JPH0764873B2

JPH0764873B2 - 抗生物質剤

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Publication number: JPH0764873B2
Application number: JP2172568A
Authority: JP
Inventors: イー．シユワルツロバート; エフ．ホワイトレイモンド; エム．リーシユジエロルド; デー．ヘンセンズオツトー; ジヨシユアヘンリー; エム．シユマツツデニス; エス．トカクツジヤン; カプランルイス; エス．ソーサマーガレット; エム．フアウントウラキスジミー; エー．ジアコツベロバート; エス．マスレカープラカシユ
Original assignee: メルクエンドカムパニーインコーポレーテツド
Priority date: 1989-06-30
Filing date: 1990-06-29
Publication date: 1995-07-12
Anticipated expiration: 2010-07-12
Also published as: DE69011006T2; EP0405997A1; NO178343B; JPH03163096A; PT94555B; CA2020062C; IL94862A0; NO902921D0; HK209496A; ES2057413T3; DK0405997T3; AU639698B2; DE69011006D1; FI903280A0; FI93647C; EP0405997B1; KR910001068A; PT94555A; FI93647B; CA2020062A1

Description

【発明の詳細な説明】本発明は微生物ザレリオンアルボリコラ（Zalerion arb
oricola）の発酵又は培養によって生産される化合物及
びその化合物の生産を高める方法及び抗真菌剤として及
び抗ニューモサイチス剤（antipneumocystis agent）と
してのその用途に関する。

本出願は抗真菌剤として及び抗ニューモサイチス剤とし
て有用であることが見い出され、好気性条件下ザレリオ
ンアルボリコラの培養で生産される未だ確認されていな
い物質に関する。本出願はまたこの化合物を得る改良さ
れた方法及びこの化合物を主生産物として得る方法に関
する。この新規な生産物は式で表わすことができる。

この化合物は１−［4,5−ジヒドロキシ−N²−（10,12−
ジメチル−１−オキソテトラデシル）オルニチン］−５
−（３−ヒドロキシグルタミン）−６−（３−ヒドロキ
シ−プロリン）エキノカンジンＢと命名することができ
る。

好適な立体異性体は、１−［4,5−ジヒドロキシ−N²−
（10,12−ジメチル−１−オキソテトラデシル）−Ｌ−
オルニチン］−５−（３−ヒドロキシ−Ｌ−グルタミ
ン）−６−［３−ヒドロキシ−Ｌ−プロリン］エキノカ
ンジンＢであると考えられる。

本発明はまたこの化合物の生産速度を改良し、更にこの
化合物を主生産物として生産させる式（Ｉ）の化合物で
強化された組成物の改良された製造方法を含む。

この化合物の構造は詳しいスペクトル特性の分析によっ
て決定されている。

質量分析データ電子衝撃（EI）質量分析データはフィンニガン−MAT212
質量分析の90eVで得た。全酸加水分解のTMS（トリメチ
ルシリル）誘導体のガスクロマトグラフ−マススペクト
ログラム（GC−MS）分析は同じ装置で行なった。高速原
子衝撃（FAB）質量スペクトルはVG20-253装置で記録し
た。

化合物IAはFAB-MS（m/z1071で（M⁺Li）^＋を実測）によ
り分子量1064を有した。全酸加水分解物のGC-MSは各々
１当量のトレオニン、４−ヒドロキシプロリン、３−ヒ
ドロキシグルタミン酸、３−ヒドロキシプロリン及びC
₁₆飽和脂肪酸を示した。

NMRスペクトルデータ化合物Ｉ CD₃OD中400MHzに於ける¹HNMRスペクトルは第１図に示さ
れる通りである。内部標準として49.0ppmの溶媒ピーク
を用いて0ppmのTMSに相対するppmに於てCD₃OD中75MHzで
得られる¹³C NMRケミカルシフト 11.6, 19.7, 20.2, 2
0.7, 27.0, 28.1, 30.30, 30.34, 30.6, 30.8, 31.18,
31.24, 32.9, 34.5, 34.8, 36.7, 38.1, 38.5, 39.4, 4
5.9, 47.0, 51.4, 55.6, 56.3, 57.1, 58.3, 62.5, 68.
2, 69.8, 70.55, 70.68, 71.3, 73.9, 74.3, 75.8, 76.
9, 116.2（2X）, 129.6（2X）, 133.0, 158.5, 169.1,
172.5, 172.7, 172.9, 173.4, 174.5, 175.8, 177.2 pp
m. これらの及び別のデータに基づいて化合物Ｉは指示した
構造を持つことがかなり確かであると考えられる。

この化合物はメタノール、エタノール、ジメチルホルム
アミド、ジメチルスルホキシド、酢酸エチル等の有機溶
媒に可溶な白色固形物質である。

本発明の化合物は糸状菌及び酵母の両方に対して抗真菌
特性を有する。これは病原真菌感染症の原因となる微生
物カンジダアルビカンス（Candida albicans）、カンジ
ダルゴサ（rugosa）、カンジダパラプシロシス（para
psilosis）に対して特に有用であり、高活性であるばか
りでなく、広範囲の菌株にわたって一貫して高活性であ
る。

さらに、多くの抗真菌剤例えばアンフォテリシンＢのよ
うにカンジダアルビカンスや他のある種真菌病原体に対
して有効であるが、都合の悪い危険な副作用のためにそ
の効用が制限されるものと異なり、本発明の薬剤は極め
て有効な抗真菌剤であるばかりでなく、実質的に無毒で
あり、望ましくない副作用を実質的に含まない。

赤血球溶解すなわち有害な潜在的に致命的な副反応は治
療投与量に近い濃度で多くの化合物によって示され、こ
の特性がこれらの化合物の薬剤としての適用性を制限し
ている。式（Ｉ）の化合物は赤血球の溶解が生じるには
治療用よりもはるかに高い濃度を必要とすることが予想
される。

この化合物はまたアスペルギルス（Aspergillus）種、
ペニシリウム（Penicillium）種、フサリウム（Fusariu
m）種、アルテルナリア（Alternaria）種、ニューロス
ポラ（Neurospora）種等を含む糸状菌に対しても抗真菌
的に有効である。

更にその上、この化合物はニューモサイチスカリニイ
（Pneumocystis carinii）、後天性免疫不全症候群（AI
DS）にかかった免疫妥協患者に対して特に重い肺炎を引
き起こす原因の治療用薬剤としても有用である。

本発明の化合物は12301パークラウンドライブ、ロック
ビルMD20852のアメリカンタイプカルチュアコレ
クションのカルチュアコレクションにブダペスト条約
に基づいて寄託され、受け入れ番号ATCC20868で得られ
るメルクカルチュアルコレクションではMF5171と同定
されているザレリオンアルボリコラの培養株を培養する
ことによって便利に生産される。

