JPH07501708A - ストレプトミセス属における組換えタンパク質の生産方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ストレプトミセス属における組換えタンパク質の生産方法本発明は、ストレプト ミセス属における組換えタンパク質の生産方法に関するものであり、その発現は ストレプトミセス　ガルブス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｇａｌｂｕｓ）　Ｄ ＳＭ　４０４８０において行なわれる。

ストレプトミセス属は、様々なタンパク質の大規模な工業生産に使用される。８ ２１のこうした菌株に関する総説が、Ｐ、　Ｋａｏ＋ｐｆｅｒら（Ｊ、ｏｆ　Ｇ ｅｎｅｒａｌ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ　１３７　（１９９１）、１８３１− １８９１）によって発表されている。したがって、ストレプトミセス属の大量発 酵法は高度な段階まで発達しており、治療用の製品の生産に関してストレプトミ セス属が無害であることはすでに何回も証明されている。また、ストレプトミセ ス属はタンパク質の組換え体の生産にも適している。このために必要な形質転換 法は、すでに多数の様々なストレプトミセス属菌株について記述されている（Ｒ ，Ｈｕ　ｔｔｅｒら、Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｓ　ｉｎ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏ ｌｏｇｙ、Ｇｏｏｄｆｅｌｌｏｗ。

ＷｉｌｌｉａｍｓおよびＭｏｒｄａｓｋｉ編、Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ、 　Ｌｏｎｄｏｎ、　１９８８．８９−１４８　、特に１４１−１４５ページのＴ ａｂｌｅ　１０参照）。しがしながら、ストレプトミセス属における異種ＤＮＡ 発現に関する一つの問題点は、例えばストレプトミセス　コエリコロア（Ｓｔｒ ｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ　）のように遺伝的によく性質が解 析されているストレプトミセス属株における、例えば大腸菌（Ｅ、　ｃｏｌｉ） 由来のような、異種ＤＮＡの切断である。ストレプトミセス　ガルブスおよびス トレプトミセス　リビダンス（ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　１ｉｖｉｄａｎｓ） における異種タンパク質の発現は、Ａ、　Ｗｅｉβら（６ｔｈ　Ｇｅｒｍａｎ　 ＶＡＡＭ　Ｗｏｒｋｓｈｏｐ　ｏｎ　ｔｈｅ　ｂｉｏｌｏｇｙ　ｏｆ　ｓｔｒｅ ｐｔｏｍｙｃｅｓ、　Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ　３Ｏ−Ｏｃｔｏｂｅｒ３、１９９０ ）によって報告されている。ストレプトミセス　リビダンスだけが、異種ＤＮＡ に対して低い切断活性を示すことから、これがストレプトミセス属における異種 ＤＮＡの発現に適している（Ｔ、　Ｋｉｅｓｅｒ　ら、Ｍｅｔｈ、　Ｅｎｚｙｍ ｏｌｏｇｙ　２０４　（１９９１）、　４３０−４５８）。

しかしながら、ストレプトミセス　リビダンスでは発現後に得られるタンパク質 の量が、大量生産には不十分である。

したがって、本発明の目的は、高収量で組換えタンパク質が得られるような、ス トレプトミセス属における組換えタンパク質の生産方法を提供することである。

この目的は、以下のようなストレプトミセス属細胞における組換えタンパク質の 生産方法によって達成される。すなわちこの方法において、当該タンパク質をコ ードするＤＮＡ配列を有するベクターで前記細胞を形質転換し、形質転換された 細胞を増殖させて、その間タンパク質を発現させ、そのタンパク質を細胞または 発酵上清から分離する。この方法の特徴は、ストレプトミセスガルブスＤＳＭ　 ４０４８０において発現を行なう点にある。

驚くべきことに、ストレプトミセス　リビダンスを用いる場合よりもストレプト ミセス　ガルブスＤＳＭ　４０４８０を用いる方が、かなり高収量の組換えタン パク質が得られることが明らかになった。こうして、ストレプトミセス　グリセ ウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｇｒｉｓｅｕｓ）由来のセリンプロテアーゼ Ｂは、ストレプトミセス　ガルブスＤＳＭ　４０４８０てクローン化および発現 を行なった後では、ストレプトミセス　リビダンスで他は同一の条件下でクロー ン化および発現を行った後よりＩ　Ｏ−５０倍の高収量で得られた（第２図参照 ）。

