JPH07501928A - 哺乳類の細胞における遺伝子のエクジステロイド依存調節 - Google Patents

Abstract

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Description

【発明の詳細な説明】 哺乳類の細胞における遺伝子のエフジステロイド依存調節発明の分野 本発明は一般的に云って、蛋白質を結合するエフジステロイド・レセプターの調 節のもとに異種遺伝子の遺伝子発現を誘発する、哺乳類の細胞における特定のエ フジステロイドの使用に関するものである。

発明の背景 ステロイドホルモンレセプターの一群は、主にリガンド依存の転写因子として機 能し発生や代謝のプロセスに影響する、進化的に保存された蛋白質群をあられｅ ｎｃｅ　２４０．８８９［１９８８］）。レセプター蛋白の構造の分析は、ＤＮ Ａやりガントと結合しそして転写を促進する機能をもつこれら蛋白質のドメイン を同定４１、８１２　［１９８８］；Ｓ、　Ｍ、　Ｈｏｌｌｅｎｂｅｒｇ　及び Ｒ，Ｍ、　Ｅｖａｎｓ、Ｃｅ１ｌ　５５．８９９［１９８８］；Ｎ、Ｊ、　Ｇ、 　Ｗｅｂｓｔｅｒ、Ｓ、　Ｇｒｅｅｎ、Ｊ、　Ｒ，Ｊｉｎ　及びＰ。

ＣｈａＩｌｌｂｏｎ、Ｃｅ１１　５４，１９９［１９８８］）。リガンド結合は 、あるレセプターとその同族体反応要素の相互作用のために必要であり（Ｐ、　 Ｂ、　Ｂｅｃｋｅｒほか、Ｎａｔｕｒｅ　３２４．６８６［１９８８］）、そし てまた二量化や転写活性能をもコントロールし得る（Ｓ、Ｙ、Ｔｓａｉほか、Ｃ ｅ１ｌ　５５．３６１［１９８８］；Ｖ、Ｋｕｗａｒ及ステムと異種遺伝子の発 現を制御する新規なメカニズムを提供した（Ａ、Ｊ、Ｃ。

ｕｒｅｙ　及びＲ，Ｔｊｉａｎ、Ｃｅ１１　５５．８８７（１９８８）：Ａ、Ｊ 、Ｃｏｕｒｅｙ、Ｄ、　Ａ。

Ｈｏ１ｔｚＩＩｌａｎ、Ｓ、　Ｐ、Ｊａｃｋｓｏｎ　及びＲ，Ｔｊｉａｎ、Ｃｅ １１　５９．８２７［１９８９］）。

哺乳動物のステロイドホルモンレセプターは、酵母（Ｄ、　Ｍｅｔｚｇｅｒ、　 Ｊ　、　Ｈ，Ｗｈｉ現させるときに機能することが見出された。

エフジステロイドは、作用が細胞内レセプターによって仲介されるステロイドで あって、昆虫の脱皮ホルモンを包含する。β−エクジソンとして知られているエ フジステロイドホルモン２Ｏ−ＯＨエクジソンは、多くの昆虫での発育のタイミ ングを調節する。一般文献としてＫｏｏｌｍａｎ（編）、Ｅｃｄｙｓｏｎｅ：Ｆ ｒｏ＋ｅ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　ｔｏ　Ｍｏｄｅ　ｏｆ　Ａｃｔｉｏｎ、Ｔｈ１ ｅｓ＋ｅ　Ｍｅｄｉｃａｌ　Ｐｕｂ、　、ニューヨーク（１９８９）を参照のこ と。「エクジソン」という一般的な用語は、屡々２Ｏ−ＯＨエクジソンの略号と して用いられる。昆虫の生育中の短時間におけるエクジソン濃度のパルス（即ち 上昇と下降）はショウジョバエの生長のいろんな段階で認められる。

胚形成、三つの幼虫段階及び二つの桶段階がこれらの段階に含まれる。最終の輛 段階は成虫ハエの形成によって終了する。生育についてのエクジソンの研究結果 は第三の、即ち最後の幼虫段階の終期のパルスから得られた。このパルスは、幼 虫から成虫への変態の開始を誘発するものである。成虫組織と呼ばれる特定の組 織は、目や翼や脚のような、その成虫構造の形成を開始する様誘導される。

生育の幼虫段階のあいだ、巨大多糸染色体が非成虫の幼虫組織中で生長する。

これらのケーブル状の染色体は、約２．０００にも達する染色体コピーより成る 凝集体から成っている。これらの染色体の凝集体は極めて有用である。何故なら ば、それによって染色体内のある遺伝子の位置が、通常の染色体に典型的に可能 であるより数等高いオーダーの極めて高い分解能で決定できる手段が提供される からである。

多糸染色体中のパフは、パフ座における遺伝子の転写に関連した、これらのケー ブル状多糸染色体凝集体の局所的な拡大又は膨張である。したがって、パフとは 、染色体中の特定位置にある遺伝子の転写の指標である。

遺伝子調節のモデルは、幼虫から成虫への変態を惹起するエクジソンパルスによ って誘導される多糸染色体パフの一時的なシーケンスを説明するために提案され た。Ａｓｈｂｕｒｎｅｒらの「多糸染色体におけるパフ活性の一時的制御につい てＪＣｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｓｙｍｐ、　Ｑｕａｔ、Ｂｉｏｌ 、３旦、６５５−６６２（１９７４）を参照。このモデルは、エクジソンはレセ プター蛋白（エクジソンレセプター）との」遺伝子の小セットの転写を直接に誘 導するであろう。これら初期の遺伝子は、初期のパフ後に現れる「後期の」パフ の形成の原因となる「後期の」遺伝子の第二のセットの転写を誘発する調節蛋白 をコードしていると考えられている。すなわちこのモデルは三ランクの遺伝子調 節階層を定める。すなわちエクジソンレセプター遺伝子が第一ランク、初期の遺 伝子が第二ランク、そして後期の遺伝子が第三ランクである。パフパターンが誘 導されたこのモデルは非成虫組織中で見られる一方で、類似の遺伝調節階層もま た、（他の生長段階でおこるエクジソンのパルスで誘発される組織生育の変化と 同じように）エクジソンのターゲットでもある成虫組織の生育における変態をも 決定し得る。

種々の構造データが、を椎動物のステロイドや他の親油性レセプター蛋白から誘 導された。このようなレセプターの「大家族」はその構造の類似性にもとづいて 定義される。Ｅ　ｖｎｓｒステロイドと甲状腺ホルモンレセプターの大家族Ｊ　 Ｓ　ｃｉｅｎｃｅ９８８）参照。それらの機能が定義されると、対応するホルモ ンと複合したレセプターは、上のモデルにおいてエクジソンレセプターで提案さ れたように、元来の標的遺伝子の転写を調節する。

ンヨウジョウバエの黒色腹腔部（ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）成虫のメスからの エフジステロイドレセプターは、Ｈｎａｄｌｅｒらの、Ｍｏｌ、Ｃｅ１ｌ　Ｅｎ ｄｏ、６３．４０３−９（１９８９）に記載されている。アオバエＣａ１ｌｉｐ ｈｏｒａ　ｖｉｃｉｎａのエフジステロイドレセプターはＬ　ｅｈｍａｎｎらの 、Ｅｕｒ、Ｊ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、１８１，５７７−８２（１９８９）により特性 づけられている。Ｖｉｔｅｘ　５ｔｒｉｃｋｅｒｉ（東アフリカの草）からの２ ０−ヒドロキシエクジソンの単離は、日本特許１，１３５．７９４に記載がある 。ショウジヨウバエ唾液腺の培養基のエクジソン含量はソ連特許１，１３０，６ ０５に記載がある。ファラダナ（ｆａｌａｄａｎａ）植物の種子から抽出したム リステロンとその生物学的殺虫剤はアメリカ特許３，８２８．０８２に記載があ る。エクジソンの合成は、アメリカ特許３．３５４．１５４に記載がある。

エフジステロイドの同族体は、昆虫の生育を阻害するため、植物により生産され ることもある。植物から生成するエフジステロイド同族体のひとつはメリストン へである。ムリステロンもしくはムリステロンＡ（図７］化合物ＩＶ）の分子量 は４９６，６４０ダルトン、分子式はＣｔ　ｔ　Ｈ４４０ｇ、そしてＣＨＣＤ名 は２．３．５゜１１．１４．２０．２１−へキサヒドロキシ−７−二レステンー ６−オン（Ｃｏｎｏｎｉｃａ、Ｌ、ら、Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　１４． ５２９．１９７５）である。本品はサツマイモ属の力ロニクチンの成分で、高い 昆虫の脱皮活性を示し、幼虫期の昆虫の生育を阻害することにより植物を保護す ると考えられる（Ｔｒｅｍａｔｅｒｒａら、Ｂｏｌｌｅｔｔｉｎ。

Ｚｏｏｌ、　Ａｇｒ、　Ｂａｃｈｉｃ、１旦、８７−９３（１９８６）参照）。

ムリステロンＡはダニの唾液腺の崩壊を誘発すると云ったような、昆虫に対して のエフジステロイド活性をもつことが判明している（　Ｌ　１ｎｄｓａｙら、Ｊ 、Ｉｎ５ｅｔ　Ｐｈｙｓｉｏｌ、３４，３５１−３６０（１９８８参照）。ムリ ステロンＡ−レセプター複合物は、他のエフジステロイド−レセプター複合物は ど、高い塩緩衝液中での解離に敏感でな（、この親和性は、クロマトグラフィー 中でエフジステロイドレセプターを追うために、放射能ラベルしたムリステロン Ａの使用を可能にした（　Ｌ　ａｎｄｏｎら、Ｊ、Ｂｉ。

１、Ｃｈｅｗ、２６３．４６９３−４６９７（１９８８参照）。

多くの医学的及び商業的に重要な蛋白が、遺伝子操作バクテリアから使用可能形 態で生産され得る。しかし多くの発現蛋白はバクテリア中で正しく処理されず、 好ましくは遺伝工学処理した有核生物細胞により生産される。典型的には、酵母 細胞又は哺乳動物組織−培養細胞が用いられる。酵母細胞中の異種蛋白の蛋白処 理はまた屡々不適当と認められるので、哺乳動物培養細胞が蛋白生産の主流とな ってきた。異種蛋白の大量生成がこれらの細胞を不健康にし所望の蛋白の収量に 悪影響を及ぼすことが通例である。この問題は部分的に、誘導可能の発現系を用 いることで回避しつる。そのような系では細胞は、異種蛋白を発現せぬよう処理 され、従って誘発剤が生育培地に添加される迄は不健康ではない。このようにし て大量の健康な細胞が生産され、次いで大量の異種蛋白の生産を誘発する。残念 乍ら、現在入手可能の系では、金属イオンや高温といったような誘発剤自体は細 胞に悪影響を与えるので、細胞の生産する所望の異種蛋白の収率をこれもまた低 下させる。従って、組換え蛋白の効果的生産のための無害な誘発因子の開発の必 要性がある。そのような無害な因子はまた特定の蛋白の生成能力の欠除した患者 であるヒトの治療にも価値がある可能性がある。

