UA43831C2 - Інгібітори тромбіну з п'явок ряду rhynchobdellida родини theromyzon, екстракт та поліпептид, що мають інгібіторну активність - Google Patents
Інгібітори тромбіну з п'явок ряду rhynchobdellida родини theromyzon, екстракт та поліпептид, що мають інгібіторну активність Download PDFInfo
- Publication number
- UA43831C2 UA43831C2 UA95018001A UA95018001A UA43831C2 UA 43831 C2 UA43831 C2 UA 43831C2 UA 95018001 A UA95018001 A UA 95018001A UA 95018001 A UA95018001 A UA 95018001A UA 43831 C2 UA43831 C2 UA 43831C2
- Authority
- UA
- Ukraine
- Prior art keywords
- thrombin
- fact
- leeches
- extract
- polypeptide
- Prior art date
Links
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 title claims abstract description 35
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 title claims abstract description 32
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 title claims abstract description 31
- 239000000284 extract Substances 0.000 title claims abstract description 24
- 229940122388 Thrombin inhibitor Drugs 0.000 title claims description 28
- 239000003868 thrombin inhibitor Substances 0.000 title claims description 28
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 title claims description 9
- 241000237651 Rhynchobdellida Species 0.000 title abstract 2
- 241000722124 Theromyzon Species 0.000 title abstract 2
- 241000545744 Hirudinea Species 0.000 claims abstract description 29
- 208000007536 Thrombosis Diseases 0.000 claims abstract description 19
- 230000028327 secretion Effects 0.000 claims abstract description 8
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 claims abstract description 7
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 claims abstract description 6
- 108090000190 Thrombin Proteins 0.000 claims description 56
- 229960004072 thrombin Drugs 0.000 claims description 55
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 claims description 24
- 102000007625 Hirudins Human genes 0.000 claims description 23
- 108010007267 Hirudins Proteins 0.000 claims description 23
- WQPDUTSPKFMPDP-OUMQNGNKSA-N hirudin Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(OS(O)(=O)=O)=CC=1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC=1NC=NC=1)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@@H](NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H]1NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)CC)NC(=O)[C@@H]2CSSC[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@H](C(NCC(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N2)=O)CSSC1)C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H]1NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](N)C(C)C)C(C)C)[C@@H](C)O)CSSC1)C(C)C)[C@@H](C)O)[C@@H](C)O)C1=CC=CC=C1 WQPDUTSPKFMPDP-OUMQNGNKSA-N 0.000 claims description 23
- 229940006607 hirudin Drugs 0.000 claims description 23
- 101000712605 Theromyzon tessulatum Theromin Proteins 0.000 claims description 19
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 15
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 14
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 claims description 13
- 239000008280 blood Substances 0.000 claims description 11
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 claims description 11
- 241000894007 species Species 0.000 claims description 11
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 10
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims description 9
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 claims description 9
- 238000000746 purification Methods 0.000 claims description 9
- 238000000265 homogenisation Methods 0.000 claims description 8
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 8
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 claims description 5
- 238000005227 gel permeation chromatography Methods 0.000 claims description 5
- 230000002776 aggregation Effects 0.000 claims description 4
- 238000004220 aggregation Methods 0.000 claims description 3
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 claims description 3
- 230000007717 exclusion Effects 0.000 claims 1
- 238000011141 high resolution liquid chromatography Methods 0.000 claims 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 claims 1
- 229940126601 medicinal product Drugs 0.000 claims 1
- 239000007858 starting material Substances 0.000 claims 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 46
- 239000004019 antithrombin Substances 0.000 abstract description 30
- 238000000034 method Methods 0.000 description 24
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 18
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 238000004007 reversed phase HPLC Methods 0.000 description 11
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 10
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 9
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 9
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 9
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 9
- 230000035602 clotting Effects 0.000 description 8
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 8
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 7
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 7
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 7
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 7
- 108010074860 Factor Xa Proteins 0.000 description 6
- -1 acetic Chemical class 0.000 description 6
- 239000003146 anticoagulant agent Substances 0.000 description 6
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 6
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 6
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 6
- HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N Heparin Chemical compound OC1C(NC(=O)C)C(O)OC(COS(O)(=O)=O)C1OC1C(OS(O)(=O)=O)C(O)C(OC2C(C(OS(O)(=O)=O)C(OC3C(C(O)C(O)C(O3)C(O)=O)OS(O)(=O)=O)C(CO)O2)NS(O)(=O)=O)C(C(O)=O)O1 HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 5
- 229940127219 anticoagulant drug Drugs 0.000 description 5
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 5
- 229960002897 heparin Drugs 0.000 description 5
- 229920000669 heparin Polymers 0.000 description 5
- 238000004448 titration Methods 0.000 description 5
- DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N Trifluoroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(F)(F)F DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 230000010100 anticoagulation Effects 0.000 description 4
- 239000012148 binding buffer Substances 0.000 description 4
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 4
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 4
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 4
- 238000001819 mass spectrum Methods 0.000 description 4
- 231100000252 nontoxic Toxicity 0.000 description 4
- 230000003000 nontoxic effect Effects 0.000 description 4
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 4
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 4
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000008351 acetate buffer Substances 0.000 description 3
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 3
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 3
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 3
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 3
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 3
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 description 3
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 description 3
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 3
- 239000000945 filler Substances 0.000 description 3
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 3
- 239000000463 material Substances 0.000 description 3
- 239000003921 oil Substances 0.000 description 3
- 235000019198 oils Nutrition 0.000 description 3
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 3
- 239000000047 product Substances 0.000 description 3
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 3
- PXFBZOLANLWPMH-UHFFFAOYSA-N 16-Epiaffinine Natural products C1C(C2=CC=CC=C2N2)=C2C(=O)CC2C(=CC)CN(C)C1C2CO PXFBZOLANLWPMH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- HZAXFHJVJLSVMW-UHFFFAOYSA-N 2-Aminoethan-1-ol Chemical compound NCCO HZAXFHJVJLSVMW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 206010053567 Coagulopathies Diseases 0.000 description 2
- 102000009123 Fibrin Human genes 0.000 description 2
- 108010073385 Fibrin Proteins 0.000 description 2
- 208000032843 Hemorrhage Diseases 0.000 description 2
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 description 2
- XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N Iron Chemical compound [Fe] XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- AFVFQIVMOAPDHO-UHFFFAOYSA-N Methanesulfonic acid Chemical compound CS(O)(=O)=O AFVFQIVMOAPDHO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N Phosphoric acid Chemical class OP(O)(O)=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N Potassium Chemical compound [K] ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000001708 Protein Isoforms Human genes 0.000 description 2
- 108010029485 Protein Isoforms Proteins 0.000 description 2
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N Sulfuric acid Chemical class OS(O)(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 206010047249 Venous thrombosis Diseases 0.000 description 2
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 2
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 2
- 230000003872 anastomosis Effects 0.000 description 2
- 230000002785 anti-thrombosis Effects 0.000 description 2
- 210000001367 artery Anatomy 0.000 description 2
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 2
- 230000000740 bleeding effect Effects 0.000 description 2
- 238000005251 capillar electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 2
- 238000002144 chemical decomposition reaction Methods 0.000 description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 2
- ZCDOYSPFYFSLEW-UHFFFAOYSA-N chromate(2-) Chemical compound [O-][Cr]([O-])(=O)=O ZCDOYSPFYFSLEW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000015271 coagulation Effects 0.000 description 2
- 238000005345 coagulation Methods 0.000 description 2
- 238000003795 desorption Methods 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 2
- 238000005194 fractionation Methods 0.000 description 2
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 2
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 description 2
- 230000036541 health Effects 0.000 description 2
- 108010005808 hementin Proteins 0.000 description 2
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 2
- 238000001802 infusion Methods 0.000 description 2
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 2
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 2
- 238000001155 isoelectric focusing Methods 0.000 description 2
- 238000004949 mass spectrometry Methods 0.000 description 2
- 150000007522 mineralic acids Chemical class 0.000 description 2
- 150000007524 organic acids Chemical class 0.000 description 2
- 229910052700 potassium Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000011591 potassium Substances 0.000 description 2
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 2
- YGSDEFSMJLZEOE-UHFFFAOYSA-N salicylic acid Chemical compound OC(=O)C1=CC=CC=C1O YGSDEFSMJLZEOE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 210000003079 salivary gland Anatomy 0.000 description 2
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 2
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 2
- 208000011580 syndromic disease Diseases 0.000 description 2
- 239000003869 thrombin derivative Substances 0.000 description 2
- PGOHTUIFYSHAQG-LJSDBVFPSA-N (2S)-6-amino-2-[[(2S)-5-amino-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-4-amino-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-5-amino-2-[[(2S)-5-amino-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S,3R)-2-[[(2S)-5-amino-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S,3R)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-5-amino-2-[[(2S)-1-[(2S,3R)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2R)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-1-[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-amino-4-methylsulfanylbutanoyl]amino]-3-(1H-indol-3-yl)propanoyl]amino]-5-carbamimidamidopentanoyl]amino]propanoyl]pyrrolidine-2-carbonyl]amino]-3-methylbutanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]acetyl]amino]-3-hydroxypropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]-3-sulfanylpropanoyl]amino]-4-methylsulfanylbutanoyl]amino]-5-carbamimidamidopentanoyl]amino]-3-hydroxybutanoyl]pyrrolidine-2-carbonyl]amino]-5-oxopentanoyl]amino]-3-hydroxypropanoyl]amino]-3-hydroxypropanoyl]amino]-3-(1H-imidazol-5-yl)propanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]-3-hydroxybutanoyl]amino]-3-(1H-indol-3-yl)propanoyl]amino]-5-carbamimidamidopentanoyl]amino]-5-oxopentanoyl]amino]-3-hydroxybutanoyl]amino]-3-hydroxypropanoyl]amino]-3-carboxypropanoyl]amino]-3-hydroxypropanoyl]amino]-5-oxopentanoyl]amino]-5-oxopentanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-5-carbamimidamidopentanoyl]amino]-3-methylbutanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]-4-oxobutanoyl]amino]-5-carbamimidamidopentanoyl]amino]-3-(1H-indol-3-yl)propanoyl]amino]-4-carboxybutanoyl]amino]-5-oxopentanoyl]amino]hexanoic acid Chemical compound CSCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](Cc1c[nH]c2ccccc12)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](Cc1cnc[nH]1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](Cc1c[nH]c2ccccc12)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](Cc1ccccc1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](Cc1c[nH]c2ccccc12)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(O)=O PGOHTUIFYSHAQG-LJSDBVFPSA-N 0.000 description 1