形質転換のために、リゾチーム処理および一７０℃での凍結によって、ストレプ トミセス　ガルブスＤＳＭ　４０４８０のコンピテントなプロトプラストを調製 することが好ましい。このようなコンピテントなプロトプラストのベクターＤＮ Ａによる形質転換は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）存在下で行なうことが できる。

形質転換後、プロトプラスト再生のために、まず２０−２５℃で３０時間インキ ュベートを行ない、その後形質転換されたストレプトミセスを選択する。次に、 異種ＤＮＡを発現するために、適当な複合培地または合成培地でストレプトミセ スを培養する。当業者に公知の好適な培地の選択は、本来、生産される異種タン パク質、および用いられるべき精製段階によって決まる。ついで、組換えタンパ ク質を細胞から、または発酵上清から、公知の方法にしたがって分離する。

組換えタンパク質の生産に用いるのに適した発現ベクターにおいて、組換えタン パク質をコードしたＤＮＡ配列は、強力なプロモーターの制御下にある。サツカ ロポリスポラ　エリスレウス（Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ　ｅｒｙｔ ｈｒｅｕｓ）由来のエリスロマイシン耐性遺伝子（ｅｒｍＥ）のｅｒｍＥプロモ ーター（Ｍ、　Ｂｉｂｂら、Ｇｅｎｅ　４１　（１９８６）　３５７−３６８） が特に好ましい。また、ｅｒｍＥプロモーターは、欠失、置換、挿入、並びにヌ クレオチドの付加によって得られ、転写を開始させるような、このプロモーター の誘導体および対立遺伝子も包含すると解される。ｅｒｍＥプロモーターの部分 を含有するハイブリッドプロモーターもまた好適である。ｅｒｍＥ−ｕｐプロモ ーターと表示され、その配列が配列番号ｌに示される、ｅｒｍＥプロモーター誘 導体の使用も望ましい。

さらに、組換えタンパク質をコードするＤＮＡ配列は誘導プロモーターの制御下 にあることが望ましい。

好適な誘導プロモーターとしては、例えば、ストレプトミセス　リビダンスのガ ラクトースオペロン由来のＧａｌ　ＰＩプロモーターがある（Ｆｏｒｎｗａｌｄ ら、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　Ｕ、Ｓ、Ａ、　８４　（１ ９８７）、　２１３０−２１３４）。ストレプトミセスにおいて誘導性の高発現 を可能にする、例えば、　ｅｒｍＥ−ｕｐプロモーターおよびＧａｌ　ＰＩプロ モーター由来のようなハイブリッドプロモーターも用いることができ、むしろ望 ましい。

ストレプトミセス　ガルブスＤＳＭ４０４８０株、ｐｌＪ６９９を有する大腸菌 ＨＢＩＯＩ　（ＤＳＭ７０３１）およびｐ［Ｊ４０７０を有する大腸菌ＪＭ８３ 　（０３Ｍ７０３２）を、特許手続きの目的で、１９９２年４月３日１ごＤｅｕ ｔｓｃｈｅ　Ｓａｍｍｌｕｎｇ　ｆｕｒ　Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ　ｕ ｎｄ　Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ　Ｇ＋ｎｂＨ，Ｍａｓｃｈｅｒｏｄｅｒ　Ｗｅ ｇ　ｌｂ、　３３００　Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ″に寄託した。

図面および配列表とともに以下の実施例によって、本発明をより詳細に説明する 。

第１図は、発現ベクターｐＣＲＷ６９を示す。

第２図は、ストレプトミセス　リビダンス、６６７に２３　（曲線ｌ）およびス トレプトミセス　ガルブス、ＤＳＭ４０４８０　（曲線２）で発現後に得られる セリンプロテアーゼＢの量の比較を示す。

配列番号＝ｌはｅｒｍＥ−ｕｐプロモーターの配列を示す。

配列番号：２および 配列番号：３は、５ｐｒＢシグナルペプチドのクローン化および変異誘発に使用 されたＰＣＲプライマーを示す。

配列番号：４および 配列番号：５は、ストレプトミセス　グリセウス由来のセリンプロテアーゼＢの クローン化に使用されたＰＣＲプライマーを示す。

配列番号：６および 配列番号＝７は、大腸菌由来のアルカリホスファターゼのクローン化に使用され たＰＣＲプライマーを示す。

配列番号二８および 配列番号＝９は、ヒト、コリパーゼのクローン化に使用されたＰＣＲプライマー を示す。

配列番号：ＩＯおよび 配列番号＝ｌｌは、ヒト膵アミラーゼのクローン化に使用されたＰＣＲプライマ ーを示す。

実施例１：発現ベクターｐＣＲＷ６９の構築ベクターｐｌＪ６９９　（Ｔ、　Ｋ ｉｅｓｅｒら、Ｇｅｎｅ　６５　（１９８８）、　８３−９１）を制限エンドヌ クレアーゼＫｐｎ　ＩおよびＢｇｌ　ＩＩで消化し、得られた４゜２７ｋｂの大 きさのフラグメントをプロモーター−シグナルペプチドマルチリンカ−カセット と結合した。

