JPH0757191B2 - ロータウイルス組換体の調製方法 - Google Patents
ロータウイルス組換体の調製方法Info
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- JPH0757191B2 JPH0757191B2 JP59502691A JP50269184A JPH0757191B2 JP H0757191 B2 JPH0757191 B2 JP H0757191B2 JP 59502691 A JP59502691 A JP 59502691A JP 50269184 A JP50269184 A JP 50269184A JP H0757191 B2 JPH0757191 B2 JP H0757191B2
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Description
【発明の詳細な説明】 技術分野 この発明は、ヒトロータウイルス／動物ロータウイルス
組換体の調製方法に関する。この発明の手法では、所望
のヒト表現型をもった組換体を選ぶために、（１）高力
価の超免疫抗血清または（２）モノクローナル抗血清の
新しい使用が関与している。抗血清単独またはモノクロ
ーナル抗血清は、それが34−38Kd糖タンパクのみに対す
るあるいは動物ウイルス親株に対する高力価の中和活性
をもつ限り、ヒトの表現型をもった組換体ロータウイル
スを選択するために充分使用し得ることが発見された
が、ここが新規な点である。同様に、新規な生産物とし
て弱毒化生ワクチン前駆体およびワクチンがある。ワク
チンとしての組換体ウイルス（野生形の動物ウイルスを
用いる）には、親株として温度感受性動物ウイルスを用
いた他の組換体ワクチンに対して少なくとも２つの利点
のあることが注目される。すなわち（１）組換体ウイル
スは、様々な突然変異によって生みだされた毒性の弱い
ウイルスよりも潜在的に安定であること、および（２）
ヒトロータウイルス遺伝子は温度感受性動物ロータウイ
ルスを用いて調製される組換体の中には存在するが、非
温度感受性動物ロータウイルスの親株を用いて調製され
る組換体の中にはあまり存在しないことである。
組換体の調製方法に関する。この発明の手法では、所望
のヒト表現型をもった組換体を選ぶために、（１）高力
価の超免疫抗血清または（２）モノクローナル抗血清の
新しい使用が関与している。抗血清単独またはモノクロ
ーナル抗血清は、それが34−38Kd糖タンパクのみに対す
るあるいは動物ウイルス親株に対する高力価の中和活性
をもつ限り、ヒトの表現型をもった組換体ロータウイル
スを選択するために充分使用し得ることが発見された
が、ここが新規な点である。同様に、新規な生産物とし
て弱毒化生ワクチン前駆体およびワクチンがある。ワク
チンとしての組換体ウイルス（野生形の動物ウイルスを
用いる）には、親株として温度感受性動物ウイルスを用
いた他の組換体ワクチンに対して少なくとも２つの利点
のあることが注目される。すなわち（１）組換体ウイル
スは、様々な突然変異によって生みだされた毒性の弱い
ウイルスよりも潜在的に安定であること、および（２）
ヒトロータウイルス遺伝子は温度感受性動物ロータウイ
ルスを用いて調製される組換体の中には存在するが、非
温度感受性動物ロータウイルスの親株を用いて調製され
る組換体の中にはあまり存在しないことである。
ロータウイルスは、ヒトおよび動物の乳児の下痢を起こ
す主な原因である。不幸にも、ヒトロータウイルスに関
する疫学、生物学、および免疫学の研究は、組織培養で
は生育の難しいこれらのウイルスを増殖させるときにぶ
つかる困難な問題点によって阻まれてきた。最近の研究
では、少なくとも何種類かのヒトロータウイルスの単離
物は直接培養し得ることが示されている（ウィアット
ら，米国特許第4,341,870号）。ヒトロータウイルスの
培養に際し問題となっている難点を打開するための戦略
として、この発明は以下の点を利用している。すなわち
ロータウイルスゲノムの断片化する性質、および培養不
可能なヒトロータウイルスと培養可能なウシロータウイ
ルスの温度感受性（ts）突然変異体とを組換えることに
よって培養不可能なヒトロータウイルスを増殖させるた
めの同時感染に際し、高頻度の遺伝子組換体が得られる
ことである。ts突然変異体を使用することと関連して、
高力価の超免疫抗血清を過剰に利用した。生体外で増殖
を制限する培養不可能なヒトロータウイルスの遺伝子
は、組織培養に適応したウシロータウイルスからの相当
する遺伝子によって置換えられた。組換えられた遺伝子
をもつウイルスは「組換ウイルス」または「組換体」と
呼ばれている。
す主な原因である。不幸にも、ヒトロータウイルスに関
する疫学、生物学、および免疫学の研究は、組織培養で
は生育の難しいこれらのウイルスを増殖させるときにぶ
つかる困難な問題点によって阻まれてきた。最近の研究
では、少なくとも何種類かのヒトロータウイルスの単離
物は直接培養し得ることが示されている（ウィアット
ら，米国特許第4,341,870号）。ヒトロータウイルスの
培養に際し問題となっている難点を打開するための戦略
として、この発明は以下の点を利用している。すなわち
ロータウイルスゲノムの断片化する性質、および培養不
可能なヒトロータウイルスと培養可能なウシロータウイ
ルスの温度感受性（ts）突然変異体とを組換えることに
よって培養不可能なヒトロータウイルスを増殖させるた
めの同時感染に際し、高頻度の遺伝子組換体が得られる
ことである。ts突然変異体を使用することと関連して、
高力価の超免疫抗血清を過剰に利用した。生体外で増殖
を制限する培養不可能なヒトロータウイルスの遺伝子
は、組織培養に適応したウシロータウイルスからの相当
する遺伝子によって置換えられた。組換えられた遺伝子
をもつウイルスは「組換ウイルス」または「組換体」と
呼ばれている。
この組換体を選択するために用いられるこの高力価抗血
清に加えて、ウシの親株に対して選択圧を加えるために
この温度感受性突然変異体が必要であるということが最
初に考えられた（グリーンバーグら，Proc.NatI.Acad.S
ci.USA,78巻,1号,420−424頁,1981年１月）。グリーン
バーグの論文に記載されているように、最初に、この所
望のウイルス組換体を選択することは、混合感染から得
られる子株をヒトロータウイルスは中和しない高い特異
性をもつウシロータウイルスにさらすことによって可能
となった。続いて、ts−ウシロータウイルスの親株およ
びts−組換体を死滅させるために制限温度（39℃）で、
生残ったウイルスのプラークを形成させた。
清に加えて、ウシの親株に対して選択圧を加えるために
この温度感受性突然変異体が必要であるということが最
初に考えられた（グリーンバーグら，Proc.NatI.Acad.S
ci.USA,78巻,1号,420−424頁,1981年１月）。グリーン
バーグの論文に記載されているように、最初に、この所
望のウイルス組換体を選択することは、混合感染から得
られる子株をヒトロータウイルスは中和しない高い特異
性をもつウシロータウイルスにさらすことによって可能
となった。続いて、ts−ウシロータウイルスの親株およ
びts−組換体を死滅させるために制限温度（39℃）で、
生残ったウイルスのプラークを形成させた。
この発明においては、温度感受性突然変異体は用いず、
テンジクネズミを用いて調製されるような超免疫抗体で
あり得る抗血清の有効性、または次のようなあるモノク
ローナル抗体およびその子株（954/159/33;954/96/18;
および952/3/68）から選ばれるモノクローナル抗体の有
効性に信頼が置かれている。
テンジクネズミを用いて調製されるような超免疫抗体で
あり得る抗血清の有効性、または次のようなあるモノク
ローナル抗体およびその子株（954/159/33;954/96/18;
および952/3/68）から選ばれるモノクローナル抗体の有
効性に信頼が置かれている。
混合感染を受けたヒトロータウイルスＤ株およびウシロ
ータウイルスUK株から性質が調べられた最初の組換体の
中で、ヒトロータウイルスＤ株由来の遺伝子を１つもつ
ものが３つあり、同じ遺伝子を２つもつものが３つあ
る。有体に言うと、これらの組換体の中でこれらの遺伝
子の残りはウシの親株UKに由来する。
ータウイルスUK株から性質が調べられた最初の組換体の
中で、ヒトロータウイルスＤ株由来の遺伝子を１つもつ
ものが３つあり、同じ遺伝子を２つもつものが３つあ
る。有体に言うと、これらの組換体の中でこれらの遺伝
子の残りはウシの親株UKに由来する。
寄託の記述 モノクローナル抗体およびその子孫として本出願に記載
された細胞系によって生産される次の抗体,954/159/33;
954/96/18;および952/3/68は、メリーランド州20205,ベ
テスダの米国国立衛生研究所，第７ビルにあるアレルギ
ーおよび感染症研究所のL.I.D.研究室に寄託された。こ
の寄託所では同じような研究所のために標準的な方法で
管理が行われており、液体窒素蒸気中で−70℃の貯蔵で
操作が行われ、またこの研究所は活発に増殖するハイブ
リドーマ細胞の無菌単離体および低温保存用培地にこれ
らの細胞を懸濁させたものを提供し、また定期的な観察
と生育性試験のための解凍法を備えている。この寄託所
は現在ロバートM.チャノック博士の管轄下にある。これ
らの抗体は1982年３月18日および1982年４月５日に寄託
され、前者の日付からこの出願書の提出日まで、サンプ
ルを必要とする当該技術分野の研究者に入手可能であっ
た。ウシロータウイルス（NCDV）はATCC（＃VR−452）
から入手し得るよく知られたウイルスである。ATCC.株
カタログII,第３版,343頁（1981）参照。次のヒト／ウ
シ組換体ロータウイルスは1983年６月16日にATCCに寄託
