JPH10507064A

JPH10507064A - グルタメートゲーテッド塩素イオンチャンネルをコードするｄｎａ

Info

Publication number: JPH10507064A
Application number: JP7530522A
Authority: JP
Inventors: カリー，ドリス・エフ; アリーナ，ジヨウジフ・ピー; リウ，ケン・ケイ; バツシラテイス，デメトリオス
Original assignee: メルクエンドカンパニーインコーポレーテッド; ザ・トラステイーズ・オブ・コロンビア・ユニバーシテイ・イン・ザ・シテイ・オブ・ニユー・ヨーク
Priority date: 1994-05-25
Filing date: 1995-05-19
Publication date: 1998-07-14
Anticipated expiration: 2020-02-23
Also published as: ATE283368T1; CA2191063A1; EP0760864A1; CA2191063C; EP0760864A4; US5527703A; ES2232822T3; WO1995032302A1; JP3623798B2; EP0760864B1; DE69533796T2; DE69533796D1

Abstract

(57)【要約】グルタメート及びアベルメクチン感受性塩素イオンチャンネルをコードするＤＮＡをクローニングし、特徴付けした。個々のα及びβサブユニットはアベルメクチンまたはグルタメートのいずれかで開くホモマー及びヘテロマーのチャンネル選択性形成能を有する。これらのｃＤＮＡを組換え宿主細胞で発現させ、活性な組換えタンパク質を産生させる。この組換えタンパク質はまた、組換え宿主細胞から精製される。さらに、この組換え宿主細胞を使用してレセプター活性のモジュレーターを同定する方法を確立し、レセプターモジュレーターを同定する。このレセプターモジュレーターは、殺虫剤や駆虫薬として有用である。

Description

【発明の詳細な説明】グルタメートゲーテッド塩素イオンチャンネルをコードするＤＮＡ発明の背景アベルメクチン（avermectin）は、もともと放線菌（Streptomyces avermiti lis ）から単離された大環状ラクトン類の一員である。半合成アベルメクチン誘導体であるイベルメクチン（ivermectin: ２２，２３- ジヒドロ- アベルメクチンＢ_1a）は、ヒトおよび動物の寄生蠕虫症および昆虫害虫を処置するのに世界中で使用されている。約１５年前に発見されて以来、アベルメクチンは宿主に対して低毒性で最も有効なブロードスペクトルの体内及び外部寄生虫殺虫剤(endecto cide)となっている。アベルメクチンは線虫（シェーファー[Schaeffer]，Ｊ．Ｍ．＆ハインズ[Haines]，Ｈ．Ｗ．、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍ．３８、２３２９−２３３８（１９８９）；カリー[Cully]，Ｄ．Ｆ．＆パレス[Paress]，Ｐ．Ｓ．、ＭｏｌｅｃｕｌａｒＰｈａｒｍ．４０、３２６−３３２（１９９１））および昆虫（ローラー[Rohrer]，Ｓ．Ｐ．、マインケ[Meinke]，Ｐ．Ｔ．、ヘイズ[Hayes]，Ｅ．Ｃ．、ムロジック[Mrozik]、Ｈ．＆シェーファー[Schaeffer]，Ｊ．Ｍ．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、８９、４１６８−４１７２（１９９２））膜の高親和性部位と基本的に不可逆的な相互作用を示し、また線虫（マーチン[Martin]，Ｒ．Ｊ．＆ペニントン[Pennington]，Ａ．Ｊ．、Ｂｒ．Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．９８、７４７− ７５６（１９８９））、節足動物（スコット[Scott]，Ｒ．Ｈ．＆デュース[Duce ]，Ｉ．Ｒ．、Ｐｅｓｔｉｃ．Ｓｃｉ．１６、５９９−６０４（１９８５））、（デュース[Duce]，Ｉ．Ｒ．＆スコット[Scott]，Ｒ．Ｈ．、Ｂｒｉｔ．Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．、８５、３９５−４０１（１９８５））および甲殻類（ズフォール[Zufall]，Ｆ．、フランケ[Franke]，Ｃ．＆ハット[Hatt]，Ｈ．、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｂｉｏｌ．、１４２、１９１−２０５（１９８９））において、膜の塩素イオン透過性の増加を誘発する。アベルメクチン感受性の塩素イオンチャンネルの天然のリガンドは明らかになっていない（ターナー[Turner]，Ｍ．Ｊ．＆シェーファー[Schaeffer]，Ｊ．Ｍ．、Ivermectin and Abamectin（キャンベル[Camp bell]，Ｗ．Ｃ編）、７３−８８（ニューヨーク州、Springer-Verlag、１９８９）。グルタメートゲーテッド塩素イオンチャンネル（glutamate-gated chloride channel）即ちＨ−レセプターは節足動物の神経および筋肉中に同定されている（リングル[Lingle]，Ｃ．＆マーダー[Marder]，Ｅ．、ＢｒａｉｎＲｅｓ．２１２、４８１−４８８（１９８１））、（ホースマン[Horseman]，Ｂ．Ｇ．、セイモア[Seymour]，Ｃ．、ベルムデス[Bermudez]，Ｉ．＆ビードル[Beadle]，Ｄ．Ｊ．、Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｌｅｔｔ．８５、６５ −７０（１９８８））、（ワホード[Wafford]，Ｋ．Ａ．＆サテレ[Sattelle]，Ｄ．Ｂ．、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｂｉｏ．１４４、４４９−４６２（１９８９））、（リー［Lea］，Ｔ．Ｊ＆アシャーウッド[Usherwood]，Ｐ．Ｎ．Ｒ．、Ｃｏｍｐ．Ｇｅｎ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．４、３３３−３５０（１９７３））、（カル- キャンディ[Cull-Candy]，Ｓ．Ｇ．、Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．２５５、４４９−４６４（１９７６））。アベルメクチン類がバッタの筋肉のグルタメートゲーテッド塩素イオンチャンネルを活性化させるということが提案されている（スコット[Sco tt]，Ｒ．Ｈ．＆デュース[Duce]，Ｉ．Ｒ．、Ｐｅｓｔｉｃ．Ｓｃｉ．１６、５９９−６０４（１９８５））。土中線虫のＣａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓｅｌｅｇａｎｓはアベルメクチンに対して非常に敏感であり、各種の駆虫剤化合物の効果を調べるためのｉｎｖｉｔｒｏモデルとして使用される（シェーファー[Schaeffer] ，Ｊ．Ｍ．＆ハインズ[Haines]，Ｈ．Ｗ．、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍ．３８、２３２９−２３３８（１９８９））。Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓｐｏｌｙ（Ａ）⁺ ＲＮＡを注入されたアフリカツメガエル卵母細胞は、アベルメクチン感受性の塩素イオンチャンネルを発現する（アリーナ[Arena]，Ｊ．Ｐ．、リュー[Liu]，Ｋ．Ｋ．、パレス[Paress]，Ｐ．Ｓ．＆カリー[Cully]，Ｄ．Ｆ．、Ｍｏｌ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．４０、３６８−３７４（１９９１））。このチャンネルはまた、グルタメートに対しても感受性があることが確認されている（アリーナ[Arena ]，Ｊ．Ｐ．、リュー[Liu]，Ｋ．Ｋ．、パレス[Paress]，Ｐ．Ｓ．、シェーファー[Schaeffer]，Ｊ．Ｍ．＆カリー[Cully]，Ｄ．Ｆ．、Ｍｏｌ．ＢｒａｉｎＲｅｓ．１５、３３９−３４８（１９９２））。バッタの筋肉からのＨ- レセプターと同様に、グルタメートおよびアベルメクチン感受性の電流はイボテネート[i botenate]で活性化され、低親和力でピクロトキシンにより遮断される（スコット[Scott]，Ｒ．Ｈ．＆デュース[Duce]，Ｉ．Ｒ．、Ｐｅｓｔｉｃ，Ｓｃｉ．１６、５９９−６０４（１９８５））、（リー[Lea]，Ｔ．Ｊ＆アシャーウッド[Usherwood]，Ｐ．Ｎ．Ｒ．、Ｃｏｍｐ．Ｇｅｎ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．４、３３３−３５０（１９７３））、（カル- キャンディ[Cul l-Candy]，Ｓ．Ｇ．、Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．２５５、４４９−４６４（１９７６）、（アリーナ[Arena]，Ｊ．Ｐ．、リュー[Liu]，Ｋ．Ｋ．、パレス[Paress]，Ｐ．Ｓ．、シェーファー[Schaeffer]，Ｊ．Ｍ．＆カリー[Cully]，Ｄ．Ｆ．、Ｍｏｌ．ＢｒａｉｎＲｅｓ．１５、３３９−３４８（１９９２））。発明の概要無脊椎動物中のアベルメクチン作用の標的をクローン化および特徴付けしたが、これはリガンドゲーテッド塩素イオンチャンネルの新しいクラスに属するものである。組換え発現システムを使用して、無脊椎動物のグルタメートおよびアベルメクチン感受性の塩素イオンチャンネルをコードする２つの機能性ＤＮＡ分子を単離した。これらタンパク質の電気生理学的および構造的特性を、アミノ酸およびヌクレオチド配列と共に開示する。この組換えタンパク質は、チャンネルのモジュレーターを同定するのに有用である。この方法により同定されるモジュレーターは、治療薬、殺虫剤および駆虫剤として有用である。図面の簡単な説明図１−ＧｌｕＣｌαのヌクレオチド配列を示す。図２−ＧｌｕＣｌβのヌクレオチド配列を示す。図３−ＧｌｕＣｌαのアミノ酸配列を示す。図４−ＧｌｕＣｌβのアミノ酸配列を示す。図５−アフリカツメガエル卵母細胞中のグルタメート感受性およびＩＶＭＰＯ₄ 感受性電流の電気生理学的特性を示す。図６−ＧｌｕＣｌαおよびＧｌｕＣｌβの透過性および電圧依存性を示す。図７−ＩＶＭＰＯ₄によるグルタメート感受性電流の調節を示す。図８−ＧｌｕＣｌαおよびＧｌｕＣｌβの系統発生分析を示す。発明の詳細な説明本発明は無脊椎動物のグルタメートおよびアベルメクチン感受性塩素イオンチャンネル（ＧｌｕＣｌ）をコードするＤＮＡに関するもので、このチャンネルはＧｌｕＣｌ産生細胞から単離されたものである。本明細書においてはＧｌｕＣｌは、グルタメートによって開閉される(gated)アニオンチャンネルとして特異的に機能することができるタンパク質を意味する。無脊椎動物のＧｌｕＣｌのアミノ酸配列は従来知られておらず、またＧｌｕＣｌをコードしたヌクレオチド配列も不明であった。本発明はグルタメートゲーテッド塩素イオンチャンネルのクローン化に関する初めての報告である。これはまた、アベルメクチンの無脊椎動物標的および無脊椎動物のアベルメクチン感受性塩素イオンチャンネルのクローン化に関する最初の報告でもある。アベルメクチンに感受性のすべての生物は、ここに記述したグルタメートおよびアベルメクチン感受性チャンネルを含むものと考えられる。ＧｌｕＣｌ産生能力のある無脊椎動物細胞には、アベルメクチンに感受性を示す生物から単離された筋肉または神経細胞などがあるが、それらに限定されない。アベルメクチンに感受性の動物は多岐にわたり、節足動物門および線虫門に属する無脊椎動物などがこれに含まれる。その他の細胞および細胞系もまたＧｌｕＣｌｃＤＮＡの単離に使用するのに好適なものがありうる。好適な細胞の選択は、細胞抽出物中のＧｌｕＣｌ活性をスクリーニングすることによって行うことができる。ＧｌｕＣｌ活性は、³Ｈ− イベルメクチン結合検定（カリーおよびパレス、前掲；ローラーら、前掲）またはグルタメートおよびアベルメクチン感受性塩素イオンチャンネルの直接電気生理学的測定（マーチン[Martin]，Ｒ．Ｊ．＆ペニントン[Pennington]，Ａ．Ｊ．、Ｂｒ．Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．９８、７４７−７５６（１９８９）；スコット[Scott]，Ｒ．Ｈ．＆デュース[Duce]，Ｉ．Ｒ．、Ｐｅｓｔｉｃ．Ｓｃｉ．１６、５９９−６０４（１９８５）；デュース[Duce]，Ｉ．Ｒ．＆スコット[S cott]，Ｒ．Ｈ．、Ｂｒｉｔ．Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．、８５、３９５−４０１（１９８５）；ズフォール[Zufall]，Ｆ．、フランケ[Franke]，Ｃ．＆ハット [Hatt]，Ｈ．、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｂｉｏｌ．、１４２、１９１−２０５（１９８９））を実施することによりモニターすることができる。この検定でＧｌｕＣｌ活性を有する細胞は、ＧｌｕＣｌＤＮＡまたはｍＲＮＡの単離用に好適でありうる。ＧｌｕＣｌＤＮＡの分子クローン化には、当分野で公知の種々の方法のいずれも使用することができる。これらの方法としては、適当な発現ベクター系中にＧｌｕＣｌ含有ｃＤＮＡライブラリを構築した後、ＧｌｕＣｌ遺伝子の直接機能発現を行うものがあるが、これらに限定されない。別の方法としては、バクテリオファージまたはプラスミドシャトルベクター中に構築されたＧｌｕＣｌ含有ｃＤＮＡライブラリを、ＧｌｕＣｌサブユニットのアミノ酸配列から設計された標識オリゴヌクレオチドプローブを使用してスクリーニングするものである。その他の別法としては、バクテリオファージまたはプラスミドシャトルベクター中に構築されたＧｌｕＣｌ含有ｃＤＮＡライブラリを、ＧｌｕＣｌサブユニットをコードする部分的ｃＤＮＡを用いてスクリーニングするものがある。この部分的ｃＤＮＡは、精製ＧｌｕＣｌサブユニットのアミノ酸配列からの縮重オリゴヌクレオチドプライマーの設計を通して、ＧｌｕＣｌＤＮＡフラグメントの特異的ＰＣＲ増幅により得られる。別の方法は、ＧｌｕＣｌ産生細胞からＲＮＡを単離し、そのＲＮＡをｉｎｖｉｔｒｏまたはｉｎｖｉｖｏ翻訳システムを通してタンパク質に翻訳するものである。ＲＮＡをペプチドタンパク質に翻訳すると、ＧｌｕＣｌタンパク質の少なくとも一部が産生し、そのタンパク質は例えば抗ＧｌｕＣｌ抗体との免疫反応性またはＧｌｕＣｌタンパク質の生物学的活性によって同定することができる。この方法においては、ＧｌｕＣｌ産生細胞から単離されたＲＮＡプールを分析して、ＧｌｕＣｌタンパク質の少なくとも一部をコードするＲＮＡの存在を知ることができる。ＲＮＡプールをさらに分別して、ＧｌｕＣｌＲＮＡを非ＧｌｕＣｌＲＮＡから精製できる。この方法によって産生されたペプチドまたはタンパク質を分析して、アミノ酸配列を得、それをＧｌｕＣｌｃＤＮＡ産生のためのプライマーを得るために使用し、あるいは翻訳に使用したＲＮＡを分析してＧｌｕＣｌをコードするヌクレオチド配列を得、そしてＧｌｕＣｌｃＤＮＡ産生のためのプローブを作ることができる。この方法は当分野では既知のものであり、例えば、マニアティス[Maniatis]，Ｔ．、フリッチュ[Fritsch]，Ｅ．Ｆ．、サンブルック[Sambrook]，Ｊ．、Molecular Cloning :A Laboratory Manual 第２版、Cold Spring Harbor Laboratory Press、ニューヨーク州コールドスプリングハーバー、１９８９に記述されている。当業者には、他の型のライブラリー、並びに他の細胞または細胞型から構築されたライブラリーが、ＧｌｕＣｌをコードするＤＮＡの単離に有用でありうることは周知のことである。他の型のライブラリーとしては、他の細胞由来のｃＤＮＡライブラリー、Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ以外の生物からのｃＤＮＡライブラリー、およびＹＡＣ（酵母人工染色体）およびコスミドライブラリーを含むゲノムＤＮＡライブラリーなどがあるが、これらに限定されない。当業者には、適当なｃＤＮＡライブラリーがＧｌｕＣｌ活性を有する細胞または細胞系から調製できることは周知のことである。ＧｌｕＣｌｃＤＮＡを単離するためのｃＤＮＡライブラリーの調製用に使用する細胞または細胞系の選択は、まず細胞に連関しているＧｌｕＣｌ活性を、アベルメクチンおよびグルタメート感受性塩素イオンチャンネルの電気生理学的測定、あるいはグルタメートまたはアベルメクチンのリガンド結合検定により測定することによって行うことができる。ｃＤＮＡライブラリーの調製は当分野で周知の標準手法によって実施できる。周知のｃＤＮＡライブラリー構築手法は、例えば、マニアティス，Ｔ．、フリッチュ，Ｅ．Ｆ．、サンブルック，Ｊ．、Molecular Cloning ：A Laboratory Man ual 第２版（Cold Spring Harbor Laboratory、ニューヨーク州コールドスプリングハーバー、１９８９）に記載されている。当業者にはまた、ＧｌｕＣｌをコードするＤＮＡは適当なゲノムＤＮＡライブラリーから単離できることも周知である。ゲノムＤＮＡライブラリーの構築は当分野で周知の標準手法によって行うことができる。周知のゲノムＤＮＡライブラリー構築手法は、マニアティス，Ｔ．、フリッチュ，Ｅ．Ｆ．、サンブルック，Ｊ．、Molecular Cloning ：A Laboratory Manual 第２版（Cold Spring Harbor Laboratory、ニューヨーク州コールドスプリングハーバー、１９８９）に記載されている。上記の方法によってＧｌｕＣｌ遺伝子をクローン化するためには、ＧｌｕＣｌのアミノ酸配列が必要であろう。これを達成するためには、ＧｌｕＣｌタンパク質を精製し、そして自動配列決定装置によって部分的アミノ酸配列を決定すればよい。