PL179215B1 - sposób wytwarzania wyciagu i srodek farmaceutyczny PL PL PL PL PL PL PL PL - Google Patents
sposób wytwarzania wyciagu i srodek farmaceutyczny PL PL PL PL PL PL PL PLInfo
- Publication number
- PL179215B1 PL179215B1 PL94307088A PL30708894A PL179215B1 PL 179215 B1 PL179215 B1 PL 179215B1 PL 94307088 A PL94307088 A PL 94307088A PL 30708894 A PL30708894 A PL 30708894A PL 179215 B1 PL179215 B1 PL 179215B1
- Authority
- PL
- Poland
- Prior art keywords
- thrombin
- polypeptide
- glu
- pro
- leeches
- Prior art date
Links
- 229940122388 Thrombin inhibitor Drugs 0.000 title description 25
- 239000003868 thrombin inhibitor Substances 0.000 title description 25
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims abstract description 53
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims abstract description 48
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims abstract description 45
- 241000545744 Hirudinea Species 0.000 claims abstract description 31
- 241000722121 Theromyzon tessulatum Species 0.000 claims abstract description 28
- 239000000284 extract Substances 0.000 claims abstract description 19
- 241000237651 Rhynchobdellida Species 0.000 claims abstract description 18
- 230000028327 secretion Effects 0.000 claims abstract description 15
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 claims abstract description 5
- 108090000190 Thrombin Proteins 0.000 claims description 61
- 229960004072 thrombin Drugs 0.000 claims description 60
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 22
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 claims description 20
- 238000004007 reversed phase HPLC Methods 0.000 claims description 20
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 18
- 125000001429 N-terminal alpha-amino-acid group Chemical group 0.000 claims description 12
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 claims description 12
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 10
- VIGKUFXFTPWYER-BIIVOSGPSA-N Ala-Cys-Pro Chemical compound C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N1CCC[C@@H]1C(=O)O)N VIGKUFXFTPWYER-BIIVOSGPSA-N 0.000 claims description 8
- GKKUBLFXKRDMFC-BQBZGAKWSA-N Asn-Pro-Gly Chemical compound [H]N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)NCC(O)=O GKKUBLFXKRDMFC-BQBZGAKWSA-N 0.000 claims description 8
- WZJLBUPPZRZNTO-CIUDSAMLSA-N Cys-Ser-Lys Chemical compound C(CCN)C[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CS)N WZJLBUPPZRZNTO-CIUDSAMLSA-N 0.000 claims description 8
- LXAUHIRMWXQRKI-XHNCKOQMSA-N Glu-Asn-Pro Chemical compound C1C[C@@H](N(C1)C(=O)[C@H](CC(=O)N)NC(=O)[C@H](CCC(=O)O)N)C(=O)O LXAUHIRMWXQRKI-XHNCKOQMSA-N 0.000 claims description 8
- JPHYJQHPILOKHC-ACZMJKKPSA-N Glu-Asp-Asp Chemical compound OC(=O)CC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O JPHYJQHPILOKHC-ACZMJKKPSA-N 0.000 claims description 8
- KZNQNBZMBZJQJO-UHFFFAOYSA-N N-glycyl-L-proline Natural products NCC(=O)N1CCCC1C(O)=O KZNQNBZMBZJQJO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- 108010002311 N-glycylglutamic acid Proteins 0.000 claims description 8
- JLMZKEQFMVORMA-SRVKXCTJSA-N Pro-Pro-Arg Chemical compound NC(N)=NCCC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H]1CCCN1C(=O)[C@H]1NCCC1 JLMZKEQFMVORMA-SRVKXCTJSA-N 0.000 claims description 8
- 108010077515 glycylproline Proteins 0.000 claims description 8
- 108010009298 lysylglutamic acid Proteins 0.000 claims description 8
- QGABLMITFKUQDF-DCAQKATOSA-N Asn-Met-Lys Chemical compound CSCC[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC(=O)N)N QGABLMITFKUQDF-DCAQKATOSA-N 0.000 claims description 7
- QDFBJJABJKOLTD-FXQIFTODSA-N Cys-Asn-Arg Chemical compound [H]N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O QDFBJJABJKOLTD-FXQIFTODSA-N 0.000 claims description 7
- SWJYSDXMTPMBHO-FXQIFTODSA-N Cys-Pro-Ser Chemical compound [H]N[C@@H](CS)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O SWJYSDXMTPMBHO-FXQIFTODSA-N 0.000 claims description 7
- CQGBSALYGOXQPE-HTUGSXCWSA-N Glu-Thr-Phe Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCC(=O)O)N)O CQGBSALYGOXQPE-HTUGSXCWSA-N 0.000 claims description 7
- GNPVTZJUUBPZKW-WDSKDSINSA-N Gly-Gln-Ser Chemical compound [H]NCC(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O GNPVTZJUUBPZKW-WDSKDSINSA-N 0.000 claims description 7
- FADYJNXDPBKVCA-UHFFFAOYSA-N L-Phenylalanyl-L-lysin Natural products NCCCCC(C(O)=O)NC(=O)C(N)CC1=CC=CC=C1 FADYJNXDPBKVCA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 7
- LALNXSXEYFUUDD-GUBZILKMSA-N Ser-Glu-Leu Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O LALNXSXEYFUUDD-GUBZILKMSA-N 0.000 claims description 7
- 108010013835 arginine glutamate Proteins 0.000 claims description 7
- 108010050848 glycylleucine Proteins 0.000 claims description 7
- 238000005227 gel permeation chromatography Methods 0.000 claims description 6
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims description 5
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 claims description 5
- 241000252254 Catostomidae Species 0.000 claims description 4
- 230000008569 process Effects 0.000 claims description 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 37
- 239000004019 antithrombin Substances 0.000 abstract description 31
- 208000007536 Thrombosis Diseases 0.000 abstract description 10
- 238000011282 treatment Methods 0.000 abstract description 5
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 abstract description 4
- 102000007625 Hirudins Human genes 0.000 description 19
- 108010007267 Hirudins Proteins 0.000 description 19
- WQPDUTSPKFMPDP-OUMQNGNKSA-N hirudin Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(OS(O)(=O)=O)=CC=1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC=1NC=NC=1)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@@H](NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H]1NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)CC)NC(=O)[C@@H]2CSSC[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@H](C(NCC(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N2)=O)CSSC1)C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H]1NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](N)C(C)C)C(C)C)[C@@H](C)O)CSSC1)C(C)C)[C@@H](C)O)[C@@H](C)O)C1=CC=CC=C1 WQPDUTSPKFMPDP-OUMQNGNKSA-N 0.000 description 19
- 229940006607 hirudin Drugs 0.000 description 19
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 16
- 101000712605 Theromyzon tessulatum Theromin Proteins 0.000 description 16
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 16
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 230000035602 clotting Effects 0.000 description 12
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 12
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 12
- 206010053567 Coagulopathies Diseases 0.000 description 11
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 10
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 9
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 9
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 9
- 239000000463 material Substances 0.000 description 9
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 9
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 9
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 8
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 8
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 8
- 108010074860 Factor Xa Proteins 0.000 description 7
- 239000003146 anticoagulant agent Substances 0.000 description 7
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 7
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 7
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 7
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 7
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 7
- HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N Heparin Chemical compound OC1C(NC(=O)C)C(O)OC(COS(O)(=O)=O)C1OC1C(OS(O)(=O)=O)C(O)C(OC2C(C(OS(O)(=O)=O)C(OC3C(C(O)C(O)C(O3)C(O)=O)OS(O)(=O)=O)C(CO)O2)NS(O)(=O)=O)C(C(O)=O)O1 HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 241000722124 Theromyzon Species 0.000 description 6
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 6
- 229960002897 heparin Drugs 0.000 description 6
- 229920000669 heparin Polymers 0.000 description 6
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 6
- 241000894007 species Species 0.000 description 6
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 6
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 5
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 5
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 5
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 5
- 238000000265 homogenisation Methods 0.000 description 5
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 5
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 5
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 5
- 238000004448 titration Methods 0.000 description 5
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 241000237902 Hirudo medicinalis Species 0.000 description 4
- 229940127219 anticoagulant drug Drugs 0.000 description 4
- 239000012131 assay buffer Substances 0.000 description 4
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 4
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 4
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 4
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 4
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 4
- 238000001819 mass spectrum Methods 0.000 description 4
- 231100000252 nontoxic Toxicity 0.000 description 4
- 230000003000 nontoxic effect Effects 0.000 description 4
- 210000003079 salivary gland Anatomy 0.000 description 4
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241001123468 Arhynchobdellida Species 0.000 description 3
- 241000237654 Haementeria ghilianii Species 0.000 description 3
- 101710154919 Hirudin variant-2 Proteins 0.000 description 3
- 241000500851 Poecilobdella manillensis Species 0.000 description 3
- ZMANZCXQSJIPKH-UHFFFAOYSA-N Triethylamine Chemical compound CCN(CC)CC ZMANZCXQSJIPKH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 206010047249 Venous thrombosis Diseases 0.000 description 3
- 239000008351 acetate buffer Substances 0.000 description 3
- -1 acetic Chemical class 0.000 description 3
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 3
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 3
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 3
- 208000009190 disseminated intravascular coagulation Diseases 0.000 description 3
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 description 3
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 3
- 238000005194 fractionation Methods 0.000 description 3
- 238000001802 infusion Methods 0.000 description 3
- 230000014508 negative regulation of coagulation Effects 0.000 description 3
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 3
- 208000010110 spontaneous platelet aggregation Diseases 0.000 description 3
- HZAXFHJVJLSVMW-UHFFFAOYSA-N 2-Aminoethan-1-ol Chemical compound NCCO HZAXFHJVJLSVMW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- HVAUUPRFYPCOCA-AREMUKBSSA-N 2-O-acetyl-1-O-hexadecyl-sn-glycero-3-phosphocholine Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCCOC[C@@H](OC(C)=O)COP([O-])(=O)OCC[N+](C)(C)C HVAUUPRFYPCOCA-AREMUKBSSA-N 0.000 description 2
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229940123583 Factor Xa inhibitor Drugs 0.000 description 2
- 208000032843 Hemorrhage Diseases 0.000 description 2
- 241000237678 Hirudinidae Species 0.000 description 2
- AFVFQIVMOAPDHO-UHFFFAOYSA-N Methanesulfonic acid Chemical compound CS(O)(=O)=O AFVFQIVMOAPDHO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N Phosphoric acid Chemical compound OP(O)(O)=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010003541 Platelet Activating Factor Proteins 0.000 description 2
- 241000345816 Polypodium maculosum Species 0.000 description 2
- 102000001708 Protein Isoforms Human genes 0.000 description 2
- 108010029485 Protein Isoforms Proteins 0.000 description 2
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M Sodium acetate Chemical compound [Na+].CC([O-])=O VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N Sulfuric acid Chemical compound OS(O)(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000541890 Thalamita cooperi Species 0.000 description 2
- DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N Trifluoroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(F)(F)F DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 2
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 230000001858 anti-Xa Effects 0.000 description 2
- 230000002785 anti-thrombosis Effects 0.000 description 2
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 2
- 210000001124 body fluid Anatomy 0.000 description 2
- 239000010839 body fluid Substances 0.000 description 2
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 2
- 238000005251 capillar electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 2
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 2
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 2
- 230000003749 cleanliness Effects 0.000 description 2
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 2
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 description 2
- 230000007717 exclusion Effects 0.000 description 2
- 239000000945 filler Substances 0.000 description 2
- 108010005808 hementin Proteins 0.000 description 2
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 2
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 2
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 2
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 2
- 238000004989 laser desorption mass spectroscopy Methods 0.000 description 2
- 238000001840 matrix-assisted laser desorption--ionisation time-of-flight mass spectrometry Methods 0.000 description 2
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 2
- MYWUZJCMWCOHBA-VIFPVBQESA-N methamphetamine Chemical compound CN[C@@H](C)CC1=CC=CC=C1 MYWUZJCMWCOHBA-VIFPVBQESA-N 0.000 description 2
- 150000007522 mineralic acids Chemical class 0.000 description 2
- 150000007524 organic acids Chemical class 0.000 description 2
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 2
- 230000010118 platelet activation Effects 0.000 description 2
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 2
- 238000011321 prophylaxis Methods 0.000 description 2
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 2
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 2
- 239000003869 thrombin derivative Substances 0.000 description 2
- 239000003981 vehicle Substances 0.000 description 2
- WXTMDXOMEHJXQO-UHFFFAOYSA-N 2,5-dihydroxybenzoic acid Chemical compound OC(=O)C1=CC(O)=CC=C1O WXTMDXOMEHJXQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- JTNCEQNHURODLX-UHFFFAOYSA-N 2-phenylethanimidamide Chemical compound NC(=N)CC1=CC=CC=C1 JTNCEQNHURODLX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BMYNFMYTOJXKLE-UHFFFAOYSA-N 3-azaniumyl-2-hydroxypropanoate Chemical compound NCC(O)C(O)=O BMYNFMYTOJXKLE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M Acetate Chemical compound CC([O-])=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 240000002470 Amphicarpaea bracteata Species 0.000 description 1
- 102000004411 Antithrombin III Human genes 0.000 description 1
- 108090000935 Antithrombin III Proteins 0.000 description 1
- 206010003226 Arteriovenous fistula Diseases 0.000 description 1
- BDMIFVIWCNLDCT-CIUDSAMLSA-N Asn-Arg-Glu Chemical compound [H]N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O BDMIFVIWCNLDCT-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- 108010027612 Batroxobin Proteins 0.000 description 1
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 1
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000024172 Cardiovascular disease Diseases 0.000 description 1
- 206010051055 Deep vein thrombosis Diseases 0.000 description 1
- BWLUMTFWVZZZND-UHFFFAOYSA-N Dibenzylamine Chemical compound C=1C=CC=CC=1CNCC1=CC=CC=C1 BWLUMTFWVZZZND-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 102000009123 Fibrin Human genes 0.000 description 1
- 108010073385 Fibrin Proteins 0.000 description 1
- BWGVNKXGVNDBDI-UHFFFAOYSA-N Fibrin monomer Chemical compound CNC(=O)CNC(=O)CN BWGVNKXGVNDBDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010049003 Fibrinogen Proteins 0.000 description 1
- 102000008946 Fibrinogen Human genes 0.000 description 1
- ATVYZJGOZLVXDK-IUCAKERBSA-N Glu-Leu-Gly Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)NCC(O)=O ATVYZJGOZLVXDK-IUCAKERBSA-N 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- 241000237903 Hirudo Species 0.000 description 1
- 101000993302 Hirudo medicinalis Hirudin variant-1 Proteins 0.000 description 1
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- DRCKHKZYDLJYFQ-YWIQKCBGSA-N Ile-Thr Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O DRCKHKZYDLJYFQ-YWIQKCBGSA-N 0.000 description 1
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 description 1
- FYYHWMGAXLPEAU-UHFFFAOYSA-N Magnesium Chemical compound [Mg] FYYHWMGAXLPEAU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 1
- RATXDYWHIYNZLE-DCAQKATOSA-N Met-Lys-Cys Chemical compound CSCC[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)O)N RATXDYWHIYNZLE-DCAQKATOSA-N 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 206010061876 Obstruction Diseases 0.000 description 1
- 239000008118 PEG 6000 Substances 0.000 description 1
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019483 Peanut oil Nutrition 0.000 description 1
- 108010001014 Plasminogen Activators Proteins 0.000 description 1
- 102000001938 Plasminogen Activators Human genes 0.000 description 1
- 229920002582 Polyethylene Glycol 600 Polymers 0.000 description 1
- 229920002584 Polyethylene Glycol 6000 Polymers 0.000 description 1
- ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N Potassium Chemical compound [K] ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010094028 Prothrombin Proteins 0.000 description 1
- 102100027378 Prothrombin Human genes 0.000 description 1
- 206010037437 Pulmonary thrombosis Diseases 0.000 description 1
- 206010038563 Reocclusion Diseases 0.000 description 1
- 206010038831 Retinal artery thrombosis Diseases 0.000 description 1
- BQCADISMDOOEFD-UHFFFAOYSA-N Silver Chemical compound [Ag] BQCADISMDOOEFD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- PMZURENOXWZQFD-UHFFFAOYSA-L Sodium Sulfate Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]S([O-])(=O)=O PMZURENOXWZQFD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 208000006011 Stroke Diseases 0.000 description 1
- 241000869038 Theromyzon pallens Species 0.000 description 1
- 241000869086 Theromyzon rude Species 0.000 description 1
- VGYVVSQFSSKZRJ-OEAJRASXSA-N Thr-Phe-Lys Chemical compound NCCCC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](N)[C@H](O)C)CC1=CC=CC=C1 VGYVVSQFSSKZRJ-OEAJRASXSA-N 0.000 description 1
- KRNYOVHEKOBTEF-YUMQZZPRSA-N Val-Val Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(O)=O KRNYOVHEKOBTEF-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 1
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 1
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 1
- 239000011149 active material Substances 0.000 description 1
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 1
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 1
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 1
- 238000013019 agitation Methods 0.000 description 1
- 229910052783 alkali metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 150000001340 alkali metals Chemical class 0.000 description 1
- 229910052784 alkaline earth metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 150000001342 alkaline earth metals Chemical class 0.000 description 1
- 229910052782 aluminium Inorganic materials 0.000 description 1
- XAGFODPZIPBFFR-UHFFFAOYSA-N aluminium Chemical compound [Al] XAGFODPZIPBFFR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910000147 aluminium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 150000001412 amines Chemical class 0.000 description 1
- 230000002429 anti-coagulating effect Effects 0.000 description 1
- 230000000702 anti-platelet effect Effects 0.000 description 1
- 229960005348 antithrombin iii Drugs 0.000 description 1
- 229960004676 antithrombotic agent Drugs 0.000 description 1
- JUHORIMYRDESRB-UHFFFAOYSA-N benzathine Chemical compound C=1C=CC=CC=1CNCCNCC1=CC=CC=C1 JUHORIMYRDESRB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WPYMKLBDIGXBTP-UHFFFAOYSA-N benzoic acid group Chemical group C(C1=CC=CC=C1)(=O)O WPYMKLBDIGXBTP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000011230 binding agent Substances 0.000 description 1
- 230000001164 bioregulatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000000740 bleeding effect Effects 0.000 description 1
- 239000010836 blood and blood product Substances 0.000 description 1
- 230000023555 blood coagulation Effects 0.000 description 1
- 229940125691 blood product Drugs 0.000 description 1
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 1
- 239000002775 capsule Substances 0.000 description 1
- 150000001734 carboxylic acid salts Chemical class 0.000 description 1
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 235000013351 cheese Nutrition 0.000 description 1
- 239000003593 chromogenic compound Substances 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 1
- 239000000356 contaminant Substances 0.000 description 1
- 239000000287 crude extract Substances 0.000 description 1
- 108010060199 cysteinylproline Proteins 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 239000007857 degradation product Substances 0.000 description 1
- 239000008121 dextrose Substances 0.000 description 1
- 235000005911 diet Nutrition 0.000 description 1
- 230000037213 diet Effects 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 239000007884 disintegrant Substances 0.000 description 1
- BNIILDVGGAEEIG-UHFFFAOYSA-L disodium hydrogen phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].OP([O-])([O-])=O BNIILDVGGAEEIG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 239000003995 emulsifying agent Substances 0.000 description 1
- 210000002889 endothelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000003511 endothelial effect Effects 0.000 description 1
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 1
- 238000011067 equilibration Methods 0.000 description 1
- UYMKPFRHYYNDTL-UHFFFAOYSA-N ethenamine Chemical compound NC=C UYMKPFRHYYNDTL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 229950003499 fibrin Drugs 0.000 description 1
- 229940012952 fibrinogen Drugs 0.000 description 1
- 230000001471 fibrinogenolytic effect Effects 0.000 description 1
- 239000003527 fibrinolytic agent Substances 0.000 description 1
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 1
- 235000015244 frankfurter Nutrition 0.000 description 1
- 230000008014 freezing Effects 0.000 description 1
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 1
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 1
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 1
- 150000002334 glycols Chemical class 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- UWYVPFMHMJIBHE-OWOJBTEDSA-N hydroxymaleic acid group Chemical group O/C(/C(=O)O)=C/C(=O)O UWYVPFMHMJIBHE-OWOJBTEDSA-N 0.000 description 1
- 230000001771 impaired effect Effects 0.000 description 1
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 1
- 230000028709 inflammatory response Effects 0.000 description 1
- 150000007529 inorganic bases Chemical class 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 1
- 238000001155 isoelectric focusing Methods 0.000 description 1
- 235000015110 jellies Nutrition 0.000 description 1
- 125000000686 lactone group Chemical group 0.000 description 1
- 239000000314 lubricant Substances 0.000 description 1
- 229910052749 magnesium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011777 magnesium Substances 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 150000002739 metals Chemical class 0.000 description 1
- 229940098779 methanesulfonic acid Drugs 0.000 description 1
- 239000002480 mineral oil Substances 0.000 description 1
- 235000010446 mineral oil Nutrition 0.000 description 1
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 1
- 208000010125 myocardial infarction Diseases 0.000 description 1