- IEJPPSMHUUQABK-UHFFFAOYSA-N 2,4-diphenyl-4h-1,3-oxazol-5-one Chemical group O=C1OC(C=2C=CC=CC=2)=NC1C1=CC=CC=C1 IEJPPSMHUUQABK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WXTMDXOMEHJXQO-UHFFFAOYSA-N 2,5-dihydroxybenzoic acid Chemical compound OC(=O)C1=CC(O)=CC=C1O WXTMDXOMEHJXQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HVAUUPRFYPCOCA-AREMUKBSSA-N 2-O-acetyl-1-O-hexadecyl-sn-glycero-3-phosphocholine Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCCOC[C@@H](OC(C)=O)COP([O-])(=O)OCC[N+](C)(C)C HVAUUPRFYPCOCA-AREMUKBSSA-N 0.000 description 1
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BMYNFMYTOJXKLE-UHFFFAOYSA-N 3-azaniumyl-2-hydroxypropanoate Chemical class NCC(O)C(O)=O BMYNFMYTOJXKLE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M Acetate Chemical compound CC([O-])=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 241000272517 Anseriformes Species 0.000 description 1
- 241000283725 Bos Species 0.000 description 1
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 1
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 1
- 206010051055 Deep vein thrombosis Diseases 0.000 description 1
- BWLUMTFWVZZZND-UHFFFAOYSA-N Dibenzylamine Chemical compound C=1C=CC=CC=1CNCC1=CC=CC=C1 BWLUMTFWVZZZND-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010014522 Embolism venous Diseases 0.000 description 1
- BWGVNKXGVNDBDI-UHFFFAOYSA-N Fibrin monomer Chemical compound CNC(=O)CNC(=O)CN BWGVNKXGVNDBDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010049003 Fibrinogen Proteins 0.000 description 1
- 102000008946 Fibrinogen Human genes 0.000 description 1
- 101710196208 Fibrinolytic enzyme Proteins 0.000 description 1
- 102000003688 G-Protein-Coupled Receptors Human genes 0.000 description 1
- 108090000045 G-Protein-Coupled Receptors Proteins 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Chemical compound OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- 241000237654 Haementeria ghilianii Species 0.000 description 1
- 241000202943 Hernandia sonora Species 0.000 description 1
- 241000237902 Hirudo medicinalis Species 0.000 description 1
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical class Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 206010029164 Nephrotic syndrome Diseases 0.000 description 1
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- 241001559981 Palyas Species 0.000 description 1
- 206010033799 Paralysis Diseases 0.000 description 1
- 235000019483 Peanut oil Nutrition 0.000 description 1
- 108010001014 Plasminogen Activators Proteins 0.000 description 1
- 102000001938 Plasminogen Activators Human genes 0.000 description 1
- 108010003541 Platelet Activating Factor Proteins 0.000 description 1
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 1
- 201000004681 Psoriasis Diseases 0.000 description 1
- 206010037437 Pulmonary thrombosis Diseases 0.000 description 1
- 206010038831 Retinal artery thrombosis Diseases 0.000 description 1
- BQCADISMDOOEFD-UHFFFAOYSA-N Silver Chemical compound [Ag] BQCADISMDOOEFD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- PMZURENOXWZQFD-UHFFFAOYSA-L Sodium Sulfate Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]S([O-])(=O)=O PMZURENOXWZQFD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M Sodium acetate Chemical compound [Na+].CC([O-])=O VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 244000300264 Spinacia oleracea Species 0.000 description 1
- 235000009337 Spinacia oleracea Nutrition 0.000 description 1
- 239000002253 acid Chemical class 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 239000013543 active substance Substances 0.000 description 1
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 1
- 238000005054 agglomeration Methods 0.000 description 1
- 229910052783 alkali metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 150000001340 alkali metals Chemical class 0.000 description 1
- 150000001342 alkaline earth metals Chemical class 0.000 description 1
- 229910052782 aluminium Inorganic materials 0.000 description 1
- XAGFODPZIPBFFR-UHFFFAOYSA-N aluminium Chemical compound [Al] XAGFODPZIPBFFR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910000147 aluminium phosphate Chemical class 0.000 description 1
- 230000000702 anti-platelet effect Effects 0.000 description 1
- 239000008365 aqueous carrier Substances 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- 239000007900 aqueous suspension Substances 0.000 description 1
- WPYMKLBDIGXBTP-UHFFFAOYSA-N benzoic acid group Chemical group C(C1=CC=CC=C1)(=O)O WPYMKLBDIGXBTP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000011230 binding agent Substances 0.000 description 1
- 208000034158 bleeding Diseases 0.000 description 1
- 239000010836 blood and blood product Substances 0.000 description 1
- 230000023555 blood coagulation Effects 0.000 description 1
- 229940125691 blood product Drugs 0.000 description 1
- 210000001124 body fluid Anatomy 0.000 description 1
- 239000010839 body fluid Substances 0.000 description 1
- 239000002775 capsule Substances 0.000 description 1
- 150000001735 carboxylic acids Chemical class 0.000 description 1
- 210000000748 cardiovascular system Anatomy 0.000 description 1
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000011097 chromatography purification Methods 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 1
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 1
- 239000013068 control sample Substances 0.000 description 1
- 239000000287 crude extract Substances 0.000 description 1
- 238000000354 decomposition reaction Methods 0.000 description 1
- 235000005911 diet Nutrition 0.000 description 1
- 230000037213 diet Effects 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- BNIILDVGGAEEIG-UHFFFAOYSA-L disodium hydrogen phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].OP([O-])([O-])=O BNIILDVGGAEEIG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 208000009190 disseminated intravascular coagulation Diseases 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 239000003995 emulsifying agent Substances 0.000 description 1
- 238000005538 encapsulation Methods 0.000 description 1
- 238000011067 equilibration Methods 0.000 description 1
- 230000029142 excretion Effects 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 229950003499 fibrin Drugs 0.000 description 1
- 229940012952 fibrinogen Drugs 0.000 description 1
- 239000003527 fibrinolytic agent Substances 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 1
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 1
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 1
- 150000002334 glycols Chemical class 0.000 description 1
- 230000009931 harmful effect Effects 0.000 description 1
- 230000002489 hematologic effect Effects 0.000 description 1
- UWYVPFMHMJIBHE-OWOJBTEDSA-N hydroxymaleic acid group Chemical group O/C(/C(=O)O)=C/C(=O)O UWYVPFMHMJIBHE-OWOJBTEDSA-N 0.000 description 1
- 238000003384 imaging method Methods 0.000 description 1
- 230000001771 impaired effect Effects 0.000 description 1
- 230000028709 inflammatory response Effects 0.000 description 1
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 1
- 150000007529 inorganic bases Chemical class 0.000 description 1
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 1
- 229910052742 iron Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000000644 isotonic solution Substances 0.000 description 1
- 235000015110 jellies Nutrition 0.000 description 1
- 239000000314 lubricant Substances 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 1
- 150000002739 metals Chemical class 0.000 description 1
- 229940098779 methanesulfonic acid Drugs 0.000 description 1
- 239000002480 mineral oil Substances 0.000 description 1
- 235000010446 mineral oil Nutrition 0.000 description 1
- 208000010125 myocardial infarction Diseases 0.000 description 1
- UPSFMJHZUCSEHU-JYGUBCOQSA-N n-[(2s,3r,4r,5s,6r)-2-[(2r,3s,4r,5r,6s)-5-acetamido-4-hydroxy-2-(hydroxymethyl)-6-(4-methyl-2-oxochromen-7-yl)oxyoxan-3-yl]oxy-4,5-dihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-3-yl]acetamide Chemical compound CC(=O)N[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](NC(C)=O)[C@H](OC=2C=C3OC(=O)C=C(C)C3=CC=2)O[C@@H]1CO UPSFMJHZUCSEHU-JYGUBCOQSA-N 0.000 description 1
- 208000009928 nephrosis Diseases 0.000 description 1
- 231100001027 nephrosis Toxicity 0.000 description 1
- 239000012053 oil suspension Substances 0.000 description 1
- 239000002674 ointment Substances 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- 235000005985 organic acids Nutrition 0.000 description 1
- 150000007530 organic bases Chemical class 0.000 description 1
- FJKROLUGYXJWQN-UHFFFAOYSA-N papa-hydroxy-benzoic acid Natural products OC(=O)C1=CC=C(O)C=C1 FJKROLUGYXJWQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000007911 parenteral administration Methods 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 239000000312 peanut oil Substances 0.000 description 1
- 230000002572 peristaltic effect Effects 0.000 description 1
- 239000003208 petroleum Substances 0.000 description 1
- WLJVXDMOQOGPHL-UHFFFAOYSA-N phenylacetic acid Chemical compound OC(=O)CC1=CC=CC=C1 WLJVXDMOQOGPHL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 1
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 229940127126 plasminogen activator Drugs 0.000 description 1
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 1
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 description 1
- 239000002798 polar solvent Substances 0.000 description 1
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 1
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 1
- 238000004321 preservation Methods 0.000 description 1
- 239000003755 preservative agent Substances 0.000 description 1
- 150000003141 primary amines Chemical class 0.000 description 1
- MFDFERRIHVXMIY-UHFFFAOYSA-N procaine Chemical compound CCN(CC)CCOC(=O)C1=CC=C(N)C=C1 MFDFERRIHVXMIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960004919 procaine Drugs 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 230000002035 prolonged effect Effects 0.000 description 1
- 238000000611 regression analysis Methods 0.000 description 1
- 229960004889 salicylic acid Drugs 0.000 description 1
- 210000003296 saliva Anatomy 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- 150000003335 secondary amines Chemical class 0.000 description 1
- 239000013049 sediment Substances 0.000 description 1
- 239000000377 silicon dioxide Substances 0.000 description 1
- 229910052709 silver Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000004332 silver Substances 0.000 description 1
- 239000001632 sodium acetate Substances 0.000 description 1
- 235000017281 sodium acetate Nutrition 0.000 description 1
- 229910052938 sodium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011152 sodium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 239000003549 soybean oil Substances 0.000 description 1
- 235000012424 soybean oil Nutrition 0.000 description 1
- 208000010110 spontaneous platelet aggregation Diseases 0.000 description 1
- 239000008223 sterile water Substances 0.000 description 1
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 description 1
- 150000008163 sugars Chemical class 0.000 description 1
- 150000003460 sulfonic acids Chemical class 0.000 description 1
- 239000000375 suspending agent Substances 0.000 description 1
- 239000003356 suture material Substances 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 239000012209 synthetic fiber Substances 0.000 description 1
- 229920002994 synthetic fiber Polymers 0.000 description 1
- 239000006188 syrup Substances 0.000 description 1
- 235000020357 syrup Nutrition 0.000 description 1
- 150000003512 tertiary amines Chemical class 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 1
- 238000009210 therapy by ultrasound Methods 0.000 description 1
- 206010043554 thrombocytopenia Diseases 0.000 description 1
- 229960000103 thrombolytic agent Drugs 0.000 description 1
- 238000011200 topical administration Methods 0.000 description 1
- 125000005270 trialkylamine group Chemical group 0.000 description 1
- 150000003628 tricarboxylic acids Chemical class 0.000 description 1
- 210000005167 vascular cell Anatomy 0.000 description 1
- 235000013311 vegetables Nutrition 0.000 description 1
- 208000004043 venous thromboembolism Diseases 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
- 230000003313 weakening effect Effects 0.000 description 1
- 239000000080 wetting agent Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/81—Protease inhibitors
- C07K14/815—Protease inhibitors from leeches, e.g. hirudin, eglin
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
- A61K35/56—Materials from animals other than mammals
- A61K35/62—Leeches; Worms, e.g. cestodes, tapeworms, nematodes, roundworms, earth worms, ascarids, filarias, hookworms, trichinella or taenia
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
- A61P7/02—Antithrombotic agents; Anticoagulants; Platelet aggregation inhibitors
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S530/00—Chemistry: natural resins or derivatives; peptides or proteins; lignins or reaction products thereof
- Y10S530/855—Proteins from animals other than mammals or birds
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Hematology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Diabetes (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
Abstract
Винахід стосується нових поліпептидів, що відзначаються антитромбіновою активністю, які одержують із тканин або секрецій п'явок ряду Rhynchobdellida, переважно виду Theromyzon tessulatum. Поліпептиди мають молекулярну масу приблизно 14 кДа, 9 кДа і 3 кДа і можуть використовуватися в фармацевтичних композиціях для лікування розладів і станів, що виникають у зв'язку з тромбозом.