全アミノ酸配列を決定する必要はないが、部分的ＧｌｕＣｌＤＮＡフラグメントのＰＣＲ増幅のためのプライマーを作成するために、タンパク質の２つの領域の６から８のアミノ酸の直線配列を決定する。好適なアミノ酸配列が同定された後、それらをコードする能力のあるＤＮＡ配列が合成される。遺伝子コードは縮重しているため、特定のアミノ酸をコードするために１つ以上のコドンが使用され、従って、アミノ酸配列は類似ＤＮＡオリゴヌクレオチドのセットのいずれにもコードされる。セットの一員だけがＧｌｕＣｌ配列と同一であるが、その一員はミスマッチのＤＮＡオリゴヌクレオチドの存在下でさえもＧｌｕＣｌＤＮＡにハイブリダイズする能力がある。このミスマッチのＤＮＡオリゴヌクレオチドはなお、ＧｌｕＣｌをコードするＤＮＡの同定および単離を可能にするのに充分な程度にＧｌｕＣｌＤＮＡとハイブリダイズする。これらの方法によって単離されたＤＮＡを用いて多種類の細胞型由来、また無脊椎および脊椎動物源由来のＤＮＡライブラリーをスクリーニングし相同遺伝子を単離することができる。精製された生物学的活性を有するＧｌｕＣｌはいくつかの異なった物理的形態を有することがある。ＧｌｕＣｌは、全長の新生またはプロセシングを受けていないポリペプチド、あるいは部分的にプロセシングを受けたポリペプチドまたはプロセシングを受けたポリペプチドの組み合わせとして存在しうる。全長新生ＧｌｕＣｌポリペプチドは、特異的な蛋白分解開裂によって翻訳後に修飾することができ、それによって全長新生ポリペプチドのフラグメントが形成される。単一のフラグメント、または物理的に会合したフラグメントはＧｌｕＣｌに関連する完全な生物学的活性（グルタメートゲーテッドおよびアベルメクチンゲーテッド塩素イオンチャンネル）を有するが、ＧｌｕＣｌ活性の程度は個々のＧｌｕＣｌフラグメントと物理的会合ＧｌｕＣｌポリペプチドフラグメントでは差がありうる。本明細書に述べた方法により得られるクローン化ＧｌｕＣｌＤＮＡは、適当なプロモーターおよびその他適当な転写制御エレメントを含む発現ベクターへの分子クローン化により、組換え的に発現させることができ、原核または真核宿主細胞中に転移させて、組換えＧｌｕＣｌを産生させることができる。そのような操作技法は前掲のマニアチス，Ｔらに詳述されており、また当分野では周知である。発現ベクターとは、本明細書では、適当な宿主における遺伝子のクローン化コピーの転写およびそれらのｍＲＮＡの翻訳に必要なＤＮＡ配列と定義される。そのようなベクターを用いて、Ｅ．Ｃｏｌｉなどのバクテリア、ラン藻、植物細胞、昆虫細胞、酵母細胞を含む真菌細胞、および動物細胞のような各種の宿主中で真核遺伝子を発現させることができる。特異的に設計されたベクターは、バクテリア−酵母またはバクテリア−動物細胞またはバクテリア−真菌細胞またはバクテリア−無脊椎動物細胞のような宿主間でＤＮＡの相互自律増殖（shuttling）を可能とする。適切に構築された発現ベクターには次のものが含まれていなければならない：宿主細胞中での自律複製のための複製開始点、選択可能なマーカー、限定された数の有用な制限酵素部位、高次コピー能、および活性なプロモーター。プロモーターとは、ＲＮＡポリメラーゼをＤＮＡに結合させ、そしてＲＮＡ合成を開始させるＤＮＡ配列と定義される。強力なプロモーターとは、ｍＲＮＡを高頻度で開始させるものである。発現ベクターとしては、クローン化ベクター、修飾されたクローン化ベクター、特異的に設計されたプラスミドまたはウイルスなどがあるが、これらに限定されない。哺乳類細胞中で組換えＧｌｕＣｌを発現させるのに各種の哺乳類発現ベクターを使用できる。組換えＧｌｕＣｌ発現に好適と考えられる市販の哺乳類発現ベクターとしては、ｐＭＡＭｎｅｏ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）、ｐｃＤＮＡ３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ｐＭＣ１ｎｅｏ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、ｐＸＴ１（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、ｐＳＧ５（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、ＥＢＯ−ｐＳＶ２−ｎｅｏ（ＡＴＣＣ３７５９３）、ｐＢＰＶ−１（８−２）（ＡＴＣＣ３７１１０）、ｐｄＢＰＶ−ＭＭＴｎｅｏ（３４２−１２）（ＡＴＣＣ３７２２４）、ｐＲＳＶｇｐｔ（ＡＴＣＣ３７１９９）、ｐＲＳＶｎｅｏ（ＡＴＣＣ３７１９８）、ｐＳＶ２−ｄｈｆｒ（ＡＴＣＣ３７１４６）、ｐＵＣＴａｇ（ＡＴＣＣ３７４６０）およびｌＺＤ３５（ＡＴＣＣ３７５６５）などがあるが、これらに限定されない。バクテリア細胞中で組換えＧｌｕＣｌを発現させるのに各種のバクテリア発現ベクターを使用できる。組換えＧｌｕＣｌ発現に好適と考えられる市販のバクテリア発現ベクターとしては、ｐＥＴベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ）およびｐＱＥベクター（Ｑｉａｇｅｎ）などがあるが、これらに限定されない。酵母のような真菌細胞中で組換えＧｌｕＣｌを発現させるのに各種の真菌細胞発現ベクターを使用できる。組換えＧｌｕＣｌ発現に好適と考えられる市販の真菌細胞発現ベクターとしては、ｐＹＥＳ２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）およびＰｉｃｈｉａ発現ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）などがあるが、これらに限定されない。昆虫細胞中で組換えＧｌｕＣｌを発現させるのに各種の昆虫細胞発現ベクターを使用できる。ＧｌｕＣｌの組換え発現に好適と考えられる市販の昆虫細胞発現ベクターとしては、ｐＢｌｕｅＢａｃＩＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）などがあるが、これらに限定されない。ＧｌｕＣｌをコードするＤＮＡはまた、組換え宿主細胞で発現させるために発現ベクターにクローン化されてもよい。組換え宿主細胞は原核または真核とすることができ、Ｅ．Ｃｏｌｉのようなバクテリア、酵母のような真菌細胞、ヒト、ウシ、ブタ、サルおよび齧歯類由来の細胞系などの哺乳類細胞、ならびに、ショウジョウバエおよび蚕由来の細胞系などの昆虫細胞などがあるが、これらに限定されない。哺乳動物種由来の細胞系として好適且つ市販されているものには、ＣＶ−１（ＡＴＣＣＣＣＬ７０）、ＣＯＳ−１（ＡＴＣＣＣＲＬ１６５０）、ＣＯＳ−７（ＡＴＣＣＣＲＬ１６５１）、ＣＨＯ−Ｋ１（ＡＴＣＣＣＣＬ６１）、３Ｔ３（ＡＴＣＣＣＣＬ９２）、ＮＩＨ／３Ｔ３（ＡＴＣＣＣＲＬ１６５８）、ＨｅＬａ（ＡＴＣＣＣＣＬ２）、Ｃ１２７Ｉ（ＡＴＣＣＣＲＬ１６１６）、ＢＳ−Ｃ−１（ＡＴＣＣＣＣＬ２６）、ＭＲＣ−５（ＡＴＣＣＣＣＬ１７１）、Ｌ−細胞類、およびＨＥＫ−２９３（ＡＴＣＣＣＲＬ１５７３）などがあるが、これらに限定されない。発現ベクターは宿主細胞中に、形質転換、トランスフェクション、プロトプラスト融合、リポフェクション、および電気穿孔など、多くの技法のいずれかにより導入することができるが、技法はこれらに限定されない。発現ベクターを含む細胞はクローン増殖され、それらがＧｌｕＣｌタンパク質を産生するかどうかを調べるために個々に分析する。ＧｌｕＣｌを発現する宿主細胞クローンの同定は、抗ＧｌｕＣｌ抗体との免疫反応性、宿主細胞連関ＧｌｕＣｌ活性の存在の確認など、いくつかの方法により行うことができるが、方法はこれらのものに限定されない。ＧｌｕＣｌＤＮＡの発現はまた、ｉｎｖｉｔｒｏ産生の合成ｍＲＮＡを使用しても行うことができる。合成ｍＲＮＡまたはＧｌｕＣｌ産生細胞から単離されたｍＲＮＡは、小麦胚芽抽出物および網状赤血球抽出物などの各種の無細胞システム、並びにカエル卵母細胞へのマイクロ注入などの細胞ベースシステムで効率的に翻訳させることができるが、カエル卵母細胞へのマイクロ注入が好ましい。しかし、これらに限定されない。最適レベルのＧｌｕＣｌ活性および／またはＧｌｕＣｌタンパク質を産生するＧｌｕＣｌＤＮＡ配列（群）を決定するためには、下記のものを含むＧｌｕＣｌＤＮＡ分子を構築することができる：ＧｌｕＣｌα（５２，５５０ｋＤａ）およびＧｌｕＣｌβ（４９，９００ｋＤａ）サブユニットをコードするＧｌｕＣｌｃＤＮＡの全長オープンリーディングフレーム、それぞれおよそ塩基５１からおよそ塩基１，４３３までと、およそ塩基１４からおよそ１，３１５まで（これらの数字は第１メチオニンの最初のヌクレオチドおよび第１停止コドンの前の最後のヌクレオチドに相当）のもの、およびＧｌｕＣｌタンパク質をコードするｃＤＮＡの一部を含むいくつかの構築物。但しこれらに限定されるものではない。すべての構築物はＧｌｕＣｌｃＤＮＡの５’または３’非翻訳領域を全く含まないか、または全部もしくは一部を含むものに設計することができる。ＧｌｕＣｌ活性およびタンパク質発現のレベルは、これらの構築物を単独または組み合わせで適当な宿主細胞に導入した後に測定することができる。一過性検定で最適発現を与えるＧｌｕＣｌＤＮＡカセットの決定後、このＧｌｕＣｌＤＮＡ構築物を種々の発現ベクターに転移し、哺乳類細胞、バキュロウイルス感染昆虫細胞、Ｅ．Ｃｏｌｉ、および酵母Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅなどの宿主細胞で発現させるが、宿主細胞はこれらに限定されない。トランスフェクトされた宿主細胞およびマイクロ注入卵母細胞は、下記の方法によりＧｌｕＣｌチャンネル活性のレベルおよびＧｌｕＣｌタンパク質のレベルの両方について検定する。組換え宿主細胞の場合には、１つまたはそれ以上のサブユニットをコードするＧｌｕＣｌＤＮＡを含む１つあるいは可能であれば２つまたはそれ以上のプラスミドで同時トランスフェクションを行う。卵母細胞の場合には、１つまたはそれ以上のＧｌｕＣｌサブユニット用に合成ＲＮＡを同時注入する。発現させるために適当な時間をおいた後、細胞性タンパク質を、例えば³⁵Ｓ−メチオニンで２４時間代謝的に標識し、その後細胞溶解産物および細胞培養上清を採取し、ＧｌｕＣｌタンパク質に対するポリクローナル抗体で免疫沈降する。ＧｌｕＣｌ活性を検出するための他の方法は、ＧｌｕＣｌｃＤＮＡによりトランスフェクトされた細胞丸ごとまたはＧｌｕＣｌｍＲＮＡを注入された卵母細胞のＧｌｕＣｌ活性を直接測定するものである。ＧｌｕＣｌ活性は、ＧｌｕＣｌＤＮＡを発現する宿主細胞の特異性リガンド結合および電気生理学的特性により測定する。ＧｌｕＣｌを発現する組換え宿主細胞の場合は、パッチ電圧クランプ法を用いて塩素イオンチャンネル活性を測定し、ＧｌｕＣｌタンパク質を定量することができる。卵母細胞の場合には、塩素イオンチャンネル活性を測定し、ＧｌｕＣｌタンパク質を定量するために、パッチクランプ法並びに二電極式電圧クランプ法を使用することができる。宿主細胞中のＧｌｕＣｌタンパク質のレベルは、免疫親和および／またはリガンド親和法により定量される。ＧｌｕＣｌを発現する細胞は、細胞膜に結合した放射性グルタメートまたはイベルメクチンの量を測定することにより、発現されたＧｌｕＣｌ分子の数に関し検定することができる。例えば³⁵Ｓ−メチオニン標識または無標識ＧｌｕＣｌタンパク質を単離するのに、ＧｌｕＣｌ特異性の親和性ビーズまたはＧｌｕＣｌ特異性抗体が使用される。標識ＧｌｕＣｌタンパク質はＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析される。無標識ＧｌｕＣｌタンパク質は、ＧｌｕＣｌ特異性抗体を用いてウエスタンブロット法、ＥＬＩＳＡまたはＲＩＡ検定により検出される。遺伝子コードは縮重しているため、ある特定のアミノ酸をコードするのに２つ以上のコドンを使用することができ、従ってアミノ酸配列は類似ＤＮＡオリゴヌクレオチドのひとつのセットの内のいずれかによりコードさせることができる。そのセットの一員だけはＧｌｕＣｌ配列に同一であるが、ミスマッチのＤＮＡオリゴヌクレオチドの存在下でさえも、適当な条件下ではＧｌｕＣｌＤＮＡにハイブリダイズする能力がある。別の条件下では、ミスマッチのＤＮＡオリゴヌクレオチドはなおＧｌｕＣｌＤＮＡにハイブリダイズすることができ、ＧｌｕＣｌをコードするＤＮＡの同定および単離を可能にする。特定の生物からのＧｌｕＣｌをコードするＤＮＡは、他の生物からのＧｌｕＣｌ相同体を単離し、精製するのに使用することができる。これを行うためには、適当なハイブリダイズ条件で第１のＧｌｕＣｌＤＮＡをＧｌｕＣｌ相同体をコードするＤＮＡを含むサンプルと混合すればよい。ハイブリダイズされたＤＮＡ複合体を単離し、そこからＤＮＡ相同体をコードするＤＮＡを精製することができる。特定のアミノ酸をコードする種々のコドンには相当数の重複があることが知られている。従って、本発明は結果として同一のアミノ酸の翻訳をコードする別のコドンを含むＤＮＡ配列にも関する。この明細書の目的においては、１つまたはそれ以上の置換コドンを有する配列を、縮重変異体と定義する。同じく本発明の範疇に入るものとして、発現されたタンパク質の最終的な物性を実質的に変化させないＤＮＡ配列または翻訳タンパク質のいずれかにある変異もある。例えば、バリンとロイシン、アルギニンとリシン、またはアスパラギンとグルタミンの置換は、ポリペプチドの機能性に変化を起こさない可能性がある。ペプチドをコードするＤＮＡ配列は、天然のペプチドの特性と異なる特性のペプチドをコードするように変えることができることが知られてれいる。ＤＮＡ配列を変更する方法としては、部位指向性突然変異誘発があるが、これに限定されない。変更される特性の例としては、基質に対する酵素の親和性またはリガンドに対するレセプターの親和性の変化などがあるが、これらに限定されない。本明細書においては、ＧｌｕＣｌの“機能性誘導体”とはＧｌｕＣｌの生物活性と実質的に同様の生物活性（機能的または構造的いずれか）を有する化合物である。“機能性誘導体”という用語は、ＧｌｕＣｌの“フラグメント”、“変異体”、“縮重変異体”、“アナログ”および“相同体”または“化学的誘導体” を含むものとする。“フラグメント”という用語は、ＧｌｕＣｌのポリペプチドのサブセットをすべて意味するものとする。“変異体”という用語は、ＧｌｕＣｌ分子全体またはそのフラグメントのいずれかと実質的に類似した構造および機能の分子を指すものとする。ある分子がＧｌｕＣｌと“実質的に類似”するということは、両方の分子が実質的に同様の構造を有するか、あるいは両方の分子が類似した生物学的活性を有する場合のことである。従って、もし２つの分子が実質的に同様の活性を有する場合、それらはたとえ一方の分子の構造が他方の分子に見られなくても、あるいは２つのアミノ酸配列が同一でなくても、それらは変異体とみなされる。“アナログ”という用語は、ＧｌｕＣｌ分子全体またはそれのフラグメントのいずれかの機能が実質的に類似している分子を指す。組換え宿主細胞中でＧｌｕＣｌを発現した後、ＧｌｕＣｌを活性な形で得るためにＧｌｕＣｌタンパク質を回収する。いくつかのＧｌｕＣｌ精製方法が利用でき、好適に使用できる。前述の天然源からのＧｌｕＣｌの精製のように、組換えＧｌｕＣｌも、細胞溶解産物および抽出物、或いはならし培養培地から、塩分画、イオン交換クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、ヒドロキシアパタイト吸着クロマトグラフィーおよび疎水的相互作用クロマトグラフィーの、単独または種々の組み合わせにより精製することができる。さらに、組換えＧｌｕＣｌは、全長の新生ＧｌｕＣｌ、ＧｌｕＣｌのポリペプチドフラグメントまたはＧｌｕＣｌサブユニットに対して特異性のモノクローナルまたはポリクローナル抗体を用いた免疫親和性カラムを使用して、他の細胞性タンパク質から分離することができる。ＧｌｕＣｌに対して単一特異性の抗体は、ＧｌｕＣｌに対して反応性の抗体を含む哺乳類の抗血清から精製するか、またはケーラー[Kohler]およびミルスタイン[Milstein]、Ｎａｔｕｒｅ２５６：４９５−４９７（１９７５）の方法を用いて、ＧｌｕＣｌに反応性のモノクローナル抗体として調製する。単一特異性抗体とは、本明細書においては、ＧｌｕＣｌに対して均質な結合特性を有する単一抗体種或いは複数抗体種と定義される。均質な結合とは、本明細書において、前述のＧｌｕＣｌに連関したものなどの、特異的抗原またはエピトープに結合する抗体種の能力を意味する。ＧｌｕＣｌ特異性の抗体は、マウス、ラット、モルモット、ウサギ、ヤギ、ウマのような動物に、免疫アジュバントを使用または使用しないで、適当な濃度のＧｌｕＣｌを用いて免疫することにより作成されるが、ウサギを使用するのが好ましい。初回免疫に先立って免疫前の血清を採取する。各動物に、約０．１ｍｇから約１０００ｍｇの間のＧｌｕＣｌを、許容される免疫アジュバントとともに与える。そのような許容アジュバントとしては、フロイントの完全アジュバント、フロイントの不完全アジュバント、ミョウバン沈降物、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｐａｒｖｕｍを含む油中水滴型エマルションおよびｔＲＮＡなどがあるが、これらに限定されない。初回免疫は、皮下（ＳＣ）、腹腔内（ＩＰ）のいずれか、または両方で、複数の部位に、ＧｌｕＣｌを好ましくはフロイントの完全アジュバントに入れて与える。各動物は一定間隔で、好ましくは毎週採血して抗体価を測定する。動物には初回免疫後に、追加免疫をしてもしなくてもよい。追加免疫を受ける動物は、通常フロイントの不完全アジュバントに入れた等量の抗原を同じ経路で与える。追加免疫は最高の抗体価となるまで約３週間の間隔で与える。各追加免疫の約７日後、または１回免疫の後ほぼ毎週動物から採血し、血清を集めて、アリコートを約−２０℃で保存する。ＧｌｕＣｌに反応性のモノクローナル抗体（ｍＡｂ）は、近交系マウス、好ましくはＢａｌｂ／ｃをＧｌｕＣｌで免疫して調製される。マウスはＩＰまたはＳＣ経路によって、約０．