新規な化合物の生産は主に特定の菌株ATCC20868に関し
て以下で述べられるが、ザレリオンアルボリコラ属及
び変異体の全菌株は本発明の範囲内と考えられる。

しかしながらメルクカルチュアコレクションでMF-5404
と同定され、Z.アルボリコラATCC20957としてアメリカ
ンタイプカルチュアコレクションから得られる特定の変
異体は化合物Ｉの生産に特に有用である。化合物Ｉの生
産に於いてこの変異体の使用も以下で記載される。

ATCC20868及びATCC20957のコロニー及び形態の説明は以
下に示される。

20℃に於けるジャガイモ−デキストロース寒天（ディフ
コ）上のコロニーは徐々に発育し、１週間で８〜12mmに
なる。ジャガイモ−デキストロース寒天上の成熟コロニ
ー（３〜４週）は深部で浸出し、気中菌糸、表面毛髪
状、ラノース又はフニクロース、曇りから中程度の光
沢、の形成は密集した分生子形成のために間質下組織で
密集した緻密なコロニーを隆起する。コロニーの色、薄
いオリーブ−褐色、オリーブ色、オリーブ−褐色、最後
にオリーブ−黒色、イザベラカラー、サヤルブラウ
ン、タウニーオリーブ、サッカルドのアンバー、セピ
ア、ブラウニッシュオリーブ、ローアンバー、ダー
クオリーブ、オリバセアスブラック（lsabella Colo
r,Sayal Brown,Tawny-olive,Saccardo's Umber,Sepia,B
rownish Olive,Raw Umber,Dark Olive,Olivaceous Blac
k、大文字の色の名前はR.リッジウエイ、1912年から色
の標準と命名、ワシントンD.C）。裏のコロニーも同じ
色。におい、浸出液及び可溶性色素は無い。

菌糸（３％KOH中）、薄黄−褐色〜オリーブ−褐色、中
隔、分岐しばしば不規則な側生又は頂生裂片、１〜３μ
ｍ幅、薄い〜わずかに厚い壁で囲まれている。壁は平滑
〜わずかに外被で覆われているか又はいぼ状。気中菌糸
はしばしば束になって一緒に付着している。剛毛及びハ
イフォポジアは無い。

分生子形成細胞単芽球、分散〜密集、組込まれている、
頂生及び間在、直角からわずかに鋭角の未分化の菌糸か
ら直接生じる。不規則な鎖状、糸状又はコイル状として
生成する分生子、後に緻密な不規則量の６〜25細胞とし
て発育する。個々の分生子細胞、直系３〜６μｍ、球
形、準球形又はわずかに不規則な浅裂、平滑〜細いいぼ
状、黄−褐色〜オリーブ褐色。

化合物Ｉは以下に記載される条件下適当な培地中でザレ
リオンアルボリコラを培養し、その後有効成分を適当な
溶媒を用いて発酵培地から抽出し、所望の成分を含むこ
の溶液を濃縮し、次に濃縮物質をクロマトグラフィー分
離にかけて存在する他の代謝産物から化合物Ｉを分離す
ることにより産生培地から回収することによって生産す
ることができる。

1989年６月７日に出願され、同時係属中の米国出願番号
第362,647号の主題であり、現在放棄されている1987年1
0月10日に出願された上記継続出願のもとになった米国
出願番号第105,795号の主題であり、その中で１−
［（4.5R）−4,5−ジヒドロキシ−N²−（10,12−ジメチ
ル−１−オキソテトラデシル）−Ｌ−オルニチン］−５
−（トレオ−３−ヒドロキシ−Ｌ−グルタミン）エキノ
カンジンＢと命名された化合物Ｘもまた微生物によって
生産される。

従って化合物Ｉの生産を容易にするために、以下に記載
される通り栄養培地を修飾するか又は、指示した合成方
法を使用するか又は、大抵は特に変異体ATCC20957を使
用する。

生産本発明の化合物の生産はいくつかの方法の一つによって
行なうことができる。一つの方法は生合成を指示し、一
次窒素源のような培地に通常存在しないアミノ酸類似体
を発酵培地中で置き換えることにより行なわれる。以後
“類似体の混入”又は“指示合成”と呼ばれる非天然ア
ミノ酸の混入は発酵培地中の化合物Ｉの生成を増加する
ことが見い出され、本発明の態様を構成する。このよう
な指示合成では非天然アミノ酸は一次窒素源になる。合
成を指示する最も有効なアミノ酸の一つは3,4−デヒド
ロプロリンである。他の有用なアミノ酸にはＬ−プロリ
ン及びＬ−アゼチジン−２−カルボン酸がある。

類似体の混入を使用するとき培地は他の普通培地でよ
い。従って窒素源として非合成アミノ酸のほかに酵母加
水分解物、酵母自己分解物、カゼイン加水分解物等の窒
素を供給する複合源であることができる。一般に炭素源
にはグリセロール、糖、デンプン及び他の炭水化物又は
デキストラン、セレロースのような炭水化物誘導体並び
にオート麦粉、コーンミール、キビコーン等の複合栄養
素がある。培地中に用いられる炭素源の正確な量は部分
的に培地中の他の成分によるが、通常には培地の0.5〜4
0重量％の炭水化物量が良好であることがわかる。これ
らの炭素源は別個に用いるか又はいくつかのこのような
炭素源を同じ培地中で混合してもよい。

培地中に混入することができる栄養素無機塩の中にはナ
トリウム、カリウム、マグネシウム、カルシウム、リン
酸、硫酸、塩素、炭酸及び類似のイオンを生じることが
できる普通の塩である。またコバルト、マンガン、鉄、
モリブデン、亜鉛、カドミウム等の微量金属も含まれ
る。

典型的な有効培地は以下のものである。

培地Ｉグリセロール 85.0g ベクチン 10.0g 落花生油 4.0g ペプトン化乳 4.0g トマトペースト 4.0g コーン浸漬液 4.0g ラード水 4.0g グリシン 2.0g KH₂PO₄ 2.0g 蒸留水 1000.0ml 滅菌前 pH＝7.0 培地II セレロース 20.0g ファーマメディア^＊ 2.5g 85％ラクトース 2.0g KH₂PO₄ 15.0g 微量元素 10.0ml 蒸留水 1000.0ml pH＝7.0 微量元素 0.6N HCl 1当り FeSO₄・7H₂O 1.0 g MnSO₄・4H₂O 1.0 g CuCl₂・2H₂O 0.025g CaCl₂ 0.1 g H₃BO₃ 0.056g （NH₄)₆Mo₇O₂₄・4H₂O 0.019g ZnSO₄ 7H₂O 0.2 g ＊ファーマメディアは市販の栄養培地であり、主成分は
綿実から得た非加水分解球状タンパク質であり、トレイ
ダースプロテイン、バックアイセルロースコーポレ
ーション、メンフィス、テネシー、38108から購入。

