JPH0761277B2 - ▲醗▼酵法による（−）トランス−２，３−エポキシコハク酸の製造法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ 本発明は、光学活性な化合物の合成原料として有用なこ
とが知られている（−）トランス−2,3−エポキシコハ
ク酸（以下“本酸”と略称することもある）の醗酵によ
る製造法で有用なものである。

［従来の技術］ （−）トランス−2,3−エポキシコハク酸は光学的に活
性であり、アンモニア水中で加熱されると容易にβ−ハ
イドロキシ−Ｌ−アスパラギン酸となる［ジャーナル
オブ メジシナル ケミストリー（Journal of Medicin
al Chemistry），6,233（1963）］。このアミノ酸はそ
れ自体で抗菌活性を有すると同時に、光学特異性を有す
るシングルβ−ラクタム抗生物質の有効な原料となる
［特開昭59-106444,ケミカル アンド ファーマスーテ
ィカル ブレチン（Chemical and Pharmaceutical Bull
etin），33,3798（1985）］。

この様に（−）トランス−2,3−エポキシコハク酸は光
学特異性を有するシングルβ−ラクタム抗生物質の良い
出発物質になると同時に、所謂キラル シントン（Chir
al synton）としての一般的利用性のある有用な化合物
であり、この化合物の経済的に有利な製造法を確立する
ことは有意義である。

（−）トランス−2,3−エポキシコハク酸はこれまで多
くの糸状菌によって、その液体培養液中に生成蓄積され
ることが知られている［日本農芸化学会誌，13,241（19
37）；14,362（1938）；14,1517（1938）；16,1015（19
40），バイオケミカルジャーナル（Biochemical Journa
l），39,70（1945）：ジャーナル オブ バクテリオロ
ジー（Journal of Bacteriology），70,405（1955）；
米国特許2674561（1954）；ジャーナル オブ メジシ
ナル ケミストリー（Journal of Medicinal Chemistr
y）6,233（1963）；アプライド アンド エンバイロン
メンタル マイクロバイオロジー（Applied and Enviro
nmental Microbiology），35,1213（1978）］。

しかしこれまでの液体培養のいずれの場合でも生成する
本酸の中和剤としては培養中に炭酸カルシウムが添加さ
れている。中和剤として炭酸カルシウムを用いると、本
酸は培養液中で、水に難溶性のカルシウム塩となって沈
澱する。このような固形分の多い培地中で糸状菌が成育
すると培養液の粘性が極度に増大し、本醗酵に必要な酸
素を培養液中に供給するためには培養時に過大な動力を
必要とする。また、この場合、本酸を採取しょうとする
と、培地中に含まれる糸状菌の菌体やその他の固形物と
の分離が困難である。そこで一般には本酸のカルシウム
塩を一旦鉱酸で溶かして、菌体や固形物と分離し、その
後溶媒で抽出するとか、カルシウム塩やバリウム塩とし
て再沈澱させるとかの方法が採られている。しかし、本
酸は溶媒（エーテル，酢酸エチル等）より水に対する分
配係数が大きく、溶媒抽出による精製は経済的に不利で
ある。また再沈澱法も操作が繁雑である。

［発明が解決しようとする問題点］ 本酸を醗酵法により液体培地中で工業的に多量生産する
には、本酸高生産能の糸状菌を採用し、培養方法がより
簡略化できるようにし、かつ生産された本酸の培養液か
らの単離を容易にして収量を増大させることが望まれる
が、未だその技術は確立されていなかった。

