕ−ＰＡの低い固有活性を確認した（エリス等、１９８７、 ベーターセン等、１９８８、ウラン等、１９８８）。ＨＴ−１０８０線維肉腫細 胞から得られたプローｕ−Ｐ、Ａの高度精製製品による一試験では、プローｕ− ＦＡが、２本鎖ｕ−ＰＡの２５０倍低濃度の場合より低いプラスミノーゲン活性 化能力を有することが示された。この低い活性が固有のものであるのか、汚染に よるものであるのかを決定することは出来なかった（ベーターセン等、１９８８ ）。 インタクトな生物では、プローｕ−ＰＡは、細胞内貯蔵におけるｕ−ＰＡの主形 態であり、また、それは、細胞外流体中でｕ−ＰＡのかなり大きなフラクション を構成する（スフリバー等、１９８４、キールベルブ等、１９８５）。従って、 プローｕ−ＰＡの細胞外活性化は、プラスミノーゲン活性化のｕ−ＰＡ経路の生 理学的調節における非常に重要な段階であり得る。プローｕ−ＰＡのプラスミン 触媒による活性化によって、少量のプローｕ−ＰＡの活性化作用を加速および増 幅する積極的なフィードバック機構が提供される。しかしながら、生理学的条件 下におけるプラスミノーゲン活性化のｕ−ＰＡ経路の開始は、この明細書に記載 されている通りプローｕ−ＰＡを活性化するトリガー因子を必要とする。リジン １５８が別のアミノ酸（例、ＧｌｕまたはＧｌｙ）へ改変されたヒト１本鎖ブロ ーｕ−ＰＡの突然変異体は、全くまたは低い程度にしか活性２本鎖ｕ−ＰＡに変 換されない（ネレス等、１９８７）。 焦点接触部位におけるｕ−ＰＡ ＨＴ−１０８０線維肉腫細胞およびヒト線維芽細胞の表面において、ｕ−ＰＡは 、不均一に分布し、明らかに細胞−細胞接触部位および細胞および培養基盤間の 最も近接した部位である焦点接触部位に位置していることが見出された（ボーラ ーネン等、１９８７．１９８８、ヘブールおよびベーカー、１９８８）。ｕ−Ｐ Ａは、他の２タイプの細胞−培養基盤接触部位、すなわち近接接触部位およびフ ィブロネクチンからは検出されなかったことから、焦点接触部位における固有成 分といえる（ポーラーネン等、１９８８）。焦点接触部位のｕ−ＰＡはレセプタ ー結合している（ヘブールおよびベーカー、１９８８）。焦点接触部位は、いわ ゆるストレス線維またはアクチン・ケーブルである、アクチン含有マイクロフィ ラメント管束の末端に位置する（ブリッジ、１９８６）。これらの部位は、幾つ かの構造成分（アクチン、タリノ）および調節因子（チロシンキナーゼ原始腫よ う遺伝子生成物Ｐ６０°パ、Ｐ１２０’°Ｍ−＊ｂｌ　、ｐ　９　Ｑ　ｌ°露り °゛、Ｐ２Ｏ３“１す°°）を含み、それらは全て細胞質側に位！する（ブリッ ジ（１９８６）参照）。 細胞表面上のプラスミノーゲン結合部位プラスミノーゲンおよびプラスミンは、 血小板、内皮細胞および新生物に由来する幾つかの細胞型を含め、多くの型の培 養細胞に結合する（マイルズおよびプロー、１９８５、バジャー等、１９８６、 プロー等、１９８６、マイルズおよびプロー１９８７、パーチンおよびフォンダ ネチェ、１９８８）。結合は、プラスミノーゲンに対するかなり低い親和力（Ｋ ｏｌμＭ）で飽和可能である。 少なくとも細胞タイプによっては、プラスミンの結合はプラスミノーゲンと同じ 部位を利用すると思われるが、プラスミンに関する結合パラメーターは、プラス ミノーゲンおよびプラスミンに関する複数タイプの結合部位が存在し得ることを 示している。すなわち、プラスミンおよびプラスミノーゲンがほぼ等しい親和力 で結合する細胞タイプもあれば（プロー等、１９８６）、明らかにプラスミンが プラスミノーゲンよりも高い親和力（Ｋｏ５０ナノモル）で結合する細胞タイプ もある（パーチンおよびフォンダネチェ、１９８８）。この結合は、低量のリジ ンおよびリジン類縁体により阻止され、プラスミノーゲンおよびプラスミンの重 鎮のクリングル構造を含むと思われる（マイルズ等、１９８８）。 結合能力は細胞タイプ間で変動し、多くの細胞タイプでは非常に高い（１細胞当 たり１０５−１０’結合部位）。結合部位の化学的性質は知られていない。膜蛋 白質Ｇ　Ｐ　ＩＩｂ／ＩＩＩａは、血小板へのプラスミノーゲンの結合に関与す ると思われ（マイルズ等、１９８６）、特にトロンビン刺激血小板では、フィブ リンもプラスミノーゲン結合に関与し得る（マイルズ等、１９８６）。その精製 形態において、血小板蛋白質トロンポスポンディンは、プラスミノーゲンと複合 体を形成する（ＫＤ３５ナノモル）（シルバースタイン等、１９８４）。また、 固定化ラミニン（サロネン等、１９８４）およびフィブロネクチン（サロネン等 、１９８５）もプラスミノーゲンと結合する（それぞれＫＤ３ナノモルおよび９ ０ナノモル）。 表面プラスミノーゲン活性化 ｕ−ＰＡおよびプラスミノーゲンの両方に結合する細胞タイプもある（プロー等 、１９８６、マイルズおよびプロー、１９８７、パーチンおよびフォンダネチェ 、１９８８、エリス等、１９８８）。レセプター結合プローｕ−ＰＡは、プラス ミンにより活性化され得（タペンス等、１９８６）、少なくとも部分的に、レセ プター結合２本鎖ｕ−ＰＡはプラスミノーゲン活性化能力を保持している（バッ サ−り等、１９８５）。 両分子に対する結合部位をもつ細胞へｕ−ＰＡおよびプラスミノーゲンを加える と、細胞結合プラスミンが発生する（プロー等、１９８６、パーチンおよびフォ ンダネチェ、１９８８）。これらの試験によって、溶液中で行なわれる活性化プ ロセス間または表面結合反応体間の厳密な区別はできなかった。 ｕ−ＰＡおよびプラスミノーゲンの結合部位間の相互作用は、２つのセルライン におけるｕ−ＰＡ結合がプラスミノーゲンに対する高い結合能力を誘導するとい う発見により示唆されている。これらの試験におけるプラスミノーゲンの結合は 、ｕ−ＰＡに関する結合能力に全く影響を与えなかった（プロー等、１９８６） 。 また、２つの試験で立証されたプラスミノーゲン結合部位は見たところ同一では ないが（上記参照）、プラスミノーゲンにより誘発されるｕ−ＰＡ結合性の向上 が、新生物由来のセルラインにおいてパーチンおよびフォンダネチェ（１９８８ ）により見出された。 最近、オツソブスキー（１９８８）は、表面ｕ−ＰＡレセプターを有するが、Ｕ −ＰＡを産生じないヒト腫よう細胞の（インビボ検定における修飾ひな胚しよう 尿膜への）侵入能力が、外因性ｕ−ＰＡでそれらのレセプターを飽和させること により増強され得るという発見を発表した。しかしながら、この発見は（著者の 意見では）暗示的なものにすぎず、それはレセプター自体への結合が必要である ことを立証してはいない。 エリス等（１９８９）は、プラスミノーゲン活性化を誘導する反応が、ｕ−ＰＡ およびプラスミノーゲンをＵ９３７細胞へ加えた場合に行なわれ得ること、およ び、それらの反応が、プラスミノーゲンおよびプローｕ−ＰＡの両方を表面に結 合させた場合にさらに有効に行なわれることを示す証拠を発表した。この実験は 、血清の非存在下、すなわちエリス等が使用した製品によるプラスミノーゲン活 性化が同じく溶液中で行なわれる（エリス等、１９８７）条件下で行なわれた。 これらの試験は、ｕ−ＰＡがレセプター結合していない場合に、関与するプロセ ス（例、２本鎖ｕ−ＰＡにより触媒されるプラスミノーゲン活性化）の一つまた はそれ以上が実際に行なわれる可能性を排除するものではない。ステファン等（ １９８９）は血清の存在下で培養されたＨＴ１０８０線維肉腫細胞の表面におけ るプラスミン形成が、当該細胞によって生産されるｕ−ＰＡが表面のｕ−ＰＡＲ に結合する場合のみに起こることを証明した。特に興味を惹くのは、外的に加え られたＤＦＰ−不活性ｕ−ＰＡが内因性レセプター結合ｕ−ＰＡと置換すること が出来、それによってプラスミノーゲン活性化を阻止する事実の発見であり、こ れは本研究の治療的応用のための前提要件である。 発明の要約 本発明は、ｕ−ＰＡレセプターに対するモノクローナル抗体とポリクローナル抗 体に関する、インタクトな生物において細胞外的に存在する場合と類似した条件 下（すなわち、プラスミン阻害物質およびプラスミノーゲン活性化因子を含む血 清の存在下）、内在性ｕ−ＰＡにより開始されるプラスミノーゲン活性化は事実 上ｕ−ＰＡがレセプター結合している場合にのみ行なわれる。この発見に基づい て、新規で、潜在的に非常に貴重な治療および診断方法および生成物が、これら の抗体により提供される。 ｕ−ＰＡがそのレセプターへ結合すると、プローｕ−ＰＡＩ！：ｕ−ＰＡは細胞 表面に位置するだけでなく、少なくともある種の細胞タイプにおいてはそれらを 細胞−細胞および細胞−基質接触部位である表面の異なった部分へ集中させる。 焦点接触部位におけるプローｕ−ＰＡとｕ−ＰＡの存在は、ｕ−ＰＡ触媒プラス ミノーゲン活性化が、例元ば細胞移動中における接触部位の分解に含まれている ことを示す。これらの部位におけるプローｕ−ＰＡの選択的活性化は、指向性細 胞周囲蛋白質分解を達成する手段を提供する。プローｕ−ＰＡ活性化は、細胞内 で開始さ　。 れ、ｕ−ＰＡレセプターを通って軽層的シグナルにより伝達され得る。 ヒト腫よう細胞は、ごく一般的にウロキナーゼ型のプラスミノーゲン活性化因子 （ｕ−ＰＡ）を分泌することが見出されている。この意味によると、それらは、 血清および他の体液中高濃度のプラスミノーゲンにおいて利用可能な蛋白質分解 能を増強させることができる。腫よう細胞の侵襲特性は、少なくとも部分的には プラスミンの広スペクトルの活性により伝達され、他の潜在プロテアーゼ、例え ばコラゲナーゼの活性化における間接的作用を含むそれらの蛋白質分解能に左右 され得る。腫よう細胞によりプロテアーゼ活性が発現されると、基底膜、毛管壁 および間質結合組織への貫通が容易になることにより、他の部位へ拡散し、転移 が確立される。 細胞移動に連動した細胞周囲蛋白質分解の段階的経路は予見され得る。細胞表面 へのｕ−ＰＡおよびプラスミノーゲンの結合により、細胞外蛋白質分解および細 胞−細胞および細胞−培養基盤結合の局所切断が誘導される。従って、細胞のこ の領域は自由に移動し、これはＦＡＩ−１が存在する領域へｕ−ＰＡを転移させ る。 ＦＡＩ−１はｕ−ＰＡを不活化し、局所蛋白質分解活性の非存在下、細胞はマト リックスと新たな結合を形成する。これは、さらに移動するのに要求されるプロ セスである。 ｕ−ＰＡおよびｕ−ＰＡＲの相互作用についてさらに特性確認するため、ｕ−Ｐ ＡＲの精製が必要であった。単核白血球様細胞Ｕ９３７により産生されるｕ−Ｐ ＡＲの数は、ホルボールエステル、例えばＰＭＡにより数倍に増加し得る。この 事実を用いて、充分な量の精製用レセプターを製造した。実施例１では、細胞か らのデタージェント抽出物の温度誘導相分離および固定ＤＦＰ不活化ｕ−ＰＡに よるアフィニティー・クロマトグラフィーを含め、ｕ−ＰＡレセプターの完全な 精製方法が記載されている。この結果、負荷がレセプター約１μｇである、５Ｄ Ｓ−ＰＡＧＥおよび銀染色後に約５５−６０ｋＤで一つのバンドを示す製品が得 られた。 精製蛋白質は化学的にｕ−ＰＡと交差結合し得る。そのアミノ酸組成およびＮ− 末端配列が決定された（３０残基、それらのうちある程度不離かなものもある） 。 それは重度にＮ−グリコノル化されていることが見出され、脱グリコリル化の結 果、約３Ｏ−３５ｋＤの見かけ上の分子量を有する蛋白質が生じた。異なるセル ラインおよびＰＭＡ−刺激および非刺激Ｕ９３７細胞由来のｕ−ＰＡＲの見かけ 上の分子量は幾分変化した。この不均一性は脱グリコジル化後に消失したため、 様々な供給源から得られたｕ−ＰＡＲのグリコノル化における差異によるもので あった。 同じレセプターの幾つかの変異体の存在は、は乳類細胞ではむしろ一般的である と思われる。実施例１で立証されたｕ−ＰＡＲ分子の変調は、細胞移動および侵 襲性の中心にあるプロセスである、細胞外蛋白質分解の調節、すなわち細胞外マ トリックスおよび基底膜成分の分解における重要な特徴を表し得る。相異なる細 胞タイプが、ｕ−ＰＡＲの蛋白質部分が異なる方法でグリコノル化されている相 異なる種類のレセプターを有する場合、局在した蛋白質分解活性の阻害に必要と される細胞タイプを区別することが可能であり、それは、癌細胞が、正常細胞の ｕ−ＰＡＲのグリコノル化とはかなり異なる方法でグリコノル化されたｕ−ＰＡ Ｒを産生するときに特に貴重であり、例えばｕ−ＰＡＲ抗体により区別され得る 。 実施例２では、ｕ−ＰＡＲのリガンド結合ドメインの単離が同定および特性検定 された。これは、リガンド結合を阻止し得るペプチドに関する潜在的に治療上貴 重な情報を提供する。 推定アミノ酸配列は、ｕ　−Ｐ　Ａ　Ｒが、２８２残基長親水性Ｎ末端部分（恐 らくは細胞外）、次いで２１個のかなり疎水性のアミノ酸（恐らくは縁膜的ドメ イン）を伴う３１３残基長蛋白質として生成されることを示した。潜在的細胞外 部分は、特にシスティンのパターンに関して著しい相同性を有する３反復単位で 組織される。これは、異なるリガンドに結合し得る別個のドメインの存在を示し 得る。 精製ｕ−ＰＡＲについての研究により、ｕ−ＰＡＲが少なくとも場合によっては 、末端プロセッシングされ、糖脂質アンカーにより細胞表面に固定されること、 および表面位置は、ホスホリビダーゼＡ２およびＤによってではなく、ホスポリ ピダーゼＰＩ−ＰＬＣにより調節され得ることが認識され得た（実施例３）。さ らに、処置されなかった細胞からの採取流体もまたある程度遊離ｕ−ＰＡＲを含 むことが見出され、このことは、内在性ホスホリピダーゼにより仲介され得る細 胞からの放出を示した。これは生理学的機構であり得、例えば血清中における遊 離レセプターの測定結果が何等かの病的プロセスの診断上貴重な指標であり得る 可能性がある。 実施例４には、ｕ−ＰＡＲに対するポリクローナルマウスとウサギ抗体の産生お よびレセプターに対する４つのモノクローナルマウス抗体の産生が記載されてい る。 ポリクローナル抗体は、＋′Ｉ−標識精製ｕ−ＰＡＲを、１・７．５００に希釈 した抗血清により達成される有意沈殿により、用量依存的に沈殿させた。逆相ラ ジオイムノアッセイにおいて、抗血清は放射標識ｕ−ＰＡＲを免疫補足すること が見いだされ、ＥＬＩＳＡにおいて固定化ｕ　−Ｐ　Ａ　Ｒハ１　ｎｇ（７）量 １．：おいて１　：　８．０００１：希釈された免疫血清で検出された。ウェス ターンブロッティングにより、抗体は精製ｕ−ＰＡＲと、ＰＭＡ処理Ｕ９３７細 胞の抽出物の粗洗剤相中のｕ−ＰＡＲを検出した。後者の場合において、ｕ−Ｐ ＡＲとは異なる電気泳動移動性を持った蛋白質との反応は検出されず、抗体の特 異性が高いことを示した。ｕ−ＰＡＲに対するポリクローナル抗体は特異的にリ ガンド結合を妨げるのに使用することができる。さらに、ポリクローナルｕ−Ｐ ＡＲ抗体はｕ−ＰＡ触媒細胞表面プラスミノーゲン活性化を阻止することが認め られる。 モノクローナル抗体は、固定化精製ｕ−ＰＡＲによるスクリーニングＥＬＩＳＡ １ホスホリパーゼ可溶化ｕ−ＰＡＲによるウェスターンブロッティング試験、元 の細胞に対する”５ｌ−ＡＴＦ　（ｕ−ＰＡのアミノ末端断片）の結合の阻止お よびｕ−ＰＡＲｍＲＮＡに対して陽性の組織部分における細胞を染色する能力を 含む各種の方法によって選択された。安定してＥＬＩＳＡ陽性を示すハイブリド ーマ培養株２４株のうち４株をクローニングのために選択した。４株の各々がら 誘導した１つのクローン化ハイブリドーマ培養株を選択し、以後の研究に使用し た。 これら４つのハイブリドーマからの精製モノクローナル抗体を、元の精製Ｕ−Ｐ ＡＲおよびキモトリプシンにより分解したｕ−ＰＡＲを免疫沈殿させてＭｒ１６ ｋＤｕ−ＰＡ結合ドメインおよびＭｒ３５−４５ｋＤｎｏｎ−ｕ−ＰＡ結合断片 を産生ずる能力によって特徴づけた。また、細胞抽出物中におけるｕ−ＰＡＲと そのグリコノル化変種を染色する能力はウェスターンブロッティング試験によっ て評価された。 これらの研究により、前記４つの抗体はｕ−ＰＡＲ中の４つの異なったエピトー プを認識するものと結論された。１つ（３Ｒと称する）はｕ−ＰＡＲのｕ−ＰＡ 結合ドメイン中のエピトープに対するものであり、他の３つ（ＩＲ，２Ｒ，４Ｒ と称する）はｕ−ＰＡＲのｎｏｎ−結合部に対するものである。 抗体は二重抗体サンドイッチ型ＥＬＩ　ＳＡＳ、たとえばモノクローナル抗体の うちの１種（４Ｒ）を捕捉抗体として使用し、ビオチン化されている他の１種の 抗体（２Ｒ）を検出抗体として使用するＥＬＴＳＡにおけるｕ−ＰＡＲを定量す るのに使用できることが証明された。他の例においては、ｕ−ＰＡＲに対するポ リクローナルウサギ抗体が捕捉抗体として用いられ、ビオチン化モノクローナル 抗体（２Ｒ）が検出抗体として用いられた。 さらに、抗体はｕ−Ｐ、Ａ／ｕ−ＰＡＲ相互反応、細胞表面プラスミン発生およ びヌードマウスのサブストレイン中へ接触されたヒト癌細胞の侵襲と移転を阻止 する物質を同定するための医薬スクリーニング計画において使用できることが証 明された。 本発明の抗体は商業的に入手し得る試薬と共に以下の選択的定量の手段を提供す るものである： １）ｕ−ＰＡＲ（それがｕ−ＰＡとコンプレックス化していると否とを問わず） ２）１１−ＰＡＲとｕ−ＦＡのコンプレックス３）ｕ−ＰＡとコンプレックス化 していないｕ−ＰＡＲ（遊離ｕ−ＰＡＲ）４）ｕ−ＰＡＲのグリコジル化変種 それぞれｕ−ＰＡＲ中のｕ−ＰＡ結合ドメインとｕ−ＰＡＲのｎｏｎ−ｕ　−Ｐ 　Ａ結合部に対して特異的なモノクローナル抗体の製造法を以下に記載する：こ のような抗体はその異なった状態においてｕ−ＰＡＲを定量するのに有用である 。 実施例７においてはモノクローナル抗体の１つ（３Ｒ）が細胞表面プラスミノー ゲン活性化を強（阻止するが、この活性化は他の３つの抗体によっては影響を受 けないかまたは影響を受けても僅がである。モノクローナル抗体３ＲはまたＵ９ ３７細胞表面における放射標識ＤＦＰ処理ｕ−ＰＡの結合を効果的に阻止する一 方、２Ｒや４Ｒによっては阻止が認められず、ＩＲでは僅かな阻止が認められる に止まった。さらに、マウスＩｇＧに対するＦＩＴＣ標識抗体を使用するフロー サイトメトリーによる抗体３Ｒ，４Ｒはヒト単球に効果的に結合することが見い だされた。４Ｒ抗体の結合は単球のｕ−ＰＡによる前処理によって影響されない が、３Ｒ抗体の結合はｕ−ＰＡによる前処理によって完全に阻止される。 実施例８においては、免疫組織化学的研究においてモノクローナル抗体の２つ（ ２Ｒと４Ｒ）は細胞の同じサブポピュレーソヨンを染色するものであって、この サブポピュレーンヨンはハイブリダイゼーションによって証明されるように、ｕ −ＰＡＲに対するｍＲＮＡを含むことによって特性化される。 先の発見に基づいて、ｕ−ＰＡのレセプター結合の阻止は、局在した蛋白質分解 活性の治療的阻止に関したその生理学的機能の幾つか、例えば癌細胞の侵襲性お よび転移、炎症性腸疾患、前癌状態の結腸腺腫、敗血性関節炎、骨関節炎、リュ ーマチ様関節炎（過剰ｕ−ＰＡ生産の直接関与が立証されている）、オステオポ ローシス、コレステリン腫よう並びに過剰のプラスミノーゲン活性化が病因であ ることが示された若干の皮膚および角膜疾患、例えば角膜潰よう、角膜炎、表皮 水はう症、乾せんおよび天ぼうそうを阻害する手段であると結論された。ｕ−Ｐ Ａレセプターは幾つかの血液細胞（好中性顆粒球および単球）や内皮細胞に存在 するため、それらの調節はまた、生理学的、病理学的および薬理学的状態におけ る血管的線維溶解活性に重要な影響を与え得る。上述の疾患は、細胞表面プラス ミノーゲン活性化を遮断または低減化する物質の投与に基づく治療にとって第一 の明確な標的となる。受精卵の着床におけるｕ−ＰＡの役割故に、レセプター結 合を阻害する手段から避妊効果が期待される。治療および予防は、例えば下記で 説明されている、レセプター結合プラスミノーゲン活性化因子活性を遮断または 低減化する薬剤による全身的または局所的処置を含む。 は乳類、特にヒトにおける局在した蛋白質分解活性の阻止または打ち消し方法で あって、は乳類においてｕ−ＰＡレセプター（ｕ−ＰＡＲ）へのｕ−ＰＡの結合 を妨害し、それによってｕ−ＰＡによるプラスミノーゲンからプラスミンへの変 化を阻止することによるプラスミノーゲンからプラスミンへの活性化を阻止する 方法。 請求の範囲を含む本明細書において、「局在した蛋白質分解活性」という語は、 実質的に体内のあらゆる場所で作用する全体的蛋白質分解活性とは反対に、人体 の一つまたは幾つかの別個の領域または別個の細胞に位置する蛋白質分解活性を 指すものとする。局在した蛋白質分解活性は、は乳類、特にヒトでは広範に、ま たは局所的に阻害され得る。「阻止または打ち消す」という語は、ｕ−ＰＡＲへ のＵ−ＰＡの結合が完全に阻止されている状況、または結合が充分に阻害されて いることによりプラスミノーゲン活性化因子の望ましくない作用が阻止される状 況を指すものとする。 ｒｕ−ＰＡＲＪという語の使用は、ある種類におけるｕ−ＰＡＲのポリペプチド 部分が全ｕ−ＰＡＲについて同じであり得ても、例えばｕ−ＰＡＲの炭水化物部 分または表面結合機構が異なり得るため、複数のｕ−ＰＡＲが存在することを示 す。 非病的細胞のｕ−ＰＡＲｓへのｕ−ＰＡの結合に影響を及ぼすことな（癌細胞に 存在するｕ−ＰＡＲへのｕ−ＦＡの結合を遮断する（例えば癌細胞上のレセプタ ー変種に対して特異的モノクローナル抗体を使用することによる）か、またはｕ −ＰＡＲを発現する癌細胞を特異的に殺す（例えば癌細胞上のレセプター変種に 特異的なモノクローナル抗体に結合した毒性物質の投与による）ことは可能であ り得るため、ある種の細胞、例えば癌細胞が、重要な治療的意義を有し得る実質 的に異なるｕ−ＰＡＲを有することさえ同様にあり得る。 酵素ウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子（ｕ−ＰＡ）は、唯一の充分に 規定された巨大分子基質、すなわちプラスミノーゲンを有する。ＡｒｇＳ＠０で の開裂により、プラスミノーゲンは、広スペクトルのプロテアーゼ・プラスミン に活性化される。従って、ｒｕ−ＰＡがプラスミノーゲンからプラスミンへの変 換するのを阻止する」という語は、ｕ−ＰＡによるこの活性化が実質的に阻害さ れること、または活性化が充分に阻害されることによりプラスミンの望ましくな い作用を阻止または低減化し得る状況を意味する。 ｕ−ＰＡＲへのｕ−ＰＡのレセプター結合形態の結合の阻止は、例えば、好適に は本発明の３Ｒ抗体のようにｕ−ＰＡＲへ結合するモノクローナル抗体をは乳類 へ投与することにより、ｕ−ＰＡのレセプター結合形態が通常結合するレセプタ ーの部位を占領することによってｕ−ＰＡＲを遮断することにより行なわれ、上 記モノクローナル抗体は、レセプターに対するｕ−ＰＡのレセプター結合形態の 結合を低減化するのに有効な量で投与される。ｒｕ−ＰＡＲへの結合によりｕ− ＰＡのレセプター結合形態が通常結合するレセプターの部位を占領する」という 語は、抗体がｕ−ＰＡＲへ結合する結果、ｕ−ＰＡのレセプター結合形態がｕ− ＰＡＲへ結合され得ないことを意味するものとする。 上記したように、ｕ−ＰＡＲへのｕ−ＰＡのレセプター結合形態の結合を阻止す ることによって細胞表面プラスミノーゲン活性化を阻止する非常に興味深い方法 は、ｕ−ＰＡＲに対する抗体の使用である。抗体はｕ−ＰＡＲの非炭水化物部分 と反応するモノクローナル抗体であり得るか、またはそれはｕ−ＰＡＲの炭水化 物部分と反応するモノクローナル抗体であり得、後者は、ｕ−ＰＡＲの独特の変 異体を発現する細胞が望ましくない蛋白質分解に関与する細胞である標的細胞間 の貴重な区別を可能にし得る。抗体は、下記の様々な方法で投与され得る。 疾患の中には、ｕ−ＰＡＲの量減少または機能障害に関連したものもあると思わ れる。これらは、創傷治癒障害の症例および同じく血栓塞栓疾患の症例を含み得 る。ある条件下での血栓溶解におけるｕ−ＰＡ（従うて、恐らく同じ（ｕ−ＰＡ Ｒ）の役割は、急性炎症中および癌においてｕ−ＰＡが内皮細胞に存在するとい う本発明発明者による発見により示唆されている。正常条件下では、内皮細胞は 、ｕ−ＰＡではな（ｔ−ＦＡを含む。さらに興味深いのは、激発性夜間ヘモグロ ビン尿症という疾患がグリセリン−ホスホイノシトール・アンカーの形成能力の 障害とｕ−ＰＡＲのアンカリングの低減に関連していることである。なお、この 疾患は血栓塞栓疾患を伴うことが多い（セルバラージ等、１９８８およびそこに 引用された参考文献参照）。 ｕ−ＰＡＲの細胞外部分がかなりの相互相同性を伴う３反復率位により構成され るという発見（実施例２）から、それが相異なるリガンドに結合し得る、すなわ ち、立証されたｕ−ＦＡの結合に加えて、それが他のリガンドとも結合し得るこ とが予想される。強い増強効果が細胞表面に対するｐｒｏ−ｕ−ＰＡおよびプラ スミノーゲンの同時結合により得られるため、当然、これらの中番：（ままだ未 知のプラスミノーゲン・レセプターまたはプラスミノーゲン結合部位を含み得る ものもあることが仮定される。ｕ−ＰＡＲの細胞−細胞および細胞−基質結合部 位への焦点集中およびｕ−ＰＡＲの幾らかの移動細胞の導入端への極在化もまた 、Ｕ−ＰＡＲとｕ−ＰＡ以外の分子の間の相互反応を示す。ｕ−ＰＡＲに関する 他の潜在的代替的リガンドは、また種々のインテグリンのような細胞−細胞およ び焦点細胞−培養基質接触部位に位置する蛋白質であってもよい。上記リガンド の結合を阻害するｕ−ＰＡＲに対する抗体は、細胞表面プラスミノーゲン活性化 の阻害において貴重であり得、上記代替りガントへのｕ−ＰＡＲの結合の阻止は 、広範囲の疾患において機能的に重要かつ治療上貴重であり得る。 ｕ−ＰＡＲは、様々な形態、例えば実施例１記載のグリコジル化変異体、実施例 ３記載の発見により示唆されているリパーゼＰＩ−ＰＬＣに対して興なる感受性 を示す変異体で存在する。υ−ＰＡＲ機能の増加を伴う幾つかの疾患において、 これらの成る種の形態は優先的に変化する。成る種の明確な形態に選択的に向け られたモノクローナル抗体は、それ故上記疾患において特に治療上貴重であり得 る。　は乳類、好ましくはヒトに対する種々の抗体の投与は、抗体の投与に適し た投与方法により遂行され得る。局所投与は、抗体またはその誘導体を膏薬、軟 膏、ローション、クリーム等に製剤化することにより行なわれ得る。 本発明の医薬組成物は、例えばヒトモノクローナル抗体またはその誘導体を含ん でよい。 上述の状態および疾患の処置に関する別のストラテジーは、薬剤により表面上に ｕ−ＰＡＲを含む細胞を標的とすることであり、ポリクローナルまたはモノクロ ーナル抗体のようなｕ−ＰＡＲに対する抗体へ結合させた薬剤の投与を含む。 上記抗体の例として、特に癌細胞タイプに存在するｕ−ＰＡＲの変異体を特に指 向した抗体が挙げられる。 薬剤は、典型的には抗癌剤、例えばアルキル化剤、例えばメルフアラン、クロラ ムブシル、ブスルファン、シスプラチン、チオテーパ、代謝きっ抗物質、例えば メトトレキセート、フルラシル、アザチオプリン、細胞分裂阻止物質、代表的に はビンクリスチン、ビンブラスチン、または抗生物質、例えばドクソルビシン、 ダウノルビシンまたはプレオマイシンであり得る。薬剤はまた細菌性または他の 毒素を含み得る。 特に興味を惹（抗体は、ｕ−ＰＡＲの種々の形を区別する抗体である。抗体に基 づく診断キット、材料および方法の詳細な記載は以下に述べるとおりである。 本発明の一態様は、純粋なｕ−ＰＡＲの製造方法であって、ｕ−ＰＡＲ含有材料 をｕ−ＰＡＲに対する固定化された本発明のモノクローナル抗体によるアフィニ ティー・クロマトグラフィーに付し、例えば酸性条件下でｕ　−Ｐ　Ａ　Ｒを溶 離することを含む方法に関するものである。 この明細書で使用されている「類縁体」という語は、類縁体の免疫原性に対して 副作用を示さないささいな変形が行なわれ得る、ｕ−ＰＡＲから誘導された特有 のアミノ酸配列と類似したアミノ酸組成または配列を有する蛋白質またはポリペ プチドを示す。類似ポリペプチドまたは蛋白質は、は乳類から誘導され得るか、 または部分的または完全に合成され得る。 本発明のモノクローナル抗体は、また高収率と純度でｕ−ＰＡＲ含有フラクショ ンを得るために使用することができる。その方法は、特異モノクローナル抗体を マトリックスに固定化させ、当該マトリックスを遊離ｕ−ＰＡＲ化合物を含む製 品と接触させ、洗浄し、最後にマトリックスに固定化された抗原抗体錯体を処理 して、ｕ−ＰＡＲ化合物を精製形で遊離させるものである。好ましい方法は、カ ラムマトリックスに固定化させた抗体を使用するカラムアフィニティークロマト グラフィーによりｕ−ＰＡＲを単離させるものである。 本明細書に関連して、「抗体」という語は、本発明ポリペプチドへの暴露に対す る応答としてを椎動物またはより正確にはを椎動物起源の免疫系に属する細胞に より産生される物質を指す。 抗体の変異ドメインは可変および定常配列により構成される。ドメインの変異部 分は抗体のイディオタイプと呼ばれる。抗体のこの部分は抗原との相互作用、抗 原結合に関与する。 イディオタイプ構造は抗原性であるため、イディオタイプ構造を指向した特異抗 体に対して生じ得る。これはマウスで行なわれた。イディオタイプに対して生じ た抗体、抗イデイオタイプ抗体は、もとの抗原の構造を模倣し得るため、もとの 抗原として機能することにより、もとの抗原と反応する抗体を生じ得る。この方 法は、問題の蛋白質の重要な免疫原性部分の特性検定および合成と関連した問題 をめぐるものであるため、有利であり得る。これは立体配座エピトープの場合に 最も重要であり、他の方法であれば同定が困難であり得る。それは、防御免疫性 がこの方法で誘導され得る若干の生物について示された（例、トリ＜ノソーマ・ デュルゼイ、トリパノゾーマ・ブルセイ、Ｂ型肝炎ウィルスおよびブラスモデイ ウム・ノウレジ）。 本発明の抗体は、免疫原形態で本発明ポリペプチドの少なくとも天然または合成 部分を投与することにより、前記ポリペプチドと反応する抗体産生細胞を得、生 物または細胞から抗体含有物質を単離することを含む方法により製造され得る。 本発明抗体の製造方法については後で詳述する。 上記抗体は、好ましくは単一特異的抗体である。単一特異的抗体は、適当な動物 へ本発明ポリペプチドの実質的に純粋な製品を注射し、初回採血前の４または５ か月まで適当な間隔（例、１または２週間ないし１箇月）で１回またはそれ以上 のブースター注射をすることにより生成され得る。確立された免疫化スケジュー ルを続行し、各ブースター免疫化の約１週間後動物から採血し、抗体を適当な方 法で血清から単離する（例、バーボーおよびインギルド、Ｓ　ｃａｎｄ、Ｊ　、 Ｉ　ｍｍｕｎ。 ２（補遺１）、１９７３．１６１−１６４頁参照）。 高い検定特異性を要求しないのであれば、抗体はポリクローナル抗体であり得る 。ポリクローナル抗体は、例えばバーボーおよびインギルドの記載（上記参照） に従い得られる。さらに具体的には、ポリクローナル抗体を得る予定の場合、好 ましくは適当なアジュバント、例えばフロインド不完全または完全アジュバント を加えた後、ｕ−ＰＡＲ化合物製品を動物に注射する。免疫原がヒトｕ−ＰＡＲ 化合物である場合、動物はウサギであり得る。動物を定期的、例えば１週間間隔 で採血し、得られた血液を抗体含有血清フラクションに分離し、所望ならば前記 フラクションをさらに別の慣用的抗体精製方法、および／または精製ｕ−ＰＡＲ 化合物の使用を含む方法に付す。 別の好ましい態様では、モノクローナル抗体が得られる。モノクローナル抗体は 、ｕ−ＰＡＲ化合物の必須成分、すなわちエピトープに対してまたは実質的にそ れを指向して産生され得る。モノクローナル抗体は、慣用的技術（例、ケーラー およびミルスタインによる「ネイチャー」、２５６．１９７５．４９５頁記載） により、例えばハイブリドーマ・セルラインの使用により、またはクローンもし くはそのサブクローンまたは前記モノクローナル抗体コードするハイブリドーマ ・セルラインからの遺伝情報をもつ細胞により製造され得る。モノクローナル抗 体は、モノクローナル抗体を産生ずる細胞を適当なセルラインの細胞と融合し、 生成した前記モノクローナル抗体を産生ずるハイブリドーマ細胞を選抜およびク ローニングすることにより製造され得る。別法として、モノクローナル抗体は、 前記モノクローナル抗体を産生ずる非融合細胞を不死化し、続いて細胞を適当な 培地で生長させて前記抗体を産生させ、生長培地からモノクローナル抗体を採取 することにより製造され得る。 本発明の抗体の製造に使用される免疫化動物は、好ましくはウサギ、サル、ヒツ ジ、ヤギ、マウス、ラット、ブタ、ウマおよびモルモットから成る群から選択さ れる。本発明の抗体を産生ずる細胞は、ひ腫細胞またはリンパ細胞、例えば末梢 リンパ球であり得る。 本発明の抗体の製造においてハイブリドーマ細胞を使用する場合、これらはイン ビトロまたは動物の体腔で生育され得る。抗体産生細胞を動物、例えばマウスに 注射すると、動物の腹水中で高濃度の抗体を放出する腹水腫ようが形成される。 動物は同じく正常抗体を産生ずるが、これらは、標準的精製方法、例えば遠心分 離、ろ過、沈澱、クロマトグラフィーまたはそれらの組み合わせにより腹水から 精製され得るモノクローナル抗体の僅かなパーセンテージに達するにすぎない。 モノクローナル抗体が製造され得る適当な方法の一例は、結果として常套技術（ 例、Ｒダルチャウ、Ｊ　キルクレイ、ＪＷ、ファープルによる「モノクローナル ・アンティボディー・トウ・ア・ヒユーマン・ロイコサイトスペシフィック・メ ンプラン・グリコプロティン・プロバブリイ・ホモロガス・トウ・ザ・ロイコサ イト−コモン（Ｌ−Ｃ）アンテイゲン・オブ・ザ・ラット」、「ヨーロピアン・ ンヤーナル・オブ・イミュノロシー」、１０．１９８０．７３７−７４４頁に記 載）を用いた免疫化マウス（例、Ｂａ１ｂ／ｃマウス）からのひ腫細胞とミエロ ーマ細胞を融合する方法である。得られた融合体を慣用的技術、例えば上記方法 で単離されたｕ−ＰＡＲ化合物を用いる結合検定によりスクリーニングする。 別の態様において、本発明は、試料中のｕ−ＰＡＲまたはその誘導体を検出およ び／または定量し得る、本発明の抗体を含む診断剤に関するものである。 上記検討によると、本発明の抗体は、癌および組織侵入および組織改造を伴う他 の疾患のプロセスにおけるｕ−ＰＡＲの関与を考慮すると、これらの診断に貴重 であり得る。ｕ−ＰＡＲｍＲＮＡタンパクが結腸癌、管状乳癌、鱗状皮膚癌を含 む種々の異なった疵種において、侵入正面に位置する細胞中に一貫して見出され るという発見は、この考えを強く支持している。この考えをさらに支持するもの は、これらのすべての場合において、ｕ−ＰＡｍＲＮＡおよび／またはタンパク がｕ−ＰＡＲ含有細胞またはｕ−ＰＡＲ含有細胞に隣接する細胞によって生産さ れるという発見である。これに関連して、胸部癌患者からの血清が正常個体と比 べて高濃度のｕ−ＰＡを有すること（グレンダールーハンセン等、１９８８）、 および胸部癌組織におけるｕ−ＰＡ含有量は、例えば本出願の優先権年度に公開 されたようにこの疾患における貴重な予後マーカーであることが示されたこと（ ヤーニツケ等、１９８９．１９９０）も興味深い。ｕ−ＰＡＲの存在がｕ−ＰＡ 機能にとって前提条件であるという事実により、癌組織におけるｕ　−Ｐ　Ａ　 Ｅ含有量はいっそう優れた診断的および予後マーカーであると考えられる。ｕ− ＰＡＲ測定結果の潜在的な診断および予後用途の新しい態様は、外来的に加えら れるホスホリパーゼの非存在下でさえ生ずる培養細胞からのｕ−ＰＡＲの放出で ある（実施例３に記載）。この発見により、ｕ−ＰＡＲもまた何等かの生理学的 および異常生理学的条件下および特に癌において体液中へ放出されるという可能 性が生じる。従って、体液、例えば血清、尿および腹水中におけるｕ　−Ｐ　Ａ 　Ｒまたはその分解生成物の濃度の測定は、診断的および／または予後的に貴重 であることが証明され得る。 大部分の検定用途の場合、抗体に結合抗体検出用の標識を付すのが好ましく、ま たは別法では（例えば二重抗体検定において）、標識および非標識抗体の組み合 わせが使用され得る。標識として使用される物質は、それ自体検出可能であるか または別の物質と反応して検出可能な生成物を生じ得るあらゆる物質から選択さ れ得る。すなわち、標識は、放射性同位元素、酵素、発色団、蛍光性または化学 発光性物質および複合体形成剤から選択され得る。 標識として有用な酵素の例は、β−ガラクトシダーゼ、ウレアーゼ、グルコース オキシダーゼ、炭酸脱水酵素、ペルオキシダーゼ（例、西洋わさびペルオキシダ ーゼ）、ホスファターゼ（例、アルカリ性または酸性ホスファターゼ）、グルコ ース−６−燐酸デヒドロゲナーゼおよびリボヌクレアーゼである。 酵素はそれ自体では検出不可能であるが、検出可能な最終生成物が得られる反応 を触媒するためには基質と組み合わせなければならない。すなわち、基質を反応 混合物に加えること