培養細胞中の蛋白生産のためのこれらのものと類似の方法を用いることにより、 所望の蛋白の合成を誘発するためのそのような無害の因子は、患者が生成する蛋 白の量とタイミングの両方をコントロールするのに使用できる。従って哺乳類の 細胞培養物及び哺乳動物それ自体において誘発可能な発現系が必要である。

哺乳類又はその他のを椎動物のステロイドレセプターのスーパーファミリーと結 合するホルモンは、そのような無害因子の候補でもなければそのような因子に必 要な性質を満足させるものでもない。何となれば、哺乳類の細胞は、対応するホ ルモンの存在下で多くの標的遺伝子の発現を変えて宿主細胞に悪影響を与えるよ うなこれらのレセプター乃至は高度にホモローガスな蛋白を含んでいるからであ る。以上の及びその他の理由のため、別のステロイドレセプタ・−系の開発は研 究の究極目的であった。残念ながら、莫大な財源投資にも拘わらず、努力は不成 功に終わった。非哺乳類のステロイドレセプターについての構造、機能及び分子 生物学の情報の欠除が、そのような物質の生産の可能性を著しく妨げてきた。近 年、Ｄａｖｉｄ　Ｈｏｇｎｅｓｓの研究室で以前に同定（Ｗ、Ｓ　ｅｅｇｒａｖ ｅｓ、論文、スタッフォード大学［１９８８］）されたステロイドホルモンレセ プタースーパーファミリーのひとつのＤＨＲ２３αポリペプチドの部分配列をも つンヨウジョバエのＤＨＲ２３αＤＮＡの単離と特性化は、ＤＨＲ２３αをコー ド化するＤＮＡ配列の単離を可能とした。この単離したＤＮＡ配列は、ＤＨＲ２ ３αエクジステロイドレセブターをコード化するＤＮＡを包含する発現系の構築 化を可能にした。

要約すれば、昆虫ステロイドホルモンとそのレセプター（たとえばエフジステロ イド）は、哺乳類の細胞培養及び哺乳動物自体に用いる無害なステロイドレセプ ター系の有用な原料である。しかし哺乳類中でエフジステロイドレセプターの活 性を誘発する機能を示すエフジステロイドは無い。したがって昆虫ホルモン−レ セプター系にもとづく系を開発するためには、哺乳類細胞中のエフジステロイド レセプターを誘発し、そのエフジステロイドレセプターの制御下に置かれたこれ らの遺伝子を発現するエフジステロイドホルモン又はホルモン類似体が必要で本 発明者は、ショウジヨウバエのステロイドレセプター同族体のＤＩＲ２３αは、 ムリステロンＡを含む特定のエフジステロイド群で誘導されたときに、培養哺乳 類細胞中でエフジステロイド依存性転写因子として機能することを示すものであ る。ムリステロンＡや２５−水酸基不含の関連エフジステロイドは、ＤＨＲ２３ αの転写調節下にＤＮＡ配列の発現を哺乳類細胞中で誘発するであろう。ＤＨＲ ２３α誘発活性は、テストされた哺乳類ステロイドホルモンのいかなるものに依 っても誘発されなかった。ウィルス、哺乳類及びバクテリアの蛋白のＤＮＡ結合 及びトランス活性化活性は、ＤＨＲ２３αリガンド結合領域に融合されるとエフ ジステロイド依存性となった。この系は、哺乳類細胞での内因性及び異種の遺伝 子の発現を選択的に調節するのに有用である。

図面の説明 図１．（Ａ）ＤＨＲ２３αｃＤＮＡクローン（配列番号コ）のヌクレオチドと誘 導アミノ酸配列。左右の数字は夫々ヌクレオチドとアミノ酸残基を示す。推定Ｄ ＮＡ結合領域に対応する保存アミノ酸には下線をつけである。（Ｂ）ショウジヨ ウバエのＤＨＲ２３α蛋白と、ヒト甲状腺ホルモンレセプター（ｈＴＲβ）、ヒ トビタミンＤ３レセプター（ｈＶＤＲ）及びヒトレチノイン酸レセプター（ｈＲ ＡＲα）との比較図。アミノ酸残渣を、囲みの上に数字で示す。ＤＮＡと表示し たＤＩＲ２３αの領域を、他のレセプターのＤＮＡ結合領域と比較し、である。

リガンドと表示したＤＨＲ２３αの領域は、他のレセプターのリガンド結合領域 への最高のホモロ−ガスを含む。これらの領域での百分率は枠内の数字で表わす 。ＱＬＱＰと表示した領域は、アミノ酸、グルタミン（Ｑ）、ロイシン（Ｉ、） 及びプロリン（Ｐ）に富んでいる。

図２．特定のエフジステロイドは、哺乳類細胞中のＤＨＲ２３αレセプターのア ゴニストである。ヒト２９３細胞を、２．５μｇの発現プラスミドｐＲ８Ｖ、Ｄ ＨＲ２３α又は親発現プラスミドｐＲ３Ｖ（コントロール）と０．５Ｍｇｓのリ ポータ−プラスミドｌ）ＥＣ４Ｍ−７？Ｃ０（ＥＣＲＥ）又はｌ）０４Ｍ−７７ ＣＯ（ＧＲＥ）と共トランスフェクトする。ｌ・ランスフエクション効率のコン トロールのために、０．５ＭｇｓのコントロールプラスミドｐＲ５Ｖ、ｈＧＨを トランスフェクション混合物中へ導入する。トランスフェクション後に細胞をα −エクジソン（ａｌｐｈａ）、２Ｏ−ＯＨエクジソン（２０−ＯＨ）、ポリボジ ンＢ（ｐｐＢ）、ポナステロンＡ　（ｐａｎ　Ａ　）又はムリステロンＡ（ｍｕ ｒＡ）と共に、又はなしで（−）処理する。ＣＡＴ抽出物をトランスフェクショ ン後に４８時間培養し、モしてテストする。数値は、ｈＧＴ（の発現に標準化し 、そして独立した３つの実験の平均値で示す。「誘発倍数」とは、加えるべきリ ガンドの不存在下に培養した細胞からの抽出物中の該リポータ−遺伝子の発現で 、ホルモンと共に培養した細胞中の該リポータ−遺伝子の発現レベルを割ったも のである。

図３．哺乳類ホルモンのＤＨＲ２３α活性に対する効果。細胞をＤＨＲ２３α発 現ベクターとＥｃ、Ｍ、、Ｃｏリポータ−遺伝子でトランスフェクトし、そして 以下のホルモン（１μＭ）と共に、又はなしで（−）処理する。即ちムリステロ ンＡ（曹ｕｒＡ）、デキサメサゾン（Ｄ　ｅｘ）、１７β−エストラジオール（ Ｒ２）、アルドステロン（Ａｌｄｏ）、コルチコステロン（Ｃａｒｔ）、ヒドロ キシコルチコステロン（ＯＨ−Ｃａｒｔ）、甲状腺ホルモン（Ｔ３）、プロメゲ ストン（Ｐ　ｒｏｍｅｇ）又は１，２５−ジヒドロキシ・ビタミンＤｓ（ＶＤｓ ）。リポータ−遺伝子活性は、図２に述べたと同様に測定。

図４．レセプター蛋白の模式図と発現。（Ａ）レセプター構築は、元のＮ−末端 トランス活性化、ＤＮＡ結合及びリガンド結合領域を表わす三部分の命名に従っ て示す。Ｇ及びＥｃはそれぞれグルココルチコイドレセプター及びＤＨＲ２３α をあられす。Ｅは、ＤＮＡ結合特異性をニストロケンレセプターのそれに変える ２つのアミノ酸置換（Ｇ４５８Ｅ、５４５９Ｇ）を持ったラットのグルココルチ コイドレセプターＤＮＡ結合領域の誘導体を示す。Ｘ（枠内の）は、Ｅ　５ｃｈ ｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ　ＬｅｘＡ蛋白のＤＮＡ結合領域（アミノ酸１〜８７） を示す。■（影をつけた枠内の）は、７ミ／Ｍ１５３〜４０６がＨ８Ｖ　ＶＰ１ ６蛋白（アミノ酸４１１〜４９０）の転写活性領域で置換されたＧＲＮ−末端領 域の誘導体をあられす。

ＧＧＥｃは、ＧＧＧのリガンド結合領域（アミノ酸５２８〜７９５）をＤＨＲ２ ３αのリガンド結合領域（アミノ酸３２９〜８７８）で置換され構築されたもの である。同様にして、ＧＸＥｃの構築のためには、ＧＸＧのリガンド結合領域を ＤＨＲ２３αリガンド結合領域で置換した。（Ｂ）トランスフェクトした細胞で のレセプター蛋白の蓄積。すべての細胞抽出物は、次の融合蛋白をコードするレ セプター発現プラスミドでトランスフェクトして４８時間後に作った。すなわち レーン１はＥｃＥｃＥｃ；Ｌ／−ン２はＧＧＧ：Ｌ／−ン３はＧＧＥｃルーン４ はＶＧＥＣ：Ｌ／−ン５１；！Ｅ″Ｅ”Ｇ；レーン６はＥ−Ｅ”Ｅｃ：レ−ン７ １ｔＧＸＧ；Ｌｚ−ン８はＥＸＥｃ；及びレーン９はＸＶＥｃ、図中の斑点図形 は、ラットのグルココルチコイド・レセプターのＮ−末端領域のエピトープを認 識するモノクローナル抗体ＢμｇＲ２と反応させ、次いでセイヨウワサビのパー オキシダーゼとがツブリングした、マウス抗体に対するヒツジの抗血清と反応さ せたものである。分子マーカーの位置が示されている。

図５．レセプター蛋白で誘発された転写体のＲＮａｓｅ保護分析。全ＲＮＡは、 ＤＨＲ２３α（ＥｃＥｃＥｃ）、ＧＧＧ又はＧＧＥｃの何れかとリポータ−遺伝 子６４Ｍ−７７Ｇｏをコードしている発現プラスミドでトランスフェクトして４ ８時間後に細胞から作成した。Ｇ４Ｍ、、Ｃｏの３７７塩基保護バンドと、内部 コントロール遺伝子（ＣＭＶエンハンサ−／プロモーター構築から発現）の２９ ４塩基保護バンドの位置は、夫々黒色及び白色の矢で示しである。

図６．エストロゲンレセプター（ＥＲＥｓ）のキメラレセプターによる誘導。細 胞を、ＭＴＶプＯモー９−と融合した４ＥＲＥｓを含むＥ　４　Ｍ　−ｔ　ｔ　 ＣＯ及びＤＨＲ２３α（ＥｃＥｃＥｃ）、Ｇ″Ｅ″Ｇ又はＧ″Ｅ″Ｅｃをコード する発現プラスミドでトランスフェクトした。細胞は、ムリステロンＡ（Ｍ）若 （はデキサメサゾン（Ｄ）と共に、又はそれなしで（−）４８時間培養したもの である。