１ｍｇから約１０ｍｇ、好ましくは約１ｍｇのＧｌｕＣｌを、前述のように等量の許容アジュバントを加えた約０．５ｍｌの緩衝液または生理食塩水に入れたもので免疫する。フロイントの完全アジュバントが好ましい。マウスは０日目に初回免疫を受け、約３から約３０週間放置される。免疫されたマウスは経静脈（ＩＶ）経路により約０．１から約１０ｍｇのＧｌｕＣｌをリン酸緩衝生理食塩水のような緩衝液に入れたもので１回ないしそれ以上追加免疫する。抗体陽性マウスからのリンパ球、好ましくは脾リンパ球を、当分野で公知の標準手法により、免疫マウスから脾臓を取り出すことによって得る。この脾リンパ球を適当な融合相手、好ましくは骨髄腫細胞と安定なハイブリドーマの形成ができるような条件下で混合して、ハイブリドーマ細胞を作る。融合相手としては、下記に限定されるものではないが、マウス骨髄腫Ｐ３／ＮＳ１／Ａｇ４−１；ＭＰＣ−１１；Ｓ−１９４およびＳｐ２／０などがあり、Ｓｐ２／０が好ましい。抗体産生細胞と骨髄腫細胞は、濃度約３０％から約５０％で約１，０００の分子量をもつポリエチレングリコール中で融合される。融合したハイブリドーマ細胞は、ヒポキサンチン、チミジンおよびアミノプテリン添加ダルベッコの修正イーグル培地（ＤＭＥＭ）中で、当分野で公知の手法により増殖して選択される。上清液を増殖陽性ウェルから約１４、１８、および２１日目に集め、抗原としてＧｌｕＣｌを使用して固相免疫放射検定（ＳＰＩＲＡ）のような免疫検定により抗体産生物をスクリーニングする。この培養液はまたモノクローナル抗体のアイソタイプを検査するためにオクタロニー沈降検定によっても試験される。抗体陽性ウェルからのハイブリドーマ細胞はマクファーソン[MacPherson]の軟寒天技法（クルーズ[Kruse]およびパターソン[Paterson]編、Tissue Culture Methods and Applications，Acade mic Press、１９７３刊中のSoft Agar Techniques）のような方法によりクローン化される。モノクローナル抗体は、プリスタン初回感作Ｂａｌｂ／ｃマウスに、初回感作約４日後に約２×１０⁶から約６×１０⁶のハイブリドーマ細胞を、マウス１匹当り約０．５ｍｌ注入することにより、ｉｎｖｉｖｏで作成される。細胞転移の約８〜１２日後に腹水を採取し、当分野で公知の方法によりモノクローナル抗体を精製する。抗ＧｌｕＣｌモノクローナル抗体のｉｎｖｉｔｒｏ産生は、約２％のウシ胎児血清を含むＤＭＥＭ中でハイブリドーマを増殖させ、充分な量の特異性モノクローナル抗体を得ることで行なう。このモノクローナル抗体は当分野で公知の方法により精製される。腹水またはハイブリドーマ培養液の抗体価は、沈降法、受動凝集法、酵素結合イムノソルベント抗体法（ＥＬＩＳＡ）および放射免疫検定（ＲＩＡ）法などの各種の血清学的または免疫学的検定法により測定されるが、これらに限定されない。体液または組織および細胞抽出物中のＧｌｕＣｌの存在を検出するためにも、同様の検定法が使用される。当業者には、単一特異性抗体を調製する上述の方法が、ＧｌｕＣｌポリペプチドフラグメント、または全長新生ＧｌｕＣｌポリペプチド、あるいは個々のＧｌｕＣｌサブユニットに特異性の抗体を作るために利用できることは周知のことである。特に、ただ１つのＧｌｕＣｌサブユニットまたは完全に機能的なグルタメートゲーテッド／アベルメクチンゲーテッド塩素イオンチャンネルに特異性の単一特異性抗体が作れることは、当業者には自明である。ＧｌｕＣｌ抗体親和性カラムは、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルで活性化されたゲル支持体であるＡｆｆｉｇｅｌ−１０（Ｂｉｏｒａｄ）に、アガロースゲルビーズ支持体と抗体が共有結合をするように抗体を付加することによって作られる。次いで、この抗体はスペーサーアームを有するアミド結合によりゲルに結合する。次いで残った活性化エステルは１ＭエタノールアミンＨＣｌ（ｐＨ８）で消去（クエンチ）される。カラムを水洗後０．２３ＭグリシンＨＣｌ（ｐＨ２．６）で洗浄し、非接合抗体または余分のタンパク質をすべて除去する。このカラムは次にリン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ７．３）中で平衡させ、ＧｌｕＣｌまたはＧｌｕＣｌサブユニットを含む細胞培養上清または細胞抽出物を緩やかにカラムに通す。このカラムを次に光学密度（Ａ₂₈₀）がバックグラウンド値に落ちるまでリン酸緩衝生理食塩水で洗浄し、さらにタンパク質を０．２３Ｍグリシン−ＨＣｌ（ｐＨ２．６）で溶出させる。精製されたＧｌｕＣｌタンパク質は、次いでリン酸緩衝生理食塩水で透析する。ｐＧｌｕＣｌαおよびｐＧｌｕＣｌβと命名された２つのＤＮＡクローンが同定されたが、これらはアフリカツメガエル卵母細胞で発現された時に、グルタメートおよびイベルメクチン−４−Ｏ−リン酸（ＩＶＭＰＯ₄）に感受性の塩素イオンチャンネルを形成するタンパク質をコードする。それぞれのサブユニットは明確に異なる電気生理学的および薬理学的特性を示すホモマーの塩素イオンチャンネルを形成する能力を有するものである。ＧｌｕＣｌαおよびＧｌｕＣｌβサブユニットが同時に発現された場合、その特性は２つのタンパク質の相互作用を示し、卵母細胞中でヘテロマーの塩素イオンチャンネルを形成する。ＧｌｕＣｌα及びβの同時発現は、ＧｌｕＣｌをコードするｐｏｌｙ（Ａ）⁺ＲＮＡを注入した卵母細胞で観察される特性を再構築することになる（アリーナ，Ｊ．Ｐ．、リュー，Ｋ．Ｋ．、パレス，Ｐ．Ｓ．＆カリー，Ｄ．Ｆ．、Ｍｏｌ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．４０、３６８ −３７４（１９９１））、（アリーナ，Ｊ．Ｐ．、リュー，Ｋ．Ｋ．、パレス，Ｐ．Ｓ．、シェーファー，Ｊ．Ｍ．＆カリー，Ｄ．Ｆ．、Ｍｏｌ．ＢｒａｉｎＲｅｓ．１５、３３９−３４８（１９９２））。これらの特性には、ＩＶＭＰＯ₄ 、グルタメートおよびイボテネートによる電流の直接活性化；グルタメートの存在下の脱感作；ＩＶＭＰＯ₄によるグルタメート感受性電流の強化；Ｉ／Ｖ関係の外向き矯正（outwardly rectifying）；ピクロトキシンおよびフルフェナム酸による低親和性遮断；並びにＧＡＢＡおよびグリシンに対する不感受性などが含まれる。グルタメートゲーテッド塩素イオンチャンネルは無脊椎動物においてのみ報告されており、昆虫の筋肉および神経細胞体、甲殻類筋肉中で見出され、そして昆虫筋肉ｐｏｌｙ（Ａ）⁺ＲＮＡから卵母細胞で発現される（リングル，Ｃ．＆マーダー，Ｅ．、ＢｒａｉｎＲｅｓ．２１２、４８１−４８８（１９８１））、（ホースマン，Ｂ．Ｇ．、セイモア，Ｃ．、ベルムデス，Ｉ．及びビードル，Ｄ．Ｊ．、Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｌｅｔｔ．８５、６５−７０（１９８８））、（ワホード，Ｋ．Ａ．＆サテレ，Ｄ．Ｂ．、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｂｉｏｌ．１４４、４４９ −４６２（１９８９））、（リー，Ｔ．Ｊ．＆アシャーウッド，Ｐ．Ｎ．Ｒ．、Ｃｏｍｐ．Ｇｅｎ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．４、３３３−３５０（１９７３））、（カル- キャンディ，Ｓ．Ｇ．、Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．２５５、４４９−４６４（１９７６））。（フレーザー[Fraser]，Ｓ．Ｐ．ら、Ｍｏｌ．ＢｒａｉｎＲｅｓ．８、３３１−３４１（１９９０））。Ｈ（過分極）レセプターという用語は、グルタメートゲーテッド塩素イオンチャンネルを、バッタ筋肉の興奮性Ｄ（脱分極）グルタメートレセプターから区別するために使用される（リー，Ｔ．Ｊ．及びアシャーウッド，Ｐ．Ｎ．Ｒ．、Ｃｏｍｐ．Ｇｅｎ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．４、３３３−３５０（１９７３））、（カル- キャンディ，Ｓ．Ｇ．、Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．２５５、４４９−４６４（１９７６））。ＧｌｕＣｌα及びβ ＲＮＡを注入した卵母細胞と同じように、節足動物Ｈ- レセプターはイボテネートで特性的に活性化され、ピクロトキシンにより低親和性で遮断され、またＧＡＢＡでは活性化されない（リングル，Ｃ．＆マーダー，Ｅ．、ＢｒａｉｎＲｅｓ．２１２、４８１−４８８（１９８１））、（ワホード，Ｋ．Ａ．＆サテレ，Ｄ．Ｂ．、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｂｉｏｌ．１４４、４４９−４６２（１９８９））、（カル- キャンディ，Ｓ．Ｇ．、Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．２５５、４４９−４６４（１９７６））、（リー，Ｔ．Ｊ．＆アシャーウッド，Ｐ．Ｎ．Ｒ．、Ｃｏｍｐ．Ｇｅｎ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．４、３５１−３６３（１９７３））。バッタ筋肉Ｈ- レセプターは、Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓｐｏｌｙ（Ａ）⁺ＲＮＡから発現されたグルタメートゲーテッド塩素イオンチャンネルと同じように、アベルメクチンで直接活性化される（スコット，Ｒ．Ｈ．＆デュース，Ｉ．Ｒ．、Ｐｅｓｔｉｃ，Ｓｃｉ．１６、５９９−６０４（１９８５））、（アリーナ，Ｊ．Ｐ．、リュー，Ｋ．Ｋ．、パレス，Ｐ．Ｓ．、シェーファー，Ｊ．Ｍ．＆カリー，Ｄ．Ｆ．、Ｍｏｌ．ＢｒａｉｎＲｅｓ．１５、３３９−３４８（１９９２））。さらに、バッタ神経細胞体のグルタメートゲーテッド塩素イオンチャンネルはアベルメクチンにより増強され、直接活性化される（アイダール[Aydar]，Ｅ．、ハーディング，Ｌ．、ビードル，Ｄ．Ｊ．＆ベルムデス，Ｉ．、ＰｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓｏｆｔｈｅＢｒｉｔｉｓｈＰｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌＳｏｃｉｅｔｙ２４頁（１９９３））。したがって、ＧｌｕＣｌαおよびＧｌｕＣｌβは節足動物のＨ- レセプターに関係するリガンドゲーテッド塩素イオンチャンネルの１種であると考えられる。このクラスのチャネルは、Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ中でアベルメクチンの標的となり、他の生物中でアベルメクチンの駆虫および殺虫作用を媒介すると考えられる。系統発生分析では、ＧｌｕＣｌαおよびＧｌｕＣｌβがリガンドゲーテッド塩素イオンチャンネルの特殊なサブクラスであり、グリシンαおよびβ、ＬｙｍｚおよびＤｒｏｓｒｄｌタンパク質に関連するものであることが示唆されている。これらのタンパク質は系統発生学的には関連しているが、異なるリガンドに応答し、薬理学的にも異なる（シュミーデン[Schmieden]，Ｖ．、グレニンロー[Grenning loh]，Ｇ．、ショフィールド[Schofield]，Ｐ．Ｒ．＆ベッツ[Betz]，Ｈ．、ＥＭＢＯＪｏｕｒｎａｌ８、６９５−７００（１９８９））、（フレンチ- コンスタント[ffrench-Constant]，Ｒ．Ｈ．、ロシュロー[Rocheleau]，Ｔ．Ａ．、スタイヘン[Steichen]，Ｊ．Ｃ．＆チャーマーズ[Chalmers]，Ａ．Ｅ．、Ｎａｔｕｒｅ３６３、４４９−４５１（１９９３））、（グレニンロー，Ｇ．ら、Ｎｅｕｒｏｎ４、９６３−９７０（１９９０））、（ハットン[Hutton]，Ｍ．Ｌ．、ハーベイ[Harvey]，Ｒ．Ｊ．、アーレイ[Earley]，Ｆ．Ｇ．Ｐ．、バーナード[Barnard]，Ｅ．Ａ．＆ダーリソン[Darlison]，Ｍ．Ｇ．、ＦＥＢＳｌｅｔｔｅｒｓ３２６、１１２−１１６（１９９３））。ＧｌｕＣｌαサブユニットとＧｌｕＣｌβサブユニットの関連性は、グルタメートとＩＶＭＰＯ₄の両方の結合部位が明らかに保存されている点にも現れている。ホモマーのＧｌｕＣｌ βチャンネルはグルタメートで直接活性化されるが、ＩＶＭＰＯ₄も結合する。なぜならば、グルタメートによる電流の活性化はＩＶＭＰＯ₄ の後では阻害されるからである。ホモマーのＧｌｕＣｌαチャンネルでは、ＩＶＭＰＯ₄で直接活性化された電流はグルタメートで一層活性化され、ＧｌｕＣｌ α上にグルタメートの結合部位があることを示している。アベルメクチンは、リガンドゲーテッド塩素イオンチャンネルファミリーのその他のものとも相互作用することが報告されている。線虫および昆虫ではアベルメクチンはＧＡＢＡ感受性電流を遮断するが、クレイフィッシュ（ザリガニ）中ではアベルメクチンはマルチトランスミッターゲーテッド塩素イオンチャンネル（グルタメート、アセチルコリン、ＧＡＢＡ）を直接活性化する（マーチン，Ｒ．Ｊ．＆ペニントン，Ａ．Ｊ．、Ｂｒ．Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．９８、７４７ −７５６（１９８９））、（ズフォール，Ｆ．、フランケ，Ｃ．＆ハット，Ｈ．、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｂｉｏｌ．、１４２、１９１−２０５（１９８９））、（ホールデン- ダイ[Holden-Dye]，Ｌ．＆ウォーカー[Walker]，Ｒ．Ｊ．、Ｐａｒａｓｉｔｏｌｏｇｙ１０１、２６５−２７１（１９９０））、（ベルムデス，Ｉ．、ホーキンス[Hawkins]，Ｃ．Ａ．、テイラー[Tayler]，Ａ．Ｍ．＆ビードル，Ｄ．Ｊ．、ＪｏｕｒｎａｌｏｆＲｅｃｅｐｔｏｒＲｅｓｅａｒｃｈ１１、２２１−２３２（１９９１））。ヒヨコ脳ＧＡＢＡ_aレセプターを発現している卵母細胞では、アベルメクチンはＧＡＢＡ応答を強化する（シーゲル[Sigel]，Ｅ．＆バウル[Baur]，Ｒ．、Ｍｏｌ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．３２、７４９−７５２（１９８７））。さらに、アベルメクチンは哺乳類グリシンレセプターへのストリキニーネの結合を阻害する（グラハム[Gra ham]，Ｄ．、ファイファー[Pfeiffer]，Ｆ．＆ベッツ，Ｈ．、Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｌｅｔｔｅｒｓ２９、１７３−１７６（１９８２））。しかしながら、ＧｌｕＣｌαおよびＧｌｕＣｌβタンパク質は、リガンドゲーテッド塩素イオンチャンネルファミリーの中で、グルタメートおよびイボテネートに関して特異な薬理学的特性を示す唯一のものであり、従ってリガンドゲーテッドイオンチャンネルファミリーの新しいサブクラスである。本発明はまた、ＧｌｕＣｌをコードするＤＮＡまたはＲＮＡの発現、ならびにｉｎｖｉｖｏでのＧｌｕＣｌタンパク質の機能を調節する化合物をスクリーニングする方法に関する。これらの活性を調節する化合物は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ペプチド、タンパク質、または非タンパク質性有機分子でありうる。これらの化合物はＧｌｕＣｌをコードするＤＮＡまたはＲＮＡの発現、またはＧｌｕＣｌタンパク質の機能を、強化または減弱化することにより調節しうる。ＧｌｕＣｌをコードするＤＮＡまたはＲＮＡの発現、あるいはＧｌｕＣｌタンパク質の機能を調節する化合物は、各種の検定法により検出することができる。検定は、発現または機能に変化があるかどうかを測定する単純な“ｙｅｓ／ｎｏ”検定とすることができる。この検定は、テストサンプルの発現または機能を、標準サンプルの発現または機能のレベルと比較することにより定量的なものとすることができる。この方法により同定されるモジュレーターは、治療薬剤、殺虫剤および駆虫剤として有用である。ＧｌｕＣｌＤＮＡ、ＧｌｕＣｌに対する抗体、またはＧｌｕＣｌタンパク質を含むキットを作ることもできる。そのようなキットは、サンプル中のＧｌｕＣｌＤＮＡにハイブリダイズするＤＮＡを検出したり、またはＧｌｕＣｌタンパク質またはペプチドフラグメントの存在を検出するために使用される。そのような特徴付けは、法的分析および伝染病学研究など、これらに限定されるものではないが、各種の目的に有用なものである。本発明のＤＮＡ分子、ＲＮＡ分子、組換えタンパク質および抗体は、ＧｌｕＣｌＤＮＡ、ＧｌｕＣｌＲＮＡまたはＧｌｕＣｌタンパク質をスクリーニングしたり、またそれらのレベルを測定するのに使用することができる。組換えタンパク質、ＤＮＡ分子、ＲＮＡ分子、および抗体はそれ自体で、ＧｌｕＣｌの検出およびタイプ分け用に好適なキットを構成できる。そのようなキットは少なくとも１つの容器内にきっちり保持するのに適した区画された（compartmentalized ）キャリヤを包含したものとなろう。このキャリヤにはさらに、ＧｌｕＣｌ検出に適した組換えＧｌｕＣｌタンパク質または抗ＧｌｕＣｌ抗体のような試薬も含むものとなろう。このキャリヤはまた標識抗原または酵素基質などのような検出手段も含むものとすることができる。アンチセンス治療のために、ＧｌｕＣｌをコードするＤＮＡ配列に相補的なヌクレオチド配列を合成することができる。これらのアンチセンス分子は、ＤＮＡ、ホスホロチオエートまたはメチルホスホネートのようなＤＮＡの安定誘導体、ＲＮＡ、２’−Ｏ−アルキルＲＮＡのようなＲＮＡの安定誘導体、またはその他のＧｌｕＣｌアンチセンスオリゴヌクレオチド疑似体とすることができる。ＧｌｕＣｌアンチセンス分子は、マイクロインジェクション、リポソーム封入またはアンチセンス配列を有するベクターからの発現によって細胞に導入することができる。ＧｌｕＣｌアンチセンス治療は、ＧｌｕＣｌ活性を低減させるのが有効な疾病の治療に特に有用である。ＧｌｕＣｌ遺伝子治療は、ＧｌｕＣｌを標的生物の細胞に導入するのに使用されうる。ＧｌｕＣｌ遺伝子はウイルスベクターに結合させることができ、このベクターが受手の宿主細胞に感染してＧｌｕＣｌＤＮＡの転移を媒介する。好適なウイルスベクターとしてはレトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルス、ポリオウイルスなどがある。かわりにＧｌｕＣｌＤＮＡを、リガンド−ＤＮＡ接合体またはアデノウイルス− リガンド−ＤＮＡ接合体を使用するレセプター媒介の標的ＤＮＡ転移、リポフェクション膜融合または直接マイクロインジェクションなどの非ウイルス技法により、遺伝子治療用に細胞に転移することもできる。これらの方法およびそれらの変形法は、ｅｘｖｉｖｏならびにｉｎｖｉｖｏのＧｌｕＣｌ遺伝子治療に好適である。ＧｌｕＣｌ遺伝子治療は特に、ＧｌｕＣｌ活性を引き上げるのが有効な疾病の治療に有用でありうる。ＧｌｕＣｌＤＮＡ、ＧｌｕＣｌＲＮＡ、またはＧｌｕＣｌタンパク質、あるいはＧｌｕＣｌレセプター活性のモジュレーターを含む薬学的に有用な組成物は、薬学的許容キャリヤとの混合のような公知の方法で調製することができる。そのようなキャリヤおよび処方調製法の例は、レミントンの薬剤科学[Remington ′s Pharmaceutical Sciences]に記述されている。有効な投与に適する薬学的許容組成物を作るためには、そのような組成物に有効量のタンパク質、ＤＮＡ、ＲＮＡ、またはモジュレーターを含ませることになる。本発明の治療または診断用組成物は、ＧｌｕＣｌ関連活性の変調が示されている疾病の治療または診断に必要充分な量をもって個体に投与される。有効量は個体の状態、体重、性別および年齢のような種々のファクターによって異なりうる。その他のファクターとしては投与方法もある。該薬剤組成物は、皮下、局所、経口および筋肉内など種々の経路で個体に投与することができる。 “化学的誘導体”という用語は、通常はベース分子の一部を構成するものではない付加的な化学的部分を含む分子を意味する。そのような部分は、ベース分子の溶解性、半減期、吸収などを改善することもある。あるいはそうした部分は、ベース分子の望ましくない副作用を弱めたり、ベース分子の毒性を軽減させることもある。そのような部分の例は、レミントンの薬剤科学のような種々のテキストに記述されている。本明細書で開示した方法に基づいて同定された化合物は、毒性の可能性を最小に抑さえ、且つＧｌｕＣｌレセプターまたはその活性の最適抑止効果を得るために、通常のテストによって適当な処方量を求め、単独で使用することができる。さらに、その他の薬剤との同時投与また順次投与が望ましいこともある。本発明はまた、本発明の新規な治療法用として好適な、局所、経口、全身および非経口薬剤組成物を提供するという目的も有する。ＧｌｕＣｌレセプターの調節用の活性成分として本発明に基づいて同定された化合物を含む組成物は、従来の投薬用賦形剤中の種々の治療投与形態で投与することができる。例えば、これらの化合物は錠剤、カプセル（それぞれ時間指定放出性および徐放性組成物を含む）、ピル、粉末、顆粒、エリキシル、チンキ剤、溶液、懸濁液、シロップおよびエマルションのような経口投与形態で、または注射により投与することができる。同様に、それらはまた静脈内（ボーラスおよび輸液の両方）、腹腔内、皮下、遮蔽または遮蔽しない局所、あるいは筋肉内形態で投与することもでき、すべての使用形態は薬剤分野の者に周知である。望ましい化合物の有効量且つ非毒性量を、ＧｌｕＣｌモジュレーターとして使用することもできる。これら生成物の日用量は、患者１人につき１日当り０．０１から１，０００ｍｇの広い範囲にわたる。経口投与の場合は、組成物は治療する患者に対して症状に合わせた投与のために活性成分として、好ましくは０．０１、０．０５、０．１、０．５、１．０、２．５、５．０、１０．０、１５．０、２５．０および５０．０ミリグラムを含むスコア付き(scored)またはスコアなしの錠剤の形として投与する。有効量の薬剤は通常、１日当り体重１ｋｇにつき約０．０００１ｍｇから約１００ｍｇの投与レベルで与えられる。この範囲はさらに具体的には、１日当り体重１ｋｇにつき約０．００１ｍｇから１０ｍｇである。ＧｌｕＣｌレセプターモジュレーターの処方量は、望ましい効果を達成するために組み合わせる場合には調節する。他方、これら種々の薬剤の処方量を個別に最適化し、いずれかの薬剤を単独で使用した場合よりも病状を軽減させるような相乗的結果を得るために組み合わせることもできる。便宜的には、本発明の化合物は１日１回投与してもよく、または合計日用量を１日２、３または４回の用量に分割して投与することもできる。さらに、本発明の化合物を適当な点鼻用賦形剤を局所的使用する点鼻用剤の形、あるいは当業者に周知の経皮性皮膚パッチの形態を使用した経皮経路で投与することもできる。経皮デリバリーシステムの形で投与する場合は、もちろん全投与を通じて、処方量の投与は間欠的ではなく連続的なものとなる。１つ以上の活性薬剤を使用する組合せ治療において、活性薬剤が個別の組成物となっている場合、それら活性薬剤を同時に投与することもできるし、或いはそれぞれを個別に時間をずらして投与することもできる。本発明の化合物を使用する処方法は、患者のタイプ、種、年齢、体重、性別および症状；治療すべき症状の程度；投与の経路；患者の腎臓および肝臓の機能；並びに使用される特定の化合物、など多くのファクターに応じて選択される。通常の技術の医者または獣医であれば、症状の進行の予防、対抗、または阻止に必要な薬剤有効量を簡単に決定し、処方することができる。毒性なしに効力を発揮させるような範囲の薬剤の濃度を達成するために最適精度で決めるためには、標的部位への薬剤の到達の動態をベースとした処方が必要である。これには薬剤の分布、平衡、および排除といったことを考慮に入れなけらばならない。本発明の方法において、本明細書で詳細に述べた化合物は活性成分を構成することができ、典型的にはこれらを投与しようとする形態、即ち経口錠剤、カプセル、エリキシル、シロップなどに応じて、また従来の薬学的慣行に沿って適切に選択された薬用希釈剤、賦形剤またはキャリヤ（ここではこれらを集合的に“キャリヤ”物質と呼ぶ）と混合した形で投与される。例えば、錠剤またはカプセルの形での経口投与の場合には、活性薬剤成分を、エタノール、グリセロール、水などの、経口用の非毒性で薬学的に許容される不活性キャリヤと組み合わせることができる。さらに、望ましい場合または必要な場合には、適当な結合剤、潤滑剤、崩壊剤および着色剤も混合物中に組み入れることができる。適当な結合剤としては、限定はされないが、澱粉、ゼラチン、グルコースまたはベータラクトースのような天然糖類、とうもろこし甘味料、アカシア、トラガカントまたはアルギン酸ナトリウムのような天然および合成ゴム、カルボキシメチルセルロース、ポリエチレングリコール、ワックスなどがある。これらの投与形態で使用される潤滑剤としては、限定はされないが、オレイン酸ナトリウム、ステアリン酸ナトリウム、ステアリン酸マグネシウム、安息香酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、塩化ナトリウムなどがある。崩壊剤としては、限定はされないが、澱粉、メチルセルロース、寒天、ベントナイト、キサンタンゴムなどがある。液体形状の場合は、例えばトラガカント、アカシア、メチルセルロースなどの天然および合成ゴムのような、適当にフレーバーのある懸濁剤または分散剤と活性薬剤成分を組合せることができる。その他使用できる分散剤としてグリセリンなども含まれる。非経口投与の場合は、滅菌した懸濁液または溶液が望ましい。静脈投与が望ましい場合には、通常適当な保存剤を含んだ等張性調剤が用いられる。活性薬剤成分を含んだ局所調剤の場合は、たとえばアルコール、アロエベラゲル、アラントイン、グリセリン、ビタミンＡおよびＥ油、鉱物油、ＰＰＧ２プロピオン酸ミリスチルなどのような当業界で周知の各種キャリヤ物質と混合し、たとえばアルコール溶液、局所クレンザー、クレンジングクリーム、スキンゲル、スキンローション、ならびにクリームまたはゲル組成物のシャンプーなどを作ることができる。本発明の化合物はまた、小さい単ラメラ小胞、大きな単ラメラ小胞および多重ラメラ小胞のようなリポソームデリバリーシステムの形で投与することもできる。リポソームは、コレステロール、ステアリルアミンまたはホスファチジルコリンのような各種のリン脂質から作ることができる。本発明の化合物はまた、その化合物分子を結合させたモノクローナル抗体を個々のキャリヤとして使用することによって送達されることもできる。本発明の化合物はまた、標的薬剤キャリヤとして溶解性ポリマーと結合させることもできる。そのようなポリマーとしては、ポリビニル- ピロリドン、ピランコポリマー、ポリヒドロキシプロピルメタクリル- アミドフェノール、ポリヒドロキシエチルアスパルトアミドフェノール、またはパルミトイル基で置換したポリエチレンオキシドポリリシンなどがある。さらに本発明の化合物は、薬剤のコントロール放出を達成するのに有用な一群の生物分解性ポリマー、たとえばポリ乳酸、ポリエプシロンカプロラクトン、ポリヒドロキシ酪酸、ポリオルトエステル、ポリアセタール、ポリジヒドロ- ピラン、ポリシアノアクリレートおよびヒドロゲルの架橋または両親媒性ブロックコポリマーなどに結合することができる。これらの化合物は、ヒト、動物、および植物に多くの寄生虫疾患を引き起こす体内および外部寄生虫、特に蠕虫および節足動物に対する抗寄生虫剤である。寄生虫疾患は体内寄生虫または外部寄生虫のいずれかで引き起こされる。体内寄生虫とは、宿主の体内の器官内（胃、肺、心臓、腸など）または単純に皮膚の下に生息する寄生虫である。外部寄生虫とは、宿主の外表面に生息し、なおかつ宿主から栄養素を吸収する寄生虫である。蠕虫病と一般的に呼ばれる体内寄生虫疾患は、蠕虫として知られている寄生虫に宿主が感染することによるものである。蠕虫病は、豚、羊、馬、牛、ヤギ、犬、猫、および家禽のような飼養動物への感染によって広く蔓延し、かつ世界的に深刻な経済的問題となっている。これら感染の多くは、線虫と呼ばれる一群の虫によって引き起こされるものであり、世界全土で各種の動物に疾病をもたらす。これらの疾病は重篤なものが多く、感染動物を死に至らせることがある。上記の動物に感染する最も一般的な線虫属は、Ｈａｅｍｏｎｃｈｕｓ、Ｔｒｉｃｈｏｓｔｒｏｎｇｙｌｕｓ、Ｏｓｔｅｒｔａｇｉａ、Ｎｅｍａｔｏｄｉｒｕｓ、Ｃｏｏｐｅｒｉａ、Ａｓｃａｒｉｓ、Ｂｕｎｏｓｔｏｍｕｍ、Ｏｅｓｏｐｈａｇｏｓｔｏｍｕｍ、Ｃｈａｂｅｒｔｉａ、Ｔｒｉｃｈｕｒｉｓ、Ｓｔｒｏｎｇｙｌｕｓ、Ｔｒｉｃｈｏｎｅｍａ、Ｄｉｃｔｙｏｃａｕｌｕｓ、Ｃａｐｉｌｌａｒｉａ、Ｈｅｔｅｒａｋｉｓ、Ｔｏｘｏｃａｒａ、Ａｓｃａｒｉｄｉａ、Ｏｘｙｕｒｉｓ、Ａｎｃｙｌｏｓｔｏｍａ、Ｕｎｃｉｎａｒｉａ、Ｔｏｘａｓｃａｒｉｓ、およびＰａｒａｓｃａｒｉｓである。多くの寄生虫は種特異性（ただ一種類だけの宿主に感染）であり、またそれらのほとんどは動物内に好みの感染部位を持っている。ＨａｅｍｏｎｃｈｕｓおよびＯｓｔｅｒｔａｇｉａは主として胃に感染するのに対し、ＮｅｍａｔｏｄｉｒｕｓおよびＣｏｏｐｅｒｉａは主として腸を攻撃する。その他の寄生虫は、心臓、眼、肺、血管などに好んで住みつくが、さらに他の種のものは皮下寄生虫である。蠕虫症は弱体化、体重減少、貧血、腸の損傷、栄養不良、およびその他の器管に損傷を与えることがある。これらの疾病を治療せずに放置すると動物を死に至らせることがある。マダニ、ダニ、シラミ、サシバエ、ツノサシバエ、クロバエ、ノミなどのような外部寄生節足類による感染もまた深刻な問題である。これらの寄生虫による感染は、血液減少、皮膚の病変を起こし、また正常な食習慣を損なわせ、体重減少を招くことがある。これらの感染はまた、脳炎、アナプラズマ症、豚痘など、致命的な重病に至らせることもある。動物は同時に数種類の寄生虫に感染されることがあるが、これは一種類の寄生虫による感染が動物を弱らせ、第２の寄生虫種による感染に対して敏感になるためである。したがってこれらの疾病の治療には、広範な活性領域を有する化合物が特に有利である。本発明の化合物はこれらの寄生虫に対する活性を有するものであり、さらに犬のＤｉｒｏｆｉｌａｒｉａに対しても、齧歯類のＮｅｍａｔｏｓｐｉｒｏｉｄｅｓおよびＳｙｐｈａｃｉａ、咬傷昆虫に対しても、また牛のＨｙｐｏｄｅｒｍａｓｐ．、馬のＧａｓｔｒｏｐｈｉｌｕｓのような移動性双翅目幼虫に対しても活性である。これらの化合物はまた、ヒトに寄生虫疾患をもたらす体内および外部寄生虫に対しても有用である。ヒトに感染するそれら体内寄生虫の例としては、Ａｎｃｙｌｏｓｔｏｍａ、Ｎｅｃａｔｏｒ、Ａｓｃａｒｉｓ、Ｓｔｒｏｎｇｙｌｏｉｄｅｓ、Ｔｒｉｃｈｉｎｅｌｌａ、Ｃａｐｉｌｌａｒｉａ、Ｔｒｉｃｈｕｒｉｓ、Ｅｎｔｅｒｏｂｉｕｓ属などの胃腸寄生虫がある。ヒトに感染するその他の体内寄生虫は、血液中またはその他の器官中に発見される。そのような寄生虫の例としては、Ｗｕｃｈｅｒｉａ、Ｂｒｕｇｉａ、Ｏｎｃｈｏｃｅｒｃａなどのフィラリア性虫、ならびにＳｔｒｏｎｇｙｌｉｄｅｓおよびＴｒｉｃｈｉｎｅｌｌａである腸管内寄生虫の腸外段階のものがある。ヒトに寄生する外部寄生虫には、マダニ、ノミ、ダニ、シラミなどの節足動物があり、また家畜動物においてはこれらの寄生虫による感染は、重大な、時には致命的な病気に至らせることがある。本発明の化合物は、これら体内および外部寄生虫に対して活性であり、加えてヒトを悩ます咬傷昆虫およびその他の双翅目害虫に対しても活性である。これらの化合物はまた、Ｂｌａｔｅｌｌａｓｐ．（ゴキブリ）、Ｔｉｎｅｏｌａｓｐ．（シミ）、Ａｔｔａｇｅｎｕｓｓｐ．（カツオブシムシ）、Ｍｕｃｓａｄｏｍｅｓｔｉｃａ（イエバエ）およびＳｏｌｅｎｏｐｓｉｓＩｎｖｉｃｔａ（外来フシアリ）などの一般的な屋内の害虫に対しても有用である。これらの化合物はさらに、アブラムシ（Ａｃｙｒｔｈｉｏｓｉｐｈｏｎｓｐ．）、バッタ、およびメキシコワタミゾウムシのような農業害虫、並びにＴｒｉｂｏｌｉｕｍｓｐ．のような貯蔵穀物を荒らす昆虫害虫、および植物組織に生息する未成熟段階の昆虫に対しても有用である。これらの化合物はまた、農業的に重大な土中線虫の抑制用の線虫殺虫剤としても有用である。動物の抗寄生虫剤として使用する場合には、これらの化合物は経口または注射により体内に、あるいは浸液またはシャンプーとして局所的に投与することができる。経口投与の場合、これらの化合物はカプセル、錠剤、またはボーラスの形で投与することもでき、あるいは代わりに動物の餌に混合することもできる。カプセル、錠剤、およびボーラスは、活性成分と澱粉、タルク、ステアリン酸マグネシウム、またはリン酸二カルシウムのような適当なキャリア・賦形剤を組み合わせて含むものとする。これらの単位投与形態のものは、活性成分が、希釈剤、充填剤、崩壊剤、および／または結合剤などの適当な微粉状不活性成分と、均一な混合物となるように十分に混合して調製される。不活性成分とは、これらの化合物と反応せず、また治療しようとする動物に対して非毒性のものである。好適な不活性成分としては、澱粉、ラクトース、タルク、ステアリン酸マグネシウム、植物性のゴムおよび油などがある。これらの組成物には、治療する動物種の大きさと種類および感染の種類と程度など、多くのファクターに応じて大幅に異なった量の活性および不活性成分を含みうる。活性成分はまた、それら化合物を単純に餌と混ぜるか、または化合物を餌の表面に塗布することによって、餌の添加物として投与することもできる。代わりに、活性成分を不活性キャリヤと混合し、その組成物を餌と混ぜるか、あるいは動物に直接給餌するか、のいずれかとすることもできる。好適な不活性キャリヤとしては、コーンミール、シトラスミール、発酵残留物、大豆粗粉、乾燥穀物などがある。活性成分はこれらの不活性キャリヤと、粉砕、撹拌、摩砕、あるいは回転混合により、最終組成物が０．００１から５重量パーセントの活性成分を含むように十分に混合する。代わりにこれらの化合物は、活性成分を不活性液体キャリヤに溶解した組成物を注射することによって、非経口的に投与することもできる。注射は筋肉内、こぶ胃内（intraruminal）、気管内、または皮下のいずれかとすることができる。注射可能な組成物は、活性成分を適当な不活性液体キャリヤと混合したもので構成される。許容される液体キャリヤとしては、ピーナッツ油、綿実油、胡麻油などの植物油、ならびにsolketal、グリセロール・フォーマルなどのような有機溶剤がある。代わりに、水性の非経口組成物も使用できる。植物油は好ましい液体キャリヤである。これらの組成物は、活性成分を液体キャリヤに、最終組成物が０．００５から１０重量パーセントの活性成分を含むように、溶解または懸濁させて調製する。これらの化合物の局所適用は、本発明化合物を水性溶液または懸濁液として含む液浸またはシャンプーを使用することにより可能である。これらの組成物は通常、ベントナイトのような懸濁剤を含み、また普通は消泡剤も含む。活性成分を０．００５から１０重量パーセント含む組成物が許容される。好ましい組成物は、本発明化合物を０．０１から５重量パーセント含むものである。これら化合物は主に、牛、羊、馬、犬、猫、ヤギ、豚、および家禽類のような飼養動物の嬬虫症の治療および／または予防のための抗寄生虫剤として有用なものである。それらはまた、マダニ、ダニ、シラミ、ノミなどの外部寄生虫によるこれら動物の寄生虫感染の予防および治療にも有用である。それらはまた、ヒトの寄生虫感染の治療にも有用である。そのような感染の治療において、これら化合物は個別に使用するか、または互いに組み合わせるか、または無関係のその他の抗寄生虫剤と組み合わせて使用することもできる。最良の結果を得るために必要なこれら化合物の処方量は、動物の種類と大きさ、感染の種類と程度、投与方法と使用する化合物などのいくつかのファクターに応じて異なる。化合物の処方レベルとしては、動物の体重１ｋｇ当り０．０００５から１０ｍｇを、１回処方または数日間の間隔を置いた数回処方とする、経口投与が一般的に良好な結果をもたらす。通常これら化合物の１種類の１回処方で良好に病状をコントロールできるが、再感染に対抗したり、あるいは異常に頑固な寄生虫種に対しては、繰り返し処方をしてもよい。これら化合物を動物に投与する技法については、獣医学の分野の者には公知のことである。