化合物Ｉは“類似体混入”法による次のような方法で生
産することができる。ザレリオンアルボリコラ培養株AT
CC20868の凍結ヴァイアルをpH5〜8.1至適pH6〜7.5の種
子培地に接種し、15〜30℃好適には25〜60℃で２〜30日
好適には２〜５日間攪拌しながら又は攪拌せずに発育さ
せる。攪拌を使用する場合、400rpmまで好適には約200
〜220rpmとする。発育の量が多くなったとき、この培養
物は類似体取り込みによって修飾され、二次代謝物質の
生産に培養される培地に接種するために使用する。

類似体は、発育を確めた５日後に最終濃度５〜8mg/mlを
得る量で加えられる。

発酵は25〜26℃で最低14日間220rpmで攪拌しながら行な
われる。

この期間の最後に、全ブイヨンを同量のメチルエチルケ
トンのような溶媒で抽出する。他の適当な溶媒には酢酸
エチル及びアセトンがある。次いで減圧下で溶媒を除去
して残留物を得、これを既知量のメタノールで可溶化
し、乾燥しHPLCで検定し、残存する物質を分離操作にか
けることができる。

指示合成が生産方法として使用されないとき通常の材料
を使用することができる。

従って窒素源としてはアンモニウム塩、アミノ酸例えば
グリシン、アルギニン、トレオニン、メチオニン等並び
に複合栄養素例えば酵母加水分解物、酵母自己分解物、
酵母細胞、トマトペースト、大豆ミール、カゼイン加水
分解物、酵母エキス、コーン浸漬液、蒸留可溶分、綿実
ミール、肉エキス等を使用することができる。種々の窒
素源は単独で又は培地の0.2〜10重量％の範囲の量で組
合わせて使用することができる。

炭素源としては前述の材料を使用することができるが、
グリセロール又はマンニトールを含む組成物が好まし
い。前述の培地Ｉはグリセロールを含む培地を例示して
いる。RG2及びRG120と呼ばれる次の培地はマンニトール
を含む培地を例示する。

更にその上、特定のマンニトール含有培地の使用によっ
て所望の生産物の生産が高められることを発見した。こ
の改良された生産は化合物Ｘに関して増大した収率の化
合物として又は全代謝物質のより速い生成として明らか
にすることができる。

生産速度は、窒素源は加水分解カゼインと酵母窒素塩基
でありpH約55に注意して制御する培地中に少なくとも４
重量％の量でマンニトールを使用することによって数培
高めることができる。決定的なpH制御を維持するために
リン含有緩衝液好ましくは一塩基性リン酸カリウムが重
要である。代表的な適当な液体培地はTG102及びTG103と
呼ばれるものである。

特定のマンニトール含有培地はその上ザレリオンアルボ
リコラの培養で本来主生成物である化合物Ｘに比べて本
発明の化合物Ｉの生産を容易にする。これらの培地の使
用により、化合物Ｉの収率は著しく増大することがわか
った。従って培地は実質的に中性であり、炭素源として
Ｄ−マンニトール、複合窒素源として乳タンパク質加水
分解物（ペプトン化乳）、アミノ酸としてグリシン及び
緩衝液、リン含有緩衝液を含み、好適には乳酸微量元素
及び選択された植物油も含む。適当な油は大豆油、落花
生油及びヒマワリ油である。有用な範囲は次の通りであ
る。

g/l Ｄ−マンニトール 20-100 KH₂PO₄ 0.5-3 グリシン 1-4 ペプトン化乳 2-20 乳酸 0-3 微量元素（前述の） 0-15ml 植物油（大豆、落花生 0-20 又はヒマワリ）滅菌pH＝７最良収率の化合物に対しては前述の組成物の成分の全部
を存在させるべきである。従ってS6培地（以下）が好適
な培地である。

液体培地のほかに固形培地を使用することができる。次
が代表例である。

前述の培地は標準操作を用いて行なわれる発酵で使用す
ることでき、まずザレリオンアルボリコラ（ATCC2086
8）の凍結植物菌糸を解凍し、種子培地に接種するため
に使用し、次に最低３日間温置して化合物Ｉの生産に於
ける種子として役立つ微生物を産生する。種子培地は次
の組成を有することができる。

種子培地（KF培地）コーン浸漬液 5.0 g トマトペースト 40.0 g オート麥粉 10.0 g グルコース 10.0 g 微量元素^＊ 10.0ml 水 1000ml pH＝6.8 ＊前述のこの方法ではATCC20868の保存培養株の斜面切片をpH5〜
8.1至適pH6〜7.5の液体栄養種子培地に接種し、このフ
ラスコを約15〜30℃好適には20〜28℃の温度で攪拌しな
がら温置する。攪拌は400rpmまで好適には約200〜220rp
mであることができる。温置は２〜30日好適には２〜14
日間にわたって行なわれる。発育が多くなる通常２〜５
日のとき、この増殖を化合物Ｉの生産の産生培地に接種
するために使用することができる。しかしながら二段発
酵は、この培養増殖の一部を接種し、次に同じ条件を使
用して、一般には温置時間を約１〜３日間に短縮して行
なうのが好ましい。次いでこの増殖は産生培地に接種す
るために使用される。

培養増殖を接種した発酵産生培地は３〜30日通常７〜14
日間攪拌しながら又は攪拌せずに温置される。発酵は好
気的に約20〜40℃の温度で行なうことができる。最適結
果のためにはこれらの発酵を約24〜30℃の温度で行なう
ことが最も便利である。約24〜28℃の温度が最適であ
る。本化合物の生産に適当な栄養培地はpH約5.0〜8.5に
異なることができ、好適な範囲はpH約6.0〜7.5である。
しかしながら急速生産としては厳密にpH約5.5に維持す
べきである。所望の化合物又はこれらの化合物の産生に
適当な期間の後、後者は以下で詳述される発酵培地から
回収される。

前述のほかに式Ｉを生産する改良方法は発酵にザレリオ
ンアルボリコラの特定の変異体を使用する。この特定の
変異体はまずZ.アルボリコラ20868を変異誘発物質に委
ね、産生したコロニーを分離して得られた。約80コロニ
ーからの単一コロニーは主成分として化合物Ｉを生産す
るのに有用であることがわかった。

変異体の生産に対して変異体を生産するために一般に使
用される物質はいずれも使用することができる。従って
紫外線照射は、化学的変異誘発物質又は挿入剤を使用す
ることができる。適当な化学的変異誘発物質には、Ｎ−
ニトロソ−Ｎ−メチルウレタン及びＮ−メチル−Ｎ′−
ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジンがある。