図７．エクジステロイド類の化学構造。（１）エフジステロイドのナンバリング 法を示し、Ｒ，及びＲ２は電気的陰性基置換位置を表わす；（ＩＩ）エクジソン ；（ＩＩ　Ｉ）２０−ＯＨｚクシソン（β−エクジソン）；（ＩＶ）ボナステロ ンＡ：（ｖ）ムリステロンＡ；（Ｖｌ）５−デヒドロキシムリステロンＡ：そし て（ＶＩＩ）１１−デヒドロキシムリステロンＡ０ 好ましい実施態様の説明 ステロイドレセプターは、その同族体ステロイドリガンドの結合によって活性が 強固に調節された転写因子という大きな一群のうちのメンバーである。これらの リガンド依存転写因子は、哺乳類細胞の異種遺伝子の調節発現を得るために利用 できる。しかし、トランスジェニック動物におけるこれら系の有用性は内因性ス テロイドとそのレセプターという背景により限定される。本発明により、昆虫エ フジステロイドの類似体（ムリステロンＡ）は昆虫ステロイドレセプターＤＨＲ ２３αとそのＤＮＡ結合配列を用いての哺乳類における遺伝子発現を誘発するこ とが示される。

本発明において、トランスジェニック動物や組織培養における哺乳類の細胞中で 異種遺伝子を特に調節する系を発展させることを本発明者は希望した。そのよう な系は、異種遺伝子の生産物の合成を調節するための強力な方法を提供する。

リガンド依存転写因子として機能する哺乳類ステロ・イドホルモンレセプターの 能力を利用する系は、哺乳類の細胞における異種遺伝子の発現の調節に有用であ ることが証明されている（Ｄ、Ｉ　、Ｉ　５ｒａｅｌ　及びＲ，Ｊ、　Ｋａｕｆ ｍａｎ、Ｎｕｃ、　Ａｃ１ｄｓＲｅｓ、ｌヱ、４５８９［１９８９］）。しかし 培養細胞又はトランスジェニック動物におけるこれらの系の応用は、異種ステロ イドレセプターやそのリガンドという背景により限定をうける。本発明において 本発明者は、ショウジヨウバエのＤＨＲ２３α蛋白（１９８８年にスタッフォー ド大学のＷ、Ｓ　ｅｅｇｒａｖｅｓにより同定［Ｗ、Ｓ　ｅｅｇｒａｖｅｓ、論 文、スタッフす−ド大学（１９８８）］されたステロイドホルモンレセプターの スーパーファミリーのうちのひとつ）は、たとえばＤＨＲ２３αのような特定の エフジステロイドで誘発されると哺乳類細胞中でリガンド依存転写因子として機 能するという事を示すものである。ＤＨＲ２３αの活性は、特定のエフジステロ イドの投与で誘発されるが、テストした哺乳類ホルモンの何れによっても誘発さ れない。新しいターゲット遺伝子特異性は、異種ＤＮＡ結合領域に融合したＤＨ Ｒ２３αリガンド結合領域を含むキメラレセプターを用いて得られた。

最後に、これらのキメラ蛋白の活性は、活性なウィルス・トランスアクチベーシ ョン領域を含ませることによって増大しつる。

部分的ＤＩＲ２３配列にもとづくオリゴヌクレオチド・プローブ（Ｗ、Ｓ　ｅａ ｇｒａｙｅｓ、論文、スタッフォード大学：１９８８］）を、ショウジヨウバエ の初期のサナギの幼虫から得たｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングするのに 用いた。ＤＨＲ２３αクローンの推定アミノ酸配列を図ＩＡに示す。ＤＨＲ２３ αとほかのステロイドレセプタースーパーファミリーに属するものとの間の最高 のホモロジー領域は、ＤＮＡ結合領域に相当するノスティンに富む領域（残基２ ６４−３２９）に見出される（図ＩＢ）。推定上のリガンド結合領域は、レチノ イン酸と甲状腺ホルモンレセプターの一群とビタミンＤレセプターとの間で限ら れたホモロジーを共有する。Ｎ−末端領域（残基１−２６３）は、いかなるステ ロイドレセプターのスーパーファミリーのものとも顕著なホモロジーを共有しな い。本発明者はまた分別スプライシングでおこると考えられるこの蛋白のもうひ とつのフオーム（ＤＩＲ２３β）を同定した。ＤＨＲ２３βはＤＮＡやリガンド 結合領域においてＤＨＲ２３αと同一であるが、２３４コのアミノ酸の無関係な Ｎ−末端領域を有している。

ＤＩＲ２３αは、２Ｏ−ＯＨエクジソンで処理したショウジヨウバエの組織培養 細胞内のエクジソン応答因子（ＥｃＲＥｓ）を含む遺伝子の転写を調節するとの 報告がある（Ｍ、　Ｋｏｅｌｌｅ、　１９８９年１０月２日のセミナーで発表、 ＧｅｎｅｎｔｅｃｈＩｎｃ、、サンフランシスコ、カリフォルニア）。本発明者 はＤＨＲ２３αが、ネズミの哺乳類腫瘍ウィルス（ＭＴＶ）プロモーターとクロ ラムフェニコール・アセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）遺伝子と結合したＥ ｃＲＥｓを含むリポータ−遺伝子の転写を高めるべ（エフジステロイドで処理し た哺乳類細胞中で機能するか否かを決定した。ヒトの２９３細胞は、ＭＴＶプロ モーター・ＣＡＴ構築物と結合したショウジヨウバエＨＳＰ２７プロモーターか らのエクジソン応答要素（ＥｃＲＥ）の４つのコピーを含むリポータ−遺伝子Ｅ ｃ４Ｍ−ｔｔｃｏ及びＤＨＲ２３αをコードするＲ３Ｖに基づく発現ベクターで 共トランスフェクトされた（Ｇ、Ｒｉｄｄｉｈｏｕｇｈ及びＨ，Ｒ，Ｂ、Ｐｅｌ ｈａｍ、ＥＭＢＯＪ、６　３７２９［１９８７］）。ＣＡＴ活性は、エフジステ ロイドα若くは２Ｏ−ＯＨエクジソン、ポリポジンＢ１ボナステロンＡ又はムリ ステロンＡと共に（又はなしで）培養した細胞からの抽出物中で測定された。α −エクジソンや２Ｏ−ＯＨエクジソンそしてボリボジンＢの何れも哺乳類細胞中 でＤＨＲ２３αのアゴニストとして作用しなかった。逆に、リポータ−遺伝子の 発現は、ムリステロンＡで処理した細胞内では顕著に、そしてポナステロンＡで 処理したときはそれよりも少ない程度で増大した（図２）。この誘発はリポータ −遺伝子中のＥｃＲＥの存在に依存する。何故ならばＤＨＲ２３αは、グルココ ルチコイドレセプター側（ＧＲＥ、図２）か又はエストロゲンレセプター側（Ｅ 　ＲＥ、図６）の結合を含むリポータ−遺伝子の発現を調節しないからである。

すなわち哺乳類の細胞中ではＤＨＲ２３αは、エフジステロイド依存的に作用し て、リポータ−遺伝子を含むＥｃＲＥからの発現を選択的に亢進させる。

ショウジヨウバエ細胞系でのアゴニストである２Ｏ−ＯＨエクジソンやポリポジ ンＢが何故に哺乳類細胞中でＤＨＲ２３αを活性化するかは明らかでない。輸送 の失敗、不活性化及び非特異的結合が哺乳類細胞内の活性の欠除の理由として挙 げ得る。しかし特定の活性とレセプターに対するリガンドの相対的効率は、その レセプターが異種系で発現した時は、ときどき異なることがわかっている。たと えばグルココルチコイド・リガンドのそのレセプターに対する活性は酵母と哺乳 類細胞中で著しく相異することが知られている。驚（べきことには、エクジソン の特定の誘導体のみがアゴニストとして作用し、それは２５−水酸基の欠除とい う関連態様を共有している。弱いアゴニストのポナステロンＡと２Ｏ−ＯＨエク ジソン（これは不活性）の間における唯一の構造上の相異点は、前者は２５の位 置に水酸基をもたないという点である。更に驚くべきそして予期しなかったこと は、強力なアゴニストのムリステロンは５と１１の位置の水酸基の付加という点 においてのみボナステロンＡと相異しているという事である。したがって、驚く べきことには、哺乳類細胞においてはＤＨＲ２３α−調節発現のエフジステロイ ド・インデューサーは２５位の水酸基を欠除しているのである。好ましい実施態 様において、エフジステロイドは５又は１１位に１コの水酸基をもっている。ま たは、ムリステロンの５及び／又は１１位に置換する電気的陰性基は、エフジス テロイド・レセプターの活性化をもたらすものと期待されよう。ムリステロンの ５及び１１位に置換できる電気的陰性基としてはヒドロキシ、ケトン、スルフヒ ドラル、ナイトレート、ナイトライド及びハロゲン（特にフッ素、臭素及び塩素 ）がある。ＤＨＲ２３α調節発現の最も活性なインデューサーはムリステロンＡ で、本島は５と１１の両位置に水酸基をもっている。ムリステロンＡのＣＨＣＤ 名は２．３，５．１１．１４．２０．２２−ヘプタヒドロキシ−７−クレスチン −６−オン：５−デヒドロキシムリステロンＡのそれは２．３．１１．１４．２ ０．２２−セブタヒドロキシー７−コレステン−６−オン、そして１１−デヒド ロキシムリステロンへのそれは２，３．５．１４．２０．２２−セブタヒドロキ シー７−コレステン一〇−オンである。

本発明においてエフジステロイドレセプターとは、ムリステロンＡ又は５−若く は１１−位に電気的陰性基置換をもつムリステロンＡ誘導体に対して生理的に顕 著な結合親和力をもつ昆虫ステロイド・レセプターとして定義されるものである 。そのような生理的に顕著なレセプターとしてはエクンソンレセブターやＤＨＲ ２３Ｘがある。生理的に顕著な結合親和力とは、１０−６モル以下の濃度で有効 に結合することである。本発明においてエフジステロイドとは、エフジステロイ ド・レセプターに対して生理的活性親和力をもち２５−ＯＨを欠除するステロイ ドとして定義される。

哺乳類ステロイドホルモンがＤＨＲ２３αのアゴニストとして作用するか否かを 決定するため、本発明者は活性な哺乳類ステロイド・レセプターとして公知のホ ルモンの代表的なものについてテストした。これらホルモンの何れもがＤＨＲ２ ３αのアゴニストとして作用しなかった（図３）。この結果は、ＤＨＲ２３活性 はエフジステロイドにより哺乳類細胞中で選択的に調節されることを示唆してい る。したがって、ＤＨＲ２３αのコントロール下の遺伝子を含む哺乳類細胞はム リステロンＡにより誘発され、テストされた上記の哺乳類ステロイドホルモンで は誘発されない。