これらの化合物はまた、農場または貯蔵中の収穫物を攻撃する農業害虫に対抗するためにも使用することができる。そのような用途にはこれらの化合物をスプレー、粉剤、エマルションなどの形で、栽培中の植物または収穫物に適用する。このような方法でこれらの化合物を適用する技法については、農業分野の者には公知のことである。以下の実施例は本発明を説明するものであるが、本発明を限定するものではない。実施例１Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓＲＮＡの単離Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ培養物を、Ｅ．ｃｏｌｉを播種した寒天ペトリ皿上で維持し、ＳｕｌｓｔｏｎおよびＨｏｄｇｋｉｎ〔ＴｈｅＮｅｍａｔｏｄｅＣａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓＥｌｅｇａｎｓ、ｐ６０２〜６０３（１９８８）、W ．Ｂ．Ｗｏｏｄ編、出版社：ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＰｒｅｓｓ、ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ、ＮｅｗＹｏｒｋ〕の記載に従って６０％ショ糖浮遊法により単離した。Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ調製物を液体窒素中で急速に凍結し、液体窒素に沈めた状態で乳鉢と乳棒を用いて粉砕した。４Ｍのグアニジニウムチオシアネート、５ｍＭのクエン酸ナトリウム（ｐＨ７．０）、および０．１Ｍのβ−メルカプトエタノールを含有する溶液を、虫１ｇ当り１０ｍｌの割合で冷凍粉末化した虫を加えながら、ポリトロン・ホモジナイザーによって混合した。５分間ホモジネートした後、０．５％のサルコシルナトリウムを加え、充分混合し、そして溶液を１０，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。上清を５．７ＭのＣｓＣｌクッション上に重ね、３３，０００ｒｐｍで１６時間遠心分離した。ＲＮＡペレットを７０％エタノールにて洗浄し、Ｈ₂Ｏ中に再懸濁し、クロロホルム：イソブタノール（４：１）にて抽出を行い、エタノールにて沈澱させた。オリゴ（ｄＴ）−セルロースカラム上で精製を２回行いポリＡ（⁺）ＲＮＡを単離した。ポリＡ（＋）ＲＮＡのアガロースゲル精製ゲル化温度が極めて低いアガロース（ＳｅａＰｒｅｐ、ＦＭＣ）を使用してポリＡ（＋）ＲＮＡをサイズ分画した。１５ｍＭのＮａＰＯ₄、１ｍＭのＥＤＴＡ（ｐＨ６．５）中でアガロース（２％）をボイルして、一旦完全に溶解させ、１５ｍＭのヨード酢酸（ＩＡＡ）を加え、アガロースを更に２分ボイルして存在するＲＮａｓｅをすべて不活性にした。全ての溶液を０．１％ジエチルピロカーボネートにて１２時間処置し、１５分間オートクレーブに付した。ゲル装置と分取用くしを１５ｍＭのＩＡＡ中に１２時間浸し、ＤＥＰで処理したＨ₂Ｏにて濯いだ。ゲルを作成し、緩衝液を循環させながら、１５ｍＭのＮａＰＯ₄と１ｍＭのＥＤＴＡ（ｐＨ６．５）中で、４℃、６．５Ｖ／ｃｍで電気泳動を行った。約２０時間、若しくはゲル中のキシレンシラノールが７ｃｍになるまでＲＮＡの電気泳動を行った。ゲル内７．５ｃｍの所からゲルの原点までの部分から約１〜２ｍｍのゲルスライスを切り出し、１〜４７の番号を（下から上の順で）付した。ＲＮＡのサイズ分画約１５０μｇのＣ．ｅｌｅｇａｎｓポリＡ（＋）ＲＮＡをエタノールにて沈澱させ、その乾燥ペレットを４００μｌのホルムアミド中に再懸濁し、６５℃で３分間変性させ、５０μｌの１％ＳＤＳと１０ｍＭのＥＤＴＡとを加え、混合し、得られたサンプルを６５℃で３分間加熱した。５０μｌのＲＮＡローディング（ loading）緩衝液（５０％グリセロール、１ｍＭのＥＤＴＡ、０．４％ＢＰＢ、０．４％ＸＣ）を加え、サンプルを直ちにロードした。ＲＮＡの回収ゲルスライスを１５ｍｌのチューブに加え、融解するまで６５℃の浴中に置いた。１０ｍｌの予め温めた１倍（１×）のオリゴｄＴ結合緩衝液（ＢＢ）を加え（０．５ＭのＫＣｌ、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）、１ｍＭのＥＤＴＡ）、サンプルを混合し、室温（約２３℃）にした。１ｇのオリゴｄＴセルロース（タイプ７、Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を１倍ＢＢ中で水和し、１ｕｇ／ｍｌのｔＲＮＡと２５ｕ／ｍｌのＲＮａｓｉｎ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を含む１５ｍｌの１倍ＢＢ中に再懸濁した。２００μｌのオリゴｄＴセルロース懸濁液を、溶融した各アガロースサンプル中に取り分け、１時間、反転（end-over-e nd）揺動した。サンプルを遠心分離し、１倍のＢＢにて１回洗浄し、１倍の洗浄緩衝液（０．１ＭのＫＣｌ、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）、１ｍＭのＥＤＴＡ）にて２回洗浄した。サンプルをチューブに移し、１０，０００×ｇにて１分間遠心分離し、ペレットを２００μｌの溶出緩衝液（１０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）、１ｍＭのＥＤＴＡ）に再懸濁した。緩衝化したフェノールを用いて６５℃で、またＣＨＣｌ₃を用いて２２℃でＲＮＡを抽出し、酢酸ナトリウムを１μｇのキャリヤｔＲＮＡとともに０．３Ｍ加え、２容量のエタノールにてＲＮＡを沈澱させた。エタノールによる沈澱を繰り返し、使用時までＲＮＡをエタノール沈澱物として−２０℃で貯蔵した。実施例２プラスミドの調製ＳｔｒａｔａｇｅｎｅからプラスミドベクターｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＳＫＩＩ（＋）を得た。１５０ｍＭのＮａＣｌ、６ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．９）、６ｍＭのＭｇＣｌ₂および１ｍＭのＤＴＴを含む４６μｌの溶液中の２０ユニットのＮｏｔＩと２４ユニットのＥｃｏＲＶにより、プラスミド（４μｇ）を３７℃で２時間消化分解した。酵素を６５℃で１０分間加熱して不活化し、緩衝化したフェノールにて２回、ＣＨＣｌ₃にて２回抽出し、０．３Ｍの酢酸ナトリウムと２容量の１００％エタノールにて沈澱させた。ペレットを２０．５μ ｌの水に再懸濁し、２．５μｌの１０倍量ＡＰ緩衝液（０．５ＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ９．０）、１０ｍＭのＭｇＣｌ₂、１ｍＭのＺｎＣｌ₂、１０ｍＭのスペルミジン）を１μｌ（１ユニット）のアルカリフォスファターゼ（Ｐｒｏｍｅｇａ）と共に加え、４２℃で３０分反応させ、１ユニットのＡＰのアリコートを追加して更に３７℃で３０分反応させた。ＴＡＥ緩衝液（４０ｍＭのＴｒｉｓ−アセテート、１ｍＭのＥＤＴＡ（ｐＨ８．３））中の０．８％ＳｅａＫｅｍＬＥアガロースゲルでサンプルを電気泳動し、ＣｌｅａｎＧｅｎｅ（Ｂｉｏ１０１）を使用してゲルから線状ベクターＤＮＡを精製した。連結ＥｃｏＲＶ−ＮｏｔＩによって消化した線状のｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＳＫＩＩ（＋）ＤＮＡ約７５ｎｇを、ＣＬ６Ｂカラムの最初から約３．１ｍｌの内の１５μｌ中の約６ｎｇのｃＤＮＡと混合し、０．５ユニットのＴ４ＤＮＡリガーゼ（ＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒＭａｎｎｈｅｉｍ）にて１６時間、１６℃で処理した。８Ｍの酢酸ＮＨ₄を７．５μｌと１００％エタノールを２容量添加してサンプルを沈澱させた。ペレットを７０％エタノールにて洗浄し、乾燥し、そして２ μｌの水に再懸濁した。実施例３ｐＧｌｕＣｌαとｐＧｌｕＧｌβのクローニングｃＤＮＡの合成第１ストランドの合成：画分２１および２２からのＲＮＡの約半分を使用してｃＤＮＡを合成した。ＲＮＡ沈澱物を遠心分離し、ペレットを７０％エタノールで洗浄し、真空乾燥した。ＲＮＡペレットをＤＥＰ処置した２５μｌのＨ₂Ｏ中に再懸濁し、１０分間６５℃で加熱して、氷上に置いた。下記の試薬を氷上に加えた：２μｌのＲＮａｓｉｎ（４０ｕ／μｌ）、１μｌのアクチノマイシンＤ（１００％エタノール中で用時調製、８００μｇ／μｌ）、１０ μｌの５倍ＲＴ緩衝液（２５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．３）、３７５ｍＭのＫＣｌ、１５ｍＭのＭｇＣｌ₂、ＢＲＬ）、０．１ＭのＤＤＴを５μｌ、５ｍＭのｄＮＴＰを５μｌ、１１ｎｇ／μｌのプライマーオリゴヌクレオチド：５’ＧＡＧＡＧＡＧＡＧＡＧＡＧＡＧＡＧＡＧＡＧＣＧＧＣＣＧＣＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴ３’（配列番号：５）を２．８μｌ、および２００ｕ／μｌのＭｏｌｏｎｅｙＭｕｒｉｎｅＬｅｕｋｅｍｉａウイルスリバーストランスクリプターゼを０．５μｌ。反応液を３７℃で６０分間インキュベートし、フェノール：ＣＨＣｌ₃（１：１（容量比）、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）にて緩衝化したフェノール（ＢＲＬ））にて抽出し、製造業者（ＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒＭａｎｎｈｅｉｍ）の仕様に従ってセファロースＧ −５０カラム上で精製した。第２ストランドの合成：Ｇ−５０カラム（ＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒＭａｎｎｈｅｉｍ）からの第１ストランド生成物を５５μｌに調整し、下記の試薬類を４℃ で加えた：１０μｌの１０倍第２ストランド緩衝液（２００ｍＭのＴｒｉｓ（ｐＨ７．４）、７０ｍＭのＭｇＣｌ₂、１ＭのＫＣｌ）、５μｌのＢＳＡ（１ｍｇ／ｍｌ）、５ｍＭのｄＮＴＰ（ヌクレオチドトリフォスフェート）を３μｌ、１０μｌのＮＡＤ（１．４ｍＭ、ｐＨ７．２、ＲＮａｓｅを含まない方法で調製し、−２０℃で保存）、５μｌのＰ³²ｄＣＴＰ（３０００Ｃｉ／ｍｍｏｌ、１０．０ｍＣｉ／ｍｌ）、２．５μｌのＥ．ｃｏｌｉリガーゼ（ＮＥＢＬ：６ｕ／μｌ）、１．１μｌのＲＮａｓｅＨ（１．１ｕ／μｌ、Ｐｈａｒｍａｃｉａ）、および７μｌのＤＮＡｐｏｌＩ（４ｕ／μｌ、Ｐｈａｒｍａｃｉａ）。反応液を６０分間は１６℃、１２０分間は２２℃、１０分間は６５℃とし、次いで氷上に置いた。反応液を、緩衝化フェノールを用いて２回、ＣＨＣｌ₃：イソアミルアルコール（２４：１（容量比））を用いて２回抽出した。１μｌのサンプルをｃＤＮＡ合成の定量のために取り出し、酢酸ナトリウムを、２０μｇのグリコーゲン（ＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒＭａｎｎｈｅｉｍ）と２容量の１００％エタノールと共に加えて０．３Ｍにし、ＤＮＡを−２０℃で沈澱させた。ｃＤＮＡ合成をＴＣＡ沈澱によって定量した。第２ストランド合成の後１：１０の希釈液を作成し、１μｌを１０ｍｌのＡｑｕａｓｏｌに加え、添加された放射性物質の総量を見積もった。１μｌのアリコートを５０μｇのキャリヤＤＮＡ（１００ μｌ）および１００μｌの２５％ＴＣＡと混合し、０．１％のＮａピロフォスフェートを１５分氷上に加えた。１０％ＴＣＡと０．１％Ｎａピロフォスフェートとの中に予め浸漬しておいたＧＦ−Ｂガラスフィルター上で４℃にて真空濾過して沈澱物を回収し、氷冷した１０％のＴＣＡにてフィルターを洗浄した。フィルターを１０ｍｌのＡｑｕａｓｏｌを含むバイアルに加え、放射能を定量した。画分２１および２２からのＲＮＡの約半分からのｃＤＮＡの見積り収量は２８２ｎｇであった。第２ストランド合成からのＤＮＡをＴ４ＤＮＡポリメラーゼにて処理し、ＤＮＡ末端を平滑化した。ＤＮＡペレットを２５μｌの水の中に再懸濁し、３μｌの１０倍Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ緩衝液を１．５μｌの５ｍＭｄＮＴＰおよび０．５μｌのＴ４ＤＮＡポリメラーゼと共に加えた。３０分間３７℃で反応させた後、０．５μｌの５００ｍＭＥＤＴＡを加えて反応を停止し、緩衝化したフェノール：ＣＨＣｌ₃（１：１）にて２回、ＣＨＣｌ₃にて２回抽出し、０．３Ｍの酢酸ナトリウムと２容量の１００％エタノールとにより沈澱させた。ＤＮＡペレットを水１７μｌ、１ｍｇ／ｍｌＢＳＡ０．２μｌ、１０倍ＮｏｔＩ緩衝液（ＮＥＢＬ）２μｌ、及び０．４μｌ（４ｕ）のＮｏｔＩの中に再懸濁し、３７℃にて３時間インキュベートした。サンプルを、緩衝化したフェノール：ＣＨＣｌ₃（１：１）にて２回、ＣＨＣｌ₃にて２回抽出し、０．３Ｍの酢酸ナトリウムと２容量の１００％エタノールとで沈澱させた。ＤＮＡ沈澱物を２５μｌの水に再懸濁し、５分間６５℃で加熱し、氷上で冷却し、２．５μｌの５ＭＮａＣｌを加え、予め平衡化したセファロースＣＬ６Ｂカラム（０．７×２２ｃｍ）にサンプルを加え、０．５ＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）および１ｍＭのＥＤＴＡ中を通過させた。１００μｌのサンプルを回収し、カラムから排除されカラムのボイド容量（約３．１ｍｌ）中で溶出したｃＤＮＡを含む画分についてＣｈｅｒｅｎｋｏｆｆカウントにてモニターした。ＴＣＡ沈澱から得た特異活性に基づきｃＤＮＡを定量し、Ｃｈｅｒｅｎｋｏｆｆカウントの測定効率を２１％と見積もった。ピーク８の画分から得たｃＤＮＡは約２６８ｎｇと見積もられた。１００μｌの画分の各々を１０μｇのグリコーゲンと２容量の１００％エタノールにてエタノール沈澱した。ペレットを１０μｌの水中に再懸濁し、緩衝化したフェノール：ＣＨＣｌ₃（１：１）にて抽出し、５μｌの水を用いてフェノールクロロフォルムを逆抽出し、ＣＨＣｌ₃で２度抽出し、１．５μｌの３Ｍ酢酸ナトリウム、及び１６．５μｌのイソプロパノールを２２℃で加えた。遠心分離によってペレットを回収し、洗浄し、乾燥し、そして５μｌの水に再懸濁した。ＤＮＡをＴＯＰ１０Ｅ．ｃｏｌｉセル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に電気穿孔し、アンピシリンを含む液体培地中で生育させてクローンを選択した。２×１０⁵の組換え体を表す増幅されたライブラリーから抽出したＤＮＡをＮｏｔＩで消化し、ゲル電気泳動によってサイズで分別した。４．０〜４．７Ｋｂの線状ＤＮＡを回収し（ＣｌｅａｎＧｅｎｅ（Ｂｉｏ１０１）使用）、再度クローニングし、５０００の組換え体のプールを得た。５０００のコロニーを個々のＬＢ−Ａｍｐ寒天プレート上に置き、一晩生育させ、ＬＢ培地中に剥離し、１／３を細菌ストックとして−７０℃で冷凍し、残りを用いてＰｒｏｍｅｇａＷｉｚａｒｄＭｉｎｉｐｒｅｐシステムにてＤＮＡを調製した。ＮｏｔＩによってＤＮＡを線状化し、インビトロＲＮＡの合成に使用した。実施例４ｐＧｕｌＣｌα及びｐＧｌｕＣｌβの特徴付け前述した当業界で公知の標準的な方法〔Ａｒｅｎａ，Ｊ．Ｐ．、Ｌｉｕ，Ｋ．Ｋ．、Ｐａｒｅｓｓ，Ｐ．Ｓ．およびＣｕｌｌｙ，Ｄ．Ｆ．、Ｍｏｌ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．４０、３６８〜３７４（１９９１）；Ａｒｅｎａ，Ｊ．Ｐ．、Ｌｉｕ，Ｋ．Ｋ．、Ｐａｒｅｓｓ，Ｐ．Ｓ．、Ｓｃｈａｅｆｆｅｒ，Ｊ．Ｍ．およびＣｕｌｌｙ，Ｄ．Ｆ．、Ｍｏｌ．ＢｒａｉｎＲｅｓ．１５、３３９〜３４８（１９９２）〕を使用してアフリカツメガエルの卵母細胞の調製・注入を行った。雌の成熟アフリカツメガエルを０．１７％のトリカインメタンスルホネートで麻酔し、卵巣を外科的に取り出し、８２．５ｍＭのＮａＣｌ、２ｍＭのＫＣｌ、１ｍＭのＭｇＣｌ₂、１．８ｍＭのＣａＣｌ₂、５ｍＭのＨＥＰＥＳを含み、ＮａＯＨによってｐＨ７．５に調整した（ＯＲ−２）皿の中に置いた。卵巣の葉を破壊して開き、数回濯ぎ、０．２％のコラゲナーゼ（Ｓｉｇｍａ、タイプ１Ａ）を含むＯＲ−２中で２〜５時間穏やかに震とうした。濾胞層（follicular layer）の約５０％が除去された時、ステージＶとＶＩの卵母細胞を選択し、注入の前に、８６ｍＭのＮａＣｌ、２ｍＭのＫＣｌ、１ｍＭのＭｇＣｌ₂、１．８ｍＭのＣａＣｌ₂、５ｍＭのＨＥＰＥＳ、２．５ｍＭのピルビン酸ナトリウム、０．５ｍＭのテオフィリンおよび０．１ｍＭのゲンタマイシンから成り、ＮａＯＨによってｐＨ７．５に調整された培地（ＮＤ−９６）に２４〜４８時間置いた。５０〜７０ｎｌのポリ（Ａ＋）ＲＮＡ（１ｍｇ／ｍｌ）または５０ｎｌのＧｌｕＣｌα（０．１〜１００ｎｇ）および／またはＧｌｕＣｌβ（０．１〜１００ｎｇ）を卵母細胞に注入した。コントロール卵母細胞には５０ｎｌの水を注入した。記録の前にＮＤ−９６中で卵母細胞を２〜１０日間インキュベートした。インキュベーションとコラゲナーゼの消化は１８℃で行った。記録は、注入の後室温で２〜１０日行った。特に示されていない限り、記録は、１１５ｍＭのＮａＣｌ、２ｍＭのＫＣｌ、１ｍＭのＭｇＣｌ₂、１．８ｍＭのＣａＣｌ₂および１０ｍＭのＨＥＰＥＳから成り、ＮａＯＨによってｐＨ７．５に調整された標準のカエル生理食塩水の中で行った。標準的な双微小電極増幅器（Ｄａｇａｎ８５００またはＴＥＶ−２００、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ）を使用して卵母細胞を電圧クランプした。ピペットは３ＭのＫＣｌで満し、抵抗は０．５〜３．０メガオームであった。プレキシガラスの記録チャンバー（容量：２００μｌ）を１０ｍｌ／ｍｉｎの速度で常時灌流した。Ａｇ／ＡｇＣｌ電極を用いて記録チャンバーを直接、若しくは細胞外塩素イオンが変化する場合にはＫＣｌ（３Ｍ）の寒天ブリッジを介して接地した。低塩素イオン溶液については、ＮａＣｌを、等モル濃度のイセチオン酸ナトリウムと置き換えた。低ナトリウム溶液については、ＮａＣｌを、等モルＫＣｌまたはコリンＣｌと置き換えた。