［問題点を解決するための手段］ 本発明者らは本酸の醗酵生産について鋭意研究の結果、
培養中培養液のpHが5.0〜7.5になるようにアンモニア，
水酸化ナトリウムまたは水酸化カリウムを添加しながら
培養すると、予想外にも炭酸カルシウムを添加する場合
より遥かに多量の本酸が蓄積することを見い出した。更
に培養後得られる培養液中に本酸は溶解しているので、
糸状菌の菌体やその他の固形物との分離は濾過などで簡
単におこなうことができ、その上濾過後に得られる培養
濾液を濃縮後または濃縮することなくpHを2.0〜3.5付近
に調整すると本酸の溶解度が極端に低下し、本酸のモノ
アンモニウム塩，モノナトリウム塩またはモノカリウム
塩が容易に晶出することを見い出し、これらに基づいて
本発明を完成するに至った。即ち、本発明は、 （１）（−）トランス−2,3−エポキシコハク酸生産能
を有する糸状菌を液体培地に培養し、培養中培養液のpH
が5.0〜7.5になるようにアンモニア，水酸化ナトリウム
または水酸化カリウムを添加しながら培養することを特
徴とする（−）トランス−2,3−エポキシコハク酸の製
造法、 （２）培養後培養濾液をpH2.0〜3.5に調整し（−）トラ
ンス−2,3−エポキシコハク酸をモノアンモニウム塩、
モノナトリウム塩またはモノカリウム塩として析出させ
採取することを特徴とする第（１）項記載の製造法、 に関するものである。

本発明に使用する菌株は本酸を生産する糸状菌であれば
いずれもこれを使用することが出来るが、本酸の生産能
が1000μg/ml以上の糸状菌を用いると本発明の効果がよ
り顕著に見られる。この場合の本酸の生産能は、本酸生
産能を有する糸状菌の醗酵培養に通常用いられる液体培
地、具体的にはグルコース7.0％（以下％は重量／容量
％を示す），KH₂PO₄ 0.1％，Na₂HPO₄ 0.2％，NH₄Cl 0.1
％，MgSO₄・7H₂O 0.012％，ZnSO₄・7H₂O 0.0005％，FeSO₄
・7H₂O0.001％，ぺプトン 0.5％，CaCO₃ 0.5％およびメ
タノール２％よりなる液体培地で30℃,6日間振盪培養し
て得られる本酸の生産量で評価するものとする。本酸の
生産能が1000μg/ml以上の糸状菌の具体例としては例え
ば、アスペルギルス・アワモリ“Aspergillus awamori"
（IFO 4122），アスペルギルス クラバタス“Aspergil
lus clavatus"（IFO 4362），アスペルギルス フミゲ
ータス“Aspergillus fumigatus"（IFO 7079），ビソク
ラミス・ニベア“Byssochlamys nivea"（IFO 8815），
ネオサトーヤ フィッシェリー“Neosartorya fischer
i"（IFO 8790），ペシロマイセス カーネウス“Paecil
omyces carneus“（IFO 8292），ペシロマイセス エレ
ガンス“Paecilomyces elegans"（IFO 6987），ペシロ
マイセス フモソロゼウス“Paecilomyces fumoso−ros
eus"（IFO 7072），ペシロマイセス ジャバニカス“Pa
ecilomyces javanicus"（IFO 8297），ペシロマイセス
ファリノサス“Paecilomyces farinosus"（IFO 858
1），タラロマイセス ウォルタマニー“Talaromyces w
ortamannii"（IFO 7574）等が用いることが出来る。こ
れらの菌は総て財団法人 発酵研究所発行の「リスト
オブ カルチャーズ（LIST OF CULTURES）」第17版（19
84年）に収載されており、入手可能なものばかりであ
る。本発明は、この様な（−）トランス−2,3−エポキ
シコハク酸生産能を有する糸状菌を液体培地に培養し、
培養中培養液のpHが5.0〜7.5になるようにアンモニア，
水酸化ナトリウムまたは水酸化カリウムを添加しながら
培養することにより実施することができる。

本発明方法の培養においては、通常微生物の培養に用い
られる炭素源，窒素源，無機塩類等を含有した液体培地
が用いられる。炭素源としては例えば澱粉，デキストリ
ン，マルトース，シュークロース，グルコース，フラク
トース等の炭水化物を単独または組合せて用いることが
出来る。濃度は３〜30％好ましくは10〜20％で用いるの
がよい。窒素源としては例えばペプトン，コーン・グル
テン・ミール，コーン・スチープ・リカー，脱脂大豆
粉，尿素，硫安，塩安，硝安等の有機物および無機物が
単独もしくは組合せて適宜必要に応じて用いられる。ま
たカリウム，ナトリウム，マグネシウム，カルシウム，
亜鉛，鉄，マンガン，コバルト，銅，燐酸等の塩類が無
機塩類として適宜使用される。これら窒素源，無機塩類
の添加濃度は、本発明の目的が達成される限り特に限定
されるものではなく、通常の醗酵法で用いられる添加濃
度範囲より適宜選択される。