本発明で有用なZ.アルボリコラ変異体は0.3Mトリス（ヒ
ドロキシメチル）アミノメタン（TRIS）緩衝液pH＝７中
Z.アルボリコラATCC20868の胞子浮遊液をＮ−ニトロソ
−Ｎ−メチルウレタンで処理し、この処理した浮遊液を
ジャガイモデキストロース寒天に平板にし、コロニーを
発育させるために温置した後、コロニーを分離し、分離
したコロニーをジャガイモデキストロース寒天の斜面に
移し、25℃で10〜14日間温置してZ.アルボリコラの変異
体の培養物を得ることにより得られ、この１つを試験的
にZ7−９と同定し、次にMF5404として保持されアメリカ
ンタイプカルチュアコレクションのパーマネント
カルチュアコレクションに寄託され受け入れ番号AT
CC20957に指定された。

変異体はもとの微生物と実質的に同じ方法で使用するこ
とができる。従ってこの変異体を使用する発酵は、上で
示した栄溶媒地好適にはS6、TG102又はTG103と同定され
た培地の１つで温度及びpHの上記条件を用いて約30日ま
での適当な期間行なうことができる。培養が完了した
後、生産物を回収し、化合物Ｉを分離する。

回収及び分離上述した方法の１つを使用する培養によって生産した
後、化合物Ｉは培地から回収、分離される。

正確な工程は、発酵が液体あるいは固形培地で行なわれ
るかどうか、どのような溶媒が使用されるか、どのよう
な吸着剤又は吸着剤との混合物を使用するかで幾分異な
ってよい。

発酵が固形培地で行なわれるとき、第一工程はアルコー
ル溶媒を発酵培地に加え十分に混合し、次に過し、回
収し、水性アルコール液を濃縮することにより行なう
ことができる。この濃縮液はまず低級脂肪族炭化水素
溶媒例えばヘキサン又は他のアルカンで逆抽出又は洗浄
してアルカン可溶性不純物を除去することができる。ア
ルカン洗浄液を水と混ざらない酸素化溶媒で抽出又は
分配し、得られた溶液を濃縮し、次に少なくとも１工
程、一般には数段階の分離工程のクロマトグラフィーカ
ラムに装填することができる。好適なカラムはシリカゲ
ル、逆相シリカゲル及び“セファデックス"LH-20（ファ
ーマシア）デキストラン吸収剤である。

発酵が一方法の液体培地で行なわれるとき、菌糸固形分
を過し、発酵培地から回収される。アルコールをこの
菌糸ケークに加え、菌糸固形物をアルコールと十分に混
合し、過し、液を集め、濃縮する。

別の方法では全ブイヨンは１容量のアルカノール好まし
くはメタノールを添加して抽出され、過して固形不純
物を除去することができる。次にアルカノール抽出液を
“ジアイオン"HP-20（スチレン−ジビニルベンゼン共重
合体、三菱ケミカル工業社）樹脂に吸着させ、100％ア
ルカノールで溶離する。“ジアイオン"SP-207（臭素
化）又は他の市販のスチレン−ジビニルベンゼン共重合
体を使用することもできる。希釈/HP-20吸着／溶離第二
工程は、クロマトグラフィー分離の調製に於ける試料を
濃縮するために用いる。しばしば希釈/HP-20吸着／溶離
第三工程は容量の減量に望まれる。

栄養固形培地又は菌糸パッドから有効物質の第一抽出で
使用されるアルコール性溶媒はメタノール、エタノー
ル、イソプロパノール等の低級アルコールのいずれでも
よい。メタノールが好ましい。

有効物質がアルカノール又はメタノール溶液から分配さ
れる場合には、適当な溶媒は酢酸エチル、酢酸イソプロ
ピル、酢酸ブチルのようなエステル、又はメチルエチル
ケトンのようなケトンである。

クロマトグラフィー分離は非イオン樹脂による通常のカ
ラムクロマトグラフィーを使用して又は逆相樹脂を用い
る高性能液体クロマトグラフィーで行なうことができ
る。抗生物質化合物Ｉを含む画分はカンジダアルビカン
スを用いる抗真菌検定によって検出することができる。
一般に一工程以上のクロマトグラフィー分離工程が使用
される。最も好ましい方法ではカラムクロマトグラフィ
ーを用いて１回以上の分離が行なわれ、最終分離はC₁₈
逆相樹脂による高性能液体クロマトグラフィー（HPLC）
を使用して行なわれる。

通例のカラムクロマトグラフィーがクロマトグラフィー
分離に使用されるとき、シリカゲルが好ましい吸着剤で
ある。通常１回以上のクロマトグラフィーが用いられ
る。シリカゲルは全ての分離で使用されるが別の溶離剤
を使用してもよい。しかしながら、これは別の吸着剤例
えば商標名“セファデックス"LH-20として販売されてい
るデキストラン吸着剤の使用と有利に組合わせることが
できる。他の吸着剤例えばアルミナ、“ジアイオン"HP-
20、HP-30、HP-40、SP-207及び“アンバーライト"XAD-
2、XAD-4、XAD-16（ロームアンドハース社）として市販
されているスチレン−ジビニルベンゼン共重合体を使用
することもできる。

シリカゲルによるクロマトグラフィーによって有効成分
を分画回収についてアルコール濃度を高くしたエステル
／アルコール混合液が良好な分離を与える。酢酸とメタ
ノールの混合液が特に有用であることがわかった。これ
らは均一勾配、段階勾配又は連続勾配系で使用すること
ができる。デキストラン吸着剤例えば“セファデック
ス"LH-20が使用されるとき、クロロ炭化水素／炭化水素
／アルコール溶媒系を使用することができる。塩化メチ
レン／ヘキサン／メタノールの混合液が特に有用である
ことがわかった。

HPLC分離を行なう場合、通例のクロマトグラフィーから
回収された物質を含むアルコール溶液を濃縮し、残留物
は移動相に見られるのと同じ比のメタノール／水に溶解
し、市販の逆相樹脂で充填されたカラム又は文献で詳細
に報告される通り調製したシリカゲル／C₁₈逆相樹脂で
充填したカラムに装填される。またこのアルコール溶液
は水で52％に希釈され、カラムにポンプで送られる。こ
のカラムはメタノール／水（1:1又は任意により他の
比）を用いて流速約20ml/分を生じる800〜2000psiで操
作される。分離は210nmで監視される。

この画分はカンジダアルビカンスによる活性及び分析用
HPLCを検定する。生成物はカンジダアルビカンス活性画
分を混合し減圧下で濃縮してクロマトグラフィー法のい
ずれかから回収される。

発酵が変異体ATCC20957を用いて行なわれるときの分離
操作は基本的に同じである。しかしながら、変異体を用
いるプロセスで多くの重要でない生成物の脱離について
クロマトグラフィー操作を使用する分離操作は著しく単
純化され、必要なクロマトグラフィー分離の数は著しく
減じられる。

真菌感染症の治療に於て治療薬として化合物Ｉの優れた
特性はカンジダアルビカンス、カンジダトロピカリス及
びカンジダパラプシロシスに対する試験の最低殺菌濃度
（MFC）結果により例示することができる。