Description
Настоящее изобретение относится к новьім ингибиторам тромбона, в частности, к ингибиторам тромбина, вьіделяемь!їм из тканей и секреций пиявок.
Тромбин катализирует образование сгустков фибрина, а потому подавляет свертьівание крови. Кроме того, тромбин вьіступает в роли биорегулятора в таких процессах, как прямая активация агрегирования тромбоцитов и активация воспалительного отклика путем стимулирования синтеза активационного фактора тромбоцитов клетками зндотелия. Зто означаєт, что тромбин играєт главную роль в заболеваниях, вьізьіваемьх тромбозом, таких как, например, заболевания сердечно-сосудистой системь!.
По зтой причине сохраняется значительньй интерес к новьм или обладающим улучшенньми свойствами ингибиторам тромбина и антикоагулянтам.
Примерами хорошо известньїхх ингибиторов тромбина являются гепарин и гирудин.
Гепарин усиливаєт антикоагуляционную активность антитромбина І. Он широко используется для лечения состояний, таких как венозньій тромбозмболизм, при которьїх активность тромбина ответственна за развитие или распространение тромба. Он не зффективен для терапевтического применения в тех случаях, когда содержание антитромбива ПШ понижено, например, в случає тромбоза, вьізьіваемого нефрозом или синдромом коагулопатий потребления. Более того, гепарин вьізьівает многочисленнье побочнье зффектьї, в том числа кровотечениєе и тромбоцитопению.
Гирудин является хорошо известньм и хорошо изученньм полиптотидом, которьїй, как известно, является тромбинспецифическим и может бьіть вьіделен из зкстрактов слюнньїх желез и других тканей пиявок вида Нігидо тедісіпаїй5. Гирудин и его производнье можно получать также по рекомбинантной технологии. Полипептид имеет сравнительно небольшой молекулярньй вес порядка 7000 Да и состоит из 65 остатков аминокислот. Последовательность аминокислот гирудина бьіла впервье определена Додтом и др. (РГЕВЗ І ецег5, 1984, Мої Іб5, рр. 180-184) В пиявках Нігидо теаїсіпаїїз обнаружень!ї три основнье формь! гирудина (НМ 1, НМ 2, НМ 3), которне отличаются всего лишь приблизительно на 109595 от общего числа позиций аминокислот. Найболее значительноє различие состоит в первьїх двух позициях М -конца молекуль: МаІ- Ма в форме І гирудина и Пе--Тіг в форме 2 гирудина: Указаннье различия носят второстепенньіїй характер и не оказьвают влияние ни на функции, ни на специфичность взаймодействия гирудин-тромбин:.Гирудин является потенциальньм природньм ингибитором коагуляции. Показана его зффективность для предотвращения тромбоза вен, закупорки анастомозов сосудов и вьізьіваемого тромбином синдрома и коагуляриин потребления, однако он вьізьівает продолжительнье кровотечения.
Фитогенетически медицинская пиявка Нігидо теаїсіпай5 являются членом подсемейства Негидіпіпає семейство пиявок Негиаіпідає (К.Т. замжуег"Геесп Віоіоду ап Віпаміог, Охіога Опімегейу Ргев55,Мої 2, р.688, 1986). Зволюционно более развитьмм видом пиявок является Нігиаіпагіпае того же семейства Негиаіпідає.
Неожиданно похожая, но вполне отличная изоформа гирудина бьіла недавно обнаружена в Непаїпагла тапіПепвіх, как зто описано в международной патентной заявке РСТ УмМо 90/05143.Указанная изоформа отличается почти по 4096 позиций аминокислот при сравнениий с нирудином от Нігидо тедісіпаїї5. Для указанньїх ранее вида, а именно Нігидо тедісіпа|й5 и Негпадіпапйа тапі МПепвіз относятся к отряду пиявок
Агпупспобраеї!ї да ("пиявки с челюстями"). Помимо отряда Агупспоравєїїїда существует еще один большой отряд пиявок, т.е. Кпупспоб аеїаа ("пиявки с хоботом") (В.Т. Зажмуег: "Нееспі Віоіоду апа Вепамі оц" Охіога
Мпімегейу Ргев55 Мої, 2.р. 651, 1986). Что касаєтся белков, содержащихся в слюне, то найболее изученньм представителем отряда "Кпупспобр аеїда" является "амазонская пиявка" Наетеп'іегіа дпіЇапії. Неожиданно бьіло обнаружено, что зтот вид не содержит антитромбин (Видгуп5кі еї а!І Ргос. бос Віо!.Меа.,1981, Мо). 168,рр.259-265). Вместо того Наетепіегіа дпіапії содержит фибринолитический фермент, получивший название гементин (Патент США 4390630), а также ингибитор фактора коагуляции крови Ха (С. Сопага еї аі. Тиготь Наєтозі 1986, Мої 61, рр. 437-441).
Основьіваясь на зтом открьтиий и последующих публикациях, полагали, что антитромбиноподобная активность ограничиваєтся пиявками отряда Апупспобраеї да и отсутствует у отряда Апупспоб ае! да.
Несмотря на обсуждавшиеся вьіше разработки, сохраняется потребность в других, кроме гепарина и гирудина, антиокоагулянтах и антитромбинах, соответственно, которне обладают более вьсокой зффективностью при подавлении образования сгустков, вьізььіваемой тромбином активации действия у клеток зндотелия, и которнье можно бьло бь получать в коммерческих количествах:
Неожиданно бьло обнаружено, что соединения антитромбиноподобной активностью могут бьть вьіделень из тканей и секреции пиявок отряда АНупспоб аеїІїда предпочтительно семейства-Тпеготи2оп и наийболее предпочтительно вид Тпеготи2оп їеззцшайшт, которьхх часто назьівают "птичьими пиявками", т.к. образ жизни зтих пиявок заключается в том, что они сосут кровь из ноздрей водоплавающих птиц.
Таким образом, целью настоящего изобретения является использование пиявок отряда АПпупспор деїїїда, предпочтительно вида ТПпеготигоп (еззцацшт для получения соединений-ингибиторов тромбина"
Бьіло показано, что активность ингибитора тромбина можно измерить в зкстрактах, состоящих из растворимьх в воде компонентов указанньїх пиявок. Таким образом, целью настоящего изобретения является получение зкстрактов с ингибиторной активностью по отношению к тромбину из тканей или секреции пиявок отряда АНпупспоб аеїїйда или семейства Тпеготи2оп или вида ТПпеготи2оп (ез5Шашт, содержащих растворимьсе в воде компоненть! указанньїх пиявок.
Активньій ингибитор тромба может бьіть вьіделен из указанньїх зкстрактов. Таким образом, целью настоящего изобретения являєтся в достаточной степени очищенньй ингибитор тромбина, которьій можно охарактеризовать как полипоптидьі, обладающий антитробной активностью, вьіделенной из указанного вьше и в формуле изобретения зкстракта путем очистки зкстракта полуденного гомогенизацией передней третьей части замороженньх и подвегнутьїх сублимационной сушке пиявок в смеси вода/ацетон, методом тромбинспецифической аффинной хроматографии с последующей, по крайней мере, одной стадией гель- проникающей хроматографии и, по крайней мере, одной стадией жидкостной хроматографии вьсокого разрешения (З5ХЕР) с обращенной фазой.