シグナルペプチドをコードする配列を、ストレプトミセスグリセウス（ＤＳＭ４ ０２３６）のセリンプロテアーゼＢをコードする遺伝子ｓｐｒ　Ｂから分離した （ｓｐｒＢ遺伝子の配列はＨｅｎｄｅｒｓｏｎら、Ｊ。

Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ　１６９　（１９８７）、　３７７８−３７８４に記載され ている）。これはりボゾーム結合部位、および遺伝子産物においてシグナルペプ チダーゼの切断部位に続く切片を包含する、シグナルペプチドをコードする配列 を含んでなる。この領域は、部分的に非相同なプライマー（配列番号：２および ３）を用いた増幅によって得られ、この過程で１５０ｂｐの長さのフラグメント として結合可能（ａｃｃｅｓｓｉｂｌｅ）となるようにＢａｍＨＴ　／　Ｓｍａ 　Ｉ制限によって変異を受けた。

このＢａｍＨＩ　／　Ｓｍａ　Ｉフラグメントを、ｅｒｍＥ−ｕｐプロモーター （配列番号：ｌ）およびマルチリンカ−を含有する、ＢａｍＨＩ　／旧ｎｄＩＩ で切断したベクターｐｌＪ４０７０に結合し、こうして得られたプラスミドｐｃ ＲＷ６８を大腸菌ＪＭ８３において形質転換した（Ｍｅｓｓｉｎｇら、Ｇｅｎｅ 　３３　（１９８５）、１０３−１１９）。

こうして作成された４２０ｂｐを含んでなるプロモーター−シグナルペプチドマ ルチリンカ−カセットを、ｐＣＲＷ６ＢのＢｇｌ　ＩＩ　／にｐｎＩフラグメン トとして、Ｋｐｎ　ＩおよびＢｇＩ　ｎで切断したベクターｐｌＪ６９９に挿入 し、このようにしてストレプトミセスベクターｐＣＲＷ６９が、長いポリリンカ ーを用いて作成された（第１図）。

リボゾーム結合部位、シグナルペプチドおよびプロペプチドを包含する、ストレ プトミセス　グリセウスのセリンプロテアーゼをコードするＤＮＡ切片（配列は 、Ｈｅｎｄｅｒｓｏｎら、Ｊ、　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、　１６９　（１９８７） 、　３７７８−３７８４）を、部分的に非相同なオＩノゴヌクレオチドプライマ ー（配列番号：４および５）を用（１て、ＰＣＲｉこよって、ストレプトミセス 　グリセウスＤＳＭ４０２３６のゲノムＤＮＡから増幅したが、この過程におい て、この領域がＢａｍＨＩ／Ｐｓｔ■フラグメントとして結合可能となるように 変異を受けた。この１、　Ｏｋｂの長さのＢａｍＨＩ　／　Ｐｓ　ｔ　Ｉフラグ メントをＢａｍＨＩ　／　Ｐｓ　ｔ　Ｉで消化したベクターｐｃＲＷ６９に結合 し、こうして得られたベクターｐｃＲＷ７０をストレプトミセス　ガルブスにお いて形質転換した（実施例６）。このベクターｐｃＲＷ７０をｓｐｈ　Ｉおよび マルチリンカ−領域で切断する酵素で消化することによって、ｐｃＲＷ７０は様 々な遺伝子がｅｒｍＥ−ｕｐプロモーターの制御下にクローン化されることを可 能にする。

ｐｈｏＡ遺伝子は、Ｃｈａｎｇらによって記述されているように、大腸菌のＤＮ Ａから旧ｎＤＩＩＩ／ＸｈｏＩフラグメントとして調製され（Ｃｈａｎｇら、Ｇ ｅｎｅ　４４　（１９８６）、　１２１−１２５）　、大腸菌ＪＭ８３において 、ＨｉｎｄｌＩＩ　／　Ｓａｔ　Ｉで消化されたｐＵｃ１８ベクター（Ｍｅｓｓ ｉｎｇら、Ｇｅｎｅ３３　（１９８５）、　１０３−１１９）にクローン化した 。成熟アルカリホスファターゼをコードする領域を、配列番号＝６および７に示 すプライマーを用いたＰＣＲ変異によって、１．３６ｋｂの長さのＰｓｔ　Ｉ　 ／Ｘｂａ　Ｉフラグメントとして増幅し、ＰｓｔＩ／ＸｂａＩで消化したベクタ ーｐＣＲＷ６９　（実施例１）に結合した。