【こより、着色した蛍光性または化学発光性生成物または色 の変化または色、蛍光または化学発光の強度の変化が得られる。上述の酵素に対 する基質として本方法で有用な基質の例は、Ｈ２Ｏ２、ｐ−ニトロフェニルホス フェート、乳糖、尿素、β−Ｄ−グルコース、ＣＯ２、ＲＮＡ、澱粉またはマレ エートである。基質は、例えば供与体または受容体である発色団と組み合わされ 得る。 本発明方法により使用される成分検出用標識として使用され得る蛍光性物質は、 ４−メチルアンペリフェリルーホスフェート、４−メチルアンペリフェリルーＤ −ガラクトピラノシドおよび３−（ｐ−ヒドロキシフェニル）プロピオン酸であ り得る。これらの物質は、蛍光分光光度計により検出され得る。化学発光性物質 は、ベルオキソダーゼ／エオシン／ＥＤＴＡ、イソルミノール／ＥＤＴＡ／Ｈｘ Ｏ２およびそれらの基質であり得る。 発光団は、０−フェニレンジアミンまたは類似化合物であり得る。これらの物質 は分光光度計により検出され得る。放射性同位元素は、検出可能かつ研究室で許 容され得る同位元素、例えば＋４５　Ｉ、　＋３１１　、３Ｈ，３１１ｐ、　Ｓ ６３または１４Ｃであり得る。放射能は、γ−計数管もしくはシンチレーノヨン 計数管またはラジオオートグラフィー、次いでデンントメータ一手段により測定 され得る。 複合体形成剤は、プロティンＡ、プロティンＧ（免疫グロブリンと複合体を形成 する）、ビオチン（アビジンおよびストレプトアビジンと複合体を形成する）お よびレクチン（炭水化物決定基、例えばレセプターと複合体を形成する）であり 得る。この場合、複合体はそれ自体直接には検出され得ず、複合体形成剤が複合 体を形成する物質の標識を必要とする。標識付けは、上記標識性物質のいずれか により行なわれ得る。 本発明の実施態様において、本発明の抗体は、固体支持体に結合させた架橋性化 合物と結合され得る。固体支持体および抗体を結合させるべく設計された架橋性 化合物は、ヒドラジド、プロティンＡ１グルタルアルデヒド、カルボジイミドま たはリジンであり得る。 使用される固体支持体は例えばポリマーであり、それはポリマー被覆されたマト リックスであり得る。マトリックスは、適当な固体材料、例えばガラス、紙また はプラスチック製であり得る。ポリマーは、可塑性セルロース、例えば特殊処理 紙、ニトロセルロース紙または臭化シアン−活性化紙であり得る。適当なプラス チック製品の例は、ラテックス、ポリスチレン、ポリビニルクロリド、ポリウレ タン、ポリアクリルアミド、ポリビニルアセテートおよびそれらの適当なコポリ マーである。シリコーンポリマーの例にはシロキサンがある。 固体支持体は、トレイ、プレート、例えばマイクロタイタープレート、例えば薄 層または、好ましくはストリップ、フィルム、糸、固体粒子、例えばビーズ、例 えばプロティンＡ被覆細菌または紙の形態であり得る。 本発明の抗体は、試料中に存在するポリペプチドの少なくとも一形態および／ま たは一部分の同定および／または定量を目的とする検定で使用され得る。本発明 用途により遂行される同定および／または定量は、ｕ−ＰＡＲ化合物またはＵ　 −ＰＡＲ化合物の一形態を伴う同定および／または定量であり得る。すなわち、 Ｕ−ＰＡＲ化合物の定性的および定量的測定は、両方とも本発明の使用により達 成され得る。同定および／または定量は、ともに科学的、臨床的および産業的目 的で実施され得る。下記でさらに詳述されている通り、ｕ−ＰＡＲ化合物の同定 または定量は、臨床的常法において特に重要である。 試料は、生きている生物体、例えばヒトまたは動物から得られた標本であり得る 。標本は、血液、例えば赤血球濃厚分画、または例えば肝細胞を含む組織試料で あり得る。本発明の非常に興味深い実施態様では、標本は尿である。 本発明の好ましい一実施態様では、本発明方法で使用される抗体は、一般に検定 のより高い精度および正確さが達成されると同時に恐らくは実施時間も少なくて すむと考えられることから、モノクローナル抗体であるのが好ましい。さらに、 試験の検出限界および感度を高め得ることから、２種またはそれ以上のモノクロ ーナル抗体から成る混合物が使用され得る。モノクローナル抗体は下記方法によ り得られる。高い総合活性を有する抗体は、捕獲技術に関して選択され得る。 本方法で使用される抗体は、本発明の検定の精度および／または正確さを改良す るために、好ましくは実質的に純粋な形態（ｉ！！当な技術または本発明方法に より精製、下記参照）である。 本発明の一面は、ここに説明するように、ｕ−ＰＡＲと反応し、それによってｐ ｒｏ−ｕ−ＰＡと活性ｕ−ＰＡの結合及び細胞表面プラスミノーゲン活性化を阻 止するモノクローナル抗体に関する。 これらの性質を持ったモノクローナル抗体は、以下に説明するように、数多くの 診断的及び治療的用途において有用である。 ｕ−ＰＡＲと反応し、それによってｐｒｏ−ｕ−ＰＡと活性ｕ−ＰＡとの結合並 びに細胞表面プラスミノーゲン活性化を阻止する、モノクロナール抗体３Ｒを生 産するハイブリドーマクローンは、ブダペスト条約の条件に従って、ヨーロピア ン・コレクション・オブ・アニマル・セル・カルチュアズに仮寄託番号９０１０ １００９号として寄託されている。 このクローンとそれによって生産されたモノクロナール抗体は本発明のこの面に おける実施態様を構成するものであるが、この面は明らかに当該モノクロナール 抗体に対する機能的均等物、すなわちｕ−ＰＡＲと反応し、それによってｐｒｏ −ｕ−ＰＡと活性ｕ−ＰＡとの結合並びに細胞表面プラスミノーゲン活性化を阻 止するいかなるモノクロナール抗体にも及ぶものである。すなわち、本発明のこ の面によるモノクロナール抗体は、クローン９０１０１００９号によって生産さ れたモノクロナール抗体３Ｒの機能的均等物であるモノクロナール抗体としても 特性化され得る。これは、それが抗体３Ｒと同様、υ−ＰＡＲと反応し、それに よってｕ−ＰＡＲとｐｒＯ−ｕ−ＰＡまたは活性ｕ−ＰＡとの結合並びにプラス ミノーゲンのプラスミンへの細胞表面活性化を阻止するからである。 上に説明したように、ｕ−ＰＡＲのｕ−ＰＡ結合ドメインはｕ−ＰＡＲのＮ末端 ８７残基を含む領域に位置するものである。すなわち、本発明のこの面によるモ ノクロナール抗体を他に定義するとすれば、ここで第８図にｕ−ＰＡＲｌとして 示された配列のポリペプチドまたはｕ−ＰＡに結合してｕ−ＰＡＲとｕ−ＰＡの 間の結合を阻止することができるいずれかの配列またはその類似体と反応するモ ノクロナール抗体である。 本発明のこの面によるモノクロナール抗体のｕ−ＰＡＲとの反応はｐｒｏ−ｕ− ＰＡと活性ｕ−ＰＡのｕ−ＰＡＲに対する結合並びに細胞表面プラスミノーゲン 活性化の阻止を結果するものであるが、これはｕ−ＰＡＲにおけるｕ−ＰＡ結合 ドメインとの反応であってもよく、また特別の可能性として、υ−ＦＡ結合ドメ インよりもｕ−ＰＡＲの他の部分に対する結合であって、アロステリック効果に より結合ドメインにおける変化を惹起するものであってもよい。モノクロナール 抗体とｕ−ＰＡＲとの反応がｕ−ＰＡＲのｕ−ＰＡ結合ドメインとの反応（モノ クロナール抗体３Ｒに対する場合に認められたように）であるときは、当該反応 はｕ−ＰＡＲの結合部位を直接食む結合であってもよく（これは約３０またはそ れ以下（またはそれ以上）、たとえば１５〜３０またはときにそれ以下、しかし 恐ら（３０〜５０またはそれ以上のアミノ酸配列を含むものと考えられる。）、 適当な結合部位を含まないが、それにも拘わらすｕ−ＰＡ結合を阻止するような 結合、たとえばアロステリック効果を有し、ｕ−ＰＡ結合を阻止するような抗体 結合であってもよい。上記いずれの場合においてもｕ−ＰＡＲのｕ−ＰＡ結合ド メインに結合してｐｒｏ−ｕ−ＰＡまたはｕ−ＰＡのｕ−ＰＡＲへの結合並びに 細胞表面プラスミノーゲン活性化を阻止するモノクロナール抗体は、治療目的の ために同じ金体的な機能性と利用性を有しており、本発明のこの面における同じ 実施態様を構成するものである。 本発明のこの面によるモノクロナール抗体は、免疫され得る動物をｕ−ＰＡＲま たはそのサブセクションまたは免疫原的変異種、たとえばｕ−ＰＡＲのｕ−ＰＡ 結合ドメインによって免疫し、免疫された動物からの細胞をミエローマセルライ ンと融合させ、ｕ−ＰＡＲと反応してｐｒｏ−ｕ−ＰＡと活性ｕ−ＰＡのＵ−Ｐ ＡＲへの結合並びに細胞表面プラスミノーゲン活性化を阻止することができる抗 体を生産するクローンをスクリーニングすることによって製造することができる 。 以下の説明および実施例から明らかなように、モノクロナール抗体の生産の初期 段階において、特別の選択プランが用いられ、これによってｕ−ＰＡＲと反応し てその結果としての阻止効果を有し、同時にＥＬＩ　ＳＡのようなイムノアッセ イにおける有用性を有する抗体を生産するハイブリドーマクローンが得られた。 このようなモノクロナール抗体が確立されたことが一旦見いだされると、当業者 にとってここに開示された特定の種とはその微小な特異的作用形式、蛋白化学組 成などにおいて異なワているが、同じ本質的機能性、すなわちｕ−ＰＡＲのＵ− ＰＡ結合ドメインに対し結合し、それによってｐｒｏ−ｕ−ＰＡまたは活性Ｕ− ＰＡのｕ−ＰＡＲに対する結合並びに細胞表面プラスミノーゲン活性化を阻止す ることができる性能を示す他のモノクロナール抗体を生産することが可能となろ う。 上記説明により、モノクロナール抗体のこの面のサブクラスはｕ−ＰＡＲのＵ− ＰＡＲ結合ドメインと反応し、それによってｐｒｏ−ｕ−ＰＡと活性ｕ−ＰＡの 結合並びに細胞表面プラスミノーゲン活性化を阻止するモノクロナール抗体であ る。 抗体が上記定義に一致することを評価する方法は、抗体とｕ−ＰＡＲとの間の反 応によって引き起こされた表面プラスミノーゲン活性化の阻止を測定するか、抗 体とｕ−ＰＡＲとの間の反応によって引き起こされたｕ−ＰＡまたはｐｒｏ−ｕ −ＰＡのｕ−ＰＡＲへの結合の阻止を測定することからなる。 本発明のこの面における、特別な狭い実施態様は、競合実験において、ブリペス ト条約の条件下にヨーロピアン・コレクション・オブ・アニマル・セル・カルチ ュアズに仮寄託番号９０１０１００９号として寄託されたハイブリドーマ・セル ラインによって生産されたモノクローナル抗体３Ｒと競合することができるモノ クローナル抗体である。 この点において、「抗体」なる用語は完全な抗体分子のみならず、Ｆａｂフラグ メントのようにその結合断片をも意味することが意図されている。実施例の抗体 はマウスハイブリドーマによって生産されているが、治療目的のための抗体は適 切にはヒトハイブリドーマによって生産される。ヒトハイブリドーマの確立と使 用は当業界においてよく知られているところであり、たとえばＭ、Ｃ，Ｇｌａｓ ｓｙ、Ｈ，Ｈ，Ｈａｎｄｌｅｙ、Ｈ，Ｈａｇｉｖａｒａおよびｌ　、　Ｒｏｙｓ ｔｏｎ　：ヒト／ヒトハイブリドーマを分泌する抗体を発生させるのに有用なヒ ドリンホブラストイドＢ−セルライン、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ 、ＵＳＡ、８０：６３２７−６３３１．１９８３やＦ、　Ｆ、　Ｉ　ｒｉｅ。 Ｌ、Ｌ、ＳｚｅおよびＲ，Ｅ、　５ａｘｔｏｎ　：ニブシュタイン−バールウィ ルス形質転換ヒトＢリンパ球セルラインによるインビトロで生産された腫瘍抗原 ０ＦＡ−１に対するヒト抗体、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳ Ａ７９：５６６６−５６７０．１９８２を参照されたい。 本発明の抗体の最も重要な有用性の一つは、診断目的に対するものであり、特に サンプル中におけるｕ−ＰＡＲの存在を検出したり定量するための方法における 使用である。以下に、このような方法、特にＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着試験 法）による方法および本発明によるモノクローナル抗体についてより詳細に述べ ることとする。 また、ある種の特異的ポリクローナル抗体についても述べる。このような特異的 ポリクローナル抗体を生産する方法は実施例４に記載されており、がかる抗体は インタクトｕ−ＰＡＲのキモトリプシンによる分解によって得られたｕ−ＰＡＲ の１６ｋＤｕ−ＰＡ結合フラグメントによる免疫によって展開されるものである 。他の興味ある特異的抗体はｕ−ＰＡＲの３５〜４５ｋＤｎｏｎ−ｕ−ＰＡ結合 フラグメントによる免疫によって得ることができる。 本発明によるかかる用途の一面はサンプル中におけるｕ−ＰＡＲの検出または定 量方法であり、検出または定量は本質的にｕ−ＰＡＲがｕ−ＰＡを結合したが否 かとは無関係であり、捕捉または／および検出抗体としてｕ−ＰＡＲがｕ−ＰＡ に結合していると否とを問わずｕ−ＰＡＲに結合することができる抗体を使用す ることを含む。 本発明において使用された各抗体は、ｕ−ＰＡＲと反応するが、そのｕ−ＰＡ結 合ドメインとは反応しない本発明によるモノクローナル抗体または遊離ｕ−ＰＡ Ｒともｕ−ＰＡとｕ−ＰＡＲの複合体とも反応する本発明のモノクローナル抗体 であってよい。 また、本発明で有用なものは、ｕ−ＰＡＲと反応するがそのｕ−ＰＡ結合ドメイ ンとは反応しないポリクローナル抗体および遊離ｕ−ＰＡＲともｕ−ＰＡとＵ− ＰＡＲの複合体とも反応するポリクローナル抗体である。 この方法の一つの有用な具体例は、ｕ−ＰＡＲと反応するが、そのｕ−ＰＡ結合 ドメインとは反応しない一つのモノクローナル抗体または遊離ｕ−ＰＡＲともｕ −ＰＡとｕ−ＰＡＲの複合体とも反応する一つのモノクローナル抗体を捕捉抗体 として使用し、ｕ−ＰＡＲと反応するが、そのｕ−ＰＡ結合ドメインとは反応し ない他の一つのモノクローナル抗体または遊離ｕ−ＰＡＲともｕ−ＰＡとＵ−Ｐ ＡＲの複合体とも反応する他の一つのモノクローナル抗体であって、このような 他のモノクローナル抗体が異なったエピトープに対して向けられたものであるよ うなものを検出抗体として使用する方法である。 このような方法の他の一つの具体例は、ｕ−ＰＡＲと反応するが、そのｕ−ＰＡ 結合ドメインとは反応しないポリクローナル抗体または遊離ｕ−ＰＡＲともＵ− ＰＡとｕ−ＰＡＲの複合体とも反応するポリクローナル抗体を捕捉抗体として使 用し、ｕ−ＰＡＲと反応するが、そのｕ−ＰＡ結合ドメインとは反応しない一つ のモノクローナル抗体または遊離ｕ−ＰＡＲともｕ−ＰＡとｕ−ＰＡＲの複合体 とも反応する一つのモノクローナル抗体を検出抗体として使用する方法である他 の一つの具体例は、ｕ−ＰＡＲと反応するが、そのｕ−ＰＡ結合ドメインとは反 応しないモノクローナル抗体または遊離ｕ−ＰＡＲともｕ−ＰＡとｕ−ＰＡＲの 複合体とも反応する一つのモノクローナル抗体を捕捉抗体として使用し、Ｕ−Ｐ ＡＲと反応するが、そのｕ−ＰＡ結合ドメインとは反応しないポリクローナル抗 体または遊離ｕ−ＰＡＲともｕ−ＰＡとｕ−ＰＡＲの複合体とも反応するポリク ローナル抗体を検出抗体として使用する方法である。 さらに他の具体例は、ｕ−ＰＡＲと反応するが、そのｕ−ＰＡ結合ドメインとは 反応しないポリクローナル抗体または遊＠　ｕ　−Ｐ　Ａ　Ｒともｕ−ＰＡとｕ −ＰＡＲの複合体とも反応するポリクローナル抗体を捕捉抗体として使用し、ｕ −ＰＡＲと反応するが、そのｕ−ＰＡ結合ドメインとは反応しないポリクローナ ル抗体または遊離ｕ−ＰＡＲともｕ−ＰＡとｕ−ＰＡＲの複合体とも反応するポ リクローナル抗体を検出抗体として使用する方法である。 本発明による他の方法は、サンプル中のｕ−ＰＡＲとｕ−ＰＡの複合体を検出す るかまたは定量する方法であって、ｕ−ＰＡまたはｐｒｏ−ｕ−ＦＡと結合した ｕ−ＰＡＲに結合することができる抗体を捕捉または検出抗体として使用し、結 合したｕ−ＰＡまたはｐｒｏ−ｕ−ＰＡを検出する抗体を検出または捕捉抗体と して使用するものである。 この方法の具体例は、ｕ−ＰＡＲと反応するが、そのｕ−ＰＡ結合ドメインとは 反応しないモノクローナル抗体または遊離ｕ−ＰＡＲともｕ−ＰＡとｕ−ＰＡＲ の複合体とも反応するモノクローナル抗体を捕捉または検出抗体として使用する 方法である。 他の具体例は、ｕ−ＰＡＲと反応するが、そのｕ−ＰＡ結合ドメインとは反応し ないポリクローナル抗体または遊離ｕ−ＰＡＲともｕ−ＰＡとｕ−ＰＡＲの複合 体とも反応するポリクローナル抗体を捕捉または検出抗体として使用する方法で ある。 本発明による他の重要な方法は、サンプル中のｕ−ＰＡとは結合していないＵ− ＰＡＲを検出または定量する方法であって、遊離ｕ−ＰＡＲと結合するが、Ｕ− ＰＡとｕ−ＰＡＲとの複合体とは結合することができない抗体を捕捉または検出 抗体として使用するものである。 この方法で使用する抗体は、ｕ−ＰＡＲのｕ−ＰＡ結合ドメインと反応するモノ クローナル抗体または遊離ｕ−ＰＡＲと反応するが、ｕ−ＰＡとｕ−ＰＡＲの複 合体とは反応しないモノクローナル抗体、もしくはｕ−ＰＡＲのｕ−ＰＡ結合ド メインと反応するが、ｕ−ＰＡとｕ−ＰＡＲの複合体とは反応しないポリクロー ナル抗体あるいは遊離ｕ−ＰＡＲと反応するが、ｕ−ＰＡとｕ−ＰＡＲの複合体 とは反応しないポリクローナル抗体であってよい。 この方法の一つの具体例は、ｕ−ＰＡＲのｕ−ＰＡ結合ドメインと反応するモノ クローナル抗体または遊離ｕ−ＰＡＲと反応し、ｕ−ＰＡとｕ−ＰＡＲの複合体 とは反応しないモノクローナル抗体を捕捉抗体として使用し、ｕ−ＰＡＲのＵ− ＰＡ結合ドメインと反応する他のモノクローナル抗体または遊離ｕ−ＰＡＲと反 応し、ｕ−ＰＡとｕ−ＰＡＲの複合体とは反応しない他のモノクローナル抗体で あって、このような他のモノクローナル抗体が異なったエピトープに対して向け られているようなものを検出抗体として使用する方法である。 この方法の他の一つの具体例は、ｕ−ＰＡＲのｕ−ＰＡ結合ドメインと反応する が、ｕ−ＰＡとｕ−ＰＡＲの複合体とは反応しないポリクローナル抗体または遊 離ｕ−ＰＡＲと反応し、ｕ−ＰＡとｕ−ＰＡＲの複合体とは反応しないポリクロ ーナル抗体を捕捉抗体として使用し、ｕ−ＰＡＲのｕ−ＰＡ結合ドメインと反応 するモノクローナル抗体または遊離ｕ−ＰＡＲと反応し、ｕ−ＰＡとｕ−ＰＡＲ の複合体とは反応しないモノクローナル抗体を検出抗体として使用する方法であ る。 この方法のさらに他の具体例は、ｕ−ＰＡＲのｕ−ＰＡ結合ドメインと反応する モノクローナル抗体または遊離ｕ−ＰＡＲと反応し、ｕ−ＰＡとｕ−ＰＡＲの複 合体とは反応しないモノクローナル抗体を捕捉抗体として使用し、ｕ−ＰＡＲの ｕ−ＰＡ結合ドメインと反応し、ｕ−ＰＡとｕ−ＰＡＲの複合体とは反応しない ポリクローナル抗体または遊離ｕ−ＰＡＲと反応し、ｕ−ＰＡとｕ−ＰＡＲの複 合体とは反応しないポリクローナル抗体を検出抗体として使用する方法である。 この方法のさらに他の具体例は、ｕ−ＰＡＲのｕ−ＰＡ結合ドメインと反応し、 ｕ−ＰＡとｕ−ＰＡＲの複合体とは反応しないポリクローナル抗体または遊離ｕ −ＰＡＲと反応し、ｕ−ＰＡとｕ−ＰＡＲの複合体とは反応しないポリクローナ ル抗体を捕捉抗体として使用し、ｕ−ＰＡＲと反応し、そのｕ−ＰＡ結合ドメイ ンとは反応しないポリクローナル抗体または遊離ｕ−ＰＡＲともｕ−ＰＡとＵ− ＰＡＲの複合体とも反応するポリクローナル抗体を検出抗体として使用する方法 である。 本発明の他の方法は、サンプル中のｕ−ＰＡと結合していないｕ−ＰＡＲを検出 または定量する方法であって、遊離ｕ−ＰＡＲと結合するが、ｕ−ＰＡ結合を阻 止することができない抗体を捕捉または検出抗体として使用し、ｕ−ＰＡまたは そのｕ−ＰＡＲ結合変異種を検出または捕捉試剤として使用するものである。 本発明の他の方法は、組織断片におけるｕ−ＰＡＲの免疫組織学的検出方法であ って、当該方法では検出抗体としてｕ−ＰＡＲと反応するモノクローナル抗体ま たはｕ−ＰＡＲと反応するポリクローナル抗体、たとえばｕ−ＰＡＲのｕ−ＰＡ 結合ドメインと反応するモノクローナル抗体、遊離ｕ−ＰＡＲと反応するが、ｕ −ＰＡとｕ−ＰＡＲの複合体とは反応しないモノクローナル抗体、ｕ−ＰＡＲと は反応するが、そのｕ−ＰＡ結合ドメインとは反応しないモノクローナル抗体、 遊離ｕ−ＰＡＲともｕ−ＰＡとｕ−ＰＡＲの複合体とも反応するモノクローナル 抗体、ｕ−ＰＡＲのｕ−ＰＡ結合ドメインと反応し、ｕ−ＰＡとｕ−ＰＡＲの複 合体とは反応しないポリクローナル抗体、ｕ−ＰＡＲと反応するが、そのＵ　− ＰＡ結合ドメインとは反応しないポリクローナル抗体、遊離ｕ−ＰＡＲと反応す るが、ｕ−ＰＡとｕ−ＰＡＲの複合体とは反応しないポリクローナル抗体、また は遊離ｕ−ＰＡＲともｕ−ＰＡとｕ−ＰＡＲの複合体とも反応するポリクローナ ル抗体を使用する。 特に、抗体は上記したモノクローナル抗体の１種である。 この方法の一つの具体例、すなわちｕ−ＰＡＲをそれがｕ−ＰＡと結合している か否かに関係なく検出する方法はｕ−ＰＡＲと反応するが、そのｕ−ＰＡ結合ド メインとは反応しないモノクローナル抗体、遊離ｕ−ＰＡＲともｕ−ＰＡとＵ− ＰＡＲの複合体とも反応するモノクローナル抗体、ｕ−ＰＡＲと反応するが、そ のｕ−ＰＡ結合ドメインとは反応しないポリクローナル抗体または遊離ｕ−ＰＡ Ｒともｕ−ＰＡとｕ−ＰＡＲの複合体とも反応するポリクローナル抗体を使用す るものである。 この方法の他の具体例は、遊離のｕ−ＰＡＲを検出するものであって、検出抗体 として遊離ｕ−ＰＡＲを検出するが、ｕ−ＰＡとｕ−ＰＡＲの複合体を検出する ことができない抗体を使用する。 この具体例において、検出抗体としては、ｕ−ＰＡＲのｕ−ＰＡ結合ドメインと 反応するモノクローナル抗体、遊離ｕ−ＰＡＲと反応するが、ｕ−ＰＡとＵ−Ｐ ＡＲの複合体とは反応しないモノクローナル抗体、ｕ−ＰＡＲのｕ−ＰＡ結合ド メインと反応するが、ｕ−ＰＡとｕ−ＰＡＲの複合体とは反応しないポリクロー ナル抗体または遊離ｕ−ＰＡＲと反応するが、ｕ−ＰＡとｕ−ＰＡＲの複合体と は反応しないポリクローナル抗体が使用されてよい。 ｕ−ＰＡと結合していると否とを問わすｕ−ＰＡＲを検出する本発明によるモノ クローナル抗体の一例は、４Ｒとして参照され、仮寄託番号９０１０１０１０号 として寄託されたハイブリドーマセルラインによって生産される抗体である。こ の点で有用であると考えられる本発明の他のモノクローナル抗体としては、ＩＲ と２Ｒがある。 遊離ｕ−ＰＡＲと反応するが、ｕ−ＰＡとｕ−ＰＡＲの複合体とは反応しない、 本発明によるモノクローナル抗体の例としては、上に述べた抗体３Ｒが挙げられ る。 抗体３Ｒに関して上記したところと同様、ここに述べられたモノクローナル抗体 の各機能タイプは、寄託された具体的なりローンの具体的な生産物に限定される ものではなく、むしろ実施例および特許請求の範囲を含め本明細書中に記載した 有用性に関して同じ機能性を示すモノクローナル抗体の集団として理解されるべ きである。 本発明の一面は、サンプル中のｕ−ＰＡＲのグリコジル化変異種を検出または定 量する方法に関し、当該方法は検出抗体として単独にまたは優先的に該変異種に 結合するモノクローナル抗体を使用するものである。 ｕ−ＰＡＲのグリコジル化変異種は、典型的には癌細胞の特別のタイプに特徴的 な変異種である。 上記した全ての場合において、サンプルとは典型的には癌患者または癌の疑いが ある患者からの血清、血漿または尿を言うが、勿論特定のケースに適切な他の　 。 サンプルたとえば糞便サンプルであってもよい。サンプルはまた癌組織または癌 の疑いがある組織から抽出されてもよい。 上記した全ての場合において、サンプルはまた組織破壊、たとえばリュウマチ性 関節炎、潰瘍性大腸炎または乾癖症を含む非腫瘍性疾病に罹っている患者または 罹っている疑いのある患者からの血清、血漿または尿であってもよい。 上に詳述したように、検出抗体は検出標識を伴っており、そのような標識の例は ここに述べるとおりである。 本発明によるモノクローナル抗体は、また、診断剤を表面にｕ−ＰＡＲを含む細 胞に命中させるための方法においても使用することができ、当該方法は哺乳類特 にヒト、特に癌に罹患したまたは罹患した疑いのある哺乳類に対してｕ−ＰＡＲ に対する本発明のモノクローナル抗体に結合した診断剤を投与することを含むも のである。診断剤はテクネチウムのような放射性物質であってもよい。 この目的のために用いられる本発明の抗体は、上記した本発明のモノクローナル 抗体のいずれであってもよく、ｕ−ＰＡＲの特別なグリコジル化変異種に単独で または優先的に結合するモノクローナル抗体であってもよい。 上記の記述を要約し、かつ図に関する説明および実施例に記載したモノクローナ ル抗体の性質を参照して、本発明によるモノクローナル抗体は、ｕ−ＰＡＲに対 するモノクローナル抗体としての以下に述べる特性の一つまたはそれ以上によっ て特徴付けることができる： １）サンドイッチＥＬＩＳＡにおいて捕捉抗体として固定化されたとき、Ｕ　− ＰＡＲを捕捉することができる、または２）サンドイッチＥＬＩＳＡにおいてビ オチン標識検出抗体として使用されたとき、ｕ−ＰＡＲを検出することができる 、または３）ＥＬＩＳＡにおいて使用されたとき、固定化されたｕ−ＰＡＲに結 合することができる、または ４）ＥＬＩＳＡにおいて捕捉抗体として固定化されたとき、ｕ−ＰＡＲがそのｕ −ＰＡ結合容を保持するようにｕ−ＰＡＲを結合することができる、または５） 放射免疫沈殿試験において、精製ｕ−ＰＡＲがインタクトの形で沈殿させる、ま たは ６）放射免疫沈殿試験において、キモトリプシン消化によって得られるｕ−ＰＡ Ｒのｕ−ＦＡ結合Ｍｒ１６．０００フラグメントを沈殿させる、または７）放射 免疫沈殿試験において、キモトリプシン消化によって得られ、ｕ−ＰＡを結合し ないｕ−ＰＡＲのｕ−ＰＡ結合Ｍ　ｒ　１６．０００７ラグメントを沈殿させる 、または ８）ｕ−ＰＡＲ含有抽出物の界面活性剤相が６〜１６％グラジェントゲル上非還 元条件下５ＤＳ−ＰＡＧＥ分離に付した場合、ウェスタンブロッティングにおい てｕ−ＰＡＲと反応する、または ９）ウェスタンブロッティングにおいて、Ｕ９３７細胞によって生産された５０ 〜６５ｋＤ範囲のｕ−ＰＡＲグリコジル化変異変異種応せず、Ｕ９３７ａ細胞に よって生産された約４０〜４５ｋＤのｕ−ＰＡＲグリコジル化変異変異種応しな い、または １０）ウェスタンブロッティングにおいて、Ｕ９３７細胞によって生産された５ ０〜５５ｋＤ範囲のｕ−ＰＡＲグリコジル化変異変異種応し、Ｕ９３７ａ細胞に よって生産された約４０〜４５ｋＤのｕ−ＰＡＲグリコリル化変異変異種応する 、または １１）ウェスタンブロッティングにおいて、Ｕ９３７細胞によって生産された５ ０〜６５ｋＤ範囲のｕ−ＰＡＲグリコジル化変異変異種く反応し、０９３７ａ細 胞によって生産された約４０〜４５ｋＤのｕ−ＰＡＲグリコジル化変異変異種く 反応する、または １２）ホルマリン固定、パラフィン包埋結腸癌組織環の断面において、癌細胞を 侵襲前面において免疫染色し、免疫染色された細胞の所在はイン・シチュ・／Ｘ イブリダイゼーションによって検出されたｕ−ＰＡＲｍＲＮＡの分布と実質的に 同じである、または １３）　ｐ　ｒ　ｏ−ｕ−ＰＡと活性ｕ７ＰＡの結合および細胞表面プラスミノ ーゲン活性化を阻止する、または １４）ｕ−ＰＡＲのｕ−ＰＡ結合ドメインと反応し、そのによってｐｒｏ−ｕ− ＰＡと活性ｕ−ＰＡの結合および細胞表面プラスミノーゲン活性化を阻止する、 または １５）図８においてｕ−ＰＡＲＩとして示された配列またはｕ−ＰＡＲに結合し てｕ−ＰＡＲとｕ−ＰＡの結合を阻止することができる配列もしくはその類似体 と反応するモノクローナル抗体、または１６）パラフィン包埋組織切片のような 組織断片におけるｕ−ＰＡＲに結合し、それによってｕ−ＰＡＲの免疫組織学的 検出に有用である、または１７）ｕ−ＰＡＲの特定のグリコリル化変異種に選択 的に結合することができる、または １８）Ｃ末端部を含み、インタクトｕ−ＰＡＲ分子中のアミノ酸残基８８で出発 するｕ−ＰＡＲ分子のｎｏｎ−ｕ−ＰＡ結合部と反応する、または１９）マウス ＩｇＧに対するフルオルエツセインイソチオンアネートー標識抗体によるフロー サイトメトリーを使用した場合、ヒト単核細胞に結合し、この結合は外因的に加 えられたｕ−ＰＡとのブレインキュベーションによって影響されない、または ２０）マウスＩｇＧに対するフルオルエツセインイソチオンアネートー標識抗体 によるフローサイトメトリーを使用した場合、ヒト単核細胞に結合し、この結合 は外因的に加えられたｕ−ＰＡとのプレインキュベーションによって完全に阻止 される。 本明細書の記載から、これらの性質は、単独でまたは結合して、本発明のモノク ローナル抗体をｕ−ＰＡＲおよびｕ−ＰＡ／ｕ−ＰＡＲ相互反応の検出、定量、 特性化および機能的分析のために、そしてまたｕ−ＰＡ／ｕ−ＰＡＲ相互反応を 含む癌およびその他の疾病における診断的予後的および治療的用途のために極め て有用なものとすることは明らかである。 本発明によるモノクローナル抗体の一つの重要な用途は、ｕ、−ＰＡ／ｕ−ＰＡ Ｒ相互反応の潜在的阻止、そしてｕ−ＰＡ／ｕ−ＰＡＲ相互反応が含まれる癌や 他の疾病における潜在的な抗侵襲および抗転移効果のための物質をスクリーニン グする手段を確立することである。かかる用途の一つは、スクリーニング方法で あって、当該方法においては、物質によるｕ−ＰＡ／ｕ−ＰＡＲ相互反応の可能 な阻止が当該物質を固定化ｕ−ＰＡＲと可溶化ｕ−ＰＡを含む系に加えることに よって決定され、ｕ−ＰＡＲに結合したｕ−ＰＡは標識することによってまたは 標識抗ｕ−ＰＡ抗体を使用することによって検出される。上記の阻止は、また、 物質を固定化ｕ−ＰＡと可溶化ｕ−ＰＡＲを含む系に添加することによって決定 され、ｕ−ＰＡに結合したｕ−ＰＡＲは標識することによってまたは標識抗Ｕ　 −ＰＡＲ抗体を使用することによって検出される。 かかる試験法の例としては、υ〜ＰＡＲを捕捉するためにｕ−ＰＡＲに対する固 定化モノクローナル抗体を使用し、それに続いてｕ−ＰＡＲに結合するｕ−ＰＡ を測定する非常に実際的なスクリーニングＥＬＩＳＡを挙げることができる。 その際の候補物質の可能な干渉、レセプター結合ｕ−ＰＡは標識がたとえばビオ チンである、標識抗ｕ−ＰＡ抗体によって検出される。 上記の簡便かつ迅速なスクリーニングにおいて、物質が陽性であることが見いだ された場合には、該物質によるｕ−ＰＡ／ｕ−ＰＡＲ相互反応の可能な阻止を、 当該物質をｕ−ＰＡＲと放射標識ｕ−ＰＡまたはその誘導体を含む系に加え、ｕ −ＰＡに結合したｕ−ＰＡＲを交差結合させ、交差結合生成物を５ＤＳ−ＰＡＧ Ｅとオートラジオグラフィによって検出することにより測定する、より労力を要 する試験法で適切にテストすることができる。この試験法における陽性の結果は 、当該物質が事実ｕ−ＰＡ／ｕ−ＰＡＲ結合を阻止することを確認する。 通常、次の工程は、上記試験法においてｕ−ＰＡ／ｕ−ＰＡＲ結合阻止陽性と認 められた物質を、培養細胞の表面におけるｕ−ＰＡのｕ−ＰＡＲに対する結合の 可能な阻止を判断する試験法で調べることである。この試験法は、放射標識り− ＰＡまたはその誘導体とｕ−ＰＡを有する細胞を含む系に当該物質を加え、Ｕ− ＰＡＲに結合するｕ−ＰＡまたは誘導体を細胞のガンマ−計数によって検出する ことからなる。この試験法における陽性の結果は、先の試験法で認められたＵ− ＰＡ／ｕ−ＰＡＲ結合の阻止が可溶化されたｕ−ＰＡＲの使用に関連した人為的 なものではなく、臨床的状況にある場合のようにｕ−ＰＡＲが細胞表面に結合し た場合に実際に達成されるものであることを証明する。 ｕ−ＰＡ／ｕ−ＰＡＲ相互反応を阻止する目的は、生物学的設定におけるＵ−Ｐ Ａの酵素活性を阻止することである。これは、細胞表面プラスミノーゲン活性化 のレセプター結合外因性ｐｒｏ−ｕ−ＰＡによる阻止が、ｕ−ＰＡＲを有する細 胞に当該物質を添加し、そこへｐｒｏ−ｕ−ＰＡを添加し、細胞表面上のプラス ミン発生を測定することによって決定される検定法で直接試験することができる 。外因的にｕ−ＰＡを加えたこの状態はあるタイプの癌、たとえば結腸腺癌にお ける状況に類似しており、その場合癌細胞はｕ−ＰＡＲを生産し、かつ含有して いるのに対し、ｕ−ＰＡは腫瘍支質中において隣接した非腫瘍細胞によって生産 される。 しかしながら、あるタイプの癌、たとえば鱗片状皮膚癌の場合には、癌細胞それ 自身がｕ−ＰＡＲとｕ−ＰＡを生産する。この場合においてはｕ−ＰＡ／ｕ−Ｐ ＡＲ相互反応の阻止は、２つの成分が異なった細胞によって生産される場合より も困難となる。問題の物質がこれらの状況のもとにｕ−ＰＡ／ｕ−ＰＡＲ相互反 応を阻止することができるか否かを試験するためには、レセプター結合外因性ｐ ｒｏ−ｕ−ＰＡによる細胞表面プラスミノーゲン活性化の可能な阻止がｕ−ＰＡ Ｒ担持細胞をインキュベートし、ｐｒｏ−ｕ−ＰＡを当該物質で生産させ、セル 表面におけるプラスミン発生の測定によって決定される方法を使用する。 動物実験において侵襲と転移についてのｕ−ＰＡ／ｕ−ＰＡＲ相互反応を阻止す る物質の効果を研究する際に固有の問題点は、ｕ−ＰＡ／ｕ−ＰＡＲ相互反応に おける種特異性である。それ故、ヒトの系においてｕ−ＰＡ／ｕ−ＰＡＲ相互反 応を阻止する物質が必ずしもマウスのような実験動物系においてｕ−ＰＡ／ｕ− ＰＡＲ相互反応を阻止するとは限らない。この問題はモノクローナル抗体がＵ− ＰＡ／ＬＪ−ＰＡＲ相互反応を阻止する物質として使用される場合に一層深刻な ものとなる。何故なら、ヒトｕ−ＰＡＲに対するマウスモノクローナル抗体はマ ウスｕ−ＰＡＲと反応しないからである。それ故、本発明によりヌードマウスに 接種されたヒト癌細胞の侵襲および転移を容易に測定できるシステムが開発され た。常套のヌードマウスに接種されたヒトの癌細胞は規則どおりには侵襲、転移 しない。本発明によれば、ｎｕ／ｎｕＭＥＴＡ／ｂｏｍと称するヌードマウスの サブストレインは、実質上すべての場合において若干の癌セルラインが侵襲し、 転移することが確認された。さらに本発明によれば、マウスに接種されたヒトの 癌細胞は、接種に先立って酵素β−Ｄ−ガラクトシダーゼをコードする］ａｃＺ 遺伝子によって形質転換された。この酵素は基質Ｘ−ガルに適用されたとき、青 色染色を示す。すなわちこの系はヒト癌細胞とマウス自身の細胞との間で顕著な 着色差を得ることを可能にし、これによって侵襲細胞と転移の検出および定量を 著しく容易化する。実施例９に記載した実験において、このマウスモデルにおけ る侵襲、転移癌細胞はｕ−ＰＡとｕ−ＰＡＲの両者を生産することが見いだされ た。さらにその侵襲と転移は、ｕ−ＰＡに対するモノクローナル抗体であって、 細胞表面プラスミン発生を阻止するものの投与によって殆ど完全に阻止できるこ とが見いだされた。ｐｒｏ−ｕ−ＰＡのレセプター結合の阻止がプラスミン発生 を阻止すると言う上記の発見と相俟って、これはｕ−ＰＡとｕ−ＰＡＲを生産す る、細胞上のｕ−ＰＡ／ｕ−ＰＡＲ相互反応を効果的に阻止する物質はヌードマ ウスモデルにおける侵襲と転移を阻止することを示すものである。 マウスがｕ−ＰＡとｕ−ＰＡＲを生産するヒト癌細胞により接種されるモデルに 加え、他の多数のモデルもまた興味あるものである。そのような他のモデルとし ては、一方がｕ−ＰＡを生産し、他方がｕ−ＰＡＲを生産する二つのタイプの癌 細胞を接種するものであって、従って二つの異なったタイプの細胞で生産される あるタイプの癌で生ずる臨床的条件が刺激されることになる。第３の興味ある場 合として、ｕ−ＰＡＲを生産するヒト癌細胞をｕ−ＰＡを生産するヒト腫瘍−潜 入繊維芽細胞と共に接種する場合である。 これらのヌードマウスモデルにおいて侵襲と転移を阻止することが見いだされた ｕ−ＰＡ／ｕ−ＰＡＲ相互反応阻止物質は、ｕ−ＰＡ／ｕ−ＰＡＲ相互反応が侵 襲と転移に決定的であると信じられているヒト癌タイプ、たとえば結腸腺癌、乳 腺癌、鱗片状皮膚癌において抗侵襲的かつ抗転移的であると考えられる。従って このような化合物は有効な抗侵襲、抗転移薬として強力な候補と考えられるから 、動物において適切な毒性試験を行った後、第１相および第２相の臨床試験でさ らに研究を行うべきである。 すなわち、本発明の一面は、上記の方法によって選択された場合に、哺乳類にお いてｕ−ＰＡのレセプター結合系のｕ−ＰＡＲへの結合を阻止することによって プラスミノーゲンのプラスミンへの活性化を妨げることによる、哺乳類、特にヒ トにおける局所的蛋白分解活性を阻止し、妨害する物質に関するものである。 他の面において、本発明は、上記した１つまたはそれ以上の試験法で試験される 種々の基準において、特に当該物質がクレーム７５にクレームした試験法１）〜 ４）に示された基準に合致する場合において、局在する蛋白分解活性を阻止し、 妨害する物質に関する。これは当該物質が、ｕ−ＰＡとｕ−ＰＡＲが異なった細 胞タイプによって生産される臨床的状況において活性があると考えられるからで ある。 さらに当該物質がクレーム７６の５）の基準にも合致する場合には、ｕ−ＰＡと ｕ−ＰＡＲが同じ細胞で生産される臨床的状況において活性があるものと考えら れる。 もし物質がマウスモデルにおいても陽性であるならば、それは人体においてヒト 癌細胞の侵襲と転移を抑制するであろうことを強く示すものである。 本発明の方法を使用してｕ−ＰＡ／ｕ−ＰＡＲ結合を阻害することが見いだされ た化学物質の一つはスラミンである。スラミン自身は一般に抗癌剤として使用す るには毒性が強過ぎるように思われるが、本発明はスラミンの類似体もしくは誘 導体であって毒性が低く、しかもなおｕ−ＰＡ／ｕ−ＰＡＲ相互反応を阻害する ものは適切な抗癌剤となることを示している。 図についての説明 図１、アフィニティ精製ｕ−ＰＡＲの５ＤＳ−ＰＡＧＥ及び特異的リガンドへの 化学架橋 Ａ）　ＰＭＡ処理ｕ−ＰＡＲ９３７ａ細胞からの膜蛋白含有トリトンＸ−１１４ フラクシヨンは固定化ＤＦＰ処理ｕ−ＰＡを用いるアフィニティクロマトグラフ ィに付した。中性化カラム溶出液を０．１％酢酸に対して透析し、凍結乾燥によ り濃縮した。精製前２Ｘ１８’細胞を表現する蛋白を還元条件下６−１６公配５ ＤＳ−ＰＡＧＥを続けた（レーン１）。ゲルを銀染色した。マーカー蛋白の分子 量（レーン２）を示す。 Ｂ）アフィニティカラム溶出液を希釈して検定の間、１ｎＭのｕ−ＰＡＲのほぼ 等濃度を得た。試料をブレインキュベートのみ（レーン２）又は以下の非標識化 試薬の存在下、１１００ｎの濃度でインキュベートした。ウシ血清アルブミン（ レーン３）、ｔ−ＰＡ（レーン４）、プラスミノーゲン（レーン５）、マウス表 皮性生成因子（レーン６）、ＡＴＦ（レーン７）、活性５４ＫＤｕ−ＰＡ（レー ン８）、ＤＦＰ−不活化５４ＫＤｕ−ＰＡ（レーン９）。室温で１５分間インキ ュベーション後、■−標識化ＡＴＦ（約１ｎＭ）を加え、次いで４℃で１時間イ ンキュベーションした。 インキュベーション後、化学架橋をＤＳＳでなしとげ、その後試料を非還元条件 下、６−１６％公配ゲル上５ＤＳ−ＰＡＧＥ及びオートラジオグラフィにより分 析した。レーン１は、”’Ｉ−ＡＴＦを伴う架橋コントロール及びｕ−ＰＡＲ又 は競合物の不添加を示す。分子量標準蛋白の電気泳動可動性を示す（ｋ　Ｄ）。 Ｃ）中性化アフィニティ力ラム溶出液を（Ａ）におけるように濃縮して、約１５ ｕ９／ｍｌのｕ−ＰＡＲ濃縮物を得、５０μｇ／ｇ７ＤＦＰ−処理ｕ−ＰＡＲ− ＰＡの存在下、ＤＳＳと（レーン３）、又はそれのみ（レーン４）と架橋した。 コントロールとも：精製ｕ−ＰＡＲのみ、化学架橋なしくレーン５）；ＤＦＰ処 理ｕ−ＰＡのみ、化学架橋なしくレーン１）；ＤＦＰ−処理ｕ−ＰＡ、架橋のみ （レーン２）。試料は非還元条件下、Ｐｈａｓｔ−８ＤＳ−ＰＡＧＥを続けた。 ゲルを銀染色した。化学架橋はＤＦＰ−処理ｕ−ＰＡのみの移動速度で少しの増 加となり、多分、内側架橋によるものであるが、ｕ−ＰＡＲのみのものではない 。分子量標準蛋白の電気泳動可動性（レーン６）を示す（ｋＤ）。 図２、精製ｕ−ＰＡＲの酵素脱グリコジル。アフィニテイ精製ｌＮｌ−標識化Ｕ −ＰＡＲを緩和な還元条件下（実験方法参照）変性による脱グリコリルのための 前処理し、ペプチド：Ｎ−グリコシダーゼＦで処理しくレーン２）又は直接分析 した（レーン１）。分析は６−１６％公配ゲル上、還元条件下、５ＤＳ−ＰＡＧ Ｅにより行ない、次いでコダックＸＡＲフィルム上オートラジオグラフィを行な った。標準蛋白の電気泳動可動性を示す（ｋ　Ｄ）。 図３、架橋”’Ｉ−ＡＴＦの脱グリコジル：ＰＭＡ−処理及び非処理ｕ９３７細 胞からのｕ−ＰＡＲコンプレックス。ＰＭＡ−処理（レーン１及び３）及び非処 理（レーン２及び４）細胞を酸処理し、０．５％ＣＨＡＰＳで溶解した。溶解質 を１２５１−ＡＴＦとインキュベートし、ジサクシニミジルスベリン酸塩で架橋 し、緩和な還元条件下変性し、次いでペプチド・Ｎ−グリコシダーゼＦの存在下 （レーン３及び４）又は不存在下（レーン１及び２）、さらにインキュベートし 、還元条件下５ＤＳ−ポリアクリルアミド（６−１６％）ゲル電気泳動により分 析し、次いでオートラジオグラフィに付した。標準蛋白の電気泳動可動性を示す （ｋ　Ｄ）。 図４、化学的交差結合によるリガンド結合υ−ＰＡＲ断片の検出精製ｕ−ＰＡＲ （３０ｇｇ／＋ｎｌ）をキモトリプシン（４０ｒａｇ／ｍｌ）により３７℃で７ 時間処理するか（レーン３）、又は分解することなく直接分析する（レーン２） 。コントロール（レーン１）はバッファーを含み、同じ条件下にキモトリプシン と共に培養した。分析は、６７倍希釈サンプルを１２５１−標識ＡＴＦ（１ａＭ ）と共に培養し、ＤＳＳで交差結合し、還元条件（Ａ）又は非還元条件（Ｂ）で ６〜１６％Ｔグラジェントゲル上の５ＤＳ−ＰＡＧＥに付し、ゲルのオートラジ オグラフィーによって行う。分子状マスマーカータンパクの電気泳動移動性が示 されている。 図５、ｕ−ＰＡＲ断片の電気泳動分解 （Ａ）非分解、精製ｕ−ＰＡＲ（０，４１１ｇＸレーン３）、図４の説明に記載 したようにキモトリプシン処理した精製ｕ−ＰＡＲ（領　４ａｇＸレーン４）又 は同じ条件でキモトリプシン処理したバッファー（レーン２）を還元条件下にト リシン５ＤＳ−ＰＡＧＥ（１０％Ｔ、３％Ｃ）で分析した。ゲルを銀染色した。 マーカータンパクの分子状マス（レーン１と５）が示されている。 （Ｂ）精製ｕ−ＰＡＲを図４の説明に記載されているようにキモトリプシンで分 解した。分解混合物のサンプルをリガンドの不存在下（レーン２）又はＡＴＦの 存在下（レーン３）ＤＳＳによる化学的交差結合に付した。レーン４は化学的交 差結合後のＡＴＦ製品のみを示す。交差結合は、１２μｍ容で行われ、各サンプ ルは領　２７μｇのｕ−ＰＡＲ物質及び／又は領　０５μｇＡＴＦを含んでいた 。ＤＳＳ−処理サンプルと交差結合に付されながったｕ−ＰＡＲ分解混合物のサ ンプル０．２７μｇ（レ−：／１）を還元条件下トＩＪシン５Ｄｓ−ＰＡＧＥ（ １０％Ｔ、３％Ｃ）で分析し、銀染色を行った。分子状マスマーカータンパクの 電気泳動移動性が示されている。 図６、ｕ−ＰＡＲとそのリガンド結合断片の界面活性剤相分離精製ｕ−ＰＡＲを 図４の説明に記載したようにキモトリプシンで分解した。