活性は培地として１％デキストロースを含む酵母窒素塩
基（ジフコ）（YNBD）を用いるミクロブイヨン希釈検定
で見ることができる。検定を行なうには、化合物Ｉを10
％ジメチルスルホキシド（DMSO）に可溶化し2560μg/ml
に希釈した。この化合物をYNBD中256μg/mlに希釈し
た。次いで浮遊液0.15mlを薬剤濃度128μg/mlを生じる
第一列の96ウェルプレート（各ウェルはYNDB 0.15mlを
含む）に分配した。次に128〜0.06μg/mlの範囲の最終
薬剤濃度を得るために２倍希釈を行なった。

ザブロ−デキストロース寒天に維持した酵母培養物をYM
ブイヨン（ジフコ）に移し、35℃で一晩振盪しながら
（250rpm）温置した。温置後、各溶媒物を滅菌水に希釈
して最終濃度１〜５×10⁶コロニー形成単位（CFU）/ml
を得た。

96ウェルミクロプレートに１ウェル当り1.5μｌを供給
するMIC-2000（ダイノテック）を用いて接種して１ウェ
ル当りの最終接種物1.5〜7.5×10³細胞を得た。このミ
クロプレートを35℃で24時間温置した。最小阻止濃度
（MICs）を目に見える増殖を示さない薬剤の最低濃度と
して記録した。

MICを記録した後、プレートを振盪して細胞を再浮遊し
た。その後、96ウェルミクロプレートのウェルからの試
料1.5μｌをサブローデキストロース寒天を含む単個ウ
ェルトレイに移した。接種したトレイを28℃で24時間温
置し次に読み取った。MFCは増殖を示さないか１スポッ
ト当り４コロニー以下を示す最低濃度として定義され
る。

最小殺菌濃度（μg/ml）真菌株No. 化合物Ｉカンジダアルビカンス（Candida albicans） MY 1585 0.5 MY 1208 0.5 MY 1028 1.0 MY 1750 0.25 MY 1783 0.5 カンジダトロピカリス（Candida tropicalis） MY 1012 2.0 カンジダパラプシロシス（Candia parapsilosis） MY 1009 8.0 MY 1010 8.0 前述の結果は、化合物Ｉによって示される優れた一貫し
た抗真菌特性の例示である。

この化合物は、抗真菌剤として有効であるが低水準の投
与量で赤血球による溶菌作用を有するために用途が制限
されている既知の抗真菌剤の代用として可能である。

この化合物はまた多くの真菌種、線状真菌及び酵母の両
方に対して有効な広範囲スペクトル抗真菌剤である。

この化合物はニューモサイチスカリニイ感染症を抑制ま
たは軽減するのに有用である。このような用途に対して
化合物Ｉは治療上有効な又は阻止量でニューモサイチス
カリニイに感染した患者にまたは感染し易い免疫妥協患
者に投与される。化合物Ｉの治療又は抗感染目的に対す
る効能は免疫抑制マウス又はラットによる研究で証明す
ることができる。

代表的な研究として、体重22〜24gの10匹の雄のC3H/Hej
マウスを飲料水にデキサメタゾンを６週間添加すること
により（8.0mg/l）免疫抑制してP.カリニイ感染症の発
生を誘発した。感染を促進するためにこのマウスはまた
低タンパク質食餌で維持した。７週目の始めにマウスを
２つのグループに分けた。両グループとも残りの研究の
ために飲料水中のデキサメタゾンと低タンパク質食餌を
うけることを続けた。グループＩのマウスに賦形剤対照
として20％DMSO溶液0.5mlを１日２回腹腔内に注射し
た。グループIIのマウスに化合物I0.0125mgを含む滅菌
水0.5mlを１日２回腹腔内に注射した（DMSOに溶解、DMS
Oの最終濃度10％、実際の投与量0.5mg/kg）。治療期間
は２週間続けた。

治療期間の最後に（合成８週間免疫抑制）、動物を犠牲
にし、肺組織を除去した。次にこの組織を処理して各動
物に対してシストの数を求めた。化合物Ｉは対照の動物
に比較するとシストの数が81％減少した。

この顕著な特性は化合物が通常の医薬配合手法により医
薬的に使用し得る担体を用いて新規な医薬組成物に処方
されるとき最も有効に利用される。

新規な組成物は少なくとも抗真菌又は抗ニューモサイチ
ス量の有効化合物を含む。一般に少なくとも１重量％の
化合物Ｉを含む。使用前の希釈に適した濃縮組成物は15
重量％以上を含み、いくらかの組成物は90重量％以上を
含む。組成物を調製する場合、化合物Ｉは通常の医薬媒
質のいずれとも緊密に混和される。

組成物は経口、非経口、局所又は肺（吸入）投与の形で
調製することができる。経口投与は、液体又は固形製剤
によることができる。液体製剤としては治療薬剤を液体
担体例えば水、グリコール、油、アルコール等と処方さ
れる。カプセル剤及び錠剤のような固形製剤としては治
療薬剤は固形担体例えばデンプン、砂糖、カオリン、エ
チルセルロース、炭酸カルシウム及び炭酸ナトリウム、
リン酸カルシウム、タルク、ラクトースと、一般には炭
酸カルシウムのような滑沢剤と結合剤、崩壊剤等と共に
処方される。投与の容易さからは錠剤及びカプセル剤が
最も有利な経口投薬形を代表する。

化合物Ｉは注射用治療組成物に処方することができる。
またこれは単位投薬形、アンプル又は多回投与用容器で
必要があれば防腐剤を添加して存在させることができ
る。注射用組成物は水中0.85％塩化ナトリウム又は５％
デキストロースのような油性又は水性賦形剤中懸濁液
剤、液剤又は乳剤のような形を用いることができあるい
はアルコール／プロピレングリコール又はポリエチレン
グリコールに可溶化することができ、沈殿防止剤、安定
化剤及び／又は分散剤のような処方剤を含むことができ
る。緩衝剤並びに他の添加剤を加えてもよい。また有効
成分は投与前に適当な賦形剤で再構成する粉末形である
ことができる。

組成物は、単位投与形で処方することができる。明細書
で使用される“単位投薬形”という用語は、物理的に分
離した単位を意味し、各単位は医薬単体と共に所望の治
療効果を生じるように計算された所定量の有効成分を含
む。このような単位投薬形の具体例は、錠剤、カプセル
剤、丸剤、粉末剤、オブラート包、アンプル又は多回投
与用容器の計量した単位等である。本発明の単位投薬量
は用途により成分薬剤35〜200mg又はそれ以上を含むこ
とができる。

適用が局所である場合には、薬剤は白色ワセリン、無水
ラノリン、セチルアルコール、コールドクリーム、グリ
セリルモノステアレート、ローズ水等の通常のクリーム
剤及び軟膏で処方することができる。通常１〜２％クリ
ーム溶液が調製され治療される面に塗布される。