実施例４：ヒトコリパーゼｃＤＮＡのクローン化膵臓由来の成熟ヒトコリパーゼ の遺伝子切片（Ｌｏｗｅら、Ｂｉｏｃｈｅｍ　２９　（１９８９）、　８２３− ８２８）が、ＰＣＲフラグメントとして、λｇｔｌｌ遺伝子バンク（Ｃ１ｏｎｔ ｅｃｈ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、　Ｉｎｃ、、　Ｐａ１ｏ　Ａｌｔｏ、　Ｃ Ａ。

ＵＳＡ、カタログ番号ＨＬ　１０６９ｂ）から、増幅によって得られた。このと き、配列番号：８および９に示すプライマーを用いたＰＣＲ変異によって、ｓｐ ｈ　Ｉ切断部位が５°末端に挿入され、ＰｓｔＩ切断部位が３゛末端に挿入され た。この３４０ｂｐの長さのフラグメントを、５ｐｈｌ／ＰｓｔＩで消化したベ クターｐＣＲＷ６９　（実施例１）に結合したが、このとき、その遺伝子は融合 部位の領域において変異をうけた。

実施例５：ヒト膵アミラーゼｃＤＮＡのクローン化ヒト膵アミラーゼｃＤＮＡを 以下のようにクローン化した：成熟アミラーゼをコードする配列（Ｎａｋａｍｕ ｒａら、Ｇｅｎｅ　２８　（１９８４）、　２６３−２７０およびＮ１５ｈｉｄ ｅら、Ｇｅｎｅ　５０　（１９８６）、　３７１−３７２）をＰＣＨによって市 販のλｇｔｌｌにおけるｃＤＮＡ遺伝子バンク（Ｃ１ｏｎｔｅｃｈ　Ｌａｂｏｒ ａｔｏｒｉｅｓ、　Ｉｎｃ、、　Ｐａ１ｏ　Ａｌｔｏ、　ＣＡ、　ＵＳＡ、カタ ログ番号ＨＬ　１０６９ｂ）から増幅し、部分的に非相同なプライマーを用いて 、Ｓｐｈ　Ｉ　／ＨｉｎｄＩ［ｒフラグメントとして結合可能となるようにこの 過程で変異させた。

この１．５３ｋｂの長さのＳｐｈ　Ｉ　／ＨｉｎｄＩＩＩフラグメントをｓｐｈ 　Ｉ　／旧ｎｄＩ［Ｉで消化したベクターｐＣＲＷ６９に結合した。

ストレプトミセス　ガルブス、ＤＳＭ　４０４８０をＣｈａｔｅｒら（Ｃｈａｔ ｅｒら、Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｔｏｐｉｃｓ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、　４６　（１９ ８２）、　６９−９５）にしたがって形質転換した。プロトプラスト形成のため に、ＴＳＢ　（１−リプトン−大豆ブロス；　ｏｘｏｉｄ　３０ｇ／ｌ）または ＹＥＭＥ培地（いずれも１０．３％スクロースを含有するが、グリシンを含まな い）における主培養２５ｍ１を、ＴＳＢでのストレプトミセス　ガルブス静置前 培養２■ｌとともに、２５０ｍ１エーレンマイヤーフラスコに接種して、３６時 間２８℃でインキュベートし、その間激しく振盪した。次に培養物を２個の滅菌 遠心管に分割し、４℃、２６００ｇで１０分間遠心分離し、菌糸体を１０．３Ｘ スクロース溶液で２回洗浄した。その後、細胞をリゾチーム含有（１ｍｇ／ｍｌ ）　Ｐバッファー４ｍｌ中で、３０℃、４５分間インキュベートし、その懸濁液 を５ｍｌガラス製ピペットで３回ピペット内を上下させて混合し、さらに１５分 間インキュベートした。