哺乳類、ウィルス及びバクテリアのＤＮＡ結合又はトランスアクチベーション領 域のエフジステロイド調節 ステロイドホルモンレセプターの著しい特徴は、異種蛋白の領域と組合せた時に 個々の領域が機能できる程度にある。レセプターのＤＮＡ結合特異性は、そのＤ ＮＡ結合領域を他のステロイドレセプターのそれら（Ｓ、　Ｇｒｅｅｎ及びＰ、 Ｃｈａｍｂｏｎ、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、Ｕ、Ｓ、Ａ、３ ２５，７５［１９８７コ）又はバクテリアからのもの（Ｐ、Ｊ、　Ｇｏｄｏｗｓ ｋｉ、Ｄ、Ｐｉｃａｒｄ　及びに、　ＲｏＹａｍａｍｏｔｏ。

結合蛋白で置換することにより変更できる。幾つかの例においては、異種蛋白の 活性は、もし該蛋白がステロイドレセプターリガンド結合領域に融合されるとホ ルモン調節的となる。たとえば、Ｅ　Ｉ　Ａ、　ｃ−ａ＋ｙｃ又はｃ−ｆｏｓの トランスアクチベーンヨン又は形質転換活性は、ステロイドレセプターリガンド 結合領域の融合によりホルモンの管理下におかれ得る（Ｍ、Ｅｉｌｅｒｓ、Ｄ、 Ｐｉｃａｒｄ、に、　Ｒ，Ｙａｍａｍ。

ｕｐｅｒｔｉ−Ｆｕｒｇａ、Ｇ、Ｂｅｒｇｅｒｓ、Ｄ、Ｐｉｃａｒｄ　及びＭ、 Ｂｕｓｓｌｉｎｇｅｒ、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ。Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、Ｌｌ、Ｓ 、Ａ、８８．５１１４［１９９１］）。

本発明者は、ＤＨＲ２３αのリガンド結合領域が、次の理由によって哺乳類グル ココルチコイド・レセプターのＤＮＡ結合及びトランスアクチベーション領域を 調節するのに使えるか否かを決めることとした。まず、ＤＨＲ２３αと逆に、Ｇ Ｒの高親和性ＤＮＡ結合部位を同定しくＭ、Ｂｅａｔｏ、　Ｃｅ１１．　５旦、 ３３５［１９８９］）そしてこれらの部位を含むリポータ−遺伝子を極めて強力 に調節する。すなわち我々のアッセイの感度を上昇させる。第二に、これらのキ メラレセプターが、エフジステロイドに応答する哺乳類細胞の異種遺伝子を選択 的に調節するのに用いる。本発明者は、その中でＧＲのリガンド結合領域をコー ド化する配列がＤＨＲ２３αのそれ（図４Ａ）と置換しているキメラ遺伝子、Ｇ ＧＥｃ、を構築した。ウェスタンプロット分析は、ＧＧＥｃはトランスフェクト された細胞中で発現された（但し完全なＧＲ（図４Ｂ）よりは可成り低いレベル ではあるが）ことを示す。予期したようにＤＨＲ２３αは、高い親和性ＧＲＥ（ 表１）の４つのコピーを含むリポータ−遺伝子であるＧ４Ｍ−７ｔｃｏの発現を 誘発できながった。しかし、ＧＲＥ含有リポータ−遺伝子の発現は、ムリステロ ン処理した細胞中のＧＧＥｃによって７００倍以上も誘発された。キメラレセプ ターのアゴニストとしてのエフジステロイドの相対的効率はＤｉ−ＩＲ２３αの それと同等であり；　α−エクジソン、２Ｏ−ＯＨエクンソン又はポリポジンＢ はアゴニストとして作用せず、一方ボナステロンＡとムリステロンＡはそれぞれ 弱い及び強いアゴニストとして作用した。

ＣＡＴアッセイの結果は確認され、そして調節されたプロモーターで開始された 転写物の直接分析によって拡げられた。トランスフェクトされた細胞がら単離さ れたＲＮＡは、ＣＭＡエンハンサ−及びプロモーターから発現された共トランス フェクトされたコントロール遺伝子とレポータープラスミドを含むＧＲＥと補足 し合うプローブを用いるＲＮＡａｓｅマツピング実験によってアッセイされた。

図５はＧＧＥｃがホルモン依存性に作用してＧＲＥ−ＭＴＶプロモーター構築が らの発現を刺戟することを示している。

次にＤＩＲ２３融合蛋白が、エストロゲンに正常に応答する遺伝子を調節できる か否かを決めた。ＧＲのＤＮＡ結合特異性をＥＲのそれに変換するとされている ラットのグルココルチコイド・レセプター（Ｇ４５８Ｅ、５４５９Ｇ）の第一の フィンガー中へ２つのアミノ酸変更を合一するＧＧＥｃ誘導体を構築した（Ｋ、 　Ｕｓｅｓｏｎｏ及びＲ，Ｅｖａｎｓ、Ｃｅ１１　５ヱ、１１３９［１９８９コ ；Ｍ、Ｄａｎｉｅｌｓｅｎ、　Ｌ。

Ｈｉｎｃｋ　及びＧ、Ｒｉｎｇｏｌｄ、Ｃｅ１１　５ヱ、１１３１［１９８９１ Ｘ図４Ａ）。この融合蛋白Ｇ″Ｅ″Ｅｃは、ムリステロン依存性にレポーター遺 伝子Ｅ　４　Ｍ　−７□Ｃ○を含むＥＲＥを調節する（図６）。予期したように 、Ｇ″Ｅ″Ｅｃは、ＥＲＥｓ欠損レポーター遺伝子の発現を誘発しなかった。

哺乳類蛋白のＤＮＡ結合部位に融合したＤＨＲ２３αリガンド結合領域を含むキ メラ蛋白は、形質転換した動物の形質転換異種遺伝子が又は未変性のもののｉ現 を調節するのに有用であることが証明されると期待される。そのような融合構築 は、形質転換した哺乳類又は哺乳類細胞に導入した異質遺伝子の発現を調節する のに有用であると期待される。次いでＤＩＲ２３αリガンド結合領域が、哺乳類 細胞に正常に発現されてないＤＮＡ結合領域の活性を調節するのに用い得るが否 かを決定した。ＧＧＥｃ融合のＧＲＤＮＡ結合領域のための配列コーディングを 、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＬｅｘＡリプレッサーのＤＮＡ結合領域 で置換することによってキメラ遺伝子ＧＬ、ｘＥｃを構築した（Ｊ、　Ｗ、Ｌｊ 、ｔｔｌｅ　及びＳ、　Ａ、、　トｌ１１１．Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ 、Ｓｃｉ、　Ｕ、Ｓ、Ａ、８２．２３０１［１９８５］Ｘ図４）。ＣＭＶプロモ ーターの一３３位（Ｄ２６ｂｐ　１ｅｘオペレ−９−０）４）（Ｄコピー４含む レポーター遺伝子、Ｘ４Ｃ−ｓｏｃｏを構築する（Ｒ，Ｂｒｅｎｔ　及びＭ、Ｐ 　ｔａｓｈｎｅ、Ｎａｔｕｒｅ　３１２．６１２［１９８４コ）。ＧＬｘＥｃは 、ｌｅｘ　オペレーターのないレポーター遺伝子であるＱＣ−３ｓＣＯの発現に 効果がない（図６Ｂ）。しかし、Ｘ４ｃｍ３ｓｃｏの転写はＧＬｘＥｃにより強 力に誘発され、そしてこの誘発にまったくホルモン依存的であった（図６Ａ）。

対照として次のことを示した。すなわちＸ４Ｃ，、ＣＯは、ムリステロンで処理 され、そして１ｅｘＡ　ＤＮＡ−結合領域を欠くＤＨＲ２３αにより、又はグル ココルチコイド・レセプター・リガンド結合領域を含むＧＬｘＧにより（Ｐ、Ｊ 、　Ｇｏｄｏｖｓｋｉ、Ｄ、Ｐｉｃａｒｄ　及びに、　Ｒ，Ｙａｍａ＋ｎｏｔｏ 。

５ｃｉｅｎｃｅ　２４ユ、８１２［１９８８］）共トランスフェクトされた細胞 中で誘発されない。

最後に、ＤＨＲ２３α融合蛋白の活性は、活性なウィルス・トランスアクチベー ノヨン領域の融合によって更に高められるか否かを決定した。ＧＧＥｃ及びＧＬ ｘＥｃのＧＲＮ−末端活性領域の部分をヘルペスウィルスｖｐ１６酸性活性領域 で置換して、夫々ＶＧＥｃ及びＶＬｘＥｃを構築した（１．　５ａｄｏｖｓｋｉ 　ほか、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、３３５．５６３［１９８ ８］；Ｄ、Ｊ、Ｃｏｕｓｅｎｓ、Ｒ８Ｇｒｅａｖｅｓ、Ｃ，Ｒ，Ｃｏｄｉｎｇ、 及びＰ、Ｏ’Ｈａｒｅ、ＥＭＢＯＪ、８．２３３７［１９８９］（図４Ａ）。ト ランスフェクトされた細胞でこれらの蛋白は、ＶＰ１６活性領域を欠く誘導体と 類似のレベルにまで蓄積された（図４Ｂ）。ＶＧＥｃ及びＶＬｘＥＣの何れもが エフジステロイド依存的に作用して適当なレポーター遺伝子の活性を誘発した（ 表１及び２）。しかしｖＧＥｃとＶＬｘＥｃの活性は、ＧＧＥｃ及びＧＬｘＥｃ よりも５乃至１０倍大きかった（Ｍ、　Ａ、Ｌａｂｏｗ、Ｓ、Ｂ、　Ｂａ１ｎ、 Ｔ、５ｈｅｎｋ及びＡ、Ｊ、　Ｌｅｖｉｎｅ、Ｍｏ１．　ａｎｄ　Ｃｅ１１．　 Ｂｉｏｌ、皿、３３４３［１９９０コ）。

すなわちＤＨＲ２３αリガンド結合領域は、ウィルス、哺乳類及びバクテリアの ＤＮＡ−結合又はトランスアクチベーンヨン領域の活性を調節するのに使用でき る。

真核細胞内の内因性及び外因性遺伝子の調節された発現のための系の発展は、こ れら遺伝子生産物の機作を研究しそして病態動物モデルの開発するための重要な 方法を提供する。本発明の結果は、哺乳類細胞の遺伝子を調節するために非哺乳 類ステロイドホルモンレセプターを使用することの可能性を示した。この系には 幾つもの重要な特徴がある。ＤＨＲ２３αはＥｃＲＥｃ’を含有する遺伝子の転 写の有力かつ選択的レギュレーターとして作用し、ＤＩＲ２３αの活性はそのＤ ＮＡ結合又はトランスアクチベーション領域を異種蛋白のそれと置換することに より更に修飾される。重要なことに、ＤＨＲ２３α活性は、ふつうの哺乳類細胞 で発現しないところのエフジステロイドによって調節される。すべての哺乳類ス テロイドをしらべたわけではないが、それらの何れもがＤＨＲ２３αのアゴニス トとして作用する天然のネズミのステロイドが豊富ではなかった。すなわちＤＨ Ｒ２３α又はＤＨＲ２３α融合蛋白の転写調節活性は完全に外因性リガンドの投 与に依存することが認められる。