抗ニューモサイチス用としては、吸入による投与が特に
有用である。吸入による投与としては、化合物Ｉは加圧
パック又は噴霧器からエアロゾル噴霧剤の形で供給する
ことができる。この化合物は処方される粉末として供給
することもでき、粉末組成物は通気粉末吸入器によって
吸入することができる。好適な吸入の供給系は一定投与
量吸入（MDI）エアロゾルであり、適当な推進薬例えば
過フッ化炭化水素又は炭化水素中化合物Ｉの懸濁液又は
溶液として処方することができる。

この化合物が医薬的に使用し得る液体担体に難溶性であ
り、肺、気管支を直接治療することが望ましいことから
エアロゾル投与は好ましい投与方法である。特に感染が
耳及び他の体腔に広がっている場合通気法も望ましい方
法である。

非医薬適用に対しては、本発明の生成物は微細乾燥又は
液体希釈剤、増量剤、充填剤、調節剤及び賦形剤例えば
種々のクレー、ケイソウ土、タルク等又は水及び種々の
有機液体例えばエタノール及びイソプロパノール又はケ
ロセン、ベンゼン、トルエン及び他の石油蒸留分又はそ
の混合液を含む不活性担体中の組成物として使用するこ
とができる。

本発明を実施する場合には組成物の抗真菌量は真菌制御
が望まれる面に直接適用することができる。

次の実施例は本発明を具体的に説明するものであるが限
定するものとして解釈されるべきではない。

実施例Ｉメルクカルチュアコレクションに維持されているMF
-5171ザレリオンアルボリコラ ATCC No.20868の凍結培
養菌を発酵に使用した。

2.5mlの全斜面培養液を解凍し、培地Ｉ（組成は前述さ
れている）40mlを含む250mlの３バッフル付フラスコに
無菌的に移した。

培養液を接種した培地Ｉを26℃で５日間220rpmで攪拌し
ながら温置して成熟種子ブイヨンを得た。

種子ブイヨンを前述した組成を有する培地IIから同様に
調製した。次に培地Ｉと培地IIからの種子を各々培地Ｉ
と培地II7.5mlに５％の水準で接種し、26℃で温置して
発育を確かめた。この期間の終りに次のアミノ酸を各培
地の分離管に加えた。Ｌ−プロリン、Ｄ−プロリン、Ｌ
−アゼチジン−２−カルボン酸、3,4−ジヒドロ−Ｌ−
プロリン及び対照として化合物Ｘ。この管を26℃に於て
220rpmで14日間温置した。

この期間の終わりにこの各管のブイヨンを同量のメタノ
ールで希釈して混合液を均一にし、過により清澄にし
た。このメタノール混合液を減圧に委ねてメタノールを
除去し残留物を回収し、次に酢酸エチル10mlで２回抽出
した。この酢酸エチル溶液を硫酸マグネシウムで乾燥し
た。

分離操作として乾燥した溶液を濃縮乾個し、メタノール
0.5mlで再構成した。得られた各溶液を1:5に希釈し、こ
の希釈溶液10μｌを対照として保持時間8.38分（培地
Ｉ）と8.29分（培地II）を有する化合物Ｘと共に1:1の
アセトニトリル／水を用いて“ゾルバックス"ODS（デュ
ポン）カラムによる分析用HPLCで使用した。Ｌ−プロリ
ン及び3,4−デヒドロ−Ｌ−プロリンを加えた培地Ｉの
管とＬ−プロリン、Ｌ−アゼチジンカルボン酸及び3,4
−デヒドロ−Ｌ−プロリンを加えた培地IIの管は、化合
物Ｘによる保持時間8.28〜8.38分のほかに7.39〜7.48分
の保持ピークを示した。

HPLCバイオオートグラフィー検定もまた分析用HPLCに使
用した同じ10μｌ発酵試料により行なった。１注入当り
試料10μｌを使用し、アセトニトリル／水（1:1）で流
速1ml/分及び200μl/留分に於て廃棄量1.5mlにして溶離
した。画分を96ウェル．ミクロタイタープレートに集め
た。HPLC溶媒を蒸発させ、各ウェルにカンジダアルビカ
ンスMY-1028を接種したジャガイモデキストロース
ブイヨン0.2mlを加え、24時間増殖した。化合物Ｘによ
るほかの活性は画分に3,4−デヒドロ−Ｌ−プロリンを
加えた培地から得られた試料中に見られ、これは7.57分
に見られるピークに対応する。このピークは分析用HPLC
評価に見られる7.39〜7.48分に対応する。

少量の化合物はHPLCバイオオートグラフィー分析から分
離した。3,4−デヒドロ−Ｌ−プロリンを用いる指示生
合成からのこの少ない方の成分のFAB質量分析は化合物
Ｘより小さい質量単位、分子イオン14を示した。

実施例II 発酵培養株MF5171（ザレリオンアルボリコラ）の 1本の凍
結ヴァイアル（約2ml）の内容物をバッフル付でない250
ml三角フラスコ中のKF種子培地54mlに接種した。この培
養液を25℃で３日間往復振盪機による220rpmで温置し
た。培養試料（5ml）をKF種子培地500mlを含む2lのバッ
フル付でない三角フラスコに接種し、25℃で３日間220r
pmに振盪しながら培養した。

３日間の最後に、培溶液5mlを種子培地500mlを含む2lの
バッフル付でない三角フラスコ５本の各々に接種し、25
℃で３日間220rpmで培養した。これらのフラスコをプー
ルし次の組成を有する産生培地50lを含む75l攪拌容器に
接種した。

産生培地材料濃度（g/l）コーン浸漬液 5.0mL （NH₄）₂SO₄ 2.0 ラード水 5.0 CoC_l26H₂O 10.0mg 肝油 2.0mL トマトペースト 5.0 クエン酸ナトリウム 2.0 グリセロール 75.0 ポリエチレングリコール2000 2.0mL 121℃で35分間滅菌する前PH＝7.0 培養は25℃で８日間攪拌速度300rpm及び5l/分の空気流
れで続けた。その後、発酵ブイヨンを分離するために回
収した。

分離前述の70l発酵ブイヨンの全ブイヨンを過し、菌子ケ
ークをメタノール10lで抽出した。このメタノール抽出
液を過し、水10lで希釈し、HP-20樹脂1.2lに吸着さ
せ、100％メタノールで溶離した。

1500mlに及ぶこのメタノールの多い留分を150mlに濃縮
した。

この濃縮物を40％メタノール/60％水混合液に希釈し、H
P-20 200mlに吸着させた。このカラムをメタノール／水
（50:50）、水及びアセトニトリル／水（25:50）で連続
して洗浄し、次に代謝物質をアセトニトリル／水（50:5
0）でカラムから溶離した。