５ｍＩＰバッファーを添加して、上記のようにピペットを用いて混合した後、滅 菌脱脂綿で濾過した。こうして得られたプロトプラストを遠心しく７分間、１５ ００ｇ）　、それぞれ４ｍｌのＰバッファーで再懸濁し、−７０℃で１．５ｍ１ 反応容器に１ｍｌずつ分割して氷上でゆっくり凍結させた。

形質転換のために、凍結したプロトプラストの一部を、３７℃で速やかに融解し 、室温で、３０００ｇで４分間遠心し、そのベレットを残留しだ液滴に再懸濁し て、最大で５μｍのＤＮＡ溶液と混合した。

Ｔバッファーに溶解した２５％（Ｗ／Ｖ）　ＰＥＧ１００Ｏ（Ｒｉｅｄｅｌ　ｄ ｅ　Ｈａｅｎ）を１００μｍ添加し、短くした２００μｌのプラスチックピペッ トの先端から３回吸い上げ下げして混合し、これをただちに、８５０μＩのＰバ ッファーで希釈して、上記のように室温で４分間遠心して、ペレットを１ｍＩ　 Ｐバッファーに再懸濁した。

形質転換後プロトプラストを再生させるため、上記のものをＲ２ＹＥ寒天平板（ 無菌の貯蔵所内で１時間予備乾燥させた）上に塗布し、２０−２５℃で約３０時 間再生させた。チオストレプトンを含有する（３００μｇ／ｍｌ）　Ｐバッファ ーで覆った後、３０℃でさらにインキュベートすることによって、培養物を選択 した。

ＴＳＢ／１０．３％スクロース ＴＳＢインスタント培地（Ｏｘｏｉｄ）　３０．　Ｏｇ／ｌスクロース　１０３ ．０ｇ／Ｉ ＹＥＭＥ培地／１０．３１スクロース 酵母エキス　３．　ＯＯｇ／ｌ ペプトン　５．００ｇ／ｌ 麦芽エキス　３．　ＯＯｇ／ｌ グルコース　ＩＯ，ｏｏｇ／ｌ スクロース　１０３．　ＯＯｇ／ｌ ＭｇＣｌ２　Ｘ　６Ｈ２０１，０２ｇ／ＩＰバッファー スクロース　１０３．０　ｇ／ｌ Ｋ２Ｓ０．　０．２０ｇ／ｌ ＭｇＣ１□ｘ　６Ｂ２０　２．０２ｇ／ｌ微量元素溶液　２．０ｍｌ 蒸留水で８００．　Ｏｍｌとし ８０ｎ＋ｌずつ分割してオートクレーブ滅菌した後、ＫＨ２ＰＯ，（０，５％） 　１ｍ１ ＣａＣＩｚ　ｘ　Ｎ２０（３，６８％）　１０ｍ１ＴＢＳバツフアー（５，７３ Ｘ、　ｐＨ７，２）　１０ｍ１を滅菌条件下でピペットによって添加した。

ＴＥＳバッファー：　５．７３ｇ　ＴＥＳ　（Ｎ　−トリス（ヒドロキシメチル ）メチル−２−アミノエタンスルホン酸、５ＥＲＶＡ）を秤量して９５ｍ１蒸留 水にいれ、２ｍｏｌ／ｌ　ＮａＯＨてｐＨを７．２に調整した後、ｌｏｏｍｌと してオートクレーブ滅菌した。

微量元素溶液 ＺｎＣｌ　２　４０．　Ｏｍｇ／ｌ ＦｅＣ１３ｘ　６Ｈ２０２００，Ｏｍｇ／ｌＣｕＣｌ２ｘ　２８２０　１０．Ｏ ｍｇ／ｌＭｎＣ１□１０．０ｍｇ／Ｉ ＮａＪｔＯｔ　ｘ　１０Ｈ２０１０，Ｏｍｇ／１（ＮＨ＋）ｇＭｏｙｏ＋　ｘ　 ４Ｈ２０１０，ｏｍｇ／ＩＴバッファー スクロース（１０，３％）２５．釦１ 蒸留水　７５．０ｍｌ 微量元素溶液　０．２ｍ１ Ｋ２ＳＯ４（２，５Ｘ）　１．　Ｏｍｌそれぞれ９．３ｍｌずつ分けてオートク レーブ滅菌し、次に滅菌条件下でピペットによって以下を添加した：　ＣａＣｌ ２ｘ　６Ｈ，０（３，６８％）：０．２ｍ１．　ＴＭバッフｙ−ｐＨ８，０：０ ．５ｍｌＴＭバッファー １ｍｏｌ／ＩＴｒｉｓをマレイン酸（固体）でｐｉ（８，０に調整し、オートク レーブ滅菌した。