哺乳類細胞中の遺伝子発現を調節するＥ、　ｃｏｌｉ　ｌａｃ　レプレッサーを 使用する可能性は幾つもの論文に示されている。ｌａｃ　レプレッサー及びステ ロイドレセプターに基づ（系の何れもが転写を誘発し又は抑制することができる （Ｄ、　Ｍ。

０ｍ１ｔｚ、Ｒ，Ｗ、　Ｍｏｒｅａｄｉｔｈ　及びＰ、Ｌｅｄｅｒ、ＰＮＡｓ　 ８８．６９８［１９９１］）。ステロイドレセプターにもとづく調節系のひとつ の興味ある特徴は、リガンド結合領域によりコントロールできるタイプの活性に おける顕著な柔軟性である。

ｌｅｘ　Ａ、ｃ−ｆｏｓ、ＧＡＬ４及びｃ　−ａｙｅのような構造的に異なった ＤＮＡ結合蛋白の活性は、ステロイド・レセプター・リガンド結合領域と融合さ れるとホルモン依存的となる（Ｐ、Ｊ、　Ｇｏｄｏｗｓｋｉ、Ｄ、Ｐｉｃａｒｄ 　及びに、　Ｒ，Ｙａｍａｍｏｔｏ、５ｃｉｅｎＤ、Ｐｉｃａｒｄ　Ｓ、Ｊ、５ ａｌｓｅｒ　及びに、　Ｒ，ＹａＩＩｌａｍｏｔｏ、　Ｃｅ１ｌ　５４，１０７ ３［１９８８］；Ｇ、Ｓｕｐｅｒｔｉ−Ｆｕｒｇａ、Ｇ、Ｂｅｒｇｅｒｓ、　Ｄ 、Ｐｉｃａｒｄ　及びＭ、Ｂｕｓｓｌｉｎｇｅｒ、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａ ｃａｄ、　Ｓｃｉ、　Ｕ、　Ｓ、　Ａ、　８８．５１１４［１９９１］）。

キメラ蛋白はトランスアクチベーション領域の付加又は削除によって更に修飾さ れる。すなわち、ＤＨＲ２３α融合遺伝子は、ｃｉｓ−作用の調節配列及びその 同族体ＤＮＡ結合領域が同定されている実質上すべての遺伝子の発現を調節すべ く構築できることが期待される。

本発明の方法において使用が予想される遺伝子はたとえば、哺乳類の中で治療必 要濃度よりも低値で存在するサイトカイン、ホルモン、構造蛋白、酵素及び核酸 である。サイトカインやホルモンの例としてはポリペプチド、たとえば生長ホル モン、インシュリン類似の生長因子、インターロイキン、ヒト生長ホルモン、Ｎ −メチオニル化されたヒト生長ホルモン、ウシ生長ホルモン、副甲状腺ホルモン 、チロキシン、インスリン、プロインスリン、レラキンン、ブロレラキシン、グ リコ蛋白ホルモン例えば濾胞刺戟ホルモン（ＦＳＨ）、甲状腺刺戟ホルモン（Ｔ ＳＨ）、副甲状腺刺戟ホルモン及び黄体形成ホルモン（Ｌ　Ｈ）、造血成長因子 、肝成長因子、センイ芽細胞成長因子、プロラクチン、胎盤性ラクトゲン、腫瘍 壊死因子（−α及び−β）、ミュラ一式阻害物質、マウスゴナドトロピン関連ペ プチド、グルカゴン、インヒビン、アクチビン、導管内皮成長因子、インテグリ ン、トロンボポイエチン、エリスロポイエチン、神経成長因子たとえばＮＧＦ− β、血小板成長因子、造血成長因子、組織因子蛋白、ミュラ一式阻害物質、マウ スゴナドトロピン関連ペプチド、トランスフォーミング成長因子（ＴＧＦ）たと えばＴＧＦ−α及びＴＧＦ−β、インスリン様成長因子−■及び−ＩＩ、潜在性 関連ペプチド、エリスロポイエチン、骨誘発因子、インターフェロンたとえばイ ンターフェロン−α、−β及び−γ、コロニー刺戟因子（Ｃ３Ｆｓ）たとえばＭ −ＣＳ　Ｆ、　ＧＭ−ＣＳＦ及びＧ−ＣＳ　Ｆ、インターロイキン（ＩＬｓ）た とえばＩ　Ｌ−１，Ｉ　Ｌ−２゜Ｉ　Ｌ−３，Ｉ　Ｌ−４，Ｉ　Ｌ−５，Ｉ　Ｌ −６，Ｉ　Ｌ−７，Ｉ　Ｌ−８及びその他のポリペプチド因子である。

酵素の例は次のようである。すなわち組織プラスミノーゲン活性酵素（ＴＰＡ） 、ウロキナーゼ、エラスターゼ、アデノシンデアミナーゼ、ボンベシン、因子Ｉ Ｘ。

因子Ｖｌｌｌ、トロンビン、エンケファリナーゼ、β−ラクタマーゼ、スーパー オキサイドジスムターゼ、逆転写酵素、ＲＮａ５ｅ、　Ｄ　Ｎａ５ｅ、そして次 のものに関与する酵素、すなわち解糖、クレブスサイクル、糖新生、尿素サイク ル、酸化的リン酸化、及び次のものの合成や分解、すなわちプリン、ピリミジン 、核酸重合体、コレステロール、蛋白、グリコゲン、脂肪酸、炭水化物、リン脂 質、糖蛋白又は脂質。

構造蛋白の例は次のようである。すなわち肺界面活性物質、アルブミン、抗体、 担体蛋白、糖蛋白ホルモンレセプター、ＣＤ−４、インスリン様成長因子が結合 する蛋白、カルシトニン、因子Ｖｌｌｌ、抗体、蛋白Ａ又はＤ１リウマチ因子、 ウィルス抗原、ＨＩＶ包膜蛋白ＧＰ・１２０がＧＰ・１４０、免疫グロブリン、 血清蛋白及び改善量存在するすべての蛋白。

核酸の例はセンス鎖及びアンチセンス鎖のＤＮＡやＲＮＡである。ＲＮＡとして は、リポソームＲＮＡ、メツセンジャーＲＮＡ、転移ＲＮＡ、手植ＲＮＡ及び酵 素機能をもつか又はそれに関与するＲＮＡのような、いかなるものであっても良 い。本発明の方法は、アンチセンス又はサプレッサー核酸として作用したり天然 に産する哺乳類核酸の活性を阻害したりする核酸の生成に応用できる。そのよう な核酸は、ウィルス性疾患、がん及び蛋白その他の代謝産物の過剰生産を処置す るために特に治療的有効性をもつ。

０ｍｎ１ｔｚほか（Ｄ、　Ｍ、　０ｍｎ１ｔｚ、Ｒ，Ｗ、　Ｍｏｒｅａｄｉｔｈ 　及びＰ、　Ｌｅｄｅｒ、　ＰＮＡｓ８８．６９８［１９９１］）は形質転換マ ウスの異種遺伝子の発現を調節するための二成分系を述べている。この系におい ては、酵母ＧＡＬ４蛋白を発現する「トランスアクチベーター」株は、ＵＡＳ配 列でコントロールされる転写的にサイレントなトランス遺伝子（ｔｒａｎｓｇｅ ｎｅ）を含む「標的」株と交雑される。この交雑の二遺伝子的子孫は、同一の組 織中の両方のトランス遺伝子を発現する。ＤＨＲ２３α又はＤＨＲ２３β遺伝子 融合を含む二遺伝子系は内因性及び外因性遺伝子の存在量、時間コース及び／又 は組織特異的発現を制御するための一般的方法を提供するであろう。たとえば、 ＥｃＲＥｓにより制御されたトランス遺伝子の組織特異的の及び発生的調節の発 現は、発現ＤＨＲ２３αを適当な組織特異性エンハンサ−で標的化して得られる ものと期待される。「標的」遺伝子をもっＥｃＲＥの発現は、そのアクチベータ ーをエフジステロイドで「スイッチ・オン」させることによって適当な回数だけ 誘発されるものと期待される。形質転換動物の遺伝子の組織と発育制御をなしう るこの系の開発は、「遺伝子ノックアウト」工学にもとづく戦略を相補する重要 なアプローチを提供する。

この方法のために適当な哺乳類細胞は、無処理の哺乳動物に含まれているものを 包含する。それは分化された及びされてない細胞の両方を包含する。哺乳類細胞 という用語は更に、哺乳類の組織から誘導された一次細胞培養及び樹立細胞系を も包含する。好ましい哺乳類細胞系の例は２９３細胞系及びＣＨＯ細胞系である 。

エフジステロイドの治療用組成物と投与エフジステロイドは、エフジステロイド の転写管理下にある遺伝子を含む形質転換哺乳類又は哺乳類細胞に投与できる。

たとえば哺乳類にポリペプチドを発現させる遺伝子療法は、これ迄に不十分な量 を生産した。そのようなポリペプチドを以下に述べる。

エフジステロイドの治療用処方物は、所望の純度のエフジステロイドのサブユニ ットを任意の生理的に許容される担体、稀釈剤又は安定剤（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ ’ｓ　Ｐｈａｒｍａｃｅｎｔｉｃａｌ　Ｓ　ｃｉｅｎｃｅｓ、既出）と混合し、 凍結乾燥ケーク又は水溶液として保存する。許容される担体、稀釈剤又は安定剤 は、使用濃度や用量で患者に無害であり、例えば次のようである。緩衝剤たとえ ばリン酸塩、クエン酸塩その他の有機酸；抗酸化剤たとえばアスコルビン酸：低 分子量（約１ｏ残基より少ない）ポリペプチド：蛋白たとえば血清アルブミン、 ゼラチン又は免疫グロブリン：親水性ポリマーたとえばポリビニルピロリドン： アミノ酸たとえばグリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニン又はリジン ：単糖類、三糖類及びその他の炭水化物たとえばグルコース、マンノース又はデ キストリン；キレート剤たとえばＥＤＴＡ。

糖アルコールたとえばマンニトール又はソルビトール：塩形成性の対イオンたと エバナトリウム、及び／又は非イオン性界面活性剤たとえばツイーン、プルロニ クス又はポリエチレングリコール（ＰＥＧ）。

インビボ投与に用いるエフジステロイドは無菌でなければならない。これは凍結 乾燥や再構成の前又はあとで、無菌濾過膜で濾過することによって容易に達成さ れる。エフジステロイドは通常は凍結乾燥形態又は溶液として保存される。治療 用のエフジステロイド組成物はふつう、無菌アクセス容器、たとえば皮下注射用 の針で貫通可能な栓のあるバイアルか静脈注射用の溶液容器中に入れられる。