生物活性に富むHP-20吸着からの画分400mlの70mlを水で
300mlに希釈し、過し、アセトニトリル／水（12.5/8
7.5）で平衡にした88ml“ゾルバックス"ODSカラムに流
速10ml/分で充填した。このカラムを流速20ml/分でアセ
トニトリル／水（40/60）、次にアセトニトリル／水（5
0/50）を用いて溶離した。この化合物を50/50のアセト
ニトリル／水で溶離した。このカラムをUVにより210nm
で監視し、カンジダアルビカンスMY-1028による抗真菌
検定及び分析用HPLC評価をこの画分で行なった。これら
の分析に基づいて特定の画分を合わせた。

濃縮乾個し、分析用HPLCで評価した後、合わせた画分試
料は化合物Ｘ及び化合物Ｉの1:1の混合物であることが
わかった。

メタノール3.2ml中化合物約7.5mgと化合物17.5mgに達す
る前述の試料を水で10mlに希釈し、アセトニトリル／水
（60/40）で予め平衡にした“ダイナマックス”−60A8
μM C18 21.4mnID×25cmカラム（5cmの保護カラム（レ
ーニンインスツルメント社、ボウバーン、MA）を取り
付けた）に注入した。

次にこの混合液を同じアセトニトリル／水溶離液を用い
て10ml/分で室温に於て溶離し、各々15mlの画分を集め
た。注入して30分後、60分にわたる直線勾配を開始し、
アセトニトリル濃度を40〜60％に増加した。この画分の
210nmでの読み取りと次のHPLC分析は化合物Ｉを含む３
画分があることを示した。大部分の最も純粋な化合物Ｉ
を含む中間の画分を濃縮乾個し、予備的質量分析測定を
行なった。

リチウム化高速原子衝撃質量分析（FAB-MS）は分子量10
64であることを示した。全酸加水分解物のトリメチルシ
リル（TMS）誘導体のガスクロマトグラム質量分析（GC-
MS）は主成分としてトレオニン、４−ヒドロキシプロリ
ン、オルニチン様化合物の酸化生成物、３−ヒドロキシ
グルタミン酸、C₁₆脂肪酸及び３−ヒドロキシプロリン
を示した。この分析に基づいて化合物Ｉの構造を提示し
た。

この画分の成分はまたこの画分をメタノール33μｌ、水
100μｌ及びトリフルオロ酢酸（TFA）10μｌに溶解し、
生じた溶液を水中0.1％ TFA55％／アセトニトリル45％
で平衡にしたダイナマックス−60A C18 10mm ID 25cmカ
ラムによりクロマトグラフィー処理して精製した。同じ
溶媒系を用いて4ml/分で室温に於て溶離すると210nmの
吸着ピークを有する３画分を生じた。２つの画分を蒸発
乾固して¹H NMRを分析した。予備的¹H NMRは式Ｉの化合
物を支持した。

式Ｉの精製試料は前述の第１図の¹H NMR、¹³C NMR及び
質量分析データを有する。

実施例III 250mlのバッフル付でない三角フラスコ中のKF種子培地5
0mlに凍結ヴァイアルのZ.アルボリコラを接種し、220rp
m、25℃で72時間振盪した。この種子2mlをKF培地50mlに
接種するために使用し72時間増殖した。第２期を産生培
地に接種するために使用した。

250mlのバッフル付でない三角フラスコ中培地Ｓ−６と
して前述した培地40mlに種子2mlを接種し、フラスコを2
20rpm、25℃で14日間振盪した。合計125個のフラスコを
プールして最終ブイヨン5lを得た。

全ブイヨンを１インチ床の“スーパー−セル”（マンビ
ル）により真空過した。過したブイヨン中に活性は
検出されなかった。菌子ケークをメタノール１で一晩
攪拌しながら抽出した。メタノール抽出液をC.アルビカ
ンスMY1028によるディスク拡散検定及びHPLC検定（50/5
0のアセトニトリル/0.01Mリン酸カリウムpH7.0）を用い
結果を標準として化合物Ｘの前で得た試料と比較して生
物活性成分の存在を検定した。メタノール抽出液を最終
濃度の50％水性メタノールに希釈し、200mlHP-20カラム
に流速20ml/分で吸着させた。このカラムを３カラム容
量の50％水性メタノールで洗浄した。活性は６カラム容
量の75％水性メタノールで溶離した。所望成分は適当な
画分であり、化合物Ｉと化合物Ｘを1.7lに合わせた。

生物活性成分を含む試料を水1.7lで希釈して50:50メタ
ノール／水の組成物を生成し、この組成物を過して不
溶粉子を除去した。この調製試料を88ml“ゾルバック
ス"0.05カラム（50:50のメタノール／水で予め平衡にし
た）に20ml/分で吸着させた。このカラムを45:55のアセ
トニトリル／水を用いて20ml/分で溶離し、30mlの廃棄
量の後20ml画分を取った。クロマトグラフィーはUV210n
m、分析用HPLC及び抗真菌生物活性（C.アルビカンス MY
1028）により監視した。主に分析用HPLCに基づき特定画
分を合わせた。80mgに達する化合物と化合物Ｘの混合物
は化合物I 19.8mgを含むことを示した。

実施例IV ザレリオンアルボリコラ、ATCC 20868の凍結栄養菌糸
のヴァイアルの内容物を解凍し、KF種子培地54mlに接種
するために使用し、次に5cmのスローを持つ回転振盪機
の220rpmで25℃に於て３日間温置して種子培養を産生し
た。

種子培養の2ml分をTG103培地50mlを含む250mlの三角フ
ラスコに接種し、25℃で５日間振盪しなかせら温置し
た。

この期間の最後に発酵ブイヨンを回収した。回収では液
体培養液を遠心分離して細胞を培養上清から分離した。
この細胞を20ml分のメタノールと混合し、室温で一晩抽
出した。固形分を遠心分離で除去し、次にメタノール抽
出液を５μ“ウルトラスフェア”（ベックマンエンジ
ニアリング）カラム（4.6mm×25cm）に注入し、アセト
ニトリル／水48/52を用いて流速0.75ml/分でインクラチ
カルに溶離した。溶出液を210nmで監視し、0.25ml画分
を96ウェルミクロタイター皿に集めた。溶媒を真空中で
この皿から除去し、この皿を各ウェルに次の組成を有し
カンジダアルビカンスMY1028を入れてある酵母エキス、
ペプトン、デキストロース（YEPD）ブイヨンを入れ、 g/l バクト酵母エキス 10 バクトペプトン 20 デキストロース 20 pHは調整しない 37℃で一晩温置して生物活性を検定した。結果は化合物
Ｉの生産を示した。化合物Ｘも産生される。