Ингибитор тромбина преймущественно содержит активнье полипептиднье фрагменть! с молекулярньми весами около 3 кДа, приблизительно 14 кДа, соответственно. Указанньюе активнье полипептидьії можно рассматривать как продуктьь разложения исходного ингибитора тромба или предшественника ингибитора тромба.
Ингибитор тромба по настоящему изобретению является новьм, поскольку он отличаєтся от известньх антитромбинов, в частности, по своему молекулярному весу, изозлектрической точке в М-концевой последовательности аминокислотньїх остатков, что указьявают на низкую гомологию (ниже 4095) с другими ингибиторами тромбина.
Таким образом, еще одной целью настоящего изобретения является изобретение из указанного зкстракта ингибитора тромбина, состоящего, по крайней мере из одного полипептида, обладающего ингибиторной активностью по отношению к тромбину и имеющего молекулярньй вес около З кДа.
Далее целью настоящего изобретения является ингибитор тромбина, состоящий, по крайней мере, из одного полипептида, обладающего ингибиторной активностью по отношению к тромбину и имеющего молекулярньй вес около 9 кДа и следующую М-концевую последовательность аминокислот:
Спи Авр Авр Авзп Рго Су Рго Рго Аго Аа Суз Рго Сіу СхІШ/
Далее, целью настої) изобретения являєтся ингибитор тромбина, состоящий, по крайней мере из одного полипептида, обладающего ингибиторной активностью по отношению к тромбину и имеющего молекулярньй вес около 14 кДа и следующую М-концевую последовательность аминокислот:
Зег Сім І еи Су Сп Зег Суз Зег І ув Спи Авп Рго Суз Рго Зег Азп Мей І уз Сув Азп Ага Сс1и ТНг РНе І уз.
В соответствий с настоящим изобретением терминьі "около 3 (9,14) кДа" включают максимальное отклонение плюс/минус 1 кДа, преимущественно 0,5 кДа. Более того, в обьем притязаний по настоящему изобретению входят указанньсе вьіше и ниже по тексту последовательности, в которьїх произведена замена аминокислот, так что сохраняются основнье биологические свойства. Изобретение охватьваєт такие формь, фрагментьії, подединицьї, природнье мутанть! и произвольно возникшие искусственнье мутанть!.
Сюда включаются также гибридньсе белки, такие как белки слияния, полученньсе из указанньх поптидов.
Изобретение относится к способу получения указанного више и в формуле изобретения зкстракта путем гомогенизации тканей или секреций пиявок отряда НПупспор аеїйда преимущественно вида
Тпеготи2оп їеззцашт и приготовления фракции, включающей их растворимьсе в воде компоненть!
Далее, целью настоящего изобретения является способ получения полипептида по пп. 4-7 формульї изобретения путей очистки зкстракта с помощью тромбинспецифической аффинной хроматографамйи и, по крайней мере, одной стадии стандартной хроматографической очистки.
МИнгибитор тромбина по настоящему изобретению ообладаєт антикоагуляционньми и антитромботическими свойствами. Позтому он может использоваться при леченийи клинических состояний, при которьїх нарушена система коагуляции..Зто использование включаєт лечение тромбоза, паралича, инфаркта миокарда, глубокого тромбоза вен, закупорки артерий конечностей, тромбоза легких, тромбоза артерии сетчатки глаза иди других еду чаєв тромбоза. Более того, ингибиторьї тромбина могут применяться для пациентов с артериовенозньми щунтами или пациентов, которьм устанавливаются коронарнье обходнье-анастомозьі. Полипептидьї по настоящему изобретению могут также использоваться в качестве антикоагулянтов для профилактики тромбоза или повторной закупорки артерий, для консервации крови иди продуктов крови и для зкстракорпоральной циркуляции крови или плазмь!.
Ингибиторьї тромбина (полипептидь) по настоящему изобретению проявляют биологическую активность, которая в основном сопоставима с активностью гирудина. Сродство при присоединений к тромбину (константа ингибирования) даже несколько возрастает по сравнению с гирудином, которьй является в настоящее время самь/м сильньі!м ингибитором тромбина"
Таким образом, еще одной целью настоящего изобретения является использование указанньх вьіше и в формуле изобретения полипептидов: в качестве медицинского средства, в частности, при лечении ІП. іп мімо расстройств, вьізьіваемьх тромбозом, и для подавления агрегирования тромбоцитов и образования сгустков крови в зкстракорпоральной крови.
Наконец, в настоящем изобретении заявляется также фармацевтическая композиция, включающая ингибитор тромбина или указанньій вьіше полипептид, соответственно, и фармацевтически приемлемьй носитель, для лечения заболеваний, вьізьіваемьх тромбозом, как зто указано ранее.
Краткое описание рисунков.
Подробное описание рисунков приводится в Примерах 1-10.
На рис. 1 представлен профиль злюмрования антитробина после аффинной колонки (Пример 3).
На рис. 2 приведен фильтрационньїйй анализ антитробина, полученного от Т. їеззшШашт на Віоде! РА (Прпмера)
На Рис:3 показань! результатьї проведения аналитической ЖХВР с обращенной фазой позитивньх фракций после аффинной хроматографии (Пример 5).
На Рис. 4 показань! результатьь проведения препаратной ЖХВР с обращенной фазой позитивньх фракций после аффинной хроматографии Пример 5).
На Рис. 5 проводится сравнение гирудина и ингибитора по настоящему изобретению методами ЖХВР (Пример 6).
На Рис. 6 представлена повторная хроматограмма активного пика 2 после ЖХВР с обращенной фазой (Пример 7),
На Рис. 7 изображен масс-спектр активного пика 2 после ЖХБР с обращенной фазой (Пример 7).
На Рис. 8 приведен ГЕГ след активного пика 2 после ЖХБР с обращенной фазой (Пример 7).
На Рис. 9 представлена повторная хроматограмма активного пика 7 после ЖХВР с обращенной фазой (Пример 9).
На Рис. 10 изображен масс-спектр активного пика 4 после ЖХВР с обращенной фазой (Пример 9).
Подробное описание изобретения
Ингибиторьї тромбина по настоящему изобретению могут бьіть вьіделеньі и очищеньі! от тканей и секреций пиявок отряда Апупспоб аеїІїда, преимущественно семейства Тпеготугоп. Ингибиторь тромбина, получаемье из пиявок семейства Тпеготулоп, обладают сходной активностью и лишь незначительно отличаются друг от друга. Примерами подходящих видов семейства ТПпеготу?оп являются Т.Біпаппи-Іапшт,
Т.соорегі, Т.дагдаємі, М.тасшосит, Т.тоїїзбвіт, Т.раПеп5, Т.ргоріпдиит, Т.годе, Т.згехосшашт, и частности
Т.Теззшашт.
В качестве источника в соответствии с настоящим изобретением используют слюннье железь! пиявок.
Но так как для приготовления слюнньїхх желез необходимо приложить определеннье усилия, при зтом неизбежньі большие потери материала, можно также использовать в качестве источника головь! или первую третью часть пиявок:
Обьчно первая стадия способа заключаєтся в основной в глубоком замораживаний и/или сублимационной сушке тканей пиявок перед проведением гомогенизации, которую обьчно проводят в ацетоне или смесях ацетон/вода. Тем не менееє, для удаления нерастворимьх в воде компонентов могут использоваться и другие полярнье растворители. Предпочтительно также, чтобь зкстракт, полученньй на первой стадии, подвергался центрифугированию перед проведением аффинной хроматографии для удаления нежелательньїх продуктов распада клеток. Аффинную хроматографию предпочтительно проводят на колонках, содержащих "активнье участки тромбина". Термин "активнье участки тромбина" в данном случає указьвает на наличие в колонке участков тромбина, к которьм может прикрепляться ингибитор тромбина. Примерами активньїх участков тромбина являются иммобилизованньй натрий или дезактивированньй тромбин, включая также пептидьі-производнье тромбина, напоминающие тромбин или другие производнье тромбина, В соответствии с изобретением тромбин или указаннье производнье тромбина иммобилизуют на активную матрицу геля, прейимущественно за счет взаймодействия с азлактоновой группой указанной матриць! геля с использованном известньїх способов. В противной случає проводят аффинную хроматографию обьічньіми способами.
Предпочтительно использовать метод гель-проникающей хроматографии совместно с аффинной хроматографией.
Матрица геля в соответствии с настоящим изобретением имеет предел разделения приблизительно 5 кДа, что позволяет провести фракционирование в интервале приблизительно от | кДа до 5 кДа,
Вьіделенньюе зкстрактьї антитромбина, с целью дальнейшей очистки, преимущественно подвергают далее ЖХВР с обращенной фазой. Указаннье ранеє полипептидьй получают очисткой вьіделенньх зкстрактов с помощью ЖХВР с обращенной фазой. Примерами подходящих соединений для обращенньмх фаз являются силикагели, модифицированнье С2-СІЗВ алифатическими заместителями. Однако полипептидь! по настоящему изобретению могут бить очищеньі другими хорошо известньмми методами хроматографии. Методики осуществления ЖХВР приведеньй в Примерах. Активность ингибиторов тромбина в зкстрактах и отдельньїх фракциях, получаемьїхх на стадиях очистки, может бьіть определена іп мійго по удлинению времени сгуст-кообразования (Є. Магкмагаї Ме Еп7 1970, МоІЛ9, рр. 924-932) или по ослаблению расщепления тромбинспецифических субстратов, таких как ацетат тозил-глицил-припил- аргинин-4-нитроанилида (СПго-тогуп Т.Н. "Воепгіпдег" Мапгйт),как зто написано в монографии Н.О.
Вегдтеуег, Мей Епг, Апаї, З га, Ед, Мої 5, 365-394, 1988.го-
Как указано ранеє, полипептидьі! по настоящему изобретению пригоднь! в качестве фармацевтически зффективньх соединений при созданиий фармацевтических композиций и смесей.
Фармацевтические составь! по настоящему изобретению не обязательно могут содержать активнье дополнительнье ингредиентьі, подобнье антикоагулянтам, таким как гирудин или гепарин или подобнье тромболитическим средствам, таким как активатор плазминогена или гементин.