培養は通常振盪または通気攪拌等の好気的条件下に行う
のがよく、培養温度は通常20〜40℃が好んで用いられ
る。培養中のpHは通常5.0〜7.5、好ましくは6.0〜7.0に
維持するのがよい。この際pHの調整はアンモニア，水酸
化ナトリウムまたは水酸化カリウム好ましくはそれらの
水溶液（５〜40重量／容量％，好ましくは30〜40重量／
容量％の水溶液）を添加して行うのが本酸の生成に良い
結果を与える。添加する方法は培養中のpHを上記の範囲
に保つことができれば、如何なる手段であつてもよく、
少量ずつ間断なく添加してもよく、あるいは間欠的に徐
々に添加する等できる。一般に糸状菌を液体培地中で好
気的に培養すると菌糸はペレット状またはパルプ状の塊
になって成育するが、時として菌糸塊が大きくなりす
ぎ、通気攪拌効果を妨げ、それに応じて物質生産に悪影
響を及ぼす。アンモニアまたはその水溶液で中和醗酵を
行う場合には窒素源としてのアンモニウムイオンの過多
から来る菌糸の異常伸張が起こり易く、これを回避する
為に燐酸制限下に培養することが望ましい。また水酸化
ナトリウム，水酸化カリウムまたはそれらの水溶液で中
和醗酵する場合には燐酸制限下でもよいが窒素源特にア
ンモニウム塩の制限条件下に培養すると良い醗酵結果が
得られる。

以上の様な条件下で通常２日から６日間好ましくは４日
から６日間培養すると、（−）トランス−2,3−エポキ
シコハク酸が60mg/75mg/ml生成蓄積する。この様な高濃
度の本酸を含む培養液は炭酸カルシウムを中和剤として
用いた培養では、得られた例が知られていない。

培養液中に生成蓄積した本酸を採取するに当っては、勿
論公知の溶媒抽出法、水酸化カルシウムや水酸化バリウ
ムを用いる沈澱法でも分離精製出来るが経済的に有利な
方法ではない。

そこで予備実験として、本酸の約83％水溶液（pH＜１）
を室温（約25℃）下、アンモニア，水酸化ナトリウムま
たは水酸化カリウム（あるいはそれらの水溶液）で徐々
に中和して行くと、アンモニア中和の場合にはpH2.0〜
2.5付近で、水酸化ナトリウム中和の場合にはpH2.5〜3.
0付近で、水酸化カリウム中和の場合にはpH2.0〜3.5付
近でそれぞれ溶解度が最小となった。それぞれ最小の溶
解度を示すpHで生じた結晶を濾取し、元素分析で調べて
みると、それぞれ（−）トランス−2,3−エポキシコハ
ク酸のモノアンモニウム塩，モノナトリウム塩またはモ
ノカリウム塩であることが分かった。この知見をそれぞ
れの中和培養液に適用して濾過,pH調整（必要ならば濃
縮）と晶出からなる簡単な本酸の精製分離法を開発し
た。たとえば、本発明の培養後に得られる培養液を常法
により濾過することにより糸状菌の菌体およびその他の
固形物を除去することができる。濾過は、一般的方法に
従って行えばよいが、たとえばハイフロスーパーセル
（ジョンズ−マンビル プロダクツ社製）などの濾過助
剤を用いて濾過するのが好ましい。必要ならば濾過の前
に硫酸，塩酸などの鉱酸で培養液のpHを4.0〜5.0に調整
して固形物との分離を容易にしてもよく、活性炭で脱色
処理等を行ってもよい。かくして得られる培養濾液は必
要ならば濃縮されてもよく、濃縮後に再濾過で不純物を
除かれてもよい。この培養濾液のpHを2.0〜3.5に調整す
れば目的の（−）トランス−2,3−エポキシコハク酸の
モノアンモニウム塩，モノナトリウム塩またはモノカリ
ウム塩を析出せしめることができる。pH調整には、たと
えば硫酸，塩酸などの鉱酸が用いられるが、特に硫酸が
好ましい。pHは、用いた中和剤に従って、上記に述べた
目的物の溶解度が最小になる様に調整されればよい。析
出した目的物は公知採取方法たとえば遠心分離，濾過な
どにより採取することができる。