され、その寄託番号はATCC＃VR2969である。この組換体
はヒトロータウイルス血清型１であるが、ウシロータウ
イルスUK遺伝子をも含んでいる。それはHD/BRV−1,クロ
ーン47−１−1,1983年６月16日と呼称されている。
された細胞系によって生産される次の抗体,954/159/33;
954/96/18;および952/3/68は、メリーランド州20205,ベ
テスダの米国国立衛生研究所，第７ビルにあるアレルギ
ーおよび感染症研究所のL.I.D.研究室に寄託された。こ
の寄託所では同じような研究所のために標準的な方法で
管理が行われており、液体窒素蒸気中で−70℃の貯蔵で
操作が行われ、またこの研究所は活発に増殖するハイブ
リドーマ細胞の無菌単離体および低温保存用培地にこれ
らの細胞を懸濁させたものを提供し、また定期的な観察
と生育性試験のための解凍法を備えている。この寄託所
は現在ロバートM.チャノック博士の管轄下にある。これ
らの抗体は1982年３月18日および1982年４月５日に寄託
され、前者の日付からこの出願書の提出日まで、サンプ
ルを必要とする当該技術分野の研究者に入手可能であっ
た。ウシロータウイルス（NCDV）はATCC（＃VR−452）
から入手し得るよく知られたウイルスである。ATCC.株
カタログII,第３版,343頁（1981）参照。次のヒト／ウ
シ組換体ロータウイルスは1983年６月16日にATCCに寄託
され、その寄託番号はATCC＃VR2969である。この組換体
はヒトロータウイルス血清型１であるが、ウシロータウ
イルスUK遺伝子をも含んでいる。それはHD/BRV−1,クロ
ーン47−１−1,1983年６月16日と呼称されている。
背景技術 グリーンバーク，ハリーB.ら，「培養可能なウシロータ
ウイルスのts突然変異を用いた混合感染に際しての遺伝
子組換体による培養不可能なヒトロータウイルスの分
離」，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,78巻,1号,420−424頁,1
981年１月。ウシロータウイルスのts遺伝子を用いて、
生体外で増殖を抑制する生育しにくいロータウイルスの
遺伝子は、組織培養に適合したロータウイルスからの相
当する遺伝子によって置換えられた。
ウイルスのts突然変異を用いた混合感染に際しての遺伝
子組換体による培養不可能なヒトロータウイルスの分
離」，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,78巻,1号,420−424頁,1
981年１月。ウシロータウイルスのts遺伝子を用いて、
生体外で増殖を抑制する生育しにくいロータウイルスの
遺伝子は、組織培養に適合したロータウイルスからの相
当する遺伝子によって置換えられた。
カリカ，アントニーR.ら，「中和およびサブグループ抗
原の遺伝情報を指定するヒトロータウイルス（WA株）お
よびウシロータウイルス（UK株）の遺伝子」，Virolog
y,112,385−390,（1981）。ウシロータウイルス（UK
株）のts突然変異体と培養不可能または可能なヒトロー
タウイルス（WA株）とを混合感染させて回収した16種の
ロータウイルス組換体を解析した結果、９番目の遺伝子
に対応するRNA断片は、中和抗体を誘導しそれと反応す
るタンパクの遺伝情報を指定すること、６番目の遺伝子
に対応するRNA断片はサブグループ抗原の遺伝情報を指
定すること、およびおそらく細胞培養で培養不可能なヒ
トロータウイルスの増殖の制限には４番目の遺伝子に対
応するRNA断片が起因していること、が示された。
原の遺伝情報を指定するヒトロータウイルス（WA株）お
よびウシロータウイルス（UK株）の遺伝子」，Virolog
y,112,385−390,（1981）。ウシロータウイルス（UK
株）のts突然変異体と培養不可能または可能なヒトロー
タウイルス（WA株）とを混合感染させて回収した16種の
ロータウイルス組換体を解析した結果、９番目の遺伝子
に対応するRNA断片は、中和抗体を誘導しそれと反応す
るタンパクの遺伝情報を指定すること、６番目の遺伝子
に対応するRNA断片はサブグループ抗原の遺伝情報を指
定すること、およびおそらく細胞培養で培養不可能なヒ
トロータウイルスの増殖の制限には４番目の遺伝子に対
応するRNA断片が起因していること、が示された。
フローレンス，ジョージら，「ロータウイルス組換体の
遺伝型を決める上での転写プローブの使用」，Virolog
y,121,288−295（1982）。
遺伝型を決める上での転写プローブの使用」，Virolog
y,121,288−295（1982）。
グリーンバーグ，ハリーB.ら，「遺伝子組換えによる培
養不可能なヒトロータウイルスの分離および血清型決
定」，Infection and immunity,37巻１号,104−109頁,1
982年７月。この論文では、遺伝子組換えにより巧みに
分離された50種の培養不可能なヒトロータウイルス中で
33種が示されている。
養不可能なヒトロータウイルスの分離および血清型決
定」，Infection and immunity,37巻１号,104−109頁,1
982年７月。この論文では、遺伝子組換えにより巧みに
分離された50種の培養不可能なヒトロータウイルス中で
33種が示されている。
カリカ，アントニーR.ら，「血球凝集反応の遺伝情報を
指定するロータウイルス遺伝子の同定およびプロテアー
ゼ活性の高まったプラークの同定」，Virology,125,194
−205,1983。ウシロータウイルス（UKコンプトン株）お
よびアカゲザルロータウイルス（MMU18006株）の温度感
受性突然変異体が用いられ、MA104細胞への同時感染に
より16種の組換体を得た。他の結果から、中和抗体が８
番目または９番目の遺伝子に対応するRNA断片に連鎖し
ていること、および血球凝集反応（HA）の抗原が４番目
の遺伝子に対応するRNA断片に連鎖していることが明ら
かにされた。
指定するロータウイルス遺伝子の同定およびプロテアー
ゼ活性の高まったプラークの同定」，Virology,125,194
−205,1983。ウシロータウイルス（UKコンプトン株）お
よびアカゲザルロータウイルス（MMU18006株）の温度感
受性突然変異体が用いられ、MA104細胞への同時感染に
より16種の組換体を得た。他の結果から、中和抗体が８
番目または９番目の遺伝子に対応するRNA断片に連鎖し
ていること、および血球凝集反応（HA）の抗原が４番目
の遺伝子に対応するRNA断片に連鎖していることが明ら
かにされた。
グリーンバーグ，ハリーら，「モノクローナル抗体を用
いたロータウイルスのサブグループタンパクの血清型分
析」，Infection and Imunity,39巻,1号,91−99頁,1983
年１月。この論文においてグリーンバーグと彼の共同研
究者らは、６番目の遺伝子のタンパク産物と関連した抗
原特異性を示しているロータウイルスサブグループとい
う言葉に焦点を合せている。６番目のロータウイルス遺
伝子の産物とは42Kdの主要な内部構造をもつタンパクの
ことであり、そして著者らは、抗原として２つの区別さ
れるサブグループと特異的に反応するモノクローナル抗
体について記載している。このタンパクはヴィリオン上
に大量に存在しており、補体結合アッセイ、免疫粘着血
球凝集アッセイ（IAHA）。放射線免疫アッセイ（RI
A）、および酸素結合免疫吸収アッセイ（ELISA）を含む
様々な抗体アッセイ系を用いて容易に検出され得る。
いたロータウイルスのサブグループタンパクの血清型分
析」，Infection and Imunity,39巻,1号,91−99頁,1983
年１月。この論文においてグリーンバーグと彼の共同研
究者らは、６番目の遺伝子のタンパク産物と関連した抗
原特異性を示しているロータウイルスサブグループとい
う言葉に焦点を合せている。６番目のロータウイルス遺
伝子の産物とは42Kdの主要な内部構造をもつタンパクの
ことであり、そして著者らは、抗原として２つの区別さ
れるサブグループと特異的に反応するモノクローナル抗
体について記載している。このタンパクはヴィリオン上
に大量に存在しており、補体結合アッセイ、免疫粘着血
球凝集アッセイ（IAHA）。放射線免疫アッセイ（RI
A）、および酸素結合免疫吸収アッセイ（ELISA）を含む
様々な抗体アッセイ系を用いて容易に検出され得る。
グリーンバーグ，ハリーB.ら，「ヒトロータウイルスの
ＷおよびDS株の増殖抑制、中和およびサブグループ特異
性の遺伝情報を指定する遺伝子」，General Virology,6
4,313−324,1983。ロータウイルスの血清型を決定する
に際し、Ｗウイルスの９番目の遺伝子断片とDA−１ヒト
ロータウイルスの８番目の遺伝子断片とは血清型特異性
において関連しており、一方Ｗウイルスの６番目の遺伝
子断片はサブグループ特異性において関連していること
が明らかとなった。
ＷおよびDS株の増殖抑制、中和およびサブグループ特異
性の遺伝情報を指定する遺伝子」，General Virology,6
4,313−324,1983。ロータウイルスの血清型を決定する
に際し、Ｗウイルスの９番目の遺伝子断片とDA−１ヒト
ロータウイルスの８番目の遺伝子断片とは血清型特異性
において関連しており、一方Ｗウイルスの６番目の遺伝
子断片はサブグループ特異性において関連していること
が明らかとなった。
グリーンバーグ，ハリーB.ら，「アカゲザルロータウイ
ルスの２つの表面タンパクに結合するモノクローナル抗
体の産生と予備検定」，J.Virology,47,267−275,198
3。アカゲザルロータウイルスの血清型は３種の主要ヒ
トロータウイルスの血清型の１つと同一性があるため、
RRVも、ワクチン前駆体を調製するためにヒト／動物ロ