Новье полипептидьй и ингибиторьї тромбина, соответственно, по настоящему изобретению могут образовьшвать фармацевтически приемлемьсе соли с нетоксичньіми, органическими или неорганическими кислотами: Неорганическими кислотами являются, например, соляная, бромисто-водородная, серная или фосфорная кислота и кислье соли металлов, такие как моногидрофосфат натрия и гидросульфат калия.
Примерами органических кислот являются моно-, ди-, и трикарбоновье кислоть!, такие как уксусная , гликолевая, молочная, пировиноградная, малоновая, янтарная, глутаровая, фумаровая, яблочная, винная, лимонная, аскорбиновая, малеийновая, гидроксималеиновая, бензойная, гидроксибензоиная, фенилуксусная, коричная, салициловая кислотьї и сульфокислоти, такие как метансульфокислота. Соли остатка С-концевой аминокислоть! могут включать нетоксичнье соли карбонових кислот, образованнье с любьми подходящими неорганическими или органическими основаниями. Указаннье соли включают, например, соли щелочньх металлов, таких как натрий и калий, соли щелочно-земельньїх металлов Группь
ША, включая алюминий, и соли органических первичньїх, вторичньїх и третичньхх аминов, таких как триалкиламиньі, в том числе тризтиламин, прокаин, дибензиламин, І-зтонал, М, М-дибен-зилзтиламин-- диамин, дигидроабиетиламин и М-алкилпиперидин.
Термин "фармацевтически приемлемьй носитель" означает в данном случає инертньй, нетоксичньй твердьй или жидкий наполнитель, разбавитель или материал для инкапсулирования, которье не вступают в нежелательное взаймодействиє с активньм соединением или не оказьивают вредного воздействия на пациента. Подходящими, преимущественно жидкими носителями, хорошо известньіми из области техники, являются такие как стерильная вода, солевой раствор, водньій раствор декстрозьі, растворь! сахаров, зтанол, гликоли и масла, в том числе получаемье из нефти и масла растительного, животного происхождения и синтетические масла, например, арахисовое масло, соевое масло и минеральное масло.
Составь по настоящему изобретению могут назначаться в виде стандартньїх доз, содержащих нетоксичнье фармацевтически приемлемье носители, разбавители, вспомогательнье соединения и наполнители, которье типичнь! для парентерального назначения.
Термин "парентеральньй" включаєт в данном случає подкожнье, внутривеннье, внутрисуставнье и внутритрахейнье иньекции и вливания. Пригодньії и другие способь! назначения, такие как оральное назначение и местное назначение. Парентеральнье композиции и сочетания найболее предпочтительно вводятся внутривенно как в виде болюсов, так и путем постоянного вливания с использованием известньх методов.
Таблетки и капсуль! для орального назначения содержат обьічнье вспомогательнье соединения, такие как связующиє, наполнители, разбавители, таблетирущие средства, смазьвающие средства, разрьхлители и смачивающие средства. Таблетки могут бьть покрьїтьї с помощью методов, хорошо известньїх из области техника.
Жидкие составь! для орального назначения могут бьїть приготовленьі в виде водньїх или масляньх суспензий, растворов, змульсий, сиропов или зликсиров или приготовленьії в виде сухих продуктов, которне растворяют перед употреблением в воде и в другом подходящем носителе. Указаннье жидкие препаратьі могут содержать обьчнье добавки, такие как суспендирующие средства, змульгаторь,, неводньсе носители и консерванть!.
Составь!ї для местного назначения могут бьіть в виде водньїх или масляньїх суспензий, растворов, змульсий, желе или предпочтительно мазей в форме змульсии.
Стандартньсе дозь! в соответствии с настоящим изобретением могут содержать суточную дозу белка по настоящему изобретению или ее дольнье единицьї с тем, чтобьї получить требуемую дозу. Оптимальная терапевтически приемлемая доза и интенсивность оприема лекарства для данного пациента (млекопитающего, в том числе человека) зависит от ряда факторов, таких как активность конкретного применяемого активного соединения, возраста, веса тела, общего состояния здоровья, пола пациента, диеть, времени и пути введения, козффициента очищения крови, поставленной цели лечения, т.е. терапийи или профілактики, и природь! тромботического заболевания, которое лечат, антитромбоцитарной и антикогуляционной активности.
Потому в композициях или составах, полезньїх в качестве антикоагулянтов при лечений больного (в условиях іп мімо) фармацевтически зффективная доза пептида по настоящему изобретению составляет приблизительно от 0,01 до 100 мг/кг веса тела, преимущественно от 0,1 до 10 мг/кг веса тела. В соответствии с изобретением одна стандартная доза может содержать от 0,5 до 10 мг ингибитора тромбина. Для достижения антикоагуляционного зффекта в зкстракорпоральной крови фармацевтически активное количество пептида по изобретению составляет от 0,2 до 150 мг/л преимущественно от 1 мг до 20 мг/л зкстракорпоральной крови.
Целью настоящего изобретения является также имплантируемоє или размещаємое вне тела медицинское устройство, контактирующее сжиткостями организма, поверхность которого для придания ей достаточной тромбозности покрита иммобилизованньм поли пептидом, указанньм ранее и в формуле изобретеньі. Поли пептид по настоящему изобретению иммобилизует на медицинское устройство, с целью придания поверхности свойства биосовместимости и тромборозистентности. Указаннье устройства иногда имеют смачиваємьсе оповерхности, которье вьізьвают аггродирование тромбоцитов, что является нежелательньм, если указанию устройства предназначеньь для использования в имплантирующем и зкстракорпоральном устройстве, контактирующем с кровью как другими жидкостями организма. Примерами подобньїх устройств, которье обьчно изготавливают из пластмасс и синтетических волокон, являются протезьі, искусственнье органь, шовне материаль, сегменть искусственньїх сосудов, катетерь, диализаторь, трубки в сосудь! для хранения крови.
Настоящее изобретению далее иллюстрируется следующими примерами, которье приведень! лишь для пояснения изобретения и не лимитируют обьем притязаний по настоящему изобретению.
Промер І. Доказательство присутствия антитромбина в
Т. їезвщіашт
Года вьї Тпеготулоп їеззшайт гомогенизируют в изотоническом растворе. Гомогенизат в течение короткого времени центрифугируют для удаления частичек веществ и жидкость над осадком сохраняют для проведения следующего антитромбинового анализа и для указанньїх гематологических испьтаний.
Для оценки антитромбиновой активности 20 мкл указанного вьіше зкстракта смешивают с 10 мкл тромбина (І ед.). К зтой смеси приливают 100 мкл раствора, содержащего 0,5 мг/мл фибриногена, перемешивают и на | минуту помещают в инкубатор с температурой 3726.
Дальнейшие детали осуществления зтого теста описань Р.Т. Сойером и др. (Сотр, Наєтайоі Іпі. 1991,
Мої, рр. 35-41). В следующей таблице подьтожень сведения об ингибированиий параметров сгусткообразования в условиях іп міо с использованием неочищенньїх зкстрактов, полученньїх из
Тпеготугоп їеззшашт.
Таблица 1
Доказательство присутствия антитромбиновой активности в Т. (езвшШашт 11111111 | Контрольньеобразць,сек. | Неочищенньй зкстракт, сек. (внутренний)
Времятромбина(антитромбин)ї | -:////////457777777717171717171711711111111111111111160011СсСс1С
Как видно из приведенньїх данньїх, область головьї ТПеготугоп (еззШашт содержит растворимьй в воде фактор или факторь, которне значительно увеличивают время сгусткообразования тромбина.
Пример 2. Хромогенньй анализ на ингибирование тромбина и фактора Ха. а) Ингибирование тромбина. мкл раствора тромбина (5 ед. Национального института здоровья (МІН-)) тромбина/мл в 20 мм фосфатном буфере с рН 6,5 , содержащем 0,0595 полизтиленгликоля (ПЗГ) 6000) предварительно вьідерживают при комнатной температуре в течение 5 минут в инкубаторе вместе с 880 мкл буферного раствора для проведения анализа на тромбин (100 ьь Тгіз-НСІ, 200 мм Масі, 0,0595 ПОГ с рН 8,3) в фотометрической кювете. МИнициируют реакцию добавлением 100 мкл раствора субстрата (4 мг Спготогут ТН от фирмь! "Воеєпгіпдег", Мангейм, Германия, растворенного в 5 мл водьї) и определяют поглощение через каждье ЗО сек. при 25"С на длине волнь 405 нм в течение 5 минут.
Дія сценки активности ингибирования образць или гирудин в качестве стандарта в количестве 110-200 мкл смешивают с 20 мкл раствора тромбина и доводят общий обьем до 900 мкл с помощью буферного раствора для анализа. Полученную смесь предварительно-вадерживают в инкубаторе при температуре в течение 5 минут и инициируют реакцию добавлением 100 мкл раствора субстрата,
б) Ингибирование активности фактора Ха. мкл раствора фактора Ха (10 ед. /0,5 мл разбавляют водой до обьема 2,0 мл) предварительно вьідерживают при комнатной температуре в течение 5 минут в инкубаторе вместе с 880 мкл буферного раствора для проведения анализа на фактор Ха (100 мм Ттгіз -НСІ, 200мм Масі, 0.0595 ПОГ с рН 8,3) в фотометрической кювете. Инициируют реакцию добавлением 100 мкл раствора субстра-та (3,5 мг
Спготогут Х от фирмьї "Военгіпдег, Мангейм, растворенного в 5 мл водьї) и определяют поглощение через каждьсе 30 сек. при 25"С на длине волнь 405 нм з течение 5 минут.
Для оценки активности интибирования образць или гирудин в качестве стандарта в количестве 110-200 мкл смешивают с 20 мкл раствора Ма и добавляют общий обьем до 900 мкл с помощью буферного раствора для анализа. Полученную смесь предварительно вьідерживают в течение 5 минут и инициируют реакцию добавлением 100 мкл раствора субстрата.
Припер 3. Очистка ингибитора тромбина из
Стадия 1
Первье третьи части от 1000 откормленньхх второсортньїх ТНе готулоп (ез5цашт бьстро замораживают при температуре минус 70"С и подвергают сублимационной сушке. К полученному материалу добавляют 4095-ньій водньій раствор ацетона и гомогенизируют суспензию ультра-тораксом триждь по 10 секунд. Вслед за двухминутной обработкой ультразвуком в гомогенизаторе следуєт еще одна стадия гомогенизации (30 секунд). Гомогенизат центрифугируют в течение 15 минут со скоростью 6000 об/мин и полученную жидкость над осадком сохраняют (51).