- UPSFMJHZUCSEHU-JYGUBCOQSA-N n-[(2s,3r,4r,5s,6r)-2-[(2r,3s,4r,5r,6s)-5-acetamido-4-hydroxy-2-(hydroxymethyl)-6-(4-methyl-2-oxochromen-7-yl)oxyoxan-3-yl]oxy-4,5-dihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-3-yl]acetamide Chemical compound CC(=O)N[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](NC(C)=O)[C@H](OC=2C=C3OC(=O)C=C(C)C3=CC=2)O[C@@H]1CO UPSFMJHZUCSEHU-JYGUBCOQSA-N 0.000 description 1
- 210000004898 n-terminal fragment Anatomy 0.000 description 1
- 239000002687 nonaqueous vehicle Substances 0.000 description 1
- 239000003921 oil Substances 0.000 description 1
- 235000019198 oils Nutrition 0.000 description 1
- 239000002674 ointment Substances 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- 235000005985 organic acids Nutrition 0.000 description 1
- 150000007530 organic bases Chemical class 0.000 description 1
- 238000007911 parenteral administration Methods 0.000 description 1
- 239000000312 peanut oil Substances 0.000 description 1
- 239000000816 peptidomimetic Substances 0.000 description 1
- 230000002572 peristaltic effect Effects 0.000 description 1
- 239000003208 petroleum Substances 0.000 description 1
- 239000008177 pharmaceutical agent Substances 0.000 description 1
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 1
- 239000000825 pharmaceutical preparation Substances 0.000 description 1
- WLJVXDMOQOGPHL-UHFFFAOYSA-N phenylacetic acid Chemical compound OC(=O)CC1=CC=CC=C1 WLJVXDMOQOGPHL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 1
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 229940127126 plasminogen activator Drugs 0.000 description 1
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 1
- 239000003495 polar organic solvent Substances 0.000 description 1
- 229910052700 potassium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011591 potassium Substances 0.000 description 1
- 229910000343 potassium bisulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000003389 potentiating effect Effects 0.000 description 1
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 1
- 238000004321 preservation Methods 0.000 description 1
- 239000003755 preservative agent Substances 0.000 description 1
- MFDFERRIHVXMIY-UHFFFAOYSA-N procaine Chemical compound CCN(CC)CCOC(=O)C1=CC=C(N)C=C1 MFDFERRIHVXMIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960004919 procaine Drugs 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 229940039716 prothrombin Drugs 0.000 description 1
- 210000001147 pulmonary artery Anatomy 0.000 description 1
- 238000010188 recombinant method Methods 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 150000003870 salicylic acids Chemical class 0.000 description 1
- 210000003296 saliva Anatomy 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- 239000000377 silicon dioxide Substances 0.000 description 1
- 229910052709 silver Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000004332 silver Substances 0.000 description 1
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- 239000001632 sodium acetate Substances 0.000 description 1
- 235000017281 sodium acetate Nutrition 0.000 description 1
- 229910052938 sodium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011152 sodium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 238000000527 sonication Methods 0.000 description 1
- 239000003549 soybean oil Substances 0.000 description 1
- 235000012424 soybean oil Nutrition 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 239000008223 sterile water Substances 0.000 description 1
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 description 1
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 1
- 150000003460 sulfonic acids Chemical class 0.000 description 1
- 238000001356 surgical procedure Methods 0.000 description 1
- 239000000375 suspending agent Substances 0.000 description 1
- 208000011580 syndromic disease Diseases 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 239000012209 synthetic fiber Substances 0.000 description 1
- 229920002994 synthetic fiber Polymers 0.000 description 1
- 239000006188 syrup Substances 0.000 description 1
- 235000020357 syrup Nutrition 0.000 description 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 1
- 206010043554 thrombocytopenia Diseases 0.000 description 1
- 229960000103 thrombolytic agent Drugs 0.000 description 1
- 238000011200 topical administration Methods 0.000 description 1
- 230000000699 topical effect Effects 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 125000005270 trialkylamine group Chemical group 0.000 description 1
- 238000007738 vacuum evaporation Methods 0.000 description 1
- 108010021889 valylvaline Proteins 0.000 description 1
- 235000013311 vegetables Nutrition 0.000 description 1
- 230000003878 venous anastomosis Effects 0.000 description 1
- 239000011800 void material Substances 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
- 239000000080 wetting agent Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/81—Protease inhibitors
- C07K14/815—Protease inhibitors from leeches, e.g. hirudin, eglin
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
- A61K35/56—Materials from animals other than mammals
- A61K35/62—Leeches; Worms, e.g. cestodes, tapeworms, nematodes, roundworms, earth worms, ascarids, filarias, hookworms, trichinella or taenia
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
- A61P7/02—Antithrombotic agents; Anticoagulants; Platelet aggregation inhibitors
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S530/00—Chemistry: natural resins or derivatives; peptides or proteins; lignins or reaction products thereof
- Y10S530/855—Proteins from animals other than mammals or birds
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Hematology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Diabetes (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
Abstract
1. Oczyszczony polipeptyd posiadajacy aktywnosc hamowania trombiny izolowany z tkanek lub wydzieliny pijawek rzedu Rhynchobdellida, korzystnie gatunku Theromyzon tessulatum, posia- dajacy ciezar czasteczkowy okolo 9000 i N-koncowa sekwencje aminokwasów: Glu Asp Asp Asn Pro Gly Pro Pro Arg Ala Cys Pro Gly Glu. 2. Oczyszczony polipeptyd posiadajacy aktywnosc hamowania trombiny izolowany z tkanek lub wydzieliny pijawek rzedu Rhynchobdellida, korzystnie gatunku Theromyzon tessulatum, posia- dajacy ciezar czasteczkowy okolo 14000 i N-koncowa sekwencje aminokwasów: Ser Glu Leu Gly Gln Ser Cys Ser Lys Glu Asn Pro Cys Pro Ser Asn Met Lys Cys Asn Arg Glu Thr Phe Lys. 3. Sposób wytwarzania oczyszczonego polipeptydu posiadajacego aktywnosc hamowania trombi- ny oraz posiadajacego ciezar czasteczkowy okolo 9000 kD i N-koncowa sekwencje aminokwasów: Glu Asp Asp Asn Pro Gly Pro Pro Arg Ala Cys Pro Gly Glu, i polipeptydu posiadajacego ciezar czasteczkowy okolo 14000 i N-koncowa sekwencje aminokwasów: Ser Glu Leu Gly Gln Ser Cys Ser Lys Glu Asn Pro Cys Pro Ser Asn Met Lys Cys Asn Arg Glu Thr Phe Lys, znamienny tym, ze homogenizuje sie tkanki lub wydzieliny pijawek rzedu Rhynchobdellida, korzystnie gatunku Theromyzon tessulatum, przygotowuje sie frakcje zawierajaca rozpuszczalne w wodzie skladniki oraz oczyszcza sie ta frakcje za pomocachroma- tografii powinowactwa specyficznej w stosunku do trombiny, a po niej co najmniej jednego etapu chroma- tografii zelowej i co najmniej jednego etapu HPLC z odwróconymi fazami. P L 179215 PL PL PL PL PL PL PL PL
Description
Przedmiotem wynalazku jest oczyszczony polipeptyd, sposób wytwarzania oczyszczonego polipeptydu, sposób wytwarzania wyciągu i środek farmaceutyczny. Oczyszczony polipeptyd zgodnie z wynalazkiem jest inhibitorem trombiny z tkanki oraz wydzielin pijawek.
Trombina katalizuj e tworzenie skrzepów fibrynowych, a przez to hamuj e krzepnięcie krwi.
Ponadto trombina odgrywa kilka innych ról bioregulacyjnych, takich jak bezpośrednie aktywowanie agregacji płytek i aktywacja odpowiedzi zapalnej przez stymulowanie syntezy czynnika aktywującego płytki krwi (PAF) w komórkach śródbłonka. Oznacza to, że trombina odgrywa
179 215 kluczową rolę w schorzeniach związanych z zakrzepicą, takich jak na przykład choroba sercowo-naczyniowa.
W konsekwencji istnieje znaczne zainteresowanie ciągłymi poszukiwaniami nowych lub ulepszonych odpowiednio inhibitorów trombiny i antykoagulantów.
Przykładami dobrze znanych inhibitorów trombiny są heparyna i hirudyna.
Heparyna wzmaga czynność przeciwzakrzepowąantytrombiny III. Jest ona szeroko stosowana do leczenia schorzeń, w których za powstawanie lub ekspansję skrzepu takich jak zakrzepowy zator żylny, odpowiedzialna jest aktywność trombiny. Heparyna jest nieskuteczna w leczeniu przypadków, w których aktywność trombiny III jest zmniejszona, na przykład w przypadkach zakrzepicy towarzyszącej nerczycy lub zespołowi rozsianej krzepliwości wewnątrznaczyniowej (DIC). Ponadto heparyna daje wiele niepożądanych działań ubocznych, w tym krwotoki i małopłytkowość.
Hirudyna jest dobrze poznanym i scharakteryzowanym, polipeptydem o znanej specyficzności w stosunku do trombiny, który można wyizolować z wyciągów z gruczołu ślinowego i innych tkanek pijawek gatunku Hirudo mecicinalis. Hirudyna i jej pochodne mogą być także otrzymane za pomocą technik rekombinacyjnych. Polipeptyd ma stosunkowo niski ciężar cząsteczkowy równy 7000 i składa się z 65 aminokwasów. Sekwencja aminokwasów hirudyny została po raz pierwszy oznaczona przez Dodt’a i współpracowników (FEBS Letters, 165, 180-18-4,1984). W pijawce lekarskiej Hirudo medicinalis wykryto trzy główne odmiany hirudyny (HV1, HV2, HV3), różniące się tylko w około 10% wszystkich pozycji aminokwasów Najbardziej istotną różnicą jest różnica w pierwszych dwóch pozycjach N-terminalnego końca cząsteczki: Val-Val w odmianie hirudyny 1 (HV1) i Ile-Thr w odmianie hirudyny 2 (HV2). Znaczenie tych różnic jest niewielkie i nie wpływają one ani na funkcję ani na specyficzność interakcji hirudyna-trombina. Hirudyna jest silnym, naturalnym inhibitorem krzepnięcia. Okazała się skuteczną w zapobieganiu zakrzepicy żylnej, okluzji zespolenia żylnego i indukowanego przez trombinę Rozsianego krzepnięcia wewnątrznaczyniowego, ale powoduje jednakże wydłużenie czasu krwawienia.
Filogenetycznie pijawka lekarska Hirudo medicinalis należy do podrodziny Hirudininae rodziny pijawek Hirudinidae (R. T. Sawyer: „Leech Biology and Behaviour”, Oxford University Press, Vol. 2, strona 688, 1986). Bardziej zaawansowanym ewolucyjnie gatunkiem pijawki jest Hirudinaria manillensis, która należy do podrodziny Hirudinarimae tej samej rodziny Hirudinidae. Nieoczekiwanie pokrewna, ale wyraźnie zupełnie różna izoforma hirudyny została ostatnio odkryta w Hirudinaria manillensis, jak ujawniono w publikacji zgłoszenia PCT WO 90/05143. Izoforma ta w porównaniu z hirudynrąz Hirudo medicinalis różni się w prawie 40% pozycji aminokwasów. Wymienione powyżej dwa gatunki, mianowicie Hirudo medicinalis i Hirudinaria manillensis, należą do rzędu pijawek Arhynchobdellida („pijawki szczękowe”). Oprócz rzędu Arhynchobdellida jest jeszcze jeden ważny rząd pijawek, to jest Rhynchobdellida („pijawki trąbkowe”) (R. T. Sawyer: „Leech Biology and Behaviour”, Oxford University Press, Vol. 2, strona 651, 1986). Najszerzej badanym przedstawicielem rzędu Rhynchobdellida, w odniesieniu do białek śliny, jest „pijawka amazońska”, Haementeria ghilianii. Wykazano jednakże, że nieoczekiwanie gatunek ten nie zawiera antytrombiny (Budzyński i współpr., Proc. Soc. Exp. Biol. Med., 168, 259-265, 1981). Zamiast tego Haementeria ghilianii zawiera enzym fibrynogenolityczny o nazwie hementin (patent USA nr 4390630), jak również inhibitor czynnika koagulacji łowi Xa (C. Condra i współpr.: Thromb. Haemost., 61, 437-441, 1986).
Na podstawie tego odkrycia i późniejszych prac zostało ogólnie zaakceptowane, że czynność antytrombino-podobna jest ograniczona do pijawek rzędu Arhynchobdellida, natomiast rząd Rhynchobdellida jest obecnie uważany za nie posiadający czynności antytrombino-podobnej.
Mimo omowionych powyżej osiągnięć istnieje nadal zapotrzebowanie na dostarczenie oprócz heparyny i hirudyny innych antykoagulantów i antytrombin, mających zwiększoną skuteczność w hamowaniu tworzenia skrzepu, indukowanej przez trombinę aktywacji płytek lub aktywacji płytek śródblonkowych, które mogłyby być wytwarzane w ilościach handlowych.