サンプルを１００倍に 希釈し、１％トライトンＸ−１１４の存在下、温度誘導相分離に付した。得られ た水相（レーン３）、界面活性剤相（レーン２）、相分離を行わなかった分離混 合物のサンプル（レーン１）及びブラインドサンプル（すなわち相分離を行わな かったキモトリプシン処理バッファー）（レーン４）を”　Ｉ　−ＡＴＦ（１ａ Ｍ）と共に培養し、ＤＳＳによる化学的交差結合に付した。すべてのサンプルは 、検定の間にＣＨＡＰＳ含有バッファーを加えて最終的に同じ希釈度（１３８倍 ）に調節した。交差結合サンプルを還元条件下に５ＤＳ−ＰＡＧＥに付し、ゲル のオートラジオグラフィーを行った。分子状マスマーカータンパクの電気泳動移 動性が示されている。 図７、リガンド結合断片のデグリコンレーションインタクト、精製ｕ−ＰＡＲ（ レーンＡ１とＢｌ）又はキモトリプシン処理ｕ−ＰＡＲ（レーンＡ２とＢ２）の サンプルを、キモトリプシン濃度を２００　ｎｇ／ｍｌとする以外は図４の説明 に記載した方法で調製した。サンプルを６７倍に希釈し、１２５■−標識ＡＴＦ （１ａＭ）と共に培養し、ＤＳＳによる化学的交差結合に付した。 交差結合サンプルを緩和な変性条件下デグリコシレーションのための前処理に付 しく実施例参照）、ペプチド：Ｎ−グリコシダーゼＦの不存在（Ａ）又は存在（ Ｂ）の下に３７℃、１８時間インキュベートした。生成物を６〜１６％Ｔグラジ ェントゲル上、還元条件下、５ＤＳ−ＰＡＧＥにより分析し、オートラジオグラ フィーに付した。分子状マーカータンパクの電気泳動移動性が示されている。 図８、ｕ−ＰＡＲの内部アミノ酸配列の繰返しとこれら繰返しのＴ細胞活性化タ ンパク／Ｌｙ−６抗原およびイカタンパクＳｇｐ−２の細胞外ドメインとの相同 性 システィン基にはアンダーラインが付されている。略号は次の意義を有する：ｕ −ＰＡＲ１，２及び３、ｕ−ＰＡＲの第１．第２及び第３繰返しくｃＤＮＡ配列 （１８）から導かれたアミノ酸配列の残基１〜９２．９３〜１９１および１９２ 〜２８２）：　Ｃｏ、ｕ−ＰＡＲの３つの繰返しに対する一致した配列；Ｌｙ− ６ａ、Ｌｙ−５ｃ、、Ｌｙ−６抗原／Ｔ細胞活性化タンパク（残基１〜７９と１ 〜７６）（２８〜３１）；　Ｓｇｐ−２、イカグリコプロティンＳｇｐ−２（残 基１〜９２Ｘ３２）；　Ｃｏ、Ｌｙ−６ａ、　Ｌｙ−６ｃおよびＳｇｐ−２に対 する一致した配列。「アンカー」とはグリコホスホリピド尾部に対する付着部位 を示す。疑問符は付着部位がＳｇｐ−２配列との配列によって提案されたもので あることを示す。（３２）。ｕ−ＰＡＲについて、付着部位は、仮に５ｅｔ２８ ２（すなわち示された最後の残基）又は残基Ｇ１ｙ２８３もしくはＡ１ａ２８４ のいずれかに対して与えられた（ブラウグら、提出済）。 示された一致配列において、すべての配列に存在した基は一致基と定義され、変 化し得る位置はＸのマークを付し、メンバー配列のいずれかにおいてギャップを 含む位置はｇのマークを付した。矢印は、制限化キモトリプシン消化の間に開裂 した結合を示す。ｕ−ＰＡＲ繰返しに対する一致配列とＬｙ−６及びＳｇｐ−２ 配列に対するそれとの類似性（システィンのパターンやギャップ部分の存在）に ついて注目されたい。 図９は、酸加水分解後ｕ−ＰＡＲ−ＰＡＲから放れたアミノ酸の陽イオン変換ク ロマトグラフィからの溶出プロフィルを示す。蛋白は、トリトンＸ−１１４デタ ージエンド相分離及びアフィニティクロマトグラフィ（ＤＦ　Ｐ　−ｕ−ＰＡＲ −ＰＡ−１ｒ７　ｙ　ｏ　２）ｉ：、ヨリ、ＰＭＡ刺激ｕ　−Ｐ　ＡＲ９３７細 胞（６Ｘ　１０　’Ｉｍ胞）カラ始めに精製した。純度を改良し、アミノ酸分析 上、低分子量化合物から干渉を排除するために、このレセプター調製物は０．１ ％酢酸に対して徹底的に透析し、凍結乾燥し、次いでトリシン−３ＤＳ−ＰＡＧ Ｅに付し、続いて０．４５μ＋１ＰＶＤＦ膜（８ｃｍＸ８ｃｍ）上電気伝導に付 した。挿入物はクーマシーブリリアントブル−Ｒ−２５０による染色後、固定化 ｕ−ＰＡＲ−ＰＡＲを示す。ｕ−ＰＡＲの可動性の少しの低下がこの実験で見ら れ、凍結乾燥調製物中のツィッターイオンデタージエントＣＨＡＰＳの大過剰に よる。ｕ−ＰＡＲを表わすＰＶＤＦ膜の染色域を切除し、３．３′−ジチオジプ ロピオン酸（ＤＴＤＰＡ）の存在下、１１０’で２０時間、真空で加水分解した 。Ｃｙｓ−Ｘは加水分解の間システィンとＤＴＤＰＡの間で形成される生成物で あり、ＧｌｃＮはグルコサミンであり、ＥｔＮはエタノールアミンである。 図１０は、バシルス・セレウスからのホスファチジルイノシトール−特異性ホス ホリラーゼＣ（ＰＩ−ＰＬＣ）による付着ＰＭＡ−刺激ｕ９３７細胞からの１２ ６１−標識化ＤＦＰ処理ｕ−ＰＡの遊離を示す。始めに内因的に生成したｕ−Ｐ Ａを酸処理によりＰＭＡ刺激ｕ９３７細胞（２Ｘ１０’細胞／皿）から溶出する 。外因的に加えた１２ｓＪ標識化ＤＦＰ処理ｕ−ＰＡ（１ａＭ及び４．５　ｘ　 １０’ｃｐｍ）の結合を、２５ｍＭＨＥＰＥＳ、ｐＨ７，４を含む５＊ｌ血清を 含まないＲＰＭ１１６４０培地中４℃で２時間実施した。細胞をこの緩衝液で３ 回洗浄後、１つの皿を５％ＳＤＳで抽出し、１００％細胞結合放射活性を明らか にし、一方、他をもう一度酸処理して、酸抽出化活性を測定した（このレベルは 縦座標で矢で示す）。２つの皿は各々０．６μ９ＰＩ−ＰＬＣ／謂ｌを受（す（ △）、一つは８μｇ／肩！ホスホリパーゼＡ、を受け（○）、一方、最後の皿は 緩衝液コントロールを構成した（・）。培地の２つのアリコツト（１００μｌ） を容器から、３７℃で撹拌テーブル上でのインキュベーションの間にとり、放出 放射活性を遠心（２０，０００Ｘ９５分間）後、上清中で測定した。試料は図１ １に示すように５ＤＳ−ＰＡＧＥにより後で分析した。 図１１は、コンプレックス形成及びｌ５ｓｌ−標識化ＤＦＰ処理ｕ−ＰＡの５Ｄ Ｓ−ＰＡＧＥによる分子分析及びＰｌ−ＰＬＯによる培地に放出されたｕ−ＰＡ Ｒを示す。図１０に記載される実験からの上清のアリコツトは、非還元条件下、 直接（Ａ）又は続＜１＋ａＭジサクシニミジルスベリン酸塩（ＤＳＳ）と架橋し 、サンプリン後直ちに実施してＣＢ）、５ＤＳ−ＰＡＧＥ（１０％Ｔ、２．５％ Ｃ）により分析した。別の実験（Ｃ）で、２皿のＰＭＡ刺激ｕ９３７細胞を、図 １０の説明に記載されるように培養し、酸処理する。中和後、−皿を５ｓｌの血 清のない培地（２５ｍＭＨＥＰＥＳを含むＲＰＭ１１６４０．ｐＨ７，４）中０ ．６μｆＰ１−ＰＬＣとインキュベートシ、一方、他を５ｓｌの培地のみでイン キュベートした。リノ（−ゼの添加及び直ちに遠心（２０，ＯＯＯＸｇ、５分間 ）後、アリコ・ソトを０分、３０分及び６０分に抜き取りた。上清を１ｔｌｌＩ ｌｌｌ識化ＤＦＰ不活化ｕ−ＰＡ（１ｎＭ）と４℃で１時間ブレインキュベート し、次いで１ｍＭＤＳＳと架橋した。最も右のレーン（ＤＦＰ−ｕ−ＰＡ）はｕ −ＰＡＲの不存在で架橋したｔｔｓｌ標識化リガンドを表わす。試料は上のよう に５ＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した。 図１２は、ＰＩ−ＰＬＯで処理による精製ｕ−ＰＡＲの疎水性性質の変化を示す 。ＰＭＡ刺激ｕ９３７細胞から精製したｕ−ＰＡＲは処理することなく（ＮＯＮ Ｅ）又は全くホスホリパーゼがない（ＭＯＣＫ）か又は２０μｍ／ｓｌ／ＰＩ　 ＰＬＣの存在下（ＰＩ−ＰＬＣ）、５ＱｍＭ）リエチルアミン／Ｈ（Ｊ（ｐＨ７ ，５）、５ｍＭＥＤＴＡ及び０．１％トリトンＸ−１００中、３７℃で３０分間 インキュベートした。一つの試料を５ＱｍＭ酢酸塩（ｐＨ６，０）、１０ｆｉ１ ＭＣａＣ４中キャベ゛ンカ）ら精製した２００μ９／菖！ホスホリパーゼＤと共 に（ＰＬＤ）、そして他は５０ｍＭＨＥＰＥＳ（ｐＨ８，０）、１０　ｔｈ　Ｍ 　Ｃａ　ＣＩ　を中／１チ毒から精製した１００μｇ／−ホスホリパーゼＡ！で （ＰＬＡＮ）インキュベートした。これらのｕ−ＰＡＲ調製品１嘘次いで１％ト リトンＸ−１１４中、温度誘発デタージエント相分離１こ付した。この相分離を 、それぞれ余分のトリトンＸ−１１４及び０．１Ｍ）リス（ｐＨ８，１）の添加 により水及びデタージエント相を得るのに一度繰り返した。最後に、１ｎＭ’！ ５１４＠化ＡＴＦとの架橋分析を水（Ａ）及びデタージエント（Ｄ）相の同時の アリコツト上で実施し、次いで非還元条件下、５ＤＳ−ＰＡＧＥ（１０％Ｔ及び ２．５％Ｃ）により行なった。”’Ｉ−ＡＴＦ／ｕ−ＰＡＲコンプレックス（Ｍ ｒ７０．０００）に相当する領域をポリアミドゲルから切除し、放射活性を測定 した（各レーンの底にＡ＋Ｄで全放射活性の％として示す）。 図１３は、ＧＰＩ−膜沈降の間プロセシング部位が既知である蛋白からのＣ０Ｏ Ｈ末端アミノ酸配列のｕ−ＰＡＲに関し予言されたものに対する（アミノ酸分析 を基礎として、表５）比較を示す。グリコリピドへの付着に含まれるアミノ酸が 目だつ。ＶＳＧ及びＰＡＲＰは変異体表面グリコプロティン及びトリバノゾマ・ プルケイからのプロサイクリック酸性反復蛋白を表わす。ＣＥＡは癌胎児性抗体 である。ＰＬＡＰは胎盤アルクリホスファターゼであり、Ｔｈｙ−１はラット胸 腺細胞から分離した表面グリコプロティンを表わす。 図１４．１２Ｈ１標識化精製ｕ−ＰＡＲの放射免疫沈降。縦座標：％１１１１　 ＋ｕ＋ＰＡＲ沈澱。横座標；免疫／非免疫血清希釈１；７５．１ニア５０．１ニ ア５００及び１ニア５０００゜ バー１−１１は、１）各試料に加えた”’Ｉ−ｕ−ＰＡＲの総量、４４０００ｃ ｐｍ・２）試験管への放射活性の結合のコントロール：３）プロティンＡセファ ロースへの”’Ｉ−ｕ−ＰＡＲの結合のコントロール：４−７）非免疫血清への ４５１−ｕ　ｐＡＲの結合：８−１１）免疫血清への”’Ｉ−ｕ−ＰＡＲの結合 を表わす。 図１５、方法のところで記載したと同じ逆固相ラジオイムノアッセイ。免疫／非 免疫血清による”５Ｉ−ｕ−ＰＡＲのキャッチング。縦座標：　Ｃｐｌ結合、横 座標；抗体の２倍系列の希釈、１：５００−１：３２００．ｘ−ｘ免疫：０−Ｑ 非免疫。 各試料に添加した”’Ｉ−ｕ−ＰＡＲの総量：３３０００ｃｐｍ０図１６、ＥＬ ＩＳＡ、精製ｕ−ＰＡＲを１　＋ｖ／ウェルの濃度で覆った。免疫／非免疫血清 （−次抗体）を１：５００から１：２５６０００の範囲で２倍系列希釈に添加し た。１：５００希釈したペルオキシダーゼ接合二次抗体を用いた。基質はＯＰＤ であった。酵素基質反応からの色彩発達を４９０ｎｍで読んだ。反応１ｔｌＯ分 後停止した。ｙ軸：ＯＤ４９０ｎｍｏｘ軸：免疫／非免疫血清の希釈。ｘ−ｘ免 疫；○−Ｏ非免疫。 図１７、精製ｕ−ＰＡＲに対して作った抗体による細胞性ＡＴＦ結合の阻害。 ５Ｘ１０’ｕ９３７ａ細胞を精製ｕ−ＰＡＲに対して作ったマウス抗血清と共に （・−・）又は、ブタムチンに対して作ったコントロールマウス抗血清と共１ｎ （０−０）４℃で１時間ブレインキュベートし、続いて２．２ｎＭ”’Ｉ−ＡＴ Ｆを加えて、同一温度でさらに１時間インキュベートした。次いで細胞を３回洗 浄し、細胞結合放射活性をガンマカウンターで測定した。横座標は、１：１５３ ，６００力λら１．３００の範囲の最終希釈の、抗血清の２倍希釈系列を表わす 。縦軸Ｃマ抗血清力（存在しないで得た値のパーセンテージとして細胞結合放射 活性を表わす。７００ｎＭ非標識化ｕ−ＰＡによる抗血清の置換は、結合の９０ ％阻害となった。 挿入：ウェスタンプロットは用いた抗血清の反応性を示す。５００ｎｇの精製ｕ 　−ＰＡＲ（レーン２及び４）又は２．５　Ｘ　１０’ＰＭＡ刺激ｕ９３７細胞 力Ａら得たトリトンＸ−１１４デタージエント相（レーン１及び３）を、６−１ ６％公配ゲル上還元条件下５ＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した。そしてウェスタン プロ・ソテイング１よ、１：２５０に希釈した一次抗血清マウス抗−ｕ−ＰＡＲ 血清（レーン１及び２）又１ま同一希釈で上記コントロール血清（レーン３及び ４）として用Ｇまた。 図１８は、ｕ−ＰＡＲに対するポリクローナルウサギ抗体の反応性を証明するウ ェスタンプロットを示す。ＰＭＡ刺激ｕ９３７細胞の溶解質力ＡらのトリトンＸ −１１４デタージエント相の７５μｌ試料はそれだけで（レーン１）、ＤＦＰ処 理Ｕ−ＰＡと混合後（実施例１：最終濃度１０μｇ／冨ｌ）（レーン４）又（よ 同一量のＤＦＰ処理ｕ−ＰＡと混合後、化学架橋しくレーン３）、分析した。コ ントロールとして同一量のＤＦＰ処理ｕ−ＰＡのみを、架橋実施後（レーン５） 又は直接（レーン６）、分析した。レーン２の試料は、７５μｌの細胞溶解質デ タージエント相を含んでおり、ＤＦＰ処理ｕ−ＰＡを添加することな（化学架橋 に付した。試料（嘘シト還元条件下６−１６％公配５ＤＳ−ＰＡＧＥ上で移動し 、次いでニトロセルロース上エレクトロブロッティングした。シートは、ウサギ 抗−ｕ−ＰＡＲ血清からの精製及び吸収１ｇＧ（Ａ）と、又は、同一ウサギから の免疫前血清からの精製及び吸収ＩｇＧ（Ｂ）とインキュベートした。インキュ ベーションの間のＩｇＧ濃度（ヨ、両場合とも１２μｇ７ｍｌであった。シート をウサギＩｇＧに対するアルカリホスファターゼ結合抗体と共に発達させ、次い でアルカリホスファターゼ活性の検出を行なった。 図１９．４つのモノクローナル抗体によるｌ２ｓｌ−標識ｕ−ＰＡＲ（Ｉ）及び Ｕ−ＰＡＲ（Ｄ）の免疫沈澱。 精製ｕ−ＰＡＲ（３０Ｍｇ／ｍｌ）はキモトリプシン（４０ｎｇ／ｍｌ）により ３７℃において７時間処理した。非分解インタクトｕ−ＰＡＲと分解ｕ−ＰＡＲ を１１８Ｉ−ヨードによって放射標識した。３．　５　Ｘ　１０’ｃｐｍ、／＋ １に相当する”’Ｉ−ｕ−ＰＡＲ（１）及び”’Ｉ−ｕ−ＰＡＲ（Ｄ）の量を材 料（Ｍａｔｅｒｉａｌｓ）と方法（Ｍｅｔｈｏｄｓ）に記載されたように免疫沈 澱に付した。すべての抗体溶液は同一濃度（２０ｇｇ／ｍｌ）であった。 Ａ、　”Ｉ　−ｕ−ＰＡＲの免疫沈澱。レーン１〜１０は次のサンプルを表す： 出発物質、Ｐｒｏｔ、　Ａ　５ｅｐｈ、溶液５０ａｌ（コントロール）、アフイ ニテイ精製つサギ抗ｕ−ＰＡＲ血清、アフイニテイ精製つサギ前免疫血清、２Ｒ ，３Ｒ，ＩＲ，４Ｒ，モノクローナル抗体のブール、抗ＴＮＰモノクローナル抗 体（ｎｅｇコントロール）。 Ｂ、”Ｉ−ｕ−ＰＡＲ（Ｄ）。レーン１〜１０は上記と同じ抗体を表す。 図２０、ｕ−ＰＡＲに対して高められた４つのモノクローナル抗体の反応性を示 すウェスターンプロット。 ３Ｘ１０フＰＭＡ−刺激ｕ９３７とｕ９３７ａ細胞から得られたトライトンＸ− １１４デイタージエントを１つの大きなスロットで適用し、６〜１６％グラジェ ントゲル上で非還元条件下５ＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した。分離したタンプく りをニトロセルロースに移し、４つのモノクローナル抗体及びコントロール血清 （マウス抗ｕ−ＰＡＲ血清とマウス非免疫血清）を使用するウェスターンプロ・ ノテイングに付した。 Ａ、ＬＩ９３７細胞からのサンプル。ニトロセルロースシート片を、モノクロー ナル抗体ＩＲ，２Ｒ，３Ｒ，４Ｒを分泌するハイブリドーマからの消費メディア の１：１希釈物（レーン１〜４）、１：５００希釈マウス抗Ｕ−ＰＡＲ血清（レ ーン５）及び１・５００希釈マウス非免疫血清（レーン６）と反応させた。分子 量マーカーが示されている。 Ｂ、ｕ９３７ａ細胞からのサンプル。ニトロセルロースシート片を上記のように インキュベートした。 図２１、精製ｕ−ＰＡＲの定量化を示す２つの抗体サンドウィッチＥＩｊＳＡ０ ＥＬＩＳＡは実施例６に記載したように実施した。捕捉抗体として次のものを使 用した・モノクローナル抗体４Ｒ、トリニトロフェハール（ＴＮＰ）に対するモ ノクローナル抗体、実施例４に記載されたように調製されたｕ−ＰＡＲに対する アフィニティ精製ポリクローナルウサギ抗体及び実施例４に記載されたように調 製サレタ前免疫血清、７１１度２０　ｐｇ／ｍＩ。精製ｕ−ＰＡＲＩｔ、１　： 　５００〜１　：　３２０００（７）範囲で２倍づつ連続的に加えた。検出抗体 は濃度５００ｎｇ／ｍｌのビオチン化モノクローナル抗体２Ｒであり、パーオキ シダーゼ結合アジピンは１：５０００に希釈した。 ７分後酵素基質反応により発色させ、４９０ａｍと５４０ａｍで測定した。 Ｘ軸、精製ｕ−ＰＡＲの２倍づつの連続希釈Ｙ軸：ＯＤ４９０ｎｍ１５４０ｎｍ ０ Ａ：４Ｒ（黒丸）とＴＮＰに対するモノクローナル抗体（白丸）Ｂ　ポリクロー ナルウサギ抗ｕ−ＰＡＲ抗体（黒三角）とウサギ前免疫血清（白三角） 注意：ｕ−ＰＡＲの希釈度１・５００において、ＯＤ値は測定するには高過ぎた 。 図２２は、ｕ９３７細胞上のしに結合したｐによるプラスミノーゲン活性化の動 力学を示す。ＤＦＰ−ｐと抗Ｕ抗体との競合によりＵに特異的に結合しているこ とが証明された、ｐと共に前培養された９３７細胞を、Ｇｌｕ−プラスミノーゲ ン（０，０９〜２．２６μＭ）と共に培養した。プラスミンの生成速度をプラス ミノーゲン濃度に対して二重相反法でプロットした。Ｋｍは０．６７ｊＭとして 決定され、Ｖ　ｗａｘは０．　０４３ｎＭｍｉｎ−’として決定されたが、これ は実験的に決定された細胞結合ｐ濃度７．７ｐＭにおいて、Ｋｃａｔ　５．　５ ｗ１ｎ−’に相当する。 図２３、酸洗９３７細胞を種々の濃度のモノクローナル抗体３Ｒと培養し、細胞 にｐを結合させたときの残留ｐ触媒細胞表面プラスミノーゲン活性化。残留ｐ活 性（すなわちプラスミン産生速度）は、抗体と培養されなかった細胞に比較した ％で示される。示されたデータは３回の独立した実験による平均上標準偏差であ る。 図２４、酸洗９３７ａ細胞をモノクローナル抗体１（パネルＡ）、２Ｒ（パネル Ｂ）、３Ｒ（パネルＣ）および４Ｒ（パネルＤ）の各々２μｇ／ｍｌの存在又は 不存在下３０分間前培養し、ｐｒｏ−ｐ、プラスミノーゲン２及び蛍光性プラス ミン基質Ｈ−Ｄ　−Ｖａｌ　−Ｌｅｕ　−Ｌｙｓ　−７〜アミド−４−メチルク マリンと培養した。 （△）細胞不存在下におけるプラスミン産生、（ロ）抗体と前培養された９３７ ａの存在下におけるプラスミン産生、（）抗体なしの９３７ａの存在下における プラスミン産生。 図２５は、ｃＤＮＡサブクローンｐＨＵＲＯ６から生じたアンチセンスＲＮＡを 用いるヒト結腸腺癌のパラフィン部分へのハイブリダイゼーションを示す。侵襲 ホーカス（ａ及びｂ）における分裂腫瘍腺は、腫瘍細胞のストランドの前縁にお ける細胞へのハイブリッド形成を示す（ｂにおける矢印、ｂはａにおける正方形 領域の拡大である）。密着細胞から成る腫瘍腺において、ハイブリダイゼーショ ン信号は悪性上皮のアルブミン表面における細胞上に位置する（ｃ；矢印）か、 腺の周りの間質組織に存在する細胞上に位置する（ｄ、矢印）。新血管新生の領 域において、開光組織由来と思われる細胞はハイブリッド形成を示す（ｅ）。倍 率：２１６Ｘ（ａ）　、５４０Ｘ（ｂ−ｄ）　、８７０Ｘ（ｅ）。 図２６、結腸腺癌の一例のモノクローナル抗ｕ−ＰＡＲ抗体クローンＲ２による 免疫染色（Ａ）。腫瘍−間質界面（点線）に位置する多数の腫瘍細胞（直線矢印 ）はｕ−ＰＡＲに対し強陽性である。断面における僅かな陽性組織法（曲線矢印 ）についても注目されたい。陰性コントロール（抗ＴＮＰ）抗体（ｂ）について は染色が認められない。 図２７、ｕ−ＰＡとｕ−ＰＡＲの間の結合阻止についての化合物スラミンの効果 は、２種の抗体サンドイッチＥＬＩＳＡとして構成され、実施例９に説明されて いるように実施された物質スクリーニングＥＬＩｓＡで試験された。Ｒ４は２０ μｇ／ｍｌの濃度において捕捉抗体として用いられた。精製ｕ−ＰＡＲは２゜ｎ ｇ／ｍ］の濃度で加えられた。ＤＦＰ−ｕ−ＰＡは最終濃度５ｎｇ／ｍｌとなる ようにブロッキングバッファーと共に又は３倍連続希釈濃度のスマツジとの混合 物の状態で加えられた。検出抗体は、濃度２μｇ／ｍｌのビオチン化抗ｕ−ＰＡ 抗体クローン５であり、パーオキシダーゼ結合アビジンは１：５０００に希釈さ れた。３分後酵素−基質反応により発色させ、４９０ａｍおよび５４０ａｍで測 定された。コントロールとして、検定の種々の工程において反応試剤を省略した ものを使用した。 Ｘ軸、スマツジの３倍連続希釈 Ｙ軸：　４９０ａｍ１５４０ｎｍにおける吸光度ＤＦＰ−ｕ−Ｐ、Ａ単独（△） 　、ＤＦＰ−ｕ−ＰＡとスラミン（ロ）、ブロッキングバッファー（）。 図２８は、＋２５Ｉ標識ＡＴＦとｕ−ＰＡＲの間の交差結合の化合物スラミンに よる阻止をスラミンの存在または不存在下、ＨＥｐ−２細胞分解物中の１２５■ 標識ＡＴＦのｕ−ＰＡＲへの化学交差結合の測定により決定したものを示す。次 のスラミン濃度（ｍｇ／ｍｌ）を使用した二〇（レーン２）、０．１（レーン３ ）、０２５（レーン４）、１．０（レーン５Ｌ２．５（レーン６）、１０．０（ レーン７）。レーン１は、細胞分解物の代わりにバッファーを加え、スマツジを 加えない陰性コントロールを示す。右の方への数はマーカープロティンの分子性 マスを示す。スマツジは、図から明らかなように、ｕ−ＰＡＲとリガンド１２５ Ｉ標識ＡＴＦの間の結合反応を用量依存的に阻止することが見いだされた。スマ ツジ１ｍｇ／ｍｌの濃度においては結合活性は検出されず、０．１ｍｇ／ｍ］の スマリン濃度では結合活性５０％以上の阻止率が得られた。結合活性は、放射標 識共有結合の形成として定義された。 ｐｒｏ−ｕ−ＰＡからＰＡＲへは、エリスら、１９８９に記載されたメカニズム によってプラスミノーゲン活性化を伝達する結合ｐｒｏ−ｕ−ＰＡの活性によっ て決定された。抗体３Ｒは抗体の不存在下に培養したコントロール細胞のプラス ミノーゲン発生速度を２０％まで低下させたが、これは３Ｒが内因的に分泌され たｐｒｏ−ｕ−ＰＡのＰＡＲへの結合を阻止するのに有効であり、またその機能 的活性を証明するものである。 図３０、イン・ビトロおよびイン・ビボで成長した腫瘍細胞のＸ−ガル染色。 細胞と腫瘍は固定し、Ｘ−ガル染色の処理を行った（実施例９参照）。Ａ：ＭＤ Ａ−ＭＢ−４３５ＢＡＧ細胞：　Ｂ　：通路２０におけるＭＤＡ−ＭＢ−４３５ ＢＡＧ細胞、Ｃ１皮下ＭＤＡ−ＭＢ−２３１キセノグラフト：Ｄ：ヌードマウス における皮下ＭＤＡ−ＭＢ−２３１ＢＡＧキセノグラフト通路２゜図３１人ニー 次元ＭＤＡ−ＭＢ−４３５ＢＡＧ腫瘍の冷凍断片。腫瘍組織は冷凍切断処理に付 し、Ｘ−ガル染色を行った（実施例９参照）。腫瘍細胞のみがＸ−ガルにより陽 性に染色された。 ＴＴ：腫瘍組織。ＭＴ　マウス組織。 ３Ｂ−Ｄ＋二次元ＭＤＡ−ＭＢ−４３５ＢＡＧ腫瘍の巨視的外観。Ｘ−ガルによ る全臓器染色。Ｂ：肝臓、Ｃ：膵臓と膵臓：Ｄ：腸管。 ３Ｅ−Ｇ：ＭＤＡ−ＭＢ−４３５ＢＡＧ腫瘍細胞のマウス肺への転移性拡がり。 Ｅ、肺転移の巨視的外観二Ｆ　単一肺転移（矢印）：Ｇ：３Ｆに亘られる肺転移 の組織学的断片、Ｈ，Ｅ、染色、４０Ｘ０３Ｈ：ＭＤＡ−ＭＢ−４３５ＢＡＧ腫 瘍細胞で皮下的に接種されたマウスからの腹水のＸ−ガル染色。 実施例１ ｕ−ＰＡＲの精製および特性決定 物質および方法 ５ＤＳ−ＰＡＧＥ　：特に説明しない場合、５ＤＳ−ＰＡＧＥは、Ｕ、　Ｋ、　 ラエムリの方法［［クリーペイジ・オン・ストラクチュラル・プロテインズ・デ ユアリング・ジ・アセンブリー・オン・ザ・ヘッド・オン・バクテリオファージ Ｔ４Ｊ、ネーチャー、２２７巻、６８０〜６８２頁（１９７０年）］により、］ ６−１６％勾の平板ゲルを使用して実施した。試料の前処理は、非還元条件下で は煮沸せずに実施した。還元条件を使用した場合は、試料を２０１１ＭＤＴＴの 存在で５分間煮沸した。 ファストゲル５ＤＳ−ＰＡＧＥはファスト・ゲル装置（ファーマシア）で既製の １０−１５％勾配ゲルを使用して実施した。電気泳動は製造業者の指示にしたが い実施した。銀染色はホイケスホーフエンおよびデルニックの方法（１９８８年 ）により実施した。 アミノ酸分析またはＮＨ２末端アミノ酸配列決定のため、電気プロットする試料 のトリンンー５ＤＳ−ＰＡＧＥは、シェーガーおよびフォノ・ヤゴフ（１９８７ 年）にしたがい、ミニ・プロチアンＩＩ装置（バイオ・ラド）で、Ｑ、７５ｍｍ の均質な７７％Ｔ、３％Ｃゲルで実施した。スカベンジャーとして１２ｍＭ３− メルカプトプロパン酸を添加したゲル緩衝液中で、ゲルを１５Ｕａ＾で３時間予 備電気泳動した。４ＱｍＭジチオトレイトールを還元剤として含有する試料緩衝 液５０１１１へ、凍結乾燥した試料を直接溶解し、２分間煮沸した。予備電気泳 動に使用したゲル緩衝液を電気泳動用緩衝液と取り換えたのち、６０Ｖで電気泳 動を４時間実施した。 アミノ酸分析またはＮＨｔ末端アミノ酸配列決定のための試料の電気プロッティ ング：電気泳動ののち、半乾燥電気プロッティング装置（ＪＫＡ・インストルメ ンツ、デンマーク）を使用し、トリシン−５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲルを二 フッ化ポリビニリデン（ＰＶＤＦ）膜（ミリポア）上へ電気プロットした。電気 プロットは、０．４ｍＭジチオエリトリトールおよび１０％メタノールを含有す る１０層Ｍ　ＣＡＰＳ　［３−（シクロへキシルアミノ）−１−プロパンスルホ ン酸］中で、ｐＨ１１，０で起こり、０．８Ｉ＾／ｃ１２で２時間実施した。タ ンパク質をローマシーＲ２５０で２分間染色し、短時間脱染色し、ついで水洗す ることにより位置を突き止めた（マッダイラ、１９８７年）。 電気プロットしたタンパク質のアルキル化およびアミノ酸配列決定：ローマシー 染色したタンパク質バンドをＰＶＤＦ膜から切り出し、暗所、室温で、５ｏ■ｙ ホウ酸ナトリウム（ｐＨ８，０）中、２５ｍＭヨード酢酸アミドで１時間処理し た。 反応後、水で十分に洗浄し、アルゴン大気下で乾燥した。乾燥フィルター上のタ ンパク質をアプライド・バイオシステムダ４フフＡ型タンパク質配列解析器で配 列決定した。ＰＴＨアミノ酸誘導体のためのオン・ラインＨＰＬＣ同定システム はカルボキシメチルンスティンの誘導体を含有していた（変換中にアミドメチル 誘導体の脱アミド化によって生成）５この誘導体の正確な同定は、これと平行し て行ったニワトリ・リゾチーム（６番目の残基にシスティンを有する）の調製用 電気泳動、電気プロッティング、およびアルキル化したのち、試験的配列決定に よって確認した。 アミノ酸組成およびアミノ糖の測定：電気プロットしたｕ−ＰＡＲの加水分解の ため、クーマツ−染色し、その位置でアルキル化したタンパク質を含有するＰ　 。 ＶＤＦ膜の領域を、真空下に０．０５％フェノール含有６Ｍ塩酸で１１０℃で２ ０時間処理した。ポストカラム−Ｏ−フタルジアルデヒド同定システムを装備し たウォーターズ・アミノ酸分析装置でアミノ酸分析を実施した（バークホルトお よびジエンセン、１９８９年）。 分析研究のための細胞培養、下記のヒト細胞系を括弧内に示した供給源から得た 。組織球性リンパ腫細胞系Ｕ９３７　（Ｕ９３７ａと命名）　（Ｅ、に、Ｏ，ク リュイトフ、ユニバージティー・ホスピタル・センター、ローザンヌ、スイス） 、この細胞系の変異株（Ｕ９３７ｂと命名）（Ａ、ファトロッシ、リサーチ・ラ ボ・オン・アエロナウティカ・ミリターレ、ローマ、イタリア）、前骨髄性白血 病細胞系ＨＬ−６０（アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣ Ｃ））、膀胱癌細胞系５６３７　（ＡＴＣＣ）　、喉頭表皮癌細胞系ＨＥｐ−２ （ＡＴＣＣ）、表皮癌細胞系Ａ−４３１（Ｅ、ヘルセス、ユニバージティー・オ ン・トロンハイム、ノルウェー）、子宮頚癌細胞系ヒーラ−（ＡＴＣＣ）　、大 腸癌細胞系ＨＣＴ１１６　（ＡＴＣＣ）　、結膜細胞系チヤツク（ＡＴＣＣ）　 、絨毛膜癌細胞系ＪＥＧ−３（Ａ、　／＜ヘリ、ユニバージティー・オン・ヘル シンキ、フィンランド）、羊Ｍ細胞系ＡＶ３　（ＡＴＣＣ）　、線維肉腫細胞系 ＨＴ−１０８０（Ａ、バヘリ）。 Ｕ９３７およびＵ９３７ａおよびＨＬ−６０細胞は懸濁で増殖したが、他のすべ ての細胞は単層で増殖した。ＨＴ−１０８０およびＡ−４３１細胞は、加熱失活 させた１０％０％ウシ胎清を含有するダルベツコの修飾したイーグルの培地で増 殖した。他のすべての細胞系は加熱失活させた５％ウシ胎児血清および２ｍＭＬ −グルタミンを含有するＲＰＭ１１６４０培地で増殖した。すべての培地はペニ シリン２００単位／ｉ１１、ストレプトマイシン２５μｇ／ｍｌを添加した。す べての細胞は５％ＣＯ２を加えた加湿大気下で３７℃で培養した。付着細胞はゴ ムかき取り器で回収した。Ｕ９３７細胞のＰＭＡ誘発は、（０，５〜１）ＸＩＯ ＠細胞／＋＋１の密度で１５０ｎＭＰＭＡで実施した。細胞がプラスチック表面 へ付着する場合は、４日間処理を行った。ＰＭＡ誘発した付着性Ｕ９３７細胞は ゴムかき取り器で回収した。 Ｕ９３７細胞の大規模生産：１リツトルのスピンナーフラスコ中で、２ｍＭＬ− グルタミン、５％ウシ胎児血清（加熱失活）、ペニシリン２００単位／ｍｌ、ス トレプトマイシン２５μｇ／ｍｌを補給した（または抗生物質を加えない）ＲＰ Ｍ１１６４０培地で、Ｕ９３７ａ細胞を（１，０〜１．５）ＸＩＯ’細胞／ｍｌ の密度に達するまで増殖した。各フラスコは細胞培養５００ｍ１を含んでいた。 Ｕ９３７細胞のホルボール−１２−ミリステート−１３−アセテート（ＰＭＡ） 誘発および回収＝１スピンナーフラスコの５００１１１１細胞浮遊液を、新たに 調製した無血清培地１リツトルへ加えた。ジメチルスルホキシドで貯蔵したＰＭ Ａ貯蔵液（１ｍｌ当たりＰＭＡｌｍｇ）１５０＃１を最終濃度１５０ｎＭＰＭＡ に達するまで添加した。培養を１０層の重層細胞培養装置（ヌンク、デンマーク ）へ移し、この装置で３．５日間増殖させた。ＰＭＡ溶液を添加すると、細胞は 分裂を停止し、表面へ付着した。 付着性の少ない多数の細胞をなお含んでいる１、５リツトルの上清を回収した。 一層強く付着している細胞は、装置を０．１％ＥＤＴＡを含有するＰＢＳ　（Ｃ ａ”４およびＭｇ−を含有せず）５００ｍｌで洗浄し、激しく振とうすることに よって回収した。２つの細胞浮遊液をプールして合計２リツトルの回収液を得た 。細胞を遠心によって採取した。 細胞溶解および界面活性剤層分離：　ＰＭＡ刺激したＵ９３７細胞をニールセン らの報告（１９８８年）のように洗浄し、酸処理した。細胞溶解緩衝液２０■１ ［０，１Ｍトリス／ＨＣｌ　（ｐＨ８，１）　、１％トリトンＸ１１４．１０ｍ ＭＥＤＴＡ、１０層ｇ／ｍｌアプロチニン］および１００ｍＭフェニルメチルス ルホニルフルオリドのジメチルスルホキシド溶液０．２ｍｌを、酸処理細胞１０ ＠へ０℃で加えた。懸濁液を完全に混合し、氷上で５分間放置し、再混合してさ らに５分間０℃で放置したのち、４℃、１６０００ｘｇで、１０分間遠心により 液を透明にした。 透明にした細胞溶解物を、３７℃で１０分間インキュベーションして熱誘発によ る層分離処理（ボージャー、１９８１年）をしたのち、２０℃、１８００ｘｇで １０分間遠心によって、界面活性剤層を採取した。上層を棄てた。０．１Ｍトリ ス／ＨＣＩ　（ｐＨ８，１）１８ｍｌを下層（約２ｍ１）へ０℃で加えることに よって洗浄し、ついで完全混合によって透明な単一層の溶液を回復させ、前記の ように加熱・遠心によって層分離を繰り返した。 新しい上層を除去後、０．１Ｍ１−リス／ＨＣＩ　（ｐＨ８，１）の添加により 下層を２０１１１１とした。その後の操作および精製の間に、新たな層分離を避 けるため、３−（（３−コールアミドプロピル）ジメチルアンモニウム）−１− プロパンスルホン酸塩（ＣＨＡＰＳ）（１０％ｗ／ｖ）５００ｇｌを添加して、 透明単一な層の界面活性剤画分を得た。微量の不溶性物質を、４℃で３３００Ｘ ｇ、１５分間の遠心によってこの溶液から除去した。 これと同様な方法で、ただし一層少量の細胞物質を使用して、他の細胞型（前掲 ）から細胞溶解物および界面活性剤層を作成した。すべての試薬量を比例的に減 量した。１実験では１％トリトンＸ１１４の代わりに０．５％ＣＨＡＰＳを細胞 溶解界面活性剤として使用した。この実験では、層分離は起こらなかった。 アフィニティーマトリックスの作成：ｕ−Ｐａ（セロノ）２．５Ｘ１０’ＩＵ　 （約２５ｍｇ）を０．ＩＭＦリス／ＨＣ１（ｐＨ８，１）　、０．１％ツイーン ８０２５ｍ１に溶解した。新しい５００ＩｎＭジイソプロピルフルオロホスフェ −１（ＤＦＰ）のイソプロパツール保存溶液２５０ａｌを添加し、３７℃で４時 間インキュベートし、最初の２時間後、さらに同量のＤＦＰを追加することによ って、酵素を失活させた。 ０．２５Ｍ　ＮａＨＣＯ３，０，５Ｍ　ＮａＣ１，０，１％トリトンＸ−１００ （ｐＨ８，５）に対して０℃で十分に透析することによって反応を停止させた。 容量合計５０ｍ１中の透析した物質を、０．２５Ｍ　ＮａＨＣＯ３，０，５ＭＮ ａＣ１（ｐＨ８，５）（カップリング緩衝液）で新たに平衡化したＣＮＢｒ−活 性化セファロース（ファーマシア）１２．５ｍＭへ結合した。反応を４℃で１夜 道行させ、ＩＭエタノールアミン／ＨＣＩ　（ｐＨ８，０）でマトリックスを平 衡化し、４℃で２４時間インキュベートすることにより反応を停止させた。マト リックス（ＤＦＰ−ｕ−ＰＡ−セファロース）をカップリング緩衝液で洗浄し、 使用前、好適な溶出緩衝液（後出、参照）で予備溶出した。　アフィニティー精 製　Ｕ９３７ａ細胞６Ｘ１０’から得られた透明にした界面活性剤画分を洗浄緩 衝液−１［１１０Ｉｎリン酸ナトリウム、１４０ｍＭ塩化ナトリウム、０．１％ ＣＨＡＰＳ　（ｐＨ７，４）］１容量で希釈し、上記と同じ緩衝液で平衡化した ＤＦＰ−ｕ−ＰＡ−セファロース８ｍｌを含有するカラムでクロマトグラフィー 精製を行った。試料を適用後、カラムを洗浄緩衝液−１で洗浄し、ついで洗浄緩 衝液−２［１０ｍＭリン酸ナトリウム、１Ｍ塩化ナトリウム、０１％ＣＩＡＰＳ 　（ｐＨ７，４）］で洗浄した。カラムを溶出緩衝液［０，１Ｍ酢酸、０．５Ｍ 塩化ナトリウム、０１％ＣＨＡＰＳ　（ｐＨ２，５）］で下方から溶出した。溶 出後、直ちにＯ，１Ｍリン酸ナトリウム、１．０Ｍ炭酸ナトリウム（ｐＨ９，０ ）の好適な容量を溶出画分へ添加することによりｐＨ７，５に調節した。ウロキ ナーゼのＨ５１−標識アミノ末端（ＡＴＦ）断片へ化学的に橋架けし、５ＤＳ− ＰＡＧＥおよびオートラジオグラフィーによって、ｕ−ＰＡＲ含有画分を同定し た。アミノ酸分析またはＮＨ，末端アミノ酸配列決定のため精製したｕ−ＰＡＲ 試料を、領１％酢酸に対して透析し、凍結乾燥した。 １２５■によるタンパク質の標識：ＡＴＦの１２５１−標識を、先の報告と同様 に（ニールセンら、１９８８年）、ただし０．１％トリトンＸ−１００を０．０ １％ツイーン８０で置き換えて実施した。０．１％酢酸に対して透析後、凍結乾 燥によって濃縮した精製ｕ−ＰＡＲタンパク質１．Ｆｕｇを、容量２５１＋１中 、”Ｉ　２５０ｊＣｉで処理して同様の方法によりヨウ素化した。 化学的な橋架は検定・複合体混合物または精製した画分中のｕ−ＰＡＲの１２５ １＝標識ＡＴＦへの橋架は反応を、可溶化した受容体に関して報告した方法にニ ールセンら、１９８８年）と同様に、架橋剤として２ｍＭジスクシンイミジルス ベリン酸（ＤＳＳ）を使用して実施した。５ＤＳ−ＰＡＧＥおよび銀染色による 分析のため、精製したｕ−ＰＡＲのＤＦＰ処理したｕ−ＰＡへの橋架は反応を、 これと同じ方法で、ただし非標識ＤＦＰで処理したｕ−ＰＡをリガンドとして使 用して、実施した。 酵素的脱グリコジル化、細胞溶解物および界面活性剤画分中のｕ−ＰＡＲに対す る脱グリコリル化研究のため、分解前に、受容体を１２５１−標識したＡＴＦへ の化学的橋架は反応により選択的に標識した。 凍結乾燥し、精製したｕ−ＰＡＲは直接放射性ヨウ素化された。　Ｎ−結合した 炭水化物を完全に除去するため、ＳＤＳおよびジチオトレイトールを、それぞれ 最終濃度０５％および１．６ｍＭまで添加して３分間煮沸する緩和な還元条件下 で、試料を変性させた。変性させた試料のアリコート（１０ｐｌ）を、ペプチド −Ｎ−グリコンダーゼＦ　１単位（Ｎ−グリカナーゼ、ゲンザイム）添加または 酵素無添加で、容量合計３０μｌで、２００−ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ８， ６）　、１５％トリトンＸ−１００，１０ＩＩＩＭ１．１０−フェナントロリン （メタノール貯蔵液から添加）を含有するように調節した。脱グリコジル化を３ ７℃で２０時間実施した。ＣＨＡＰＳで溶解後、得られた非分画の細胞溶解物の 研究では、還元のため、ジチオトレイトールの代わりに１００ｍＭβ−メルカプ トエタノールを使用し、脱グリコジル化では、１，１０−フェナントロリンの代 わりにｌＱｍＭＥＤＴＡを含有させた。 脱シアル酸するため、”’Ｉ−ＡＴＦへの橋架は反応によって標識した細胞溶解 物７０ｐ１を０．０５Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ５，０）で２００μｍへ増量した 。混合物の９０μｍアリコートを３３ｎｇ／μｌノイラミニダーゼ（ベーリンガ ーーマンハイム）１４ｕｌまたは無酵素で処理した。脱シアル酸は３７℃で１夜 実施した。 結果： 精製・ＰＭＡ刺激したＵ９３７細胞を酸処理して、表面結合したｕ−ＰＡがあれ ば除去し、緩衝液を含有するトリトンＸ−１１４で細胞溶解した。界面活性剤抽 出物を温度誘発層分離で処理し、単離した界面活性剤層をアフィニティークロマ トグラフィーの原料として使用した。酸溶出物を中和して、直接または０．１％ 酢酸に対する透析により濃縮し凍結乾燥したのち、これを分析した。精製物質の 電気泳動の挙動を第１図に示す。 ５ＤＳ−ＰＡＧＥおよび銀染色のあと（第１Ａ図）、溶出したタンパク質は１本 の幅広いバンドとして約５５〜６０ｋＤａの範囲を含んで移動した。この範囲の 外側では、タンパク質物質は検出されなかった。５ＤＳ−ＰＡＧＥを非還元条件 下で実施すると、同一の見掛けの分子質量を有する単一のバンドが認められた（ 第１ｃ図、レーン５）。 ＡＴＦに対するウロキナーゼの結合活性の分析を、１２５１−標識したＡＴＦへ の化学的橋架は反応、ついで５ＤＳ−ＰＡＧＥおよびオートラジオグラフィーに より実施した。ＡＴＦ結合活性が銀染色可能なタンパク質と一緒に溶出した。Ａ ＴＦと精製タンパク質との間に生成した複合体は、電気泳動の間、７０〜７５ｋ Ｄａの１成分として移動した（第１Ｂ図、レーン２）。部分的に精製したｕ−Ｐ ＡＲで以前に示したように（ニールセンら、１９８８年）、生成した複合体は、 無傷のＰＭＡ刺激したＵ９３７細胞でＡＴＦによって生成した橋架は反応生産物 （成績は示さない）、およびこれと同じ細胞からの未精製の界面活性剤抽出物中 の橋架は反応生産物と判別ができなかった。１１３Ｉ−標識したＡＴＦへの結合 および橋架は反応は、特異的であり、かつ可飽和であった。即ち、この結合は過 剰の非標識ＡＴＦ、活性なｕ−ＰＡ、またはＤＦＰ処理したｕ−ＰＡによって競 合できたが、例えばウシ胎児血清アルブミンのような無関係なタンパク質、また はｔ−ＰＡ、プラスミノーゲン、または上皮細胞増殖因子のような関連タンパク 質では競合が得られなかった（第１Ｂ図）。 精製したタンパク質の機能的完全性および純度を研究するため、橋架は実験を非 標識成分で実施した（第１Ｃ図）。このリガンドが高分子量であるため、精製し たタンパク質自身から５ＤＳ−ＰＡＧＥから明瞭に分離し得る複合体を生じるは ずであるので、この実験ではＡＴＦの代わりに、ＤＦＰ処理したｕ−ＰＡをＵ− ＰＡＲ特異的なリガンドとして選んだ。精製した標品中に存在しているすべての タンパク質物質が、非標識リガンドへ結合できることが認められ（レーン４およ び３を比較）、シたがってｕ−ＰＡＲに対する本質性（ニールセンら、１９８８ 年）、および精製したタンパク質の純粋性が確かめられた。実際、結合能は標品 中で銀染色によって検出され得るタンパク質だけの特性であった。 アミノ酸分析による定量化の結果、６Ｘ１０’細胞からの精製収率はポリペプチ ド６〜９μｇ（ｕ−ＰＡＲ糖タンパク質約１０〜１５ＩＩｇに対応する、後記） であることが判明した。 アミノ酸組成およびＮＨ２末端アミノ酸配列：調製用電気泳動、電気プロッティ ング、およびヨード酢酸アミドによるアルキル化後の精製タンパク質のアミノ酸 組成を第１表に示す。