ータウイルス組換体で遺伝子供与体として計画的に用い
られた。研究が示すところによれば、アカゲザルロータ
ウイルスの２種の主要表面タンパクの１つと反応する36
種のモノクローナル抗体のうち３種が利用され、８番目
または９番目の遺伝子産物である38Kdの外面にあるキャ
プシドの糖タンパクと特異的に免疫沈降反応を起こし
た。
ルスの２つの表面タンパクに結合するモノクローナル抗
体の産生と予備検定」，J.Virology,47,267−275,198
3。アカゲザルロータウイルスの血清型は３種の主要ヒ
トロータウイルスの血清型の１つと同一性があるため、
RRVも、ワクチン前駆体を調製するためにヒト／動物ロ
ータウイルス組換体で遺伝子供与体として計画的に用い
られた。研究が示すところによれば、アカゲザルロータ
ウイルスの２種の主要表面タンパクの１つと反応する36
種のモノクローナル抗体のうち３種が利用され、８番目
または９番目の遺伝子産物である38Kdの外面にあるキャ
プシドの糖タンパクと特異的に免疫沈降反応を起こし
た。
米国特許第3,992,522号チャノクら 米国特許第4,341,870号ウィアットら 上記関連文献において注目すべきことは、ウシロータウ
イルスUK株の突然変異体と培養不可能なヒトロータウイ
ルスWA株との混合感染に関して、９番目の遺伝子に対応
するRNA断片が中和抗体を誘導しそれと反応するタンパ
クの遺伝情報を指定していることが示されたことであ
る。さらに、４番目の遺伝子に対応するRNA断片が原因
で細胞培養においてロータウイルスの増殖が制限される
ようである。様々な部位からの50種の培養不可能なヒト
ロータウイルスのうち33種が遺伝的組換えにより見事に
分離されることが明らかになったと同様に、19種の株は
予め血清学的に性質の分っているヒトロータウイルスWA
株と似ており、３種の株はDS−１と血清学的に相関があ
った。一方11種の株はWAおよびDS−１株と血清学的に区
別され、１つ以上の新しいヒトロータウイルス血清型を
表わしていることが明らかとなった。
イルスUK株の突然変異体と培養不可能なヒトロータウイ
ルスWA株との混合感染に関して、９番目の遺伝子に対応
するRNA断片が中和抗体を誘導しそれと反応するタンパ
クの遺伝情報を指定していることが示されたことであ
る。さらに、４番目の遺伝子に対応するRNA断片が原因
で細胞培養においてロータウイルスの増殖が制限される
ようである。様々な部位からの50種の培養不可能なヒト
ロータウイルスのうち33種が遺伝的組換えにより見事に
分離されることが明らかになったと同様に、19種の株は
予め血清学的に性質の分っているヒトロータウイルスWA
株と似ており、３種の株はDS−１と血清学的に相関があ
った。一方11種の株はWAおよびDS−１株と血清学的に区
別され、１つ以上の新しいヒトロータウイルス血清型を
表わしていることが明らかとなった。
発明の開示 この発明の組換体調製方法および産物は、現在ヒトロー
タウイルス病に対するワクチン前駆体およびワクチンを
製造するために有効である。
タウイルス病に対するワクチン前駆体およびワクチンを
製造するために有効である。
遺伝子供与体として用いられ得る動物ロータウイルスに
は、ウシ（UK）、サル（MMU18006）、イヌ（CU−１）、
マウス、およびトリのウイルスがある。この発明に用い
るに敵したヒトロータウイルスは、ノトバイオートの子
ウシ排泄物、ヒトの糞便懸濁液の型で用いられるか、ま
たはアフリカミドリザル腎（AGMK）の消化管を通過した
ものとして用いられる。
は、ウシ（UK）、サル（MMU18006）、イヌ（CU−１）、
マウス、およびトリのウイルスがある。この発明に用い
るに敵したヒトロータウイルスは、ノトバイオートの子
ウシ排泄物、ヒトの糞便懸濁液の型で用いられるか、ま
たはアフリカミドリザル腎（AGMK）の消化管を通過した
ものとして用いられる。
方法は最初にヒトおよび動物ロータウイルスをトリプシ
ンで前処理することを含む。ヒトロータウイルスは全く
培養不可能かまたはほとんど培養不可能であるため、そ
れを単層のAGMK細胞の上に遠心させる。この段階によっ
て細胞に入るウイルスの量が増える、換言すると、感染
の多様性が増す。続いてAGMK細胞をある種の動物ロータ
ウイルス株で同時感染させ、約36時間増殖させて、ウイ
ルスを回収し凍結する。同時感染させたこれらの細胞か
ら得られたウイルスを続いて高い特異性をもつ抗血清で
処理し、動物ロータウイルスの親株を効果的に中和す
る。組換えの条件を確立する過程において、超免疫抗体
またはモノクローナル抗体は動物ウイルス親株の４番目
の遺伝子産物に指向される活性を持つべきでないことが
判明した。この段階が最も重要である。というのはこの
方法において組換体の混合物は、選択されたヒト表現型
を含む組換体ウイルスだけになるからである。それぞれ
のウイルスのプラークは４から７日後に採取され、続い
て均質な製剤となるまで精製され、そしてワクチン前駆
体またはワクチンを製造するために供される。
ンで前処理することを含む。ヒトロータウイルスは全く
培養不可能かまたはほとんど培養不可能であるため、そ
れを単層のAGMK細胞の上に遠心させる。この段階によっ
て細胞に入るウイルスの量が増える、換言すると、感染
の多様性が増す。続いてAGMK細胞をある種の動物ロータ
ウイルス株で同時感染させ、約36時間増殖させて、ウイ
ルスを回収し凍結する。同時感染させたこれらの細胞か
ら得られたウイルスを続いて高い特異性をもつ抗血清で
処理し、動物ロータウイルスの親株を効果的に中和す
る。組換えの条件を確立する過程において、超免疫抗体
またはモノクローナル抗体は動物ウイルス親株の４番目
の遺伝子産物に指向される活性を持つべきでないことが
判明した。この段階が最も重要である。というのはこの
方法において組換体の混合物は、選択されたヒト表現型
を含む組換体ウイルスだけになるからである。それぞれ
のウイルスのプラークは４から７日後に採取され、続い
て均質な製剤となるまで精製され、そしてワクチン前駆
体またはワクチンを製造するために供される。
この発明の重要な特徴は組換体を分離するために用いら
れる選択技術にある。現在まで、所望の組換体ロータウ
イルスの選択法を開発することに問題が集中していた。
この発明に先立って、最も最近の方法としてウシロータ
ウイルスの温度感受性突然変異体を用いることが考えら
れていた。さらに詳しい考察のためには、PNAS,78巻,42
0頁，およびInfection and Immunity,37巻,104頁を参照
のこと。
れる選択技術にある。現在まで、所望の組換体ロータウ
イルスの選択法を開発することに問題が集中していた。
この発明に先立って、最も最近の方法としてウシロータ
ウイルスの温度感受性突然変異体を用いることが考えら
れていた。さらに詳しい考察のためには、PNAS,78巻,42
0頁，およびInfection and Immunity,37巻,104頁を参照
のこと。
端的に言うと、温度感受性突然変異体を用いる手法は、
培養可能なウシロータウイルスと培養不可能なヒトロー
タウイルスとを許容温度で同時感染させ、同時感染によ
り得られたウイルス組換体をウシウイルスの増殖には非
許容的（制限的）温度で培養することからなる。ウシウ
イルス株の非温度感受性の遺伝子断片を含む組換体だけ
が生残る。
培養可能なウシロータウイルスと培養不可能なヒトロー
タウイルスとを許容温度で同時感染させ、同時感染によ
り得られたウイルス組換体をウシウイルスの増殖には非
許容的（制限的）温度で培養することからなる。ウシウ
イルス株の非温度感受性の遺伝子断片を含む組換体だけ
が生残る。
この発明の系では、非温度感受性の動物ロータウイルス
の親株を用いるが、これには２つの利点がある。すなわ
ち（１）動物ロータウイルスには化学物質による突然変
異は起きないため、しばしば遺伝的に不安定で不活動な
点突然変異は、組換体に存在する動物ロータウイルスの
遺伝子には存在しない、および（２）温度感受性動物ロ
ータウイルス親株を用いるよりも非温度感受性動物ロー
タウイルス親株用いて調製される組換体の中にはヒトロ
ータウイルスの遺伝子はあまり存在しない、点である。
の親株を用いるが、これには２つの利点がある。すなわ
ち（１）動物ロータウイルスには化学物質による突然変
異は起きないため、しばしば遺伝的に不安定で不活動な
点突然変異は、組換体に存在する動物ロータウイルスの
遺伝子には存在しない、および（２）温度感受性動物ロ
ータウイルス親株を用いるよりも非温度感受性動物ロー
タウイルス親株用いて調製される組換体の中にはヒトロ
ータウイルスの遺伝子はあまり存在しない、点である。
この発明は非温度感受性ウイルスを用いることによる温
度感受性選択技術とは異なる。所望のウイルス組換体の
選択は、動物およびヒトロータウイルスの混合感染から
得られる子株を、動物ウイルス親株を中和する強力で特
異的な動物ロータウイルスの抗血清にさらすことによっ
て可能となる。この方法によって、（１）組織培養にお
いて増殖が速く、（２）非常に効率よくプラークを形成
し、（３）血清型が特異的なヒトロータウイルスの抗血
清による中和によって、表現型ではヒトであると特徴付
けられ、および（４）ヒトロータウイルスの遺伝子を少
ししか含まないウイルス組換体を回収した。
度感受性選択技術とは異なる。所望のウイルス組換体の
選択は、動物およびヒトロータウイルスの混合感染から
得られる子株を、動物ウイルス親株を中和する強力で特
異的な動物ロータウイルスの抗血清にさらすことによっ
て可能となる。この方法によって、（１）組織培養にお
いて増殖が速く、（２）非常に効率よくプラークを形成
し、（３）血清型が特異的なヒトロータウイルスの抗血
清による中和によって、表現型ではヒトであると特徴付
けられ、および（４）ヒトロータウイルスの遺伝子を少