К таблетке І добавляют еще 35 мл 40955-ного ацетона и проводят вторую гомогенизацию (І Х 10 сек.; 2 мин. гомогенизации ультразвуком; І Х 30 сек.) гомогенизацию опять-таки центрифугируют в течение 15 минут со скоростью 6000 об/мин. Жидкость над осадком 2 добавляют к жидкости над осадком | и к обьединенньїм растворам добавляют 8095-ньїй ацетон (об/об).
Доводят рН до 4,0 с помощью уксусной кислоть! и полученную суспензию центрифугируют в течение 20 мин. со скоростью 6000 об/мин. Таблетку З отделяют. Жидкость над осадком З упаривают в 4 раза с помощью ротационного испарителя (фирмь! " 5реєй Мас ").
Свободньй от оацетона зкстракт испьїтьшвшаєт на антитромбиновую активность по анализу сгусткообразования в соответствий с Примером І а таюже по хромогенному анализу в соответствии с
Примером 2.
Стадия 2
Свободньй от ацетона зкстракт помещают в колонку РО-10 (от фирмь! РНаптасіа") для замень буфера. Колонку уравнивают зфирньим буфером (20 мМ Ттгіз -НСІ, 50 мМ НС с рН 7,4) и в колонку помещают 2,5 мл зкстракта со стадии І. Злюат анализируют на антитромбиновую активность.
Тромбиновую аффинную колонку готовят следующим образом: 400 мг сухой матриць Аліасіоп
Тепіасіє Егасіоде! ("Е. Меск", Дармштадт, Германия) суспондируют в 7 мл буфера для связьівания (50 мМ фосфата, 150 мМ Насі с рн 7,55 при комнатной температуре в течение 2 час. Суспензию дваждь промьівают центрифугированием и ресуспендированием в буфере для связьівания:5000 МІН- ОО бьчьего тромбина ("Зіота") растворяют в 1 мл водьі и доводят рН до 7,5. Подученньй раствор тромбина уравнивают буфером для связьншвания с помощью колонки РО-10 для гель-проникающей хроматографии. К уравновешенному раствору тромбина добавляют сульфат натрия до конечной концентрации 1 м.
Тромбиновьй белок бьстро вносят пипеткой в активированную матрицу геля и дают возможность связьвваться при 4"С в течение 3 час. при медленном перемешиваний. Промьввают триждь! пятикратнь!м обьемом буфера для связьіввания. Для дезактивации матриць! добавляют 1,5 мл зтаноламина и оставляют при 4"С на ночь, слегка встряхивал. Промьшвают матрицу дваждь! пятикратньм обьемом ацетатного буфера (100 мМмі ацетата натрия, 50 мм хлорида натрия с рН 4,0). Заключительное уравнивание проводят, дваждь промьївая пятикратньмм обьеемом аффинного буфера.
Активнье злюать! колонки РО-10 подают в аффинную колонку с помощью перистальтического насоса (поток 10 мл/мин). Несвязанную фракцию собирают и промьшвают колонку 12 мл аффинного буфера (промьївка 1). Злюирование проводят 6 мл ацетатного буфера с рН 4,0 и собирают фракции обьемом 0,5 мл. Профиль злюирования зтой колонки представлен на Рис 1.
За первьім злюированием следуєт второе с использованием б мл ацетатного буфера с рн 3,0.
Собирают фракции по 1,5 мл. Колонку вновь уравновешивают с помощью 25 мл аффинного буфера.
Результать! стадии зкстракции и аффинной хроматографии суммировань! в следующей Таблице 2:
Таблица 2
Результать очистки ингибитора тромбина из Тпеготугоп (еззцШашт с помощью аффинной хроматографии
Фракция Обьем Время сгустко- Ингибирование Ингибирование фактора (мл) образования (сек.) | тромбина(меж.ед.) Ха(меж.ед.) пусвя 301010101010101111205119110 не связанньй 34 24,3 1,8 11 зкстракт после аффин. Хромат. ше Гб ово хромат. ше Пр хроглат.
Пример 4. Анализ активного ингибитора тромбина из Тпеготугоп їеззшайшт с помощьюшощьо» гель- проникающей хроматографии
Активное вещество помещают в колонку Віоде! РА ("Віогаа") обьемом 25 мл. Злюирование проводят 20
ММ Тіз - НОСІ, 50 мМ Масі с рн 7,4 со скоростью подачи реагентов 4 мл/час. На антитромбиновую активность исследуют фракция обьемом 1 мл.
Гель-матрица Р4 имеет предел разделения 5000 Да в позволяет проводить фракционирование в интервале молекулярньїх весов от 1000 до 5000 Да. Неожиданно бьіло обнаружено, что антитромбиновая активность злюируется во фракционируемьй обьем, т.е. очевидно имеет молекулярньій вес меньше 5000
Да (Рис.2). Такое поведение отличается от гирудина (молекулярньій вес 7000 Да), которьй в тех же условиях остаєтся в отдельном обьеме. Путем калибрования колонки Р. для антитромбинной активности из ТПеготугоп їеззшШашт бьл получен молекулярньй вес приблизительно 3000 Да.
Пример 5. ЖХЕР с обращенной фазой ингибитора тромбина из Тпеготугоп (еззцашт
Активнье злюать! после стадии аффинной хроматографии по Примеру З далее анализируют методьї
ЖХЕР с обращенной фазой. 20 мкл образца инжектируют в колонку ЖХЕР (Гі Спгозрпег 300 АР-18, 5 микрон; "Е.МогекК", Дармштадт, Германия) и градионтно злюируют в следующих ацетонитрильньмх растворах со скоростью подачи реагентов 1,0 мл/мин:
Буфер А: 0,195 трифторуксусной кислоть! в воде"
Буфер Б: 0,0895 трифторуксусной кислоть! в ацетонитриле.
Градиент: 0-2 мин. 1095 Б; 2-3 мин. инжекция; 3-28 мин. 6095 Б.
На Рис. З показана типичная аналитическая хроматограмма, записанная на длине волньі 220 нм.
Активность ингибитора тромбин обнаруживаеєется в пиках обозначенньх пик 2 и пик 4. Информацию, полученную с помощью аналитической ЖХЕР, используют для проведения препаративного разделения в тех же самьх условиях"
Препаративную очистку проводят, используя аликвотьї 500 мкд. После аффинной хроматографии (Рис.4). Отбирают индивидуальнье пики, алюируют и упаривают на ротационном испарителе Ббреєй Мас.
Упареннье фракции вновь растворяют в воде и анализируют на антитромбиновую активность в тесте по времени сгусткообразования, а также в хромогенном тесте, приведенном в Примере 2.
Наибольшая активность в обеих системах обнаружена у пиков 2 и 4, некоторая активность обнаруживается в пике 5, что вероятнее всего свидетельствуеєт о загрязнений пика 5 соединением пика 4.
Все другие пики на хроматограмме вовсе не проявляют антитромбиновой активности. Суммарная активность пиков 2 и 4 соответствует приблизительно 9395 общей активности.
Пример 6. Сравнениеє ингибитора тромбина по настоящему изобретению с гирудином методами ЖХЕР.
Чтобь! привести дальнейшие доказательства того, что ингибитор по настоящему изобретению является молекулой, принципиально отличной от гирудина, проводят следующий зксперимент. К активному пику 2 после ЖХЕР в соответствий с Примером 5 добавляют аналогичную белковую концентрацию очищенного гирудина и подвергают смесь ЖХЕР с обращенной фазой в градиенте ацето- нитрила (40-7095). Обнаружень два пика, которне содержат антитромбиновую активность (Рис. 5). С помощью сравнительньїх зкспериментов, в которьїх вводят индивидуальньюе ингибиторь), проводят отнесение пиков, как зто показано на Рис.5.
Из Рис. 5 очевидно, что антитромбин по настоящему изобретению злюируется совершенно отлично от гирудина. То же самое может бьіть показано для активного пика 4 после разделения методом ЖХЕР по
Примеру 5.
Пример 7. Дальнейшее изучение пика 2 антитромбиновой активностью
Чистота.
Злкированньй активньй пик 2 после ЖХЕР с ообращенной фазой оподвергают повторной хроматографии в тех же условиях, что и приведеннье на Рис. 3. Как показано на Рис. 6, от основного активного пика может бьть отделено небольшое количество примесного соединения, в итого после повторной ЖХЕР с обращенной фазой получают гомогенньій препарат (см. также Рис. 8, на котором представленьї данньєе капиллярного злектрофореза указанной фракции)
Ингибированного тромбина
Пик 2 после ЖХЕР с обращенной фазой проявляют активность и в анализе на сгусткообразование (время тромбина » 6бб0бсек/5 мл) и в хромогенном антитромбиновом анализе по Примеру 2. Активность в последнем тосте составляет 3,2 межд.ед./250 мкл. Ингибированная активность фактора Ха, определяемая по Примеру 2 в пике 2 не обнаруживается, что свидетельствует о том, что максимальная анти-фактор Ха активность составляєт ««. 195 от антитромбиновой активности. На зтом оснований можно заключить, что описанньй здесь ингибитор являются весьма специфичньїм по отношению к тромбину.
Титрование активньх участков
Константу ингибитора по отношению к тромбину определяют спектрофотометрическим титрованием стандартизированного раствора тромбина ингибитором по настоящему изобретению. Подробности метода описань в публикации С.М// Татезоп еї.аі.:Віоспет Т., 1973, Мої. 131,рр. 107-117.
Если коротко, то в зксперименте по титрованию используют флуорогенньій субстрат То5-СіІу-Рго-Ага-
АМС с концентрацией 50 мкМ. Анализ проводят в 100 мм Ттг -НСІ, 200 мМ масі, 00595 ЦОГ 6000 с рн 7,8 при 25"С. Титрованньій альфа-тромбин человека с концентрацией активньх участков 20 пМ вьідерживают в инкубаторе и вместе с ингибитором при 0,2-5 Х Ео в течение 10 минут и определяют постояннье скорости после добавления субстрата. Кинетические константь! рассчитьввают, используя программу нелинейного регрессивного анализа Сга Бії Стейнз, Великобритания, 1980). Найдено, что Кі составляет 178 фемтомолей.