本発明の方法によって得られる目的物が（−）トランス
−2,3−エポキシコハク酸であることは、例えば元素分
析，融点，旋光度，赤外線スペクトル等の物理科学的性
質の測定によって同定された。培養液中あるいは精製過
程に存在する本酸の定量は、スルホン化ポリスチレンゲ
ル充填カラム（島津製作所製,SCR−101Hカラム,7.9mm×
30cm）を用いる高速液体クロマトグラフィー法（移動
相:pH2.1の希過塩素酸水溶液，流量:1.0ml/min,検出:21
4nmの吸収）で行った。この条件下で本酸の保持時間は
約5.6分である。

また（−）トランス−2,3−エポキシコハク酸の検出は
薄層クロマトグラフィー法で行なった。セルロースプレ
ート（メルク社製）にサンプルをスポットし、ジエチル
エーテル：ギ酸：水（7:2:1）の溶媒で室温（約25℃）
３時間展開後、プレートを風乾し、ブロム・フェノール
・ブルーの0.05％エタノール溶液を噴霧すると、本酸は
Rf値0.74付近に青緑地に黄色のスポットを与えることに
より検出される。

［作用］ 本発明方法で得られる（−）トランス−2,3−エポキシ
コハク酸は、光学的に活性であるため、光学特異性を有
する化合物の有用な合成原料となり得、たとえばアンモ
ニア水中で加熱するとβ−ハイドロキシ−Ｌ−アスパラ
ギン酸となり、優れた抗菌活性を有するシングルβ−ラ
クタム抗生物質へ導かれる（特開昭59−106444）ことが
可能である。

［実施例］ 以下に実施例を挙げて本発明をさらに具体的に説明す
る。実施例中、％は重量／容量％を示す。

実施例１ アスペルギルス クラバタス“Aspergillus clavatus"I
FO 4362をグルコース10％，ペプトン1.0％，KNO₃ 0.2
％，（NH₄）H₂PO₄ 0.2％，MgSO₄・７H₂O 0.05％，CAC1₂
0.01％と寒天2.0％からなる斜面培地に、28℃で７日間
培養し胞子を形成させる。生じた胞子を滅菌水に懸濁
し、胞子懸濁液を得る。シュークロース 2.0％，脱脂大
豆粉1.0％，KH₂PO₄0.3％，Na₂HPO₄・12H₂O 0.6％，NH₄C
l 0.1％，MgSO₄・７H₂O 0.012％，ZnSO₄・７H₂O 0.0005
％，FeSO₄・7H₂O 0.001％，ペプトン 0.2％，CaCO₃ 0.5
％とアクトコール（消泡剤，武田薬品製） 0.05％から
なる培地100lを200l容醗酵槽に仕込み、120℃で20分間
滅菌する。この醗酵槽に、前記の滅菌水に懸濁した胞子
約10⁷個を接種し、通気 100l/min,攪拌160rpm,内圧1Kg/
cm²Ｇの条件下に28℃で29時間培養して種培養液を得
た。

グルコース（別滅菌） 15.0％，脱脂大豆粉 0.2％，MgS
O₄・7H₂O 0.012％，FeSO₄・7H₂O 0.001％，ZnSO₄・7H₂O 0.
0005％，アクトコール 0.05％からなる醗酵培地1000l分
を900lになる様2000l容の醗酵槽に仕込み、120℃,30分
間滅菌した。この醗酵槽に前記の種培養液100lを移植
し、26％アンモニア水で培養液のpHを6.5付近に調整し
ながら培養した。同時にKH₂PO₄を燐として10μg/ml/day
の速度で連続的に添加した。通気1000l/min,攪拌200〜2
50rpm,内圧1Kg/cm²Ｇの条件下で28℃,137時間培養する
と、醗酵液中に遊離酸として75.0mg/mlの（−）トラン
ス−2,3−エポキシコハク酸が生成蓄積した。