ししか含まないウイルス組換体を回収した。
発明を実施するための最良の形態 ４種の動物ロータウイルス株がその培養可能な遺伝子断
片を組換体株に供与する。
片を組換体株に供与する。
１）ウシ:UK株，子ウシ腎細胞中で増殖。
２）サル:MMU18006（アカゲザル）株、アフリカミドリ
ザル腎細胞中で増殖、続いてDBS−FRhL−２細胞（米国
特許第4,040,905号）中で増殖。
ザル腎細胞中で増殖、続いてDBS−FRhL−２細胞（米国
特許第4,040,905号）中で増殖。
３）イヌ:CU−１株,AGMK細胞中で増殖。
４）ネズミ:EW22348株,AGMK細胞中で増殖。
トリロータウイルスは上記ウイルスの特性を備えている
が、このことはトリロータウイルスもまた遺伝子を供与
することを示している。
が、このことはトリロータウイルスもまた遺伝子を供与
することを示している。
この発明の教示するところは、これら４種の動物ロータ
ウイルスに限定されるものではない。それというのも病
気の主因として付随的な血清型が連続的に現われるた
め、ワクチンの最終的な型を予測することは不可能だか
らである。
ウイルスに限定されるものではない。それというのも病
気の主因として付随的な血清型が連続的に現われるた
め、ワクチンの最終的な型を予測することは不可能だか
らである。
４株のヒトロータウイルスが用いられるが、それらはプ
ラーク半減中和アッセイによって定義される４種の異な
った血清型を表わしている。すなわち、 ａ）Ｄ株，血清型1,ノトバイオートの子ウシ排泄物の型
で用いられる。
ラーク半減中和アッセイによって定義される４種の異な
った血清型を表わしている。すなわち、 ａ）Ｄ株，血清型1,ノトバイオートの子ウシ排泄物の型
で用いられる。
ｂ）DS−１株，血清型2,ノトバイオートの子ウシ排泄物
の型で用いられる。
の型で用いられる。
ｃ）Ｐ株，血清型3,約２％のヒト糞便懸濁液の型で用い
られる。注目すべきことに、アカゲザルロータウイルス
（MMU18006）およびイヌロータウイルス（CU−１）も同
様に血清型３のロータウイルスである。
られる。注目すべきことに、アカゲザルロータウイルス
（MMU18006）およびイヌロータウイルス（CU−１）も同
様に血清型３のロータウイルスである。
ｄ）ST4株，血清型4,約２％の糞便懸濁液の型で用いら
れるか、AGMK細胞の中で増殖させる。
れるか、AGMK細胞の中で増殖させる。
動物ロータウイルスの場合と同様に、ヒトの株を掲げた
ことはこの発明の範囲を限定するためのものではない。
ロータウイルスの新しい血清型が同定されるにつれ、こ
の発明の方法を用いて新しいワクチンを開発することは
容易である。
ことはこの発明の範囲を限定するためのものではない。
ロータウイルスの新しい血清型が同定されるにつれ、こ
の発明の方法を用いて新しいワクチンを開発することは
容易である。
ヒト／ウシ組換体ロータウイルスはヒトロータウイルス
の血清型１を示すとともに、ウシロータウイルスのUK遺
伝子も含んでいる。それはHD/BRV−1,クローン47−１−
1,1983年６月16日と呼称される。
の血清型１を示すとともに、ウシロータウイルスのUK遺
伝子も含んでいる。それはHD/BRV−1,クローン47−１−
1,1983年６月16日と呼称される。
組換えに用いられる動物およびヒト双方のロータウイル
スは、培養細胞への接種に先立って約0.5μg/mlのトリ
プシンを用いて前処理される。培養不可能かほとんど培
養不可能なヒトロータウイルスは単層培養のAGMK細胞の
上へと遠心される。この操作により細胞に入るウイルス
の量が増す、換言すると感染の多様化が促進される。続
いてAGMK細胞は適当な動物ロータウイルス株によって同
時感染を受ける。混合したウイルスを増殖させ、37℃で
約36時間かけて組換えを行なう。１日半から２日の後に
感染させた細胞を回収し、凍結する。感染させた培養細
胞から回収するウイルスは、続いて37℃で１時間トリプ
シン（10μg/ml）と共に培養する。次に動物ロータウイ
ルスを標的として、1:100または1:500に希釈した高い特
異性のある超免疫抗体と共に37℃で１時間の培養を追加
して行ない。抗体を用いた処理は最も重要な段階である
ので、次の段落でさらに詳細に考察する。個々のウイル
スプラークを４ないし７日後採取し、続いてウイルスを
精製して、均質な懸濁液を調製する。プラークで精製し
たロータウイルス組換体において、遺伝子型（どの遺伝
子がどの親株から由来するかで定義される）および表現
型（プラーク半減アッセイで血清型が定義される）を決
定する。精製したウイルス調製物を種の懸濁液として増
殖させ、ワクチン前駆体または弱毒化生ワクチンを製造
するために薬剤として適当な培地に混合させる。精製し
たワクチンを連続的に継代接種し、その結果、生きたま
まの弱毒化ワクチンからワクチン前駆体が製造される。
スは、培養細胞への接種に先立って約0.5μg/mlのトリ
プシンを用いて前処理される。培養不可能かほとんど培
養不可能なヒトロータウイルスは単層培養のAGMK細胞の
上へと遠心される。この操作により細胞に入るウイルス
の量が増す、換言すると感染の多様化が促進される。続
いてAGMK細胞は適当な動物ロータウイルス株によって同
時感染を受ける。混合したウイルスを増殖させ、37℃で
約36時間かけて組換えを行なう。１日半から２日の後に
感染させた細胞を回収し、凍結する。感染させた培養細
胞から回収するウイルスは、続いて37℃で１時間トリプ
シン（10μg/ml）と共に培養する。次に動物ロータウイ
ルスを標的として、1:100または1:500に希釈した高い特
異性のある超免疫抗体と共に37℃で１時間の培養を追加
して行ない。抗体を用いた処理は最も重要な段階である
ので、次の段落でさらに詳細に考察する。個々のウイル
スプラークを４ないし７日後採取し、続いてウイルスを
精製して、均質な懸濁液を調製する。プラークで精製し
たロータウイルス組換体において、遺伝子型（どの遺伝
子がどの親株から由来するかで定義される）および表現
型（プラーク半減アッセイで血清型が定義される）を決
定する。精製したウイルス調製物を種の懸濁液として増
殖させ、ワクチン前駆体または弱毒化生ワクチンを製造
するために薬剤として適当な培地に混合させる。精製し
たワクチンを連続的に継代接種し、その結果、生きたま
まの弱毒化ワクチンからワクチン前駆体が製造される。
ウイルスの弱毒化は動物とヒトの遺伝子を組換えること
によって達成されるであろうし、さらに毒力を弱めるこ
とはアフリカミドリザル腎の培養細胞へ繰返し断代接種
することによって可能となろう。ウイルスの精製はプラ
ークを形成させることによって行ない、そして形成され
たプラークは生きたままのウイルスの無菌製剤を調製す
るために、当該分野では公知の手法により、適当な溶媒
に溶解するか、加えることができる。同じようなワクチ
ンの実際の調製法は、Remingtons′ Pharmaceutical Sc
iences（the Philadelphia College of Pharmaey and S
cience出版、Mack Printing Co.,Eastan,PA印刷）,16
版,1980年,1331−1335頁のウイルスワクチン（Virus Va
ccine）に関する節に示されている。
によって達成されるであろうし、さらに毒力を弱めるこ
とはアフリカミドリザル腎の培養細胞へ繰返し断代接種
することによって可能となろう。ウイルスの精製はプラ
ークを形成させることによって行ない、そして形成され
たプラークは生きたままのウイルスの無菌製剤を調製す
るために、当該分野では公知の手法により、適当な溶媒
に溶解するか、加えることができる。同じようなワクチ
ンの実際の調製法は、Remingtons′ Pharmaceutical Sc
iences（the Philadelphia College of Pharmaey and S
cience出版、Mack Printing Co.,Eastan,PA印刷）,16
版,1980年,1331−1335頁のウイルスワクチン（Virus Va
ccine）に関する節に示されている。
モノクローナル抗体および超免疫抗血清 ヒトの培養不可能なロータウイルスの親株と動物のロー
タウイルスの親株から由来する組換体に関して、この発
明の重要な特徴は、混合感染させた子株を中和抗体で処
理することにある。これは高い特異性のある抗体を用い
て行なわれるが、この抗体は動物ロータウイルスの親株
を中和する。サル（RRV）およびイヌ（CU−１）ロータ
ウイルスの場合、望ましい抗体はサルロータウイルスの
38Kd糖タンパクに結合する３種の異なった抗体の混合物
から成っている。これらのモノクローナル抗体は高力価
であり、イヌロータウイルスおよび他の型の３種のウイ
ルスと明らかに交差反応をおこす。アカゲザルに対する
これらのモノクローナル抗体を開発する過程において、
39種のモノクローナル抗体のうち３種のみが、血清型特
異的に中和活性のある抗体を誘導しまたはそれと反応す
る８番目または９番目の遺伝子産物に相当する重要な38
Kdの外側にあるキャプシドの糖タンパクと沈降反応を起
こすことが明らかになった。ウシロータウイルス（UK）
の場合、ウシロータウイルスを使って調製される交差反
応陽性の抗血清が用いられる。この抗血清は高力価でウ
シロータウイルスの38Kd糖タンパクと明らかに交差反応
を起こすが、ウシロータウイルス（UK）の82Kdタンパク
を標的とした中和活性をほとんどかまたは全く示さな
い。
タウイルスの親株から由来する組換体に関して、この発
明の重要な特徴は、混合感染させた子株を中和抗体で処
理することにある。これは高い特異性のある抗体を用い
て行なわれるが、この抗体は動物ロータウイルスの親株
を中和する。サル（RRV）およびイヌ（CU−１）ロータ