エフジステロイドの投与ルートは公知の方法による。たとえば静脈内、腹腔内、 脳内、筋肉内、眼内、動脈内又は傷害部位内への注射若くは注入又は下記のよう な持続放出系による。エフジステロイドは注入又は全量一時注射によって連続的 に投与される。

持続放出剤の適当な例は、エフジステロイドを含有する固形の水と不親和性のポ リマーの半透過性マトリックスであり、該マトリックスは有形の材料たとえばフ ィルム又はマイクロカプセルの形状である。持続放出マトリックスの例は次のよ うである。すなわちポリエステル、ヒドロゲル［たとえばｌａｎｇｅｔほか、Ｊ 、Ｂｉミリレート］、ポリ（ビニルアルコール）、ポリラクチド（アメリカ特許 ３．７７３゜９１９及びＥＰ５８．４８１）、Ｌ−グルタミン酸とγ−エチルー し一グルタメートのコポリ７−　（Ｓ　１ｄＩＩｌａｎほか、Ｂｉｏｐｏｌｙ＋ ５ｅｒｓ、２２．５４７−５５６［１９８３］）。

非分解性のエチレン−ビニルアセテート（Ｌ　ａｎｇｅｒほか、既出）、分解性 の酪酸−グリコール酸コポリマーたとえばＬｕｐｒｏｎ　Ｄｅｐｏｔ（商標）（ 酪酸−グリコール酸コポリマーとりューブロリド・アセテートから成る注射可能 の微小球）及びポリ−Ｄ−（−）−３−ヒドロキシ酪酸（ＥＰ１３３，９８８） 。

持続放出剤の他の例は、埋め込み（ｅｎｔｒａｐｐｅｄ）タイプのエフジステロ イドである。エフジステロイドを含むリポソームは、それ自体公知の方法で製造 される。

４０３０−４０３４（１９８０）：ＥＰ５２．３２２：ＥＰ３６．６７６：ＥＰ ８８．０４６；ＥＰ１４３．９４９；ＥＰ１４２．６４１＋特願昭５８−１１８ ００８：アメリ力特許４．４８５．０４５並びに４．５４４．５４５：及びＥＰ １０２，３２４゜ふつうリポソームは小さい（約２００−８００人）単層タイプ で、その中の脂質含量は約３０モル％コレステロールより大でなく、選択された 比率が最適のエフジステロイド治療のために調節される。

治療に用いるエフジステロイドの有効量は、たとえば治療対称、投与方法、エフ ジステロイドで誘発されるポリペプチドの活性及び患者の体調といったものに依 存する。したがって治療を行う者にとっては、最適の治療効果を得るに必要なよ うに用量をきめ投与方法を変更することが必要であろう。典型的な一日用量は上 述の要因に応じて約１μｇ／ｋｇがら１００ｍｇ／ｋｇ又はそれ以上の範囲内で あろう。典型的には、用量が目的とする効果に達するまで医師はエフジステロイ ドを投与するであろう。この治療法の進め方は、誘発されたポリペプチドの活性 や存在を通常の試験法で容易にモニターされる。

所望のポリペプチド又は核酸をコード化したＤＮＡ配列の発現を促進するように 位置ぎめされたエツジステロイドＤＮＡ結合領域及び入手できるエフジステロイ ドレセプターが標的細胞集団内にあるときは、エフジステロイド組成物は形質転 換哺乳類又は形質転換哺乳類細胞培養物に投与される。ＤＨＲ２３αのようなエ フジステロイドレセプターは、エツジステロイドレセプターＤＮＡ結合部位を含 む遺伝子の転写を有力かつ選択的調節剤として作用する。ＤＨＲ２３αのような エフジステロイドの活性は、そのＤＮＡ結合又はトランスアクチベーション領域 を他の天然に存在する遺伝子で置換することにより更に修飾することが出来、そ れによってエフジステロイドは池の天然に存在する遺伝子やその生産する生成物 をコントロールすることを容易とする。しかしキメラ型のエフジステロイドレセ プターは尚も同様のリガンドを結合−し、それらは融合トランスアクチベーショ ン領域で特定化された異種ＤＮＡ結合領域で特定化した遺伝子の発現を誘発する 。

哺乳類細胞の形質転換は標準的方法を用いて達成される。形質転換哺乳類細胞に 適するベクターは、哺乳類細胞で発現しつるウィルス及び哺乳類ＤＮＡを包含す る。

以下に実施例を限定の目的でなく説明の目的のために記載する。

実施例Ｉ　ＤＨＲ２３αコード化ＤＮＡのクローニング部分的ＤＨＲ２３配列（ Ｗ、Ｓ　ｅｅｇｒａｖｅｓ、論文、スタッフォード大学［１９８８］）にもとづ くオリゴヌクレオチド・プローブを、ショウジヨウバエの初期のサナギの幼虫か ら得たｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングするために使用する。ＤＨＲ２３ αクローンの推定アミノ酸配列を図ＩＡに示す。ＤＨＲ２３αとステロイドレセ プタースーパーファミリーのうちの他のもの５間の相同性の最も高い領域は、Ｄ ＮＡ結合領域に対応するシスティンに富んだ領域（残基２６４−３２９）中に見 出される（図ＩＢ）。推定リガンド結合領域は、レチノイン酸及び甲状腺ホルモ ンレセプター並びにビタミンＤレセプターとの限定された相同性を共有する。

Ｎ−末端領域（残既１−２６３）は、どんなステロイドレセプターとも顕著な相 同性を共存しない。本発明者はさらに、示差スプライソングによって起ると思わ れるこの蛋白の第二の形態（ＤＩＲ２３β）を同定した。ＤＨＲ２３βは、ＤＮ Ａやリガンド結合領域においてＤＨＲ２３αと同一であるが、但し２３４コのア ミノ酸の無関係のＮ−末端領域をもっている。

図ＩＡはＤＨＲ２３αｃＤＮΔクローンのヌクレオチド及び誘導アミノ酸配列を 示す。左と右の数字はそれぞれヌクレオチド及びアミノ酸残基をあられす。上流 のイン−フレーム（ｉｎ−ｆｒａｍｅ）停止コドンはアンダーラインをつけてあ り、開始コドンとして選ばれる。イニシエーターのメチオニンは、翻訳開始のた めのショウジヨウバエ共通配列と一致する。推定ＤＮＡ結合領域に対応する保存 アミノ酸はアンダーラインをつけである。ＤＩＲ２３αクローン全体を単離する ために、ンヨウノヨウバエの三齢幼虫ライブラリーからの〜６０．０００ファー ジを、Ｓｅｅｇｒａｖｅｓ（スタッフォード大学論文、１９８８）の部分ＤＨＲ ２３ａ配列の１０９〜１５８及び１８２０〜１８６９ヌクレオチドに対応する２ つの５　Ｑ−ｍａｒオリゴヌクレオチドでスクリーニングした。８つの明瞭なり ローンが単離され、ＰＣＲ分析でさらに特徴づけられ、そして２つの最大の挿入 断片が決定された。配列決定の結果を図ＩＡに示す。

案施例２　＠乳類細胞におけるＤＨＲ２３ａポリペプチドの発現と活性本発明者 は、ネズミの哺乳類腫瘍ウィルス（ＭＴＶ）プロモーター及びクロラムフェニコ ール・アセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）遺伝子に結合したＥｃＲＥｓを含 むリポータ−遺伝子の転写を促進するエフジステロイドで処理した哺乳類細胞の 中で、ＤＨＲ２３αが機能できるか否かを決定した。ヒトの２９３の細胞を、Ｄ ＨＲ２３αをエンコードしたＲ３Ｖにもとづ（発現ベクター及びＭＴＶプロモー ターとＣＡＴの構築に結合したショウジヨウバエＨ３２７プロモーター（Ｇ。

Ｒｉｄｄｉｈｏｕｇｈ及びＨ，Ｒ，Ｂ、Ｐｅｌｈａｍ、ＥＭＢＯＪ、旦、３７２ ９［１９８７］）からのエクジソン応答要素（ＥｃＲＥ）の４つのコピーを含む リポータ−遺伝子Ｅｃ４Ｍ−７？Ｃ○とで共トランスフェクションした。エフジ ステロイドα又は２Ｏ−ＯＨエクジソンポリボジンＢ１ポナステロンＡ又はムリ ステロンＡと共に、又はなしで培養した細胞からの抽出物の中でＣＡＴ活性を測 定した。α−エクジソン、２０−ＯＨエクジソン及びボリボジンＢの何れもが、 哺乳類細胞中でＤＨＲ２３αのアゴニストとして作用しなかった。反対に、ムリ ステロンへで処理した細胞の中ではリポータ−遺伝子の発現は著しく増大し、な おポナステロンＡ処理の場合はその程度がすこし小さかった（図２）。この誘発 はリポータ−遺伝子中のＥｃＲＥの存在に依存する。何故ならばＤＨＲ２３αは 、グルココルチコイド・レセプター（ＧＲＥ、図２）か又はエストロゲンレセプ ター（ＥＲＥ、図６）との結合部位を含むリポータ−遺伝子の発現を調節しない からである。すなわち哺乳類細胞ではＤＨＲ２３αは、リポータ−遺伝子を含む ＥｃＲＥからの発現を選択的に促進するためにエフジステロイド依存的に作用す る。

特定のエクジステロイ′ドは哺乳類細胞内のＤＨＲ２３αレセプターのアゴニス トである。ヒトの２９３の細胞を、２．５μｇの発現プラスミドｐＲ３Ｖ、ＤＨ Ｒ２３α又は親発現プラスミドｐＲ８Ｖ（コントロール）及び０．５μｇｓのリ ポータ−プラスミドｐＥｃｎＭ−ｔｔｃｏ（ＥｃＲＥ）若くはＩ）０４Ｍ−７７ ＣＯ（ＧＲＥ）で共トランスフェクションする。トランスフェクション効率のコ ントロールとして、コントロールプラスミドｐＲ８Ｖ、ｈＧＨｏ、５μｇｓをト ランスフェクション混合物中に含める。ｌ・ランスフエクションの後に、細胞を α−エクジソン（ａｌｐｈａ）、２Ｏ−ＯＨエクジソン（２０−ＯＨ）、ボリポ ジンＢ　（ｐｐ　Ｂ　）、ポナステロンＡ（ｐｏｎＡ）又はムリステロインＡ（ ｍｕｒＡ）と共に、又はなしで（−）処理する。すべてのりガント補候は１μＭ １１度で添加する。ＣＡＴ抽出物をトランスフェクションのあと４８時間培養し 、アッセイをり、　Ｒ，Ｃａｖｅｎｅｒ、Ｎｕｃｌ、　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、１ ５．１３５３−１３６０１９８７）に記載のようにして行う。数値は、ｈＧＨの 発現に標準化し、３つの独立した実験の平均値を図２に示す。誘発倍数とは、添 加リガンドの不存在下に培養した細胞の抽出物中のリポータ−遺伝子の発現で分 けたホルモンで培養した細胞中の該リポータ−遺伝子の発現レベルを表わす。