実施例２ グルコース（別滅菌） 16.0％，KH₂PO₄ 0.1％，Na₂HPO₄
・12H₂O 0.2％，NH₄Cl 0.3％，ペプトン 0.2％，MgSO₄・7
H₂O 0.012％，FeSO₄・7H₂O 0.001％，ZnSO₄・7H₂O 0.0005
％，アクトコール 0.05％からなる醗酵培地 1000l分を9
00lになる様に2000l容醗酵槽に仕込み、120℃で30分間
滅菌する。この醗酵槽に実施例１と同じ方法で調製した
アスペルギルス クラバタス IFO4362の種培養液100lを
移植し、40％の水酸化カリウム水溶液を用いて、培養液
のpHを6.5付近に自動的に調整しながら、通気1000l/mi
n,攪拌200〜250rpm,内圧1Kg/cm²Ｇの条件下、28℃,137
時間培養したところ、遊離酸として73.7mg/mlの（−）
トランス−2,3−エポキシコハク酸が培養液中に生成蓄
積した。

実施例３ 実施例２の40％水酸化カリウム水溶液の代りに、30％水
酸化ナトリウム水溶液を用いて、培養液中のpHを6.5付
近に調整する以外は、実施例２と同じ方法で、アスペル
ギルス クラバタスIFO4362を培養したところ、遊離酸
として76.1mg/mlの（−）トランス−2,3−エポキシコハ
ク酸を含む醗酵液を得た。

実施例４ 実施例１で得られた醗酵液1020l（75.0mg/ml）に10％硫
酸約12lを攪拌しながら徐々に加えて、pHを4.5に調整し
た。これを90℃で15分間熱処理したのち、15℃前後に冷
却し一夜放置した。この熱処理液に10kgの活性炭（白鷺
A,武田薬品製）を加え、緩やかに２時間攪拌した。つい
で15kgの濾過助剤，トプコパーライト34（東興パーライ
ト工業社製）を加え、あらかじめ45kgのハイフロスーパ
ーセル（ジョンズ・マンビル プロダクツ社製）をプレ
コートしたオリバー・フィルターで濾過し、1310l（50.
8mg/ml）の１次濾液と濾過ケーキを得た。

この濾過ケーキに水約600lを加えてスラリーとし、先と
同じオリバー・フィルターで濾過して、740l（11.0mg/m
l）の２次濾液を得た。これを１次濾液と合せて、2050l
（36.4mg/ml）の混合濾液を得た。

実施例５ 実施例４で得られた混合濾液から1000lを取り、これを5
0℃で液膜濃縮機を用いて約120lまで濃縮した。得られ
た濃縮液に0.5kgの濾過助剤，ハイフロスーパーセルを
加え、あらかじめ0.5kgのハイフロスーパーセルでプレ
コートしたフィルタープレスで濾過し、清澄濾液120l
（302.6mg/ml）を得た。この清澄濾液に30％硫酸約30l
を徐々に加えてpHを2.3に調整し、生じた第１結晶をバ
スケット型遠心分離機で分離した。結晶を冷水約200lで
洗浄後、40℃で20時間真空乾燥して19.27kgの（−）ト
ランス−2,3−エポキシコハク酸のモノアンモニウム塩
を得た。得られた結晶の分析値は、 元素分析値 C₄H₇NO₅として 理論値:C,32.22;H,4.73;N,9.39 測定値:C,31.98;H,4.89;N,9.30 比旋光度：▲［α］²⁴ _D▼−88.9°（ｃ＝1.0,水） 融点:178〜179℃（分解） 次に母液と洗液を合せ50℃で65l迄濃縮し、室温（25
℃）迄冷却後、生じた第２結晶を分解した。結晶を約10
lの冷水で洗浄後、40℃,20時間真空乾燥して、14.44kg
の（−）トランス−2,3−エポキシコハク酸モノアンモ
ニウム塩を得た。得られた結晶の分析値は、 元素分析値 C₄H₇NO₅として 理論値:C,32.22;H,4.73;N,9.39 測定値:C,32.29;H,4.85;N,9.35 比旋光度：▲［α］²⁴ _D▼−90.8°（ｃ＝1.0,水） 融点:178〜179℃（分解） なお、第１結晶，第２結晶共高速液体クロマトグラフィ
ーの保持時間は遊離酸標準品と一致した。