この組成は、注目すべき高含量のシスティン残基を含んで いる。さらにリノン残基の存在が若干少ないことが注目される。使用した分析系 では、アミノ酸以外にもグルコサミンおよびガラクトサミンの定量ができる。グ ルコサミンは加水分解中の損失分を補正すると、タンパク質１モル当たりＮ−ア セチルグルコサミン約３０モルに対応する量で検出された。これに反して、ガラ クトサミンは全く同定されなかった。　酸加水分解後、極めて多数のグルコサミ ン残基が検出可能であること、およびペプチド：Ｎ−グリコシダーゼＦ処理（後 記）によって見掛けの分子質量の著しい減少が生じたことは、Ｎ−結合した炭水 化物の大きい側鎖がタンパク質に存在していることを示している。ガラクトサミ ンが全く検出できなかったことは、この型の〇−−合炭水化物がｕ−ＰＡＲに存 在しないことを示している。然し、アミノ酸分析による検出をまぬがれ得るその 他の〇−結結合オリ精糖存在を除外することはできない。 ２種類のアミノ酸配列決定実験を実施した。第１の配列決定実験では、透析およ び凍結乾燥ののち、アフィニティー精製したｕ−ＰＡＲの直接的なＮＨ，末端配 列決定を実施した。部分配列（第２Ａ表）が得られ、このことは１配列だけが精 製した物質に存在していることを示している。 第２の配列決定実験では、透析し、凍結乾燥し、精製したｕ−ＰＡＲをトリシン −８ＤＳ−ＰＡＧＥにかけ、ＰＶＤＦ膜上へ電気プロットし、クーマシー染色し 、アルキル化して、上記のように切り出して、ついでＮＨ７末端配列決定を行っ た。この配列を第２Ｂ表に示す。 第２表に示されるように、この２つの配列を比較すると、同定したすべてのアミ ノ酸残基が同一であることが判る。また第２の実験だけで同定された３位、６位 、１２位は、すべてシスティンであることが判った。即ち、最初の実験でこれら 位置の同定が何れもできなかったのは、アルキル化が欠けていることに起因して いた。標品中で唯一検出可能なＮＨ２末端配列は、ｕ−ＰＡＲの電気泳動の移動 を伴っていた。したがって、例えばポリペプチド主鎖に伴う低分子量のペプチド 成分の形で隠されている追加的な配列はなかった。　ジョージタウン・ユニバー ジティー・タンパク質データベースによる探索では、ｕ−ＰＡＲＮＨｚ末端アミ ノ酸配列の本質は明らかにならず、また既知のどのタンパク質との際立った相同 性も明らかにならなかった。 アミノ末端は、タンパク質全体のアミノ酸組成と同様にシスティン残基に富んで いる。 プローブ組み立てのためのデータ（実施例２）を第２Ａ表に示した配列から誘導 した。この組み立てのため、アミノ酸配列の６位は試験的にＡｓｎを割り当てた （第２Ａ表の脚注ａ参照）。 グリコジル化：精製した＋２Ｊ−標識したｕ−ＰＡ受容体をペプチド：Ｎ−グリ コシダーゼＦで処理した。この酵素はあらゆる種類のＮ−結合炭水化物を除去す ることができ、その切断部位はアスパラギン側鎖と最も内部のＮ−アセチルグル コサミン残基との間である（クレソチンら、１９８５年）。第２図に脱グリコジ ル化したタンパク質の電気泳動の挙動を示す。Ｎｉ１−標識したタンパク質のオ ートラジオグラフィー後に観察された電気泳動のバンドは、直接タンパク質染色 後に見られるより常に僅かに幅広いバンドを示した。然し、反応が、不均一な５ ５〜６０ｋＤａ受容体（レーン１）を遥かに尖鋭なバンドとして移動する３５ｋ Ｄａだけの脱グリコジル化されたタンパク質（レーン２）へ変えるので、したが って最初の不均一な物質は、すべて同一のタンパク質の変異体を現していること がさらに確認された。 細胞系間のグリコジル化の不均一性および変異：別の実験系で、受容体を含有し ている細胞溶解物からの未精製の界面活性剤画分、または未分画の溶解物を、上 記で使用したのと同一の酵素で処理した。これらの実験では、ウロキナーゼの１ ２５（−標識したアミノ末端断片（ＡＴＦ）への化学的橋架は反応によりにニー ルセンら、１９８８年）、脱グリコジル化反応の前に、ｕ−ＰＡＲの選択的な標 識を実施したにニールセンら、１９８８年）。 第３図から、受容体を精製した細胞溶解物は、７０〜７５ｋＤａのｕ−ＰＡＲ− ＡＦＴ複合体を生じ（レーン１）、これは脱グリコジル化されて約５０ｋＤａの 生産物を生じ得ることが判る（レーン３）。ＡＦＴがＮ−結合炭水化物を含有し ていることは知られていない。即ち、見掛けの分子質量で起こる変化は、前記の 精製したタンパク質で見られた変化と同一であるので、この実験は、認められた 大量のグリコジル化が、事実、これらの細胞の界面活性剤溶解物中で、唯一有意 なＡＦＴ結合成分の特性であるということの独立した証拠を提供した。 刺激されていないＵ９３７細胞抽出物で橋架は反応を実施すると（第３図、レー ン２）、生成した複合体は、ＰＭＡ刺激後に認められるより僅かに高い電気泳動 移動度で再現性をもって移動し、その場合の見掛けの分子質量は７０ｋＤａであ った。然し脱グリコジル化すると、ＰＭＡ処理した細胞および未処理の細胞から の複合体は判別できなくなった（レーン３および４を比較）。したがってＰＭＡ 刺激したＵ９３７細胞から精製した受容体は、無刺激細胞に存在している受容体 のグリコジル化変異体であった。 他の細胞系から得られた界面活性剤による細胞溶解物をＡＦＴへの化学的橋架は 反応によって分析すると、ある場合には、放射能標識した生産物の電気泳動移動 度における変化が観察された。これらの分析で、比較のため、種々の細胞型間の ｕ−ＰＡＲ含量の大きな変化を補正するには希釈要素の個々の調節が必要であっ たにニールセンら、１９８８年）。ただし別々の実験では、希釈が個々の複合体 °の移動に対して影響を与えないことが確かめられた。 上記のパタンを含め、合計４種類の区別できる電気泳動パタンか判明した。以前 報告したようににニールセンら、１９８８年）、細胞系の大多数は、例えばＰＭ Ａで処理しなかったＵ９３７細胞の場合のように７０ｋＤａの単一の複合体バン ドを生じた（第３図、レーン２）。即ち、このパタンは、例えばＡ−４３１表皮 癌細胞、ヒーラ−子宮頚癌細胞、５６３７膀胱癌細胞、ＨＣＴ１１６大腸癌細胞 、ＡＶ３羊膜細胞、ＪＥＧ−３絨毛膜癌細胞、およびチャック結膜細胞で認めら れた。 線維肉腫細胞系ＨＴ−１０８０は第３のｕ−ＰＡＲ変異体を含んでおり、僅かに 低分子量の単一な複合バンドを生じた（約６５ｋＤａ、データは示さず）。 第４のパタンは、精製の原料として使用した株とは異なったＵ９３７９３７細胞 究で見いだされた。ＰＭＡで処理しないと、この株（Ｕ９３７ａと命名する）は 、上記のＵ９３７細胞が示したのと同一の複合体バンドを示した。然しＰＭＡ処 理に対する反応は、再現性を伴って異なっていた。即ち、ＰＭＡ処理したＵ９３ ７ａ細胞は２つの複合バンドを生じた。最高のバンドはＰＭＡ処理したＵ９３５ ５ｋＤａ成分として移動した（データは示さず）。このバンドは可溶化した物質 で橋架は反応後にだけ認められた。無傷の細胞で橋架は反応を実施すると（ニー ルセンら、１９８８年）、最高のバンドだけが存在しくデータは示さず）、シた がって低い方のバンドは細胞内前駆体、または受容体の分解産物を現したもので あり得ることを示唆している。 然し上記の４種類のパタンを現す試料をｕｓｌ−ＡＴＦへ橋架は反応したのち、 酵素的な脱グリコジル化で処理すると、分子量の変化は消失した。生じた複合体 バンドは、親細胞系の本質とは無関係に尖鋭で、５０ｋＤａ成分として移動した （データは示さず）。 即ち、Ｎ−結合グリコシル化は、ＰＭＡ刺激したＵ９３７系の範囲内、およびＰ ＭＡ刺激したＵ９３７系で２つのバンドを生じる分子ｕ−ＰＡＲの不均一性に起 因しているだけでなく、無刺激のまたはＰＭＡ刺激したＵ９３７細胞からのＵ− ＰＡＲ間の電気泳動上の差異、および異なった細胞系間の変異にも起因する（即 ち試験した他の細胞系とＨＴ−１０８０線維肉腫細胞を比較して）。 シアル酸の除去：上述した未精製の界面活性剤画分中のｕ−ＰＡＲのための橋架 は標識方式を、酵素的な脱シアル酸の研究に使用した（データは示さず）。ＰＭ Ａ刺激したＵ９３７細胞からの橋架は界面活性剤画分のノイラミニダーゼ処理に よって、ＡＴＦ−ｕ−ＰＡＲ複合体の見掛けの分子量で約５ｋＤａの減少が生じ た。即ちグリコジル化は数個のシアル酸残基を含んでいた。ＰＭＡ刺激していな いＵ９３７細胞を脱シアル酸実験に使用すると、分子量の変化は疑いもなく存在 するが、若干小さく出現した。然しなから予備的な比較では、シアル酸化はで無 刺激のｕ−ＰＡＲとＰＭＡ刺激された細胞との間の全体的な差異を説明すること はできないことが示唆された。 ［第１表］　トリシン−３ＤＳ−ＰＡＧＥ、ＰＶＤＦ膜上への電気プロッティン グ、およびアルキル化ののちに測定した　アフィニティ−精製したｕ−ＰＡＲの アミノ酸配列 Ａ　ｓ　ｐ／Ａ　ｓ　ｎ　３３．２ （第１表つづき） Ｇ　ｌ　ｕ／Ｇ　ｌ　ｎ’　４３．２ Ｃｙｓ　（Ｃｙｓ（Ｃｍ）として）　２８．４１加水分解中の５％損失を補正 ５加水分解中の１０％損失を補正 ゛アミノ酸標準混合物におけるピローグルタミン酸の生成のため、わずかに過剰 刺激の可能性 ６電気泳動およびプロッティング（３５）の間に通常観察される３０％損失を補 正 ９加水分解中の５０％損失を補正 タンパク質７０ピコモルの加水分解をＰＶＤＦ膜上で、２０時間直接実施した。 残基数を計算し、合計３１０残基と推定した。同一条件下で分析した標準的なタ ンパク質で見いだされる補正要素にしたがい、電気泳動および電気プロッティン グ（Ｍｅｔ）および加水分解中の損失（ＴｈｒＳＳｅｒ、グルコサミン）に対す る補正を実施した。 ［第２表］ｕ−ＰＡＲのＮ−末端アミノ酸配列。括弧内は試験的に分類した同定 を示す。疑問詞は同定しなかったことを表す。脚注がある場合は、最良の推定を 示す。 Ａ、０．１Ｍ酢酸に対して透析し、凍結乾燥後、アフィニティー精製したｕ　− ＰＡＲの直接配列決定。最初の収量は第１段階で７０ピコモルのＰＴＨ−Ｌｅｕ であった。直接配列決定でシスティン残基の同定ができなかったことに注意。 研究番号　１２３４５６７８９１０ アミノ酸残基　Ｌｅｕ　？　？　１ｌｅｔ　Ｇｉｎ　？”　Ｌｙｓ　Ｔｈｒ　Ａ ｓｎＧ１ｙ研究番号　１１　１２　１３　１４　１５　１６アミノ酸残基　Ａｓ ｐ　？　Ａｒｇ　Ｖａｌ　（Ｇｌｕ）　Ｇｌｕ゛＾ｓｎ？ Ｂ、）リシン−３ＤＳ−ＰＡＧＥ、電気プロッティングおよびアルキル化後に得 られた配列。ＰＶＤＦ膜は、平行して実施したアミノ酸分析実験から推定してｕ −ＰＡＲ３５ピコモルを含有している（第１表）。最初の収量は第１段階でＰＴ Ｈ−Ｌ　ｅ　ｕ　１９．５ピコモルであった。反復した収量はＬｅｕｌ、Ｌｅｕ ｌ９、およびＬｅｕ２３に基づき９６％であった。Ｃｙｓはアルキル化したタン パク質におけるカルボキンメチルシスティンのＰＴＨ誘導体の同定を示す。 研究番号　１２３４５６７８９１０ アミノ酸残基　Ｌｅｕ　？　Ｃｙｓ　ｌ１ｅｔ　Ｇｉｎ　Ｃｙｓ　Ｌｙｓ　Ｔｈ ｒ　ＡｓｎＧ１ｙ研究番号　１１　１２　１３　１４　１５　１６　１７　１８ 　１９２０アミノ酸残基　Ａｓｐ　Ｃｙｓ　（Ａｒｇ）Ｖａｌ　Ｇｌｕ　Ｇｌｕ 　（Ｈｉｓ）＾ｌａ　Ｌｅｕ　Ｇｌｙ研究番号　２１　２２　２３　２４　２５ 　２６　２７　２８　２９　３０アミノ酸残基　Ｇｌｎ　？’　Ｌｅｕ　？’　 （Ａｒｇ）Ｔｈｒ　（Ｔｈｒ）Ｉｌｅ　Ｖａｌ？’ｂＡｓｐ？ ”Ａｒｇ／Ｃｙｓ？ ６＾ｒｇ／Ｔｈｒ？ 実施例２ ｕ−ＰＡＲのリガンド結合するドメインの単離および同定実験方法： 精製ｕ−ＰＡＲは、上記と同様に、ホルボール−１２−ミリスタート−１３−ア セタート処理細胞から得た。５ＤＳ−ＰＡＧＥ精製操作および銀染色で検出ｌ能 なすべての蛋白質は上記と同様の化学的橋架試験において非標識ＤＦＰ−処玉ｕ −ＰＡまたはＡＴＦへの結合が可能であった。 酵素分解 キモトリプシン（６７ｕ／ｍｇ）およびトシルフェニルクロロメチルケトン−処 理トリプシン（２５５ｕ／ｍｇ）はワーシントン・ノくイオケミカル・コーポ： −ション、フリーホールド、ニュージャーシイからのものである。エンドプロ・ イナーゼＧｌｕ−ＣおよびＬｙｓ−Ｃ（配列決定用）およびプロメレインはべ・ リンガ−・マンハイム、ＦＲＧからのものである。分解条件の検討１ま精製Ｕ　 −ＡＲ（３μｇ／ｍｌ上記と同様にして得られた中性アフイニテイカラム溶出？ の形態を直接使用した）と、所定のプロテナーゼを希釈列で添加しｔこものを一 ］インキュベートした（８ｎｇ／ｍｌ　〜ｌμｇ／ｍＬまたはＬｙｓ−Ｃの場合 、〜０，２μｇ／ｍｌの範囲の最終濃度）。キモトリプシンによる分解１こ関す る左統的な検討のために、精製ｕ−ＰＡＲを、上記と同様に透析および凍結乾燥 （こ。 り濃縮し、０．０５Ｍ　トリス／ＨＣＬ　Ｏ，０５％ＣＨＡＰＳ、ｐＨ８，１中 １：＃終濃度３０μｇ／ｍｌに再溶解し、ついで（４０ｎｇ／ｍ＋、また１ま所 定の）モトリプシンを添加した。７時間３７℃にてインキュベートした後、分解 をフニルメチルスルホニルフルオリド（メルク、ＦＲＧ）を添加して終了させ、 新Ｉなジメチルスルホキシドの２０ｍＭ保存溶液に添加した。 ｕ−ＰＡＲおよびｕ−ＰＡＲフラグメントのリガンド−結合活性についての化学 的架橋試験 ＡＴＦ　（ひとウロキナーゼのアミノ酸残基番号１〜１３５）はＧ、ガッサニ、 ル・ブチト、イタリーからの好意により贈与された。Ｎ、Ｎ−ジスクシシニミジ ルスベラート（ＤＳＳ）を用いる、＋ｚｓｌ−標識ＡＴＦに対する、未変化また は分解処理ｕ−ＰＡＲの化学的架橋は上記と同様に行った。精製した架橋コンシ ュケートの視覚化は、スラブゲル上しミリ（上掲）による５ＤＳ−ＰＡＧＥ、つ いでオートラジオグラフィーにより行った。 汀　幾つかの実験では、非−標識ＡＴＦをリガンドとして用いた。これらの実験 は、里　蛋白質濃度を所定のものに、電気泳動分析をトリシン−５ＤＳ−ＰＡＧ Ｅおよび銀染色で行う以外は同じ方法で行った（下記実施例４参照）。 ＡＴＦ結合成分の疎水性分析のためのトリトンＸ−１１４相分離未変化またキモ トリプシン処理ｕ−ＰＡＲを、０℃にて０１Ｍトリス／ＨＣ／　１．１％トリト ンＸ−１１４、ｐＨ８，１に希釈し、５分間３７℃にてインキュ升　ベートした 。得られたデタージェントおよび水相を遠心分離によりそれぞれ分離−した。各 相を０．１Ｍトリス／ＨＣＬ　ｐＨ８，１を添加して初期容量にし、そのＰ　後 、ＣＨＡＰＳ　（０，２５％最終濃度）を添加して、あらたな相分離を避けた。 皮　各相におけるＡＴＦ−結合成分の存在は、”’Ｉ−ＡＴＦへの化学的架橋に より交　分析した。 脱グリコジル化分析 酵素的脱グリコリル化のために、＋２５１−ＡＴＦに架橋させた試料を１．５倍 に１　希釈し、領５％ＳＤＳおよび１．７ｍＭジチオスレイトール中で３分間煮 沸し変性させた。変性試料を脱グリコジル化緩衝液を添加してさらに６倍の希釈 し、最ヤ　終濃度の０１１２Ｍりん酸ナトｌＪ’７ム、０．９％トリトンＸ−１ ００，５ｍＭ１゜エ　１０フエナンスロリンおよび３３Ｕ／ｍｌペプチド・Ｎ− グリコシダーゼＦ（Ｎ洋　−グリカナーゼ：ゲンザイム、ボストン、マサチュー セッツ）をそれぞれ含み、ｐＨ８，６，１，１０フエナンスロリンは、２５０ｍ Ｍのメタノール貯蔵溶液で添加した。脱グリコジル化は試料を３７℃で一夜イン キユベートすることにより行った。 アミノ酸配列決定のための成分のフラグメント分析および分離のための電気泳動 技術 アミノ酸配列分析のための分解ｕ−ＰＡＲの試料は、電気泳動の前に凍結乾燥に より濃縮した。銀染色されるゲルの試料は直接分析した。 シエツガーおよびフォノ・ジャガラ（アナリテイカル・バイオケミストリー、１ ６６．１９８７．３６８−３７９）によるトリシン−８ＤＳ−ＰＡＧＥは、１０ ％Ｔ、３％ゲルを用いた以外は上記と同様に行った。銀染色はヒュークショーブ ンおよびダーニングの試薬系（エレクトロフォレイシス、９．１９８８）を用い て行った。 アミノ酸配列決定のためのポリビニリデンジフルオリド（ＰＶＤＦ）膜上の試料 の電気プロッティングは、移動緩衝液のメタノールおよびジチオスレイトールの 濃度をそれぞれ１５％および０．５ｍＭにし、プロッティングを９０分間０．４ ｍＡ／ｃｍ”の電流密度にした以外は、ブラウグら（アナリティカル・バイオケ ミストリー、１８１．１９８９．３３−３９）に記載と同様に行った。アルキル 化は行わなかった。 アミノ酸配列決定 ＮＨ！−末端アミノ酸配列決定は、電気ブロッティングされた蛋白質バンド（上 記）を含むＰＶＤＦ膜の切り出し切片上で直接行った。アプライド・バイオシス テム・プロティン・ンークエンサー、タイプ４７７Ａを使用した。 配列および相同性分析 ｕ−ＰＡＲ中の内部反復、内部反復の多重配列および共通配列の検討はり、パテ ィ（ジャーナル・オン・モルキュラー・バイオロジー、１９８．１９８７．５６ ７−５７７）に記載の方法により行った。ナショナル・バイオメディカル・リサ ーチ・ファウンデーション／蛋白質同定用データベースを隔たりのある相同性の 検索のための適当な方法を用いて相同性につき検索した（Ｌ、パティ、ジャーナ ル・オン・モルキュラー・バイオロジー、２０２．１９８８．６８９−６９６； Ｌ、パティ、セル、６１．１９９０．１３−１４）。この方法では、蛋白質系統 群に特徴的な共通配列の類似性を、被検蛋白質が当該蛋白質群の典型的な特徴を 有するかどうかを決定するために用いた。 結果 ｕ−ＰＡＲの蛋白質加水分解によるリガンド−結合フラグメントの放出リガンド −結合能力に重要なｕ−ＰＡＲの構造的特徴の検討のために、精製レセプターの 試料を、非変性条件下の種々のプロテアーゼの希釈列で処理し、ついで、化学的 架橋試験を用いて、１２５Ｉ標識ＡＴＦに対する結合活性につき分析した（Ｌ、 　Ｓ、ニールセンら、ジャーナル・オン・バイオロジカル・ケミストリー、２６ ３．１９８８．２３５８−２３６３）。 ５種の被検プロテアーゼのうち、トリプシンおよびキモトリプシンは、レセプタ ーのりガント−結合活性を排除し得るが、Ｌｙ　ｓ−Ｃ，Ｇ　ｌ　ｕ−Ｃおよび プロメラインは有効でない。しかし、トリプシンによる処理により、被検の全濃 度にわたって、すべての架橋活性は完全に消滅したが、低濃度のキモトリプシン は、約Ｍｒ３２０００のＡＴＦとのフンシュゲートの形成により証明されるよう に（第４図、レーン３）、異なるｕ−ＰＡＲのリガンド−結合フラグメントを生 成した。 この成分は、上記のＭｒ７０−８００００のコンジュゲートのみを示す未処理の レセプターが試験された場合の試料には存在しない（レーン２）。後者のコンジ ュゲートの強度はキモトリプシン処理試料中で著しく減少し、活性レセプターの むしろ効果的な開裂を示す（下記も参照、より高濃度のキモトリプシンを用いた 場合は、このバンドは完全に消滅した）。他のＡＴＦ−結合生成物は検出されな かった。 ５ＤＳ−ＰＡＧＥが未変化または変化試料で行われたかにかかわらず、電気泳動 パターンは一致した（第４Ａ図と４Ｂ図を比較せよ）：特に、ＡＴＦとｕ−ＰＡ Ｒのキモトリプシン開裂生成物間で形成されたコンジュゲートは同じ見かけＭｒ で移動する。 ５ＤＳ−ＰＡＧＥおよび銀染色によるキモトリプシン処理試料の直接分析は非常 に簡単な開裂パターンを示した（第５Ａ図）。原料から生成された未変化のＵ− ＰＡＲは不均質性成分として移動し、Ｍｒ５０−６５０００にまたがり（レーン ３）、この不均質性はＮ−結合炭水化物中の変化形によるものである。キモトリ プシン処理は、鋭いバンドとして移動するＭｒ１６０００の１個の主要フラグメ ントおよびＭｒ３５−５００００範囲の不均質性成分の出現をもたらし、これは 分子中の残部を示すものであると思われる（すなわち、Ｍｒ約１６０００７ラグ メントの除去によって分解された出発物質）（レーン４）。さらに、少量の未変 化のｕ−ＰＡＲがこの試料中に見られ、上記で観察された残存しているりガント −結合活性に結び付く。 このパターンは、リガンド−結合ｕ−ＰＡＲ分解生成物がＭｒ１６０００フラグ メントに一致することを示唆し、それゆえ、この分子量はＡＴＦ　（見かけＭｒ １８０００）との−コンジュゲートＭｒ３２０００の形成と一致する。しかし、 別に、架橋活性は銀染色によって検出されない痕跡のフラグメントにより得られ るものかも知れない。この可能性を検討するために、架橋実験を非標識成分で行 い、ついで、生成したコンジュゲートの５ＤＳ−ＰＡＧＥおよび銀染色を行った （第５Ｂ図）。 キモトリプシン処理試料（レーン１）の電気泳動像は、リガンドが添加されなか ったとき、架橋工程の実施により影響されなかった（レーン２）。一方、ＡＴＦ の存在下で架橋が行われたとき（レーン３）、独特のＭｒ３２０００生成物が形 成されたが、Ｍｒ１６０００バンドはほとんど消滅した。この試料中にＭｒ２０ ０００領域に数個の斑点が観察されたが、これは余剰に添加されたＡＴＦによる ものであり、これは使用した電気泳動システム中の電気泳動移動度とともに移動 した（レーン４）。 すなわち、Ｍ　ｒ　３２０００コンジユゲートは銀染色によりはっきりと検出さ れ、この形成はＭｒ１６０００フラグメントの消失を伴うものであるから、この 開裂生成物は直接リガンド−結合活性に対応するものである。 ゛より高濃度のキモトリプシン（０，２−１μｇ／ｍ１）を用いるｕ−ＰＡＲの 分解は、還元条件下で５ＤＳ−ＰＡＧＥ中Ｍ　ｒ　１３０００成分だけ移動する 追加の銀−染色フラグメントの出現をもたらす（データは示さず）。キモトリプ シン希釈列の使用は、この生成物がリガンド−結合フラグメントのさらなる分解 から生じるものであることを示している。この生成はＭｒ１６０００成分の消失 を伴うものであるが、より大きなフラグメントは分解されない。ｌ！ｌ　Ｉ　− ＡＴＦ架橋試験を用いて平行分析を行うと、Ｍｒ１３０００フラグメントを示す コンジュゲートは検出され得なかった。銀−染色ゲル上のＭｒ１６０００フラグ メントの分解的消失は、架橋試験における、Ｍｒ３２０００放射能標識コンジュ ゲートの消失を伴う。一方、新規の放射能標識バンドは出現しない。すなわち、 リガンド−結合能力が失われたことを示している。Ｍｒ７０−８００００の架橋 生成物もまた次第に消失し、キモトリプシン１μｇ／ｍ１ｕ−ＰＡＲの処理後全 く存在しない。従って、この実験はまた、Ｍｒ７０−８００００架橋ＡＴＦ−コ ンジュゲート（第４図）が専ら、より少量のキモトリプシンによる処理後に残っ ている、未変化のｕ−ＰＡＲにより形成され、銀染色ゲル上でまた高濃度キモト リプシンで変化しなかったＭｒ３５−５００００によって生成したものでないこ とを確認するものである。 リガンド−結合フラグメントの同定 精製ｕ−ＰＡＲ約２０μｇを、上記で用いたＭｒ１６０００フラグメントの生成 条件と同じ条件下でキモトリプシン（４０ｎｇ／ｍｌ）で処理した。試料は凍結 乾燥により濃縮し、第５図で採用したのと同じシステムを用いて、トリシン−８ ＤＳ−ＰＡＧＥにかけた。ゲルは、ＰＶＤＦ膜上に電気プロットし、クーフシ− 染色後、下記の染色領域を膜から切り出した（第５Ａ図の平行電気泳動パターン の矢印参照）：　Ｉ）Ｍｒ１６０００開裂生成物；ＩＩ）Ｍｒ３５−４５０００ 領域に対応する染色領域、すなわち、残存する未分解ｕ−ＰＡＲを除き、より大 きな開裂生成物を含む領域。 切り出したポリペプチドをＮＨ２−末端アミノ酸配列決定にかけ、第３表に示す 配列を得た。各場合とも唯一の配列のみであった。Ｍｒ１６０００フラグメント は上記の未変化ｕ−ＰＡＲのＮＨ２−末端と同じＮＨｚ−末端を有するが、より 大きな開裂生成物は、未変化の蛋白質の残基番号８８にＮＨ，−末端を有し、Ｕ −ＰＡＲの完全なアミノ酸配列と比較することにより同定され、ｃＤＮＡ配列決 定から推定された（ロルダンら、１９９０）。 開裂後の親水性度および解離 温度誘発トリトンＸ−１１４相分離（Ｃ，ボーディエ、ジャーナル・オン・バイ オロジカル・ケミストリー、２５６．１９８１．１６０４−１６０７）は、未変 化のｕ−ＰＡＲをデタージェント相に導くことを示した。この親水性度はＣ００ Ｈ−末端グリコンルーホスファチジル−イノシトールグリコリピド膜アンカーの 存在によるものである（実施例３）。リガンド−結合ｕ−ＰＡＲフラグメントが 共有結合力により、分子の残部に付着したままであるかどうか、または非−変性 条件下で解離し得るかどうかを分析するために、キモトリプシン−処理、精製ｕ −ＰＡＲをデタージエント相分離にかけ、得られた相を”Ｉ−ＡＴＦ架橋試験で 分析した（第６図）。Ｍｒ７０−８００００の放射能標識コンジュゲート（すな わち、１２５１−ＡＴＦと消化後の残存未変化ｕ−ＰＡＲの付加物）はほとんど 専ら、デタージエント相中で形成されたが、一方、Ｍｒ３２０００コンジュゲー ト（リガンド−結合ｕ−ＰＡＲフラグメントの活性を示す）は水相でのみ観察さ れた（レーン２と３を比較せよ）。前者の知見は相分離の内部標準を提供するも のであり、さらに、Ｃ００Ｈ−末端の、疎水性特質は、例えば、混濁しているホ スフォリパーゼや検出されない蛋白質分解が生じても失われないことを確証する ものである。従って、水相中のＮＨ２−末端の、リガンド−結合フラグメントの 独占的出現は、このフラグメントが、変性剤不存在下でＣ００Ｈ−末端の、グリ コリピド含有部から解離したものであることを示している。 グリコジル化 ｕ−ＰＡＲは、酵素ペプチド：Ｎ−グリコシダーゼＦで処理して除去し得る、多 量のＮ−結合炭水化物を含む（上記参照）。キモトリプシン−処理ｕ−ＰＡＲに 架橋した”’Ｉ−ＡＴＦを含む試料をこの酵素で処理したとき（第４図）、Ｍｒ ３２０００コンジュゲートを脱グリコジル化され、Ｍｒ約２５０００のコンジュ ゲートを生成させる（レーンＡ２とＢ２を比較せよ）。未変化のｕ−ＰＡＲで形 成するコンシュケート（レーンＡＩ）はＭｒ５００００生成物（レーンＢｌ）に 変換する。上記参照。すなわち、リガンド−結合ｕ−ＰＡＲフラグメントが脱グ リコジル化される。 すなわち、ｒ１６０００のＵ−ＰＡＲのキモトリプシン分解フラグメントが生成 し、これは、少なくとも、定性的に、リガンドに対する結合能力を維持している 。定量的結合性の検討は、入手した量では不可能であったが、１ＨＭで存在する 放射能標識リガンドでインキュベート後、すなわち、未変化レセプターの結合活 性の証明に最適であることがすでに判明しているのと同じ条件を用いて（上記参 照）、化学的架橋により示された。 アミノ酸配列決定はりガント−結合フラグメントが、非開裂ｕ−ＰＡＲと同じＮ Ｈ，−末端を有し、開裂は、未変化蛋白質のＴｙｒ８７と５ｅｒ８８の間で生じ たことを示した。後者のアミノ酸残基は、観察された唯一の別の分解生成物（す なわち、より大きい、非−リガント−結合成分）中の単一の検出可能なＮＨ！− 末端を構成しており、著しい開裂特異性を示す。このより大きいフラグメント中 の分子量の不均質性は親の蛋白質の分子量不均質性を示しており（第５Ａ図）、 これは、すでにグリコジル化変形体によるものであることを示した（上記参照） 。 リガンド−結合フラグメントは多分全配列１〜８７にわたっているが、新規のＣ ００Ｈ−末端に近い別の開裂は排除され得ない（直接確認されなかった）。５Ｄ Ｓ−ＰＡＧＥにより分析されたこのフラグメントのみかけの分子量は、８７個の アミノ酸残基フラグメントにつき予想されたものより幾分高いものであったが、 この矛盾はＮ−結合炭水化物の存在により説明され得た。すなわち、脱グリコジ ル化後、”’Ｉ−ＡＴＦおよびリガンド−結合フラグメントのコンシュケートは 、ＡＴＦと８７個のアミノ酸残基成分間で形成される付加物の予想される大きさ に良く一致するＭｒ２５０００コンシュケートとして移動する。 今回の検討で観察されたすべての特徴は、ＮＨ２−末端、Ｍｒ１６０００フラグ メントが、ｕ−ＰＡＲ内のあきらかな構造的および機能的ドメインを構成するこ とを示唆している。すなわち、それははっきりと範囲の限定されたりガント−結 合フラグメントであり、緩和なプロテアーゼ処理により分離される。このフラグ メントと＋２ｓ■　ＡＴＦにより形成されたＭ　ｒ　３２０００架橋コンシユケ ートは、非減成試料処理後に５ＤＳ−ＰＡＧＥ中で観察され得たものであるから （第４Ｂ図参照）、蛋白質の残部にジスルフィド−結合したものではない。さら に、トリトンＸ−１１４相分離にかけたとき（すなわち、非変成条件下）、それ は蛋白質の残部から解離し、デタージエント結合がないことは、それが水可溶性 であることを示唆する。その結合能力は同じ実験におけるデタージエント相分離 後に示され得たものであるから、最終的に、リガンドを結合する能力は、少なく とも定性的には蛋白質の残部とは独立している。 Ｍｒ１６０００フラグメントがはっきりした構造的ドメインとしての性質を示す という実験的知見はｕ−ＰＡＲにおける内部の相同性の分析に一致する。この分 析は、レセプターのアミノ酸配列が、ｃＤＮＡ配列決定から帰結され（ロルダン ら、１９９０年）、システィン残基の特徴的なパターンによって特徴付けられる ３個の繰返しく繰返し１．１−９２残基；繰返し２．９３−１９１残基：繰返し ３．１９２−２８２残基）を含むことを明らかにした（第８図）。この配列にお いて、第２および第３の繰返しの配列は２２％の一致を示す；第２の繰返しの１ ０個のシスティンすべてが第３の繰返しのすべての１０個のシスティンと一致す る。第１の繰返しはより離れた関係にある（第３および第２の繰返しと、それぞ れ１２および１６％の一致）：その８個のシスティンのうちの７個は他の２個の 繰返しのものと一致する。これらの知見は、ｕ−ＰＡＲが３個の構造ドメインで 組織されていることを意味する；観察された機能的活性フラグメントは実験的に 第１の繰返しに対応し、繰返し一間結合の開裂により遊離される（第８図）。 この提案されたドメインの構造はまた、ｕ−ＰＡＲのキモトリプシン分解の著し い特異性を説明するものである（すなわち、蛋白質分解に対する、このドメイン を接続させるヒンジのような流動性ペプチドセグメントの一般的感受性による） 。 ｕ−ＰＡＲ内の３個の繰返しの存在は、レセプターが先祖のドメインの内部的３ 重複写の結果として生じたものであるとを示唆している。実際、蛋白質配列デー タベースの検索ではこのシスティンリッチ単位の単一の複写のみを処理する数個 の相同性蛋白質を確認した。Ｔ−細胞活性化蛋白質の細胞内部分／　Ｌ　ｙ　６ 抗体（Ｋ、Ｐ、ルクレアら、ＥＭＢＯジャーナル、５．１９８６．３２２７−３ ２３４；パルフリーら、イムノジェネティクス、２６．１９８７．３８９−３９ １：パルフリーら、ジャーナル・オン・イムノロジー、１４０．１９８８．３０ ５−３１０；Ｈ，レイザーら、プロシーディング・オン・ナショナル・アカデミ −・オン・サイエンス　Ｕ、Ｓ、　Ａ、８５．２２５５−２２５９）およびＬｙ −６関違いか蛋白質Ｓｇｐ−２（Ａ、　Ｆ、　ウィリアムら、イムノジエネティ クス、２７．１９８８．２６５−２７２）はｕ−ＰＡＲの内部の繰返しに関連す る（第５図）。 興味あることに、ｕ−ＰＡＲ同様に、これらの蛋白質はグリコシルーホスファチ ジル−イノシトールアンカーにより細胞膜に付着している（Ａ、Ｆ、　ウィリア ムら、イムノジエネティクス、２７．１９８８．２６５−２７２　；　Ｊ、Ｗ　 ハンメルバーガーら、バイオケミカル・アンド・バイオケミカル・リサーチ・コ ミュニケーション、１４８．１９８７．１３０４−１３１１）。ｕ−ＰＡＲ見ら れる繰返し型の単一の複写との相同性グリコホスホリピド−アンカー蛋白質の存 在はこれらのドメインの構造的独立性を強調するものである。さらに、この新規 なドメイン群の各構成員の同数のシスティンの存在はシスティンがドメイン内の ジスルフィド結合と関連するとの推定に一致する。ｕ−ＰＡＲ分子内の２８個の システィンから８個のみが、推定されたｕ−ＰＡＲのアミノ酸配列の番号１−８ ７残基内に存在するのであるから、ジスルフィドブリッジがｕ−ＰＡＲの結合ド メインと蛋白質の残部間に存在しないという事実は前者のジスルフィド構造の検 討を著しく容易にする。 Ｍｒドメインのさらなるキモトリプシン分解開裂はりガント−結合活性を消失さ せる。Ｍｒ１３０００生成物が還元条件下で５ＤＳ−ＰＡＧＥにより示されるの であるから、この第２の開裂はＭｒ１６０００ポリペプチドの一方のより末端近 くで生じた。入手し得た量が非常に少なく、Ｍｒ１３０００生成物のＮＨｔ−末 端アミノ酸配列決定が不可能であったので、関連する開裂部位がＭｒ１６０００ フラグメントのＮＨｌ−またはＣ０ＯＨ末端内に存在したかどうかはわからない 。この第２の減成段階に含まれる領域はＭｒ１６０００ドメインの結合活性にと って重要には違いないが、それが、直線結合決定素を含むかどうか、配座効果が 観察された活性の消失に対応するかどうかの立証は残されている。 ｃＤＮＡ配列決定から帰結されたｕ−ＰＡＲアミノ酸配列配列ルダンら、１９９ ０年）はＮ−結合グリコシル化のための潜在的な５個の部位を含む；しかじ、こ れらのうちのどれが実際に成熟蛋白質中でグリコジル化されるのかは決定されて いない。これらの部位の唯１個、すなわち、Ａｓｎ５２は残基番号１−８７の領 域内に存在するから、ここで報告した脱グリコジル化実験はこのグリコジル化残 基としてこのアスパラギンを確認するものである。しかし、前記の炭水化物に基 づく差異は、ＰＭＡ刺激後のＵ９３７細胞の２種の異なる株を比較したときに、 ｕ−ＰＡＲの電気泳動パターンで観察され、リガンド−結合ドメインとは関係し なかった。ｕ−ＰＡＲ試剤は細胞の２種の株のいずれかから精製され、いずれの 場合もキモトリプシン処理で５ＤＳ−ＰＡＧＥで鋭いバンドとして移動する、Ｍ ｒ１６０００リガンド−結合フラグメントを生成する。親の蛋白質問電気泳動的 差異はより大きな（すなわち、非−リガント−結合）生成物（データは示さず） を生じ、各試剤内の不均質性は上記で論じた。 プラスミン−仲介細胞表面蛋白質加水分解（Ｖ、エリスら、ジャーナル・オン・ バイオロジカル・ケミストリー、２６４．１９８９．２１８５−２１８８　；Ｒ 。 Ｗ、スティーブンズら、ジャーナル・オン・セル・バイオロジー、１０８．１９ ８９．１９８７−１９９５）において、ｕ−ＰＡＲに関係すると思われる機能的 重要性は、この相分離リガンド−結合ドメインを有効な可溶性ｕ−ＰＡＲ拮抗剤 としての価値ある試薬となす。すなわち、ｕ−ＰＡの結合に対してｕ−ＰＡＲと 競合する可溶性分子は、細胞侵入における細胞表面プラスミノーゲン活性化の検 討の重要な手段になり（Ｌ、オソースキー、ジャーナル・オン・セル・バイオロ ジー、１０７．１９８８．２４３７−２４５５．Ｖ、Ｊ、ヒヤリングら、キャン サー・リサーチ、４８．１９８８．１２７０−１２７８）　、これらのプロセス の妨害のための治療的可能性を有し得る。 箪３表 キモトリプシン分解ｕ−ＰＡＲフラグメントのＮＨ，−末端アミノ酸配列および 未変化のｕ−ＰＡＲの部分的配列Ｍ　ｒ　１６０００フラグメント””　ＬＲ？ ＭＱ？（Ｋ）ＴＮＧＤ？ＲＶＥＥ？Ａ？Ｇｕ−ＰＡＲ残基１−２０”　ＬＲＣＭ ＱＣＫ　ＴＮＧＤＣＲＶＥＥＣＡＬＧＭ　ｒ　３５−５００００フラグメント” ”　５Ｒ３ＲＹＬＥ？（Ｉ）Ｓ？ｕ−ＰＡＲ残基８８−９８”　５ＲＳＲＹＬＥ ＣＩ　５Ｃ１）　（）は同定が不確かであることを示す。 ？は同定が行われなかったことを示す。 ２）　電気ブロッティングされたＭｒ１６０００ｕ−ＰＡＲフラグメントの自動 配列決定による決定（第５Ａ図のバンドＩ）。初回収率は段階１でＬｅｕ２４１ ）＋１１０１であった。Ｇｌｙに基づく、反復収率（１０およびは２０段階）は ９６％であった。他の配列は検出されなかった（配列決定限界２ｐ■ｏｌ）。 ３）　電気ブロッティングされたＭｒ３５−５００００ｕ−ＰＡＲフラグメント の自動配列決定による決定（第５Ａ図のバンドＩＩ）。初回収率は段階１でＳ　 ｅ　ｒ　２９ｐｍｏｌであった。Ｓｅｔに基づく、反復収率（１，３およびは１ ０段階）は９０％であった。他の配列は検出されなかった（配列決定限界２ｐ＋ ａｏｌ、　Ｇ　１　ｕおよびｃｒｙにつき３　ｐｏｏｌ）。 ４）　未変化の蛋白質（１７）およびｃＤＮＡ配列決定（１８）のＮＨｆ１−末 端アミノ酸配列決定から得られた配列 ５）　ｃＤＮＡ配列決定（１８）から帰結される配列。先行する残基（すなわち 、番号８７）はチロシンである。 実施例３ ｕ−ＰＡＲはグリコシルーホスファチジルイノシトール・アンカーを有し、Ｃ− 末端でプロセスされる 物質および方法： 物質： ＰＶＤＦ膜（イモピロン−Ｐ）はミリボアから、Ｎ’、Ｎ”−ジメチル−Ａｒｇ はシグマから、Ｎｗ−モノメチル−Ａｒｇはカルビオケムから入手し、Ｎ”、Ｎ １−ジメチル−ＡｒｇはＴ、オガワ博士（徳島大学、日本）の好意により贈与さ れた。エタノールアミンはメルクから入手した。Ｎａ”’Ｉ、［９，１０（ｎ） 　−３Ｈコーミリスチン酸（５３Ｃｉ／ミリモル）、ミオ−［２−”Ｈ］イノシ トール（１８，３Ｃｉ／ミリモル）、［１−”Ｈ］エタノールアミン塩酸塩（１ ９Ｃｉ／ミリモル）はアマ−ジャムから入手した。 タンパク質： ヒトおよびウシ赤血球からのアセチルコリンエステラーゼ、ミツバチ毒液からの ホスホリパーゼＡ２、ウシ脳からのミニリン塩基性タンパク質はシグマから入手 した。キャベツからのホスホリパーゼＤおよびバシラス・セレウスからのホスフ ァチジルイノシトール特異的なホスホリパーゼＣ（ＰＩ−ＰＬＯ）はベーリンガ ー・マンハイムから入手した。ｕ−ＰＡＲは実施例１で示したようにＰＭＡ刺激 したＵ９３７細胞から精製した。活性なヒトｕ−ＰＡはセロノから購入し、報告 したようにＤ’ＦＰで阻害しただ（ニールセンら、１９８８年）。ｕ−ＰＡのア ミノ末端（ＡＴＦ）はＧ、カサニ博士（レペチット、イタリア）から好意的に贈 与された。ＡＴＦ、ｕ−ＰＡＲおよびＤＦＰ失活させたｕ−ＰＡは、報告したよ うに放射能標識したにニールセンら、１９８８年）。ただしｕ−ＰＡＲの場合は 、０．１％（ｖ／ｖ）トリトンＸ−１００の代わりに０．１％（ｗ／ｖ）ＣＨＡ ＰＳで、またＡＴＦおよびＤＦＰ−ｕ−ＰＡの場合は、０．０１％（ｖ／ｖ）ツ イーン８０で置き換えた。ヒトｕ−ＰＡＲに対するポリクローナル家兎抗体の作 成は実施例１１で説明したようにして実施した。 無傷なＵ９３７細胞のホスホリパーゼ処理：付着性のＰＭＡ刺激したＵ９３７細 胞（約２Ｘ１０’／皿）を、まず２５＋ａＭＨＥＰＥＳを含有する無血清ＲＰＭ Ｕ１６４０培地（ｐＨ７，４、緩衝液Ａ）で洗浄した。ライで細胞を、５ＱｍＭ グリシ：／／ＨＣＩ、Ｏ，ＩＭ　ＮａＣ１（ｐＨ３゜０）で室温で３分間酸処理 して、内因的に生産されたｕ−ＰＡをすべて解離し、その受容体へ自己分泌のや り方で結合させた。０．５Ｍ　ＨＥＰＥＳ、Ｏ，ＩＭ　Ｎａｃｌ　（ｐＨ７，５ ）の０．２容量で中和後、直ちに上清を除き、細胞を緩衝液Ａで２回洗浄した。 幾つかの実験では、外来性に添加した１ｔｌｉ−標識したＤＦＰ−ｕ−ＰＡ　（ １ｎＭ）を未標識のｕ−ＰＡＲへ緩衝液Ａ中で４℃で２時間インキュベーション により再結合させ、リガンド無添加のこれと同一の緩衝液で３回洗浄した。これ らの付着性Ｕ９３７細胞の種々のホスホリパーゼとのインキュベーションを、緩 衝液Ａ中、３７℃で振とうテーブル上で実施した。 生体内標識： 実施例１の報告と同様に細胞培養を実施した。ｕ−ＰＡＲの発現を増大させるた め、ヒトＵ９３７細胞（５Ｘ１０’細胞／皿）の代謝的標識に先立ってＰＭＡ（ １５０ｎＭ）で５時間刺激した。［３Ｈ］エタノールアミンおよび［３Ｈ］ミリ スチン酸で標識するため、細胞をＲＰＭｌ　１６４０培地で培養し、ミオ−［３ Ｈ］イノシトールによる標識はイーグルの最少必須培地で実施した。どちらの培 地とも、２ｍＭＬ−グルタミン、５１０Ｍピルビン酸ナトリウム、２００単位／ ■ｌペニシリン、２５　ｐｇ／ｍ１ストレプトマイシン、２５ｍＭ　ＨＥＰＥＳ 　（ｐＨ７，４）　、０゜５１ｇ／ｍｌ脱脂ＢＳＡ、４×規規定度の非必須アミ ノ酸類を補給した。すべてのトレーサーは、２５＋ａｇ／ｍｌ脱脂ＢＳＡ、０． １Ｍ　ＨＥＰＥＳ　ＣｐＨ７，４）の貯蔵溶液から、最終濃度０．１ａ＋Ｃｉ／ ｍｌで培地１０ｍ１に添加し、代謝標識を３７℃で１５時間進行させた。