Ｔバッファー／２５ＸＰＥＧ Ｏ，５ｇ　ＰＥＧ１００Ｏ（Ｒｉｅｄｅｌ　ｄｅ　Ｈａｅ　ｎ）を秤量し、オー トクレーブ滅菌した。使用する直前に再び液状にし、滅菌条件下でピペットによ りＴバッファー１．５ｍｌを加えた。

ＭｇＣｌ　２　１０．１２ｇ／ｌ グルコース　１０．０　ｇ／ｌ Ｋ２Ｓ０１　０．２５ｇ／ｌ カザミノ酸　０．１ｇ／ｌ 寒天（Ｂａｃｔｏ−Ａｇａｒ、　Ｄｉｆｃｏ　Ｃｏｍｐａｎｙ）　２５．０　ｇ ／ｌ蒸留水で８００ｍ１とし、オートクレーブ滅菌した後、ＫＨ２ＰＯｔ　（０ ，！５％）　１０．０ｍ１ＣａＣＩ２ｘ　２Ｈ２０（３，６８％）　８０．０ｍ １Ｌ−プロリン（２０，０％）　１５．０ｍ１ＴＥＳバツフ　ｙ　−（５，７３ ％；ｐＨ７，２）　１００．０ｍｌ微量元素溶液　２．０ｍｌ ＮａＯＨ（１ｍｏｌ／Ｉ）　５．０ｍｌ酵母エキス（Ｄｉｒｃｏ）（１０，Ｂ） 　５０．０ｍｌを滅菌条件下で加えた。

ストレプトミセス　ガルブスＤＳＭ　４０４８０を、実施例２−５にしたがって クローン化された遺伝子配列を用いて、実施例６にしたがって形質転換した。ク ローン化された遺伝子の発現のために、形質転換された細菌を以下の条件下で培 養した：ａ）ストレプトミセス　グリセウス由来のプロテアーゼＢの発現プロテ アーゼＢを最適に生産するために、低脂肪乳最小培地（ＭＭ培地）を使用した。

１００ｍ１培養物を１０１００Ｏエーレンマイヤーフラスコで３０℃で生育させ 、その間活発に通気した（Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ　５ｃｉｅｎｔ汀ｉｃ　Ｃｏｍｐ ａｎｙ製、Ｇｙｒａｔｏｒｙ　ｗａｔｅｒ−ｂａｔｈ　５ｈａｋｅｒ、　Ｍｏｄ ｅｌＧ７６：振盪速度：８）。２−４日間の後、プロテアーゼの生成が始まり、 それは培地の清澄化によって直接観察することができた。

Ｆｅ５０．　０．　Ｏｌｇ （Ｎｌ（ｌ）２ＳＯ１２，００ｇ＄ ＣａＣＬ　ｏ、３６ｇ本 に２ＨＰＯＩ　０．５０ｇ！ グルコース　ｉｏ、０ｇ本 粉乳　２．０ｇ！ ＊を付していない塩類を秤量して、再蒸留水で８２５ｍ１とし、１０分間撹拌し た後、Ｎａ１ｌ（てｐＨ値を７．０から７．５に調整した。＊を付した、上記以 外の培地成分を、それぞれ別々に２５ｍ１に溶解し、グルコースは３回蒸留した 水５０ｍ１に溶解し、オートクレーブ滅菌した後、それらを滅菌条件下で、オー トクレーブ滅菌した塩類溶液に添加した。

ｂ）大腸菌由来のアルカリホルファターゼの発現大腸菌由来のアルカリホルファ ターゼは、プロテアーゼＢに関するａ）項記載の培養条件下で、ＴＳＢ培地中で 生産された。

Ｃ）ヒト膵アミラーゼの発現 ヒト膵アミラーゼを生産するために、それぞれ形質転換されたストレプトミセス 　ガルブスをａ）項で述べた条件下で１％デンプン含有１００ｍ１　Ｌｅｃｈｅ ｖａｌｉｅｒ培地で培養した。