実施例６ 実施例２で得られた水酸化ナトリウム中和醗酵液1030l
（73.7mg/ml）を実施例４と同じ方法で処理して、2100l
（35.0mg/ml）の混合濾液を得た。このうち1000lを50℃
で300l（116.6mg/ml）まで濃縮し、得られた濃縮液に0.
5kgのハイフロスーパーセルを加え、予め0.5kgのハイフ
ロスーパーセルでプレコートしたフィルタープレスで濾
過して清澄濾液約300l（115.3mg/ml）を得た。得られた
清澄濾液に37％塩酸を徐々に加えて、pHを3.0に調整
し、濃縮晶出釜で更に約100lまで濃縮した。生じた結晶
をバスケット型遠心分離機で集め、これを冷水約20lで
洗浄した。得られた湿結晶を40℃で30時間真空乾燥し
て、（−）トランス−2,3−エポキシコハク酸モノカリ
ウム塩の無色結晶34.1kgを得た。得られた結晶の分析値
は、 元素分析値 C₄H₃O₅Kとして 理論値:C,28.23;H,1.78;K,22.98 測定値:C,28.35;H,1.83;（K,22） Ｋは原子吸光法による測定値 比旋光度：▲［α］²⁴ _D▼−81.3°（ｃ＝1.0,水） 融点:209〜213℃（分解） 得られた結晶の高速液体クロマトグラフィーの保持時間
と薄層クロマトグラフィーのRf値は遊離酸標準品と一致
した。

実施例７ 実施例３で得た水酸化ナトリウム中和醗酵液1010l（76.
1mg/ml）を実施例４と同じ方法で処理して2020l（36.9m
g/ml）の混合濾液を得た。このうち1000lを50℃で約90l
（407.0mg/ml）迄濃縮した。得られた濃縮液に0.5kgの
ハイフロスーパーセルを加え、予め0.5kgのハイフロス
ーパーセルでプレコートしたフィルタープレスで濾過し
て90lの清澄液を得た。これに37％塩酸を徐々に加えてp
Hを2.5に調整した。更に濃縮晶出釜で約60l迄濃縮し、
５℃に一夜放置した。生じた結晶をバスケット型遠心分
離機で分離し、これを冷水約15lで洗浄し湿結晶を得
た。湿結晶を40℃で、30時間真空乾燥し、（−）トラン
ス−2,3−エポキシコハク酸モノカリウム塩の無色結晶2
3.6kgを得た。得られた結晶の分析値は、 元素分析値 C₄H₃O₅Naとして 理論値:C,31.19;H,1.96;Na,14.92 測定値:C,31.22;H,1.85;（Na,14） Naは原子吸光法による測定値 比旋光度：▲［α］²⁴ _D▼−88.2°（ｃ＝1.0,水） 融点:218〜223℃（分解） であり、高速液体クロマトグラフィーの保持時間と薄層
クロマトグラフィーのRf値は遊離酸標準品のそれと一致
した。