ついで 付着細胞を酸処理し、１％前濃縮したトリトンＸ−１１４，０，１Ｍトリス（ｐ Ｈ８，１）　、１０μｌｇ／ｍｌ）ラジロール、１ｍＭＰＭｓＦ。 および０．２１ＭＺｎＣｌ２の水冷溶液５ｍｌで洗浄し、細胞溶解した。最後に 界面活性剤層分離を実施例１で報告したように実施した。 生合成的に標識したｕ−ＰＡＲの免疫沈降：透明な界面活性剤層の２ｍＩアリコ ートへ免疫前家兎１ｇＧ１２μｇを添加し、混合物を４℃で２時間インキュベー トした。０１Ｍトリス（ｐＨ８，１）　、０．１％ＣＨＡＰＳ、および領１％脱 脂ＢＳＡへ、プロティンＡセファロース（ファーマンア）を５０％（Ｖ／Ｖ）で 懸濁した液１００Ｉｌｌを添加したあと、同時混合しながら４℃でインキュベー ションを２時間続けた。遠心（５０００ｘｇ、５分間）によって上清を回収し、 ポリクローナル抗ｕ−ＰＡＲ家兎１ｇＧ１２ｇｇを添加してインキュベーション を４℃で１夜進行させ、最後にプロティンＡセファロースの新しいアリコートで 、さらに３時間インキュベートした。ついで不動化した免疫複合体を、０．１％ （Ｗ／Ｖ）脱脂ＢＳＡ　（１回）、０１％脱脂ＢＳＡ／１Ｍ　ＮａＣ１（１回） を含有し、または無添加（２回）の何れかの０．１Ｍトリス（ｐＨ８，１）１０ ．１％ＣＨＡＰＳで十分に洗浄した。このように洗浄したプロティンＡセファロ ースを遠心によって採取し、最後に２％（Ｗ／Ｖ）ＳＤＳを含有する０、１Ｍト リス（ｐＨ６，８）５０μｌに懸濁し、５分間煮沸したのち、５ＤＳ−ＰＡＧＥ により分析した。 トリノン−８ＤＳ−ＰＡＧＥおよびアミノ酸分析。 ンエーガーおよびフォノ・ヤコフの方法（１，９８７年）に従い、トリノン−５ ＤＳ−ポリアクリルアミドゲルをバイオ・ラド・ミニプロチアンＩＩ装置（８ｃ ｍｘ７ｃｍｘ　０．７５ｃｍ）て調製した。均質なゲル（７５％Ｔおよび３％Ｃ ）を１日前に流し込み、０．５Ｍ　トリス、０．１％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ、および １２ｍＭ３−メルカプトプロピオン酸（スカベンジャーとして添加）（ｐＨ８， ４５）で１５＋ｎ＾／ゲルで４時間予備電気泳動を行った。精製し、凍結乾燥し たｕ−ＰＡＲを、４％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ、１２％（ｗ／ｖ）グリセリン、５０１ ｇＭトリス、および４０ｍＭジチオトレイトール（ｐＨ６，８）で２分間員煮沸 により還元した。予備電気泳動に使用したゲル緩衝液を本来の電気泳動緩衝液（ シェーガーおよびフォノ・ヤコフ、１９８７年）と取り換え、ただし１ｍＭ３− メルカプトプロピオン酸をカソード緩衝液へ含有させた。電気泳動を６０Ｖで４ 時間実施した。以前報告されたように（プラグら、１９８９年）、半乾燥方法に より０．４５μｒａ　ＰＶＤＦ膜上で、１０ｍＭ３−（シクロへキシルアミノ） −１−プロパンスルホン酸、１０％（ｖ／ｖ）メタノール、および０．４ｍＭジ チオトレ、イトール中（ｐＨ１１）で、電気移動を０．８ｍ＾／Ｃｍ２で２時間 実施した。 アミノ酸分析のために、００５％（Ｗ／Ｖ）フェノールを含有する再蒸留した６ ＭＨＣ］　１００μｌおよび１％（ｗ／ｖ）ＤＴＤＰＡの２Ｍ　ＮａＯＨ溶液５ μｍ中で、先に報告されたように（プラグら、１９８９年）、切り出したＰＶＤ Ｆ膜上で１１０℃で、クーマシー染色したｕ−ＰＡＲを作成した。主として報告 された（バークホルトおよびジエンセン、１９８９年）、０−フタルジアルデヒ ド誘導体化を備えたウォーターズ・アミノ酸分析器でアミノ酸分析を実施した。 ただしクロマトグラフィー系は、塩基性アミノ酸の分離能を増大するため若干修 飾した。溶出はハロゲン化物を含まない２種の緩衝液ＡおよびＢ（組成について は、バークホルトおよびジエンセン、１９８９年参照）の混合液から得られたｐ Ｈ勾配により実施したが、勾配は下記の直線状セグメントからなっていた。最初 の溶離液１００％Ａ１１５分で８８％Ａおよび１２％Ｂ１２４分で６０％Ａおよ び４０％Ｂ１２６分で５５％Ａおよび４５％Ｂ１３６分で５０％Ａおよび５０％ Ｂ１４０分で３０％Ａおよび７０％Ｂ、６４分で２５％Ａおよび７５％Ｂ１６５ 分で１００％Ａ、６５〜７０分で１００％Ａであった。 種々の分析。 実施例１で報告したように、５ＤＳ−ＰＡＧＥ、ジスクシンイミジルスベリン酸 （ＤＳＳ）による化学的橋架は反応、および分析的界面活性剤層分離をトリトン Ｘ−１１４で実施した。 直接オートラジオグラフィー（１２３１）および蛍光光度法（３Ｈ）を増感紙（ クロネックス）を使用して一８０°ＣでＸ線フィルム（コダ・ツクＸ−オーマ・ ソト）で実施した。蛍光光度法の場合は、Ｘ線フィルムを予備露光しく０，２〜 ０．３Ａ）、製造業者の指示により、ポリアクリルアミドゲルを増感剤で含浸さ せた。 結果。 精製したｕ−ＰＡＲのアミノ酸分析： 精製したｕ−ＰＡＲのアミノ酸分析では（実施例１）、酸加水分解物の中番二〇 −フタルジアルデヒドと反応し、カチオン交換クロマトグラフィーで、アンモニ アのすぐ後に溶出する未確認の化合物の存在が明ら力１）こなった（第９図）。 束１１激しないＵ９３７細胞（２Ｘ１０’°細胞）からｕ−ＰＡＲを精製すると 、類似のピークが観察されたが、その他の方法で処理すると同一であった（デー タ１ま示さず）。この未知の化合物は、これを２％ＳＤＳで煮沸し、つし１でト ＩＪシン−５ＤＳ−ＰＡＧＥ、および０．４５μｍポリビニリデンジフル第１ノ ド（ｐＶＤＦ）膜上で１０％（ｖ／ｖ）ＭｅＯＨの存在で電気プロ・ソテイング しても、精製されたタンノ（り質内に残存しているので、ｕ−ＰＡＲの共有結合 的な構成成分として挙動しｔこ。 さらにこの化合物は、タンパク質が染色されｔこ領域のす（′上下でＰＶＤＦ膜 の好適な切片を切り出し、アミノ酸分析のために同一の方法で調製すると存在し な（なるので、クーマン−染色したｕ−ＰＡＲの特殊な構成成分であった（第９ 図、挿入）。そのうえ以前にこの手法で、分析しｔこ数種の染色されｔニタンノ くり質およびペプチドでは、この特殊な成分の存在が顕在イヒされな力１つｔこ （プラグら、１９８９年）。 この研究でアミノ酸分析のため、一般的なもの１ぼ力）ってなく、さまざまな滅 菌にない塩基性アミノ酸を、その保持時間の再現性を損なうことなく、分離を増 大させることができる特殊な勾配をカチオン交換クロマトグラフィーのため（こ 設計した（物質および方法の項、参照）。この方法によって、ｕ−ＰＡＲ中の同 定できなかった化合物を、アンモニア（５３，５分）およびアルギニン（６０， ８分）の間で５５．３分後に再現性をもって溶出した。種々の物理的に生じるア ルギニン誘導体が、はぼ類似の保持時間を有することが予想されるので、Ｎ’、 Ｎ’−ジメチルアルギニン（５３，８分）　、Ｎ’、Ｎ”−ジメチルアルギニン （５４，４分）、Ｎｗ−モノメチルアルギニン（５８，６分）等を含む数種のメ チル化アルギニン誘導体を試験した。これらの保持時間は、何れもｕ−ＰＡＲ中 の同定できなかった化合物の値と一致しなかった。然し基準的なエタノールアミ ンを試験すると、同定できなかったｕ−ＰＡＲ中の化合物とまさに同一の保持時 間を示した。そのうえヒトおよびウシの双方の赤血球のアセチルコリンエステラ ーゼを加水分解すると、この保持時間を有する化合物が同様に観察され、一方、 例えばミニリン塩基性タンパク質からの加水分解物ではこの化合物は存在しなか った。赤血球から単離されたアセチルコリンエステラーゼは糖脂質膜アンカーに 共有結合成分としてエタノールアミンを含有しているが、ミニリン塩基性タンパ ク質は部分的にメチル化されたアルギニン残基を有している。したがってｕ−Ｐ ＡＲは、酸に不安定な結合（例えばエステルまたはアミド結合）によってタンパ ク質と共有結合的に結合しているエタノールアミンを含有していると結論した。 第１２図の定量分析データは、各ｕ−ＰＡＲ分子が２〜３個のエタノールアミン 残基を含んでいることを示している（第４表参照）。 ＰＩ−ＰＬＣ処理による細胞表面からのｕ−ＰＡＲの放出；精製したｕ−ＰＡＲ にエタノールアミンが存在することは、この細胞受容体がグリコジルホスファチ ジルイノシトール（ＧＰＩ）によって形質膜へ繋ぎ止められていることことを示 唆している。そのようなＧＰＩ−アンカー型タンパク質の大多数は、細菌性ホス ファチジルイノシトール特異的なホスホリパーゼＣ（ＰＩ−ＰＬＣ）感受性であ り、糖脂質のジアセチルグリセロール部分を除去することによって、タンパク質 を培地へ放出する（ロー、１９８９年）。したがって発明者らは、最初、ＰＭＡ 刺激されたＵ９３７細胞の細胞表面へ結合した、１０Ｉ−標ｍＤＦＰ処理したｕ −ＰΔをＰＩ−ＰＬＣが放出できるかどうかを研究した。 第１０図に示したように、細胞に伴っている放射能の約５０％が、ＰＩ−ＰＬＣ によって最初の１５分以内に放出された。さらにＰＩ−ＰＬＣ濃度が僅か５０ｎ ｇ／ｍｌまで低下したときでも、放出速度はごく僅か低下するだけであった（デ ータは示さず）。これとは対照的に、ホスホリパーゼＡ！（第１０図）およびホ スホリパーゼＤ（データは示さず）は、これらのホスホリパーゼが比較的高濃度 で存在していても（〉５ａｇ／ｍｌ、第１０図）、生試料と比べて、細胞表面か らの１２５Ｉ−標識ＤＦＰ−ｕ−ＰＡ遊離の促進を何ら誘発できなかった。これ に反して、トリプシンはすべての細胞表面に付随している放射能を効率的に放出 しくデータは示さず）、即ち、受容体へ結合しているｕ−ＰＡの物理的な接近を 証明した。 第１１Ａ図に示したように、ＰＩ−ＰＬＣによって培地へ放出されたｕ−ＰＡは 本質的に分解されず、少量のそのアミノ末端断片（ＡＴＦ、Ｍｒ１７０００）と −緒に、生として無傷な２本鎖ｕ−ＰＡ　（Ｍｒ５００００）からなっていた。 ｕ−ＰＡの受容体結合ドメインはこれらの両成分にともに備わっている（アペラ ら、１９８７年）。したがってこれら２つの分子種は１２５Ｉ−標識ＤＦＰ−ｕ −ＰＡと前インキュベーションの間に細胞表面へ結合した。対照的に受容体結合 ドメインを欠いているｕ−ＰＡの低分子量形（Ｍｒ３３０００）は、洗浄操作に よって消失した。これらの成績から、ｕ−ＰＡおよびＡＴＦは、Ｐｌ−ＰＬＣに よって細胞表面から放出されるが、これらは特異的にｕ−ＰＡＲを伴っているこ とが判る。 この実験で、サンプリングと同時に、回収した上清へ１ｍＭジスクシンイミジル スベリン酸（ＤＳＳ）を添加することによる橋架は分析を実施すると、複合体を 含有している可溶性ｕ−ＰＡはＰＩ−ＰＬＣ処理した細胞からの培地でだけ検出 された（第１１Ｂ図）。５ＤＳ−ＰＡＧＥで、この複合体の電気泳動による移動 度（Ｍｒｌｌｏｏｏｏ）は、ｕ−ＰＡ／ｕ−ＰＡＲ複合体の移動度と同じであっ たに−ルセンら、１９８８年）。模擬的に処理した試料では培地中に遊離のり− ＰＡだけが認められ、このことはｕ−ＰＡＲからの緩徐な一過性のｕ−ＰＡの解 離を反映していた。この実験は、ＰＩ−ＰＬＣによって放出されたｕ−ＰＡ力（ 、ｕ−ＰＡＲとの複合体を作るという解釈をさらに支持するものである。 最後にＰＩ−ＰＬＣによるｕ−ＰＡＲタンパク質の特異的な放出そのものが、観 察した＋２８１−標識リガントの放出の真の原因であることを直接的に証明した 。 この実験では、ＰＭＡ刺激したＵ９３７細胞を、まず酸処理して内因性のｕ−Ｐ Ａを除き、ついでＰＩ−ＰＬＣとインキュベートした。ついで培地へ放出された 何らかのｕ−ＰＡ結合成分の存在を、１ｕｌｌ−標識ＤＦＰ−ｕ−ＰＡへの橋架 は反応によって検定した。この実験で、ＰＩ−ＰＬＣは、遊離形ｕ−ＰＡＲが、 膜結合形から、１２５Ｉ−標識ＤＦＰ−ｕ−ＰＡ（第１１Ｃ図）および＋２５１ −標識ＡＴＦ（データは示さず）に対する高い親和性をなお発現し得る可溶性タ ンパク質（Ｍｒ６００００）へ急速に変換するのを誘導することが判った。さら にＰＭＡ刺激したＵ９３７細胞のＰＩ−ＰＬＣ処理後、無血清培地で、精製した ヒｔ−ｕ　−ＰＡＲに対して生じさせたポリクローナル・マウス抗血清を使用し て５ＤＳ−ＰＡＧＥおよび免疫プロッティングにより、−似のＭｒを有するタン パク質を検出した（データは示さず）。したがってこの可溶性タンパク質は機能 性（結合特異性）および構造関係（Ｍｒおよび抗原性）の双方の点から細胞結合 型ｕ−ＰＡＲに似ている。懸濁液中の非刺ｆｆ１Ｕ９３７細胞の分析によって、 類似したＰＩ−ＰＬＣ依存性のｕ−ＰＡＲの放出が明らかになった（データは示 さず）。 然しＰｌ−ＰＬＣで処理しない無血清培地で長期間インキュベーションしたのち に、ｕ−ＰＡＲの緩徐な内因性の放出が検出された（第１１Ｃ図）。この知見は 、細胞が可溶性ｕ−ＰＡＲを産生じたのか、あるいは分泌したのかの何れかであ ることを示し得るが、一層可能性があるのは細胞がＧＰＩ特異的なホスホリパー ゼを産生じたことである。 精製したｕ−ＰＡＲのＰＩ−ＰＬＣ処理後に変化した疎水性：精製したｕ−ＰＡ ＲをトリトンＸ−１１４による界面活性剤層分離にかけると、１２５Ｉ−標識Ａ ＴＦへの橋架は反応による試験で、はとんど定量的に界面活性剤層へ分配され（ 第１２Ａ図）、即ち、受容体の極めて疎水性な特性が証明された。 ＰＩ−ＰＬＣとインキュベーションすると、ＡＴＦ結合活性の５０％以上は水層 １２Ｂ図）。ＰＩ−ＰＬＣの濃度増加によって、精製したｕ−ＰＡＲ標品でこの 変換の水準をさらに高めることは不可能であることが判った。これらの成績は、 以前の実験で無傷のＰＭＡ刺激したＵ９３７細胞のＰＩ−ＰＬＣ処理によりて、 放出されたｕ−ＰＡを伴う細胞の分画と一致している（第１０図）。この知見は 、細菌性ＰＩ−ＰＬＯに対する部分的抵抗性（約５０％）が生体内ｕ−ＰＡＲ集 団の真の特徴であることを示し得る。他のホスホリパーゼ（ＰＬＤおよびＰＬＡ Ｊは精製したｕ−ＰＡＲの疎水性に何ら有意な変化を誘発しなかった（第１２Ｃ 図）。 １２５■−標識したｕ−ＰＡＲの試料を種々のホスホリパーゼで酵素的に処理し たあと、電荷シフト電気泳動によって分析すると、類似の挙動が認められた。Ｐ ｌ−ＰＬＣだけが、ポリアクリルアミドゲルで界面活性剤組成と独立して移動す る標識ｕ−ＰＡＲ（約５０％）の意味のある部分を疎水性形へ変えることができ た（データは示さず）。この実験は、ＰＩ−ＰＬＣが誘発したＡＴＦ結合活性の 層分配の変化が、全体的にｕ−ＰＡＲタンパク質そのものの疎水性の同一の変化 に起因することを示している。 生体内標識 ＰＭＡ刺激したＵ９３７細胞の［３Ｈ］−エタノールアミン、ミオ−［”Ｈ］　 −イノシトール、または［３Ｈ］−ミリスチン酸の何れかとのインキュベーショ ンのあと、ＤＦＰ−ｕ−ＰＡＲへ結合可能な成分（Ｍｒ５０−６００００）の生 合成的な標識が得られた（データは示さず）。ｕ−ＰＡＲに特異的なポリクロー ナル抗体との免疫沈降によって、このタンパク質をＵ９３７細胞の界面活性剤溶 解物から単離し、５ＤＳ−ＰＡＧＥおよび蛍光光度法によって分析した（物質お よび方法の項参照）。 カルボキシル末端の翻訳後プロセッシング：約２モルのエタノールアミン７１モ ルのｕ−ＰＡＲの存在を証明することとは別に（第９図および第４表）、アミノ 酸分析によって、この膜受容体の翻訳後プロセッシングの可能性に関する追加的 な情報が明らかになった。精製したｕ−ＰＡＲに対して計算したアミノ酸組成を ｃＤＮＡ配列からの発生期タンパク質に対する予測値と比較すると、幾つかの再 現性のある有意な矛盾が生じた（ロルダンら、１９９０年）。特にＡｌａおよび Ｌｅｕの実測値はあまりに低く、ＴｙｒおよびＰｈｅの値はあまりに高かった（ 第４表）。然し、興味深いことに、何か翻訳後の出来事の間に２９〜３１ＣＯＯ Ｈ末端残基が除去されたと仮定すると、計算した値と予測したアミノ酸組成とは 完全に一致することが可能であった（第４表）。即ち、測定したアミノ酸組成、 および通常この装置で得られる正確さ／精度に基づけば、ｕ−ＰＡＲにＣ０ＯＨ プロセッシング部位が存在することが推定される。このモデルにしたがい、プロ セッシングは、第１３図に示したように、Ｓ　ｅ　ｔ　２！＋２、ＧＩｙ２ｇｓ 、またはＡ　１ａ　２８．残基の１カ所で起こることが予測される６ ［第４表コ　精製されたｕ−ＰＡＲのアミノ酸組成と提案されたＣ０ＯＨプロセ ッシング前後のｃＤＮＡから推定されたものとの比較（Ｂ）　プロセッシング後 に推測したｕ−ＰＡＲの配列（Ｌ　ｅ　ｕ　１〜Ａ　ｌ　ａ　１８４）アミノ酸 　ｃＤＮＡからの　酸加水分解後の　ＳＤ予測値　測定値 Ａｓｐ＋Ａｓｎ　２９　２９．８　０．４Ｔｈｒｂ　２０　２０．０　０．５ Ｓｅｒｂ　２４　２３．６　０．４ Ｇ］ｕ＋ＧＩｎ’　３６　３８．１　１．２Ｐｒｏ　９　１０．２　０．３ Ｇｌｙ　２６　２６．８　１．０ Ａｌａ　８　７．６　０．１ Ｃｙｓ’　２８　２６．　３　０．　９Ｖａｌ　１２　１１゜００，２ Ｍｅｔ　６　５．５　領５ １１ｅ　７　６．１　０．１ Ｌｅｕ　２４　２４．５　０．６ Ｔｙｒ　７　７．　１　０．　１ Ｐｈｅ　５　５．　２　０．　１ Ｈｉｓ　１２　１１．６　０．１ Ｌｙｓ　１０　９．　９　０．　２ Ａｒｇ　１９　１８．６　０．２ Ｔｒｐ　２　測定せず　測定せず エタノールアミン　２．　４　０．　４第４表の注 ａ、精製したｕ−ＰＡＲは第９図の解説で説明したアミノ酸分析のために作成し た。示した値は３つの独立した測定の平均値を表す。データはトリプトファンを 除いてすべてのアミノ酸に関して正常化した。発生期ｕ−ＰＡＲでは合計数３０ ９残基であり、完全にプロセスされたタンパク質では２８２と推定した（４およ び２トリプトフアン残基をそれぞれ除いた）。アミノ酸数はシグナル配列を除い てｕ−ＰＡＲのためのｃＤＮＡ配列に基づいている（ロルダンら、１９９０年） 。 ｂ、これらのヒドロキシアミノ酸の値は加水分解中の分解を補正した［５ｅｒ（ ５％）およびＴｈｒ　（１０％）］。 Ｃ，アミノ酸標準混合物にピログルタミン酸の生成のため、僅かな過剰評価が予 想される。 ｄ　１試料では、システィンを加水分解前にヨード酢酸アミドを使用してそのま まアルキル化して誘導体化し、その後、酸加水分解してＳ−カルボキシシスティ ンとして定量化した。一般にこのアルキル化の収量は９５％である（プラグ、１ ９８９年）。別法として、加水分解の間、３，３゛−ジチオジプロピオン酸（Ｄ ＴＤ　ＰＡ）の存在でシスティンを誘導体化し、システィンとＤＴＤＰＡの間に 生成した混合ジスルフィド化合物（Ｃｙｓ−ｘ）として定量化した。 ｅ、ｎｄ＝測定しなかった。 ｆ、ＳＤ＝標準偏差（残基の絶対数） この実施例の結果から、ｕ−ＰＡＲはグリコジル化したホスファチジルイノシト ールアンカーを有し、Ｃ末端をプロセスされていることが明白に証明された。 実施例４ ｕ−ＰＡＲに対するマウスおよびウサギポリクローナルおよびモノクローナル抗 体の製造 精製ひとｕ−ＰＡ受容体（実施例１）を、６−１６％勾配ゲルで非還元条件下で ５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動の対象とした。蛍光分子量マーカーを 隣の列で泳動せることにより、抗原に対応する電気泳動部位を切り出した。ゲル 片はミクローヂスメンブレーターエエ装置で凍結乾燥し、続いて解凍した（ビー ・ブラウン・ニージー、ドイツ連邦共和国）。ポリアクリルアミドゲル粉はトリ ス緩衝化食塩水中で再構成させ、フロインド不完全アジュバントと混合し、ニュ ーシーラント白色ウサギへの注射に使用した。１０週間にょゎたり動物は５回の 注射を受け、それぞれ約３μｇの抗原を含み、その後、単一の８μｇの注射をさ らに７週間後行った。血清を最後の注射の１週間後取り出し、ＩｇＧをプロティ ンＡ−セファロースクロマトグラフィーで調製した。注射抗原内の痕跡の不純物 を除去するために、抗体を、固定化ひとｕ−ＰＡおよびＰＭＡ−刺激　Ｕ９３７ 細胞（実施例１参Ｉ］′ｇ）由来トリトンＸ−１１４デタージエント蛋白質混合 物をそれぞれ含むカラムを逐次通過させることにより吸着させた。得られた抗体 調製物は溶液中でｕ−ＰＡのアミド加水分解またはプラスミノーゲン活性化活性 を阻害し未変化ｕ−ＰＡＲに対する上記と同様の方法がｕ−ＰＡＲの１６ｋＤｕ −ＰＡ結合ドメインおよび実施例２に記載同様のキモトリプシン分解で得たｕ− ＰＡＲのＭ　ｒ　３５−４５　ｋ　Ｄ非−ｕ−ＰＡ結合フラグメントに特異的な ポリクローナル抗体の製造に利用できる。免疫化のためには、これらの２つの断 片を上記と同様に５ＤＳ−ＰＨＡＧＥゲルがら切断して別々に得られ得る。 ウェスタンプロットティングにより評価したｕ−ＰＡＲポリクローナル抗体の特 異性 電気泳動法　５ＤＳ−ＰＡＧＥをラエミリ（上掲）により６〜１６％ポリアクリ ルアミド直線濃度勾配でスラブゲル中行った。試料を還元条件下移動させた。 試料を２−メルカプトエタノールを１００℃３分間ジチオトレイトールを置き換 えること以外ラエミリ緩衝液中電気泳動する直前に還元した。下記の分子量マー カーを使用した。ホスホリラーゼｂ（分子量約９４０００）、ウソ血清アルブミ ン（分子量６７０００）、卵白アルブミン（分子量約４３０００）、炭酸脱水酵 素（分子量約３００００）、大豆トリプシン阻害剤（分子量約２０１００）およ びα−ラクトアルブミン（分子量約１４４００）。 ウェスタンブロッティング　−　アフィニティー精製ｕ−ＰＡＲまたはＰＭＡ− 刺激Ｕ９３７細胞のトリトンＸ−１１４抽出物からのデタージェント相を６〜１ ６％勾配ゲル勾配ゲル上下５ＤＳ−ＰＡＧＥに適用する。ゲルをニトロセルロー スシート上へ電気プロットした。ソートを濯ぎ、トリス緩衝化食塩水、ｐＨ７゜ ４中３０％ウノ胎仔で不活化した。シートをマウス−抗−ｕ−ＰＡＲまたは対照 血清でインキュベートしく即ち、豚ムチンに対するマウス抗血清）、トリス−緩 衝化食塩水中胎仔つン血清中希釈した。ソートを濯ぎ、第２の抗体（アルカリホ スファターゼ−接合ウサギ抗−マウスＩｇ（ダコバッ゛人コペンハーゲン）でイ ンキュベートシ、ニトロブルーテトラゾリウム１５−ブロモ−４−クロロ−３− インドリルホスフェート／レバミゾールで染色した。 ウサギｕ−ＰＡＲ抗体のウェスタンブロッティング分析を、以下の変更以外同様 の方法で行った：　５ＤＳ−ＰＡＧＥを非還元条件下行った。新生子ウソ血清を 胎仔ウシ血清の代わりに使用した。最初の抗体インキュベーション工程中には１ ０％血清だけを含んだ。１００倍希釈のアルカリホスファターゼ接合ブタ抗−ウ サギＩｇ（ダッコバ社製商品番号３０６）を第２の抗体として使用した。 細胞ＡＴＦ結合の阻害に関する分析　−Ｕ９３７細胞を、ニールセン等（１９８ ８年）に記載と同様に洗浄し、酸処理した。細胞をＰＢＳ１００μｍ、０゜１％ ウシ血清アルブミン中再懸濁し、前以て希釈した抗−ｕ−ＰＡＲ１００μｍを加 えた。対照試料に前以て希釈した対照血清１００μｍを加えた（即ち、豚ムチン に対して生じたマウス抗血清）。試料を静かに撹拌しつつ４℃１時間インキュベ ートした。インキュベート後、Ｉｌ’１−ＡＴＦ１００μｍを加え、インキュベ ーションをもう１時間続けた。３００Ｉｍ反応容積中、”Ｉ−ＡＴＦの最終濃度 は、２．２ｎＭであり、抗−ｕ−ＰＡＲ血清／対照血清の最終希釈は１：３゜Ｏ 〜１　：１５３６００の範囲であった。ついで、細胞をＰＢＳ−ウシ血清アルブ ミンの１ｍｌで３回洗浄し、結合放射能をガンマ計数器で測定した。これらの条 件下、放射能の１２％は、抗血清を加えないとき、細胞−結合となった。結合放 射能の９０％は、細胞が非標識化ｕ−ＰＡ７００ｎＭで前以てインキュベートし たとき置換された。 結果 第１４図が示すように、免疫化マウスから血清は１２６ｉ標識化精製ｕ−ＰＡＲ を沈降させた。１ニア５．１　：　７５０，１　：　７５００．１　：　７５０ ００に希釈した抗−ｕ−ＰＡＲ血清は、それぞれ２５％、１８％、５％および１ ％沈降させた。 同じ希釈で免疫化血清および他方の対照は領　５〜１％血清の範囲内で沈降し得 る。 逆固相放射能免疫測定を使用して、抗血清を１１５■標識化精製ｕ−ＰＡＲ（第 １５図）　ヲ免疫捕獲１：使用Ｌり。抗−ｕ−ＰＡＲ血清１　：　５００〜１　 ：　３２０００　（７）　２　倍系列希釈ＩＬ同ｊｉ（７）　’　２５１−　ｕ 　−Ｐ　Ａ　Ｒ（総量）約２　％　）を１　＋　４０００までの血清希釈で捕獲 し、１　：　３２０００で半量に低下した。非免疫血清の同じ系列希釈物および 他方の対照は、総量の約０．５％”’Ｔ−ｕ−ＰＡＲの捕獲となった。 ＥＬＩＳＡにおける免疫に対する非免疫血清の反応を第１６図に示す。ウェルに 対するコート化精製ｕ−ＰＡＲのｌｎｇは１：８０００に希釈した免疫血清で検 出されるのに十分であった。すべての希釈非免疫血清および他の試料について、 バンクグランド濃度で反応値が得られる。 ひとｕ−ＰＡＲに対するマウス抗血清を、Ｕ９３７細胞を、抗血清と前以てイン キュベートし、ついで１２５Ｉ−ＡＴＦを加えた競合実験において使用した。第 １７図が示すように、抗−ｕ−ＰＡＲ血清は細胞に対する”Ｉ−ＡＴＦの特異的 結合を完全に阻害し得た。５０％阻害は１　：　２４００希釈で得た。同じ条件 下、対照血清は僅かに阻害、即ち、使用した最も高い濃度で約２０％（１：　３ ００希釈）を示した。ウェスタンブロッティングにおいて、ＰＭＡ−処理Ｕ９３ ７細胞からのデタージエント相内に含まれるｕ−ＰＡＲおよび精製ｕ−ＰＡＲは 、抗−ｕ−ＰＡＲ血清により検出された（第１７図、差し込み図、レーンｌおよ びレーン２）。対照免疫血清は、同じ調製物とは反応しなかった（レーン３およ びレーン４）。 ウサギポリクローナル抗体をウサギを５ＤＳ−ＰＡＧＥを連続して分取したアフ ィニティー精製ｕ−ＰＡＲを含むポリアクリルアミドゲル物質でウサギを免疫化 することにより製造した。ＩｇＧ画分を得られた抗血清から分離し、固定相ヒト ｕ−ＰＡおよびＰＭＡ−刺激Ｕ９３７細胞由来の固定化膜−タンパク質混合物の それぞれカラムを通して吸収させた。抗体は、ＰＭＡ刺激Ｕ９３７細胞（図１８ ）（Ａ）からトリトンＸ−１１４デタージエント相中ｕ−ＰＡＲを認識した。 すなわち、化学的架橋の実施（方法につき実施例１参照）（レーン３）後ＤＦＰ 処理ｕ−ＰＡとの１００〜１１０ｋＤフンシユゲートを形成する能力によりＵ− ＰＡＲであることを決定し得る５０〜６５ｋＤの範囲内のタンパク質が認められ た（レーンｌおよび２）。ＤＦＰ処理Ｌｌ−ＰＡだけ（レーン５および６）では 発色せず、ＤＰＦ処理ｕ−ＰＡを加えなかったとき、架橋操作は、ｕ−ＰＡＲの 電気泳動像を変化させなかった（レーン２）。同じ方法で調製され、同じウサギ からの前免疫１ｇＧで染色されたバンドは試料のいずれにもなかった。 ｕ−ＰＡＲの配位結合能に対するウサギ抗体の効果を、ｕ−ＰＡＲの精製試料（ 実施例；約２０　ｎ　ｇ／ｍ　ｌ　）を、ウサギ抗−ＰＡＲ血清からの精製およ び吸収ＩｇＧと前辺てインキュベートした別の実験において検討した（プレイン キュベーション中最終１ｇＧ濃度９０μｇ／ｍｌ）。この処理は、”５Ｉ−ＡＴ Ｆとの架橋コンジュゲートの形成を完全に妨害した。前免疫血清からのＩｇＧは 、同じ濃度で架橋分析に影響を与えなかった。 ｕ−ＰＡＲに対するモノクローナルマウス抗体の産生マウスの免疫化 ＢＡＬＢ／ｃ系マウスを、ジイソプロピルフルオライド・ウロキナーゼ型フラス ミ°゛ノーゲン活性化物（ＤＦＰ−ｕ−ＰＡ）リガンド親和性カラム上でｕ９３ ７　ａ細胞から精製したｕ−ＰＡＲで免疫した（実施例１参照）。マウスは３週 間間隔でυ−ＰＡＲ５Ｉｇを３回腹腔内注射した。最後の注射後８−１０日で、 血清を、ｕ−ＰＡＲに対する反応性についてＥＬＩＳＡおよびウェスタンブロッ ティングの両方で試験した。陽性の反応が検出されたとき、ｕ−ＰＡＲ１０１５ μｇを腹腔内に最終的にブースター注射した。 ハイブリドーマの融合及びクローニング融合のための標準的な実験計画に従った が、簡単な概要は以下のとおりであるａ）免疫ＢＡＬＢ／ｃマウスから単離した 膵臓及び末梢リンパ節を機械的に粉砕し、均一な細胞懸濁液を血清不含溶媒中調 製した。 ｂ）指数増殖期の骨髄腫細胞およびＸ６３−Ａｇ３．６５３細胞（ケルニー、ジ ャーナル・オン・イムノロジー、１２３巻、１５４８−１５５０頁、１９７９年 ）を単離し、ＢＡＬＢ／ｃ牌臓リンパ膵臓の融合に供した。骨髄腫細胞は血清不 含溶媒に再懸濁した。 ｃ＞　ｎ臓およびリンパ節リンパ球並びに骨髄腫細胞それぞれ１：１．２５及び １・２の比率で混合した。 ｄ）細胞は３７℃で５０％（重量／容量）ポリエチレングリコール４０００（Ｐ ＥＧ）を（膵臓及びリンパ節リンパ球に対し、それぞれ５■ｌないしｎｘ　ｉ　 ｏ’及び１閣１ないし４．５Ｘ１０’）滴加することにより融合したｅン　血清 不含溶媒を穏やかに添加して融合を停止させた。 ｆ）遠心後、上清を除去し、細胞を血清含有溶媒で１回洗浄した。次いで、細胞 をヒポキサンチン・アミノプテリン・チミジン（ＨＡＴ）含有溶媒中注意深く再 懸濁した。 ｇ）融合した細胞を約７Ｘ１０Ｓセル／ウエル（膵臓融合）及び５Ｘ１０’セル ／ウヱル（リンパ節融合）の濃度で、１５０μｌの選択溶媒中２．５Ｘ１０’マ クロフアージを含有する平底マイクロタイタープレートのウェルに５０μｌずっ 分配した。 ｈ）細胞を加湿恒温培養器中５％ｃｏ２雰囲気下３７℃で恒温培養した。 ｉ）選択溶媒は１週間後かまたは必要な時に新しくした。 ｊ）ハイブリドーマの成長を見るために、ウェルを検査した。膨大に成長し色が 黄色に変化したのが観察された時、上清を採りＥＬＩＳＡ法によりｕ−ＰＡＲと 反応する抗体のふるい分けに供した（以下参照）。 ｋ）融合後１０−１４日に、ＨＡＴ培地をＨＴ培地に置き換え、その後、例えば １０日後に普通の培地に置き換えた。 １）ＥＬＩＳＡ陽性のウェルを２４−ウェルプレートのカップに移し、次に小さ Ｌ”Ｃ２５ｃｍ２）培養フラスコに移した。 ｍ）ＥＬＩＳＡ陽性のハイブリッド細胞を、液体窒素中できるだけ早く凍結した 。 ｎ）　４つのＥＬＩＳＡ陽性ウェルがらのハイブリドーマを制限希釈によりクロ ーン化した。平均０．５セル／ウエルで３６ウエル、平均１セル／ウエルで３６ ウエル及び平均３セル／ウエルで３６ウエルを各培地から調製した。唯一の型の モノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマが確立されるまで再びクローン化 し再試験した。 融合細胞を含むウェルがらの培地をＥＬＩＳＡで試験し、元のハイブリドーマ培 養体の各々から平均０５セル／ウエルで接種したウェルからのクローンの強いＥ ＬＩＳＡ反応を安定に示す一つを次の増殖用に用いた。 スクリーニング用に用いた固相酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）材料 １）９６ウエルプレート（平底高度な結合能力、ヌンク）。 ２）ｕ９３７細胞から精製したｕ−ＰＡＲ（１０μｇ／ｍｌ）。 ３）西洋ワサビペルオキシダーゼ・複合ウサギ抗マウスＩｇ（ＨＲＰ−ＲａＭＩ ｇ）。 ４）ＰＢＳＩＩＩＩ液、ｐＨ７，４（ＰＢＳ）。 ５）　ＰＢＳ＋０．１％トウィーン２０．ｐＨ７，４（ＰＢＳ／）ウィーン２０ ）６）妨害用緩衝液：　ＰＢＳ中１％脂肪粉乳（ＳＭＰ）。 ７）　’ｙエン酸塩緩衝液：０．１Ｍクエン酸塩、ｐＨ５，０゜８）基質溶液： クエン酸塩緩衝液中１，２−フェニレンジアミン−ジヒドロ知ライド（ＯＰ　Ｄ ）錠、たとえばクエン酸塩緩衝液１５ｍ１十ＨｚＯｚ　５μｍ中。ＰＤ３錠（３ ０％）。 ９）停止用緩衝液＋　ＩＭ　Ｈ２ＳＯ。 方法 １）　Ｏ，ＩＭ　Ｎａ２ＣＯ３、ｐＨ９，８で希釈して濃度を２０　ｎｇ／ｍｌ ニＬり精製ｕ−ＰＡＲ１００μｍでウェルを被覆する。 ２）　４℃で一晩恒温培養する。 ３）翌日、ウェルをＰＢｓ／トウィーン２ｏで４回洗浄する。 ４）ウェル中に残存する活性部位を１％ＳＭＰ／ＰＢＳ、２００μｌ／ウエルで 、室温で１／２時間妨害する。穏やかに振とぅする。 ５）段階３のように洗浄する。 ６）　ＰＢＳ／）ウィーン２ｏ＋１％ＳＭＰ中連続希釈したハイブリドーマ分泌 抗体／免疫／非免疫血清がらの使用溶媒１００μｌ／ウエルを加え、適切な対照 を含める。 ７）８１やかに振とうしながら３７℃で１時間恒温培養する。 ８）段階３のように洗浄する。 ９）　ＰＢＳ／トウィ−ン２０＋１％５ＭＰｔ’ｌ：５００１：希釈した２次抗 体ＨＲＰ−ＲａＭ　Ｉｇ　１００１／ウエルを添加する。 １０）段階７のように恒温培養する。 ＩＩ）　段階３のように洗浄する。 １２）２回蒸留水で１回洗浄する。 １３）基質溶液１００μｍ／ウェルを添加する。 １４）鮮やかな黄色が現れた時、ＩＭ　Ｈ，３０，１５０μｌ／ウエルで１５− ３０分間反応を停止させる。 １５）　４９０ｎｍフィルターの付いたＥＬＩＳＡ読み取り機を読む。 モノクローナル抗体の精製 材料 １、ハイブリドーマ分泌モノクローナル抗体からの使用溶媒。 ２、ａ、プロティンＧセファロース４ファスト・フロラ使い捨て可能カラム３■ １０ｂ、結合用緩衝液：２Ｘ１００ｍｌ、０．２Ｍリン酸ナトリウム（ｐＨ７， ０）。 予防剤として０．０５％ナトリウムアジドを含む１０×濃縮物。 Ｃ１溶出溶液＋　ｌＸ１００ｍ１．１．０Ｍグリシン−ＨＣｌ　（ｐＨ２，７） 、１０×濃縮物。２．７のｐＨは防腐剤を使用することなくすぐれた安定性を与 える。 ｄ、中和緩衝液・ｌＸ１００ｆｆｉｌ、１．０Ｍトリス−ＨＣｌ　（ｐＨ９）。 防腐剤として０．０５％ナトリウムアンドを含む。 を含むＩｇＧの精製用ＭＡｂ　トラップＧ完全キット（ファルマシア）。 ３、フラクションコレクター及びＵＶ−モニター４、ミニソーブ管 方法 プロティンＧセファロース４ＦＦカラムをまず頂上キャップを除くことにより開 けた。これはゲル中に入る気泡を防ぐ。２０％エタノール保管溶液を注ぎ、プロ ティンＧセファロース４ＦＦカラムを結合用緩衝液（〜３０ｍ１）で頂上まで満 たすことにより平衡化し、その後カラムから引き出した。カラムはメニスカスが 頂上フリットに達すると流れを自動的に停止し、カラムを乾燥から防ぐ。培養上 清を１５０Ｘｇ遠心し、濾過した（０．２０μｍ）、５０−１５０ｍｌの調製し た試料を用いゲルに吸収させた。未結合の蛋白を結合用緩衝液（〜３Ｑａ＋１） で頂上までカラムを満たすことにより流去し、緩衝液をカラムに通過させて未結 合材料を溶出した。結合したＩｇＧは、溶出緩衝液（〜１５諷ｌ）でカラムを満 たすことによりカラム上に溶出させた。溶出した抗体の１ｍｌフラクションを４ ０−８０１１中性緩衝液を含むミニソーブ管に集め、溶出フラクションの純度を ファストゲルシステム（ファルマンア）を適用し、次いで銀染色して８−２５％ 勾配ゲル上で調べた（実施例１参照）。 モノクローナル抗体のサブイソタイピング材料 １．９６ウエルプレート（平均高度な結合能力、ヌンク）。 ２、精製したｕ−ＰＡＲ（１０１１ｇ１０＋１）。 ３、マウス・タイパ町サブイソタイピング・キット（バイオ−ラド）。 ４、西洋ワサビペルオキシダーゼ・複合ブタ抗ウサギＩｇ（ＨＲＰ−３ａＲＩｇ ）５、ＰＢＳ緩衝液、ｐＨ７，４（ＰＢＳ）。 ６、ＰＢＳ＋０．１％）ウィーン２０．ｐＨ７，４（ＰＢＳ／トウイー：／２０ ）。 ７、妨害用緩衝液：　ＰＢＳ中１％脱脂粉乳（ＳＭＰ）。 ８、クエン酸塩緩衝液＝０１Ｍクエン酸塩、ｐＨ５，ｏ。 ９、基質溶液、クエン酸緩衝液中１．２−フェニレンジアミン−ジヒドロクロラ イド（ＯＰＤ）錠、例エバクエン酸液１１１ｉ液１５ｍｌ＋ＨｔＯｔＳｘｌ中０ ＰＤ３錠（３０％）。 １０、停止用緩衝液：　１ＭＨ２ＳＯ４方法 ウェルを０．１ＭＮａ２Ｃｏ、、ｐＨ９，８中２０ｎｇ／ｍｌの濃度まで希釈し た精製Ｕ−ＰＡＲ１０ｈｌで被覆し、１夜４℃で恒温培養した。次いでウェルを ＰＢｓ／トウイーン２０で４回洗い、ウェルに残っている活性部位を、１％ＳＭ Ｐ／ＰＢＳ。 ２００μｌ／ウエルで１／２時間室温でゆるやかに振とうしながら反応を停止さ せる。それらを再び上記のように洗い、／ゾブリドーマ分泌モノクローナル抗体 からの使用溶媒１００μｌ／ウエルを加え、次いで１時間３７℃でゆるやかに振 とうしながら恒温培養した。上記のように洗浄したのち、サブイソタイピング抗 体の未希釈溶液１００μｍ／ウェルを加えた。１時間３７℃で恒温培養したのち 、ウェルを上記のように洗浄した。１：５００に希釈したＨＲＰ−８ａＲＩｇ１ ００μｍ／ウェルをＰＢＳ／トウィーン２０＋１％ＳＭＰに加え、ウェルを恒温 培養し、上記のように洗浄し、次いで２回蒸留水で洗浄した。基質溶液１００μ ｍ／ウェルを加え、５−１０分後、鮮やかな黄色が現れたとき、１５０μｌ／ウ エルのＩＭＨ、ＳＯ，で反応を停止させた。４９０止フイルターの付いたＥＲＩ ＳＡ読み取り機で吸光度を測定した。各実験で適当な対照を含んだ。 結果 融合膵臓細胞を有する１０００ウエルは１９、そして融合リンパ節細胞を有する ９０ウエルは５つの安定なＥＬＩＳＡ陽性ハイブリドーマを得た。−次クローニ ング用に異なる特質でハイブリドーマを選択するため、安定なＥＬＩＳＡ陽性ハ イブリドーマからの調整溶媒を、（１）ウェスタンブロッティング（実施例４参 照）でｕ−ＰＡＲを可溶化したＰｌ−ＰＬＣを染色する能力（実施例３参照）、 （２）放射標識型でのｕ−ＰＡのＡＴＦ部分のｕ９３７細胞への結合の妨害（実 施例１１参照）。及び（３）結腸アデノアルジノナス（ａｄｅｎｏａｒｃｉｎｏ ｎａｓ）のパラフィン区分の染色、インサイチュウハイプリダイゼーンヨンによ りそれらはｕ−ＰＡＲに対するｍＲＮＡの発現を伴う細胞を含むことを示した（ 実施例８参照）、について試験した。 これらの基準で、４ハイブリドーマをクローニング用に選択した（Ｉ　４Ｅ−８ 、Ｉ　５Ａ−７、Ｉ　ｌ０Ａ−４、ＩＩ　ＩＤ−６）。最初の３つは膵臓細胞融 合から誘導され、最後のものはリンパ節細胞融合から誘導された。これらの４つ のハイブリドーマからの調整溶媒の特質は以下の通りであった。 Ｉ　４Ｅ−８Ｉ　５＾−７１１０＾−４ＩＩ　ＩＤ−６スクリーニングＥＬＩＳ Ａ中 ｕ−ＰＡＲとの反応　十　＋＋＋ 可溶化されたｕ−ＰＡＲの ウェスタンブロッティング　＋　十　＋”Ｉ−ＡＴＦのＵ９３７細胞への 結合阻害　十　＋　＋ ｕ−ＰＡＲｍＲＮＡに陽性の細胞の 免疫染色　−十−− ４つのハイブリドーマのクローニング後、平均０．５セル／ウエルで植えたウェ ルのほぼ半分が生成を示し、それぞれの元のハイブリドーマ用に、−貫して強Ｌ ）ＥＬ　Ｉ　ＳＡ反応を示すものの一つを繁殖用及び全ての続く研究用に用いた 。クローンを選択したものはＩＲ（１４Ｅ−８から）　、２Ｒ（１５Ａ−７から ）、３Ｒ（Ｉ　ｌ０Ａ−４から）及び４Ｒ（ＩＩ　ＩＤ−６から）と名付けた。 ＩＲは他の３つのクローンよりも弱いＥＬＩＳＡ反応を一貫して示した。これら のクローンから生成された抗体のサブイソタイピングは上記したように実施した 。ＩＲはＩｇＧ２ｂ、カッパーであると測定され、他の３つはＩｇＧ１カッパー イソタイプと測定された。抗体は上記のように精製し、ファストゲルシステムで の電気泳動後、１つの銀染色バンドを示すこれらの精製標品は全ての続く研究に 用いた。 実施例５ 免疫沈降及びウェスタンブロッティングによるモノクローナル抗体の特性表示モ ノクローナルこれらのによる免疫沈降による精製ｕ−ＰＡＲの特異認識放射免疫 沈降検定法（ＲＩＰＡ）。この検定法は、無処理のｕ−ＰＡＲ（１）又はＭｒ− １６，０ＯＯｕ−ＰＡ結合ドメイン及びｕ−ＰＡと結合しないＭｒ３５−４５． ０００断片を含むｕ−ＰＡＲ（Ｄ）のキモトリプシン崩壊型を特異的に検出する 目的で開発された。 材料 １．１ｆｆｉｓＩ−ヨウ素化ｕ−ＰＡＲ（１）及びｕ−ＰＡＲ（Ｄ）。 ２、反応用緩衝液中０．１ＭトリスーＨＣｌ中０．１％ウシ血清アルブミン（Ｂ ＳＡ）＋〇、１％ＣＨＡＰＳ＋３００ｍＭＮａＣ１、ｐＨ＝８．１゜３、洗浄用 緩衝液０：反応用緩衝液。 洗浄用緩衝液１：０．１％ＢＳＡのない反応用緩衝液。 ４、反応用緩衝液中に膨張し、１；１に希釈したプロティンＡセファロースＣＬ ４Ｂ（プロティンＡセファロース溶液）。 ５、エッペンドルフプラスチック試験管。 方法 １、反応用緩衝液に希釈した放射性標識化ｕ−ＰＡＲ（１）又はｕ−ＰＡＲ（Ｄ ）（約３．５　Ｘ　１０　’ｃｐｓ／ｍｌ）　１００μｍをエツペンドルフ試験 管に加える。 ２、反応用緩衝液に適当な濃度（即ち２０　ａｇ／ｍｌ）に希釈した精製モノク ローナル抗体を添加し、適切な対照も含める。 ３、穏やかに振とうしながら４℃で１時間恒温培養する。 ４、プロティンＡセファロース溶液５０μｍを加える。 ５、エンド・オーバー・エンド撹拌器上、４℃で１時間恒温培養する。 ６、最後の恒温培養の後、１０．０００ｒｐ■で２０秒間試料を遠心沈殿させる （ミニヒューグ）。 ７、　１ｍｌウェスタン緩衝液０にペレットを再び懸濁し、１０．０００ｒｐ＋ ｏで２０秒間セファロースを遠心沈殿させる。上清を除去する。 ８、段階７を繰り返す。 ９．１＋＋１ウエスタン緩衝液１にペレットを再び懸濁し、１０．００　Ｏｒｐ ｍで２０秒間セファロースを遠心沈殿させる。上清を除去する。 １０　段階９を繰り返す。 １１、ゲル電気泳動用二回濃縮試料緩衝液５０μｍにペレットを再び懸濁し、試 料を５分間煮沸する。 １２、　１０．００　Ｏｒｐｍで２０秒間試料を遠心沈殿させる。 １３、上清を試験管に移し、ガンマ−カウンターで試料を数える。 １４、計数後、６−１６％公配ゲル及び自動ラジオグラフィーで非還元条件下、 ５ＤＳ−ＰＡＧＥにより試料を分析する。 結果 ４つのモノクローナル抗体は、無処理形及び崩壊形で精製ｕ−ＰＡＲへの結合に ついて放射免疫沈降検定法で試験した。キモトリプシン分解の結果、Ｍｒｌ（３ ゜０００のｕ−ＰＡ結合断片及びＭｒ３０−５０，０００範囲の不均質成分の遊 離となり、これは分子の静止を示す。無処理のｕ−ＰＡＲはＭｒ５０−６５，０ ００を有する不均質成分である。ｕ−ＰＡＲＳｕ−ＰＡＲ（１）及びｕ−ＰＡＲ （Ｄ）の画調製品は、実施例１に記載したように１２５■−ヨウ素で放射標識化 し、免疫沈降に付した。図１９Ａは、モノクローナル抗体（それぞれレーン７、 　５．　６．　８におけるｌＲ１２Ｒ１３Ｒ１４Ｒ）ｆｌなる効率を有するＭｒ ５０−６５．０００の範囲のｕ−ＰＡＲ（１）を沈降させることを示す。この違 いは精製ｕ−ＰＡＲに対する異なる親和性を反映しうる。２Ｒ及び４Ｒはｕ−Ｐ ＡＲ（１）を沈殿させるのに等しく効果的であるが、３Ｒは効果がより少ない。 ＩＲによって沈殿されるｕ−ＰＡＲ（１）の量は、非常に少ない。これは、この 抗体と精製ｕ−ＰＡＲとの比較的弱い反応を示すＥＬＴＳＡ結果と一致する（上 記参照）。４つのモノクローナル抗体のプールは個々の抗体の混合効果を反映す る。ｕ−ＰＡＲ（Ｄ）を抗原として用いた場合、免疫沈降の結果、３ＲによるＭ ｒｌ６，０００を有するＵＰＡＲのｕ−ＰＡ結合断片の特異認識となった。２Ｒ 及び４Ｒはほぼ同じ効率を有するＭｒ３５−５０，０００範囲の不均質成分を認 識した。プールしたモノクローナル抗体は、個々の抗体の反応から予想されるよ うに両成分を認識した（図１９Ｂ）。 ウェスタンブロッティングにより測定された通りのＰＭＡ処理ｕ９３７細胞から のｕ−ＰＡＲとモノクローナル抗体との反応性方法 電気泳動。ラエムリに従って、平板ゲル中、直線６−１６％ポリアクリルアミド 濃度勾配で５ＤＳ−ＰＡＧＥを実施した（止揚）。試料は還元条件下とした。 試料は、２−メルカプトエタノールをジチオトレイトールに置き換えた以外、３ 分間１００℃でラエムリ緩衝液中での電気泳動前直ちに還元した。ウェスタンブ ロッティング。ＰＭＡ活性ｕ９３７細胞及びｕ９３７ａのトリトンＸ−１１４抽 出物からの清浄相の試料を、それぞれ非還元条件下、６−１６％公配ゲル上５Ｄ Ｓ−ＰＡＧＥに付した。分離した蛋白をニトロセルロースフィルターソート上に エレクトロプロットした。ノーツをトリス緩衝・食塩水ｐＨ８，０中１％脱脂粉 乳で妨害し、５ｍｍ片に切った。これらを妨害用溶液に希釈したｕ−ＰＡＲ又は 対照血清（即ちマウス抗ｕ−ＰＡＲ血清及びマウス非免疫血清）に対する、実施 例１に記載したように調製したマウスモノクローナル抗体ＩＲ，２Ｒ，３Ｒ及び ４Ｒと恒温培養した。片を妨害用溶液（上記参照）中０．０５％トゥイーンに浸 漬し、二次抗体［アルカリホスファターゼ複合ウサギ抗マウスＩｇ（ダコパッ゛ 人コペンハーゲン）］と恒温培養し、ニトロブルーテトラゾリウム１５−ブロモ −４−クロロ−３−インドチルホスファターゼで展開した。 結果 ＰＭＡ処理ｕ９３７及びｕ９３７ａ細胞からの清浄相内に含まれるｕ−ＰＡＲに 対する４つのモノクローナル抗体の反応性を、それぞれウェスタンブロッティン グにより分析した。ｕ−９３７細胞は５Ｏ−６５ＫＤ範囲にｕ　−Ｐ　Ａ　Ｒ蛋 白を発現し、ｕ９３７ａ細胞はさらにｕ−ＰＡＲ変異体系４Ｏ−４５ＫＤを発現 する。図２０Ａに示すように、モノクローナル抗体ＩＲ（レーン１）はウェスタ ンブロッティングで何の反応も示さなかったが、２Ｒ，３Ｒ及び４Ｒ（それぞれ レーン２．３及び４）はｕ−ＰＡＲに対して予想された分子量を有する蛋白を認 識した。４Ｒは非常に弱い反応を与えた。図２０Ｂは、ｕ９３７ａ細胞からのｕ −ＰＡＲとの反応性のパターンを示す。ＩＲ（レーン１）はｕ−ＰＡＲとの反応 を示さなかった。 ２Ｒ及び３Ｒ（それぞれレーン２及び３）はｕ−ＰＡＲの高及び低分子量形の両 方を認識し、一方４Ｒ（レーン４）はｕ−ＰＡＲの低分子量変異体を優勢に強く 認識した。 結論 これらの実験の結果から、４つのモノクローナル抗体ＩＲ，２Ｒ，３Ｒ及び４Ｒ は全てｕ−ＰＡＲに向けられ、これらはｕ−ＰＡＲ分子上の異なるエピトープを 認識すると結論される。 ＩＲ：抗体はｕ−ＰＡＲの非ｕ−ＰＡ結合部分に結合する。抗体はＥＬＩＳＡで 反応性なだけである。蛋白を５ＤＳ−ＰＡＧＥ及びエレクトロブロッティングに 付すと、この抗体により認識されるエピトープは崩壊する。 ２Ｒ：抗体はｕ−ＰＡＲの非ｕ−ＰＡ結合部分に結合する。それが向けられるエ ピトープは５ＤＳ−ＰＡＧＥ及びエレクトロブロッティングにより破壊されない 。ウェスタンブロッティングにおいて、ＰＭＡ活性化ｕ９３７ａ細胞がらのｕ− ＰＡＲの高及び低分子量グリコシレージョン変異体の両方とそれが反応すること で４Ｒと異なる。 ３Ｒ：抗体はｕ−ＰＡＲのｕ−ＰＡ結合部分と結合する。それが向けられるエピ トープは５ＤＳ−ＰＡＧＥ及びエレクトロブロッティングにより破壊されない。 ４Ｒ１抗体はｕ　−Ｐ　Ａ　Ｒの非ｕ−ＰＡ結合部分に結合する。それが向けら れるエピトープは５ＤＳ−ＰＡＧＥ及びエレクトロブロッティングにより破壊さ れない。それは、ＤＭＡ活性化ｕ９３７ａ細胞からのｕ−ＰＡＲの低分子量グリ コシレージョン変異体とほとんど独占的に反応するので２Ｒと異なる実施例６ ＥＬＩＳＡによるｕ−ＰＡＲの定量 生物学的材料：実施例１で記載したように精製したｕ−ＰＡＲ親和性。 実施例４に記載したように精製したモノクローナル抗体ＩＲ，２Ｒ，３Ｒ及びＲ ０ モノクローナル抗体のビオチン化（ゲストン、Ｊ−Ｌら、ジャーナル・オン・ヒ ストケミカル・シトケミストリイ、２７．１９７９．１１３１−１１３９参照） 材料 １．１■ｇ／ｍｌの濃度で精製抗体。 ２１反応用緩衝液：　０．ＩＭＮａＨＣＯｓ、ｐＨ９，５゜３、希釈ジメチルホ ルムアミド中ＢＸＮＨ８（ビオチンのＮ−ヒドロキシコハク酸イミドエステル＋ スペーサー基）の貯蔵溶液：　０．ＩＭＢＸＮＨ８０４、ＰＢＳ緩衝液、ｐＨ７ ，４（ＰＢＳ）。 ５、透析管 ６．８７％グリセロール 方法 ２１１　（２ｍｇ）の精製抗体を５００ｍ１．０．１ＭＮａＨＣＯ，、ｐＨ９， ５で２時間、次いで５００ｍ１０゜ＩＭＮａＨＣＯｓ、ｐＨ９，５で一夜４℃で 透析した。４５．６ｇ１Ｏ，ＩＭＢＸＮＨ３を透析した抗体に加え、次いでこれ を１時間室温で光から保護して、ゆるやかに磁気撹拌しつつ恒温培養した。恒温 培養後、反応溶液を２４時間４℃で、４回更新で、５００ｍＬＰＢＳ、ｐＨ７， ４に対し透析した。ビオチン化抗体を８７％グリセロールで１：１に希釈し、− ２０℃で保存した。 ｕ−ＰＡＲの測定 材料 １．９６ウエル・プレート（平底高結合能力、ヌンク）。 ２、未標識化精製モノクローナル抗体４Ｒ。 ３、ビオチンで標識した精製モノクローナル抗体２Ｒ０４、西洋ワサビベルオキ シダーゼ複合（ＨＲＰ）ストレプトアビジン（ＤＡＫＯ。 コペンハーゲン）。 ５、ＰＢＳ緩衝液、ｐＨ７，４（ＰＢＳ）。 ６、ＰＢＳ＋０．１％トウイーン２０、ｐＨ７，４（ＰＢＳ／ｌ−ウィーン）。 ７、妨害用緩衝液：　ＰＢＳ中１％脱脂粉乳（ＳＭＰ）。 ８、クエン酸塩緩衝液・０．１Ｍクエン酸塩、ｐＨ５，０゜９、基質溶質　クエ ン酸塩緩衝液中１，２−フェニレンジアミン−塩酸塩（ＯＰＤ）錠、例えばクエ ン酸塩緩衝液１５ｍ１＋ＨｚＯｚ　（３０％）５μｍ中４０ＰＤ錠。 １０、停止用緩衝液＋　ＩＭＨ，ＳＯ２゜方法 １．０．１ＭＮａ２ＣＯｓ　（ｐＨ９，８）中に希釈した精製モノクローナル抗 体４Ｒ（２０μｇ／ｍｌ）　１００μｍでウェルを被覆する。 ２．４℃で一夜恒温培養する。 ３、ＰＢＳ／！−ウィーンで５回ウェルを洗浄する。 ４、ウェル中に残っている活性部位を１％ＳＭＰ／ＰＢＳ、２５０ｐｌ／ウェル で少なくとも１時間３７℃で妨害する。 ５、段階３のように洗浄する。 ６、未標識化標準抗原溶液の連続希釈１００μｍを添加する。 ７、ゆるやかに振とうしながら、最小１．５時間、室温で恒温培養する。 ８、段階３のように洗浄する。 ９、ビオチン標識化モノクローナル抗体２Ｒ（濃度５００ｎｇ／ｍｌ）　１００ μｍを添加する。 １０、段階７のように恒温培養する。 １１、段階３のように洗浄する。 １２、ＳＭＰ／ＰＢＳ／ｌ−ウィーンに１　：　５０００に希釈したＨＲＰ−ス トレブアビジン（ＤＡＫＯ、コペンハーゲン）１００μｍを添加する。 １３、段階７のように恒温培養する。 １４、段階３のように洗浄する。 １５、二回蒸留水で１回洗浄する。 １６、基質溶液１００１１１／ウエルを添加する。 １７、鮮やかな黄色が現れたとき、１ＭＨ２Ｓ０４１００μｌ／ウエルで５−１ ０分、反応を停止する。 １８．４９０ｎ園フイルターの付いたＥＬＩＳＡ読み取り機で読む。 モノクローナル抗体４Ｒをｕ−ＰＡＲに対する親和性精製ポリクローナル抗体と 置き換え、同様の実験を実施した。ｕ−ＰＡＲに対するポリクローナル抗体はＡ 、非標識捕捉抗体：ＩＲ，２Ｒおよび４Ｒ，アフィニティー精製ポリクローナル 抗−ｕ−ＰＡＲウサギ抗体。 ビオチン−標識検出抗体：ｕ−ＰＡのＢ−鎖と反応するモノクローナル抗体（例 えば、クローン２および５、ニールセン等、ジャーナル・オン・イムノアッセイ 、７巻、１９８６年、２０９〜２２８頁）。 Ｂ、非標識捕捉抗体：ｕ−ＰＡのＢ−鎖と反応するモノクローナル抗体。 ビオチン−標識検出抗体：ＩＲ，２Ｒまたは３Ｒ，アフィニティー精製ポリクロ ーナル抗−ｕ−ＰＡＲウサギ抗体。 下記の組合せの試薬は、ｕ−ＰＡＲ単一またはｕ−ＰＡとの複合体の測定に有効 であると思われる： Ａ、非標識捕捉抗体二モノクローナル抗体ＩＲ，２Ｒまたは４Ｒ、アフィニティ ー精製ポリクローナル抗−ｕ−ＰＡＲウサギ抗体。 検出試薬：ビオチン−標識検出抗体３Ｒ、ビオチニル化ＤＦＰ−ｕ−ＰＢ、非標 識捕捉抗体：　３Ｒ，ＤＦＰ−ｕ−ＰＡ０ビオチン−標識検出抗体：モノクロー ナル抗体ＩＲ，２Ｒまたは４Ｒ。 アフィニティー精製ポリクローナル抗−ｕ−ＰＡＲウサギ抗体。 ｕ−ＰＡＲＥＬＩＳＡａの上記の種々の型において、３Ｒモノクローナル抗体は 、ｕ−ＰＡＲの１６ｋＤのｕ−ＰＡ結合断片で免疫化により産生したポリクロー ン抗体により置換し得る。ＩＲ，２Ｒおよび４Ｒモノクロ一ンル抗体は、実施例 ４記載と同様にｕ−ＰＡＲのＭｒ３５〜４５ｋＤの非−ｕ−ＰＡ結合断片で免疫 化により産生じたポリクローナル抗体により置換し得る。 実施例１０ ｕ−ＰＡＲ抗体による細胞表面プラスミノーゲン活性化の阻害材料および方法 Ｕ９３７細胞上のｕ−ＰＡＲ結合ｕ−ＰＡによるプラスミノーゲン活性化を、詳 細に上述（エリス等、１９９０年）されているとおりに決定した。簡単に述べる と、種々濃度のプラスミノーゲン（０，０９μＭおよび２．２６μＭ）をプラス ミン特異性蛍光原性基質Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−ＡＭＣ（バケム、スイス）の 存在下、Ｕ９３７細胞（活性ｕ−ＰＡと共に前もって恒温培養し続いて洗浄した ）と共に恒温培養した。プラスミン発生は基質の加水分解による蛍光の増加の変 化率から決定した。蛍光は励起および発光波長を各々３８０ｎＩｌおよび４８０ ｒｌｌｉで測定した。これらのプラスミン発生率は次いで、二重逆数法でプラス ミノーゲン濃度に対してプロットし、反応に対する個々の反応速度定数、Ｋｍお よびＶｍａｘを決定した。最高反応速度Ｖｍａｘは、Ｖｍａｘをｕ−ＰＡＲに結 合したｕ−ＰＡの濃度で割ることにより、触媒反応速度定数Ｋｃａｔに変換した 。 Ｕ９３７細胞上のｕ−ＰＡＲに結合したｕ−ＰＡの濃度は、反応速度実験と平行 して＋２５１−ｕ−ＰＡ（エリス等（１９９０年）により記載のとおり調製）を 細胞と恒温培養し反応速度実験と同じ処理をして決定した。ｕ−ＰＡＲに結合し た＋！′Ｉ−ｕ−ＰＡは一般的なガンマ−・カウンティング技法を用いて定量し た。 結果 Ｕ９３７細胞上でｕ−ＰＡＲに結合したｕ−ＰＡによるプラスミノーゲン活性化 の反応速度論 Ｕ９３７細胞上のｕ−ＰＡＲに結合したｕ−ＰＡは、ｕ−ＰＡＲが存在しない場 合に示すのとは異なる反応速度特性を示して天然基質プラスミノーゲンを活性化 することが認められた。ｕ−ＰＡＲ結合ｕ−ＰＡによるＧｌｕ−プラスミノーゲ ンの活性化は、明らかにミカエリス・メントン型反応速度機構に従った。これは に−が０６７μＭ、　ｋｃａｔが５．６／分であることに特徴づけられた（図２ ２）。これらの両者の定数は溶液中、すなわちＵ９３７細胞が不在のときにｕ− ＰＡで得られたものとは異なっていた。この場合、Ｋ園は２５μＭ（細胞関与ｕ −ＰＡＲが不在の場合のプラスミノーゲン親和性が約４０倍低いことと等価であ る）と非常に高く、ｋｃａｔは４４／分（細胞関与ｕ−ＰＡＲが不在の場合の触 媒速度が約８倍高いことと等価である）と高かった。従って、Ｕ９３７細胞上で ｕ−ＰＡＲに結合したＵ−ＰＡはプラスミノーゲン活性化を誘起し、溶液中でよ りも低いプラスミノーゲン濃度で飽和されるが、触媒反応速度の低下を伴う。し かしながら、全体的な効果をみると、Ｕ９３７細胞上のｕ　−Ｐ　Ａ　Ｒに結合 している場合、ｕ−ＰＡの触媒効率（ｋｃａｔ／Ｋｍ）が５倍増加する（表５） 。プラスミノーゲン（およびプラスミン）はＵ９３７細胞およびその他広範な種 類の細胞（エリスら、１９８９年ニブロウら、１９８６年）に結合することが知 られているので、これらの定数はｕ−ＰＡＲを有する細胞の表面で起こるプラス ミノーゲン活性化、すなわち細胞表面プラスミノーゲン活性化の程度を表す。 図５でも、ＰＭＡ刺激Ｕ９３７細胞上でｕ−ＰＡＲに結合したｕ−ＰＡによるプ ラスミノーゲン活性化の類似の測定結果を示す。プラスミノーゲン活性化のＫｍ は今回は１．４３μＭであり、溶液中の反応の場合に比べるとまだかなり低い。 しかしながら、ｋｃａｔもまた５、６７分から１２３／分に低下するので、非刺 激細胞と比較した場合、全体的にはプラスミノーゲン活性化（ｋｃａｔ／Ｋｍ） は約１０倍低下する結果となる。 表５ ｕ−ＰＡＲ関与Ｕ９３７の存在下、Ｇｌｕ−プラスミノーゲン活性　化の反応速 度定数 Ｋｍ　ｋｃａｔ　ｋｃａｔ／　Ｋｍ　溶液中のり−ＰＡ　２５μＭ　４４／分　 １．７６／μＭ・分Ｕ９３７細胞上の　０．６７　５．６　８．３６ｕ−ＰＡ− ｕ−ＰＡＲ ＰＭＡ−Ｕ９３７上の　１．４３　１．２３　０．８６ｕ　−Ｐ　Ａ　−ｕ　− Ｐ　Ａ　Ｒ ｕ−ＰＡＲのポリクローナル抗体による細胞表面プラスミノーゲン活性化の阻害 精製したｕ−ＰＡＲに対して上昇したポリクローナルウサギ抗体（実施例１１参 照）を用いて、前章で実証されたｕ−ＰＡの細胞表面プラスミン発生ど活性化活 性が、確かにｕ−ＰＡＲに結合したｕ−ＰＡによるものであることを証明し、ま たこの抗体が溶液中ｕ−ＰＡＲに対するｕ−ＰＡの結合を実際に妨害することを も証明した。 最初に、溶液中のｕ−ＰＡ活性に及ぼすこの抗体の効果を決定した。４回の実験 で抗ｕ−ＰＡＲ（１００μｇ／ｍｌ、３０分）により残存ｕ−ＰＡ活性は９０． １＋９゜３％になり、それに対して同じ動物から採った免疫前ＩｇＧでは８８． ６＋１２゜３％であった。従って、抗ｕ−ＰＡＲ抗体はｕ−ＰＡ活性を特異的に 阻害することはなかった。 ２５μｇ／ａ＋１の濃度で３０分間Ｕ９３７細胞と前もって恒温培養した場合、 抗Ｕ−ＰＡＲ抗体は結果的におこるプラスミノーゲン活性化活性を７６％（３回 の実験の平均、６６％−８２％の範囲）に減少させた。免疫前ＩｇＧが１％未満 しか阻害しないのに対して、一方ＤＦＰ−ｕ−ＰＡは９０％阻害した（３回の実 験で７４％−１００％の範囲）。従って、抗ｕ−ＰＡＲポリクローナル抗体は細 胞表面プラスミノーゲン活性化を効果的に阻害する。 ｕ−ＰＡＲに対するモノクローナル抗体による外来性ｕ−ＰＡにより開始された 細胞表面プラスミノーゲン活性の阻害４種のモノクローナル抗体ＩＲ，２Ｒ１３ Ｒおよび４Ｒのうち、３種は、上記の方法により試験した濃度（５０μｇ／ｍｌ まで）で細胞表面プラスミノーゲンの活性化の阻害に効果がないことが判明した 。これらは、ＩＲ，２Ｒおよび４Ｒであった。しかしながら、モノクローナル抗 体３Ｒは、図２３に示したようにプラスミノーゲン活性化を強く阻害した。この 阻害は約０．０７μｇ／ｍｌの抗体濃度で最強の半分であった。 モノクローナル抗体３Ｒは、また、実施例１に記載と同様に行った架橋実験によ り試験したようにＵ９３７細胞上ｕ−ＰＡＲに対して＋２５Ｉ標謙化ＤＦＰ−処 理ｕ−ＰＡの結合を十分に阻害した。抗体ＩＲ，２Ｒおよび４Ｒは、ＤＦＰ−ｕ −ＰＡ結合を阻害しなかった。 マウスＴｇＧに対して市販のＦＩＴＣ−（フルオレセインイソチオシアネート） 標識抗体を用いて標準フローサイトメトリー法の使用により、２種の抗体３Ｒお よび４Ｒは、新たに製造したヒト単球に十分に結合したことが見出された。３Ｒ の結合は、外来性付加ｕ−ＰＡとのブレインキュベーションにより完全に阻害さ れ、４Ｒの結合はｕ−ＰＡとのプレインキュベーションにより影響を受けなかっ た。 従って、３Ｍ抗体は、その特定細胞受容体にするｕ−ＰＡの結合を阻害する。 この相互反応は細胞表面上プラスミン蛋白分解活性の発生に必須のものである。 ３Ｒを含むモノクローナル抗体はｕ−ＰＡが結合した細胞、即ち細胞をｕ−ＰＡ とインキュベートし、ついでモノクローナル抗体とインキュベートした細胞によ る細胞表面プラスミノーゲン活性に対して影響を及ぼさない。 ｕ−ＰＡＲに対するモノクローナル抗体による外来性プローｕ−ＰＡにより開始 した細胞表面プラスミノーゲン活性化の阻害方法 Ｕ９３７ａ細胞の存在下プローｕ−ＰＡおよびプラスミノーゲンの混合物からプ ラスミノの生成を最初に開示した方法（エリス　Ｖ等、１９８９年）の修飾法に より測定した。Ｕ９３７ａ細胞を洗浄し、酸処理（ベーレンド等、１９９０年） し、３０分間３７℃で２ｍｇ／ｍｌ脂肪酸無含有ＢＳＡを含むＰＢＳ中様々な濃 度のモノクローナル抗体とインキュベートし、ついで同じ緩衝液で１回洗浄する 前に、細胞に結合した外来性ｕ−ＰＡの微量を除去した。ついで、細胞を、０゜ ０５Ｍトリス−ＨＣｌ　ｐＨ７，４、ブｏ−ｕ−ＰＡ　（１，２ＭＭ）を含む０ ゜１Ｍ　ＮａＣ１、プラスミノーゲン２（０，１４ＵＭ）およびプラスミン特異 性蛍光ペプチド基質である０、２ｍＭ　Ｈ−Ｄ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ７−７ ミドー４−メチルクマリン中２Ｘ１０’セル／ｍｌの最終濃度でインキュベート した。このインキュベーションを、３７℃に保温した１０ｍｍプラスチック製蛍 光光度計キュヘット中行い、微小磁気撹拌機を備えたパーキン−エルマーＬＳ− ５ルミネセンス分光光度計中静かに撹拌した。プラスミン生成を蛍光強度におけ る変化率から測定した（エリス等、１９９０年）。対照実験において、抗−ｕ− ＰＡＲ抗体は５０Ｕｇ／ｍ］までの抗体濃度で細胞の不在下プラスミノーゲンに 対して影響を及ぼさないことが判明した。 結果 プローｕ−ＰＡ依存プラスミノーゲン活性化は、プローｕ−ＰＡおよびプラスミ ノーゲン両方の細胞結合を必要とするこの効果でＵ９３７細胞の存在下非常に増 強したことが判明した（エリス等、１９８９年）。図２４は、プローｕ−ＦＡお よびプラスミノーゲンが酸洗浄０９３７ａ細胞とインキュベートし、プラスミン 生成をタンパク質の付加時間から細胞の存在下直接測定した機構でこの効果を表 す。図はｕ−ＰＡＲに対して生成する４種の抗体それぞれで細胞を前もってのイ ンキュベーションした効果も示す。抗体３Ｒが、ことを示し得る実施例６ ｕ−ＰＡＲｍＲＮＡ用時ハイブリッド形成およびｕ−ＰＡＲの免疫染色用時ハイ ブリッド形成 材料および方法 材料　下記の材料は表記した供給源から得た：Ｔ７およびＴ３ポリメラーゼ、ｐ ブルースクリプト（Ｂ　１ｕｅｓｃｒｉｐｔ）　Ｋ　Ｓ　（＋　）プラスミドベ クター（ストラタジン；ＣＡ、ＵＳＡ）；ＲＮＮアシンよびＤＮアーゼ■（プロ メガ、Ｗｌ、ＵＳＡ）；［３５］Ｓ−１ＪＴＰ（１３００Ｃｉ／ｍｍｏｌ）（Ｎ ＥＮデュポン、ＭＡ、ｔＪｓＡ）＋ジチオスレイトールおよび制限エンドヌクレ アーゼ（ベーリンガーマンハイム、マンハイム、ＦＲＧ）；に５オートラジオグ ラフイクエマルジヨン（イルフォード、チェシャー、英国）、ホルムアミド（フ ル力、ブッチス、スイス）、さけ精子ＤＮＡ（タイプ■、シグマ、ＭＯ，ＵＳＡ ）、他のすべての材料は既述と同様である（クリステンセンら、１９８４年：ク リステンセンら、１９９０年）か、十分入手可能な等級のものである。 組織調製　手術後、結腸の腺癌を有する１３人の患者からの組織標本を切取し、 ４％または１０％（重量／容量）ホルマリン−０，９％ＮａＣ１溶液中に２４− ４８時間放置した後、パラフィンワックスに固定した。 ＲＮＡプローブの調製　完全なひとｕ−ＰＡＲｃＤＮＡ（実施例３参照）は標準 的技術を用いてサブクローンしくマニアチスら、１９８２年）、２種のサブクロ ーンを調製した：ｐブルースクリプト中ｐＨＵＲＯ４：ＰｓｔＩ（１８４）−Ｐ ｓｔｌ（４５１）フラグメントおよびｐＨＵＲＯ６：ＢａｍＨＩ（４９７）−Ｂ ａｍＨＩ（１０８１）フラグメント、塩基対数は実施例３中に表記した配列に対 応している。精製プラスミド調製物はＣｓＣ］勾配中でバンドとしくｂａｎｄｉ ｎｇ）プラスミドをＳｍａｌ制限エンドヌクレアーゼ（ｐＨＵＲＯ４）または５ ｐｅｌおよびＥｃｏＲＩ（ｐＨＵＲｏ６）を用いて転写のために直線状にした。 直線状プラスミド５μｇをフェノールおよびクロロホルム／イソアミルアルコー ル（２５：１）を用いて抽出し、エタノールで沈澱させ、水に再溶解した。各転 写反応は直線状ＤＮＡ鋳型（１Ｍｇ）、ＲＮアシン（４０Ｕ）、４ＯｍＭトリス ーＣＩ、ｐＨ７，６，６ｍＭ　ＭｇＣｌ２．１０ｗＭ　ＮａＣ１，２ｍＭスペル ミジン、１０ｍＭ　ＤＴＴ、１ｍＭ　ＧＴＰ、１ｍＭ　ＡＴＰ、１ｍＭＣＴＰ、 ４μＭ［３５］５ＵＴＰおよび関連（ｒｅｌｅｖａｎｔ）ポリメラーゼ（Ｔ３ま たはＴ７．４０Ｕ）を含む。ｐＨＵＲＯ４鋳型はＴ３ポリメラーゼを用いて転写 し、ＥｃｏＲＩで直線化されたｐＨＵＲＯ６鋳型はＴ７ポリメラーゼで転写し、 アンチセンス転写物を生成する。５ｐｅｌによる消化により直線化したｐＨＵＲ Ｏ６鋳型はＴ３ポリメラーゼで転写し、センス転写物を生成する。 １２０分３７℃にて転写後、鋳型ＤＮＡを、ＲＮアーゼ無含有ＤＮアーゼ（ＩＵ ）、酵母ｔ−ＲＮＡ（２０Ｕｇ）、ＲＮアシン（２０Ｕ）の添加および３７℃、 １５分間のインキュベーションにより除去した。フェノールおよびクロロホルム ／イソアミルアルコール（２５：１）で抽出後、ＲＮＡをエタノールで沈澱させ 、酢酸アンモニウム（最終濃度２Ｍ）添加後、１５０００ｘｇ、４℃、１０分間 遠心分離し、１０ｍＭ　ＤＴＴに再度溶解した。ＲＮＡを１０ｍＭ　ＤＴＴを含 む、ｐＨ１０２のＯ，１Ｍ炭酸ナトリウム緩衝液中で、平均１００ｂｐに加水分 解した。加水分解時間は前記（コックスら、１９８４年）と同様に計算した。加 水分解後、１０ｍＭ　ＤＴＴを含む、同量のｐＨ６，２の０．２Ｍ酢酸ナトリウ ム緩衝液を添加して中性とし、ＲＮＡを上記と同様にエタノールで２度沈澱させ た。ＲＮＡプローブを１０ａ＋Ｍ　ＤＴＴに再溶解し、放射活性をンンチレーシ ョン計数管を用いて測定した。プローブ調製物は常に４　ｘ　ｌ　Ｑ　＠ｃｐｍ ／μｍ以上を含み、ＴＣＡ沈澱可能物の量は通常的９０％であった。ｐＨＵＲＯ ６ブラスミド鋳型の向い合っている鎖から転写された２種の対応ＲＮＡプローブ を１０ｍＭ　ＤＴＴの添加により、同じ放射活性濃度に調製し、脱イオンしたホ ルムアミドを最終濃度５０％になるように添加し、プローブを使用時まで一２０ ℃にて保存した。 用時（Ｉｎ　５ｊｔｕ）ハイブリッド形成　用時ハイブリッド形成を多数の公知 方法（コックスら、１９８４　：アングエール等、１９８７年）から採用した方 法を用いて行った。スライドを０．５％ゼラチン、０．５％クロムミョウバン中 に浸し、室温で乾燥、１８０℃にて３時間焼成し、はこりのない状態で室温にて 保存した。パラフィン断片を切断し、スライド上に置き、６０℃にて３０分間加 熱し、キシレン中で脱パラフィンし、等級化アルコール（ｇｒａｄｅｄ　ａｌｃ ｏｈｏｌ）を通して、ＰＢＳ（０１４Ｍ　ＮａＣ１を含む０．ＯＩＭりん酸ナト リウム緩衝液ｐＨ７，４）に再水和した。 ついでスライドをＰＢＳ中で２回洗浄し、０．２Ｍ　ＨＣＩ中２０分間酸処理し 、ＰＢＳ中で５分間洗浄した。その後、５ＱｉＭ）リス−Ｃ１、ｐＨ８，０中プ ロテアーゼに５Ｍｇ／ｍｌプロテアーゼにおよび５＋ａＭＥＤＴＡ中で７．５分 間インキュベーションし、ＰＢＳ（２分間）中で２回洗浄し、ＰＢＳ中、４（重 量／容量）％パラホルムアルデヒド中２０分間で固定した。固定化剤はＰＢＳ中 で洗浄して除き、スライドをビーカー９１００ｗＭ１−リエタノールアミンに、 マグネチックスクーラー上で浸漬した。溶液を攪拌しながら、無水酢酸を添加し く最終濃度０．２（容／容）％）、添加を５分後くり返す。最後にスライドをＰ ＢＳ中で洗浄しく５分）、等級化アルコール中で脱水し、室温にて風乾した。プ ローブを８０℃にて３分間加熱し、放冷し、ハイブリッド形成混合物に添加した 。最終ハイブリッド形成溶液はＲＮＡプローブ（８０Ｕｇ／μｍ）、脱イオンホ ルムアミド（５０％）、硫酸デキストラン（１０％）、ｔ−ＲＮＡ（１Ｍｇ／μ ｍ）、フィニル４００（０，０２（重量／容量）％、ポリビニルピロリドン（０ ，０２（重量／容量）％、ＢＳＡフラクションＶ（００２（重量／容量）％）、 １０ｍＭ　ＤＴＴ、０．３Ｍ　ＮａＣｌ５Ｏ，５ｍＭ　ＥＤＴＡ、１０ｍＭトリ ス−Ｃ１および１０＋ｇＭ　ＮａＰＯ４（ｐＨ６，８）を含む。ハイブリッド形 成溶液をスライドに適用しくセクション当り、約２０μｍ）、アルコール洗浄、 高圧滅菌カバースリップ（ｃｏｖｅｒ　５ｌｉｐ）で覆った。セクションを、プ ローブ、硫酸デキストラン、ＤＴＴおよびｔ−ＲＮＡを除き、ハイブリッド形成 溶液と同じ混合物（洗浄混合物）１０ｍｌを用いて湿潤化した室内で、４７℃に て一夜（１６−１８時間）ハイブリッド形成させた。ハイブリッド形成後、セク ション上にところどころ形成された気泡の位置をマークし、洗浄混合物中で１時 間５０℃にてインキュベーションしてカバースリップを除いた。洗浄混合物をと り替え、１時間５０℃にて洗浄を継続した。セクションを０．５Ｍ　ＮａＣ１， １ｍＭ　ＥＤＴＡ、１０１１Ｍトリス−Ｃ１（ｐＨ７，２、ＮＴＥ）およびｌＱ ｍＭ　ＤＴＴ中で３７℃にて１５分間洗浄し、ＲＮアーゼ（２０μｇ／ｍｌ）で ＮＴＥ中３７℃にて３０分処理した。 ついでＮＴＥ中３７℃にて（２×３０分）洗浄し、１５ｍＭ塩化ナトリウム、１ ．５ｍＭ（えん酸ナトリウム、ｐＨ７，０および１ｍＭ　ＤＴＴの２リツトル中 で室温にて攪拌しながら洗浄した。ついで、セクションを、すべて３００ｍＭ酢 酸アンモニウムを含む９９％エタノールまでの等級化アルコール溶液中で脱水し 、風乾した。最後に、製造業者の推せんに従って、オートラジオグラフエマルジ ョンを適用し、セクションを乾燥剤入り暗密室箱中で１〜２週間週間曝露像現像 るまで４００にて保存する。 結果 組織を２種の非重複クローンｐＨＵＲＯ４およびｐＨＵＲＯ６からのアンチセン ス転写物およびｐＨＵＲＯ６からのセンス転写物を用いて分析した。 外観が正常な粘膜の領域はすべての場合にハイブリッド形成の徴候がなかった（ 示さず）。 腫瘍の浸潤性病巣には、ｐＨＵＲＯ６アンチセンス転写物を用いた時はハイブリ ッド形成シグナルが常に見られた。特に顕著なハイブリッド形成シグナルが細胞 上の、明瞭な炎症の徴候と周囲の間葉組織の崩壊の領域内の破裂腫瘍腺の先端に 歓察された（図２５ａ−ｂ）。腫瘍腺がより組織的な構造を示す浸潤腫瘍の他の 領域では、ハイブリッド形成シグナルが腫瘍細胞の付着糸状体に密接に結合する 細胞上（図２５−ｄ）か、または腫瘍性乳首自体の漿膜表面に集中した細胞上に 見られた（図２５−ｃ）。セクションから問題となっている細胞型（類）を確実 に同定することも、Ｉシブリッド形成シグナルを示した新生血管形成領域内の細 胞の同定も確定的に確認すること（図２５−ｅ）はできなかった。さらに腫瘍の 当該領域の拡大写真（４００−１０００Ｘ）による検討の後、臭化銀結晶を過ヨ ウ素酸に５分間浸漬して除き、スライドを再検査した。この方法によって、ハイ ブリッド形成を示す細胞をより詳細に検討することができ、現在、この方法で細 胞型（類）の最終的評価を行っている。 ｐＨＵＲＯ６アンチセンス転写物で得られたノゾブリッド形成シグナルは、ｐＨ ＵＲＯ４からのアンチセンス転写物を用いて、隣接セクション上に確認された（ 示さず）。放射活性プローブの非特異的結合はｐＨＵＲＯ６からのセンス転写物 を用いて示し、分析したすべての腫瘍中に、組織セクション上に不均一に分散し たシグナルが生じており、非ハイブリッド形成領域（例えば、正常に見える粘膜 ）でｐＨＵＲＯ６アンチセンス転写物で得られたものと比較すると顕著であった （示さず）。 パラフィン包埋、ホルマリン定着ヒト腫瘍におけるｕ−ＰＡＲの免疫組織学的検 出 抗体・ｕ　ＰＡＲｓクロン２Ｒおよび４Ｅ、精製１ｇＧに対するモノクローナル 抗体 組織−セクション・結腸腺癌の３症例および肺鱗状癌の１症例からの常用法のホ ルマリン定着およびパラフィン包埋組織ブロックを使用した。薄いセクション（ ３〜５ミクロン）をミクロトーム上で切断した。 方法・セクションを２×５分間キシレン中脱パラフィン化し、等級化アルコール 浴を通してＴＢＳ−）リドンに脱水し、室温で１０分間０１％ＣａＣ１，を含む ５０ｍＭ）リス／ＨＣＩ中０．０１％トリプシン溶液で処理した（免疫化による ）。ついで、セクションを脱イオン水を流して５分間洗浄し、ついで室温で１５ 分間５％血清−ＴＢＳ−ＢＳＡ中不活し、最初の抗体はｍ−抗−ｕ−ＰＡＲクロ ーン２Ｒおよび４Ｒであり、阻害対照として、ｍ−抗−ＴＮＰであった。インキ ュベーションをセクションの乾燥を防ぐために湿潤させた箱中−夜４℃または１ 時間３７℃で行った。ＴＢＳ−ｈリドン中５×５分間セクションを洗浄後、第２ のウサギ−抗−マウス−抗体を室温で３０分間適用しくダコバッッ　Ｚ２５９． ５％ウサギ血清−ＴＢＳ−ＢＳＡ中１．５に希釈した）、ついでＴＢＳ−トリト ン中５Ｘ５分で洗浄した。ついで、アルカリホスファターゼ複合体マウス−抗− アリカリホスファターゼを室温で３０分間セクションに適用した（ダコパッッＤ ６５１．５％ウサギ血清−ＴＢＳ−ＢＳＡ中１．２０に希釈した）。最後の洗浄 をＴＢＳ−トリトン中５×５分間、ついでＡＰ−緩衝液中２Ｘ５分間行った。 色素産生基質ＮＶＴ／ＢＣＩＰでの染色は既に記述のように室温で暗室中３０分 間行った（クリステンセン問う、１９９０年、ヒストケミストリー、９３巻、５ ５９〜５６２頁）。セクションをユキット（Ｅｕｋｉｔｔ）でカバーガラスする 前にケルネクトロット（Ｋｅｒｎｅｃｈｔｒｏｔ）で対照染色した。 緩衝液：ＴＢＳ　：　５０ｍＭ　トリス／ＨＣＩ、１５０ｍＭ　ＮａＣｌ　ｐＨ ７，４ＴＢＳ−トリトン、１％トリトンｘ−１００を含むＴＢＳＴＢＳ−ＢＳＡ 　：　０．２５％ウシ血清アルブミン５％ウサギ血清−ＴＢＳ−ＢＳＡ：　５％ 正常ウつギ血清ＴＢＳ−ＢＳＡＡＰ−緩衝液：５ｍＭＭｇＣ］２．１００ｍＭＮ ａＣ１を含む１００ｍＭトリス／ＨＣＩ、ｐＨ９，５ 結果 同じ免疫グロブリン濃度で比較するとき、抗体２Ｒは４Ｒより高い考慮すべき染 色強度を示したけれども、抗体２Ｒおよび４Ｒは４種すべてにおいて同じ組織成 分と反応した。免疫活性物質は、侵襲病巣の腫瘍−基質界面で好中球中、組織法 のサブセット中および細胞中−貫して発見された。対照として使用したｍ−抗− ＴＮＰ抗体とインキュベートしたセクションには染色は見られなかった。同じ種 からの組織セクションを特異的ｕ−ＰＡＲｍＲＮＡの位置付けのために用時ハイ ブリダイゼーションによって前もって試験した（上述、参照）。これら腫瘍中抗 体２Ｒおよび４Ｒで見られるようにｕ−ＰＡＲの免疫組織学的位置付けは、間質 細胞中で発見される、または肉芽組織中存在する侵襲病巣、組織法細胞および好 中球で陽性細胞に関してｕ−ＰＡＲｍＲＮＡ　（用時ハイブリダイゼーション） の分布と実質的に同じであった。血管中に含まれる好中球が関連するかぎり、ｕ −ＰＡＲｍＲＮＡがこれら細胞中発見され得ることを除いて、強いｕ−ＰＡＲ免 疫反応性が発見され得る。 実施例９ 基質スクリーニング概要 様々な連続工程を含む下記の基質スクリーニング概要は、ｕ−ＰＡとｕ−ＰＡＲ の間の界面を阻害するのに使用し得、侵襲および転移工程を阻害する薬剤として 使用される基質を決定することを確実にした。最初の基質のスクリーニングは下 記の基質スクリーニングＥＬＩＳＡを使用して行い、および基質が阻害効果を示 すなら、基質の次のスクリーニングを概要の次ぎの工程を使用して行った。 １、　ｕ−’ＰＡ／ｕ−ＰＡＲ界面を阻害し得る基質のスクリーニングにおける 使用のための基質スクリーニングＥＬ　Ｉ　ＳＡ２種の抗体サンドウィッチＥＬ ＩＳＡアッセイを、溶液中ｕ−ＰＡとｕ−ＰＡＲ間の界面を阻害するためにそれ らの才能に対してスクリーニング基質１）９６−ウェルプレート（平底高結合容 積、ＮＵＮＣ）２）非標識化精製Ｒ４ ３）ビオチン標識化精製抗−ｕ−ＰＡクローン５（ニールセン等、１９８６年） ４）西洋ワサビペルオキシダーゼ複合化（ＨＲＰ）アビジン５）アフィニティー 精製ｕ−ＰＡＲ ６）ＤＦＰ−ｕ−ＰＡ ７）スラミン（ゲルマニン（商標）、ノ＜イニル社製）８）ＰＢＳ緩衝液、ｐＨ ７，４（ＰＢＳ）９）ＰＢＳ　十　領　１％トウイーン２０、ｐＨ７，４（ＰＢ Ｓ／トウィーン）１０）不活緩衝液：　ＰＢＳ中１％スキムミルク、（ウダー（ ＳＭＰ）１１）クエン酸緩衝液＋０．１Ｍクエン酸、ｐＨ５，０１２）基質溶液 ・クエン酸緩衝液中１．２−フエニレンンアミドジヒドロクロリド（ＯＰ　Ｄ） 錠、例えば、クエン酸１５ｍ１中０ＰＤ３錠。 １３）中止緩衝液：ＩＭ　Ｈ２ＳＯ。 製造法 １）Ｏ，ＩＭ　Ｎａ２ＣＯ３中希釈された１００μ１Ｒ４（２０μｇ／ｍ＋）で ウェルをコートする。 ２）４℃で一夜インキユベートする。 ３）ＰＢＳ／トウイーン中ウェルウエル５Ｘする。 ４）ＲＴで少なくとも１時間ウェル中残存活性部位を１％　ＳＭＰ／ＰＢＳ、２ ００μｌ／ウエルで不活する。 ５）工程３）と同様に洗浄する。 ６）ｕ−ＰＡＲ（２０ｎｇ／ｍｌ）の１００μｌを加える。 ７）ＲＴで１時間静かに撹拌しつつインキュベートする。 ８）工程３）と同様に洗浄する。 ９）ＤＦＰ−ｕ−ＰＡ　（１０ｎｇ／ｍ１）１００μ＋および不活緩衝液の混合 物またはＤＦＰ−ｕ−ＰＡ　（１０ｎｇ／ｍ１）１００μｌおよびスラミンの連 続希釈１００μｍの混合物を加える。 １０）工程７）と同様にインキュベートする。 １１）工程３）と同様に洗浄する。 １２）バイオチオニル化抗−ｕ−ＰＡクローン５　（２μｇ／ｍ１）１９９μｍ を加える。 １３）工程７）と同様にインキュベートする。 １４）工程３）と同様に洗浄する。 １５）ＳＭＰ／ＰＢＳ／トウイーン中１　：　５０００に希釈されたＨＲＰ−ア ビジン１００μｍを加える。 １６）工程７）と同様にインキュベートする。 １７）工程３）と同様に洗浄する。 １８）希釈水中１ｘを洗浄する。 １９）基質溶液１００μｍ／ウェルを加える。 ２０）明黄色になるとき、ＬＭ　Ｈ，５Ｏ４１００μｍ／ウェルとの反応を中止 する。 ２１）４９０ｎｍフィルター、バックグラウンド参照として５４０ｎｍフィルタ ーでＥＬＩＳＡリーダーで読み取る。 ２、物質のｕ−ＰＡ／ｕ−ＰＡＲ相互反応阻害能力を試験するための、さらなる 架橋試験 上記スクリーニングＥＬＩＳＡで行ったｕ−ＰＡとｕ−ＰＡＲの間の阻害相互作 用を阻害することが見出された物質の更なる試験が、上記ＥＬＩＳＡで示された 阻害が実際にｕ−ＰＡとｕ−ＰＡＲの間の結合阻害によるものであることを確証 するために行われる。本実施例において、上記ｕ−ＰＡのｕ−ＰＡＲへの結合の 化合物スラミンによる上記阻止の性質がｕ−ＦＡとｕ−ＰＡＲの間の結合の真の 阻害であることが証明される。 材料 ｕ−ＰＡＲ含有ＨＥｐ−２ラリンクス表皮癌セルライン（ベーレントら、１９９ ０）はＡＴＣＣから購入した。ＨＥｐ−２細胞の澄明化分解物は、１％ＣＨＡＰ Ｓを１％トリトンＸ−１１４の代わりに使用した以外、上記のＵ９３７に対して 記載されたと同様の方法で産生された。スラミンは種々の濃度で使用した。 方法 ＨＥｐ−２細胞分解物は４０倍に希釈し、＋２５７−標識ＡＴＦおよび種々の濃 度のスラミン存在下インキュベーションし、続いて化学的架橋および５ＤＳ−フ ァージおよびオートラジオグラフィーによる分析を行った。架橋と分析は実施例 １に記載したように行った。 結果 スラミンはｕ−ＰＡＲおよびＨ３■−標識ＡＴＦの結合反応を、図２８記載のよ うに、用量依存的に阻害することが見出された。１ｍｇ／ｍｌの濃度のスラミン 存在下では結合活性は検出されず、Ｏ，１ｍｇ／ｍｌスラミン存在下では５０％ 以上の結合阻害が観察された。結合活性は放射能標識共有結合形成として定義さ れた。したがって、上記物質スクリーニングＥＬＩ　ＳＡはｕ−ＰＡとｕ−ＰＡ Ｒの間の結合を阻害することが出来る物質を同定するために使用しうるものと結 論出来る。 ３　培養細胞の細胞表面上のｕ−ＰＡのｕ−ＰＡＲに対する結合の阻害能につい ての物質スクリーニング 化合物または抗体のｕ−ＰＡのｕ−ＰＡＲへの結合阻害能は、実施例４に記載の 方法を含む工程として好適に試験される。この実施例では、ポリクローナル抗体 の結合阻害の効果を試験する。図１７より、ポリクローナル抗体がｕ−ＰＡのｕ −ＰＡＲへの結合を阻害することが示される。ポリクローナル抗体を種々の濃度 における試験下で化合物または抗体で、またはモノクローナル抗体で置き換える ことにより、化合物または抗体によるｕ−ＰＡのｕ−ＰＡＲへの結合阻害能を細 胞表面上で評価することが出来る。 ４、種々の型の培養癌細胞におけるプラスミノーゲン活性化阻害能についての物 質スクリーニング。 種々の癌細胞がｕ−ＰＡＲおよびｕ−ＰＡ発現について差を有することが知られ ているので、化合物または抗体のプラスミノーゲン活性化阻害効果は異なった型 の癌細胞で試験する。効果はｕ−ＰＡＲを発現するがｕ−ＰＡを発現しない、そ れゆえ内因性プローｕ−ＰＡを所有しない癌細胞およびｕ−ＰＡＲおよびＵ　− ＰＡの両方を発現し、それゆえ内因性プローｕ−ＰＡをもつ細胞で試験する。ス クリーニングの目的にしたがって、異なった源からの癌細胞タイプを検定に使用 する。 ４ａ、ｕ　−Ｐ　Ａ　Ｒを発現するがｕ−ＰＡを発現しない培養癌細胞における 活性化阻害能に対する物質スクリーニング このスクリーニング検定は、本質的に実施例７に記載したｕ−ＰＡＲを発現する がｕ−ＰＡを発現しない癌細胞タイプＭＤＡ−ＭＢ−４３５（プライス・ジエー ら、１９８７）を使用して行う。 図２３から、モノクローナル抗体Ｒ３（Ｒ１、Ｒ２およびＲ４ではない）が活性 化を阻害する能力のあることがわかる。