ウイルスの場合、望ましい抗体はサルロータウイルスの
38Kd糖タンパクに結合する３種の異なった抗体の混合物
から成っている。これらのモノクローナル抗体は高力価
であり、イヌロータウイルスおよび他の型の３種のウイ
ルスと明らかに交差反応をおこす。アカゲザルに対する
これらのモノクローナル抗体を開発する過程において、
39種のモノクローナル抗体のうち３種のみが、血清型特
異的に中和活性のある抗体を誘導しまたはそれと反応す
る８番目または９番目の遺伝子産物に相当する重要な38
Kdの外側にあるキャプシドの糖タンパクと沈降反応を起
こすことが明らかになった。ウシロータウイルス（UK）
の場合、ウシロータウイルスを使って調製される交差反
応陽性の抗血清が用いられる。この抗血清は高力価でウ
シロータウイルスの38Kd糖タンパクと明らかに交差反応
を起こすが、ウシロータウイルス（UK）の82Kdタンパク
を標的とした中和活性をほとんどかまたは全く示さな
い。
中和活性のあるモノクローナル抗体に関して、この発明
では、954/159/33,954/96/18,および952/3/68が利用さ
れている。これらのモノクローナル抗体を単独でまたは
複数組合わせて利用することができる。それらはすべて
重要な38Kdの外側にあるキャプシドの糖タンパクを沈降
させることを目的とするが、その糖タンパクは、中和活
性のある抗体を誘導しまたはそれと反応するタンパクの
遺伝情報を指定する８番目または９番目の遺伝子産物に
相当する。
では、954/159/33,954/96/18,および952/3/68が利用さ
れている。これらのモノクローナル抗体を単独でまたは
複数組合わせて利用することができる。それらはすべて
重要な38Kdの外側にあるキャプシドの糖タンパクを沈降
させることを目的とするが、その糖タンパクは、中和活
性のある抗体を誘導しまたはそれと反応するタンパクの
遺伝情報を指定する８番目または９番目の遺伝子産物に
相当する。
同様にこの発明の高力価の超免疫抗体に関して、これは
テンジクネズミで調製される高力価の超免疫抗体から選
ばれる。注目すべきことに、上記のモノクローナル抗体
はこの出願書を提出する時点で公知であり利用されてい
るモノクローナル抗体に由来する。さらに注目すべきこ
とは、従来この型のワクチン前駆体が、産物が常に生き
たまま弱毒化されたウイルスであるように、既知のウイ
ルスまたは既知の感染性ウイルスの遺伝的組換えおよび
連続的継代接種を必要とすることである。前記のごと
く、前駆体は無菌的なワクチンを製造するための従来の
方法により生じ得るプラークの形で得られる。
テンジクネズミで調製される高力価の超免疫抗体から選
ばれる。注目すべきことに、上記のモノクローナル抗体
はこの出願書を提出する時点で公知であり利用されてい
るモノクローナル抗体に由来する。さらに注目すべきこ
とは、従来この型のワクチン前駆体が、産物が常に生き
たまま弱毒化されたウイルスであるように、既知のウイ
ルスまたは既知の感染性ウイルスの遺伝的組換えおよび
連続的継代接種を必要とすることである。前記のごと
く、前駆体は無菌的なワクチンを製造するための従来の
方法により生じ得るプラークの形で得られる。
１型のヒトロータウイルスのDS−１株,2型のヒトロータ
ウイルスのWA株およびウシロータウイルスのNCDV（リン
カン）株に対する超免疫抗体はテンジクネズミで調製さ
れた。ウシおよびDS−１ロータウイルスはシヨ糖勾配遠
心法によって部分的に精製され、フロインド完全アジュ
バントの中に入れて注射された。ヒトロータウイルスの
組織培養に適合したWA突然変異体はシヨ糖を通した遠心
によって部分的に精製され、同様にフロインド完全アジ
ュバントの中に入れて注射された。三週間後ウイルスを
フロインド不完全アジュバントの中に入れて注射し、さ
らに３週間後最後にアジュバントなしでウイルスを接種
した。１型ヒトウイルスは感染されたノトバイオートの
子ウシの糞便から精製され、一方２型のヒトウイルスは
AGMK培養細胞中で増殖させた。ウシロータウイルスのNC
DV株はAGMK細胞の中で増殖させた。
ウイルスのWA株およびウシロータウイルスのNCDV（リン
カン）株に対する超免疫抗体はテンジクネズミで調製さ
れた。ウシおよびDS−１ロータウイルスはシヨ糖勾配遠
心法によって部分的に精製され、フロインド完全アジュ
バントの中に入れて注射された。ヒトロータウイルスの
組織培養に適合したWA突然変異体はシヨ糖を通した遠心
によって部分的に精製され、同様にフロインド完全アジ
ュバントの中に入れて注射された。三週間後ウイルスを
フロインド不完全アジュバントの中に入れて注射し、さ
らに３週間後最後にアジュバントなしでウイルスを接種
した。１型ヒトウイルスは感染されたノトバイオートの
子ウシの糞便から精製され、一方２型のヒトウイルスは
AGMK培養細胞中で増殖させた。ウシロータウイルスのNC
DV株はAGMK細胞の中で増殖させた。
試験法 動物ロータウイルスを中和し、38Kdの糖タンパク（８番
目または９番目の遺伝子産物）を免疫的に沈降させるか
もしれない抗体は免疫沈降および中和の試験によって、
上記の必要事項を満たすようなモノクローンから選択す
ることができる。J.Virology,47:265−276,1983に見ら
れるグリーンバーグの論文「アカゲザルの２種の表面タ
ンパクに結合するモノクローナル抗体の産生と予備試
験」において、一群の39種の抗体が記載されているが、
そのうち36種は、４番目の遺伝子の産物でありウイルス
の血球凝集素でもある82Kdの外側にあるキャプシドのタ
ンパクを免疫的に沈降させる。39種のうち３種のモノク
ローナル抗体のみがアカゲザルロータウイルスの中和反
応に対し高力価を示し得なかった。またその３種にはHI
活性があった。36種は血球の凝集阻害を示し、アカゲザ
ルロータウイルスの中和反応に対し中程度または高い力
価を示した。
目または９番目の遺伝子産物）を免疫的に沈降させるか
もしれない抗体は免疫沈降および中和の試験によって、
上記の必要事項を満たすようなモノクローンから選択す
ることができる。J.Virology,47:265−276,1983に見ら
れるグリーンバーグの論文「アカゲザルの２種の表面タ
ンパクに結合するモノクローナル抗体の産生と予備試
験」において、一群の39種の抗体が記載されているが、
そのうち36種は、４番目の遺伝子の産物でありウイルス
の血球凝集素でもある82Kdの外側にあるキャプシドのタ
ンパクを免疫的に沈降させる。39種のうち３種のモノク
ローナル抗体のみがアカゲザルロータウイルスの中和反
応に対し高力価を示し得なかった。またその３種にはHI
活性があった。36種は血球の凝集阻害を示し、アカゲザ
ルロータウイルスの中和反応に対し中程度または高い力
価を示した。
実施例１ 中和アッセイ。培養ハイブリドーマからの上澄液、選択
されたハイブリドーマを接種したマウスからの腹水およ
び前接種したマウスの血清の力価を標準60％プラーク半
減法により測定した。トリプシンで活性化され、15ない
し80プラーク形成単位（PFU）を表わす200μｌのウイル
スを、２倍または４倍と逓減希釈（MEMにより）したモ
ノクローナル抗体200μｌと混合した。37℃で１時間培
養したあと、その混合物をMA104単層細胞の上に接種
し、そして１時間吸着させた。続いてトレイの穴を一度
洗い、EMEMアガロースを重層した。３ないし６日後、ニ
ユートラルレッドを含むアガロース層を重層し、プラー
クの数を測定した。ネガティブ対照には、NS1上澄液と
モノクローナル培養液（HAT）で培養したウイルスとを
混合したウイルス、および前培養したマウス血清と混合
したウイルスが含まれた。
されたハイブリドーマを接種したマウスからの腹水およ
び前接種したマウスの血清の力価を標準60％プラーク半
減法により測定した。トリプシンで活性化され、15ない
し80プラーク形成単位（PFU）を表わす200μｌのウイル
スを、２倍または４倍と逓減希釈（MEMにより）したモ
ノクローナル抗体200μｌと混合した。37℃で１時間培
養したあと、その混合物をMA104単層細胞の上に接種
し、そして１時間吸着させた。続いてトレイの穴を一度
洗い、EMEMアガロースを重層した。３ないし６日後、ニ
ユートラルレッドを含むアガロース層を重層し、プラー
クの数を測定した。ネガティブ対照には、NS1上澄液と
モノクローナル培養液（HAT）で培養したウイルスとを
混合したウイルス、および前培養したマウス血清と混合
したウイルスが含まれた。
結果。以前の研究が示すところによれば、固相RIAによ
りモノクローンを篩分けたため、６番目の遺伝子による
42Kdの産物であるロータウイルスの主要な内部構造タン
パクを規定するハイブリドーマの優先的選択が可能とな
った。それ故、HIアッセイがRRVの表面タンパクに結合
するモノクローナル抗体を単離するための第１の篩分け
手法として選ばれた。最初に1000穴の中からHIにより篩
分けられ、HI活性のある39種の異なったモノクローナル
抗体が最終的にクローニングされ、そしてさらに解析を
するために増殖させて量を増やした。
りモノクローンを篩分けたため、６番目の遺伝子による
42Kdの産物であるロータウイルスの主要な内部構造タン
パクを規定するハイブリドーマの優先的選択が可能とな
った。それ故、HIアッセイがRRVの表面タンパクに結合
するモノクローナル抗体を単離するための第１の篩分け
手法として選ばれた。最初に1000穴の中からHIにより篩
分けられ、HI活性のある39種の異なったモノクローナル
抗体が最終的にクローニングされ、そしてさらに解析を
するために増殖させて量を増やした。
HI活性のある39種のモノクローナル抗体のうち36種がRR
V細胞溶解質からの82Kdタンパクを沈降させた。さら
に、これらのモノクローナル抗体は沈降反応において、