Ｌｅｃｈｅｖａｌ　ｉｅｒ／１％デンプンデンプン　１０．００ｇ／　Ｉ し一アスパラギン　１０．００ｇ／１ ＺｎＳＯ，ｘ　７Ｈ２００，０２ｇ／ｌＭｇ５Ｏ＋　Ｘ　７Ｈ２００，２０ｇ／ ｌＦｅ５Ｏ４ｘ　７Ｈ２００，０２ｇ／ｌＣｕ５Ｏ，Ｘ　５Ｈ２００，０２ｇ／ ＩＫ２ＨＰＯ，０，８８ｇ／ｌ ＫＨ２ＰＯ４０，６８ｇ／１ ｐＨ７，２ ｄ）ヒトコリパーゼの発現 ヒトコリパーゼの発現は、ＴＳＢ培地／１０．３％スクロースまたはＹＥＭＥ培 地／１０．３％スクロース（いずれの場合もグリシン無し）を用いる以外は、ａ ）の記載にしたがって実施された。

ストレプトミセス　グリセウスのセリンプロテアーゼＢをコードする５ｐｒＢ遺 伝子の２．８ｋｂ長さのＢｇｌ　Ｉｆフラグメント（配列は以下に示される：　 Ｈｅｎｄｅｒｓｏｎら、Ｊ、　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、　１６９（１９８７）、　 ３７７８−３７８４）を、ＢａｍＨＩで切断したｐＵｃ１８ベクターにクローン 化し、こうしてベクターｐＡＩＶＤ７−１４が得られた。５ｐｒＢプロモーター を包含する完全な５ｐｒＢ遺伝子を含有する２、　７ｋｂ長さのＰｓｔＩ／Ｋｐ ｎＩフラグメントを、このベクターから分離し、やはりＰｓｔ　Ｉ　／Ｋｐｎ　 Ｉで切断したベクターｐｌＪ７０２　（Ｋａｔｘら、Ｊ、　Ｇｅｎ、　Ｍｉｃｒ ｏｂｉｏｌ、　１２９（１９８３）、　２７０３−２７１４）に結合した。スト レプトミセス　ガルブスＤＳＭ　４０４８０およびストレプトミセス　リビダン ス６６　ＴＫ２３　（）Ｉｏｐ＋ｖｏｏｄら、（１９８５）　Ｇｅｎｅｔｉｃ　 Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ、　Ａ　Ｌａｂｏ ｒａｔｏｒｙｍａｎｕａｌ、　Ｔｈｅ　Ｊｏｈｎ　［ｎｎｅｓ　Ｆｏｕｎｄａｔ ｉｏｎ：　Ｎｏｒｗｆｃｈ）を、上記のようにして得られたベクターｐＡＷｓ７ −１４−４を用いて、実施例６記載の方法にしたがって形質転換した。

形質転換された細胞のプロテアーゼ発現を、Ｄｅｌｍａｒらの方法にしたがって 測定した（Ａｎａｌ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　９９（１９７９）、　３１６−３２ ０およびＧｅｉｇｅｒ（Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｅｎｚｙｍａｔｉｃ　ａｓｓａｙ）　 Ｂｅｒｇｍｅｙｅｒ　ｅｄｉｔｏｒ（１９８４）。

８１５−８１８）　、このために、７０μｍ基質溶液（Ｎ−スクシニル−Ａｌａ −Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−ｐ−ニトロアニリド、３．１２＋ｎｇ／ｍｌを５０ ｍｍｏｌ／ｌリン酸ナトリウム−カリウムバッファーｐＨ８中に含有）および６ ２０μｌ　５０闘Ｏ１／ｌリン酸ナトリウム−カリウムバッファ　−ｐＨ８（５ ０ＩＩ＋ｍｏｌ／ｌ　Ｎａ、ＨＰＯｔ、および５０ｍｍｏｌ／ｌ　ｋＨ２ＰＯ１ ）をミクロキュベツトに入れ、混合し、加温可能なキュベツト内で３０℃５分間 ブレインキュベートした。

被験菌株の培養上清ｌＯμｍの添加によって、反応を開始し、その後ただちに、 ４０５ｎｍで少なくとも５分間、吸光度の増加を測定した。容量活性は以下によ って与えられる。