このモノクローナル抗体を種々の濃度で の試験下、物質で、または他のモノクローナル抗体に置き換えることにより、活 性化の阻止に関する化合物又は抗体の能力を試験することが出来る。 ４ｂ、ｕ−ＰＡＲおよびｐｒｏ−ｕ−ＰＡを発現する各細胞培養における活性化 阻官能に対する物質スクリーニング。 このスクリーニング検定は、ｕ−ＰＡＲとｕ−ＰＡの両方を発現し、それゆえｕ −ＰＡＲおよびｐｒｏ−ｕ−ＰＡをもっている癌細胞で行うべきであり、以下に モノクローナル抗体Ｒ３の活性化阻害能を示した実施例を記載する。 アメリカ合衆国メリーランド州在、ＡＴＣＣから得たＭＤＡ−ＭＤ−２３１細胞 を、２４ウエルの培養プレートに、５％ウシ胎児血清を添加したＤＭＥＭ　（フ ロー・ラボラトリーズ、スコツトランド）中濃度領　２５Ｘ１０’細胞／ｍｌで 、１００μｇ／ｍｌのモノクローナル抗体Ｒ３の存在または非存在下に種付けし た。 細胞を５日間、すなわちフンフルエンスに達するまで培地を変えずに培養した。 この期間後の細胞の計数は、細胞の増殖が抗体の存在によって影響されないこと 証明した。 ｕ−ＰＡＲ媒介プラスミン産生のそれぞれの測定のため、１２ウエルを２５ｍＭ ヘペス、ｐＨ７，４で緩衝化したＤＭＥＭ中で３回、０．２％ＢＳＡ添加ＰＢＳ 中で１回洗浄した。続いて、ウェルを１ウエルあたり２００μｌの１５μｇ／ｍ １Ｇ１ｕ−プラスミノーゲンおよびＣａ４４およびＭｇ４″″を含むＰＢＳ中の ０２ｍＭのプラスミン特異性蛍光物質Ｈ−Ｄ−Ｖａ　ｌ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−ＡＭ Ｃと共にインキュベーションした。３分毎に１５０μ】の０．０５Ｍトリス−Ｈ Ｃｌ。 ｐＨ７，４，０，ＩＭＮａ’ＣＩをマイクロ蛍光測定キュベツトに入れた。産生 プラスミン活性による基質の開裂による蛍光は、ノ（−キンーエルマーＬＳ５蛍 光光度測定器で、励起および発光波長それぞれ３８０および４８０μｍにおいて 測定された。産生プラスミンは３分毎の蛍光の変化速度を測定し、これを活性部 位測定プラスミンを使用して作成した検量線と比較することにより定量した（エ リスら、１９８９）。 図２４は、モノクローナル抗体３Ｒ存在下でＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞を培養し た場合のプラスミン産生についての効果を示す。抗体３Ｒはプラスミン産生速度 を抗体非存在下に培養された対照細胞のそれの２０％に減少させる。した力くっ て、３Ｒが内因的に分泌されたｐｒｏ−ｕ−ＰＡのＰＡＲへの結合、それによる プラスミノーゲン活性化の阻害に効果的であることが証明される。 下記の実施例のモノクローナル抗体を種々の濃度でスクリーニングされるべき化 合物または抗体により、または他のモノクローナルまたはポリクローナル抗体に より置き換えることにより、化合物または抗体の活性化阻害効果を評価すること が出来る。 ５、ヌードマウスにおけるヒト癌細胞の侵襲および転移過程の阻害能に対する物 質スクリーニング。 物質スクリーニング計画の上記前工程に示された物質スクリーニングの最終工程 。 方法 ヌード雌マウス６−８週令ヌ／ヌーＭＥＴＡ／Ｂｏｍ（ボンホルトガード、デン マーク）を下記の形質導入ひと癌細胞で接種する。下記の型のひと癌細胞を使用 し得る：ＭＤＡ−ＭＢ−２３１、ＭＤＡ−ＭＢ−４３５、ＨＴ１０８０　（アン ドレアセンら、１９８６）　、Ｕ９３７およびＭＩＩＩ（クラーク・アールら、 １９８９）。 レトロウイスルトラスダクション 転移腫瘍を可視化するために、測定に使用されるヒト癌細胞型をＬａｃＺ遺伝子 の形質導入で標識し、Ｘガル染色によって可視化するようにする。この形質転換 は先にリンら（１９９０）がＬａｃＺ遺伝子で形質転換したラスー形質転換マウ ス３Ｔ３細胞を使用して行っているが、本明細書の実施例ではヒト癌セルライン を使用している。ＬａｃＺ遺伝子はβ−ガラクトピラノシドをコードし、その活 性は暗青反応を与える発色性基質５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β −Ｄ−ガラクトピラノシド（Ｘ−ｇａｌ）で染色して検出し得る。これによって 又、顕微鏡的転移腫瘍を観察することが出来る。 選択されたヒト癌細胞の形質転換は、下記のように行い得る。 物質の薬物動力学 スクリーニングされる化合物または抗体の薬物動力学的特性がマウスにおける有 効濃度で当該化合物や抗体を投与し、かつ保持するために明確化されなければな らない。 スクリーニングされる化合物または抗体の投与はその化学的性質に依存し、腹腔 内注射または皮下注射、経口投与または局所投与によっそ行われてよい。以下に 、モノクローナル抗体の薬物動力学的特性を試験した実施例を示す。 マウスおよび形質転換癌細胞の前処理 形質転換癌細胞を注射する前にマウスをスクリーニングする化合物または抗体で 前処理することは、化合物または抗体の充分な濃度を得るために有利である。 さらに、マウスに注射する形質転換癌細胞は細胞と化合物または抗体の間の接触 を増加させるために、当該化合物または抗体を含む溶液内でブレインキュベーシ ョンされてよい。通常、この前処理を変化させたり、または除外する若干の実験 が化合物または抗体の全体の効果を明確にし、または推測するために行われるべ きである。 癌細胞接種 形質転換癌細胞は皮下または腹腔内のいずれにも接種することが出来る。 腫瘍増殖の測定 腫瘍増殖は試験する化合物または抗体が、侵襲、転移工程に対する可能的効果に 加えて、腫瘍増殖に影響があるかどうかを明確にするために測定されるべきであ る。増殖は下記のように測定する。 スクリーニング測定の期間 測定の期間は化合物または抗体の性質および侵襲、転移工程に対する効果につい ての影響に依存する。 侵襲および転移工程の測定 化合物または抗体の侵襲、転移工程および腫瘍の増殖に対する効果は、ヒト細胞 とマウス細胞の間の染色による顕著な差を利用して、局所的および／または肺、 リンパ節および腹腔内で評価することが出来る。このような測定の例は下記の６ ）に記載する。 侵襲および転移工程の試験物質の阻害の結果は、ｕ−ＰＡ／ｕ−ＰＡＲ相互反応 がこれらの工程で重要な役割を担っていると考えられる結ＭＡ腺癌、乳管癌およ び鱗状皮膚癌のようなヒト癌における抗侵襲、抗転移薬として良好な候補である ことを示す。従って、適当な毒性学的研究の後、これらは第１相および第２相臨 床試験で試験されるべきである。 ５）ｕ−ＰＡに対するモノクローナル抗体を使用する、マウスにおける侵襲およ び転移工程の阻止。 癌細胞の侵襲および転移工程におけるｕ−ＰＡの酵素的活性の有意性は、下記の ように試験した。その結果とスクリーニング計画の前工程で得られた結果とを併 せて、この方法がυ−ＰＡ／ｕ−ＰＡＲ相互反応を阻害する物質の抗侵襲および 抗転移効果を阻害するのに価値があることを示す。 材料および方法 細胞系 ヒト乳癌セルラインＭＤＡ−ＭＢ−２３１およびＭＤＡ−ＭＢ−４３５を１０％ ０％ウシ胎清添加ＤＭＥＭ中で常法により増殖させた（Ｄｌｏ）。ヌードマウス 実験用細胞は酵素を使用する代わりに細胞回収機を用いて回収した。セルライン を試験し、マイコプラズマ汚染のないことを確認した。 マウス ヌード雌マウス６−８週令ヌ／ヌーＭＥＴＡ／Ｂｏｍ　（ポンホルトガード、デ ンマーク）を使用した。マウスは層状流動クリーンベンチで飼育し、使用したす べての設備はオートクレーブで処理した。 レトロウィルス形質転換 ＬａｃＺ遺伝子を含むＰＡ３１７細胞（ミラー・ニー・ディーら、１９８６）に 包まれたＢＡＧベクター（ＬＴＲ−ＬＡＣＺ−５Ｖ４０　ＰＲＯＭ０ＴＥＲ−Ｎ ＥＯ（商標）ＬＴＲ含有）（プライス・ジエーら、１９８７）のウィルスストッ クを細胞の形質転換に使用した。ネオマイシン耐性遺伝子を形質転換細胞の選択 のために使用した。ヒト癌細胞を感染の１日前に１：１０分割率でプレート上に おいた。細胞を感染させるために、培養培地を４μｇ’／ｍ　］のポリプロピレ ン含有５ｍｌのウィルス上清液で置き換え、５％ｃｏ、インキュベーター中、２ 時間３７℃インキュベーションした。５ｍｌのＤｌｏを添加し、このように形質 転換したヒト癌細胞をインキュベーターに戻した。培地を次の日に新鮮なり１ｏ で置換した。得られた形質転換セルラインはＭＤＡ−ＭＢ−２３１およびＭＤＡ −ＭＢ−４３５ＢＡＧと名付けた。 選択方法 ＢＧＡベクター含有細胞を増殖させるため、感染細胞集団を５００Ａｔｇ／ｍ１ Ｇ４１８含有培地で増殖させた。しかしながら、選択細胞は上記のようにＸ−ｇ ａ１染色によって測定した場合、必ずしもすべてがβ−ガラクトシダーゼを発現 しなかった。したがって、細胞はフルオレッセインージーβ−ガラクトピラノシ ド（ＦＤＧ）−ＦＡＣ５選択をノーランら（１９８８）が記載したように実施し た。この方法では、ＩａｃＺ遺伝子産物であるβ−ガラクトシダーゼを発現する 細胞による非蛍光基質からの蛍光の遊離はフローサイトメトリーにおける細胞の 分離を可能にする。コンフルエントな１００ｍｍ皿をトリプシン処理し、単一細 胞懸濁液をＤ１０中１−５Ｘ１０７細胞／ｍｌに調節した。１００μｍの細胞懸 濁液をファルコン２０５８試験管中で３７℃でインキュベーションした。基質Ｆ ＤＧの細胞による取り込みは、ｄＨ２０中の２ｍＭ　ＦＤＧ１００μｍを添加す ることによる低張刺激により行った。３７℃での１分のインキュベーションの後 、基質を水冷１．８ｍ１Ｄ１０を添加することにより細胞内にトラップした。細 胞を氷の上で１時間インキュベーションし、４８８ｎｍ波長に合わせたベクトン ・ディッキンソン２層し−ザーＦＡＣ５ｔａｒプラスフローサイトメーターで分 類した。 細胞接種 総数２Ｘ１０’腫瘍細胞をそれぞれの横腹の皮下に接種した。腫瘍細胞は常に胸 壁の下に位置した。細胞接種の１日前、５００．ｃｚｇの抗体をマウスに注射し 、２１日後に５００μｇを注射した。マウスは接種後６週間で層殺した。 抗体 ｕ−ＰＡ抗体クローン５に−ルセンら、１９８６）を酵素活性阻害に使用し、無 関係な対照抗体として大麦蛋白に対するＩｇＧ１マウスモノクローナル抗体を使 用した。 形質転換ヒト乳癌細胞系の実験 形質転換細胞はノーザン・プロッティングでｕ−ＰＡおよびｕ−ＰＡＲをコード するｍＲＮＡの存在に対して実験した。 全ＲＮＡはＭＤＡ−ＭＢ−２３１ＢＡＧキセノグラフトがら前記のように抽出し た（チーブウィンら、１９７９）。２５μｇのＲＮＡを２．２Ｍホルムアルデヒ ド含有１．２％アガロースゲルを使用する電気泳動によりサイズ分画した。 ＲＮＡをニトロセルロースフィルターにプロットし、３！Ｐ−標識ｃＤＮＡプロ ーブで５８℃でにおいて８時間櫟準ハイブリダイゼーション緩衝液でハイブリダ イズした（チョムチンスキーら、１９８７）、ｕ−ＰＡのＣＤＮＡはｐＨＵＫ８ を含有しくランドら、１９８７）　、ｕ−ＰＡＲのｃＤＮＡはｐ−ｕ−ＰＡＲ− １を含有した（ローランドら、１９９０）。ハイブリダイゼーションに続き、フ ィルターを、全１時間、６５℃で０．１ｘＳＳＣを３回変えて洗浄した。オート ラジオグラフィーはクロネックス・クアンタ・■増強スクリーンで行った。 培養物中の細胞のＸ−ｇａｌ染色 培養物中の細胞をガラススライドにおき、２日間増殖させてからＰＢＳ中５分間 の０．５％（容量／容量）ゲルタールアルデヒド処理で固定し、ＰＢＳでの３回 の洗浄に続き、３７°ＣでＸ−ｇａｌ染色溶液（ＰＢＳ中１ｍｇ　Ｘ−ｇａｌ／ ｍｌ；３５ｍＭ　フェリシアン化カリウム；　２ｍＭ　Ｍｇ　Ｃｌ　ｚ）中で一 晩インキユベートした。この断片はケネクトロットにより逆染色した。 腫瘍増殖 腫瘍増殖は２元的に１週間に３回測定し、腫瘍面積を測定した。形質転換ゴンペ ルッ機能（リガード・ケーおよびスパン−ドームセン・エム、１９８９）を使用 し、個々の腫瘍の増殖速度（形質転換コンペルッ増殖曲線の傾き）を計算した。 局所侵襲の測定 細胞接種後６週間、すべての動物を頚部脱きゅうにより層殺した。細胞接種部位 の初期腹腔腫瘍を皮膚に向かって腹腔方向から摘出し、これによって腫瘍の片側 に腹腔筋肉壁を、他の片側に皮膚を残した。それぞれの腫瘍は、腫瘍の最も長い 直径に対する垂直切開により２つの部位に分けた。他の切開は腫瘍の境界地核で 行った。組織学的切片は切開の部位により作られる。局所侵襲は腹腔筋肉繊維の 間に位置する腫瘍細胞として定義される。皮膚への侵襲処理は行われなかった。 腫瘍細胞が筋肉繊維に接近して位置しているが、筋肉を分割でしていない場合、 侵襲を除外するため、更に切片を作った。 転移の測定 肝臓、横隔膜、膵臓、膵臓、腸および肺の創見を、それぞれの動物で行った。 器官をＩＸＰＢＳで処理し、４％パラホルムアルデヒドおよび０．　５％ゲルタ ールアルデヒド中、３時間固定した。器官を次にＩＸＰＢＳで３回処理し、Ｘ− ｇａ１溶液（ＰＢＳ中１ｍｇ　Ｘ−ｇａｌ／ｍｌ；３５ｍＭ　フェリシアン化カ リウム；　２　ｍＭ　Ｍ　ｇ　ＣＩ　２）で４℃で一夜染色した。次の日、器官 をＩＸＰＢＳで処理し、ナトリウムアジド中に保存し、ライッツＭＰ　Ｓ　５２ カメラをつけた回転ステレオマイクロスコープで測定した。ヒト腫瘍細胞の転移 の存在を確認するため、種々の組織の青い部分を４％ホルマリンで固定し、常套 の組織学的方法で処理した。器官に１個またはそれ以上の青い部分が存在すると き、それを転移部位に陽性であると記録した。 凍結セクション 器官を４°Ｃ，２時間０．１ＭＰＢＳ　ｐＨ＝４中２％パラホルムアルデヒドに 固定し、次に０．１ＭＰＨ８で処理し、０．ＩＭＰＢＳ中、７％シュクロースで ２時間、１５％ツユクロースで更に２時間脱水し、寒冷断片作成処理に付した。 寒冷断片を次に細胞系に使用される方法にしたがってＸ−ｇａｌ染色した。 架橋測定 ｕ−ＰＡＲを発現し続けるこの形質転換を確立するために、ｕ−ＰＡＲの存在を 上記２）に記載した方法にしたがって、交差結合試験を行った。ｕ−ＰＡＲに結 合するリガンドとしで”Ｉ−ＡＴＦを使用した。 細胞表面プラスミノーゲン活性化の抗−ｕ−ＰＡ抗体による阻害ＭＤＡ−ＭＢ− ４３５細胞のプラスミノーゲン活性化能力は先に記載した懸濁液−増殖細胞用の 方法（エリスら、１９９０）を修正した方法により、測定した。 簡単には、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞を２４ウェルコスタ−トレイ中でコンフル エントに増殖させた。当該トレイは血清を含まないＤＭＥＭ　（フロー・ラボラ トリーズ、スコツトランド）中、プラスミン阻害剤アプロチニン（１０Ｍｇ／ｍ ］）（バイヤー、ドイツ）存在下に維持された。測定の前に、細胞を３回１ＨＥ ＰＥＳ−緩衝化ＤＭＥＭで洗浄し、続いて１５分間室温で１０Ｍｇ／ｍ】のｕ− ＰＡに対するモノクローナル抗体の存在下および非存在下インキュベーションし た（クローン５）。２回の洗浄後、細胞は０．２％ＢＳＡ含有ＰＢＳ　（インキ ュベーション毎に１２ウエルそれぞれに２００μｌ）中、プラスミノーゲン（２ ０Ｍｇ／ｍ１）と特異的蛍光性プラスミン特異性基質Ｈ−Ｄ−Ｖａ　Ｉ−Ｌｅｕ −Ｌｙｓ　−ＡＭＣ（０，２ｍＭ）と共に、３７℃でインキュベーションした。 時間的間隔をおいて１５０μｍの細胞懸濁上澄液を除去し、１５０μｍ０．０５ Ｍ）リスｐＨ７゜４．０．１ＭＮａＣｌで希釈し、蛍光強度をパーキン−エルマ ーＬＳ−５蛍光スペクトロメーター中、ミクロクキュベットを使用し、励起およ び発光波長それぞれ３８０および４８０ｎｍで測定した。プラスミン濃度は各時 間的インターバルをおいて基質の加水分解を計算しくｄＦ／ｄｔ）　、活性部位 力価既知プラスミン（エリスら、１９９０年）を使用した検量線と比較して決定 した。 抗ｕ−ＰＡ−抗体の薬物動力学 それぞれ５匹のヌードマウスからなる７つの群に単一用量のμｇ抗−ｕ−ＰＡ− 抗体クローン５を腹腔内に投与した。注射後０．１．２．４．８．１６および３ ２日後、一群５匹のマウスを採血し、血清を保存した。さらに、腫瘍担持動物を 使用した実験において、血清はすべての抗ｕ−ＰＡ−抗体一処理動物から抗体投 与後１４日に得た。ヌンク・イムノプレート（平底マキシソーブ、ヌンク・工− ／ニス、デンマーク）を−晩４℃で０．ＩＭ　ＮａｚＣＯｓ、ｐＨ９，８中の１ μｇ／ｍＩのｕ−ＰＡ（ＵＫＩＤＡＮ　Ｌｅｏ）で被覆した。過剰のｕ−ＰＡを 洗浄して除き、付加的蛋白結合部位をＰＨ３中の１％脱脂粉とともに１時間イン キュベートした。洗浄後、プレートをマウス血清または試験すべきサンプル中、 抗ｕ−ＰＡ抗体クローン５の標準希釈液と共に、３７℃で１時間インキュベート した。プレートを再び洗浄し、次にビオチン化ウサギ抗マウスＩｇＧ　（ＤａＫ ｏ）と共に更に１時間インキュベートした。さらに洗浄後、プレートをパーオキ シダーゼ結合アビジン（ＤａＫｏ）と共に１時間インキュベートし、パーオキシ ダーゼ反応を０ＰＤ−錠剤と過酸化水素を使用し、０．１Ｍクエン酸−リン酸緩 衝液、ｐＨ５，０中で進行させた。反応を１００μＩ　ＩＭＨ，Ｓ０４の添加に よって停止させ、吸光度を４９０μｍで読み取った。すべてのサンプルについて ２回行った。 結果 ＬａｃＺ形質転換および細胞の選択 ＭＤＡ−ＭＢ−２３１およびＭＤＡ−ＭＢ−４３５細胞は、ＢＡＧベクターに感 染し、ＬａｃＺ遺伝子を図３０に示された細胞のようにもたない限り、Ｘ−ｇａ ｌで染色されない。低いウィスル価（−５Ｘ１０’ｃ　ｆｕ／ｍｌ）のため、各 セルラインの約１％のみがＸ−ｇａｌで陽性に染色されることが最初に見出され た。Ｇ４１８選択に続いて、約６０−７０％のＧ４１８−耐性細胞がＸ−ｇａｌ 染色に基づいてＬａｃＺ遺伝子を発現した。ＬａｃＺ−発現細胞を増殖させるた め、両方の乳癌セルラインをＦＤＡ−ＦＡＣ３選択に付した。ＬａｃＺ形質転換 の安定性を測定するために、形質転換以後２０継代目の細胞をＸ−ｇａｌで染色 した。図３０Ｂに示されるように、ＭＤＡ−ＭＢ−４３５ＢＡＧ細胞はＬａｃＺ 発現細胞の相対数において、わずかな損失を示すのみであった。同様の結果がＭ ＤＢ−ＭＢ−２３１細胞でも得られた（データは示していない）。 形質転換ヒト乳癌セルラインの実験の結果ＭＤＡ−ＭＢ−２３１８ＡＧ腫瘍は、 多くのｕ−ＰＡおよびｕ−ＰＡＲに対す特表千７−５００４８６　（４０） るｍＲＮＡを発現し、”’Ｉ　ＡＴＦは細胞分解物の界面活性剤相にｕ−ＰＡＲ の存在を明らかに証明した。 非形質転換および形質転換腫瘍細胞の比較ヒト腫瘍細胞をＬａｃＺ遺伝子で形質 転換する目的は、ヌードマウス中に拡散させた後、細胞を位置付けることができ るからである。形質転換セルラインのいずれも初期の皮下腫瘍は高度のＸ−ｇａ ｌ染色特異性を表すが、一方非形質転換細胞由来の腫瘍は青く染まらなかった。 これは図３０のＭＤＡ−ＭＢ−２３１およびＭＤＡ−ＭＢ−２３１ＢＡＧ腫瘍に 対して示される（それぞＣおよびＤ）。 同一の結果がＭＤＡ−ＭＢ−４３５およびＭＤＡ−ＭＢ−４３５８ＡＧの染色に 続いて見られた。 イン・ビボにおけるヒト腫瘍細胞の検出両方のＢＡＧラインをヌードマウス中で 連続的に継代し、少なくとも３っ継代後、ＬａｃＺ発現を保持した。初期の腫瘍 の寒冷断片においてＸ−ｇａｌ染色は、ＢＡＧ形質転換ヒト癌細胞に制限された （図３１）。 非形質転換および形質転換腫瘍の両方とも動物の腹腔壁の浸透と共に局所的侵襲 が行われた（示していない）。いずれの腫瘍ラインでも形質転換皮下腫瘍を担持 したマウスからの肝臓、膵臓、膵臓、腸および肺のＸ染色は、腹腔内に位置する 器官内の二次的腫瘍形成の青い染色を示した（図３１（ＢおよびＤ））。二次腫 瘍は種々の腹腔内器官において局所的侵襲を示した（図３１（ＥおよびＦ））。 肺の青い染色部位の組織学的検討は微小転移の存在を確認した（図３１（Ｇ）） 。 未感染腫瘍細胞を接種したマウスまたは腫瘍転移のない器官におけるＸ−ｇａｌ 染色は、陽性ではなかった。 抗ｕ−ＰＡ抗体を使用するマウスにおける侵襲および転移の阻止抗ｕ−ＰＡ抗体 を注射しなかったマウス内のＭＤＡ−ＭＢ−２３１ＢＡＧ腫瘍は、マウスの腹腔 筋肉層に侵襲して成長した。癌細胞は筋肉繊維の中に広がり、しばしば腫瘍細胞 は筋肉の腹腔側に位置し得る。非関連抗体は表６がら明らかなように、局所的腫 瘍侵襲に効果を有しながった。対照的に、抗ｕ−ＰＡ抗体は腫瘍細胞の局所的広 がりを阻害した。表６に示されるように、８匹のマウスのうち５匹は腹腔内器官 に癌細胞の転移的広がりがあった。最も一般的には、腫瘍細胞は肝臓と膵臓の間 管に見いだされた。非関連抗体は腹腔内への転移的形成に効果を有しなかった。 抗ｕ−ＰＡ抗体による注射は、表６に示されるように腫瘍細胞の腹腔内器官への 広がりを有意に阻害した。抗ｕ−ＰＡ抗体の注射により、肺に青斑点のある動物 の数もまた有意に減少した。青斑点の部分に癌細胞が存在することを確認するた めに、幾つかの斑点を切除し、組織学的慣用法により処理した。 表６ 局所的侵襲　腹腔内の広がり　肺転移 対照　１２／１６　５／８　８／８ 大麦抗体　１７／２０　５／１０　９／１０抗ｕ−ＰＡ抗体　６／１６　０／８ 　、　１／８抗ｕ　−Ｐ　Ａ、抗体の腫瘍細胞増殖への効果抗ｕ−ＰＡ抗体の腫 瘍細胞増殖への効果の実験において、抗ｕ−ＰＡ抗体および非関連抗体のどちら も腫瘍増殖の有意な変化の原因とはならないことが示された（示していない）。 薬物動力学 １００μｇの抗ｕ−ＰＡ抗体の単独膜腔内注射は抗体の血清濃度を約２５ｎｇ／ ｍｌにした。血清濃度は評価Ｔ、、、約２１日で僅かに低下するのみである。 文献 アンドレアセンＰＡ、ニールセンＬＳ、クリステンセンＰ１グレンダールーハン センＪ、スフリバーし、ダネＫ（１９８６年）ヒト線維肉腫細胞からのプラスミ ノーゲンアクチベーターインヒビターは、ウロキナーゼ型プラスミノーゲンアク チベーターを結合するが、そのプロ酵素とき結合しない。ジャーナル・オン・バ イオロジカル・ケミストリー２６１　：　７６４４−７６５１アンドレアセンＰ Ａ等、エンドクリノロジー（１９９０年）１２６：２５６７−アンゲールＬＭ、 ストーラＭＨ，アンゲールＲＣ（１９８７年）注釈き調理法。 もとの場所のハイブリダイゼーション。神経生理学への応用。オックスフォード ・ユニバーシティ・プレス、オツクスフォー、ｐｐ、　７１−９６アペラＥ１０ ビンソンＥＡ、ウルリッチＳＪ、ストベリーＭＰ、コルティＡ１カツサ一二Ｇ、 ブラーシＦ（１９８７年）ウロキナーゼのレセプター結合配列。プロテアーゼの 成長因子モジュールのための生物学的作用。ジャーナル・オン・バイオロジカル ・ケミストリー２６２　：　４４３７−４４４０アペラＥ、ウェヴールＪＴ、ブ ラーシＦ（１９８８年）蛋白中の表皮性成長因子様部分の構造と作用。ＦＥＢＳ レタース２３１　：１−４バイパイＡ、ベーカーＪＢ　（１９８５年）ヒト前皮 膚線維芽細胞上の陰性ウロキナーゼ結合部位。バイオケミカル・アンド・バイオ フィジカル・リサーチ・コミュニケーションズ１３３　：　４７５−４８２バイ パイＡ１バカールＪＢ　（１９８５ａ年）バイオケミカル・アンド・バイオフィ ジカル・リサーチ・コミュニケーションズ１３３　：　９９４−１０００／＜カ ーｆｉｖＪ　Ｂ、　ＯつＤＡ、　スイマールＲＬ、　’Ｆ−ユニンカムＤＤ　（ １９８Ｃｕｔ−）　セル２１・３７−４５ バルクホルトＶ１ジエンセンＡＬ　（１９８９年）アミノ酸分析：付加物として のジスルフィド化合物との塩酸加水分解後、蛋白中のシスティンプラス半システ ィンの検定 アナリティカル・バイオケミストリー１７７：３１８−３２２バルナザンＥＳ、 シネＤＢ、バロネに１クオＡ１ラルセンＧＲ（１９８８年）ヒト肉皮細胞に対す るリコンビナント型及び変異ｔ−ＰＡの特異結合。フィブリノリスイス２、補遺 １．２８ ビーベＤＰ　（１９８７年）ヒトへそ静脈付肉皮細胞への組織プラスミノーゲン 活性因子の結合。ソロンボスイス・リサーチ４６　：　２４１−２５４ベルＧｌ 、フォノＮＭ、ステンピアンＭＭ、ウルムステドＭＡ、カブユＤ１りＬ１ウーダ ＭＳ、ラルＳＢ、サンチェーペスカドールＬ　（１９８６年）（ヒト表皮性成長 因子プレカーサー・ＣＤＮＡ配列、インヒドロ発現及び遺伝子体制）ヌクレック ・アンド・リサーチ１４　：　８４２７−８４４６ブラーシＦ　（１９８８年） フィブリノリスイス２　：　７３−８４ウロキナ一ゼプラスミノーゲンアクチベ ーター用表面レセブターブラーシＦ１ストベリーＭＰ、キュベリＭＶ（１９８６ 年）ウロキナーゼプラスミノーゲンアクチベーター用レセプター。ジャーナル・ オン・セル・バイオロジカル３２　：１７９−１８６ ブラーシＦ、ヴアサリーＪ−ＤＰ、ダネＫ（１９８７年）ウロキナーゼ型プラス ミノーゲン活性化因子・プロ酵素、レセプター及びインヒビター。ジャーナル・ オン・セル・バイオロジカル１０４：８０１−８０４ボルデイアＣ（１９８１年 ）トリトンＸ−１１４溶液中完全膜蛋白の相分離。ジャーナル・オン・バイオロ ジカル・ケミストリー２５６　：１６０４−１６０７ボイドＤ１フロレントＧ１ キムＰ１ブラテインＭ（１９８８８年）ウロキナーゼのレベルの検定及びヒト直 腸癌細胞系のそのレセプター。キャンサー・リサーチ４８　：　３１１２−３１ １６ ボイドＤ、フロレントＧ５ムラノＧ、ブラテインＭ　（１９８８ｂ年）Ｎ、Ｎ− ジメチルホルムアミドによるヒト直腸細胞系中のウロキナーゼレセプターの変調 。 バイオロジカル・アンド・バイオフィジカル・アクタ９４７　：　９６−１００ デ・ブラインＰＡＦ、クレイマーボウボウスＧ１ウエルスパゲＨＷ、ヴエルイエ ンＪＨ，ドウビイエールＧ１エタルマンＩＴ、ラマールＣＢＨＷ（１９８８年） ソロンボスイス・アンド・ハエモスタスイス６０　：　２　：　２６２−２６６ ブリソジＫ　（１９８６年）正常及び形質転換線維芽細胞　病巣接触での細胞骨 格膜及び外細胞マトリックス成分の体制及び調節キャンサー・リサーチ４　：１ ８−７８プルテインＰ、フォンダネチェＭ−Ｃ（１９８８年）ヒト癌細胞上プラ スミンへのレセプター。ジャーナル・オン・ナショナル・キャンセル・インステ ィテユート８０　：　７６２−７６５ カーベンターＧ１フェン５（１９７６年）ジャーナル・オン・セル・バイオロジ カル７１　：１５９−１７１ チャーゲインＪＭ等（１９７９年）バイオケミストリー２４　：　５２９４−５ ２９コムシンスキーＰ１サクチ、Ｎ　（１９８７年）酸公配チオシアナートーフ ェノール−クロロホルム抽出によるＲＮＡ分離の単一段階方法。アナリティカル ・バイオケミストリー１６２　：１５６−１５９クラークＲ等（１９８９年）Ｐ ＮＡＳ８６　：　３６４９−３６５３コレンＤ１ザマロンＣ１リヨネンＨＲ，ホ イルアルツＭ（１９８６年）プロウロキナーゼによるプラスミノーゲンの活性化 。ジャーナル・オン・バイオロジカル・ケミストリー２６１　＋１２５９−１２ ６６コルサロＣＭ、ベアザンＭＬ（１９８１年）哺乳動物細胞中ＤＮＡ−仲介遺 伝子転移の効率の増強。ツマティック・セル・アンド・モレキュラー・ジエネテ ィックス７：６０３−６１６ コクスＫＨ、ディリオンＤｖ、アンゲールＲＣ（１９８４年）不斉ＲＮＡプロー ブを用いるそれ自体のハイブリダイゼーションによるシー・ウルチン・エンブイ オス中のｍＲＮＡ５の検免。ディベロブメント・バイオロジカル１０１：４８５ キュベリＭＶ、ノリＭＬ、カサ二Ｇ１ブラーシＦ　（１９８６年）ヒトのウロキ ナーゼレセプターへの単一プロウロキナーゼの結合。ジャーナル・オン・バイオ ロジカル・ケミストリー２６１　＋１５８１９−１５８２２キュベリＭＶ、アン ドレアセンＰＡ、ラグノＰ１メイエルＭ１ダネに１ブラーシＦ　（１９８９年） ブロスイーデング・オン・ナショナル・アカデミ−・オン・サイエンスイズＵＳ Ａ８６　：　４８２８−４８３０ダネに１アンドレアセンＰＡ、グレンダールー ハンセンＪ１クリステンセンＰに−ルセンＬＳ、スタンパーＬ　（１９８５年） プラスミノーゲン活性化因子、組織連化及び癌 アドバンスドウ・キャンサー・リサーチ４４　：１３９−２６６ダネにに−ルセ ンＬＳ、ピケＣおよびキラルマンＧＭ（１９８８年）プラスミノーゲン活性化因 子及び新形成。フィジオロジカル・アンド・クリニカル・アスペクトＣ１クルフ ト編、ＣＲＣ出版、ポカ・レイトン１９８８年ｐｐ、１９−４６ダネに等（１９ ９０年）モレキュラー・バイオロジー・オン・ザ・カーディオバスキュシー・シ ステム１３２巻１７３−１８６デ・デユープＣ、デュ・パルスイＴ、ポーμＢ、 トユルーエＡ１トユルケンズＰ、ヴアン・オーツＦ　（１９７４年）バイオロジ カル・ファーマコロジー２３：２４イートンＤＬ、スコツトＲＷ、ベーカーＪＢ 　（１９８４年）ヒト線維芽細胞ウロキナーゼプロ酵素の精製及びプロテアーゼ 及びプロテアーゼネキシンによるその調節。ジャーナル・オン・バイオロジカル ・ケミストリー２５９：６２４１−６２４フ イリスＶ、スカーリーＭＦ、カキャールＶＶ（１９８７年）機能分離中単鎖ウロ キナーゼによるプラスミノーゲン活性化。ジャーナル・オン・バイオロジカル・ ケミストリー２６２　：１４９９８−１５００３１スｖ、　スカ−！Ｊ−ＭＦ、 カキャールＶｖ（１９８８年）調節単鎖ウロキナーゼ初発プラスミノーゲン活性 化におけるヒトＵ９３７単核球の役割。フィブリノリスイス２：サブルメント１ ．１１２イリスＶ１ス力−リーＭＦ、カキャールＶＶ（１９８９年）単鎖ウロキ ナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子により開始したプラスミノーゲン活性化。 ジャーナル・オン・バイオロジカル・ケミストリー２６４・２１８５−８８イリ スＶ１ツエーチエイン・ラン、ベーレントＮルネＥ１ダネＫ　（１９９０年）プ ラスミノーゲン活性化因子阻害剤によるレセプター結合ウロキナーゼの阻害ジャ ーナル・オン・バイオロジカル・ケミストリー２６５．９９０４−９９０８エス トリシヤールＡ１ウールエンドＡ１ベリンＤ１スクリーニングＷ−Ｄ、ヴアサリ Ｊ−Ｄ　（１９８９年）ウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子に適した細 胞結合の特徴づ１九ジヤーナル・オン・バイオロジカル・ケミストリー２６４： １１８０−１１８９ ファグソンおよびウィリアムス（１９８８年）グリコシルーホスファチジルイノ ントル構造を経る蛋白の細胞表面沈降。アニューアル・レヴユー・バイオケミカ ル５７：２８５−３２０ ケントンＣ１クリユイトフＥＫＯ、スクリーニングＷ−Ｄ（１９８７年）ジャー ナル・オン・セル・バイオロジカル１０４　：　７０５−７１２グレンダールー ハンセンＪ１アゲ−リンＮ１ムンクホルムーラーセンＰ１バチＦに−ルセンＬＳ 、　ドンベルノスキーＰ１ダネＫ（１９８８年）ウロキナーゼ型プラスミノーゲ ン活性化因子に適した、感受性で特異的酵素結合免疫吸着剤検定及び胸痛を伴う 患者からの血漿への応用。ジャーナル・オン・ラボラトリ−・アンド・クリニカ ル・メディシン１１１：４２−５１グレンダールーハンセンＪ、ランドＬＲ，ラ ルフキアＥ１オッテヴアンゲルＶ。 ダネに、（１９８８年）インビボで傷いた再上皮形成の間、ケラナノサイト中の ウロキナーゼ及び組織型プラスミノーゲン活性化因子。ザ・ジャーナル・オン・ インベスティガティブ・ダマトロジー９０　：　７９０−７９５グアウィッチｖ １パネルＲ，ルビＳ１ケリーＰ１サデイチＲＬ、グリーンリーＲ（１９８４年） ウロキナーゼ（プロウロキナーゼ）のチモーゲンレセプターによる有効かつフィ ブリン特異的血餅溶解。インビトロ及び２動物種での研究。ジャーナル・オン・ クリニカル・インベスティガティブ７３　：１７３１−１７３９ヘイグラ−ＨＴ 、マックスフィールドＦＲ，ウィリンガムＭＣ。 パスタンＩ　（１９８０年）ジャーナル・オン・バイオロジカル・ケミストリー ２５５　：１２３９−１２４１ アジャールＫＡ、アーベルＰＣ１ジャフエＥＡ、ナチマンＲＬ　（１９８６年） プラスミノーゲンの培養ヒト内皮細胞への結合。ジャーナル・オン・バイオロジ カル・ケミストリー２６１・１１６５６−１１６６２アジヤールＫＡ、ナチマン ＲＬ　（１９８８年）培養ヒト内皮細胞上の線維溶解系の組み立て。フィブリノ リスイス２、補遺１・１１８ハシモトＦ、ホリゴメＴ、カンバヤシＭ１ヨシダＫ 、スガノＨ（１９８３年）ナトリウムドデシルスルファ−トポリアクリルアミド ゲル中の電気泳動による低分子量ポリペプチドの分離改良法。アナリティカル・ バイオケミストリー１２９：アーリンＶＪ、ロウＬＷ、コルティＡ、アベラＥ、 ブシーシＦ　（１９８８年）ネズミメラノーマ細胞の細胞表面ウロキナーゼによ る転移可能性の変調。キャンサー・リサーチ４８　：１２７０−１２７８エベー ルＣＡ、ベーカーＪＢ　（１９８８年）細胞外プラスミノーゲン活性化因子の線 維芽細胞骨格への結合、ピングリンによる細胞表面ウロキナーゼのコロカリゼー ション。ジャーナル・オン・セル・バイオロジカル１０６　：１２４１−１２ユ ークシヨーベンＪ１デルニックＲ（１９８８年）ファスト系発展単位における着 色染色用改良銀染色方法。ファスト・システム・デイベロブメント・ユナイテッ ド・エレクトロフォレスイス９　：　２８−３２ホツプＴＰ、ウッズＫＲ（１９ ８１年）アミノ酸配列からの蛋白抗原決定基のプロディクション。ブロスイーデ ング・オン・ナショナル・アカデミ−・オン・サイエンスイズＵＳＡ７８　：　 ３８２４−３８２８ホイルア一ツＭ、リーケンＤＣ、リーネンＨＲ，コレンＤ　 （１９８２年）ヒト組織プラスミノーゲン活性化因子によるプラスミノーゲンの 活性化の運動性。フィブリンの役割。ジャーナル・オン・バイオロジカル・ケミ ストリー２５７　＋　２９ジョニクＦ、スクミットＭ、アフテルＡ、オールリー ダーＡ１バビクＲ１ウルムＫ、ゲスナーＷ、グラフＨ（１９９０年）ウロキナー ゼ型プラスミノーゲン活性化因子（Ｕ　−Ｐ　Ａ）抗原は胸痛の卑い再発の予言 諸である。フィブリノリスイスジョニクＦ１スクミットＭ１ウルムに１ゲスナー Ｗ１グラフＨ（１９８９年）ウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子及び胸 痛での早い再発：ザ・ランセット、１０４９ カサイＳ、アリムラＨ、ニジムラ間１スヤマＴ（１９８５年）単一プロウロキナ ーゼの蛋白分解切断は、チモーゲン及びフィブリンに対するその高親和性の減少 の活性化が起こる形態的変化を含む。ジャーナル・オン・バイオロジカル・ケミ ストリー２６０　：１２３７７−１２３８１キールバーグｖ１アンドレアセンＰ Ａ、グレンダールーハンセンＪ、ニールセンＬＳ、スタンパーしいダネＫ　（１ ９８５年）マウス・インビボのウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子に対 するプロ酵素。ＦＥＢＳレタース１８２　：　４４クリステンセンＰ１ラーソン Ｌ−Ｉ、ニールセンＬＳ、グレンダールーハンセンＪ、アンドレアセンＰＡ、ダ ネＫ（１９８４年）ヒト内皮細胞はプラスミノーゲン活性化因子の一タイプを含 む。ＦＥＢＳレタース１６８　：　３３−３７クリステンセンＰ１ピケＣ１ラン ドＬＲ，アンドレアセンＰＡ、ダネＬ（１９９０年）ルイス肺癌におけるプラス ミノーゲン活性化因子インヒビター型１゜ルイス・ラング・カルシツマ・ヒスト ケミストリーコザクＭ（１９８７年）６６９を椎動物メツセンジャーＲＮＡから の５°−非コーディング配列の分析。ＲＮＡ５．　ヌクリア・アクタ・リサーチ １５：８１２５−８１３２ク一ベルＪ１オツタールＭ１リーケンＤＣ，ヴアン・ バーケルＴＪＣ（１９８８年）ラット腎細胞との組織型プラスミノーゲン活性化 因子のインビボ相互反応。フィブリノリスイス２、補遺１：２８キテＪ、ドリッ テルＲＦ　（１９８２年）蛋白の水治療法特性を展示する簡単な方法。ジャーナ ル・オン・モルキュシー・バイオロジー１５７　：１０５−１３２ラミリＵＫ（ １９７０年）バクテリオファージＴ４のヘッドの組み立ての間、構造蛋白の切断 。ネイチャー２２７　：　６８０−６８５リーネンＨＲ，ザマロンＣ１ブラベル Ｍ１ウィンクラ−ＭＥ、コレンＤ（１９８６）プロウロキナーゼ１１メクニズム によるプラスミノーゲンの活性化。ジャーナル・オン・バイオワ／カル・ケミス トリー２６１　：１２５３−１２５８リンＷ−Ｃ，ブレドローｎＴＰ、カルブＬ Ａ　（１９９０）腫瘍進行中の微小転移生成検出の高感度マーカーとしての細菌 ＬａｃＺ遺伝子、カンサー・リサーチ５０　：　２８０８−２８．１７ リオツタＬＡ（１９８６年）腫瘍侵入及び転移−細胞外マトリックスの役割：ロ ード・メモリアル・アワード・レフチャー。キャンサー・リサーチ４６　：１− ７０つＭＧ（１９８９年）膜蛋白のグリコシルーホスファチジルイノシトール沈 降。 バイオケミカル・バイオフィジカル・アクタ９８８　：　４２７−４５４ランド ＬＲ，リチオＡ１アンドレアセンＰＡ、ニールセンＬＳ、クリステンセンＰ、レ イホー間１サクセラ０、ブシーシＦ、ダネＫ（１９８７年）形質転換成長因子− Ｂは、Ｗｌ−３８ヒト肺線維芽細胞中、タイプ−１プラスミノーゲン活性化因子 インヒビターのレベルの強く固い作用の陽性調整物である。Ｗｌ−３８ヒユーマ ン・ラング・フィブロブラストＥＭＢＯＪ６：１２８１−１２８６ランドＬＲ， ジョージＢに−ルセンＬＳ、メイエルＭ、ダネに１アンドレアセンＰ　（１９８ ８年）モルキュシー・セル・エンドクリノール６０　：　４３−５３マニアテイ ス等（１９８２年）モルキュシー・クローニング：ラボラトリ−・マニュアル・ コールド・スプリング・ハーバ−・ラボラトリ−マンＫＧ、ジェニーＲＧ、クリ シュナトウエミＳ　（１９８８年）組み立てにおけるコファクター蛋白及び血液 凝固酵素コンプレックスの発現。アニューアル・レヴユー・バイオケミカル５７ ：９１５−９５６マツダイラＰ　（１９８７年）ポリビニリデンジフルオリド膜 上に電気泳動した蛋白のピコモル量からの配列。ンヤーナル・オン・バイオロジ カル・ケミストリー２６２・１００３５−１００３８ マッオ０、タナ力Ｓ、キクチＨ（１９８８）骨関節炎への尿トリプシンインヒビ ターの効果。トロンボスイス・リサーチ５２　：　２３７−２４５メイ工ルＭ、 ランドＬＲ，リチオＡ１スクーヴＪに−ルセンＬＳ、スタッシーＳＮ、ダ不Ｋ、 アンドレアセンＰＡ　（１９８８年）プラスミノーゲン活性化因子インヒビター 型１蛋白、ｍＲＮＡ及び遺伝子転写は、ヒト横絞筋肉腫細胞において、ホルボー ルエルテル類により増加する。ジャーナル・オン・バイオロジカル・ケミストリ ー２６３　：１５６８８−１５６９３ミグナツテイＰ１０ビンズＥ１リフキンＤ Ｂ　（１９８６年）ヒト羊水膜を経る腫瘍侵入　プロティナーゼカスケードの要 求。セル４７　：　４８７−４９８マイルズＬＡ、ダウルバーグＣＭ、プロウＥ Ｆ　（１９８８年）プラスミノーゲンの細胞結合ドメイン及び血漿中のそれらの 機能。ジャーナル・オン・バイオロジカル・ケミストリー２６３・１１９２８− １１９３４マイルズＬＡ、ギンズバーグＭＨ、ホワイトＪＧ、ブロウＥＦ　（１ ９８６年）２つの明白なメカニズムによるヒト血小板とのプラスミノーゲン相互 反応。ジャーナル・オン・クリニカル・インベスティガティブ７７　：　２００ １−２００９マイルズＬＡ、ブロクＥＦ　（１９８５年）血小板表面でのプラス ミノーゲンの結合及び活性化ジャーナル・オン・バイオロジカル・ケミストリー ２６０　：　４３０マイルズＬＡ、ブロウＥＦ　（１９８６年）特異的抗体プロ ーブで定義されたのと同じ、プラスミノーゲンの高親和リジン結合部位の地形図 。バイオケミストリー２５・６９２６−６９３３ マイルズＬＡ、ブロクＥＦ　（１９８７年）末梢血液細胞に対する線維素溶解成 分、プラスミノーゲン及びウロキナーゼのレセプター仲介結合。ソロンボ・ハエ モスク５８　：　９３６−９４２ ミラーＡＤ、パティモアＣ（１９８６年）ヘルパーウィルス生成をもたらす組か えを回避するためのレトロウィルスパッケージ細胞再デザイン、モレキュラー・ アンド・バイオロジー６巻２８９５−２９０２モリスイＪＨ，ファルライＨ、ニ ドギントンＴＳ　（１９８７年）組織因子、凝固ブロティナーゼカスケードの開 始のための細胞レセプター用ｃＤＮＡの分子クローニング。セル５０　：１２９ −１３５ミユーラーーエバーハードＨＪ　（１９８８年）補体系の分子体系及び 機能。