ＤＨＲ２３αの活性に対する哺乳類ホルモンの影響を図３に示す。細胞をＤＩＲ ２３α発現ベクターとＥｃ４Ｍ、、Ｃｏリポータ−遺伝子でトランスフェクトし 、そして次のホルモン（１μＭ）と共に、又はなしで（−）処理する。

すなわちムリステロンＡ（ｍｕｒＡ）、デキサメサゾン（Ｄｅｘ）、１７β−エ ストラジオール（Ｅ２）、アルドステロン（Ａｌｄｏ）、コルチコステロン（Ｃ ａｒｔ）、ヒドロキシコルチコステロン（ＯＨ−Ｃｏｒｔ）、甲状腺ホルモン（ Ｔ３）、プロメゲストン（Ｐｒ。

ｍｅｇ）又は１，２５−ジヒドロキシビタミンＤｓ（ＶＤ３）。図２について上 述したようにしてリポータ−遺伝子活性を測定した。レチノイン酸はまたＤＨＲ ２３αのアゴニストとして作用しなかった。

キメラ遺伝子構築及び得られた発現レセプター蛋白のウェスタンプロットの図式 的表現を図４Ａ及びＩＢに示す。図４八でレセプター構築はそのｎ−末端トラン スアクチベーンヨンの起源ＤＮＡ結合及びリガンド結合領域を記載した三部分命 名法に従フて示しである。“Ｇ”及び“Ｅｃ”はそれぞれグルココルチコイドレ セプター及びＤＨＲ２３αをあられす。“Ｅ”は、ＤＮＡ結合特異性をエストロ ゲンレセプターのそれに変える（Ｋ、　Ｕｍｅｓｏｎｏ　及びＲ，Ｅｖａｎｓ、 Ｃｅ１ｌ　５７，１１３９　［１９８９］；Ｍ、　Ｄａｎｉｅｌｓｅｎ、　Ｌ、 　Ｈｉｎｃｋ　及びＧ、　Ｒｉｎｇｏｌｄ、Ｃｅ１１．５ユ、１１３１［１９８ ９］）２コのアミノ酸置換（Ｇ４５８Ｅ及び５４５９Ｇ）によるラット・グルコ コルチコイド・レセプターＤＮＡ結合領域の誘導体をあられす。“Ｘ”（枠内の ）はＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＬｅｘＡ蛋白のＤＮＡ結合領域（アミ ノ酸１〜８７）をあられす。“Ｖ”（影付き枠内）は、アミノ酸（１５３−４０ ６）がＨ５ＶＶＰ１６蛋白（アミノ酸４１１−４９０）の転写活性領域で置換さ れたＧＲＮ−末端領域の誘導体をあられす。ＧＧＥｃ構築は、ＧＧＧ（アミノ酸 ５２８−７９５）のりガント結合領域をＤＨＲ２３α（アミノ酸３２９−８７８ ）のリガンド結合領域で置換して構築した。同様に、ＧＸＥｃの構築のためには 、ＧＸＧのリガンド結合領域（Ｐ、Ｊ、　Ｇｏｄｏｗｓｋｉ、Ｄ、Ｐｉｃａｒｄ 　及びに、　Ｒ，Ｙａｎ＋ａｍｏｔｏ、５ｃｉｅｎｃｅ　２４１．８１２［１９ ８８］ではＮＬｘＣとなっている）をＤＨＲ２３ａリガンド結合領域で置換した 。

図４Ｂでは、トランスフェクトした細胞のレセプター蛋白の蓄積は、酵素結合抗 体で検出したウェスタンプロットで示しである。全細胞抽出物は、次の融合蛋白 をコード化したレセプター発現プラスミドでトランスフェクトして４８時間後に 作った。すなわちレーン１．ＥｃＥｃＥｃ；レーン２．ＧＧＧ；レーン３．ＧＧ Ｅｃ；レーン４．ＶＧＥｃ：レーン５．Ｇ″Ｅ″Ｇ；レーン６、Ｇ”Ｅ″Ｅｃ： レーン７．ＧＸＧ：レーン８．ＧＸＥｃ；レーン９．ＶＸＥｃ、　プロットは、 ラットのグルココルチコイド・レセプター（３０）のＮ−末端領域のエピドーム を認識するモノクローナル抗体ＢｕＧＲ２と反応させ、次いでセイヨウワサビ・ パーオキシダーゼとカップルしたマウス抗体に対するヒツジ抗血清と反応させる 。分子マーカーの位置が示しである。

レセプター蛋白で誘発した転写物のＲＮａｓｅ保護分析を図５に示す。全ＲＮＡ は、ＤＨＲ２３（Ｚ（ＥＣＥＣＥＣ）、ＧＧＧ又はＧＧＥｃ及びリポータ−遺伝 子Ｇ４Ｍ−７ｔＧｏでコード化した発現プラスミドでトランスフェクトした４８ 時あとで細胞から製造する。このリポータ−遺伝子に、ＭＴＶプロモーター・ヒ ト生長ホルモン遺伝子構築の一７７位で融合された４つのＧＲＥｓを含んでいる 。アッセイには全ＲＮＡの５０βｇｓを用いた。０４Ｍ−７？ＣＯの３７７塩基 保護バンド位置及び内部コントロール遺伝子からの２９４塩基保護バンド（ＣＭ Ｖエンハンサ−／プロモーター構築からの発現）を夫々黒及び白の矢印で示す。

キメラ・レセプターによるＥＲＥｓの誘発を図６に示す。細胞は、ＭＴｖプロモ ーターに融合した４つのＥＲＥｓを含むところのＥ４Ｍ−，７Ｃｏ及びＤＨＲ２ ３α（ＥＣＥＣＥＣ）、Ｇ”Ｅ”Ｇ又はＧ”Ｅ”Ｅｃのうちの何れかをコード化 した発現プラスミドでトランスフェクトされた。細胞はムリステロンＡ（Ｍ）又 はデキサメサゾン（Ｄ）と共に、又はなしで（−）培養した。リポータ−遺伝子 活性を、上述の図２について述べたようにして測定した。

以下の表１にキメラレセプターによるグルココルチコイド・レセプター（ＧＲＥ ）応答遺伝子の誘発を示す。２９３の細胞を、指示したレセプター蛋白及びリポ ータ−遺伝子Ｇ４Ｍ、□ＣＯでコード化したエフェクター・プラスミドをトラン スフェクトした。これらのトランスフェクトされた細胞は、添加ホルモンなしく −）か、ムリステロンＡ（Ｍ）と共にか又はｄｅｘ（Ｄ）と共に培養した。リポ ータ−遺伝子活性は、上記図２で述べたようにしてめた。「誘発倍数」とは、添 加リガンドの不存在下に培養した細胞からの抽出物中のリポータ−遺伝子の発現 で分けられたホルモンで培養した細胞の該リポータ−遺伝子の発現のレベルを表 わすものである。

表１　キメラレセプターによるグルココルチコイドレセプターの誘発レセプター 　−Ｍ　Ｄ ＥｃＥｃＥｃ　１．０（領２）　０．９（０，２）　ＮＴＧＧＧ　１．０（０， ３）　１．０（０，３）　３４７ＧＧＥｃ　１．７（領３）　７９８（５７）　 ＮＴＶＧＥｃ　４．７（０，８）　３１１７（２４０）　ＮＴレセプター・Ｌｅ ｘ融合蛋白による転写活性を表２に示す。指示レセプター蛋白をコードしたエフ ェクター・プラスミドは、１ｅｘ−オペレーターを含有する（Ｘ４Ｃ−ｓｓｃＯ ）か又は欠除する（ＱＣ−＊５ＣＯ）リポータ−遺伝子でトランスフェクトされ た。「対照」とは、レセプターｃＤＮＡを含まない「エフェクター」プラスミド でトランスフェクトされた細胞をあられす。細胞はムリステロンＡと共に（＋） 又はなしで（−）培養した。誘発倍数は既述のようにしてめた。標準偏差をカッ コ内に示す。

表２　キメラレセプターによる転写活性Ｘ　４Ｃ−ｓ　ｓ　ＣＯＯＣ−ｓ　ｓ　 ＣＯレセプター　−＋ 対照　１．０（０，３）　１．１（０，３）　１．０（０，２）　１．１（０， ４）ＥｃＥｃＥｃ　１．２（０，２）　１．４（０，１）　ＮＴ　ＮＴＧＸＧ　 １．０（０，１）　１．１（０，２）　ＮＴ　ＮＴＧ　Ｘ　Ｅｃ　１．０（０， ２）　４４．３（８，３）　０．７（０，２）　０．９（０，３）ＶＸＥｃ　４ ．７（１，３）　５６３　（６１）　０．８（０，４）　１．０（０，２）本発 明は好ましい実施態様について必要的に記述してきたけれども、この明細書を読 んだ当業者はその精神と範囲から逸脱することなく、ここに記載の内容について 種々の変更、均等物の置換及び改変をなし得るであろう。従って、本発明はここ に特異的に記述した以外の方法で実施することができる。その故にここに特許証 によって与えられる保護は、添付の特許請求の範囲とその均等範囲によってのみ 限定をうける。