179 215
Nieoczekiwanie stwierdzono, że związki o czynności antytrombino-podobnej można wyizolować z tkanek i wydzielin pijawek rzędu Rhynchobdellida, korzystnie rodziny Theromyzon, zwanej niekiedy „pijawkąptasią”, ponieważ gatunek ten ma wyjątkowo wyspecjalizowany sposób życia, polegający na wysysaniu krwi z nozdrzy ptaków wodnych. .
Zatem celem wynalazku jest wykorzystanie pijawek rzędu Rhynchobdellida, korzystnie gatunku Theromyzon tessulatum, do wytwarzania związków hamujących trombinę.
Stwierdzono, że w wyciągach, zawierających rozpuszczalne w wodzie składniki tych pijawek, może być zmierzona aktywność hamowania trombiny. Zatem celem wynalazkujest wytworzenie posiadającego czynność hamowania trombiny wyciągu z tkanek lub wydzielin pijawek rzędu Rhynchobdellida lub rodziny Theromyzon lub gatunku Theromyzon tessulatum, zawierającego ich składniki rozpuszczalne.
Ze wspomnianych wyciągów może być wyizolowany aktywny inhibitor trombiny. Zatem celem wynalazkujest dostarczenie polipeptydu o aktywności inhibitora trombiny o wysokim stopniu oczyszczenia, który może być zidentyfikowany jako polipeptydy posiadające aktywność hamowania trombiny, uzyskiwalne z wyciągu zdefiniowanego powyżej oraz w zastrzeżeniach, przez oczyszczanie wyciągu otrzymanego przez homogenizację w' wodzie/acetonie przedniej przyssawki mrożonych i liofilizowanych pijawek, za pomocą chromatografii powinowactwa specyficznej dla trombiny, po której następuje etap chromatografii żelowej i co najmniej jeden etap HPLC z odwróconymi fazami.
Inhibitor trombiny korzystnie zawiera czynne fragmenty polipeptydowe o ciężarach cząsteczkowych odpowiednio około 3000, około 9000 i około 14000. Te czynne polipeptydy mogą być uznane za produkty degradacji macierzystego lub prekursorowego inhibitora trombiny.
Inhibitor trombiny według wynalazku jest nowy, ponieważ różni się od znanych antytrombin, w szczególności od hirudyny, ciężarem cząsteczkowym jak również punktem izoelektrycznym i N-terminalnymi sekwencjami aminokwasów, które wykazują ograniczoną homologię (poniżej 40%) z innymi inhibitorami trombiny.
Przedmiotem wynalazku jest oczyszczony polipeptyd posiadający aktywność hamowania trombiny izolowany z tkanek lub wydzieliny pijawek rzędu Rhynchobdellida, korzystnie gatunku Theromyzon tessulatum, posiadający ciężar cząsteczkowy około 90001 N-końcową sekwencję aminokwasów: Glu Asp Asp Asn Pro Gly Pro Pro Arg Ala Cys Pro Gly Glu.
Przedmiotem wynalazku jest także oczyszczony polipeptyd posiadający aktywność hamowania trombiny izolowany z tkanek lub wydzieliny pijawek rzędu Rhynchobdellida, korzystnie gatunku Theromyzon tessulatum, posiadający ciężar cząsteczkowy około 14000 i N-końcową sekwencję aminokwasów: Ser Glu Leu Gly Gln Ser Cys Ser Lys Glu Asn Pro Cys Pro Ser Asn Met Lys Cys Asn Arg Glu Thr Phe Lys.
Ponadto, przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania oczyszczonego polipeptydu posiadającego aktywność hamowania trombiny oraz posiadającego ciężar cząsteczkowy około 9000 kD i N-końcową sekwencję aminokwasów: Glu Asp Asp Asn Pro Gly Pro Pro Arg Ala Cys Pro Gly Glu, i polipeptydu posiadającego ciężar cząsteczkowy około 14000 i N-końcowąsekwencję aminokwasów: Ser Glu Leu Gly Gln Ser Cys Ser Lys Glu Asn Pro Cys Pro Ser Asn Met Lys Cys Asn Arg Glu Thr Phe Lys, polegający na tym, że homogenizuje się tkanki lub wydzieliny pijawek rzędu Rhynchobdellida, korzystnie gatunku Theromyzon tessulatum, przygotowuje się frakcję zawierającą rozpuszczalne w wodzie składniki oraz oczyszcza się tą frakcję za pomocą chromatografii powinowactwa specyficznej w stosunku do trombiny, a po niej co najmniej jednego etapu chromatografii żelowej i co najmniej jednego etapu HPLC z odwróconymi fazami. Korzystnie przednie przyssawki zamrożonych lub liofilizowanych pijawek homogenizuje się wodą/acetonem.
Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania wyciągu posiadającego aktywność hamowania trombiny, polegający na tym, że homogenizuje się tkankę lub wydzieliny pijawekrzędy
Rhynchobdellida, korzystnie gatunku Theromyzon tessulatum, w obecności wody/acetonu i sporządza frakcję zawierającą składniki rozpuszczalne w wodzie.
179 215
Następnym przedmiotem wynalazku jest środek farmaceutyczny zawierający polipeptyd i farmaceutycznie dopuszczalny nośnik, charakteryzujący się tym, że jako polipeptyd zawiera oczyszczony polipeptyd posiadający aktywność hamowania trombiny izolowany z tkanek lub wydzieliny pijawek rzędu Rhynchobdellida, korzystnie gatunku Theromyzon tessulatum, przy czym polipeptyd ten został wybrany spośród polipeptydu posiadającego ciężar cząsteczkowy około 9000 i N-końcową sekwencję aminokwasów: Glu Asp Asp Asn Pro Gly Pro Pro Arg Ala Cys Pro Gly Glu, albo polipeptydu posiadającego ciężar cząsteczkowy około 14000 i N-końcową sekwencję aminokwasów: Ser Glu Leu Gly Gln Ser Cys Ser Lys Glu Asn Pro Cys Pro Ser Asn Met Lys Cys Asn Arg Glu Thr Phe Lys.
Zgodnie z wynalazkiem określenia ciężaru cząsteczkowego „około 3000 (9000, 14000)” obejmują maksymalne odchylenie plus/minus ciężar cząsteczkowy 1000, korzystnie 500.
Ponadto wynalazek obejmuje także wymienione powyższe i poniższe sekwencje, w których nastąpiła wymiana aminokwasów przy zachowaniu zasadniczych właściwości biologicznych. Obejmuje to także odmiany, fragmenty, podjednostki, naturalnie występujące mutacje i przypadkowo wytworzone mutanty sztuczne. Obejmuje to również białka hybrydowe, takie jak białka fuzyjne pochodzące od ujawnionych peptydów'.
Polipeptyd według wynalazku posiada właściwości przeciwzakrzepowe i antytrombotyczne. Może on być zatem stosowany we wszelkich stanach klinicznych, w których zaburzone jest działanie układu krzepliwości. Do zastosowań tych należą leczenia zakrzepicy, udaru, zawału serca, zakrzepicy żyły głębokiej, niedrożności tętnic kończyn, zakrzepicy płucnej, zakrzepicy tętnic siatkówki oraz wszelkich innych zaburzeń trombotycznych. Ponadto inhibitor(y) trombiny mogą być stosowane u pacjentów ze sztucznymi przetokami tętniczo-żylnymi lub pacjentów poddawanych operacji omijającego przepływu wieńcowego. Polipeptydy według wynalazku mogą być również stosowane jako leki przeciwzakrzepowe w profilaktyce zakrzepicy lub reokluzji tętniz, do konserwacji krwi lub produktów krwiopochodnych oraz w pozaustrojowym krążeniu krwi lub osocza.
Oczyszczone polipeptydy według wynalazku czyli inhibitory trombiny wykazują czynność biologiczną porównywalną w zasadzie z hirudyną. Powinowactwo wiązania z trombiną (stała hamowania) jest nawet nieco zwiększone w porównaniu z hirudyną, która jest znana jako najsilniejszy dotychczas inhibitor trombiny.
Wynalazek dostarcza zatem polipeptydów zdefiniowanych powyżej do stosowania jako leku, zwłaszcza do leczenia in vivo schorzeń związanych z zakrzepicąoraz do hamowania agregacji płytek i tworzenia skrzepów krwi poza ustrojem.
Środek farmaceutyczny według wynalazku zawiera inhibitor trombiny lub polipeptyd, taki jak zdefiniowano powyżej, oraz dopuszczalny farmaceutycznie nośnik do leczenia schorzeń związanych z zakrzepicą wymienionych powyżej.
Szczegóły figur są objaśnione w przykładach 1 do 10.
Figura 1 przedstawia profil elucji antytrombiny z kolumny powinowacta (przykład 3). Fig. 2 analizę antytrombiny otrzymanej z T. tessulatum na żelu filtracyjnym Biogel P4 (przykład 4). Fig. 3 analityczną RP-HPLC frakcji pozytywnych z etapu powinowactwa (przykład 5). Fig. 4 - preparatywnąRP-HPLC frakcji pozytywnych z etapu powinowactwa (przykład 5). Fig. 5 - porównanie hirudyny i inhibitora według wynalazku na HPLC (przykład 6). Fig. 6 - powtórną chromatografię aktywnego piku 2 z RP-HPLC (przykład 7). Fig. 7 - widmo masowe aktywnego piku 2 z RP-HPLC (przykład 7). Fig. 8 - ślad IEF aktywnego piku 2 z RP-HPLC (przykład 7). Fig. 9 - powtórną chromatografię aktywnego piku 4 z RP-HPLC (przykład 9). Fig. 10 - widmo masowe aktywnego piku 4 z RP-HPLC (przykład 9).
Oczyszczone polipeptydy według wynalazku mogąbyć wyizolowane i oczyszczone z tkanek lub wydzielin pijawek rzędu Rhynchobdellida, korzystnie rodziny Theromyzon. Z pijawek rodziny Theromyzon otrzymywane są inhibitory trombiny o podobnej czynności i tylko niewielu różnicach. Przykładami odpowiednich gatunków rodziny Theromyzon są T. binannulatum, T. cooperi, T. garjaewi, T. maculosum, T. mollissimum, T. pallens, T. propinquum, T. rude, T. sexoculatum, a zwłaszcza T. tessulatum.
179 215
Korzystnie jako źródło zgodnie z wynalazkiem stosuje się gruczoły ślinowe pijawek. Jednakże ponieważ wypreparowanie gruczołów ślinowych wymaga wiele wysiłku, a także nie można uniknąć przy tym znacznych strat materiału, możliwe jest stosowanie jako źródła głów lub przednich przyssawek pijawek.
Typowo pierwszy etap sposobu polega korzystnie na tym, że tkanki pijawek zamrażą się i/lub liofilizuje, po czym poddaje się homogenizacji, którą typowo prowadzi się w acetonie lub mieszaninach aceton/woda. Jednakże do usunięcia składników nierozpuszczalnych w wodzie można stosować inne polarne rozpuszczalniki organiczne. Ponadto korzystnie wyciąg otrzymany w etapie pierwszym poddaje się odwirowaniu, a następnie chromatografii powinowactwa w celu usunięcia zbędnych resztek komórek. Korzystnie w chromatografii powinowactwa stosuje się kolumnę z „trombinowymi miejscami aktywnymi”. Określenie „trombinowe miejsca aktywne” oznacza tu obecność na kolumnie miejsc trombinowych, z którymi inhibitor trombiny może się wiązać. Przykładami trombinowych miejsc aktywnych są^m^mobilizowana natywna lub dezaktywowana trombina, również pokrewne trombinie peptydy, peptydomimetyki lub inne pochodne trombiny. Zgodnie z wynalazkiem trombinę lub wymienione pochodne trombiny immobilizuje się na matrycy aktywnego żelu, korzystnie przez reakcję znanymi metodami z grupąazlaktonową wspomnianej matrycy żelu. Następnie chromatografię powinowactwa przeprowadza się za pomocą standardowych technik.