Молекулярньй вес
Молекулярньй вес активного пика 2 определяют с помощью масс спектрометрии с лазерной десорбцией, используя метод МАЇ. 0І-ТОЕ (Кгаїо5). 0,5 мкл образца смешивают с небольшим количеством дигидроксибензойной кислоть! в ацетонитрил, которая служит матрицей. Смесь вьісушивают холодньм воздухом на поверхности серебряного прободержателя и помещают в прибор. Полученньій масс-спектр калибруют по стандартньмм белкам с известньмм молекулярньмм весом. Пик соответствует молекулярной массе около 9000 Да (Рис. 7).
Изозлектрофокусировка
Изозлектрическую точку ингибитора определяют методом капиллярного злектрофореза в режиме изозлектрофокусировки ("Арріїєй Віовзувіетв"). Как видно из Рис. 8, пик ингибитора появляєтся при значений 4,9, если сравнивать со стандартньми белками:
Пример 8. Данньсе о последовательности пика 2 с антитромбиновой активностью
Используя ЖХЕР с обращенной фазой (Пример 5), для пика 2 методом химического разложения по
Здману в белковом секвенвенторе фирмь "ВесКтап" получают следующую М-концевую последовательность: спи Авр Авр Авп Рго Су Рго Рго Аго Аа Сув Рго Су Спи
Пример 9. Дальнейшее изучение пика 4 с антитромбиновой активностью
Частота
Злкированньй активньй пик 4 после ЖХЕР с ообращенной фазой оподвергают повторной хроматографии в тех же условиях. Как показано на Рис. 9 от основного активного пика может бьть отделено небольшое количество примесного соединения и в итоге после повторной ЖХЕР с обращенной фазой получают гомогенньй препарат.
Ингибирование тромбина
Пик 4 после ЖХЕР с обращенной фазой проявляеєт активность и в анализе на сгусткообразование (время тромбина »600 сек/5 мл) и в хромогенном антибромбиновом анализе по Примеру: Активность в последнем тесте составляеєет 1,3 межд.ед./250 мкл. Ингибиторная активность фактора Ха, определяемая по
Примеру 2, в пике 4 не обнаруживаєтся, что свидетельствует о том, что максимальная анти-фактор Ха активность составляє ««195 от антитромбиновой активности. На зтом оснований можно заключить, что описанньй здесь ингибитор является весьма специфичньїм по отношению к тромбину.
Титрование активньх участков
Константу ингибитора по отношению к тромбину определяют спектрофотометрическим титрованием стандартизированного раствора тромбина ингибитором по настоящему изобретению. Подробности метода описань в Примере 7. Найдено, что Кі составляет 240 фемтомолей.
Молекулярньй вес
Молекулярньй вес активного пика 4 определяют с помощью масс спектрометрии с лазерной десорбцией, используя метод МАГО І-ТОЕ (Кгаїюз), как описано в Примере 7. Полученньій масс-спектр калибруют по стандартньмм белкам с известньмм молекулярньмм весом. Пик соответствует молекулярной массе около 14 кДа (Рис. 10).
Пример 10. Данньсе о последовательности пика 4 с антитромбиновой активностью
Используя ЖХЕР с обращенной фазой (Пример 5), для пика 4 методом химического разложения по
Здману в белковом секвенторе фирмь! "Весктап" получают следующую М-концевую последовательность:
Зег Спи Геи Су Сп Зег Сув Гуз Си Авп Рго Суз Рго еп Авп Меї и Сувз Авп Аг Сіи Тпп Рпе Гуз.
Пример 11.
Используя те же методики, что и приведеннье в Примерах1-5, можно вьіделить антитромббиновую активность из следующих видов ТПеготугоп;
Т. Віпаппи Іашт,
Т. соореїї,
Т. дагіаємі,
Т. таси вит, т. зехоси Іашшт жк я хантитромбиновая активность 000-280 нм мл/час й Ммардс рН
Фиг. 1 І з хантитромбиновая активность 002280 нм
Отделяемьй 4 мл/час обьем 13
Фиг. 2
І ра «ох ї У ра : / Га 8. | х . ОО в ;
Е Я Е
: І | | т рай і 57 В і ! 2 ї 23! У у
Фиг. З
4 5 6 7 :
Е а 2
Фиг. 4
М й ї - в , ІЗ й г ій т ї - / ; Е
Гирудин й і 4 ра А в: 7 Новьй ингибитор ї : ри тромбина Н Є р ; и і
Я | Н о че т 131-5 жі жннх пеижтітжчтннвільниячнії щі " Е з ; : в г
Імин)
Фиг. 5 о
З
Фиг. 6
Фракция 2 М/:
М/2х тя | І | | / | а 2000 2000 10000 15000 20000
Мопекулярньй вас (ОЇ
Фиг.7 рі - Нормь! -з.3і 54 43 28 -1.3 -4.3 ї -3.1 2 г -в 4 і -5.3 -17,5 кол ро ЧИ ни -..1 паля аа до Я, ні, Пий нііні п іпт п, ВНС пінні ПИВ нп ніш інки нинінініннння, питний
Фиг. 8 т 15 ' у
Фиг. 9
Мі:
М/22
І
2000 -З000 10000 15000 20000
Молекулярньй вес (01 . Фиг. 10
Claims (12)
1. Зкстракт, обладающий ингибиторной активностью по отношению к тромбину, отличающийся тем, что указанньй зкстракт содержит растворимье в воде компонентьій из тканей или секреций пиявок отряда Апупспобраеї!ї да семейства Тпеготугоп.
2. Зкстракт по п. 1, отличающийся тем, что он вьіделен из пиявок вида Пеготугоп (еззшашт.
3. Полипептид, обладающий ингибиторной активностью по отношению к тромбину, которьійй отличаєтся от гирудина по молекулярному весу, изозлектрической точке и последовательности аминокислот, отличающийся тем, что он получен из тканей или секреций пиявок отряда РНупспораеєїїйда семейства Тпеготугоп, предпочтительно Тпеготуоп (езвціацшт, путем гомогенизации передней третьей части замороженньіх и подвергнутьїх сублимационной сушке пиявок в смеси вода/ацетон и вьіделения полипептида путем последующей очистки водорастворимьїх компонентов полученного зкстракта методом тромбинспецифической аффинной хроматографии с последующей по крайней мере одной стадией гель-проникающей хроматографии и по крайней мере одной стадией жидкостной хроматографии вьсокого разрешения с обращенной фазой.
4. Полипептид по п. 3, отличающийся тем, что имеет молекулярньй вес около З кДа и вьіделенньй из зкстракта стадией гельпроникающей хроматографии с применением гелевой матрицьї, имеющей предел исключения 5 кДа.
5. Полипептид по п. 3, отличающийся тем, что имеет молекулярньй вес около 9 кДа и следующую М-концевую последовательность аминокислот: сіи-Авр-Авр-Авзп-Рго-С1у-Рго-Рго-Аго-АіІа-Сув-Рго-Сс11у-спи.
6. Полипептид по п. З, отличающийся тем, что имеет молекулярньй вес около 14 кДа и следующую М-концевую последовательность аминокислот: Зег-С1-ІЇ еи-спу-сІп-Зег-Сувз-зеї-І уз-СПи-Авп-Рго-Сувз-Рго-5ег-Авп-Меї-І уз-Сув-Авп-Аго-с1и-Тпг-РНе-ї ув.
7. Полипептид по одному из пп. 3-6, отличающийся тем, что его используют в качестве медицинского средства.
8. Полипептид по п. 7, отличающийся тем, что его используют в качестве ингибитора тромбина при лечениий іп мімо расстройств, вьізьіваемьх тромбозом.
9. Полипептид по п. 7, отличающийся тем, что его используют в качестве ингибитора тромбина для подавления агрегирования тромбоцитов в зкстракорпоральной крови.
10. Полипептид по одному из пп. 3-6, отличающийся тем, что его используют для приготовления фармацевтической композиции для лечения іп мімо расстройств, вьіізьяваемьх тромбозом.
11. Полипептид по одному из пп. 3-6, отличающийся тем, что его используют для приготовления фармацевтической композиции для подавления агрегирования тромбоцитов и образования сгустков крови в зкстракорпоральной крови.