アニューアル・レヴユー・バイオケミカル５７：３２１−３４７ニーダム ＧＫ、／ヤーベＧＶ、ファーンドンＪＲ，ハリスＡＬ　（１９８７年）ヒト胸痛 膜上特異的レセプター部位でのウロキナーゼの結合。ヨーロピアン・ジャーナル ・オン・キャンセル５５・１３−１６ネルズＬ１リーネンＨＲ，コレンＤ１ホル ムズＷＥ（１９８７年）リジンの部位特異的変異誘発により生じた組換型ヒト− 末娘ウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子変異体の特徴づけ。ジャーナル ・オン・バイオロジカル・ケミストリー２６２　：　５６８２−５６８９ ニールセンＬＳ、ハンセンＪＧ、スクライバーＬ１ウィルソンＥＬ、カルトフト に１ズーサンＪ、ダネＫ　（１９８２年）モノクローナル抗体によるアフニテイ クロマトグラフィによるヒトグリア芽腫細胞からのプラスミノーゲン活性化因子 に対するチモーゲンの精製。バイオケミストリー２４　：　６４１０−６４１５ ニールセンＬＳ、ケレアマンＧＭ、ベーレントＮ１ピコーネＲ１ダネに１ブラー シＦ　（１９８８年）ウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子に適した５５ ．０ＤＤ−６０，０００Ｍ　ｒレセプター蛋白。ジャーナル・オン・バイオロジ カル・ケミストリー２６３・２３５８−２３６３ ニールセンＬＳ、アンドレアセンＰＡ、グレンダールーハンセンＪ１ファンＪ− Ｙ１クリステンセンＰ１ダネＫ　（１９８６年）ソロンボ・ハエモスト５５　： 　２０ノランＧＰ、フィーリングＳ１ニコラＪ−Ｆ、ヘルツェンベルクＬＡ　（ １９８８年）エンエリキア・コｌ）　Ｌ　ａ　ｃ　Ｚ導入後のＢ−Ｄ−ガラクト ノダーゼ活性に基づ（生存は乳類細胞の蛍光賦活細胞分析および検索、プロシー ディンゲス・オン・ザ・ナショナル・アカデミ−・オン・サイエンシズ・ニーニ スエイ８５　：　２６０ノリＭＬ、サルビＥ、コルティＡ１０ビアーテイＦ１ソ フイエンテイーニＡ１ブラーシＦ１バレンテイＦ１カツサー二Ｇ（１９８９年） マウス細胞からのヒト組換型−末鎖ウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子 の製造及び特徴づけ。フィブリノリスイス３　：１０１−１０６ オカヤマＨ、バーブＰ　（１９８３年）哺乳動物細胞中にｃＤＮＡ挿大の発現を 詳ｔｃＤＮＡクローニングベクター。モレキュラー・アンド・セル・バイオロジ ー３　：　２８０−２８９ オツソウスキーＬ　（１９８８年）ニワトリ胚中ヒト腫瘍細胞の播種におけるプ ラスミノーゲン活性化因子依存通路。セル５２　：　３２１−３２８オツソウス キーＬ１リーヒＥ（１９８３年）プラスミノーゲン活性化因子阻害ヒト腫瘍転移 に対する抗体。セル３５　：　６１１−６１９パネルＲ、グレビヒＶ　（１９８ ７年）１本鎖ウロキナーゼが低触媒活性（プロウロキナーゼ）を有する１本鎖ウ ロキナーゼによる、又は２本鎖ウロキナーゼによるプラスミノーゲンの活性化。 プロット６９　：　２２−２６ベテルセンＬＣ、ルンＬＲ、ニールセンＬＳ、ダ ネＫ、スフリーバ−Ｌ（１９８８年）ヒト肉腫細胞からの１本鎖ウロキナーゼ型 プラスミノーゲン活性化因子は、少しの又は全（内因性活性のないプロ酵素であ る。ジャーナル・オン・バイオロジカル・ケミストリー２６３：１１１８９−１ １１９５ピコーネＲ１カンタニアツクＥＬ、ニールセンＬＳ、ベーレントＮ１マ ストロニコラＭＲ，タペンスＭＶ、ストツベリＭＰ、ペーダーセンＳ１ダネに、 ブシーシＦ　（１９８９年）　ホルボールエステルＰＭＡによる単核球様Ｕ９３ ７細胞中ノウロキナーゼレセプターの調節。ジャーナル・オン・セル・バイオロ ジー１０８＝プローグＭ、ジエンセンＡＬ、バークホルトＶ　（１９８９年）ト リシン−ナトリウムドデシルサルフェート−ポリアクリルアミドゲル電気泳動か らのＰＶＤＦ膜上に電気プロットしたペプチドのアミノ酸成分及びＮＨ２末端配 列の決定。アニューアル・バイオケミカル１８１　：　３３−３９ブロウＥＦ、 フレアネＤＥ、ブレシアＪ１マイルズＬＡ　（１９８６年）プラスミノーゲン系 及び細胞表面　同じ細胞型上プラスミノーゲン及びウロキナーゼレセプターに対 する証拠。ジャーナル・オン・バイオロジー１０３・２４１１−２４ボラキンＪ １バズマンにに−ルセンＬＳ、ダネに１ヴアエリＡ　（１９８８年）病巣接触で の血漿膜結合ウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子の超構造局在。ジャー ナル・オン・バイオロジー１０６：８７−９５ポラネンＪ１サクセラＥ−Ｍ、ア ンドレアセンＰに−ルセンＬＳ、ダネＫ、ヴアエリＡ（１９８７年）ウロキナー ゼ型プラスミノーゲン活性化因子の明白な局在と培養ヒト線維芽細胞及び肉腫細 胞下のそのタイプ−１インヒビター。ジャーナル・オン・バイオロジー１０４　 ：１０８５−１０９６ポンテＰ、ゲニンＰ、プラウＨ、ケデスＬ（１９８３年） ヒトアクチン遺伝子１よ、α−心臓アクチンに対する単一コピーであるが、β− 及びα−細胞骨格遺伝子番二対するマルチコピーである：３゛−非翻訳部分は同 位元素特異的であるカベ進化↓こおいて変換する。モレキュラー・アンド・セル ・ノくイオロジ−３：１７８３−１ポラアラティＲ、マセルＲ、ウィリアムスＳ Ｊ、バドマナバンＲ、ノ＼ワードＢ、リオッタし、コウリーＧ　（１９８６年） １又は２オンコシンにより形質転換したー次ラット胎児は異なる転移潜在性を示 す。 プライスＪ、ターナ−Ｄ、セブコＣ（１９８７年）レトロウィルス仲介遺伝子伝 達によるを椎動物系における系統分析、プロシーディンゲス・オン・ザ・ナショ ナル・アカデミ−・オン・サイエンシズ・ニーニスエイ８４　：１５６−１６０ ライヒＲ，トンプソンＥ１イワモトＹ、マーティンＧＲ，ディーソンＪＲ，フラ ーＧＣ、ミスキンＲ（１９８８年）プラスミノーゲン活性化因子、セリンブロテ ナーゼ及びコラゲナーゼルの阻害は、転移細胞による基部膜の侵入を防ぐ。 ロルダンＡＬ、タペンスＭＶ、マスツイＭＴ、ベーレント、ルンドＬＲ，ダネに １アペラＥ、ブラシＦ（１９９０年）ヒトウロキナーゼプラスミノーゲン活性化 因子のレセプター、細胞表面の中心分子のクローニングと発現、プラスミン依存 蛋白溶解、ジＥＭＢＯジャーナル９　；　４６７−４７４ラッセルＤＷ、シュナ イダーＷＪ、ヤマモトＴ１ラスキーＫＬ、ブラウンＭＳ。 ボルト−シュタインＪＬ　（１９８４年）ＬＤＬレセプターのドメインマップ二 表皮性成長因子プレカーサーによる配列類似点。セル３７　：　５７７−５８５ サクセラ０（１９８５年）細胞周囲蛋白分解のプラスミノーゲン活性化と調節。 バイオケミカル・アンド・バイオフィジカル・アクタ８２３　：３５−６５サロ ネンＥ−Ｍ、サクセラＯ，ヴアルテイオＴ１ヴアエリＡ、ニールセンＬＳ。 ツォイテンＪ　（１９８５年）プラスミノーゲン及び組織型プラスミノーゲン活 性化因子は固定化フィブロネクチンに結合する。ジャーナル・オン・ノくイオロ ジカル・ケミストリー２６０　：１２３０２−１２３０７サロネンＥ−Ｍ、ツィ ッテイングＡ１ヴアエリＡ（１９８４年）ラミニンはプラスミノーゲン及びその 組織型活性化因子と相互作用する。ＦＥＢＳレタース１７２　：　２９−３２ シエガーＨ、フォノ・ヤゴー〇　（１９８７年）１−１００ｋＤａの範囲の蛋白 の分離のためのトリシン−ナトリウムトデシルサルフエートーポリアクリルアミ ドゲル電気泳動。アナリテイカル・バイオケミストリー１６６　：３６８−３７ ９セルヴアライＰ１０ツセＷ、シルバーＲ１スジリンガ−ＴＡ（１９８８年）血 液中の主なＦｃレセプターはホスファチジルイノシトール沈降を有し、発作用夜 間ヘモグロビン尿症に欠損である。ネイチャー３３３　：　５６５−５６７シル バーシュティンＲＬ、ロイングＬＬＫ１バーペルＰＣ，ナハマンＰ（１９８４年 ）プラスミノーゲンとの血小板トロンポスポンジンのコンプレックス形成。 組織活性化因子による活性化の変調。ジャーナル・オン・クリニカル・インベス テイガテイブ７４　：１６２５−１６３３スクリーバ−Ｌ１ラーションＬ−１， キールベリｖに−ルセンＬＳ、アンドレアセンＰＢ、クリステンセンＰ、ダネＫ （１９８４年）ルイス肺癌中のウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子の免 疫細胞化学局在。ジャーナル・オン・セル・バイオロジー９９　：　７５３−７ ５８スクリーバーしいニールセンＬＳ、ステフェンＲ１ダネＫ（１９８２年）肉 腫ウィルスにより形質転換したネズミ細胞から不活性プロ酵素として放出された プラスミノーゲン活性化因子。ヨーロピアン・ジャーナル・オン・バイオケミス トリー１２４　：　４０９−４１４ ステフェンズＲＷ、アリタロＲ１タピオヴアーラＨ１ヴアエリＡ　（１９８８年 ）白血病細胞系による活性ウロキナーゼの製造：固体腫瘍の細胞系からの新規識 別。 リュケミア・リサーチ１２　：　４１９−４２２ステフェンスＲＷ、フォルタム ＣＪ、　ドウＷＦ（１９８７年）ヒト直腸癌中のウロキナーゼ型プラスミノーゲ ン活性化因子に対するプロ酵素：蛋白分解活性化後、単核球ミナクチビンによる インビトロ阻害。ヨーロピアン・ジャーナル・オン・キャンセル・クリニカル・ オンコロジー２３　：　２１３−２２２ステフエンズＲＷ、ロイングに−Ｃ，ポ ラネンキンサロネンＥ−Ｍ、ヴアエリＡ（１９８７年）プラスミノーゲン活性化 因子及びそれらの特異的インヒビターのミクロフレート免疫捕獲（ｉｍｍｏｃａ ｐｔｕｒｅ）検定。ジャーナル・オン・イムノロジカル・メソッド１０５　：　 ２４５−２５１ステフアンス等（１９８９年）ジャーナル・オン・セルラー・バ イオロジー１０８　：１９８７−１９９５ ストツペリＭＰ、コルティＡ１ソフイエンテイーニＡ、カツサーニＦ１アソイア ンＲＫ（１９８５年）Ｕ９３７単核球上特異的レセプターへのヒトウロキナーゼ プラスミノーゲン活性化因子のアミノ末端断片の分別増強結合。ブロスイーディ ング・オン・ナショナル・アカデミ−・オン・サイエンスイズＵＳＡ８２：　４ ９ストッペリＭＰ、タチェティＣ，タペンスＭＶ、コルティＡ１ヘアリングＶＪ 。 カッサー二Ｇ１アッペラＥ１ブラーシＦ　（１９８６年）ヒトＡ４３１細胞上プ ロウロキナーゼレセプターのオートクリン飽和。 セル４５　：　６７５−６８４ スタンプＤＣ，レイキンＨＲ，コレンＤ　（１９８６ａ年）ヒト細胞培養からの 単鎖ウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子の精製及び特徴づ：九ジャーナ ル・オン・バイオロジカル・ケミストリー２６１　：１２７４−１２７８スタン プＤＣ，ティアンポン間１コレンＤ　（１９８６ｂ年）ヒト尿のウロキナーゼ関 連蛋白。ジャーナル・オン・バイオロジカル・ケミストリー２６１　：１２６タ レンティーノＡＬ、ゴメスＣＬ、プラマーＴＨ（１９８５年）ペプチド−Ｎ−グ リコシダーゼによるアスパラギン結合グリカンの脱グリコジン化。Ｆ・ノくイオ ケミストリ−２４：　４６６５−４６７１トーセンＳ１グラスーグリーンヴアル トＰ１アストロツブＴ（１９７２年）ウロキナーゼ及びプラスミノーゲン活性化 因子のフィブリンへの結合における相違。 ソロンボス・ディアス・ハエモロフ２８　：　６５−７４トリユグヴアソンに１ ホイヒテヤＭ１サロＴ（１９８７年）腫瘍侵入における細胞外マトリックスの蛋 白分解退化。バイオロジカル・アンド・バイオフィジカル・アクタ９０７：１９ ．１−２１７ ウラノＴ１デ・セラノＶＳ、ジャフニーＰＪ、カステリーノＦＪ　（１９８８年 ）ヒト単鎖ウロキナーゼによるヒト（Ｇｌｕ’）プラスミノーゲンの活性化。ア ーチブ・オン・バイオケミストリー・アンド・バイオフィジックス２６４　：　 ２２２−ヴアサリＪ−Ｄ、ハミルトンＪルイチＥ（１９７７年）マクロファージ プラスミノーゲン活性化因子　コンカナバリンＡ及びホルボールミリステートア セテートによる誘導。セル１１：６９５−７０５ヴアサリＪ−Ｄ、バッチーノＤ １ベリンＤ　（１９８５年）ヒトプラスミノーゲン活性化因子、ウロキナーゼの Ｍ　ｒ　５５．０００形にに対する細胞結合部位。ジャーナル・オン・セル・バ イオロジー１００　：　８６−９２ヴアサリＪ−Ｄ、ダイエールＪ−Ｍ、ウール エンドＡ１ベリンＤ　（１９８４年）培養ヒト単核球マクロファージによるプロ ウロキナーゼの及びプラスミノーゲン活性化因子の随伴分泌。ジャーナル・オン ・イクスペリメンタル・メデイシン１５９　：１６５２−１６６８ ウンＴ−Ｃ，オソウスキーＬルイチＥ　（１９８２年）ヒトウロキナーゼのプロ 酵素形。ジャーナル・オン・バイオロジカル・ケミストリー１５７　：　７２６ ２−ウンＴ−Ｃ，レイチＥ（１９８７年）ヒト胎盤からのプラスミノーゲン活性 化のインヒビター。ジャーナル・オン・バイオロジカル・ケミストリー２６２・ ３６ヤーデンＹ、ウルリノチＡ（１９８８年）成長因子による単一トランスダク ションの分子分析。バイオケミストリー２７＋３１１３−３１１９Ｍ、ｘｌｏ− ３１２３４ Ｆｉｇ、　５８ Ｍ、ｘｌｏ−３１２３４５ Ｍｒｘｌｏ”３１　２　３　４ 相対的蛍光度 １２’　Ｉ　−ＡＴＦの結合％ Ｕコ 寸 ロ ク Ｍｒｘ　１０−３ ＯＤ　４９０ｎｍ１５４０ｎｍ １　：５００　１　：４０００　１　：３２０００ｕ−ＰＡＲの２倍連続希釈 Ｆｉｇ、　２５Ａ　Ｆｉｇ、　２５Ｂ Ｆｉｇ、　２５ＣＦｉｇ、　２５Ｄ Ｆｉｇ、　２５Ｅ Ｆｉｇ、　２６Ａ １２３４５６７　ｋＤ８ 分 Ｆｉｇ、　３０Ａ　Ｆｉｇ、　３０Ｂ Ｆｉｇ。３１Ａ　Ｆｉｇ、３１Ｂ Ｆｉｇ、　３１ＣＦｉｇ、　３１Ｄ Ｆｉｇ、３１　Ｅ　Ｆｉｇ、　３１　Ｆ国際調査報告 ｋｍ　ＫＭｕａ’＋ＯＩＭＩ　ｍ　１２１１Ｆｅｌ＋！８　Ｍ国際調査報告 伽１謝１−〜９−彎−Ｉ−マーーーー菰軸←−一一一一情４　ｋｍ　ｌ１ｗ　ｉ ｗ−ｗ−・−一消−−−−−−ｗｖ　ｗ　ｅ＋＋ｍｍｗ４　ｍ　ｔｍ　Ｆｙ＊ｐ ｅｍ　Ｐｍｅｍ　ＯＩＦ＋ｅｅ　Ｆ−ｎＰＮｅ　＠＠　ｌｌｌ１１２１ｔ１！伽 Ｅ１・−Ｆ−０１１％＋ｗｍＩＲＩＩ＠　＊＠Ｉ　Ｍｅｒｅｆｍｎｗｗｐ−ｙｓ ｍａｉｄｗｅ−７ｗｖｑ　ｌｅ＋　−−ｄＴｄｗｍ−フロントページの続き （５１）Ｉｎｔ、　Ｃ１，’　識別記号　庁内整理番号Ａ６１Ｋ　４５１００　 ８４１５−４ＣＣＯ７Ｋ　１４／７０５　８３１８−４ＨＣ１２Ｐ　２１１０８ 　９１６１−４８ＧＯＩＮ　３３１５３　Ｌ　８３１０−２Ｊ３３１５７４　Ｄ 　９０１５−２Ｊ ３３１５７７　Ｂ　９０１５−２Ｊ ／／（Ｃ１２Ｐ　２１１０８ Ｃ１２Ｒ１：９１） （７２）発明者　レネ、エベ デンマーク国デー・コー−２３００コペンハーゲン・ニス、クアランズヴアイ　 １８番、フェアスト・チル・ヴエンストレ （７２）発明者　ベーレント、ニルス デンマーク国デー・コー−２８８０バウスヴエアズ、ランゲモーセヴアイ　１７ 番 （７２）発明者　エリス、ヴインセントデンマーク国デー・コー−１０５１コペ ンハーゲン・コー、ニューハウン　１８番 Ｉ （７２）発明者　ヘイアーハンセン、グニラデンマーク国デー・コー−２８２０ ゲントフテ、トフテケアスヴアイ　６７番 （７２）発明者　バイラ、チャールズ デンマーク国デー・コー−２８６０セボー、カール・メシース・アレー　１８番 、フェアスト・チル・ヘイア （７２）発明者　ブリュンナー、ニルスデンマーク国デー・コー−２８３０ヴイ ルーム、ペンヴエズヴエンゲット　９番

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．（１）サンドイッチ酵素結合イムノソルベント検定法の捕獲抗体として固定 したときｕ−ＰＡＲを捕獲する能力をもち、または（２）サンドイッチ酵素結合 イムノソルベント検定法のビオチン標識検出抗体として使用したときｕ−ＰＡＲ を検出する能力をもち、または（３）酵素結合イムノソルベント検定法で使用し たとき固定化ｕ−ＰＡＲに結合する能力をもち、または （４）酵素結合イムノソルベント検定法で捕獲抗体として固定したとき、ｕ−Ｐ ＡＲがそのｕ−ＰＡ結合能力を維持するようにｕ−ＰＡＲを結合する能力をもち 、または （５）放射線免疫沈澱検定法で無傷の形の精製ｕ−ＰＡＲを沈澱させ、または（ ６）放射線免疫沈澱検定法でキモトリプシン消化で得られるＭｒ１６，０００の ｕ−ＰＡＲフラグメントに結合するｕ−ＰＡを沈澱させ、または（７）放射線免 疫沈澱検定法において、キモトリプシン消化で得られｕ−ＰＡを結合しないＭｒ ３０，０００−５０，０００のｕ−ＰＡＲフラグメントを沈澱させ、または （８）非還元条件下６−１６％勾配ゲルでＳＤＳ−ＰＡＧＥ上でｕ−ＰＡＲ含有 抽出物のデタージエント相を分離に付した場合ウエスタンブロッティングでｕ− ＰＡＲと反応し、または （９）ウエスタンプロッティングにおいて、Ｕ９３７細胞が産生した５０−６５ ＫＤ範囲のｕ−ＰＡＲグリコシル化変異種と反応せず、Ｕ９３７ａ細胞が産生し た４０−４５ＫＤ附近のｕ−ＰＡＲグリコシル化変異種と反応せず、（１０）ウ エスタンプロッティングにおいて、Ｕ９３７細胞が産生した５０−６５ＫＤ範囲 のｕ−ＰＡＲグリコシル化変異種と反応し、Ｕ９３７ａ細胞が産生した４０−４ ５ＫＤ附近のｕ−ＰＡＲグリコシル化変異種と反応し、（１１）ウエスタンプロ ッティングにおいて、Ｕ９３７細胞が産生した５０−６５ＫＤ範囲のｕ−ＰＡＲ グリコシル化変異種と弱く反応し、Ｕ９３７ａ細胞が産生した４０−４５ＫＤ附 近のｕ−ＰＡＲグリコシル化変異種と強く反応し、（１２）ホルマリン固定およ びパラフィン埋封結腸がん組織塊の切片において侵入前端のがん細胞を免疫染色 し、免疫染色細胞の局在性は切片上ハイブリッド形成法で検出したｕ−ＰＡＲｍ ＲＮＡの分布とほとんど一致し、または（１３）ブロｕ−ＰＡと活性ｕ−ＰＡお よび細胞表面プラスミノーゲン活性化体の結合を阻害し、または （１４）ｕ−ＰＡＲのｕ−ＰＡ結合ドメインと反応し、それによりブロｕ−ＰＡ と活性ｕ−ＰＡの結合および細胞表面プラスミノーゲン活性化を阻害し、または （１５）第８図にｕ−ＰＡＲ１として示す配列をもつポリペプチドまたはｕ−Ｐ ＡＲと結合する結果ｕ−ＰＡＲおよびｕ−ＰＡ間の結合を阻害する能力をもつ部 分配列または類似体と反応するモノクローナル抗体、または（１６）パラフィン 埋封組織切片を含む組織切片中のｕ−ＰＡＲと結合する能力をもち、それにより ｕ−ＰＡＲの免疫組織化学的検出に使用することができ、または （１７）特定のｕ−ＰＡＲグリコシル化変異種と選択的に結合する能力をもち、 または （１８）Ｃ末端部分を含み無傷のｕ−ＰＡＲ分子のアミノ酸残基８８から始まる ｕ−ＰＡＲ分子の非ｕ−ＰＡ結合部分と反応し、または（１９）フルオレスセイ ンイソチオシアナート標識したマウスＩｇＧに対する抗体とフローサイトメトリ ーを用いるとヒト単球に結合し、その結合は外因性添加ｕ−ＰＡとの予備インキ ュベートに影響されず、または（２０）フルオレスセインイソチオシアナート標 識したマウスＩｇＧに対する抗体とフローサイトメトリーを用いるとヒト単球に 結合し、その結合は外因性添加ｕ−ＰＡとの予備インキュベートによって完全に 阻害される、ｕ−ＰＡＲに対するモノクローナル抗体。 ２．ｕ−ＰＡＲのｕ−ＰＡ結合ドメインに反応するモノクローナル抗体。 ３．遊離ｕ−ＰＡＲと反応するがｕ−ＰＡとｕ−ＰＡＲの複合体とは反応しない 、請求項１または２記載のモノクローナル抗体。 ４．ｕ−ＰＡＲと反応するが、そのｕ−ＰＡ結合ドメインとは反応しないモノク ローナル抗体。 ５．遊離ｕ−ＰＡＲおよびｕ−ＰＡとｕ−ＰＡＲの複合体の両者と反応する、請 求項１−４記載のモノクローナル抗体。 ６．ｕ−ＰＡＲのｕ−ＰＡ結合ドメインと反応するがｕ−ＰＡとｕ−ＰＡＲの複 合体とは反応しないポリクローナル抗体。 ７．ｕ−ＰＡＲと反応するが、そのｕ−ＰＡ結合ドメインとは反応しないポリク ローナル抗体。 ８．遊離ｕ−ＰＡＲと反応するがｕ−ＰＡとｕ−ＰＡＲの複合体とは反応しない 請求項６または７記載のポリクローナル抗体。 ９．遊離ｕ−ＰＡＲおよびｕ−ＰＡとｕ−ＰＡＲの複合体の両者と反応する、請 求項６または７記載のポリクローナル抗体。 １０．捕獲抗体もしくは検出抗体または両者として、ｕ−ＰＡＲがｕ−ＰＡに結 合したか否かに無関係にｕ−ＰＡＲに結合する能力をもつ抗体を使用することを 含む、検出または定量が、ｕ−ＰＡＲがｕ−ＰＡに結合したか否かに実質的に影 響されない、試料中のｕ−ＰＡＲの検出または定量法。 １１．抗体が請求項４、５、７または９の何れかに記載の抗体である、請求項１ ０記載の方法。 １２．請求項４または５記載の１種のモノクローナル抗体を捕獲抗体として使用 し、請求項４または５記載の別のモノクローナル抗体を検出抗体として使用する 、請求項１０または１１記載の方法。 １３．請求項７または９記載の１種のポリクローナル抗体を捕獲抗体として使用 し、請求項４または５記載のモノクローナル抗体を検出抗体として使用する、請 求項１０または１１記載の方法。 １４．請求項４または５記載の１種のモノクローナル抗体を捕獲抗体として使用 し、請求項７または９記載のポリクローナル抗体を検出抗体として使用する、請 求項１０または１１記載の方法。 １５．請求項７または９記載の１種のポリクローナル抗体を捕獲抗体として使用 し、請求項７または９記載の別のポリクローナル抗体を検出抗体として使用する 、請求項１０または１１記載の方法。 １６．それぞれ、捕獲抗体または検出抗体として、ｕ−ＰＡまたはブロｕ−ＰＡ に結合したｕ−ＰＡＲに結合する能力をもつ抗体を、結合ｕ−ＰＡまたはブロｕ −ＰＡを検出する抗体を検出または捕獲抗体として一緒に使用する、試料中のｕ −ＰＡＲとｕ−ＰＡの複合体の検出または定量法。 １７．ｕ−ＰＡＲに結合する能力をもつ抗体が請求項４または５記載のモノクロ ーナル抗体または請求項７または９記載のポリクローナル抗体である、請求項１ ６記載の方法。 １８．請求項４または５記載のモノクローナル抗体を捕獲抗体または検出抗体と して使用する、請求項１６または１７記載の方法。 １９．請求項７または９記載のポリクローナル抗体を捕獲抗体または検出抗体と して使用する、請求項１６または１７記載の方法。 ２０．捕獲抗体または検出抗体として、遊離ｕ−ＰＡＲには結合能力をもつがｕ −ＰＡとｕ−ＰＡＲの複合体にはもたない抗体を使用することを含む、試料中の 、ｕ−ＰＡと結合していないｕ−ＰＡＲの検出または定量法。 ２１．抗体が請求項２、３、６または８記載の抗体である、請求項２０記載の方 法。 ２２．請求項２または３記載のモノクローナル抗体を捕獲抗体として使用し、請 求項２または３記載の異なるエピトープを指向する別の抗体を検出抗体として使 用する、請求項２０または２１記載の抗体。 ２３．請求項６または８記載のポリクローナル抗体を捕獲抗体として使用し、請 求項２または３記載のモノクローナル抗体を検出抗体として使用する、請求項２ ０または２１記載の方法。 ２４．請求項２または３記載のモノクローナル抗体を捕獲抗体として使用し、請 求項６または８記載のポリクローナル抗体を検出抗体として使用する、請求項２ ０または２１記載の方法。 ２５．請求項６または８記載のポリクローナル抗体を捕獲抗体として使用し、請 求項７または９記載のポリクローナル抗体を検出抗体として使用する、請求項２ ０または２１記載の方法。 ２６．捕獲または検出抗体として、遊離ｕ−ＰＡＲに結合する能力をもつが、ｕ −ＰＡの結合を阻害しない抗体を使用し、検出または捕獲試薬として、ｕ−ＰＡ またはそのｕ−ＰＡＲ結合変異種を使用することを含む、ｕ−ＰＡを結合してい ないｕ−ＰＡＲの検出または定量法。 ２７．抗体が請求項４記載のモノクローナル抗体または請求項７記載のポリクロ ーナル抗体である、請求項２６記載の方法。 ２８．検出抗体として、請求項１−９の何れかに記載の抗体を使用することを含 む、組織切片中のｕ−ＰＡＲの免疫組織化学的検出法。 ２９．抗体が請求項１−５の何れかに記載のモノクローナル抗体である、請求項 ２８記載の方法。 ３０．請求項４もしくは５記載のモノクローナル抗体または請求項７もしくは９ 記載のポリクローナル抗体を使用することを含む、ｕ−ＰＡと結合したか否かに 影響なくｕ−ＰＡＲを検出する、請求項２８記載の方法。 ３１．検出抗体として、遊離ｕ−ＰＡＲを検出する能力をもつがｕ−ＰＡとｕ− ＰＡＲの複合体にはもたない抗体を使用することを含む、請求項２８記載の方法 。 ３２．検出抗体が請求項２もしくは３記載のモノクローナル抗体または請求項６ もしくは８記載のポリクローナル抗体である、請求項３１記載の方法。 ３３．検出抗体として、下記変種にもっばらまたは優先的に結合するモノクロー ナル抗体を使用することを含む、試料中のｕ−ＰＡＲのグリコシル化変種の検出 または定量法。 ３４．ｕ−ＰＡＲのグリコシル化変種が特定の型のがん細胞に特徴的な変種であ る、請求項３３記載の方法。 ３５．試料ががん患者またはがんの疑がある患者の血清、血漿または尿である、 請求項１０−２７の何れかに記載の方法。 ３６．試料ががん組織またはがんの疑がある組織から得た抽出物である、請求項 ３５記載の方法。 ３７．試料が慢性関節リュウマチ、潰瘍性大腸炎または乾せんのような非悪性組 織破壊関連疾患にかかっているかその疑がある患者の血清、血漿または尿である 、請求項１０−２７の何れかに記載の方法。 ３８．検出抗体が検出可能な標識を具える、請求項１０−３７の何れかに記載の 方法。 ３９．ほ乳類特にひとに、ｕ−ＰＡＲに対するモノクローナルまたはポリクロー ナル抗体に結合した診断剤を投与することを含む、表面にｕ−ＰＡＲを含む細胞 に診断剤を標的化する方法。 ４０．ほ乳類ががんにかかっているかまたはその疑があるほ乳類である、請求項 ３９記載の方法。 ４１．診断剤がテクネチウムのような放射性物質である、請求項３９または４０ 記載の方法。 ４２．抗体が請求項１−９の何れかに記載の抗体またはｕ−ＰＡＲの特定のグリ コシル化変異種にもっばらまたは優先的に結合するモノクローナル抗体である、 請求項３５−４１の何れかに記載の方法。 ４３．ｕ−ＰＡＲに反応し、それによりブロｕ−ＰＡと活性ｕ−ＰＡの結合およ び細胞表面プラスミノーゲン活性化を阻害する点で、ブダペスト条約の条項およ び条件下でヨーロピアン・コレクション・オブ・アニマル・セル・カルチャーズ に受託番号９０１０１００９で寄託したハイブリドーマセルラインが産生する抗 体３Ｒと機能的に均等なモノクローナル抗体。 ４４．競合実験においてブダペスト条約の条項および条件下でヨーロピアン・コ レクション・オブ・アニマル・セル・カルチャーズに受託番号９０１０１００９ で寄託したハイブリドーマセルラインが産生するモノクローナル抗体３Ｒと競合 する能力をもつモノクローナル抗体。 ４５．組織切片中のｕ−ＰＡＲに結合する能力をもち、それによりｕ−ＰＡＲの 免疫組織化学的検出に使用できるモノクローナル抗体であって、上記抗体がブダ ペスト条約の条項および条件下でヨーロピアン・コレクション・オブ・アニマル ・セル・カルチャーズに受託番号９０１０１００８で寄託したハイブリドーマセ ルラインが産生する抗体２Ｒまたは受託番号９０１０１０１０で寄託したハイブ リドーマセルラインが産生する抗体４Ｒとこの点で機能的に均等な抗体。 ４６．捕獲抗体または検出抗体として酵素結合イムノソルベント検定法で使用す るに適すべく充分有効にｕ−ＰＡＲに結合する能力をもつモノクローナル抗体で あって、上記抗体がブダペスト条約の条項および条件下でヨーロピアン・コレク ション・オブ・アニマル・セル・カルチャーズに受託番号９０１０１００８で寄 託したハイブリドーマセルラインが産生する抗体２Ｒまたは受託番号９０１０１ ０１０で寄託したハイブリドーマセルラインが産生する抗体４Ｒとこの点で機能 的に均等な抗体。 ４７．ｕ−ＰＡＲの特定のグリコシル化変異種に選択的に結合する能力をもつモ ノクローナル抗体であって、上記抗体がブダペスト条約の条項および条件下でヨ ーロピアン・コレクション・オブ・アニマル・セル・カルチャーズに受託番号９ ０１０１０１０で寄託したハイブリドーマセルラインが産生する抗体４Ｒとこの 点で機能的に均等な抗体。 ４８．遊離ｕ−ＰＡＲおよびｕ−ＰＡとｕ−ＰＡＲ間の複合体の両者と反応する 能力をもつモノクローナル抗体であって、上記抗体がブダペスト条約の条項およ び条件下でヨーロピアン・コレクション・オブ・アニマル・セル・カルチャーズ に受託番号９０１０１０１０で寄託したハイブリドーマセルラインが産生する抗 体４Ｒとこの点で機能的に均等な抗体。 ４９．遊離ｕ−ＰＡＲに反応する能力をもつが、ｕ−ＰＡとｕ−ＰＡＲ間の複合 体にはもたないモノクローナル抗体であって、上記抗体がブダペスト条約の条項 および条件下でヨーロピアン・コレクション・オブ・アニマル・セル・カルチャ ーズに受託番号９０１０１００９で寄託したハイブリドーマセルラインが産生す る抗体３Ｒとこの点で機能的に均等な抗体。 ５０．Ｃ末端部分を含み無傷のｕ−ＰＡＲ分子のアミノ酸残基８８から始まるｕ −ＰＡＲ分子の非ｕ−ＰＡ結合部分と反応するモノクローナル抗体であって、上 記抗体がブダペスト条約の条項および条件下でヨーロピアン・コレクション・オ ブ・アニマル・セル・カルチャーズに受託番号９０１０１００７で寄託したハイ ブリドーマセルラインが産生する抗体１Ｒとこの点で機能的に均等な抗体。 ５１．Ｃ末端部分を含み無傷のｕ−ＰＡＲ分子のアミノ酸残基８８から始まるｕ −ＰＡＲ分子の非ｕ−ＰＡ結合部分と反応するモノクローナル抗体であって、上 記抗体がブダペスト条約の条項および条件下でヨーロピアン・コレクション・オ ブ・アニマル・セル・カルチャーズに受託番号９０１０１００８で寄託したハイ ブリドーマセルラインが産生する抗体２Ｒとこの点で機能的に均等な抗体。 ５２．Ｃ末端部分を含み無傷のｕ−ＰＡＲ分子のアミノ酸残基８８から始まるｕ −ＰＡＲ分子の非ｕ−ＰＡ結合部分と反応するモノクローナル抗体であって、上 記抗体かブダペスト条約の条項および条件下でヨーロピアン・コレクション・オ ブ・アニマル・セル・カルチャーズに受託番号９０１０１０１０で寄託したハイ ブリドーマセルラインが産生する抗体４Ｒとこの点で機能的に均等な抗体。 ５３．ｕ−ＰＡＲと反応し、それによりブロｕ−ＰＡまたは活性ｕ−ＰＡの結合 および細胞表面プラスミノーゲン活性化を阻害する請求項１記載のモノクローナ ル抗体の投与によりほ乳類におけるｕ−ＰＡのレセプター結合型のｕ−ＰＡＲへ の結合を妨害することによってプラスミノーゲンからプラスミンヘの活性化を阻 害することを含む、ほ乳類特にヒトにおける蛋白溶解活性の妨害または対抗法。 ５４．ほ乳類におけるｕ−ＰＡのレセプター結合型のｕ−ＰＡＲへの結合を妨害 することによってプラスミノーゲンからプラスミンヘの活性化を阻害することに よる、ほ乳類特にヒトにおける蛋白溶解活性の妨害または対抗するための組成物 の製造におけるｕ−ＰＡＲと反応し、それによりブロｕ−ＰＡまたは活性ｕ−Ｐ Ａの結合および細胞表面プラスミノーゲン活性化を阻害する請求項１記載のモノ クローナル抗体の使用。 ５５．モノクローナル抗体がヒトモノクローナル抗体である、請求項５３または ５４記載の方法。 ５６．抗体がＦａｂフラグメントである、請求項５３、５４または５５記載の方 法。 ５７．妨害または抗体される蛋白溶解活性ががん関連蛋白溶解活性である、請求 項５３−５６の何れかに記載の方法。 ５８．慢性関節リューマチ、潰瘍性大腸炎または乾せんのような組織破壊を伴な う非悪性疾患の処置に使用される、請求項５３−５６の何れかに記載の方法。 ５９．モノクローナル抗体が、ある種のがん細胞に存在する特定のｕ−ＰＡＲグ リコシル化変異種にもっばらまたは優先的に結合するモノクローナル抗体である 、請求項５８記載の方法。 ６０．患者の単球および顆粒球上のｕ−ＰＡＲ減少の検出による発作性夜間血色 素尿症の診断または予知における請求項１−５の何れかに記載のモノクローナル 抗体の使用。 ６１．がんの診断または予知における請求項１−５の何れかに記載のモノクロー ナル抗体の使用。 ６２．ほ乳類におけるｕ−ＰＡＲに対するｕ−ＰＡの受容体結合型の結合を妨害 することによるプラスミノーゲンからプラスミンヘの活性化の阻害による、ほ乳 類特にヒトにおける局在性蛋白質溶解活性の防止または対抗に適当な物質を選択 する方法であって、物質による存在可能なｕ−ＰＡ／ｕ−ＰＡＲ相互作用の阻害 を、固定化ｕ−ＰＡＲと可溶化ｕ−ＰＡを含む系に物質を加え、ｕ−ＰＡＲに結 合したｕ−ＰＡを抗ｕ−ＰＡ抗体の標識化または標識化した抗ｕ−ＰＡ抗体の使 用により検出するか、または固定化ｕ−ＰＡと可溶化ｕ−ＰＡＲを含む系に物質 を加え、ｕ−ＰＡに結合したｕ−ＰＡＲを抗ｕ−ＰＡＲ抗体の標識化または標識 化した抗ｕ−ＰＡＲ抗体の使用により検出することにより測定するスクリーニン グアッセイを行なうことを含む方法。 ６３．ほ乳類におけるｕ−ＰＡＲに対するｕ−ＰＡの受容体結合型の結合を妨害 することによるプラスミノーゲンからプラスミンヘの活性化の阻害による、ほ乳 類特にヒトにおける局在性蛋白質溶解活性の防止または対抗に適当な物質を選択 する方法であって、 （１）物質による存在可能なｕ−ＰＡ／ｕ−ＰＡＲ相互作用の阻害を、固定化ｕ −ＰＡＲと可溶化ｕ−ＰＡを含む系に物質を加え、ｕ−ＰＡＲに結合したｕ−Ｐ Ａを抗ｕ−ＰＡ抗体の標識化または標識化した抗ｕ−ＰＡ抗体の使用により検出 するか、または固定化ｕ−ＰＡと可溶化ｕ−ＰＡＲを含む系に物質を加え、ｕ− ＰＡに結合したｕ−ＰＡＲを抗ｕ−ＰＡＲ抗体の標識化または標識化した抗ｕ− ＰＡＲ抗体の使用により検出することにより測定するスクリーニングアッセイ、 （２）物質による存在可能なｕ−ＰＡ／ｕ−ＰＡＲ相互作用の阻害を、ｕ−ＰＡ Ｒと放射能標識ｕ−ＰＡまたはその誘導体を含む系に物質を加え、ｕ−ＰＡ結合 したｕ−ＰＡＲがあればこれを架橋結合し、架橋結合した生成物があればこれを ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびオートラジオグラフィーで検出するアッセイ、（３）存 在可能な培養細胞表面上のｕ−ＰＡＲに対するｕ−ＰＡの結合阻害を、放射能標 識したｕ−ＰＡまたはその誘導体とｕ−ＰＡＲ担持細胞を含む系に物質を加え、 ｕ−ＰＡＲに結合するｕ−ＰＡまたは誘導体があればこれを細胞のガンマ線計数 により検出するアッセイ、 （４）存在する可能な細胞表面プラスミノーゲン活性化のレセプター結合外因性 プロｕ−ＰＡによる阻害を、ｕ−ＰＡＲ担持細胞に物質を加え、ついでブロｕ− ＰＡを加え、さらに細胞表面のプラスミン発生の測定を行なうことにより測定す るアッセイ、 （５）存在する可能な細胞表面プラスミノーゲン活性化のレセプター結合外因性 ブロｕ−ＰＡによる阻害を、ｕ−ＰＡＲ担持細胞をインキュベートし、物質によ りブロｕ−ＰＡを産生し、さらに作用表面のプラスミン発生の測定を行なうこと により測定するアッセイ、 （６）ｕ−ＰＡおよびｕ−ＰＡＲの存在下に侵入および／または転移レマウスに 侵入およびまたは転移することが知られているヒトがん細胞を接種したヌードマ ウスにｕ−ＰＡ／ｕ−ＰＡＲ相互作用を阻害することが確認されている物質を投 与し、適当な物質として、マウスにおけるヒトがん細胞の侵入および／または転 移を阻害する物質を選択すること、 の段階の１つまたはそれ以上を含む方法。 ６４．ヒトがん細胞が、ｕ−ＰＡを産生する細胞であり、ｕ−ＰＡＲがマウスに 接種した他のヒト細胞により供給される、請求項６３記載の方法。 ６５．ヒトがん細胞が、ｕ−ＰＡＲを産生する細胞であり、ｕ−ＰＡがマウスに 接種した他のヒト細胞により供給される、請求項６３記載の方法。 ６６．ヒトがん細胞が、ｕ−ＰＡもｕ−ＰＡＲも産生しない細胞であり、ｕ−Ｐ Ａとｕ−ＰＡＲがマウスに接種した他のヒト細胞により供給される、請求項６３ 記載の方法。 ６７．ヒトがん細胞がｕ−ＰＡおよびｕ−ＰＡＲの両者を産生する細胞である、 請求項６３記載の方法。 ６８．マウスがｎｕ／ｎｕ−ＭＥＴＡ／Ｂｏｍ系のマウスである請求項６３−６ ７の何れかに記載の方法。 ６９．ヒトがん細胞とマウス細胞の視覚による識別をヒトがん細胞とマウス細胞 間の明確な色差の確立の助けで行なう、請求項６３−６８の何れかに記載の方法 。 ７０．ヒトがん細胞とマウス細胞間の明確な色差を酵素と酵素用色原体基質によ り確立する、請求項６９記載の方法。 ７１．酵素がβ−Ｄ−ガラクトシダーゼであり、基質がＸ−ｇａｌである、請求 項７０記載の方法。 ７２．β−Ｄ−ガラクトシダーゼがヒトがん細胞に導入されたｌａｃＺ遺伝子に より産生されるものである、請求項７１記載の方法。 ７３．ｌａｃＺ遺伝子がレトロウイルス性ベクターを用いた形質導入によりヒト がん細胞に導入されたものである、請求項７２記載の方法。 ７４．請求項６３−７３の何れか記載の方法により選択される場合、ほ乳類にお けるｕ−ＰＡＲに対するレセプター結合型ｕ−ＰＡの結合を妨害することによる プラスミノーゲンからプラスミンヘの活性化の阻害による、ほ乳類特にヒトにお ける局在外蛋白質溶解活性の妨害または対向用物質。 ７５．（１）物質を、固定化ｕ−ＰＡＲと可溶化ｕ−ＰＡを含む系に加え、ｕ− ＰＡＲに結合したｕ−ＰＡを抗ｕ−ＰＡ抗体を標識化することまたは標識化した 抗ｕ−ＰＡ抗体の使用により検出するか、または物質を固定化ｕ−ＰＡと可溶化 ｕ−ＰＡＲを含む系に加え、ｕ−ＰＡに結合したｕ−ＰＡＲを抗ｕ−ＰＡＲ抗体 を標識化することまたは標識化した抗ｕ−ＰＡＲ抗体の使用により検出すること により測定して、ｕ−ＰＡ／ｕ−ＰＡＲ相互作用を阻害する、および（２）物質 を、ｕ−ＰＡＲと放射能標識したｕＰＡまたはその誘導体を含む系に加え、ｕ− ＰＡに結合したｕ−ＰＡＲがあれば架橋結合させ、架橋結合した生成物をＳＤＳ −ＰＡＧＥおよびオートラジオグラフィーにより検出することにより測定して、 ｕ−ＰＡ／ｕ−ＰＡＲ相互作用を阻害する、および（３）物質を、放射能標識し たｕ−ＰＡまたはその誘導体とｕ−ＰＡＲ担持細胞を含む系に加え、ｕ−ＰＡＲ に結合するｕ−ＰＡまたは誘導体があれば細胞のガンマ線計数により検出するこ とにより測定して、培養細胞表面のｕ−ＰＡＲに対するｕ−ＰＡの結合を阻害す る、および （４）物質を、ｕ−ＰＡＲ担持細胞に加え、ついでブロｕ−ＰＡを加え、その後 細胞表面のプラスミン発生を測定することにより測定して、レセプター結合外因 性ブロｕ−ＰＡによる細胞表面プラスミノーゲン活性化を阻害する物質の、ほ乳 類におけるｕ−ＰＡＲに対するレセプター結合型ｕ−ＰＡの結合を妨害すること によるプラスミノーゲンからプラスミンヘの活性化の阻害による、ほ乳類特にヒ トにおける局在外蛋白質溶解活性の妨害または対向用組成物の製造における使用 。 ７６．物質がさらに （５）ｕ−ＰＡＲを担持しブロｕ−ＰＡを産生する細胞と物質をインキュベート し、ついで、細胞表面のプラスミン発生を測定することにより測定して、レセプ ター結合内因性ブロｕ−ＰＡによる細胞表面プラスミノーゲン活性化を阻害する 、請求項７５記載の方法。 ７７．物質がさらに （６）ｕ−ＰＡとｕ−ＰＡＲの存在下に侵入および／または転移するこてが知ら れ、マウスに侵入および／または転移する能力があるヒトがん細胞を接種したヌ ードマウスに投与したときヒトがん細胞の侵入および／または転移を阻害する能 力をもつ、請求項７５または７６記載の方法。 ７８．マウスがｎｕ／ｎｕ−ＭＥＴＡ／Ｂｏｍ系のマウスである請求項７７記載 の使用。 ７９．ヒトがん細胞とマウス細胞の視覚による識別を、酵素β−Ｄ−ガラクトシ ダーゼおよび酵素用色原体基質Ｘ−ｇａｌによるヒトがん細胞とマウス細胞間の 明確な色差の確立を用いて行なう、請求項７７記載の使用。 ８０．β−Ｄ−ガラクトシダーゼがヒトがん細胞に導入されたｌａｃＺ遺伝子に より産生されるものである、請求項７９記載の方法。 ８１．ｌａｃＺ遺伝子がレトロウイルス性ベクターを用いた形質導入によりヒト がん細胞に導入されたものである、請求項８０記載の方法。 ８３．物質がスラミンまたはスラミン類似体または誘導体である、請求項７５− ８１の何れか記載の使用。