70ないし75Kd範囲に相当する１ないし３本のあまり強く
ない沈降線を示した。82Kdタンパクを沈降させるこれら
のモノクローナル抗体の力価を血球を凝集させる様々な
ロータウイルスに対するHIによって測定した。どれもHI
アッセイにおいて、同じように高い特異性を示した。サ
ルSALLロータウイルスとブタOSUロータウイルスとの低
いレベルの交差反応がいくつかの例で観察された。82Kd
のタンパクを免疫沈降させるモノクローナル抗体も、RR
Vに対する標準プラーク半減中和アッセイにより検定し
た。中和活性は、1:20の希釈で試験したこれらのモノク
ローナル培養細胞の上澄液では検出されなかった。ハイ
ブリドーマ細胞培養の上澄液には中和活性は検出されな
かったため、82Kdタンパクに対するモノクローナル抗体
を産生するハイブリドーマ細胞を接種したマウスから採
取した腹水液がプラーク半減中和法により試験された。
RRVに対する腹水液のHI力価は培養液上澄の力価より102
から103.5倍高かった。プラーク半減中和アッセイで試
験したとき、中程度から高度のレベルの中和活性が腹水
液で検出された。それぞれのマウスの前培養した血清の
RRVに対する中和抗体の力価は1:500よりも低かった。異
種のウイルスに対する限定した中和試験において、中和
活性はRRV株を免疫に用いた場合、高い特異性が見られ
た。これらのモノクローナル抗体の中和活性は、感染力
を高める濃度でRRVをトリプシン処理することでは影響
をうけなかった。抗血球抗体を産生するハイブリドーマ
を使ったプラーク半減アッセイの特異的な特徴は、ウイ
ルスの一部の分画（10ないし20％）が試験に用いられた
腹水液のいかなる濃度でも中和されなかったということ
であった。
V細胞溶解質からの82Kdタンパクを沈降させた。さら
に、これらのモノクローナル抗体は沈降反応において、
70ないし75Kd範囲に相当する１ないし３本のあまり強く
ない沈降線を示した。82Kdタンパクを沈降させるこれら
のモノクローナル抗体の力価を血球を凝集させる様々な
ロータウイルスに対するHIによって測定した。どれもHI
アッセイにおいて、同じように高い特異性を示した。サ
ルSALLロータウイルスとブタOSUロータウイルスとの低
いレベルの交差反応がいくつかの例で観察された。82Kd
のタンパクを免疫沈降させるモノクローナル抗体も、RR
Vに対する標準プラーク半減中和アッセイにより検定し
た。中和活性は、1:20の希釈で試験したこれらのモノク
ローナル培養細胞の上澄液では検出されなかった。ハイ
ブリドーマ細胞培養の上澄液には中和活性は検出されな
かったため、82Kdタンパクに対するモノクローナル抗体
を産生するハイブリドーマ細胞を接種したマウスから採
取した腹水液がプラーク半減中和法により試験された。
RRVに対する腹水液のHI力価は培養液上澄の力価より102
から103.5倍高かった。プラーク半減中和アッセイで試
験したとき、中程度から高度のレベルの中和活性が腹水
液で検出された。それぞれのマウスの前培養した血清の
RRVに対する中和抗体の力価は1:500よりも低かった。異
種のウイルスに対する限定した中和試験において、中和
活性はRRV株を免疫に用いた場合、高い特異性が見られ
た。これらのモノクローナル抗体の中和活性は、感染力
を高める濃度でRRVをトリプシン処理することでは影響
をうけなかった。抗血球抗体を産生するハイブリドーマ
を使ったプラーク半減アッセイの特異的な特徴は、ウイ
ルスの一部の分画（10ないし20％）が試験に用いられた
腹水液のいかなる濃度でも中和されなかったということ
であった。
RRVの４番目の遺伝子は、82Kdタンパクの遺伝情報を指
定する遺伝子であると同定された。それは固相RIAにお
いて、82Kdタンパクを沈降させる選別されたモノクロー
ナル抗体と、様々なRRVとUKウシロータウイルスとの組
換体とを反応させることにより同定された。これらのモ
ノクローナル抗体は固相RIAにおいてRRVと特異的に反応
したが、UKウシウイルスとは結合し得なかったので、組
換体とそれらの結合が82Kdタンパクの由来となる遺伝子
を決定するために用いられ得た。組換体の遺伝型も表現
型も双方とも過去に研究されていた。UKウシロータウイ
ルス親株は赤血球を凝集させないが、RRVは凝集させ
る。RRV親株由来の４番目の遺伝子をもつ組換体は赤血
球を凝集させたが、４番目の遺伝子がUKウシロータウイ
ルス由来の組換体は赤血球凝集反応を示さなかった。82
Kdタンパクを沈降させたモノクローナル抗体は、RIAに
おいて赤血球凝集タンパクを含んだ組換体すなわち４番
目の遺伝子がアカゲザルロータウイルスから由来する組
換体のみと反応した。他のすべてのロータウイルスの遺
伝子は、これらのモノクローナル抗体と反応したタンパ
クの遺伝情報を指定しているものではあり得なかった。
定する遺伝子であると同定された。それは固相RIAにお
いて、82Kdタンパクを沈降させる選別されたモノクロー
ナル抗体と、様々なRRVとUKウシロータウイルスとの組
換体とを反応させることにより同定された。これらのモ
ノクローナル抗体は固相RIAにおいてRRVと特異的に反応
したが、UKウシウイルスとは結合し得なかったので、組
換体とそれらの結合が82Kdタンパクの由来となる遺伝子
を決定するために用いられ得た。組換体の遺伝型も表現
型も双方とも過去に研究されていた。UKウシロータウイ
ルス親株は赤血球を凝集させないが、RRVは凝集させ
る。RRV親株由来の４番目の遺伝子をもつ組換体は赤血
球を凝集させたが、４番目の遺伝子がUKウシロータウイ
ルス由来の組換体は赤血球凝集反応を示さなかった。82
Kdタンパクを沈降させたモノクローナル抗体は、RIAに
おいて赤血球凝集タンパクを含んだ組換体すなわち４番
目の遺伝子がアカゲザルロータウイルスから由来する組
換体のみと反応した。他のすべてのロータウイルスの遺
伝子は、これらのモノクローナル抗体と反応したタンパ
クの遺伝情報を指定しているものではあり得なかった。
39種のモノクローナル抗体のうち３種にHI活性があった
が、82Kdのタンパクは沈降させなかった。これら３種の
モノクローナル抗体は免疫沈降反応を生じ、RRVの主要
な内部構造タンパクである42Kdの少し前に移動した38Kd
のバンドを示した。トウニカマイシン処理の細胞溶解質
を使った実験により、このバンドには糖鎖が結合してる
ことが示され、また糖鎖が結合していない前駆体タンパ
クはトウニカマイシン処理の溶解質の中でモノクローナ
ル抗体によって沈降反応を起こすことが示された。これ
ら３種のモノクローナル抗体から得られる細胞培養上澄
液の赤血球凝集反応は、RRV、イヌロータウイルスおよ
び程度は低いもののSA−11によって阻害された。82Kdタ
ンパクを標的としたハイブリドーマとは異なって、これ
ら３種のハイブリドーマからのモノクローナル細胞培養
上澄液はRRV（力価,1:160または1:320）に対して中和活
性を示した。３種のモノクローナル抗体由来のマウス腹
水液は対応のアカゲザルロータウイルスに対して高力価
の中和活性を示した。82Kdタンパクに対するモノクロー
ナル抗体とは異なって、これらのモノクローナル抗体は
同様に血清学的に相関のあるイヌロータウイルスおよび
SA−11ロータウイルスを効果的に中和した。同様に血清
学的にRRVと相関のあるヒトロータウイルスのＰ株も３
種のモノクローナル抗体のうちの２種によって中和され
た。血清学的に異なっているウシUK株およびヒトWA株は
中和されなかった。1:2000以下の希釈度で38Kd糖タンパ
クに対するこれら３種のモノクローンはRRVを完全に中
和した（100％プラーク半減）。
が、82Kdのタンパクは沈降させなかった。これら３種の
モノクローナル抗体は免疫沈降反応を生じ、RRVの主要
な内部構造タンパクである42Kdの少し前に移動した38Kd
のバンドを示した。トウニカマイシン処理の細胞溶解質
を使った実験により、このバンドには糖鎖が結合してる
ことが示され、また糖鎖が結合していない前駆体タンパ
クはトウニカマイシン処理の溶解質の中でモノクローナ
ル抗体によって沈降反応を起こすことが示された。これ
ら３種のモノクローナル抗体から得られる細胞培養上澄
液の赤血球凝集反応は、RRV、イヌロータウイルスおよ
び程度は低いもののSA−11によって阻害された。82Kdタ
ンパクを標的としたハイブリドーマとは異なって、これ
ら３種のハイブリドーマからのモノクローナル細胞培養
上澄液はRRV（力価,1:160または1:320）に対して中和活
性を示した。３種のモノクローナル抗体由来のマウス腹
水液は対応のアカゲザルロータウイルスに対して高力価
の中和活性を示した。82Kdタンパクに対するモノクロー
ナル抗体とは異なって、これらのモノクローナル抗体は
同様に血清学的に相関のあるイヌロータウイルスおよび
SA−11ロータウイルスを効果的に中和した。同様に血清
学的にRRVと相関のあるヒトロータウイルスのＰ株も３
種のモノクローナル抗体のうちの２種によって中和され
た。血清学的に異なっているウシUK株およびヒトWA株は
中和されなかった。1:2000以下の希釈度で38Kd糖タンパ
クに対するこれら３種のモノクローンはRRVを完全に中
和した（100％プラーク半減）。
38Kd糖タンパクを免疫沈降させるモノクローナル抗体
は、固相RIAにおいてRRVと特異的に反応しUKロータウイ
ルスとは反応しないので、82Kdタンパクを免疫沈降させ
るモノクローナル抗体に対して用いたように同じような
技術を用いることができた。過去の研究において示され
たことは、血清型は一次的に８番目または９番目の遺伝
子に対応するRNA断片の情報が発現したものであるが、
ウイルスの赤血球凝集素の遺伝情報は４番目の遺伝子に
対応するRNA断片によって指定されているということで