Ａ　４０５ｎｍ／分Ｘ希釈倍率ｘＶ　ｔｏｔａｌ容量活性＝□ ε４０５ｎｍ　ｘ　ｄ　ｘ　ＶｓａｍｐｌＶ　ｔｏｔａｌ　：総容量（０，７ｍ ｌ）Ｖｓａｍｐｌｅ　：試料容量（０，０１ｍ１）ｄ　、キュベツトの光路長（ １ｃｍ） ε４０５ｎｎ＋　：モル吸光係数（９，３０４Ｍ　’ｃｍ−’）配列表 配列番号＝１ 配列の長さ：３３５ 配列の型・核酸 鎖の数ニー末鎖 トポロジー　直鎖状 配列の種類：　ＤＮＡ　（ｇｅｎｏｍｉｃ）配列 配列番号＝２ 配列の長さ・２４ 配列の型：核酸 鎖の数、−末鎖 トポロジー二直鎖状 配列の種類−ｃＤＮＡ 配列 ＧＧＡＴＣＣＣＣＣＴ　ＣＧＧＡＧＧＡＡＣＣＣＧＡＡ配列番号　３ 配列の長さ　２２ 配列の型、核酸 鎖の数　−末鎖 トポロジー・直鎖状 配列の種類　ｃＤＮＡ 配列 ＣＧＴＣＣＣＧＧＧＣＧＴＴＴＣＧＧＣＴＣＧＣ２２配列番号：４ 配列の長さ、３０ 配列の型　核酸 鎖の数　−末鎖 トポロジー　直鎖状 配列の種類　ｃＤＮＡ 配列 ＧＧＡＴＣＣＣＣＣＴ　ＣＧＧＡＧＧＡＡＣＣＣＧＧＣＡＴＧＣＧＧ　３０配列 番号゛５ 配列の長さ・２８ 配列の型　核酸 鎖の数　−末鎖 トポロジー、直鎖状 配列の種類：　ｃＤＮＡ 配列 ＣＴＧＣＡＧＡＧＣＴ　ＣＣＣＣＧＧＣＧＡＧ　ＣにＧＧＡＧＣＣ２Ｂ配列番号 ：６ 配列の長さ：２４ 配列の型、核酸 鎖の数ニー末鎖 トポロジー・直鎖状 配列の種類：　ｃＤＮＡ 配列 ＴＴＣＴＧＣＡＧＴＴ　ＣＴＧＧＡＡＡＡＣＣＧＧＧＣ２４配列番号＝７ 配列の長ざ　２４ 配列の型　核酸 鎖の数、−末鎖 トポロジー・直鎖状 配列の種類：　ｃＤＮＡ 配列 ＡＡＴＣＴＡＧＡＴＴ　ＡＴＴＴＣＡＧＣＣＣＣＡＧＡ　２４配列番号−８ 配列の長さ：２４ 配列の型：核酸 鎖の数ニー重鎖 トポロジー・直鎖状 配列の種類：　ｃＤＮＡ 配列 ＡＴＴＧＣＡＴＧＣＡ　ＴＡＴＧＣＡＧＣＴＣＣＴＧＧ　２４配列番号二〇 配列の長さ＝２４ 配列の型：核酸 鎖の数ニー重鎖 トポロノー：直鎖状 配列の種類：　ｃＤＮＡ 配列 ＣＴＧＣＡＧＣＡＴＴ　ＣＴＧＧＧＣＴＡＧＧ　ＴＧＴＧ　２４配列番号　ｌＯ 配列の長さ、２４ 配列の型　核酸 鎖の数　−末鎖 トポロンー：直鎖状 配列の種ＩＩ　：　ｃＤＮＡ 配列 配列番号：１１ 配列の長さ＝２４ 配列の型、核酸 鎖の数ニー重鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：　ｃＤＮＡ 配列 ＡＡＧＣＴＴＴＧＣＧ　ＧＡＴＴＴＧＣＡＴＴ　ＴＡＡτ　２４Ｆｉｇ、Ｉ Ｂｌ：（１ Ｆｉｇ　、　２ 時間　（ｄ） 手続補正書 平成６年ＩＯ月７日

Claims (4)

【特許請求の範囲】
1. １．タンパク質をコードするＤＮＡ配列を含有するベクターで細胞を形質転換し 、こうして得られた形質転換細胞を増殖させてタンパク質を発現させ、タンパク 質を細胞から、または発酵上清から分離するが、上記においてその発現がストレ プトミセスガルブスＤＳＭ４０４８０で行なわれる、ストレプトミセス属細胞に おける組換えタンパク質の生産方法。
2. ２．タンパク質をコードするＤＮＡ配列がｅｒｍＥプロモーターの制御下にある 発現ベクターを使用する、請求の範囲第１項記載の方法。
3. ３．タンパク質をコードするＤＮＡ配列がｅｒｍＥ−ｕｐプロモーターの制御下 にある発現ベクターを使用する、請求の範囲第１項記載の方法。
4. ４．タンパク質をコードするＤＮＡ配列が誘導プロモーターの制御下にある発現 ベクターを使用する、請求の範囲第１項記載の方法。