ＴＬ−１インターフェースを有するＰＣＬＡＭＰ（ＡｘｏｎＩｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、ＦｏｓｔｅｒＣｉｔｙ、ＣＡ）を使用してデータの収集と解析を行った。−８０ｍＶの保持電位における膜電流を記録した。薬剤の存在下で得たピーク電流から−８０ｍＶにおける保持電流を引くことによって薬剤に感応する電流の振幅を測定した。データを３０Ｈｚでフィルタリングし、１６．６Ｈｚでサンプリングした。電流／電圧の関係（Ｉ／Ｖ）と反転電位（Ｅ_rev）は、−１１０から＋８０ｍＶの電圧範囲全体に渡る１〜３秒の電圧勾配を用いて決定した。電圧勾配については、データを０．３〜３ＫＨｚでフィルタリングし、１６０Ｈｚでサンプリングした。薬剤が存在する場合の電流から薬剤を含まない溶液での電流を引いて薬剤に感応する電流／電圧の関係を得た。Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓポリ（Ａ）⁺ＲＮＡを注入したアフリカツメガエル卵母細胞は、急速に活性化する可逆性グルタメートおよび非可逆性イベルメクチン４− Ｏ−ホスフェート（ＩＶＭＰＯ₄）に感応する電流を示した（図５〔Ａｒｅｎａ，Ｊ．Ｐ．、Ｌｉｕ，Ｋ．Ｋ．、Ｐａｒｅｓｓ，Ｐ．Ｓ．、Ｓｃｈａｅｆｆｅｒ，Ｊ．Ｍ．およびＣｕｌｌｙ，Ｄ．Ｆ．、Ｍｏｌ．ＢｒａｉｎＲｅｓ．１５、３３９〜３４８（１９９２）；Ａｒｅｎａら、１９９１、前掲〕）。グルタメートおよびＩＶＭＰＯ₄感応性チャンネルのための機能性ｃＤＮＡクローンを分離するために、サイズ分画したＣ．ｅｌｅｇａｎｓポリ（Ａ）⁺ＲＮＡの１．７〜１．９ｋＢ画分から指向性ｃＤＮＡライブラリーを構築した。５０００ｃＤＮＡのプールから合成したインビトロＲＮＡの注入後、グルタメートおよびＩＶＭＰＯ₄感応性電流が観察された。ｃＤＮＡの集団を小さいプールに再分画した結果、グルタメートおよびＩＶＭＰＯ₄反応を回復するためには二つの異なったサブユニットが必要であることが示された。一緒に加えると両方の反応が回復する２つの５００ｃＤＮＡのプールが同定された。或る再分画したプールからのＲＮＡと５００ｃＤＮＡの第２のプールからのＲＮＡを共注入することによってｃＤＮＡクローンｐＧｌｕＣｌαを単離した。ｃＤＮＡクローンｐＧｌｕＣｌβは、５００クローンの第２プールの再分画とｐＧｌｕＣｌαからのインビトロＲＮＡとの共注入によって単離した。再分画したプールの複雑さが２５ｃＤＮＡまで減少した時、単一のプールを注入した卵母細胞での反応が認められた。ｐＧｌｕＣｌαおよびｐＧｌｕＣｌβからのインビトロＲＮＡを注入した卵母細胞における電気生理学的特徴を調べた（図５）。ＧｌｕＣｌαおよびβタンパク質を同時に発現する卵母細胞は、ポリ（Ａ）⁺ＲＮＡを注入した卵母細胞において見られた、急速に活性化する可逆性グルタメートおよび非可逆性ＩＶＭＰＯ₄ 感応性電流（図５）を示した。ＩＶＭＰＯ₄感応性電流の活性化が最大になるのは、ＧｌｕＣｌαおよびβについては４２±２秒の時点であり、ポリ（Ａ）⁺ＲＮＡについては３６±３秒の時点であった。ポリ（Ａ）⁺ＲＮＡを注入した卵母細胞で見られたグルタメート感応性の電流の不感応（desensitization）は、ＧｌｕＣｌαおよびβを注入した卵母細胞においても、グルタメートの濃度が１ｍＭよりも大きい場合に観察された。ＧｌｕＣｌαまたはＧｌｕＣｌβの個々のサブユニットは、それぞれＩＶＭＰＯ₄またはグルタメートに選択的に反応する機能性ホモマーのチャンネルを発現した（図５）。ホモマーのＧｌｕＣｌαチャンネルのＩＶＭＰＯ₄活性化の時間は１８±１秒で、ＧｌｕＣｌαおよびβまたはポリ（Ａ）⁺ＲＮＡについて観察されたよりも速かった（ｐ＜０．００１）。ＧｌｕＣｌαチャンネルは、１０ｍＭの高いグルタメート濃度には非感応的であったが、グルタメートを用いてのホモマーのＧｌｕＣｌβチャンネルを活性化するための閾値は５０μＭであった。共注入された卵母細胞と同程度の振幅を有する電流を得るためには、個々のサブユニットの１０倍以上のＲＮＡを注入しなければならなかった。これはホモマーのチャンネルの機能的形成の効率が低いことを示唆している。グルタメートおよびＩＶＭＰＯ₄の用量反応曲線の分析の結果、ＧｌｕＣｌαおよびβの共発現は、リガンド親和性とＨｉｌｌ係数の変化をもたらすことが示された（図５）。ＧｌｕＣｌαとＧｌｕＣｌβを共注入した場合、グルタメートについてのＥＣ₅₀が３８０から１３６０μＭにシフトした（図１ｂ）。ＧｌｕＣｌβについてのＨｉｌｌ係数が１．９でＧｌｕＣｌαおよびβ についてのＨｉｌｌ係数が１．７であったことは、チャンネルを開閉するためには一つより多くのグルタメート分子が必要であることを示唆している。ＩＶＭＰＯ₄電流活性化についてのＥＣ₅₀は、ＧｌｕＣｌα注入卵母細胞とＧｌｕＣｌα およびβを注入した卵母細胞でそれぞれ１４０ｎＭ、１９０ｎＭであり（図５）類似していた。しかし、Ｈｉｌｌ係数は、ＧｌｕＣｌαの場合の１．５であったが、ＧｌｕＣｌαおよびβの場合２．５に変化した。これは、チャンネルを開くために必要なＩＶＭＰＯ₄分子の数が増大したことを示唆している。ＥＣ₅₀およびＨｉｌｌ係数において観察された変化は、グルタメートによるＧｌｕＣｌαチャンネルの活性化またはＩＶＭＰＯ₄によるＧｌｕＣｌβチャンネルの活性化によるものではありえない。何故なら、これらのホモマーのチャンネルはこれらのリガンドには応答しないからである（図５）。ＧｌｕＣｌαおよびβチャンネルを発現する卵母細胞における透過性と電流電圧の関係はポリ（Ａ）⁺ＲＮＡを注入した卵母細胞において観察されたものと同様であった（図６）〔Ａｒｅｎａ，Ｊ．Ｐ．、Ｌｉｕ，Ｋ．Ｋ．、Ｐａｒｅｓｓ，Ｐ．Ｓ．およびＣｕｌｌｙ，Ｄ．Ｆ．、Ｍｏｌ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．４０、３６８〜３７４（１９９１）；Ａｒｅｎａ，Ｊ．Ｐ．、Ｌｉｕ，Ｋ．Ｋ．、Ｐａｒｅｓｓ，Ｐ．Ｓ．、Ｓｃｈａｅｆｆｅｒ，Ｊ．Ｍ．およびＣｕｌｌｙ，Ｄ．Ｆ．、Ｍｏｌ．ＢｒａｉｎＲｅｓ．１５、３３９〜３４８（１９９２）〕。ＧｌｕＣｌαおよびβチャンネルは、外部ＮａＣｌをイソチオン酸ナトリウムと置換した後におけるグルタメートまたはＩＶＭＰＯ₄感応性電流についての逆転電位（Ｅ_rev）におけるシフトとして観察されるように、塩素イオンに対して選択的であった（図６）。ＧｌｕＣｌαおよびβチャンネルは、一価のカチオンに対しては透過性でなかった。何故なら、外部ＮａＣｌのＫＣｌまたはコリンＣｌとの置換によりＥ_revをシフトしなかったからである（図６）。また、ホモマーのＧｌｕＣｌαまたはＧｌｕＣｌβチャンネルについての透過性の研究により、カチオンよりアニオンに対する選択性が明らかになった（図６）。ＧｌｕＣｌαおよびＧｌｕＣｌβチャンネルの何れにおいても、ＮａＣｌのイソチオン酸ナトリウムとの置換はＥ_revを正の電圧にシフトし、ＫＣｌまたはコリンＣｌとの置換はＥ_revには影響しなかった（図６）。イソチオン酸ナトリウムにおけるＧｌｕＣｌαチャンネルについてのＥ_revは、大きなアニオンであるイソチオネートに対して透過性があり、塩素イオンに対する割合は０．２であることを示した〔Ｇｏｌｄｍａｎ，Ｄ．Ｅ．、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．２７、３７〜６０（１９４３）；Ｈｏｄｇｋｉｎ，Ａ．Ｌ．＆ＫａｔｚＢ．：Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．（Ｌｏｎｄ．）１０８、３７〜７７（１９４９）〕。ＧｌｕＣｌαおよびβを注入した卵母細胞における電流と電圧の関係（Ｉ／Ｖ）は、外側に向けて矯正（rectifying）する電圧依存を示した（図６）。グルタメートまたはＩＶＭＰＯ₄感応性電流についてのＩ／Ｖは、データが定電場式に適合することによって確認されたように同様の電圧依存性を示した（図６）〔Ｇｏｌｄｍａｎ，Ｄ．Ｅ．、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．２７、３７〜６０（１９４３）；Ｈｏｄｇｋｉｎ，Ａ．Ｌ．＆ＫａｔｚＢ．：Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．（Ｌｏｎｄ．）１０８、３７〜７７（１９４９）〕。ホモマーのＧｌｕＣｌα またはＧｌｕＣｌβチャンネルについてのＩ／Ｖ曲線は、ＧｌｕＣｌαおよびβ についてのＩ／Ｖ曲線から大きく偏寄しており、定電場の仮定にはうまく適合しなかった（図６）。ＧｌｕＣｌβチャンネルからのグルタメート感応性電流は、急な外側に矯正する電圧依存性を示し、負の電圧においては小電流を示した（図６）。ＧｌｕＣｌαチャンネルからのＩＶＭＰＯ₄感応性電流は、本質的に直線的な電圧依存性を示した（図６）。ＩＶＭＰＯ₄はＣ．ｅｌｅｇａｎｓポリ（Ａ）⁺ＲＮＡを注入した卵母細胞に対し２重の効果を及ぼす〔Ａｒｅｎａ，Ｊ．Ｐ．、Ｌｉｕ，Ｋ．Ｋ．、Ｐａｒｅｓｓ，Ｐ．Ｓ．およびＣｕｌｌｙ，Ｄ．Ｆ．、Ｍｏｌ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．４０、３６８〜３７４（１９９１）〕、〔Ａｒｅｎａ，Ｊ．Ｐ．、Ｌｉｕ，Ｋ．Ｋ．、Ｐａｒｅｓｓ，Ｐ．Ｓ．、Ｓｃｈａｅｆｆｅｒ，Ｊ．Ｍ．およびＣｕｌｌｙ，Ｄ．Ｆ．、Ｍｏｌ．ＢｒａｉｎＲｅｓ．１５、３３９〜３４８（１９９２）〕。電流の直接的な活性化（図５）に加え、グルタメート感応性の電流は、ＩＶＭＰＯ₄の低い濃度によって増強される（図７）。〔Ａｒｅｎａ，Ｊ．Ｐ．、Ｌｉｕ，Ｋ．Ｋ．、Ｐａｒｅｓｓ，Ｐ．Ｓ．、Ｓｃｈａｅｆｆｅｒ，Ｊ．Ｍ．およびＣｕｌｌｙ，Ｄ．Ｆ．、Ｍｏｌ．ＢｒａｉｎＲｅｓ．１５、３３９〜３４８（１９９２）〕。同様に、ＩＶＭＰＯ₄（５ｎＭ）は、ＧｌｕＣｌαおよびβを注入した卵母細胞におけるグルタメート感受性電流を４９０±４５％増強した（図７）。ＩＶＭＰＯ₄とグルタメートを両方適用した場合には、グルタメートについてのＥＣ₅₀が１３６０ μＭから３６０μＭにシフトし、Ｈｉｌｌ係数が１．７から１．３に減少した。ホモマーＧｌｕＣｌβチャンネルからのグルタメート反応は、ＩＶＭＰＯ₄によって強化されなかった（図７）。一方、ＩＶＭＰＯ₄の濃度を高くすると（１μ Ｍ）、ＧｌｕＣｌβを注入した卵母細胞におけるグルタメート感応性電流が８８ ±４％減少した（図７）。グルタメートに反応しないＧｌｕＣｌαチャンネルを発現する卵母細胞においては（図５）、電流の活性化をＩＶＭＰＯ₄により前もって行うことにより、グルタメートによる電流が２０±４％増大した（図７）。ＧｌｕＣｌαチャンネルを注入した卵母細胞からのグルタメート感受性電流は、ＩＶＭＰＯ₄による電流活性化の後だけで観察されたが、１０μＭの低いグルタメート濃度で観察できた。ＧｌｕＣｌαおよびβを注入した卵母細胞の薬理学的プロフィルは、他のクローニングしたリガンドゲーテッド塩素イオンチャンネルやグルタメートゲーテッドカチオンチャンネルの何れとも異なっていた（表１）。リガンドゲーテッドイオンチャンネル作用薬および拮抗薬の幾つかをＧｌｕＣｌαおよびβを注入した卵母細胞でテストした（表１）。グルタメート感受性の塩素イオンチャンネルを活性化することで知られている、グルタメートの構造的類似物であるイボテネートを除き全ての化合物が不活性であった〔Ｃｕｌｌ−Ｃａｎｄｙ，Ｓ．Ｇ．、Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．２５５、４４９〜４６４（１９７６）；Ａｒｅｎａ，Ｊ．Ｐ．、Ｌｉｕ，Ｋ．Ｋ．、Ｐａｒｅｓｓ，Ｐ．Ｓ．、Ｓｃｈａｅｆｆｅｒ，Ｊ．Ｍ．およびＣｕｌｌｙ，Ｄ．Ｆ．、Ｍｏｌ．ＢｒａｉｎＲｅｓ．１５、３３９〜３４８（１９９２）；Ｌｅａ，Ｔ．Ｊ．およびＵｓｈｅｒｗｏｏｄ，Ｐ．Ｎ．Ｒ．、Ｃｏｍｐ．Ｇｅｎ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．４、３５１〜３６３（１９７３）〕。グルタメートおよびＩＶＭＰＯ₄感受性電流はピクロトキシンおよびフルフェナム酸によって遮断され、Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓポリ（Ａ）⁺ ＲＮＡについて報告されたものと同様な濃度依存性があった〔Ａｒｅｎａ，Ｊ．Ｐ．、Ｌｉｕ，Ｋ．Ｋ．、Ｐａｒｅｓｓ，Ｐ．Ｓ．およびＣｕｌｌｙ，Ｄ．Ｆ．、Ｍｏｌ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．４０、３６８〜３７４（１９９１）；Ａｒｅｎａ，Ｊ．Ｐ．、Ｌｉｕ，Ｋ．Ｋ．、Ｐａｒｅｓｓ，Ｐ．Ｓ．、Ｓｃｈａｅｆｆｅｒ，Ｊ．Ｍ．およびＣｕｌｌｙ，Ｄ．Ｆ．、Ｍｏｌ．ＢｒａｉｎＲｅｓ．１５、３３９〜３４８（１９９２）〕。幾つかの証拠によって、ＧｌｕＣｌαおよびβの共発現はヘテロマーのチャンネルの形成をもたらすことが示された。サブユニットの会合の第１の証拠は、反応を引き起すためにｃＤＮＡのプールを２つ要するクローニング操作時においてみられた。第２に、共注入した卵母細胞について得られた発現レベルを達成するために個々のサブユニットでは１０倍以上のＲＮＡを注入する必要がある。更に、リガンド特異的反応における下記の変化が、ＧｌｕＣｌαおよびβを共発現する卵母細胞において観察された：電流のＩＶＭＰＯ₄活性化の時間変化；グルタメートに対する親和性と電流のＩＶＭＰＯ₄活性化のＨｉｌｌ係数；Ｉ／Ｖ関係の矯正における差異；イセチオネートに対する透過性；およびグルタメート反応のＩＶＭＰＯ₄による増強。共注入した卵母細胞におけるグルタメートおよびＩＶＭＰＯ₄感受性Ｉ／Ｖ曲線の電圧依存性が同一であることは、形成されたチャンネルの大部分がヘテロマーであることを示唆している。もし多数のホモマーのＧｌｕＣｌαおよびＧｌｕＣｌβチャンネルが共注入された卵母細胞内に存在するとしたら、グルタメート感受性Ｉ／Ｖ曲線はＩＶＭＰＯ₄感受性電流についてのＩ／Ｖに比べもっと外側に矯正するはずである。これらの結果は、共注入された卵母細胞において観察された特性がヘテロマーのチャンネルの特性を表していることを示唆している。実施例５ＧｌｕＣｌＲＮＡ注入卵母細胞を用いたグルタメートおよびイベルメクチン結合アッセイＧｌｕＣｌαおよびＧｌｕＣｌβインビトロＲＮＡを注入した卵母細胞を用いて³Ｈ- イベルメクチン結合アッセイと³Ｈ- グルタメート結合アッセイとを行った。ＧｌｕＣｌα（１ｎｇ）またはＧｌｕＣｌβＲＮＡ（１ｎｇ）を別個にあるいは同時に（この場合は各０．５ｎｇ）卵母細胞に注入し、２日後、卵母細胞を dounceホモジナイザーで破壊して卵黄タンパク質を当業界で公知の標準方法によって除去した。慣用方法によって平衡リガンド結合アッセイを行った。ＧｌｕＣｌαおよびβの双方あるいはＧｌｕＣｌα単独を発現する卵母細胞はいずれも約０．２ｎＭという高親和性で³Ｈ- イベルメクチンと結合した。ＧｌｕＣｌαを注入した卵母細胞からの膜調製物において、特異的な³Ｈ- グルタメート結合が観察された。ＧｌｕＣｌαおよびβを発現する卵母細胞を用いて他の化合物群の結合親和性を測定すると共に、それらの化合物が³Ｈ- イベルメクチンおよび³Ｈ- グルタメート結合と置換する置換能を測定した。実施例６ＧｌｕＣｌαとＧｌｕＣｌβチャンネルの一次構造ｐＧｌｕＣｌαとｐＧｌｕＣｌβのヌクレオチド配列は、約１３８３および約１３０２塩基対の単一大オープンリーディングフレームを示した。それらのｃＤＮＡは、ｐＧｌｕＣｌαについては約５０ヌクレオチドの５’−非翻訳延長部と約９０ヌクレオチドの３’−非翻訳延長部とを有し、ｐＧｌｕＣｌβについては約１３ヌクレオチドの５’−非翻訳延長部と約１４４ヌクレオチドの３’−非翻訳延長部とを有している。ｐＧｌｕＣｌαとｐＧｌｕＣｌβそれぞれのオープンリーディングフレーム領域中のヌクレオチド配列は、約５０％の同一性を示した。推定分子量（Ｍｒ）約５２，５５０のＧｌｕＣｌαタンパク質と推定Ｍｒが約４９，９００のＧｌｕＣｌβタンパク質とが予想されるオープンリーディングフレームの開始コドンとして、フレーム内第一のメチオニンを指定した。両タンパク質とも疎水性アミノ末端残基を含有していたが、このアミノ末端残基は、ＧｌｕＣｌαでは２１番目のアミノ酸から、ＧｌｕＣｌβでは２３番目のアミノ酸から始まる成熟タンパク質をもたらすシグナル開裂部位を強く示唆する配列を有した。ＧｌｕＣｌαタンパク質とＧｌｕＣｌβタンパク質とを比較すると、アミノ酸の同一性は４５％で類似性は６３％であった。予想されたＧｌｕＣｌαタンパク質とＧｌｕＣｌβタンパク質とをヌクレオチドデータベースおよびタンパク質データベースに対して整列させた結果、グリシンレセプターおよびＧＡＢＡ_aレセプターに関連するものであることが判明した。ＧｌｕＣｌαとＧｌｕＣｌβとにおけるアミノ酸の約２１％が強く保存されており、リガンドゲーテッド塩素イオンチャンネルのファミリー内におけるアミノ酸の同一性は少なくとも７５％であることを示した。このチャンネルファミリーにおける保存モチーフ（大ＮＨ₂- 末端細胞外ドメインや４つの疎水性トランスメンブラン・ドメインであるＭ１〜Ｍ４）は、ＧｌｕＣｌα配列およびＧｌｕＣｌβ配列においてもまた見いだされた。ＧｌｕＣｌαタンパク質とＧｌｕＣｌβ タンパク質とは、全部のリガンドゲーテッド塩素イオンチャンネルの細胞外ドメインに見られる保存されたシステイン残基を有していた（ＧｌｕＣｌαでは１９１番目と２０５番目のアミノ酸、ＧｌｕＣｌβでは１６１番目のアミノ酸と１７５番目のアミノ酸）。それ以外の２つのシステイン残基が存在したが、それらもまたグリシンゲーテッド塩素イオンチャンネル中に見いだされる（ＧｌｕＣｌαでは２５２番目と２６３番目のアミノ酸、ＧｌｕＣｌβでは２２３番目のアミノ酸と２３４番目のアミノ酸）。ＧｌｕＣｌαタンパク質は、推定メンブランドメインＭ３とＭ４との間に位置するプロテインキナーゼＣリン酸化部位に対する強いコンセンサス配列を有していた。ＧＡＢＡ_aレセプターサブユニットにおいては、Ｍ３とＭ４との間の細胞内ドメインに同様のリン酸化部位が位置しており、これらはチャンネル調節において何らかの役割を果たすと考えられる［Ｌｅｉｄｅｎｈｅｉｍｅｒ，Ｎ．Ｊ．、ＭｃＱｕｉｌｋｉｎ，Ｓ．