Korzystnie chromatografię powinowactwa stosuje się razem z chromatografią żelową.
Matryca żelowa ma zgodnie z wynalazkiem granicę ekskluzji około 5000, pozwala zatem na frakcjonowanie w zakresie około 1000 i 5000.
Korzystnie wyizolowane wyciągi antytrombinowe poddaje się następnie dalszemu oczyszczaniu za pomocąHPLC z odwróconymi fazami. Opisane powyżej fragmenty polipeptydów są uzyskiwalne przez oczyszczanie wyizolowanych wyciągów za pomocąRP-HPLc. Przykładami odpowiednich materiałów do fazy odwróconej sążele krzemionkowe modyfikowane podstawnikami alifatycznymi C2-C18. Jednakże polipeptydy według wynalazku mogąbyć oczyszczane za pomocą innych dobrze znanych procedur chromatograficznych. Szczegóły oczyszczania za pomocą HPLC są podane w przykładach.
Aktywność inhibitorów trombiny w wyciągach oraz w poszczególnych frakcjach z etapu oczyszczania może być zmierzona in vitro przy zastosowaniu pomiaru przedłużenia czasu krzepnięcia (F. Markwardt: Meth. Enz., 19,924-932,1970) lub zmniejszenia rozszczepiania specyficznego dla trombiny substratu chromogenicznego, takiego jak octan tosyloghcylo-piOlllo-arginino-4-nitroanilidu (Chromozym TH, Boehringer Mannheim), jak opisano (H. U. Bergmeyer: Meth. Enz. Anal., 3 wydanie, wol. 5, 365-394,1988).
Jak wskazano powyżej, polipeptydy według wynalazku są odpowiednie jako związki skuteczne farmaceutycznie w kompozycjach i kombinacjach farmaceutycznych.
Preparaty farmaceutyczne według wynalazku mogą ewentualnie zawierać dodatkowe składniki czynne, jak czynniki przeciwzakrzepowe takie jak hirudyna lub heparyna lub czynniki trombolityczne, takie jak aktywator plazminogenu lub hementyna.
Nowe polipeptydy i inhibitory trombiny według wynalazku mogą tworzyć dopuszczalne farmaceutycznie sole z dowolnym nietoksycznym kwasem organicznym lub nieorganicznym. Kwasami nieorganicznymi są na przykład kwas chlorowodorowy, bromowodorowy, siarkowy lub fosforowy oraz kwasowe sole metali, takie jak wodoroortofosforan sodowy i wodorosiarczan potasowy. Przykładami kwasów organicznych są kwasy mono-, di-1 trika^loc^l^.ss/l<^lwe, takie jak kwas octowy, glikolowy, mlekowy, pirogronowy, malonowy, bursztynowy, glutarowy, fumarowy, jabłkowy, winowy, cytrynowy, askorbinowy, maleinowy, hydroksymaleinowy, benzoesowy, hydroksybenzoesowy, fenylooctowy, cynamonowy, salicylowy i kwasy sulfonowe, takie jak kwas metanosulfonowy. Sole ugrupowania karboksylowego końcowego aminokwasu obejmują nietoksyczne sole kwasu karboksylowego, utworzone z dowolnymi zasadami nieorganicznymi lub organicznymi. Sole te obejmująna przykład sole metali alkalicznych, takich jak sód i potas, metali ziem alkalicznych, takich jak wapń i magnez, metali lekkich grupy IIIA, w tym glinu, oraz pierwszorzędowych, drugorzędowych i trzeciorzędowych amin organicznych, takich jak trialki179 215 loaminy, w tym trietyloamina, prokaina, dibenzyloamina, 1-etenoamina, N,N'-dibenzyloetylenodiamina, dihydroabietyloamina i N-alkilopiperydyna.
Stosowane tu określenie „dopuszczalny farmaceutycznie nośnik” oznacza obojętny, nietoksyczny stały lub ciekły wypełniacz, rozcieńczalnik lub materiał kapsułkujący, nie oddziaływujący w sposób niepożądany na związek czynny lub pacjenta. Odpowiednie, korzystne nośniki ciekłe są dobrze znane ze stanu techniki, takie jak jałowa woda, solanka, wodny roztwór dekstrozy, roztwory cukrów, etanol, glikole i oleje, w tym pochodzenia naftowego, roślinnego, zwierzęcego lub syntetycznego, na przykład olej arachidowy, olej sojowy i olej mineralny.
Środki według wynalazku mogąbyć podawane w dawkachjednostkowych, zawierających zwykłe, nietoksyczne, dopuszczalne farmaceutycznie nośniki, rozcieńczalniki, adiuwanty i podłoża, typowe dla podawania pozajelitowego.
Określenie „pozajelitowy” oznacza tu techniki iniekcji i infuzji podskórnych, dożylnych, dostawowych i dotchawiczych. Odpowiednie są także inne drogi podawania, takie jak podawanie doustne i miejscowe. Kompozycje i kombinacje pozajelitowe najkorzystniej podaje się dożylnie albo w postaci wlewu lub w postaci ciągłej infuzji zgodnie ze znanymi procedurami.
Tabletki i kapsułki do podawania doustnego zawierają zwykłe środki pomocniczne, takie jak środki wiążące, wypełniacze, rozcieńczalniki, środki tabletkujące, środki smarujące, środki rozsadzające i zwilżające. Tabletki mogąbyć powlekane sposobami dobrze znanymi ze stanu techniki.
Płynne preparaty doustne mogą mieć postać zawiesin, roztworów, emulsji, syropów lub eliksirów wodnych łub oleistych, lub mogą mieć postać suchego produktu do roztwarzania przed użyciem wodą lub innym odpowiednim wehikulum. Takie płynne preparaty mogą zawierać typowe dodatki, jak środki utrzymujące w zawiesinie, środki emulgujące, podłoża niewodne i konserwanty.
Preparaty miejscowe mogą mieć postać wodnych lub olejowych zawiesin, roztworów, emulsji, galaretek lub korzystnie maści emulsyjnych.
Dawki jednostkowe według wynalazku mogą zawierać wymagane dzienne ilości białka według wynalazku lub ich podwielokrotności tworzące żądaną dawkę. Optymalna dopuszczalna terapeutycznie dawka i sposób dawkowania danemu pacjentowi (ssaki, w tym ludzie) zależy od różnych czynników, takich jak aktywność szczególnego zastosowanego materiału, wiek, ciężar ciała, zdrowie ogólne, płeć, dieta, czas i droga podawania, szybkość usuwania, cel terapii, to jest leczenie lub profilaktyka oraz rodzaj leczonej choroby zakrzepowej, czynności przeciwpłytkowej lub przeciwzakrzepowej.
Zatem w kompozycjach i kombinacjach użytecznych jako środki przeciwzakrzepowe u leczonego pacjenta (in vivo) efektywna farmaceutycznie dawka dzienna peptydów według wynalazku jest równa między około 0,01 a 100 mg/kg wagi ciała, korzystnie między 0,1 a 10 mg/kg wagi ciała. Zależnie od postaci podawania jedna pojedyncza dawka może zawierać między 0,5 a 10 mg inhibitora trombiny. Efektywna farmaceutycznie dawka dla uzyskania efektu przeciwzakrzepowego w krwi poza ustrojem jest równa między 0,2 a 150 mg/l, korzystnie między 1 mg a 200 mg/l krwi poza ustrojem.
W oparciu o oczyszczony polipeptyd według wynalazku można skonstruować implantowalne lub pozaustrojowe urządzenie medyczne do stosowania w kontakcie z płynami ustrojowymi, którego powierzchnia jest powleczona immobilizowanym polipeptydem zdefiniowanym powyżej oraz w zastrzeżeniach, w celu nadania powierzchni tego urządzenia znacznej odporności na krzepnięcie. Polipeptyd według wynalazkujest immobilizowany na urządzeniu medycznym tak, aby nadać powierzchni biokompatybilność i odporność na krzepnięcie. Takie urządzenia niekiedy mają zwilżalne powierzchnie, które zwykle indukująagregację płytek, co jest niekorzystne w ich zamierzonych zastosowaniach w urządzeniach implantowalnych i pozaustrojowych w kontakcie z krwią lub innymi płynami ustrojowymi. Przykładami takich urządzeń, które są zwykle wykonane z materiałów plastikowych i włókien syntetycznych są protezy, sztuczne narządy, bandaże, sztuczne segmenty naczyń, katetery, dializatory, rurki i naczynia do przenoszenia krwi.
Wynalazek zostanie dalej zilustrowany w odniesieniu do poniższych przykładów, które służą do zilustrowania wynalazku i nie ograniczają jego zakresu.
179 215
Przykład I
Wykazanie obecności antytrombiny w T. tessulatum
Dziesięć główek Theromyzon tessulatum zhomogenizowano w izotonicznej solance. Homogenizat krótko wirowano w celu usunięcia zawieszonych cząstek, a supernatant zachowano w celu przeprowadzenia poniższego testu antytrombinowego oraz innych wskazanych testów hematologicznych.
W celu oszacowania aktywności antytrombinowej 20 gl powyższego wyciągu zmieszano z 10 gl trombiny (1 j.). Do tej mieszaniny dodano 100 gl roztworu fibrynogenu o stężeniu 0,5 mg/ml, następnie wymieszano i inkubowano przez 1 minutę w 37°C. Dalsze szczegóły tego testu opisali R. T. Sawyer i współpr. (Comp. Haematol. Int., 1,35-41,1991). W poniższej tabeli zestawiono hamowanie in vitro parametrów krzepnięcia przez surowe wyciągi z Theromyzon tessulatum:
Tabela 1
Wykazanie obecności aktywności antytrombiny w T. Tessulatum
| Normalne kontrole [sekundy] | Surowy wyciąg [sekundy] | |
| Czas protrombiny (zewnętrzny) | 15 | 42 |
| Aktywowany PTT (wewnętrzny) | 40 | 220 |
| Czas trombiny (antytrombina) | 45 | >600 |
| Czas reptilazy | 20 | 20 |
Z powyższych danych widoczne jest, że region głowy 'Theromyzon tessulatum zawiera rozpuszczalny w wodzie czynnik lub czynniki, które znacznie przedłużajączas krzepnięcia trombiny.
Przykład II
Chromogeniczny test hamowania trombiny i czynnika Xa
a) Hamowanie trombiny gl roztworu trombiny (5 NIH-U trombiny/ml 250 mM buforu fosforanowego zawierającego 0,05% PEG 6000, pH 6,5) preinkubowano przez 5 minut w temperaturze pokojowej z 880 gl buforu do oznaczania trombiny (100 mM Tris-HCl, 200 mM NaCl, 0,05% PEG, pH 8,3) w kuwecie fotometrycznej. Reakcję rozpoczęto przez dodanie 100 gl roztworu substratu (4 mg Chromozymu TH z Boehringer Mannheim, Niemcy, rozpuszczone w 5 ml H2O) i odczytywano przez 5 minut absorpcję w 25°C przy 405 nm z trwającymi 30 sekund interwałami.