実施例８ アスペルギルス フミゲータス“Aspergillus fumigatu
s"（IFO 7079），ネオサトーヤ フィッシェリー“Neos
artorya fischeri"（IFO 8790），ペシロマイセス エ
レガンス“Paecilomyces elegans"（IFO 6987），ペシ
ロマイセス ファリノサス“Paecilomyces farinosus"
（IFO 8581）とタラロマイセス ウオルタマニー“Tala
romyces wortamannii"（IFO 7574）を実施例１と同じ条
件で斜面培地に培養し、胞子を形成させ、各々の胞子懸
濁液を得る。得られた胞子約10₆個を実施例１と同じ種
培地150mlを含む１容三角フラスコに接種し、30℃で3
0時間振盪培養して、各々の菌株の種培養液を得る。グ
ルコース（別滅菌）15.5％，ペプトン0.2％，MgSO₄・7H₂
O0.012％，ZnSO₄・7H₂O 0.0005％，FeSO₄・7H₂O 0.001
％，アクトコール0.05％からなる醗酵培地3l分を2.9lに
なるように5l容醗酵槽に仕込み120℃,30分間滅菌した。

この醗酵槽に前記の菌株の種培養液100mlを移植し、26
％アンモニア水で培養液のpHを6.5付近に調整しながら
培養した。同時にKH₂PO₄を燐として５μg/ml/dayの速度
で連続的に添加した。通気3l/min,攪拌800〜1,000rpmの
条件下に、30℃,140時間培養するとそれぞれ著量の
（−）トランス−2,3−エポキシコハク酸が培養液中に
生成蓄積した。

その結果を第１表にまとめた。

実施例９ ビソクラミス・ニベア“Byssochlamys nivea"（IFO 881
5）を実施例１と同じ条件で斜面培地に培養し、胞子を
形成させ、胞子懸濁液を得る。シュークロース 2.0％，
酵母エキス 0.5％，脱脂大豆粉 1.0％，KH₂PO₄ 0.3％，
Na₂HPO₄・12H₂O 0.6％，NH₄Cl 0.1％，MgSO₄・7H₂O 0.01
2％，ZnSO₄・7H₂O 0.0005％，FeSO₄・7H₂O 0.001％，ペプ
トン 0.2％，CaCO₃ 0.5％とアクトコール（消泡剤、武
田薬品製）0.05％からなる種培地150mlを含む１容三
角フラスコに、得られた胞子約10⁶を接種し、30℃で30
時間振盪培養して、種培養液を得る。グルコース（別滅
菌）15.5％、酵母エキス 0.5％，ぺプトン 0.2％，NH₄C
l 0.3％，MgSO₄・7H₂O 0.012％，ZnSO₄・7H₂O 0.0005％，
FeSO₄・7H₂O 0.001％，アクトコール 0.05％からなる醗
酵培地3l分を2.9lになるように5l容醗酵槽に仕込み、12
0℃,30分間滅菌した。

この醗酵槽に前記の種培養液100mlを移植し、30％に水
酸化ナトリウム水溶液で培養液のpHを6.5付近に調節し
ながら培養した。通気3l/min,攪拌800/1000rpmの条件下
に、30℃で、140時間培養したところ、遊離酸として65.
4mg/mlの（−）トランス−2,3−エポキシコハク酸が培
養液中に生成蓄積した。

［発明の効果］ 本発明によれば、醗酵法により（−）トランス−2,3−
エポキシコハク酸を一層効率よく製造することができる
ので、本酸の工業的多量生産を活発ならしめ、光学特異
性を有するシングルβ−ラクタム抗生物質の有効な原料
等になるβ−ハイドロキシ−Ｌ−アスパラギン酸の供給
等を一層容易ならしめる。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｒ 1:645） (Ｃ１２Ｐ 17/02 Ｃ１２Ｒ 1:79）

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】（−）トランス−2,3−エポキシコハク酸
   生産能を有する糸状菌を液体倍地に培養し、培養中培養
   液のpHが5.0〜7.5になるようにアンモニア，水酸化ナト
   リウムまたは水酸化カリウムを添加しながら培養するこ
   とを特徴とする（−）トランス−2,3−エポキシコハク
   酸の製造法。
2. 【請求項２】培養後培養濾液をpH2.0〜3.5に調整し
   （−）トランス−2,3−エポキシコハク酸をモノアンモ
   ニウム塩，モノナトリウム塩またはモノカリウム塩とし
   て析出させ採取することを特徴とする特許請求の範囲第
   （１）項記載の製造法。