配列表 （１）一般的情報 （ｉ）　特許出願人：ジェネンテク、インコーポレイテッド（ｉｉ）　発明の名 称：哺乳類の細胞における遺伝子のエフジステロイド依存調節 （ｉｉｉ）配列の数＝１ （ｉｖ）　連絡先・ （＾）名宛人：ジェネンテク、インコーポレイテッド（Ｂ）通り、ポイント・サ ン・ブルーノ・ブールバード４６０番（Ｃ）市：サウス・サン・フラッジスコ（ Ｄ）州：カリフォルニア （Ｅ）国、アメリカ合衆国 （Ｆ）ＺＩＰ：９４０８０ （Ｖ）コンピューター解読書式： （＾）媒体型：５．２５インチ、３６０Ｋｂフロツピーデイスク（Ｂ）コンピュ ーター＋ＩＢＭＰＣ適合（Ｃ）オペレーティング・システム：　ＰＣ−ＤＯ８／ ＭＳ−ＤＯ８（Ｄ）ソフトウェア：　ｐａｔｉｎ　（ジェネンテク）（ｖｆｉ） 本出願のデータ： （＾）出願番号、未　定 （Ｂ）出願日：１９９２年８月３日 （０分類：未　定 （ｖｉｉｉ）弁理士／代理人情報： （Ａ）　氏名：　フィッツ、リニー・エイ（Ｂ）登録番号：３５．１３６ （Ｃ）参照／整理番号二６０７ （ｉｘ）電話連絡先情報： （＾）電話番号：４１５／２２５−１４８９（Ｂ）ファックス番号：　４１５／ ９５２−９８８１（Ｃ）テレックス番号：　９１０／３７１−７１６８（２）配 列番号１の情報 （ｉ）配列の特徴： （＾）長さ・２９７０塩基 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）　Ｈの数ニー末鎖 （Ｄ）トポロジー・直鎖状 （ｘｉ）配列：配列番号Ｉ ＡＡＧＣＴＴＣＴＴＧ　ＴＣＣＣＣＡＧＣＣＧ　ＡＣＧＣＴＡＡＧＴＧ　ＡＡＣ ＧＧＡＡＡＡＣＧＧＣＣＡＣＡＡＡＡ　５０ＣＧＧＣＧＡＣＴＡＴ　ＣＧＧＣＴ ＧＣＣＡＧ　ＡＧＧ　ＡＴＧ　ＡＡＧ　ＣＧＧ　ＣＧＣＴＧＧ　ＴＣＧ　９１Ｍ ｅｔ　Ｌｙｓ　Ａｒｇ　Ａｒｇ　Ｔｒｐ　ＳｅｒＡＡＣＡＡＣＧＧＣＧＧＣＴＴ ＣＡＴＧ　ＣＧＣＣＴＡ　ＣＣＧ　ＧＡＧ　ＧＡＧ　ＴＣＧ　ＴＣＣ１３０＾ｓ ｎ　ＡｓｎＧｌｙ　Ｇｌｙ　Ｐｈｅ　ＩＪｅｔ　Ａｒｇ　Ｌｅｕ　Ｐｒｏ　Ｇｌ ｕ　Ｇｌｕ　Ｓｅｒ　ＳｅｒＴＣＧ　ＧＡＧ　ＧＴＣＡＣＧ　ＴＣＣＴＣＣ丁Ｃ Ｇ　ＡＡＣＧＧＧ　ＣＴＣＧＴＣＣＴＧ　ＣＣＣ１６９Ｓｅｒ　Ｇｌｕ　Ｖａｌ 　Ｔｈｒ　Ｓｅｒ　Ｓｅｒ　Ｓｅｒ　Ａｓｎ　Ｇｌｙ　Ｌｅｕ　Ｖａｌ　Ｌｅｕ 　Ｐｒ。

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Claims (27)

【特許請求の範囲】
1. １．エクジステロイドを哺乳類の細胞内でエクジステロイド・レセプターポリペ プチドと接触させることからなる哺乳動物細胞内で遺伝子発現を誘発する方法で あって、該哺乳類細胞がそのリガンド・エクジステロイドと一緒のときは該エク ジステロイド・レセプターのためのＤＮＡ結合配列を更に含んでいること、およ びレセプター・リガンド−ＤＮＡ結合配列複合物の生成が遺伝子発現を誘発する ことから成る方法。
2. ２．該エクジステロイドが２５−水酸基を含まない請求項１の方法。
3. ３．該エクジステロイドが５位に電子求引性基を含む請求項２の方法。
4. ４．該エクジステロイドが１１位に電子求引性基を含む請求項２の方法。
5. ５．該電子求引性基がヒドロキシル、ケトン、スルフヒドラル、ナイトレート、 ナイトライト、フッ素、臭素、ヨウ素及び塩素より成る群から選ばれる請求項３ の法。
6. ６．該電子求引性基がヒドロキシル、ケトン、スルフヒドラル、ナイトレート、 ナイトライト、フッ素、臭素、ヨウ素及び塩素より成る群から選ばれる請求項４ の方法。
7. ７．該エクジステロイドがムリステロンＡ、５−デヒドロキシムリステロンＡ、 １１−デヒドロキシムリステロンＡ及びポナステロンより成る群から選ばれる請 求項２の方法。
8. ８．該ＤＮＡ結合配列が更に真核生物遺伝子をコードしたＤＮＡ配列を含んでい る請求項１の方法。
9. ９．該真核生物遺伝子が、サイトカイン、酵素、構造ポリペプチド、ＤＮＡ及び ＲＮＡより成る群から選ばれたポリペプチド又は核酸をコード化している請求項 ８の方法。
10. １０．該サイトカインが成長ホルモン、インスリン様成長因子、インターロイキ ン、ヒト成長ホルモン、Ｎ−メチオニル・ヒト成長ホルモン、ウシ成長ホルモン 、副甲状腺ホルモン、チロキシン、インスリン、プロインスリン、レラキシン、 プロレラキシン、糖蛋白ホルモンたとえば濾胞刺戟ホルモン（ＦＳＨ）、甲状腺 刺戟ホルモン（ＴＳＨ）、副甲状腺ホルモン及び黄体形成ホルモン（ＬＨ）、造 血成長因子、肝成長因子、繊維芽細胞成長因子、プロラクチン、胎盤性ラクトゲ ン、腫瘍壊死因子−α及び−β、ムレリアン阻害物質、マウス・ゴナドトロピン 関連ペプチド、グルカゴン、インヒビン、アクチビン、血管内皮細胞成長因子、 インテグリン、トロンボポイエチン、エリスロポイエチン、神経成長因子たとえ ばＮＧＦ−β、血小板成長因子、造血成長因子、組織因子蛋白、ムレリアン阻害 物質、マウス・ゴナドトロピン関連ペプチド、トランスフォーミング成長因子（ ＴＧＦ）たとえばＴＧＦ−α及びＴＧＦ−β、インスリン様成長因子−Ｉ及び− ＩＩ、潜在性関連ペプチド、エリスロポイエチン、骨誘発性因子、インターフェ ロン−α，−β及び−γ、コロニー刺戟因子（ＣＳＦ）Ｍ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳ Ｆ及びＧ−ＣＳＦ、インターロイキン（ＩＬｓ）ＩＬ−１，ＩＬ−２，ＩＬ−３ ，ＩＬ−４，ＩＬ−５，ＩＬ−６，ＩＬ−７，ＩＬ−８及びその他のポリペプチ ド因子から選ばれる請求項８の方法。
11. １１．該酵素が組織プラスミノーゲン・アクチバーゼ（ＴＰＡ）、ウロキナーゼ 、エラスターゼ、アデノシンデアミナーゼ、ボンベシン、因子ＩＸ、因子ＶＩＩ Ｉ、トロンビン、エンケファリナーゼ、β−ラクタマ−ゼ、スーパーオキシド、 ジスムターゼ、逆転写酵素、ＲＮアーゼ、ＤＮアーゼ、あるいは糖分解、クレブ スサイクル、糖新生、尿素サイクル、酸化的リン酸化を触媒する酵素、またはプ リン類、ピリミジン類、核酸ポリマー類、コレステロール、蛋白、グリコゲン、 脂肪酸、炭水化物、燐脂質、糖蛋白ないしは脂質を合成または分解する酵素から 選ばれる請求項８の方法。
12. １２．該構造ポリペプチドが肺界面活性物質、アルブミン、抗体、担体蛋白、輸 送蛋白、糖蛋白ホルモンレセプター、ＣＤ−４、インスリン様成長因子が結合す る蛋白、カルシトニン、因子ＶＩＩＩ、抗体、蛋白Ａ又はＤ、リウマチ因子、ウ イルス抗原、ＨＩＶエンベロープ蛋白ＧＰ−１２０ならびにＧＰ−１４０、免疫 グロブリン、血清蛋白及びすべての細胞骨格ポリペプチドから選ばれる請求項８ の方法。
13. １３．該核酸がＤＮＡ及びＲＮＡである請求項８の方法。
14. １４．該哺乳類細胞が哺乳動物のなかにある請求項１の方法。
15. １５．該哺乳動物がヒトである請求項１４の方法。
16. １６．以下から成る、所望の蛋白の製造方法、すなわちａ）エクジステロイドを 哺乳類の細胞内で、そしてエクジステロイド・レセプターとリガンドの複合体の 転写調節下でエクジステロイド・レセプターポリペプチドと接触させること、但 しこゝに該哺乳類の細胞は更に（１）そのリガンド・エクジステロイドと一緒の ときは該エクジステロイドレセプクーの結合特異性をもつ第一のＤＮＡ結合配列 及び（２）該ＤＮＡ結合配列と異種の所望の蛋白をコード化した第二のＤＮＡ配 列を含むものとし；そしてｂ）該細胞を培養しそして該所望の蛋白を生産するこ と。
17. １７．該哺乳類の細胞が哺乳動物のなかにある請求項１６の方法。
18. １８．該所望の蛋白がサイトカイン類、酵素及び構造ポリペプチドから選ばれた ものである請求項１６の方法。
19. １９．該エクジステロイドがムリステロンＡ、５−デヒドロキシムリステロンＡ 、１１−デヒドロキシムリステロンＡ及びポナステロンから選ばれたものである 請求項１６の方法。
20. ２０．以下から成る、形質転換哺乳動物の内因性又は異種遺伝子の調節方法、す なわち ａ）エクジステロイドを哺乳類の細胞内で、そしてエクジステロイド・レセプタ ーとリガンドの複合体の転写調節下でエクジステロイド・レセプターポリペプチ ドと接触させること、但しここに該哺乳類の細胞は更に（１）そのリガンド・エ クジステロイドと一緒のときは該エクジステロイドレセプターの結合特異性をも つ第一のＤＮＡ結合配列及び（２）該ＤＮＡ結合配列と異種の所望の遺伝子産物 をコード化した第二のＤＮＡ配列を含むものとし；そしてｂ）該細胞を培養しそ して該所望の遺伝子産物を生産すること。
21. ２１．該エクジステロイドレセプターがムリステロンＡとの結合親和性をもって いる請求項２０の方法。
22. ２２．該エクジステロイドが２５位に水酸基をもっていない請求項２０の方法。
23. ２３．該エクジステロイドかムリステロンＡ、５−デヒドロキシムリステロンＡ 、１１−デヒドロキシムリステロンＡ及びポナステロンから選ばれたものである 請求項２２の方法。
24. ２４．以下から成る、哺乳類の細胞に異種のポリペプチドをコード化したＤＮＡ 配列を含む該哺乳類の細胞の中で、そしてエクジステロイド・レセプターの転写 調節下で、遺伝子発現を調節する方法、すなわちａ）該哺乳類の細胞を形質転換 してエクジステロイド・レセプター融合ポリペプチドを発現すること、但しここ に該融合ポリペプチドは異種トランスアクチベーション領域を含むものとし；そ して ｂ）該形質転換された哺乳類の細胞を、該エクジステロイドレセプターを活性化 するエクジステロイドと接触させること。
25. ２５．該トランスアクチベーション領域がヘルペスウイルスＶＰ１６酸性活性化 領域、ｌｅｘＡ、ｃ−ｆｏｓ、ＧＡＬ４及びｃ−ｍｙｃから選ばれたものである 請求項２４の方法。
26. ２６．該エクジステロイドがムリステロンＡ、５−デヒドロキシムリステロンＡ 、１１−デヒドロキシムリステロンＡ及びポナステロンから選ばれたものである 請求項２４の方法。
27. ２７．該エクジステロイド・レセプターがＤＨＲ２３αである請求項２４の方法 。