あった。固相RIAで試験したとき、RRVとUKウシロータウ
イルスの組換体が赤血球凝集反応を起こさせたか起こさ
せなかったかにかかわらず、38Kd糖タンパクに対するモ
ノクローナル抗体は、血清型としてアカゲザルロータウ
イルスであるその組換体にのみ結合した。組換体の遺伝
子型が固相放射免疫アッセイにおいてモノクローナル結
合と相関していたので、モノクローナル抗体の結合は、
組換体においてアカゲザルロータウイルスに由来する８
番目または９番目の遺伝子が存在することと関係がある
ことが明らかとなった。これら２つの遺伝子は組換体の
中で分化することはあり得なかった。これらのデータは
38Kd糖タンパクがこれら２つの遺伝子断片の１つからの
産物であることを示していた。
は、固相RIAにおいてRRVと特異的に反応しUKロータウイ
ルスとは反応しないので、82Kdタンパクを免疫沈降させ
るモノクローナル抗体に対して用いたように同じような
技術を用いることができた。過去の研究において示され
たことは、血清型は一次的に８番目または９番目の遺伝
子に対応するRNA断片の情報が発現したものであるが、
ウイルスの赤血球凝集素の遺伝情報は４番目の遺伝子に
対応するRNA断片によって指定されているということで
あった。固相RIAで試験したとき、RRVとUKウシロータウ
イルスの組換体が赤血球凝集反応を起こさせたか起こさ
せなかったかにかかわらず、38Kd糖タンパクに対するモ
ノクローナル抗体は、血清型としてアカゲザルロータウ
イルスであるその組換体にのみ結合した。組換体の遺伝
子型が固相放射免疫アッセイにおいてモノクローナル結
合と相関していたので、モノクローナル抗体の結合は、
組換体においてアカゲザルロータウイルスに由来する８
番目または９番目の遺伝子が存在することと関係がある
ことが明らかとなった。これら２つの遺伝子は組換体の
中で分化することはあり得なかった。これらのデータは
38Kd糖タンパクがこれら２つの遺伝子断片の１つからの
産物であることを示していた。
38Kd糖タンパクを標的とするモノクローナル抗体にはHI
活性はあるが、35Sでラベルした細胞溶解質でまたは固
相RIAでウイルスの赤血球凝集素と結合しなかったよう
なので、モノクローナル抗体を使って、選択された組換
体による赤血球凝集反応をその抗体がどのくらい阻害す
る力があるかを調べる試験を行なった。38Kdタンパクを
沈降させ、８番目または９番目のRRVの遺伝子産物に結
合したモノクローナル抗体954/159/33および952/3/68
は、組換体がアカゲザルロータウイルス中和血清型を示
したときのみHI活性を発揮した。
活性はあるが、35Sでラベルした細胞溶解質でまたは固
相RIAでウイルスの赤血球凝集素と結合しなかったよう
なので、モノクローナル抗体を使って、選択された組換
体による赤血球凝集反応をその抗体がどのくらい阻害す
る力があるかを調べる試験を行なった。38Kdタンパクを
沈降させ、８番目または９番目のRRVの遺伝子産物に結
合したモノクローナル抗体954/159/33および952/3/68
は、組換体がアカゲザルロータウイルス中和血清型を示
したときのみHI活性を発揮した。
実施例２ 超免疫デンジクネズミ抗血清。ウシロータウイルスおよ
びヒトロータウイルス（１型および２型）に対して調製
された抗血清は、プラーク半減法によって検定されたと
き非常に特異的であった。ウシウイルス血清の対応の力
価は、１型の組織培養に適応したWAヒトロータウイルス
に対するその力価よりも少なくとも1000倍高かった。こ
れが意味することは、この抗血清が同一の懸濁液に存在
するかもしれない１型ヒトロータウイルス特異性のある
ウイルスに影響を与えずにウシ抗原特異性のあるウイル
スを選択的に中和するために用いられ得ることであっ
た。１型および２型ヒトロータウイルス抗血清も強力か
つ特異的であった。注目すべきことに、強力な抗ウシ
（NCDV）抗血清のみが、82−88Kd表面タンパクとではな
く34−38Kdタンパクと相互作用することによってウシロ
ータウイルス（UK）を中和する。実際、２種のウイルス
の82−88Kdタンパクは、中和によって検定されると、抗
原としては異なっている。
びヒトロータウイルス（１型および２型）に対して調製
された抗血清は、プラーク半減法によって検定されたと
き非常に特異的であった。ウシウイルス血清の対応の力
価は、１型の組織培養に適応したWAヒトロータウイルス
に対するその力価よりも少なくとも1000倍高かった。こ
れが意味することは、この抗血清が同一の懸濁液に存在
するかもしれない１型ヒトロータウイルス特異性のある
ウイルスに影響を与えずにウシ抗原特異性のあるウイル
スを選択的に中和するために用いられ得ることであっ
た。１型および２型ヒトロータウイルス抗血清も強力か
つ特異的であった。注目すべきことに、強力な抗ウシ
（NCDV）抗血清のみが、82−88Kd表面タンパクとではな
く34−38Kdタンパクと相互作用することによってウシロ
ータウイルス（UK）を中和する。実際、２種のウイルス
の82−88Kdタンパクは、中和によって検定されると、抗
原としては異なっている。
この明細書および請求の範囲において、培養不可能なヒ
トロータウイルスの定義にはほとんど培養不可能なヒト
ロータウイルスも含まれる。
トロータウイルスの定義にはほとんど培養不可能なヒト
ロータウイルスも含まれる。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｒ 1:91） (72)発明者 カピキアン，アルバート・ザアベン アメリカ合衆国 メリーランド 20852 ロツクビレ，マークリツフ・ロード 11201 (72)発明者 カリカ，アンソニー・アール アメリカ合衆国 メリーランド州 20852 ロツクビレ，ハーリントン・ロード 732 (72)発明者 ミドサン，カレン アメリカ合衆国 メリーランド州 21782 シヤープスバーグ，ボツクス 93 エ ー・ルート １ (72)発明者 チヤノツク，ロバート・メリツト アメリカ合衆国 メリーランド州 20817 ベセスダ，ロングウツド・ドライブ 7001
Claims (1)
- 【請求項１】培養不可能なヒトロータウイルス親株を培
養可能な動物ロータウイルス親株と共に同時感染させる
ことによりヒトロータウイルス／動物ロータウイルス組
換体の親株を得、次いで、動物ロータウイルスの38kd糖
タンパクに特異的に結合するモノクローナル抗体もしく
は超免疫テンジクネズミ抗血清で動物ロータウイルス親
株を中和することを具備するロータウイルス組換体の調
製方法。
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US06/508,323 US4571385A (en) | 1983-06-27 | 1983-06-27 | Genetic reassortment of rotaviruses for production of vaccines and vaccine precursors |
| US508323 | 1983-06-27 | ||
| PCT/US1984/000994 WO1985000184A1 (en) | 1983-06-27 | 1984-06-27 | Genetic reassortment of rotaviruses for production of vaccines and vaccine precursors |
Related Child Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP5302103A Division JPH07112432B2 (ja) | 1983-06-27 | 1993-12-01 | ロータウイルス組換体およびその調製方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS60501639A JPS60501639A (ja) | 1985-10-03 |
| JPH0757191B2 true JPH0757191B2 (ja) | 1995-06-21 |
Family
ID=24022290
Family Applications (2)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP59502691A Expired - Lifetime JPH0757191B2 (ja) | 1983-06-27 | 1984-06-27 | ロータウイルス組換体の調製方法 |
| JP5302103A Expired - Lifetime JPH07112432B2 (ja) | 1983-06-27 | 1993-12-01 | ロータウイルス組換体およびその調製方法 |
Family Applications After (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP5302103A Expired - Lifetime JPH07112432B2 (ja) | 1983-06-27 | 1993-12-01 | ロータウイルス組換体およびその調製方法 |
Country Status (11)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US4571385A (ja) |
| EP (1) | EP0130906B1 (ja) |
| JP (2) | JPH0757191B2 (ja) |
| AT (1) | ATE65698T1 (ja) |
| AU (1) | AU584582B2 (ja) |
| CA (1) | CA1217422A (ja) |
| DE (2) | DE19975069I1 (ja) |