Ｊ．、Ｈａｈｎｅｒ，Ｌ．Ｄ．、Ｗｈｉｔｉｎｇ，Ｐ．及びＨａｒｒｉｓ，Ｒ．Ａ．、“Ｍｏｌ．Ｐｈａｒｍ．” ４１、１１１６〜１１２３（１９９２年）、［Ｋｅｌｌｅｎｂｅｒｇｅｒ，Ｓ．、Ｍａｌｈｅｒｂｅ，Ｐ．及びＳｉｇｅｌ，Ｅ．、“Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ． ”２６７、２４６６０〜２５６６３（１９９２年）］。ＧＡＢＡ_Aレセプター配列及びグリシンレセプター配列において見いだされるように、ＧｌｕＣｌαタンパク質とＧｌｕＣｌβタンパク質とは、提案された細胞外ドメインに推定Ｎ−結合糖鎖形成部位を有していた。アセチルコリン及びグルタメートカチオンチャンネルサブユニットを用いたアラインメント分析の結果、ＧｌｕＣｌα及びＧｌｕＣｌβはそれぞれ約１０％及び＜５％の類似性を有していることが判明した。ＧｌｕＣｌα及びＧｌｕＣｌβタンパク質の全配列と、ＧＡＢＡ_a及びグリシンレセプターサブユニットと、関連の無脊椎動物由来タンパク質配列とを用いて系統発生分析を行った。ＧＡＢＡ_Aα及びγサブユニットを残りのタンパク質から分ける２本の大きな枝の分枝によってこのタンパク質ファミリーにおける進化論的分裂が示された。これらの大きな枝は、タンパク質群をＧＡＢＡ_aα、β、 γ、δ（ｄ）、ρ（ｒ）、及びグリシンα及びβ等それぞれのサブクラスにグループ分けする下位の枝を有していた。Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ（Ｄｒｏｓ）及びＬｙｍｎａｅｓｔａｇｎａｌｉｓ（Ｌｙｍ）の配列は、リガンドゲーテッドアニオンチャンネルに類似した、利用可能な無脊椎動物タンパク質配列を示している。Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓのＧｌｕＣｌα及びＧｌｕＣｌβタンパク質配列は、グリシンα及びβ 、Ｌｙｍツェータ（ζ）及びＤｒｏｓｒｄｌタンパク質と同じ枝に緩くグループ化(loosely grouped)していたが、これは、これらのタンパク質が共通の祖先に由来することを示唆している。ＧｌｕＣｌαタンパク質とＧｌｕＣｌβタンパク質とは、結合枝の長さ（joining limb lengths）が最も短いことによって示唆されるように、グリシンａタンパク質との関連性が非常に高い。この分析は、ＧｌｕＣｌαタンパク質とＧｌｕＣｌβタンパク質とが他のタンパク質とは別個の独立した下位の枝を形成することを示唆している。最大パーシモニー（parsimon y）プログラムを用いて、ＧｌｕＣｌα若しくはＧｌｕＣｌβの細胞外若しくはメンブランスパニングドメインを別に分析して、同様な系統樹を得た。ＧｌｕＣｌα及びＧｌｕＣｌβタンパク質はグリシンα及びβ、Ｌｙｍツェータ（ζ）及びＤｒｏｓｒｄｌタンパク質と系統発生的に関連しているとはいえ、両タンパク質は薬理学的には別個である。アフリカツメガエルの卵母細胞における発現の研究によって、グリシンに感受性を有するグリシンαタンパク質［Ｓｃｈｍｉｅｄｅｎ，Ｖ．、Ｇｒｅｎｎｉｎｇｌｏｈ，Ｇ．、Ｓｃｈｏｆｉｅｌｄ，Ｐ．Ｒ．及びＢｅｔｚ，Ｈ、“ＥＭＢＯＪｏｕｒｎａｌ”８、６９５〜７００（１９８９）］とＧＡＢＡに感受性を有するＤｒｏｓｒｄｌタンパク質［ｆｆｒｅｎｃｈ−Ｃｏｎｓｔａｎｔ，Ｒ．Ｈ．、Ｒｏｃｈｅｌｅａｕ，Ｔ．Ａ．、Ｓｔｅｉｃｈｅｎ，Ｊ．Ｃ．及びＣｈａｌｍｅｒｓ，Ａ．Ｅ．、“Ｎａｔｕｒｅ”３６３、４４９〜４５１（１９９３）］とによって機能あるホモマー塩素イオンチャンネルが形成されることが判明している。ホモマーのグリシンｂチャンネル形成の効率は非常に低く［Ｇｒｅｎｎｉｎｇｌｏｈ，Ｇ．ら、“Ｎｅｕｒｏｎ”４、９６３〜９７０（１９９０）］、Ｌｙｍツェータ（ζ）タンパク質は機能あるホモマーチャンネルを形成しない［Ｈｕｔｔｏｎ，Ｍ．Ｌ．、Ｈａｒｖｅｙ，Ｒ．Ｊ．、Ｅａｒｌｅｙ，Ｆ．Ｇ．Ｐ．、Ｂａｒｎａｒｄ，Ｅ．Ａ．及びＤａｒｌｉｓｏｎ，Ｍ．Ｇ．、“ＦＥＢＳｌｅｔｔｅｒｓ”３２６、１１２〜１１６（１９９３）］。ＧｌｕＣｌα及びＧｌｕＣｌβホモマーチャンネルは、ＧＡＢＡ、グリシン及びこれに関連するチャンネル作用薬及び拮抗薬に対して非感受性であるので（表１参照）、これらのチャンネルは系統発生的関連チャンネルとは別に、異なるリガンド選択性を進化させてきたものと考えられる。Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓゲノムＤＮＡとポリＡ⁺ＲＮＡでハイブリダイゼーション分析を行った。プローブとしてはＧｌｕＣｌαｃＤＮＡ及びＧｌｕＣｌβｃＤＮＡを用いた。ｃＤＮＡプローブの制限消化したゲノムＤＮＡとの高ストリンジェンシー・ハイブリダイゼーションによって、ＧｌｕＣｌのｃＤＮＡは単一のコピーＤＮＡフラグメントのみにハイブリダイズすることが判明した。Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓＲＮＡへの高ストリンジェンシー・ハイブリダイゼーションによって、ＧｌｕＣｌαは２．４及び１．７ＫｂのＲＮＡにハイブリダイズし、ＧｌｕＣｌβ は１．７ＫｂのＲＮＡにハイブリダイズすることが示された。この研究に用いたプローブは単一の大オープンリーディングフレームをコードするＧｌｕＣｌαｃＤＮＡ及びＧｌｕＣｌβｃＤＮＡの領域のみを表している。ＧｌｕＣｌα及びＧｌｕＣｌβプローブをＣ．ｅｌｅｇａｎｓＹＡＣとコスミッドライブラリーにハイブリダイズした。このハイブリダイゼーションの結果、染色体Ｖ、ＹＡＣ＃Ｙ４２Ｂ４、及びコスミッド＃Ｃ２５Ｄ４上にＧｌｕＣｌα遺伝子が見いだされた。染色体Ｉ、ＹＡＣ＃Ｙ２４Ｃ９、及びコスミド＃Ｃ０４Ｅ４上にはＧｌｕＣｌβ遺伝子が位置している。ＹＡＣとコスミドの分類は英国ケンブリッジ、ＭＲＣラボのＪｏｈｎＳｕｌｓｔｏｎによるものである。実施例７Ｅ．ｃｏｌｉ発現ベクターへのＧｌｕＣｌｃＤＮＡのクローニングＧｌｕＣｌ発現カセットをＥ．ｃｏｌｉ発現ベクター（ｐＥＴシリーズ（Ｎｏｖａｇｅｎ）等であるが、これに限定されない）に転移させ、Ｅ．ｃｏｌｉ内で組換えＧｌｕＣｌを産生させる。ｐＥＴベクターによって、ＧｌｕＣｌの発現は厳密に調節されたバクテリオファージＴ７プロモーターの制御下に置かれる。誘導性ｌａｃプロモーターによって制御されるＴ７ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子の染色体コピーを含有するＥ．ｃｏｌｉ宿主内にこの構築物を転移させた後、適切なｌａｃ基質（ＩＰＴＧ）を培養物に添加してＧｌｕＣｌを発現させる。発現したＧｌｕＣｌのレベルは上記のアッセイによって決定する。ＧｌｕＣｌα及びＧｌｕＣｌβの全オープンリーディングフレームをコードするｃＤＮＡをｐＥＴ［１６］１１ａのＮｄｅＩ部位に挿入する。配列分析によって正の配向にある構築物を同定して発現宿主株ＢＬ２１の形質転換に用いる。次いで形質転換体を使用して、ＧｌｕＣｌタンパク質産生のために培養物を接種する。培養物はＭ９またはＺＢ培地で生育させることができるが、その組成は当業者には公知である。ＯＤ₆₀₀値が１．５となるまで生育させた後、３７℃で３時間、１ｍＭのＩＰＴＧによってＧｌｕＣｌの発現を誘導する。実施例８哺乳類発現ベクターへのＧｌｕＣｌｃＤＮＡのクローニング哺乳類発現ベクターｐＭＡＭｎｅｏ及びｐｃＤＮＡ３にＧｌｕＣｌｃＤＮＡをクローニングした。ＧｌｕＣｌα及びＧｌｕＣｌβブルースクリプト・プラスミドをＮｏｔＩで消化分解し、クレノー酵素で処理して平滑クローニング端を得た。インサートをＳａｌＩ消化で切断し、アガロースゲル電気泳動で精製した。ｐＭＡＭｎｅｏベクターをＸｈｏＩ、クレノー酵素、次いでＳａｌＩと子ウシ腸フォスファターゼ（ＣＩＰ）で処理した。線状ベクターをアガロースゲル上で精製して、それを使用してＧｌｕＣｌｃＤＮＡインサートに連結した。組換え体を単離してＧｌｕＣｌα−ｐＭＡＭｎｅｏ及びＧｌｕＣｌβ−ｐＭＡＭｎｅｏと命名し、それを使用してＣａＰＯ₄- ＤＮＡ沈澱法によって哺乳類細胞（Ｌ細胞）にトランスフェクトした。細胞を、ＧｌｕＣｌα−ｐＭＡＭｎｅｏ、ＧｌｕＣｌβ−ｐＭＡＭｎｅｏ、あるいはＧｌｕＣｌα−ｐＭＡＭｎｅｏとＧｌｕＣｌβ−ｐＭＡＭｎｅｏの両方でトランスフェクトした。Ｇ４１８の存在下で生育させることにより、安定細胞クローンを選択した。Ｇ４１８抵抗性の１個のクローンを単離した。このクローンは完全なＧｌｕＣｌα遺伝子、ＧｌｕＣｌβ遺伝子、又はＧｌｕＣｌαとＧｌｕＣｌβ遺伝子双方を含有することが判明した。ＧｌｕＣｌタンパク質に特異的な抗体を用いる免疫沈澱法、ウェスタン・ブロッティング、免疫蛍光法等の免疫学的手法によってＧｌｕＣｌｃＤＮＡ含有クローンの発現を分析する。抗体は、ＧｌｕＣｌ配列から予測されたアミノ酸配列から合成されたペプチドを接種したウサギから得る。パッチクランプ電気生理学的技法や³Ｈ -イベルメクチンおよび³Ｈ- グルタメート結合アッセイによっても発現を分析する。ｐｃＤＮＡ３にＧｌｕＣｌαまたはＧｌｕＣｌβ遺伝子を挿入した。ＧｌｕＣｌα−ブルースクリプトＳＫＩＩ＋及びＧｌｕＣｌβ−ブルースクリプトＳＫＩＩ＋をＸｈｏＩ及びＮｏｔＩで消化分解し、ｃＤＮＡインサートをアガロースゲル電気泳動で単離した。ベクターｐｃＤＮＡ３をＸｈｏＩとＮｏｔＩで消化分解し、ＣＩＰで処理し、線状ベクターをゲル電気泳動で単離してｃＤＮＡインサートに連結した。組換えプラスミドであるＧｌｕＣｌα−ｐｃＤＮＡ３及びＧｌｕＣｌβ−ｐｃＤＮＡ３を用いて哺乳類ＣＯＳ細胞又はＣＨＯ細胞を形質転換する。ＧｌｕＣｌα又はＧｌｕＣｌβ、及びＧｌｕＣｌαとＧｌｕＣｌβの双方を安定的にあるいは一時的に発現する細胞を用いてアベルメクチン及びグルタメートに感受性を有する塩素イオンチャンネルの発現とリガンド結合活性とについて試験する。これらの細胞を用いて、アベルメクチン及びグルタメートに感受性を有する塩素イオンチャンネルに対するその他の化合物の調節能、阻害能若しくは活性化能、あるいは放射活性イベルメクチンやグルタメート結合との競合能を同定・試験する。プロモーターに関して正の配向にあるＧｌｕＣｌｃＤＮＡを含有するカセットを、プロモーターの適切な制限部位３’に連結し、制限部位マッピングおよび／または配列決定によって同定する。これらのｃＤＮＡ発現ベクターを例えばＣＯＳ−７（ＡＴＣＣ＃ＣＲＬ１６５１）、ＣＶ−１ｔａｔ［Ｓａｃｋｅｖｉｔｚら、“Ｓｃｉｅｎｃｅ”２３８：１５７５（１９８７）］、２９３、Ｌ（ＡＴＣＣ＃ＣＲＬ６３６２）等の繊維芽宿主細胞中に標準法によって導入する。標準法としては電気穿孔や化学的方法（カチオン性リポソーム、ＤＥＡＥデキストラン、リン酸カルシウム）が挙げられるがこれらに限定されない。トランスフェクトされた細胞および細胞培養上清を集め、本明細書の記載に従ってＧｌｕＣｌの発現について分析する。哺乳類の一時的発現に用いられるベクターのすべてが、ＧｌｕＣｌを発現する安定した細胞系を確立させるために用い得る。発現ベクター中にクローニングされた未改変のＧｌｕＣｌｃＤＮＡ構築物は、ＧｌｕＣｌタンパク質を作るように宿主細胞をプログラムすると考えられる。また、分泌タンパク質のシグナル配列をコードするＤＮＡとＧｌｕＣｌｃＤＮＡ構築物とを連結することにより、ＧｌｕＣｌは分泌タンパク質として細胞外に発現される。トランスフェクション宿主細胞としてはＣＶ−１−Ｐ［Ｓａｃｋｅｖｉｔｚら、“Ｓｃｉｅｎｃｅ”２３８：１５７５（１９８７）］、ｔｋ−Ｌ［Ｗｉｇｌｅｒら、“ＣｅｌＩ”１１：２２３（１９７７）］、ＮＳ／０、及びｄＨＦｒ−ＣＨＯ［Ｋａｕｆｍａｎ及びＳｈａｒｐ、“Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．”１５９：６０１（１９８２）］が挙げられるがこれらに限定されない。ＧｌｕＣｌｃＤＮＡを含有するいずれかのベクターを薬剤選択プラスミドと共トランスフェクトさせることによって安定にトランスフェクトされたクローンが選択される。この薬剤選択プラスミドとしてはＧ４１８、アミノグリコシドホスホトランスフェラーゼ；ハイグロマイシン、ハイグロマイシン−Ｂホスホルトンスフェラーゼ；ＡＰＲＴ、キサンチン−グアニンホスホリボシル−トランスフェラーゼ等が挙げられるがこれらに限定されない。ＧｌｕＣｌのレベルは本明細書中に記載のアッセイによって定量される。また、ＧｌｕＣｌｃＤＮＡ構築物を、増幅可能な薬剤耐性マーカー含有ベクターに連結して、最高可能レベルでＧｌｕＣｌを合成する哺乳類細胞クローンを産生させる。これらの構築物を細胞に導入した後、プラスミドを含有するクローンを適切な薬剤によって選択して、高コピー数のプラスミドを有する過剰発現クローン細胞を前記薬剤の用量を増加させながら選択することによって単離する。組換えＧｌｕＣｌの発現は、哺乳類宿主細胞中に完全長のＧｌｕＣｌｃＤＮＡをトランスフェクトさせることによって達成される。実施例９昆虫細胞中での発現のための、バキュロウイルス発現ベクターへのＧｌｕＣｌｃＤＮＡのクローニング昆虫細胞のＳｆ９系（ＡＴＣＣＣＲＬ＃１７１１）にｃＤＮＡを高レベルに発現させるように、ＡｃＮＰＶウイルスのゲノムに由来するバキュロウイルスベクターを設計する。ＧｌｕＣｌｃＤＮＡを発現する組換えバキュロウイルスは、次の標準法によって作成される（ＩｎＶｉｔｒｏｇｅｎのＭａｘｂａｃマニュアルより）：ＧｌｕＣｌｃＤＮＡ構築物を、ｐＡＣ３６０及びＢｌｕｅＢａｃベクター（ＩｎＶｉｔｒｏｇｅｎ）等の各種バキュロウイルス転移ベクターにおいてポリヘドリン遺伝子と連結する。組換えバキュロウイルスの生成は、バキュロウイルス転移ベクターと線状化したＡｃＮＰＶゲノムＤＮＡ［Ｋｉｔｔｓ，Ｐ．Ａ．、Ｎｕｃ．Ａｃｉｄ．Ｒｅｓ．１８：５６６７（１９９０）］とをＳｆ９細胞に共トランスフェクトした後に相同的組換えを行って達成する。組換えｐＡＣ３６０ウイルスは、感染細胞中に封入体が存在しないことによって同定し、組換えｐＢｌｕｅＢａｃウイルスは、βガラクトシダーゼ発現（Ｓｕｍｍｅｒｓ，Ｍ．Ｄ．及びＳｍｉｔｈ，Ｇ．Ｅ．、ＴｅｘａｓＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅＥｘｐ．ＳｔａｔｉｏｎＢｕｌｌｅｔｉｎＮｏ．１５５５）に基づいて同定する。プラーク精製に引き続きＧｌｕＣｌの発現を本明細書に記載のアッセイによって測定する。ＧｌｕＣｌサブユニットの完全オープンリーディングフレームをコードするｃＤＮＡを、ｐＢｌｕｅＢａｃＩＩのＢａｍＨＩ部位に挿入する。配列分析によって正の配向にある構築物を同定し、それを使用して線状ＡｃＮＰＶのマイルドタイプＤＮＡの存在下でＳｆ９細胞にトランスフェクトさせる。真正の活性ＧｌｕＣｌは感染細胞の細胞質中に見いだされる。活性ＧｌｕＣｌを感染細胞から低張若しくは界面活性剤での溶解によって抽出する。実施例１０酵母発現ベクターへのＧｌｕＣｌｃＤＮＡのクローニング異種タンパク質の細胞内若しくは細胞外発現をさせるように設計した発現ベクターに最適ＧｌｕＣｌｃＤＮＡシストロンを挿入して、酵母Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅで組換えＧｌｕＣｌを作成する。細胞内発現の場合には、ＥｍＢＬｙｅｘ４等のベクターをＧｌｕＣｌシストロンに連結する［Ｒｉｎａｓ，Ｕ．ら、“Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ”８：５４３〜５４５（１９９０）；ＨｏｒｏｗｉｔｚＢ．ら、“Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６５：４１８９〜４１９２（１９８９）］。細胞外発現の場合には、分泌シグナル（酵母または哺乳類ペプチド）をＧｌｕＣｌタンパク質のＮＨ₂末端に融合する酵母発現ベクターに、ＧｌｕＣｌシストロンを連結する［Ｊａｃｏｂｓｏｎ，Ｍ．Ａ．、Ｇｅｎｅ８５：５１１〜５１６（１９８９）；ＲｉｅｔｔＬ．及びＢｅｌｌｏｎＮ．“Ｂｉｏｃｈｅｍ．”２８：２９４１〜２９４９（１９８９）］。これらのベクターとしては、ｐＡＶＥ１＞６及びベクターｐＬ８ＰＬが挙げられるがこれらに限定されない。前者はヒト血清アルブミンシグナルを発現ｃＤＮＡに融合する［ＳｔｅｅｐＯ．“Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ”８：４２〜４６（１９９０）］。後者はヒトリゾチームシグナルを発現ｃＤＮＡに融合する［Ｙａｍａｍｏｔｏ，Ｙ．“Ｂｉｏｃｈｅｍ．” ２８：２７２８〜２７３２）］。また、ＧｌｕＣｌは、ベクターｐＶＥＰ［Ｅｃｋｅｒ，Ｄ．Ｊ．、“Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．”２６４：７７１５〜７７１９（１９８９）、Ｓａｂｉｎ，Ｅ．Ａ．、“Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ”７：７０５〜７０９（１９８９）、ＭｃＤｏｎｎｅｌｌＤ．Ｐ．、“Ｍｏｌ．ＣｅｌｌＢｉｏｌ．”９：５５１７〜５５２３（１９８９）］を用いて、ユビキチン結合融合タンパク質として、酵母で発現される。発現したＧｌｕＣｌのレベルは、本明細書に記載のアッセイによって決定される。実施例１１組換えＧｌｕＣｌの精製組換え技法によって産生されたＧｌｕＣｌは、抗体アフィニティークロマトグラフィーによって精製できる。ＧｌｕＣｌ抗体アフィニティーカラムは、Ａｆｆｉｇｅｌ−１０（Ｂｉｏｒａｄ）に抗ＧｌｕＣｌ抗体を添加することによって作成する。Ａｆｆｉｇｅｌ−１０は、抗体がアガロースゲルビーズ支持体と共有結合を形成するようにＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステルで予め活性化したゲル支持体である。次いで、スペーサーアームを用いてアミド結合を介して抗体をゲルに結合させる。次に、残存する活性化エステルを１ＭのエタノールアミンＨＣｌ（ｐＨ８）で消去する。カラムを水、次いで０．２３ＭのグリシンＨＣｌ（ｐＨ２．６）で洗浄し、未結合抗体や外部由来のタンパク質が存在すれば除去する。リン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ７．３）を界面活性剤などの適切な膜溶解剤と共に用いてカラムを平衡化し、溶解したＧｌｕＣｌ若しくはＧｌｕＣｌサブユニットを含有する細胞培養上清または細胞抽出液をゆっくりとカラムに通す。次いで、リン酸緩衝生理食塩水を界面活性剤と共に用いて、光学密度（Ａ２８０）がバックグラウンドレベルとなるまでカラムを洗浄し、タンパク質を０．２３Ｍのグリシン−ＨＣｌ（ｐＨ２．６）と界面活性剤とで溶出させる。次に精製ＧｌｕＣｌタンパク質をリン酸緩衝生理食塩水に対して透析する。