12. Применение пиявок отряда НАНупспобраеїПйда, предпочтительно вида Тпеготу2оп (еззШіацшт в качестве исходного материала для получения веществ-ингибиторов тромбина по одному из пп. 3-5.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| GB939309509A GB9309509D0 (en) | 1993-05-07 | 1993-05-07 | Thrombin inhibitors |
| PCT/EP1994/001404 WO1994026777A1 (en) | 1993-05-07 | 1994-05-03 | Thrombin inhibitors |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| UA43831C2 true UA43831C2 (uk) | 2002-01-15 |
Family
ID=10735154
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| UA95018001A UA43831C2 (uk) | 1993-05-07 | 1994-03-05 | Інгібітори тромбіну з п'явок ряду rhynchobdellida родини theromyzon, екстракт та поліпептид, що мають інгібіторну активність |
Country Status (22)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5583111A (uk) |
| EP (1) | EP0652900B1 (uk) |
| JP (1) | JP3537437B2 (uk) |
| KR (1) | KR100335536B1 (uk) |
| AT (1) | ATE208793T1 (uk) |
| AU (1) | AU682368B2 (uk) |
| CA (1) | CA2139652C (uk) |
| CZ (1) | CZ287794B6 (uk) |
| DE (1) | DE69429062T2 (uk) |
| DK (1) | DK0652900T3 (uk) |
| ES (1) | ES2167364T3 (uk) |
| GB (1) | GB9309509D0 (uk) |
| HU (1) | HU226243B1 (uk) |
| NO (1) | NO318017B1 (uk) |
| PL (1) | PL179215B1 (uk) |
| PT (1) | PT652900E (uk) |
| RU (1) | RU2138275C1 (uk) |
| SK (1) | SK282860B6 (uk) |
| TW (1) | TW369541B (uk) |
| UA (1) | UA43831C2 (uk) |
| WO (1) | WO1994026777A1 (uk) |
| ZA (1) | ZA943171B (uk) |
Families Citing this family (13)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CA2380633A1 (en) * | 1999-08-06 | 2001-02-15 | Genentech, Inc. | Peptide antagonists of factor viia |
| GB9930659D0 (en) * | 1999-12-24 | 2000-02-16 | Bio Discovery Ltd | Inhibitors of complement activation |
| FR2834293B1 (fr) * | 2002-01-03 | 2005-02-04 | Ricarimpex | Extraits de sangsues a effet psychosomatique |
| US7164002B2 (en) | 2002-02-06 | 2007-01-16 | Genentech, Inc. | FVIIa antagonists |
| US20110034396A1 (en) * | 2005-09-28 | 2011-02-10 | Biovascular, Inc. | Methods and compositions for inhibiting cell migration and treatment of inflammatory conditions |
| US7691839B2 (en) * | 2005-09-28 | 2010-04-06 | Biovascular, Inc. | Methods and compositions for blocking platelet and cell adhesion, cell migration and inflammation |
| CN101095697A (zh) * | 2006-06-28 | 2008-01-02 | 李振国 | 水蛭和/或地龙分子量5800道尔顿以下的提取物 |
| RU2366441C2 (ru) * | 2007-08-03 | 2009-09-10 | Государственное учреждение гематологический научный центр Российской академии медицинских наук (ГУ ГНЦ РАМН) | Антикоагулянтное средство на основе биологически активного комплекса из коры кедра сибирского |
| TWI540132B (zh) * | 2009-06-08 | 2016-07-01 | 亞培公司 | Ｂｃｌ-２族群抑制劑之口服醫藥劑型 |
| RU2519741C2 (ru) * | 2012-06-25 | 2014-06-20 | Общество с ограниченной ответственностью Научно-внедренческая фирма "Гируд И.Н." (ООО НВФ "Гируд И.Н.") | Фармацевтическая композиция, обладающая противотромботическим, тромболитическим, иммуномодулирующим, противовоспалительным действиями, нормализующая липидный и углеводный обмен |
| US8501241B1 (en) | 2012-09-17 | 2013-08-06 | Biopep Solutions, Inc. | Treating cancer with a whole, leech saliva extract |
| CN108395475B (zh) * | 2018-03-29 | 2021-09-10 | 苏州至汇生物科技有限公司 | 一种基于亲和层析的水蛭素分离纯化方法 |
| CN116987181B (zh) * | 2023-09-27 | 2023-12-08 | 北京元延医药科技股份有限公司 | 高生物学活性的天然水蛭素和高收率制备它们的方法 |
Family Cites Families (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US3432596A (en) * | 1967-10-13 | 1969-03-11 | Dresden Arzneimittel | Method for producing highly pure hirudine |
| US4390630A (en) * | 1980-10-28 | 1983-06-28 | The Regents Of The University Of California | Hementin--a fibrinolytic agent |
| DE3689525D1 (de) * | 1985-07-17 | 1994-02-24 | Hoechst Ag | Neue Polypeptide mit blutgerinnungshemmender Wirkung, Verfahren zu deren Herstellung bzw. Gewinnung, deren Verwendung und diese enthaltende Mittel. |
| EP0347376B1 (en) * | 1988-06-11 | 1994-03-23 | Ciba-Geigy Ag | Novel polypeptides with an anticoagulant activity |
| GB8826428D0 (en) * | 1988-11-11 | 1988-12-14 | Biopharm Ltd | Antithrombin |
| DE69127346T2 (de) * | 1990-04-06 | 1998-02-26 | Merck Patent Gmbh, 64293 Darmstadt | Behandlung thrombotischer ereignisse |
-
1993
- 1993-05-07 GB GB939309509A patent/GB9309509D0/en active Pending
-
1994
- 1994-03-05 UA UA95018001A patent/UA43831C2/uk unknown
- 1994-05-03 JP JP52489694A patent/JP3537437B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 1994-05-03 AT AT94916187T patent/ATE208793T1/de not_active IP Right Cessation
- 1994-05-03 AU AU67950/94A patent/AU682368B2/en not_active Ceased
- 1994-05-03 KR KR1019950700039A patent/KR100335536B1/ko not_active Expired - Fee Related
- 1994-05-03 WO PCT/EP1994/001404 patent/WO1994026777A1/en not_active Ceased
- 1994-05-03 CA CA002139652A patent/CA2139652C/en not_active Expired - Fee Related
- 1994-05-03 SK SK8-95A patent/SK282860B6/sk not_active IP Right Cessation
- 1994-05-03 EP EP94916187A patent/EP0652900B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1994-05-03 CZ CZ199542A patent/CZ287794B6/cs not_active IP Right Cessation
- 1994-05-03 DE DE69429062T patent/DE69429062T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1994-05-03 ES ES94916187T patent/ES2167364T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1994-05-03 US US08/362,567 patent/US5583111A/en not_active Expired - Lifetime
- 1994-05-03 DK DK94916187T patent/DK0652900T3/da active
- 1994-05-03 RU RU95105983A patent/RU2138275C1/ru not_active IP Right Cessation
- 1994-05-03 PT PT94916187T patent/PT652900E/pt unknown
- 1994-05-03 HU HU9500038A patent/HU226243B1/hu not_active IP Right Cessation
- 1994-05-03 PL PL94307088A patent/PL179215B1/pl not_active IP Right Cessation
- 1994-05-06 ZA ZA943171A patent/ZA943171B/xx unknown
- 1994-08-02 TW TW083107061A patent/TW369541B/zh not_active IP Right Cessation
-
1995
- 1995-01-06 NO NO19950075A patent/NO318017B1/no not_active IP Right Cessation
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP0652900B1 (en) | 2001-11-14 |
| SK282860B6 (sk) | 2002-12-03 |
| ES2167364T3 (es) | 2002-05-16 |
| US5583111A (en) | 1996-12-10 |
| NO950075D0 (no) | 1995-01-06 |
| GB9309509D0 (en) | 1993-06-23 |
| AU6795094A (en) | 1994-12-12 |
| PL307088A1 (en) | 1995-05-02 |
| NO950075L (no) | 1995-01-06 |
| PT652900E (pt) | 2002-05-31 |
| PL179215B1 (pl) | 2000-08-31 |
| KR100335536B1 (ko) | 2002-11-11 |
| SK895A3 (en) | 1995-05-10 |
| ZA943171B (en) | 1995-01-11 |
| JPH07508765A (ja) | 1995-09-28 |
| CZ4295A3 (en) | 1995-10-18 |
| DE69429062D1 (de) | 2001-12-20 |
| RU2138275C1 (ru) | 1999-09-27 |
| CA2139652A1 (en) | 1994-11-24 |
| WO1994026777A1 (en) | 1994-11-24 |
| CZ287794B6 (en) | 2001-02-14 |
| DK0652900T3 (da) | 2002-02-25 |
| EP0652900A1 (en) | 1995-05-17 |
| DE69429062T2 (de) | 2002-06-20 |
| JP3537437B2 (ja) | 2004-06-14 |
| KR950702579A (ko) | 1995-07-29 |
| HU9500038D0 (en) | 1995-03-28 |
| CA2139652C (en) | 2003-03-18 |
| RU95105983A (ru) | 1997-02-27 |
| HUT70215A (en) | 1995-09-28 |
| HU226243B1 (en) | 2008-07-28 |
| AU682368B2 (en) | 1997-10-02 |
| ATE208793T1 (de) | 2001-11-15 |
| NO318017B1 (no) | 2005-01-24 |
| TW369541B (en) | 1999-09-11 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Markwardt | Past, present and future of hirudin | |
| US4736018A (en) | Blood coagulation inhibiting proteins, processes for preparing them and their uses | |
| US6774107B1 (en) | Protein for blocking platelet adhesion | |
| JPS60136597A (ja) | デスルフアトヒルジン、その製造及びそれを含む製薬組成物 | |
| Orevi et al. | A potent inhibitor of platelet activating factor from the saliva of the leech Hirudo medicinalis | |
| UA43831C2 (uk) | Інгібітори тромбіну з п'явок ряду rhynchobdellida родини theromyzon, екстракт та поліпептид, що мають інгібіторну активність | |
| US9034823B2 (en) | Medicament for therapeutic treatment and/or improvement of sepsis | |
| KR100455639B1 (ko) | 콜라겐-자극 혈소판 응집을 위한 단백질 및 이로 코팅된의료 기기 | |
| KR20010005529A (ko) | 덴드로아스핀 스캐폴드에 기초한 이 또는 다기능성 분자 | |
| NO170430B (no) | Fremgangsmaate for fremstilling av et protein som har antikoagulerende og anti-metastatiske egenskaper | |
| US6025330A (en) | Inhibitors of fibrin cross-linking and/or transglutaminases | |
| AU659807B2 (en) | Platelet adhesion inhibitor | |
| CA1317878C (en) | Method and therapeutic compositions for the treatment of bleeding disorders | |
| EP0239644A1 (en) | Novel physiologically active substance having blood coagulation controlling activity | |
| JP3878668B2 (ja) | 血栓性疾患の治療 | |
| RU2799764C2 (ru) | Лекарственное средство для терапевтического лечения и/или улучшения состояния при сепсисе, сопровождающемся коагулопатией | |
| AU2019366008B2 (en) | Drug for treating and/or improving septicemia associated with coagulation abnormality | |
| DK175116B1 (da) | Vævsfaktorprotein-antagonist til farmaceutisk anvendelse, anvendelse af vævsfaktorprotein-antagonister til fremstilling af et lægemiddel til behandling af hyperkoagulativ blödningsforstyrrelse, og terapeutisk doseringsform | |
| JPWO1987000050A1 (ja) | 血液凝固制御作用を有する新たな生理活性物質 | |
| JPS63146900A (ja) | 抗凝血性及び抗転移性特性を有するタンパク質 | |
| HK1130209B (en) | Therapeutic and/or ameliorating agent for disseminated intravascular coagulation | |
| JPWO1991004276A1 (ja) | 単離された生理的に活性なヒトトロンボモジュリンポリペプチド |