| FR (1) | FR99C0041I2 (ja) |
| LU (1) | LU90472I2 (ja) |
| NL (1) | NL990038I2 (ja) |
| WO (1) | WO1985000184A1 (ja) |
Families Citing this family (19)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CA1339735C (en) * | 1984-04-27 | 1998-03-17 | The University Of Melbourne | Cloning and sequencing of the major outer capsid gylcoprotein gene of a human rotavirus |
| US5374426A (en) * | 1986-09-03 | 1994-12-20 | University Of Saskatchewan | Rotavirus nucleocapsid protein VP6 in vaccine compositions |
| US4927628A (en) * | 1987-09-21 | 1990-05-22 | The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services | Vaccine against rotavirus diseases and method of preparing same |
| AU618973B2 (en) * | 1987-11-30 | 1992-01-16 | Children's Hospital Foundation, The | Novel rotavirus reassortant vaccine |
| US5626851A (en) * | 1987-11-30 | 1997-05-06 | The Wistar Institute Of Anatomy And Biology | Rotavirus reassortant vaccine |
| WO1989006971A1 (en) * | 1988-02-01 | 1989-08-10 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junio | Conserved rotavirus gene segments and use in immunization and neutralization |
| US5215745A (en) * | 1988-04-27 | 1993-06-01 | United Cancer Research Institute | Method for treating viral diseases with attenuated virus |
| ES2122973T3 (es) * | 1990-07-26 | 1999-01-01 | Wistar Inst | Vacuna de recombinante de rotavirus. |
| ES2121841T3 (es) * | 1990-11-16 | 1998-12-16 | Childrens Hosp Medical Center | Una vacuna para proporcionar proteccion inmunologica contra enfermedades de rotavirus en humanos. |
| US5610049A (en) * | 1991-05-01 | 1997-03-11 | The Wistar Institute Of Anatomy And Biology | Human rotavirus HCR3A and method of growing said rotavirus |
| PT696326E (pt) * | 1993-04-30 | 2003-08-29 | Wellstat Biologics Corp | Utilizacao de ndv no fabrico de um medicamento para tratamento do cancro |
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| US5646033A (en) * | 1994-11-30 | 1997-07-08 | Dyncorp | African green monkey kidney cell lines useful for maintaining viruses and for preparation of viral vaccines |
| DE69929443T2 (de) | 1998-07-28 | 2006-07-27 | The Government Of The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services | Multivalenter human-boviner rotavirus-impfstoff |
| IL141142A0 (en) * | 1998-07-30 | 2002-02-10 | Wisconsin Alumni Res Found | Gastrointestinal bacterial antibody factories |
| GB9919468D0 (en) * | 1999-08-17 | 1999-10-20 | Smithkline Beecham Biolog | Vaccine |
| SK287261B6 (sk) * | 1999-08-17 | 2010-04-07 | Smithkline Beecham Biologicals S.A. | Oslabená ľudská rotavírusová populácia, spôsob jej výroby, vakcínový prostriedok s jej obsahom a jej použitie |
| CA2398428C (en) | 2000-01-28 | 2015-09-08 | Albert Kapikian | Compositions and method for preventing reactogenicity associated with administration of immunogenic live rotavirus compositions |
| KR102374547B1 (ko) | 2021-05-31 | 2022-03-14 | 에스케이바이오사이언스(주) | 재배열 로타바이러스의 제조 방법 |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
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| US3992522A (en) * | 1973-01-24 | 1976-11-16 | The United States Of America As Represented By The Department Of Health, Education And Welfare | Temperature-sensitive recombinant mutant viruses and a process for producing same |
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| US4341763A (en) * | 1981-03-10 | 1982-07-27 | Smithkline-Rit | Methods of vaccinating humans against rotavirus infection |
-
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- 1983-06-27 US US06/508,323 patent/US4571385A/en not_active Expired - Lifetime
-
1984
- 1984-06-19 CA CA000456934A patent/CA1217422A/en not_active Expired
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- 1984-06-27 AU AU31505/84A patent/AU584582B2/en not_active Expired
- 1984-06-27 WO PCT/US1984/000994 patent/WO1985000184A1/en not_active Ceased
-
1993
- 1993-12-01 JP JP5302103A patent/JPH07112432B2/ja not_active Expired - Lifetime
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- 1999-11-03 LU LU90472C patent/LU90472I2/fr unknown
- 1999-11-05 FR FR99C0041C patent/FR99C0041I2/fr active Active
- 1999-11-05 NL NL990038C patent/NL990038I2/nl unknown
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| EP0130906B1 (en) | 1991-07-31 |
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