【手続補正書】特許法第１８４条の８【提出日】１９９６年９月９日【補正内容】請求の範囲１．アベルメクチンおよび／またはグルタメート結合タンパク質をコードし、配列番号１、配列番号２、およびそれらの機能的誘導体からなる群から選択されるヌクレオチド配列を有する単離・精製されたＤＮＡ分子であって、前記タンパク質がグルタメートゲーテッドアニオンチャンネルとして機能することを特徴とする前記ＤＮＡ分子。２．配列番号１及び配列番号２からなる群から選択されるヌクレオチド配列を有する単離・精製されたＤＮＡ分子。３．前記ＤＮＡ分子がゲノムＤＮＡであることを特徴とする請求項１に記載の単離・精製されたＤＮＡ分子。４．アベルメクチンおよび／またはグルタメート結合タンパク質を組換え宿主で発現させる発現ベクターであって、前記ベクターはアベルメクチンおよび／またはグルタメート結合タンパク質をコードする組換え遺伝子を含有し、前記タンパク質はグルタメートゲーテッドアニオンチャンネルとして機能することを特徴とする発現ベクター。５．前記発現ベクターはアベルメクチンおよび／またはグルタメート結合タンパク質をコードするクローニングされた遺伝子を含有し、前記遺伝子は配列番号１、配列番号２、およびそれらの機能的誘導体からなる群から選択されるヌクレオチド配列を有することを特徴とする請求項４に記載の発現ベクター。６．前記発現ベクターはアベルメクチンおよび／またはグルタメート結合タンパク質をコードするゲノムＤＮＡを含有し、前記タンパク質はグルタメートゲーテッドアニオンチャンネルとして機能することを特徴とする請求項５に記載の発現ベクター。７．アベルメクチンおよび／またはグルタメート結合タンパク質をコードする組換え的にクローニングされた遺伝子を含む組換え宿主細胞であって、前記タンパク質はグルタメートゲーテッドアニオンチャンネルとして機能することを特徴とする組換え宿主細胞。８．前記遺伝子は配列番号１、配列番号２、およびそれらの機能的誘導体からなる群から選択されるヌクレオチド配列を有することを特徴とする請求項７に記載の組換え宿主細胞。９．グルタメートゲーテッドアニオンチャンネルをコードする前記クローニングされた遺伝子がゲノムＤＮＡであることを特徴とする請求項７に記載の組換え宿主細胞。１０．グルタメートゲーテッドアニオンチャンネルとして機能し、アベルメクチンおよび／またはグルタメート結合タンパク質として機能する実質的に純粋なタンパク質。１１．配列番号３、配列番号４、およびそれらの機能的誘導体からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する、請求項１０に記載のタンパク質。１２．アベルメクチンおよび／またはグルタメート結合タンパク質に免疫反応性を有する単一特異性抗体であって、前記タンパク質が任意的にグルタメートゲーテッドアニオンチャンネルとして機能してもよいことを特徴とする前記抗体。１３．前記抗体がグルタメートゲーテッドアニオンチャンネルの活性を遮断することを特徴とする請求項１２に記載の抗体。１４．アベルメクチンおよび／またはグルタメート結合タンパク質を発現させる方法であって、（ａ）請求項５に記載の発現ベクターを適切な宿主細胞に転移させる段階と、（ｂ）段階（ａ）の宿主細胞を、アベルメクチンおよび／またはグルタメート結合タンパク質を発現ベクターから発現させる条件下で培養する段階を包含する前記方法。１５．アベルメクチンおよび／またはグルタメート結合タンパク質活性を調節する化合物の同定方法であって、（ａ）アベルメクチンおよび／またはグルタメート結合タンパク質活性のモジュレーターを、アベルメクチンおよび／またはグルタメート結合タンパク質と混合する段階（但し、前記タンパク質は任意的にグルタメートゲーテッドアニオンチャンネルとして機能してもよい）と、（ｂ）前記タンパク質に対する前記モジュレーターの効果を測定する段階を包含する前記方法。１６．前記タンパク質に対する前記モジュレーターの効果は、グルタメートゲーテッドアニオンチャンネルリガンドの結合を阻害又は増大するものであることを特徴とする請求項１５に記載の方法。１７．前記タンパク質に対する前記モジュレーターの効果は、グルタメートゲーテッドアニオンチャンネルによって仲介されるアニオンフラックスの刺激又は阻害であることを特徴とする請求項１５に記載の方法。１８．前記アニオンフラックスが膜塩素イオンフラックスであることを特徴とする請求項１７に記載の方法。１９．前記化合物がグルタメートゲーテッドアニオンチャンネルのモジュレーターであることを特徴とする請求項１５に記載の方法において活性な化合物。２０．前記化合物がグルタメートゲーテッドアニオンチャンネルの作用薬または拮抗薬であることを特徴とする請求項１５に記載の方法において活性な化合物。２１．前記化合物がグルタメートゲーテッドアニオンチャンネルの発現のモジュレーターであることを特徴とする請求項１５に記載の方法において活性な化合物。２２．請求項１５に記載の方法において活性な化合物を含有する医薬組成物であって、前記化合物がグルタメートゲーテッドアニオンチャンネル活性のモジュレーターであることを特徴とする医薬組成物。２３．請求項１５に記載の方法において活性なグルタメートゲーテッドアニオンチャンネル調節化合物を投与することを包含する、グルタメートゲーテッドアニオンチャンネルによって仲介される症状に対する治療を必要とするヒト以外の動物を治療する方法。２４．請求項１５に記載の方法において活性なグルタメートゲーテッドアニオンチャンネル調節化合物を投与することを包含する、グルタメートゲーテッドアニオンチャンネルによって仲介され、かつ無脊椎生物による感染又はインフェステーションを特徴とする症状に対する治療を必要とするヒト以外の動物を治療する方法。２５．グルタメートゲーテッドアニオンチャンネル活性を調節する化合物を同定する方法であって、（ａ）グルタメートゲーテッドアニオンチャンネル活性のモジュレーターを、組換えアベルメクチン結合タンパク質を発現する細胞と混合する段階（但し、前記アベルメクチン結合タンパク質は任意的にグルタメートゲーテッドアニオンチャンネルとして機能してもよい）と、（ｂ）前記チャンネルに対する前記モジュレーターの効果を測定する段階を包含する前記方法。２６．段階（ｂ）におけるチャンネルに対する前記モジュレーターの効果は、グルタメートゲーテッドアニオンチャンネルリガンドの結合を阻害又は増大するものであることを特徴とする請求項２５に記載の方法。２７．段階（ｂ）におけるチャンネルに対する前記モジュレーターの効果は、グルタメートゲーテッドアニオンチャンネルによって仲介されるアニオンフラックスの阻害又は増大であることを特徴とする請求項２５に記載の方法。２８．前記アニオンフラックスが膜塩素イオンフラックスであることを特徴とする請求項２７に記載の方法。２９．前記化合物がグルタメートゲーテッドアニオンチャンネルのモジュレーターであることを特徴とする請求項２５に記載の方法において活性な化合物。３０．前記化合物がグルタメートゲーテッドアニオンチャンネルの作用薬または拮抗薬であることを特徴とする請求項２５に記載の方法において活性な化合物。３１．前記化合物がグルタメートゲーテッドアニオンチャンネルの発現のモジュレーターであることを特徴とする請求項２５に記載の方法において活性な化合物。３２．請求項２５に記載の方法において活性な化合物を含有する医薬組成物であって、前記化合物がグルタメートゲーテッドアニオンチャンネル活性のモジュレーターであることを特徴とする医薬組成物。３３．請求項２５に記載の方法において活性なグルタメートゲーテッドアニオンチャンネル調節化合物を投与することを包含する、グルタメートゲーテッドアニオンチャンネルによって仲介される症状に対する治療を必要とするヒト以外の動物を治療する方法。３４．請求項２５に記載の方法において活性なグルタメートゲーテッドアニオンチャンネル調節化合物を投与することを包含する、グルタメートゲーテッドアニオンチャンネルによって仲介され、かつ無脊椎生物による感染又はインフェステーションを特徴とする症状に対する治療を必要とするヒト以外の動物を治療する方法。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号ＦＩＣ０７Ｋ 16/18 Ｃ０７Ｋ 16/18 Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｐ 21/02 ＣＣ１２Ｐ 21/02 Ｇ０１Ｎ 33/15 ＺＧ０１Ｎ 33/15 33/53 Ｄ 33/53 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ // Ａ６１Ｋ 38/00 Ａ６１Ｋ 37/02 (Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:91） (72)発明者カリー，ドリス・エフアメリカ合衆国、ニユー・ジヤージー・ 07065、ローウエイ、イースト・リンカーン・アベニユー・126 (72)発明者アリーナ，ジヨウジフ・ピーアメリカ合衆国、ニユー・ジヤージー・ 07065、ローウエイ、イースト・リンカーン・アベニユー・126 (72)発明者リウ，ケン・ケイアメリカ合衆国、ニユー・ジヤージー・ 07065、ローウエイ、イースト・リンカーン・アベニユー・126 (72)発明者バツシラテイス，デメトリオスアメリカ合衆国、ニユー・ジヤージー・ 07065、ローウエイ、イースト・リンカーン・アベニユー・126

Claims

【特許請求の範囲】１．アベルメクチンおよび／またはグルタメート結合タンパク質をコードする単離・精製されたＤＮＡ分子であって、前記タンパク質が任意的にグルタメートゲーテッドアニオンチャンネル又はその機能性誘導体として機能してもよいことを特徴とする前記ＤＮＡ分子。２．配列番号１、配列番号２、およびそれらの機能的誘導体からなる群から選択されるヌクレオチド配列を有する、請求項１に記載の単離・精製されたＤＮＡ分子。３．前記ＤＮＡ分子がゲノムＤＮＡであることを特徴とする請求項１に記載の単離・精製されたＤＮＡ分子。４．アベルメクチンおよび／またはグルタメート結合タンパク質を組換え宿主で発現させる発現ベクターであって、前記ベクターはアベルメクチンおよび／またはグルタメート結合タンパク質をコードする組換え遺伝子を含有し、前記タンパク質は任意的にグルタメートゲーテッドアニオンチャンネル又はその機能性誘導体として機能してもよいことを特徴とする発現ベクター。５．前記発現ベクターはアベルメクチンおよび／またはグルタメート結合タンパク質をコードするクローニングされた遺伝子を含有し、前記タンパク質は任意的にグルタメートゲーテッドアニオンチャンネルとして機能してもよく、前記遺伝子は配列番号１、配列番号２、およびそれらの機能的誘導体からなる群から選択されるヌクレオチド配列を有することを特徴とする請求項４に記載の発現ベクター。６．前記発現ベクターはアベルメクチンおよび／またはグルタメート結合タンパク質をコードするゲノムＤＮＡを有し、前記タンパク質は任意的にグルタメートゲーテッドアニオンチャンネルとして機能してもよいことを特徴とする請求項４に記載の発現ベクター。７．アベルメクチンおよび／またはグルタメート結合タンパク質をコードする組換え的にクローニングされた遺伝子を含む組換え宿主細胞であって、前記タンパク質は任意的にグルタメートゲーテッドアニオンチャンネル又はその機能的誘導体として機能してもよいことを特徴とする組換え宿主細胞。８．前記遺伝子は配列番号１、配列番号２、およびそれらの機能的誘導体からなる群から選択されるヌクレオチド配列を有することを特徴とする請求項７に記載の組換え宿主細胞。９．グルタメートゲーテッドアニオンチャンネルをコードする前記クローニングされた遺伝子がゲノムＤＮＡであることを特徴とする請求項７に記載の組換え宿主細胞。１０．任意的にグルタメートゲーテッドアニオンチャンネルとして機能してもよい、アベルメクチンおよび／またはグルタメート結合タンパク質として機能する実質的に純粋なタンパク質。１１．配列番号３、配列番号４、およびそれらの機能的誘導体からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する、請求項１０に記載のタンパク質。１２．アベルメクチンおよび／またはグルタメート結合タンパク質に免疫反応性を有する単一特異性抗体であって、前記タンパク質が任意的にグルタメートゲーテッドアニオンチャンネルとして機能してもよいことを特徴とする前記抗体。１３．前記抗体がグルタメートゲーテッドアニオンチャンネルの活性を遮断する、請求項１２に記載の抗体。１４．アベルメクチンおよび／またはグルタメート結合タンパク質を発現させる方法であって、前記タンパク質は組換え宿主細胞中において任意的にグルタメートゲーテッドアニオンチャンネルとして機能してもよく、当該方法は、（ａ）請求項４に記載の発現ベクターを適切な宿主細胞に転移させる段階と、（ｂ）段階（ａ）の宿主細胞を、アベルメクチンおよび／またはグルタメート結合タンパク質を発現ベクターから発現させる条件下で培養する段階を包含する前記方法。１５．アベルメクチンおよび／またはグルタメート結合タンパク質活性を調節する化合物の同定方法であって、（ａ）アベルメクチンおよび／またはグルタメート結合タンパク質活性のモジュレーターを、アベルメクチンおよび／またはグルタメート結合タンパク質と混合する段階（但し、前記タンパク質は任意的にグルタメートゲーテッドアニオンチャンネルとして機能してもよい）と、（ｂ）前記タンパク質に対する前記モジュレーターの効果を測定する段階を包含する前記方法。１６．前記タンパク質に対する前記モジュレーターの効果は、グルタメートゲーテッドアニオンチャンネルリガンドの結合を阻害又は増大するものであることを特徴とする請求項１５に記載の方法。１７．前記タンパク質に対する前記モジュレーターの効果は、グルタメートゲーテッドアニオンチャンネルによって仲介されるアニオンフラックスの刺激或いは阻害であることを特徴とする請求項１５に記載の方法。１８．前記アニオンフラックスが膜塩素イオンフラックスであることを特徴とする請求項１７に記載の方法。１９．前記化合物がグルタメートゲーテッドアニオンチャンネルのモジュレーターであることを特徴とする請求項１５に記載の方法において活性な化合物。２０．前記化合物がグルタメートゲーテッドアニオンチャンネルの作用薬または拮抗薬であることを特徴とする請求項１５に記載の方法において活性な化合物。２１．前記化合物がグルタメートゲーテッドアニオンチャンネルの発現のモジュレーターであることを特徴とする請求項１５に記載の方法において活性な化合物。２２．請求項１５に記載の方法において活性な化合物を含有する医薬組成物であって、前記化合物がグルタメートゲーテッドアニオンチャンネル活性のモジュレーターであることを特徴とする医薬組成物。２３．請求項１５に記載の方法において活性なグルタメートゲーテッドアニオンチャンネル調節化合物を投与することを包含する、グルタメートゲーテッドアニオンチャンネルによって仲介される症状に対する治療を必要とする患者を治療する方法。２４．請求項１５に記載の方法において活性なグルタメートゲーテッドアニオンチャンネル調節化合物を投与することを包含する、グルタメートゲーテッドアニオンチャンネルによって仲介され、かつ無脊椎生物による感染又はインフェステーションを特徴とする症状に対する治療を必要とする患者を治療する方法。２５．グルタメートゲーテッドアニオンチャンネル活性を調節する化合物を同定する方法であって、（ａ）グルタメートゲーテッドアニオンチャンネル活性のモジュレーターを、組換えアベルメクチン結合タンパク質を発現する細胞と混合する段階（但し、前記アベルメクチン結合タンパク質は任意的にグルタメートゲーテッドアニオンチャンネルとして機能してもよい）と、（ｂ）前記チャンネルに対する前記モジュレーターの効果を測定する段階を包含する前記方法。２６．段階（ｂ）におけるチャンネルに対する前記モジュレーターの効果は、グルタメートゲーテッドアニオンチャンネルリガンドの結合を阻害又は増大するものであることを特徴とする請求項２５に記載の方法。２７．段階（ｂ）におけるチャンネルに対する前記モジュレーターの効果は、グルタメートゲーテッドアニオンチャンネルによって仲介されるアニオンフラックスの阻害又は増大であることを特徴とする請求項２５に記載の方法。２８．前記アニオンフラックスが膜塩素イオンフラックスであることを特徴とする請求項２７に記載の方法。２９．前記化合物がグルタメートゲーテッドアニオンチャンネルのモジュレーターであることを特徴とする請求項２５に記載の方法において活性な化合物。３０．前記化合物がグルタメートゲーテッドアニオンチャンネルの作用薬または拮抗薬であることを特徴とする請求項２５に記載の方法において活性な化合物。３１．前記化合物がグルタメートゲーテッドアニオンチャンネルの発現のモジュレーターであることを特徴とする請求項２５に記載の方法において活性な化合物。３２．前記化合物がグルタメートゲーテッドアニオンチャンネル活性のモジュレーターであることを特徴とする請求項２５に記載の方法において活性な化合物を含有する医薬組成物。３３．請求項２５に記載の方法において活性なグルタメートゲーテッドアニオンチャンネル調節化合物を投与することを包含することを特徴とするグルタメートゲーテッドアニオンチャンネルによって仲介される症状に対する治療を必要とする患者を治療する方法。３４．請求項２５に記載の方法において活性なグルタメートゲーテッドアニオンチャンネル調節化合物を投与することを包含する、グルタメートゲーテッドアニオンチャンネルによって仲介され、かつ無脊椎生物による感染又はインフェステーションを特徴とする症状に対する治療を必要とする患者を治療する方法。