W celu zmierzenia aktywności hamowania próbkę 10-200 gł lub hirudynę jako wzorzec zmieszano z 20 gl roztworu trombiny i dopełniono do łącznej objętości 900 gl buforem do oznaczeń. Mieszaninę tę preinkubowano przez 5 minut w temperaturze pokojowej i rozpoczęto reakcję przez dodanie 100 gl roztworu substratu.
b) Hamowanie czynności czynnika Xa gl roztworu czynnika Xa (10 j/0,5 ml rozcieńczone do 2,0 ml H2O) preinkubowano przez 5 minut w temperaturze pokojowej z 880 gl buforu do oznaczeń czynnika Xa (100 mM Tris-HCl, 200 mM NaCl, 0,05% PEG, pH 8,3) w kuwecie fotometrycznej. Reakcję zapoczątkowano przez dodanie 100 gl roztworu substratu (3,5 mg Chromozymu X, Boehringer Mannheim, rozpuszczono w 5 ml H2O) i odczytywano przez 5 minut w odstępach 3 0-sekundowych absorpcję przy 405 nm w temperaturze pokojowej.
W celu zmierzenia czynności hamującej próbkę 10-200 gl zmieszano z 20 gl roztworu czynnika Xa i dopełniono buforem do oznaczeń do objętości całkowitej 900 gl. Mieszaninę tę preinkubowano przez 5 minut w temperaturze pokojowej i zapoczątkowano reakcję przez dodanie 100 gl roztworu substratu.
179 215
Przykład III
Oczyszczanie inhibitora trombiny z Theromyzon tessulatum
Etap 1
Przednie przyssawki Theromyzon tessulatum karmionych przez 1000 sekund natychmiast zamrożono w -70°C i liofilizowano. Do materiału tego dodano 35 ml 40% acetonu i homogenizowano zawiesinę w ultra-toraksie 3 razy za każdym razem po po 10 sekund. Poddano obróbce w somkatorze przez 2 minuty, po czym przeprwadzono dodatkowy etap homogenizacji (30 sekund). Homogenizat wirowano przez 15 minut przy 6000 rpm, a utworzony supematant zachowano (S1).
Do peletki 1 dodano następne 35 ml 40% acetonu i przeprowadzono drugą homogenizację (1x10 sekund; 2 minuty sonikacji, 1 x 30 sekund). Homogenizat ponownie wirowano przez 15 minut przy 6000 rpm. Supematant 2 dodano do zachowanego supematanta 1, a do połączonych supernatantów dodano 80% aceton (v/v).
pH ustawiono na 4,0 za pomocą kwasu octowego, a uzyskaną zawiesinę wirowano przez 20 minut przy 6000 rpm. Peletkę 3 odrzucono. Supematant 3 zatężono 4-krotnie za pomocą wyparki próżniowej (Speed Vac).
Obecność aktywności antytrombinowej w wyciągu bezacetonowym wykazano za pomocą testu krzepnięcia według przykładu I oraz testu chromogenicznego według przykładu U.
Etap 2
Wyciąg bezacetonowy naniesiono na kolumnę PD-10 (Pharmacia) do wymiany buforowej . Kolumnę zrównoważono buforem powinowactwa (20 mM Tris-HC'l, 50 mM NaCl. pH 7,4) i naniesiono na nią2,5 ml wyciągu z etapu 1. Eluat testowano na obecność aktywności antytrombinowej.
Kolumnę powinowactwa z trombinąprzygotowano w następujący sposób.
400 mg suchej matrycy Azlacton Tentacle Fractogel (E. Merck, Darmstadtd, Niemcy) zawieszono na 2 godziny w temperaturze pokojowej w 7 ml buforu do sprzęgania (50 mM fosforan, 150 mM NaCl, pH 7,5). Zawiesinę przemyto dwukrotnie przez wirowanie i ponowne zawieszenie w buforze do sprzęgania. 500 NIH-U trombiny bydlęcej (Sigma) rozpuszczono w 1 ml H2O i ustawiono pH na 7,5. Ten roztwór trombiny zrównoważono z buforem do sprzęgania za pomocą żelu filtracyjnego PD-10. Do zrównoważonego roztworu trombiny dodano siarczan sodu do osiągnięcia końcowego stężenia 1M. Na zaktywowany żel matrycy naniesiono natychmiast pipetką białko trombiny i umożliwiono sprzęganie przez 3 godziny w 4°C przy lekkim mieszaniu. Przemyto trzykrotnie 5 objętościami buforu do sprzęgania za każdym razem. W celu dezaktywacji matrycy dodano 1,5 ml etanoloaminy i pozostawiono na noc w 4 °C przy lekkim wstrząsaniu. Matrycę przemyto dwukrotnie 5 objętościami buforu octanowego (100 mM octanu sodu, 500 mM NaCl, pH 4,0). Końcowe zrównoważenie przeprowadzono przez dwukrotne przemycie 5 objętościami buforu powinowactwa.
Aktywne eluaty z kolumny PD-10 naniesiono na kolumnę powinowactwa za pomocą pompy perystaltycznej (przepływ 10 ml/h). Zebrano niezwiązanąfrakcję i przemyto kolumnę 12 ml bufom powinowactwa (przemywka 1). Eluowano 6 ml bufom octanowego o pH 4,0 i zbierano frakcje o objętości 0,5 ml. Profil elucji z tej kolumny przedstawiono na fig. 1.
Po pierwszej elucji przeprowadzono drugi etap elucji, stosując 6 ml bufom octanowego o pH 3,0. Zbierano frakcje po 1,5 ml. Kolumnę ponownie zrównoważono 25 ml bufom powinowactwa.
Wyniki ekstrakcji i etapu chromatografii powinowactwa zestawiono poniżej w tabeli 2.
179 215
Tabela 2
Wyniki oczyszczania inhibitora trombiny z Theromyzon tessulatum za pomocą chromatografii powinowactwa
| Frakcja | Objętość [ml] | Czas krzepnięcia [sek] | Inhibitor trombiny [j. m.] | Inhibitor czynnika Xa [j. m.] |
| Ślepa | - | 20,5 | 0 | 0 |
| aceton | 34 | 59,4 | 33 | nie ozn. |
| wyciąg niezwiązany w chr. pow. | 34 | 24;3 | 1,8 | 1,1 |
| przemywka 1 | 24 | 20,2 | 1,6 | 1,0 |
| eluat 1 z chr. pow. | 4 | >600 | 25 | 0,2 |
| eluat 2 z chr. pow. | 4 | 22,1 | 0 | 0 |
chr. pow. = chromatografia powinowactwa
Przykład IV
Analiza aktywnego inhibitora trombiny z Theromyzon tessulatum za pomocą chromatografii żelowej
Aktywny materiał naniesiono na kolumnę do chromatografii żelowej Biogel P4 (Biorad) o objętości 25 ml. Elucję prowadzono za pomocą20 mM Tris-HCl, 40 mM NaCl, pH 7,4, przy prędkości przepływu 4 ml/godz. Frakcje o objętości 1 ml testowano na obecność aktywności antytrombinowej.
Matryca żelowa P4 posiada granicę ekskluzji 5000 D i pozwala na frakcjonowanie w zakresie ciężaru cząsteczkowego 1000 do 5000 D. Nieoczekiwanie stwierdzono, że aktywność antytrombinowa eluuje w objętości frakcjonowania, to jest ma pozorny ciężar cząsteczkowy poniżej 5000 D (fig. 2). Zachowanie to stoi w kontraście z zachowaniem hirudyny (ciężar cząsteczkowy 7000 D), która w tych samych warunkach pojawia się w objętości pustej. Na podstawie kalibracji kolumny P4 wyliczono, że ciężar cząsteczkowy aktywności antytrombinowej z Theromyzon tessulatum wynosi około 3000 D.
Przykład V
HPLC z odwróconymi fazami oczyszczonego inhibitora trombiny z Theromyzon tessulatum
Po etapie chromatografii powinowactwa według przykładu III aktywne eluaty analizowano dalej za pomocą RP-HPLC. Próbkę o objętości 20 pl wstrzykiwano na kolumnę HPLC (LiChrospher 300 RP-18, 5 pm; E. Merck. Darmstadt, Niemcy) i eluowano poniższym gradientem acetonitrylu z szybkością 1,0 ml/min:
Bufor A: 0,1% kwas trifuorooctowy w H2O
Bufor B: 0,08% kwas trifluorooctowy w acetonitrylu
Gradient: 0-2 minuty 10% B
2- 3 minuty wstrzyknięcie
3- 28 minut 60% B
Figura 3 obrazuje typowy chromatogram analityczny zarejestrowany przy 220 nm. Aktywność hamowania trombiny wykryto w pikach oznaczonych jako pik 2 i pik 4. Informacja z analitycznej HPLC została następnie wykorzystana do przeprowadzenia w tych samych warunkach rozdziałów preparatywnych.
Oczyszczanie preparatywne prowadzono na próbkach z chromatografii powinowactwa o objętości 500 pl (fig. 4). Poszczególne piki zbierano, łączono i zatężano przez odparowanie próżniowe w Speed Vac. Wysuszone frakcje roztwarzano w H2O i oznaczano w nich aktywność antytrombinową, stosując test czasu krzepnięcia, jak również test chromogeniczny, opisane w przykładzie II.
W obu układach testowych aktywności wykrywano głównie w pikach 2 i 4, znajdując pewną aktywność również w piku 5, co najprawdopodobniej jest odzwierciedleniem zanieczyszczenia materiału piku 5 pikiem 4. Wszystkie pozostałe piki z chromatogramu nie wykazywały
179 215 wcale aktywności antytrombinowej. Suma aktywności pików 2 i 4 stanowiła około 93% aktywności całkowitej.
Przykład VI
Porównanie inhibitora trombiny według wynalazku z hirudyną za pomocą HPLC
W celu dalszego wykazania, że inhibitor według wynalazku jest cząsteczką różniącą się fundamentalnie od hirudyny, przeprowadzono poniższy eksperyment. Do aktywnego piku 2 po HPLC zgodnie z przykładem V dodano oczyszczoną hirudynę o podobnym stężeniu białka i mieszaninę poddano RP-HPLC w gradiencie acetonitrylu (40-70%). Otrzymano dwa piki, zawierające aktywność antytrombinową (fig. 5). Na podstawie eksperymentów porównawczych, w których wstrzykiwano pojedyncze inhibitory, można dokonać przypisania pików takjak wskazano na fig. 5.
Z figury 6 wynika wyraźnie, że antytrombina według wynalazku eluuje w pozycji bardzo różnej od pozycji hirudyny. To samo można wykazać dla aktywnego piku 4 po rozdziale HPLC zgodnie z przykładem 5.
Przykład VH:
Dalsze scharakteryzowanie piku 2 posiadającego aktywność antytrombiny
Czystość
Połączony aktywny pik z RP-HPLC poddano ponownej chromatografii w tych samych warunkach jak chromatografia na fig. 3. Jak pokazano na fig. 6, z głównego piku aktywnego można jeszcze po drugiej RP-HPLC wydzielić niewielką ilość materiału zanieczyszczającego, uzyskując preparat homogenny (patrz również fig. 8, która przedstawia elektroforezę kapilarną tej frakcji).
Hamowanie trombiny
Pik 2 z RP-HPLC okazał się aktywny w teście krzepnięcia (czas trombiny > 600 sek./5 pl), jak również w chromogenicznym teście antytrombinowym według przykładu II. Aktywność w teście chromogenicznym wynosiła 3,2 j. m./250 pl. Stosuj ąc test opisany w przykładzie II nie można było wykryć aktywności hamowania czynnika Xa w piku 2, który wykazywał maksymalną aktywność anty-Xa<<1% aktywności antytrombiny. Wyciągnięto zatem wniosek, że ujawniony tu inhibitor jest wysoce specyficzny w stosunku do trombiny.
Miareczkowanie miejsc aktywnych
Stałą hamowania trombiny oznaczono przez spektrofluorometryczne miareczkowanie inhibitorem według wynalazku standaryzowanego roztworu trombiny. Szczegóły metody opisane są przez G. W. Jamesona i współpr. (Biochem. J., 131, 107-117, 1973).
Skrótowo, w eksperymentach miareczkowania użyto fluorogenicznego substratu TosGly-Pro-Arg-AMC w stężeniu 50 μΜ. Testy prowadzono w buforze 100 mM Tris-HCl, 200 mM NaCl, 0,05% PEG 600, pH 7,8, w 25°C. Ludzkąa-trombinę z oznaczonymi miejscami aktywnymi w stężeniu 20 pM inkubowano przez 10 minut z inhibitorem przy 0,2-5 x Eo i po dodaniu substratu mierzono prędkości ustalone. Stałe kinetyczne oznaczano stosując program analizy regresji nieliniowej GraFit (R. J. Leatherbarrow, Erithacus Software, Staines, Wielka Brytania, 1980). Wyliczono, że Kj jest równa 178 fentomoli.
Ciężar cząsteczkowy
Ciężar cząsteczkowy aktywnego piku 2 oznaczono za pomocą spektrometrii masowej z desorpcją laserową, stosując metodąMALDI-TOF (Kratos). 0,5 μ! próbki zmieszano z kilkoma μ] kwasu dihydroksybenzoesowego w acetonitrylu, który służył jako matryca. Mieszaninę wysuszono pod zimnym powietrzem na srebrnym uchwycie do próbek i umieszczono w aparacie. Uzyskane widmo masowe kalibrowano białkami wzorcowymi o znanym ciężarze cząsteczkowym. Pik odpowiadał masie cząsteczkowej około 9000D (fig. 7).
Ogniskowanie izoelektryczne
Punkt izoelektryczny inhibitora mierzono za pomocąelektroforezy kapilarnej w trybie IEF (Applied Biosystems). Jak widać z fig. 8, pik inhibitora wystąpił przy pl 4,9 w porównaniu z białkami wzorcowymi.
179 215
Przykład VIII
Sekwencja piku 2 posiadającego aktywność antytrombiny
Dla piku 2 z RP-HPLC (przykład V) otrzymano za pomocą standardowej chemii degradacji edmana na sekwencjonerze peptydowym Beckmanna następującą sekwencję N-końcową:
Glu Asp Asp Asn Pro Gly Pro Pro Arg Ala Cys Pro Gly Glu
Przykład IX
Dalsze charakteryzowanie piku 4 posiadającego aktywność antytrombiny
Czystość
Połączony aktywny pik 4 z RP-HPLC poddano ponownej chromatografu w tych samych warunkach. Jak pokazano na fig. 9, z głównego piku aktywnego można nadal wydzielić pewną ilość materiału zanieczyszczającego, otrzymując po drugiej HPLC preparat homogenny.
Hamowanie trombiny
Pik 4 z RP-HPLC był aktywny w teście krzepnięcia (czas trombiny > 600 sek./5 pl), jak również w chromogenicznym teście antytrombinowym według przykładu II. Aktywność w teście chromogenicznym wynosiła 1,3 j. m./250 pl. W piku 2 przy użyciu testu opisanego w przykładzie II nie można było wykryć aktywności hamowania czynnika Xa, co odzwierciedla maksymalna aktywność anty-Xa«1°% aktywności antytrombinowej. Wyciągnięto zatem wniosek, że ujawniony tu inhibitor jest wysoce specyficzny w stosunku do trombiny.
Miareczkowanie miejsc aktywnych
Stała hamowania trombiny została oznaczona za pomocą miareczkowania spektrofluorometrycznego standaryzowanego roztworu trombiny inhibitorem według wynalazku. Szczegóły metody podano w przykładzie VII. Zmierzona wartość K1 była równa 240 fentomoli.
Ciężar cząsteczkowy
Ciężar cząsteczkowy aktywnego piku 4 oznaczono za pomocą spektrometrii masowej z desorpcją laserem, stosując metodę MALDI-TOF (Kratos), opisaną w przykładzie VII. Uzyskane widmo masowe kalibrowano za pomocąwzorcowych białek o znanym ciężarze cząsteczkowym. Pik odpowiadał masie cząsteczkowej około 14 kD (fig. 10).
Przykład X
Sekwencja piku 4, posiadającego aktywność antytrombinową
Dla piku 4 z HPLC (przykład V) otrzymano za pomocą standardowej chemii degradacji edmana na sekwencjonerze peptydowym Beckmanna następującą sekwencję N-końcową:
Ser Glu Leu Gly Gln Ser Cys Ser Lys Glu Asn Pro Cys Pro Ser Asn Met Lys Cys Asn Arg Glu Thr Phe Lys
Przykład XI
Stosując taką samą procedurę jak procedura opisana w przykładach I-V można wyizolować polipeptydy posiadające aktywność antytrombiny z następujących gatunków Theromyzon:
T. binannulatum
T. cooperi
T. garjaewi
T. maculosum
T. sexoculatum
179 215
WYKAZ SEKWENCJI (1) INFORMACJA OGÓLNA (i) ZGŁASZAJĄCY (A) NAZWA: Merck Patent GmbH (B) ULICA: Frankfurter Str. 250 (C) MIASTA; Darmstadt (E) KRAJ: Republika Federalna Niemiec (F) KOD POCZTOWY (ZIP): 64271 (G) TELEFON: 06151-727022 (H) TELEFAX: 06151-727191 (ii) TYTUŁ WYNALAZKU: Inhibitory trombiny (iii) LICZBA SEKWENCJI: 2 (IV) FORMA CZYTANA PRZEZ KOMPUTER (A) RODZAJ NOŚNIKA: Dyskietka (B) KOMPUTER: kompatybilny z IBM PC (C) SYSTEM OPERACYJNY: PC-DOS/MS-DOS (D) OPROGRAMOWANIE: Patentln Release #1.0, Version #1.25 (EPO) (2) INFORMACJE DOTYCZĄCE SEKWENCJI O NUMERZE IDENTYFIKACYJNYM: 1 (i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 14 aminokwasów (B) TYP: aminokwasowa (C) STRUKTURA NICIOWA: jednoniciowa (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: peptyd (IV) ŹRÓDŁO POCHODZENIA:
(B) SZCZEP: Theromyzon tessulatum
179 215 (F) TYP TKANKI: gruczoł ślinowy (xi) OPIS SEKWENCJI: sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 1:
Glu Asp Asp Asn Pro Gly Pro Pro Arg Ala Cys Pro Gly Glu
10 (2) INFORMACJE DOTYCZĄCE SEKWENCJI O NUMERZE IDENTYFIKACYJNYM: 2:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 25 aminokwasów (B) TYP: aminokwasowa (C) STRUKTURA NICIOWA: jednoniciowa (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: peptyd (iii) PRZYPUSZCZALNY: Numer (iii) ANT^TSENSOWNY: Nnmer (v) TYP FRAGMENTU: N-terminalny (vi) ŹRÓDŁO POCHODZENIA:
(B) SZCZEP: theromyzon tessulatum (F) TYP YKANKI:: grugzoł sl inovn (ix) CECHA:
(A) NAZWA/KLUCZ: Peptyd (B) ROZMIESZCZENIE: 1..24 (D) INNE INFORMACJE: /znak= N-terminalny fragment polipeptydu o mmsse cząsttezkowej 14KD/ (xi) OPIS SEKWENCJI: SErwencjy o niwrze identyfikacyjnym: 2:
Ser Glu Leu Gly Gln Ser Cys Ser Lys Glu Asn Pro Cys Pro Ser Asn 15 10 15
Met Lys Cys Asn Arg Glu Thr Phe Lys 20 25
179 215
179 215 αο
Fig.3
179 215
Fig. 6
179 215
Fig.7
<im_et md
Fig. 8 pl - Wzorce
179 215
Fig. 9
Fig. 10
Ciężar cząsteczkowy [D]
179 215 +++
Fig.1 π ΓΊ + = aktywność antytrombiny
OD=280 nm ml /godzina
NaOAc pH4 0
Fig. 2
Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 70 egz.
Cena 4,00 zł.
Claims (6)
- Zastrzeżenia patentowe1. Oczyszczony polipeptyd posiadający aktywność hamowania trombiny izolowany z tkanek lub wydzieliny pijawek rzędu Rhynchobdellida, korzystnie gatunku Theromyzon tessulatum, posiadający ciężar cząsteczkowy około 9000 i N-końcową sekwencję aminokwasów·': Glu Asp Asp Asn Pro Gly Pro Pro Arg Ala Cys Pro Gly Glu.
- 2. Oczyszczony polipeptyd posiadający aktywność hamowania trombiny izolowany z tkanek lub wydzieliny pijawek rzędu Rhynchobdellida, korzystnie gatunku Theromyzon tessulatum, posiadający ciężar cząsteczkowy około 14000 i N-końcową sekwencję aminokwasów: Ser Glu Leu Gly Gln Ser Cys Ser Lys Glu Asn Pro Cys Pro Ser Asn Met Lys Cys Asn Arg Glu Thr Phe Lys.
- 3. Sposób wytwarzania oczyszczonego polipeptydu posiadającego aktywność hamowania trombiny oraz posiadającego ciężar cząsteczkowy około 9000 kD i N-końcową sekwencję aminokwasów: Glu Asp Asp Asn Pro Gly Pro Pro Arg Ala Cys Pro Gly Glu, i polipeptydu posiadającego ciężar cząsteczkowy około 14000 i N-końcową sekwencję aminokwasów: Ser Glu Leu Gly Gln Ser Cys Ser Lys Glu Asn Pro Cys Pro Ser Asn Met Lys Cys Asn Arg Glu Thr Phe Lys, znamienny tym, że homogenizuje się tkanki lub wydzieliny pijawek rzędu Rhynchobdellida, korzystnie gatunku Theromyzon tessulatum, przygotowuje się frakcję zawierającą rozpuszczalne w wodzie składniki oraz oczyszcza się tą frakcję za pomocą chromatografii powinowactwa specyficznej w stosunku do trombiny, a po niej co najmniej jednego etapu chromatografii żelowej i co najmniej jednego etapu HPLC z odwróconymi fazami.
- 4. Sposób według zastrz. 3, znamienny tym, że homogenizuje się przednie przyssawki zamrożonych lub liofilizowanych pijawek wodą/acetonem.
- 5. Sposób wytwarzania wyciągu posiadającego aktywność hamowania trombiny, znamienny tym, że homogenizuje się tkankę lub wydzieliny pijawek rzędu Rhynchobdellida, korzystnie gatunku Theromyzon tessulatum, za pomocą woda/aceton i sporządza frakcję zawierającą składniki rozpuszczalne w wodzie.
- 6. Środek farmaceutyczny zawierający polipeptyd i farmaceutycznie dopuszczalny nośnik, znamienny tym, że jako polipeptyd zawiera oczyszczony polipeptyd posiadający aktywność hamowania trombiny izolowany z tkanek lub wydzieliny pijawek rzędu Rhynchobdellida, korzystnie gatunku Theromyzon tessulatum, przy czym polipeptyd ten został wybrany spośród polipeptydu posiadającego ciężar cząsteczkowy około 9000 i N-końeowąsekwencję aminokwasów···: Glu Asp Asp Asn Pro Gly Pro Pro Arg Ala Cys Pro Gly Glu, albo polipeptydu posiadającego ciężar cząsteczkowy około 14000 i N-końcowąsekwencję aminokwasów: Ser Glu Leu Gly Gln Ser Cys Ser Lys Glu Asn Pro Cys Pro Ser Asn Met Lys Cys Asn Arg Glu Thr Phe Lys.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| GB939309509A GB9309509D0 (en) | 1993-05-07 | 1993-05-07 | Thrombin inhibitors |
| PCT/EP1994/001404 WO1994026777A1 (en) | 1993-05-07 | 1994-05-03 | Thrombin inhibitors |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| PL307088A1 PL307088A1 (en) | 1995-05-02 |
| PL179215B1 true PL179215B1 (pl) | 2000-08-31 |
Family
ID=10735154
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| PL94307088A PL179215B1 (pl) | 1993-05-07 | 1994-05-03 | sposób wytwarzania wyciagu i srodek farmaceutyczny PL PL PL PL PL PL PL PL |
Country Status (22)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5583111A (pl) |
| EP (1) | EP0652900B1 (pl) |
| JP (1) | JP3537437B2 (pl) |
| KR (1) | KR100335536B1 (pl) |
| AT (1) | ATE208793T1 (pl) |
| AU (1) | AU682368B2 (pl) |
| CA (1) | CA2139652C (pl) |
| CZ (1) | CZ287794B6 (pl) |
| DE (1) | DE69429062T2 (pl) |
| DK (1) | DK0652900T3 (pl) |
| ES (1) | ES2167364T3 (pl) |
| GB (1) | GB9309509D0 (pl) |
| HU (1) | HU226243B1 (pl) |
| NO (1) | NO318017B1 (pl) |
| PL (1) | PL179215B1 (pl) |
| PT (1) | PT652900E (pl) |
| RU (1) | RU2138275C1 (pl) |
| SK (1) | SK282860B6 (pl) |
| TW (1) | TW369541B (pl) |
| UA (1) | UA43831C2 (pl) |
| WO (1) | WO1994026777A1 (pl) |
| ZA (1) | ZA943171B (pl) |
Families Citing this family (14)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| AU783087B2 (en) * | 1999-08-06 | 2005-09-22 | Genentech Inc. | Peptide antagonists of factor VIIA |
| GB9930659D0 (en) * | 1999-12-24 | 2000-02-16 | Bio Discovery Ltd | Inhibitors of complement activation |
| FR2834293B1 (fr) * | 2002-01-03 | 2005-02-04 | Ricarimpex | Extraits de sangsues a effet psychosomatique |
| US7164002B2 (en) | 2002-02-06 | 2007-01-16 | Genentech, Inc. | FVIIa antagonists |
| JP2009510105A (ja) | 2005-09-28 | 2009-03-12 | バイオバスキュラー インコーポレーティッド | 血小板および細胞の接着、細胞移動、および炎症を阻止するための方法および組成物 |
| US20110034396A1 (en) * | 2005-09-28 | 2011-02-10 | Biovascular, Inc. | Methods and compositions for inhibiting cell migration and treatment of inflammatory conditions |
| CN101095697A (zh) * | 2006-06-28 | 2008-01-02 | 李振国 | 水蛭和/或地龙分子量5800道尔顿以下的提取物 |
| RU2366441C2 (ru) * | 2007-08-03 | 2009-09-10 | Государственное учреждение гематологический научный центр Российской академии медицинских наук (ГУ ГНЦ РАМН) | Антикоагулянтное средство на основе биологически активного комплекса из коры кедра сибирского |
| TWI540132B (zh) * | 2009-06-08 | 2016-07-01 | 亞培公司 | Ｂｃｌ-２族群抑制劑之口服醫藥劑型 |
| RU2519741C2 (ru) * | 2012-06-25 | 2014-06-20 | Общество с ограниченной ответственностью Научно-внедренческая фирма "Гируд И.Н." (ООО НВФ "Гируд И.Н.") | Фармацевтическая композиция, обладающая противотромботическим, тромболитическим, иммуномодулирующим, противовоспалительным действиями, нормализующая липидный и углеводный обмен |
| US8784896B2 (en) | 2012-09-17 | 2014-07-22 | Biopep Solutions, Inc | Antioxidant therapy with a whole, leech saliva extract |
| CN108395475B (zh) * | 2018-03-29 | 2021-09-10 | 苏州至汇生物科技有限公司 | 一种基于亲和层析的水蛭素分离纯化方法 |
| CN116425863A (zh) * | 2022-07-01 | 2023-07-14 | 武汉宜芝林医药技术开发有限公司 | 用于制备血管紧张素转化酶抑制剂的水蛭提取物制备方法 |
| CN116987181B (zh) * | 2023-09-27 | 2023-12-08 | 北京元延医药科技股份有限公司 | 高生物学活性的天然水蛭素和高收率制备它们的方法 |
Family Cites Families (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US3432596A (en) * | 1967-10-13 | 1969-03-11 | Dresden Arzneimittel | Method for producing highly pure hirudine |
| US4390630A (en) * | 1980-10-28 | 1983-06-28 | The Regents Of The University Of California | Hementin--a fibrinolytic agent |
| EP0209061B1 (de) * | 1985-07-17 | 1994-01-12 | Hoechst Aktiengesellschaft | Neue Polypeptide mit blutgerinnungshemmender Wirkung, Verfahren zu deren Herstellung bzw. Gewinnung, deren Verwendung und diese enthaltende Mittel |
| ES2052062T3 (es) * | 1988-06-11 | 1994-07-01 | Ciba Geigy Ag | Nuevos polipeptidos con actividad anticoagulante. |
| GB8826428D0 (en) * | 1988-11-11 | 1988-12-14 | Biopharm Ltd | Antithrombin |
| DK0487660T3 (da) * | 1990-04-06 | 1998-03-30 | Merck Patent Gmbh | Behandling af trombosetilfælde |
-
1993
- 1993-05-07 GB GB939309509A patent/GB9309509D0/en active Pending
-
1994
- 1994-03-05 UA UA95018001A patent/UA43831C2/uk unknown
- 1994-05-03 AT AT94916187T patent/ATE208793T1/de not_active IP Right Cessation
- 1994-05-03 KR KR1019950700039A patent/KR100335536B1/ko not_active Expired - Fee Related
- 1994-05-03 WO PCT/EP1994/001404 patent/WO1994026777A1/en not_active Ceased
- 1994-05-03 CZ CZ199542A patent/CZ287794B6/cs not_active IP Right Cessation
- 1994-05-03 HU HU9500038A patent/HU226243B1/hu not_active IP Right Cessation
- 1994-05-03 DK DK94916187T patent/DK0652900T3/da active
- 1994-05-03 ES ES94916187T patent/ES2167364T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1994-05-03 SK SK8-95A patent/SK282860B6/sk not_active IP Right Cessation
- 1994-05-03 RU RU95105983A patent/RU2138275C1/ru not_active IP Right Cessation
- 1994-05-03 US US08/362,567 patent/US5583111A/en not_active Expired - Lifetime
- 1994-05-03 CA CA002139652A patent/CA2139652C/en not_active Expired - Fee Related
- 1994-05-03 PT PT94916187T patent/PT652900E/pt unknown
- 1994-05-03 JP JP52489694A patent/JP3537437B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 1994-05-03 PL PL94307088A patent/PL179215B1/pl not_active IP Right Cessation
- 1994-05-03 EP EP94916187A patent/EP0652900B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1994-05-03 DE DE69429062T patent/DE69429062T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1994-05-03 AU AU67950/94A patent/AU682368B2/en not_active Ceased
- 1994-05-06 ZA ZA943171A patent/ZA943171B/xx unknown
- 1994-08-02 TW TW083107061A patent/TW369541B/zh not_active IP Right Cessation
-
1995
- 1995-01-06 NO NO19950075A patent/NO318017B1/no not_active IP Right Cessation
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| AU6795094A (en) | 1994-12-12 |
| NO950075D0 (no) | 1995-01-06 |
| JP3537437B2 (ja) | 2004-06-14 |
| RU2138275C1 (ru) | 1999-09-27 |
| DE69429062T2 (de) | 2002-06-20 |
| DK0652900T3 (da) | 2002-02-25 |
| EP0652900A1 (en) | 1995-05-17 |
| ATE208793T1 (de) | 2001-11-15 |
| CZ287794B6 (en) | 2001-02-14 |
| US5583111A (en) | 1996-12-10 |
| UA43831C2 (uk) | 2002-01-15 |
| NO950075L (no) | 1995-01-06 |
| TW369541B (en) | 1999-09-11 |
| HUT70215A (en) | 1995-09-28 |
| WO1994026777A1 (en) | 1994-11-24 |
| SK282860B6 (sk) | 2002-12-03 |
| PT652900E (pt) | 2002-05-31 |
| CZ4295A3 (en) | 1995-10-18 |
| JPH07508765A (ja) | 1995-09-28 |
| ES2167364T3 (es) | 2002-05-16 |
| SK895A3 (en) | 1995-05-10 |
| ZA943171B (en) | 1995-01-11 |
| AU682368B2 (en) | 1997-10-02 |
| PL307088A1 (en) | 1995-05-02 |
| RU95105983A (ru) | 1997-02-27 |
| GB9309509D0 (en) | 1993-06-23 |
| HU9500038D0 (en) | 1995-03-28 |
| DE69429062D1 (de) | 2001-12-20 |
| NO318017B1 (no) | 2005-01-24 |
| KR100335536B1 (ko) | 2002-11-11 |
| KR950702579A (ko) | 1995-07-29 |
| HU226243B1 (en) | 2008-07-28 |
| EP0652900B1 (en) | 2001-11-14 |
| CA2139652C (en) | 2003-03-18 |
| CA2139652A1 (en) | 1994-11-24 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Wesselschmidt et al. | Tissue factor pathway inhibitor: the carboxy-terminus is required for optimal inhibition of factor Xa | |
| EP0815139B1 (en) | Thrombin inhibitors based on the amino acid sequence of hirudin | |
| MAURER‐FOGY et al. | Cloning and expression of cDNA for human vascular anticoagulant, a Ca2+‐dependent phospholipid‐binding protein | |
| US6087487A (en) | Nematode-extracted serine protease inhibitors and anticoagulant proteins | |
| US20090137779A1 (en) | Peptide inhibitors of thrombin as potent anticoagulants | |
| JPH05508150A (ja) | 酸化抵抗性トロンボモジュリン類縁体 | |
| Salzet | Leech thrombin inhibitors | |
| EP0652900B1 (en) | Thrombin inhibitors | |
| JPH04502907A (ja) | 抗トロンビン | |
| JP2004527452A (ja) | 医薬用途のためのトロンボモジュリン | |
| WO1993003748A1 (en) | Modulation of blood pressure and inhibition of platelet activation with kininogen fragment | |
| JPH11507664A (ja) | 第ｖｉｉｉ因子由来の第ｉｘ因子結合ペプチド及び血液凝固のインヒビターとしてのそれらの使用 | |
| US5955294A (en) | Nematode-extracted serine protease inhibitors and anticoagulant proteins | |
| EP0239644A1 (en) | Novel physiologically active substance having blood coagulation controlling activity | |
| US5523287A (en) | Thrombin-inhibitory protein from assassin bugs | |
| US6841534B2 (en) | Protein Z-dependent protease inhibitor | |
| JPH05500906A (ja) | 血栓性疾患の治療 | |
| DiMaio et al. | Thrombin inhibitors and thrombin receptor agonists/antagonists | |
| HK1005511B (en) | Thrombin inhibitors based on the amino acid sequence of hirudin |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| LAPS | Decisions on the lapse of the protection rights |
Effective date: 20110503 |