実施例Ｖ KF種子培地（前に示した）54mlを含む250mlフラスコを
調製し、MF5404Z.アルボリコラATCC20957の寒天斜面か
ら接種し、25℃で４日間220rpmで温置した。KF培地500m
lを含む４個の2lフラスコの各々に接種するために20ml
試料を使用した。このフラスコを25℃で３日間220rpmで
温置した。次にKF培地180lを含む300l種子発酵器の接種
物として使用するためにこのフラスコ内容物をプール
し、ポリプロピレングリコールP-2000（ダウケミカル
社）2ml/lを加えて発泡を減少させた。種子発酵器を３
日間25℃で空気流れ90l/分、圧力0.7kg/cm²ゲージ、攪
拌機速度220rpmとして操作した。前で示した組成を有す
るがポリプロピレングリコールP-2000 2ml/lが添加さ
れ、120℃で25分間滅菌したTG103培地475lを含む800lの
産生発酵槽に接種するために25l試料を使用した。発酵
は25℃の温度、５日間空気流れ250l/分、圧力0.7kg/cm²
ゲージ及び攪拌機速度150rpmで行なった。開始pH値6.0
〜5.5から低下させ、次にNaOH及びH₂SO₄を用いて維持し
た。５日後、２つのバッチからのブイヨンを生産物分離
のために回収した。

メタノール750lを発酵全ブイヨン750mlに加え、混合液
を８時間攪拌した。全ブイヨン抽出液を遠心分離して不
溶性発酵固形分を除去し、pH7に調整した清澄化上清143
6lを生成した。

77lの“ジアイオン"SP-207（三菱ケミカル工業）床をメ
タノールで洗浄し、50:50のメタノール／水（MeOH/H
₂O）で予め平衡にして調製した。次に清澄化した上清を
上の方向に流れるSP-207に流動床速度5.7l/分で充填し
た。充填後、カラムを65:35のメタノール／水567lで洗
浄し、100％メタノール454lで溶離した。

SP-207カラムからのMeOH/H₂O65:35及び100％MeOH SP-20
7画分を合わせ。H₂Oを加えて組成50:50のMeOH/H₂Oに調
整して945lの濃厚画分を得た。この濃厚画分を108lの
“ジアイオン"HP-20カラム（メタノールで洗浄し、MeOH
/H₂O50:50で予め平衡にした）に流速２〜4l/分で充填し
た。次にこの樹脂を567lのMeOH/H₂O 65:35で洗浄し454l
の100％MeOHで溶離した。

化合物Ｉの多いHP-20留分をまずH₂Oで希釈し、次に大き
い方のHP-20カラムで使用したのと同じ方法で吸着させ
小さい方のHP-20カラムから溶離して6l容量に濃縮し
た。

濃縮HP-20濃厚画分2lを水2lで希釈し、MeOHで予め洗浄
し、MeOH/H₂O50:50で予め平衡にした3.9lのC18カラム
（アミコン）を備えた800A分取用HPLC系（セバレーショ
ンズテクノロジー）に充填した。次にMeOH/H₂O50:50
500mlを充填し、流速212ml/分で60分間のMeOH/H₂O50:50
〜100％MeOHの直線勾配を用いて溶離した。画分をHPLC
により分析し、合わせ、濃縮乾固して純度88％の化合物
Ｉ約20gを得た。

実施例VI 実施例Ｖで記載した通り得た化合物Ｉの多いHP-20画分
の6l濃縮物から900mlを精製に使用した。

900mlに同量のメタノールを加え、得られた溶液に水900
ml、ヘキサン900ml及び酢酸イソプロピル900mlを加え、
激しく振盪した。分離できないエマルジョンが生じ、こ
こにメタノール450mlを加えて２層を得た。2.5lに達し
た下槽をヘキサン900ml、酢酸イソプロピル及びメタノ
ール450mlに加え再び激しく攪拌し、下層3lを回収し
た。分配工程は下層で３度目を行なって3lに達する別の
下層を生成した。

分配実験からの最終の下層を濃縮乾固した。この残留物
（4g）をCH₂Cl₂/CH₃OH/5％ CH₃COOH（72.5/27.5/10）
の混合液50mlに加え、この時下層に溶解した。この溶液
を移動相として同じCH₂Cl₂/CH₃OH/5％CH₃COOH（72.5/2
7.5/10）（72.5/27.5/10）を用いて50ml/分としてシリ
カゲル60（230〜400メッシユ）2lによりクロマトグラフ
ィー処理して少ない方の成分から分離した高純度の化合
物Ｉを得た。

実施例VII 各々化合物I mgを含む1000個の圧縮錠剤を次の処方から
調製する。

ｇ化合物Ｉ 500 デンプン 750 二塩基性リン酸カルシウム水和物 5000 ステアリン酸カルシウム 2.5 微細に粉末にした成分を十分に混合し、10％デンプンペ
ーストで顆粒にする。顆粒を乾燥し、錠剤に圧縮する。

実施例VIII 各々化合物IA 210mgを含む1000個のゼラチンカプセルを
次の処方から調製する。化合物ｇ化合物Ｉ 500 デンプン 250 ラクトース 750 タルク 250 ステアリン酸カルシウム 10 これらの成分の均一混合液を混和により調製し、２ピー
ス硬ゼラチンカプセルに充填するために使用する。

実施例IX 局所適用に適した軟膏は、化合物I 13mgを市販のポリエ
チレン／炭化水素ゲル1gに緊密に分散して調製すること
ができる。

実施例Ｘ注射用懸濁液（IM）は次の通り調製することができる。

mg/ml 化合物Ｉ 10.0 メチルセルロース 5.0 トウイーン80 0.5 ベンジルアルコール 9.0 塩化ベンザルコニウム 1.0 水 1mlに実施例XI 次の処方を有するエアロゾル組成物を調製することがで
きる。

１カン当り化合物Ｉ 24 mg レシチンNF液体 1.2mg 濃縮物トリクロロフルオロメタン 4.025g ジクロロジフルオロメタン 12.15g

【図面の簡単な説明】

第１図は、化合物ＩのCD₃OD中400MHzにおける¹H NMRス
ペクトルである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩ技術表示箇所Ｃ１２Ｒ 1:645）微生物の受託番号ＡＴＣＣ２０８６８微生物の受託番号ＡＴＣＣ２０９５７ (72)発明者ジエロルドエム．リーシユアメリカ合衆国，08550 ニユージヤーシイ，プリンストンジヤンクシヨン，シエーブルツクドライヴ 10 (72)発明者オツトーデー．ヘンセンズアメリカ合衆国，07701 ニユージヤーシイ，レツドバンク，リヴアープラザ, アレキサンダードライヴ 65 (72)発明者ヘンリージヨシユアアメリカ合衆国，10314 ニユーヨーク, スタテンアイランド，ウツドワードアヴエニユー 256 (72)発明者デニスエム．シユマツツアメリカ合衆国，07016 ニユージャーシイ，クランフオード，エリザベスアヴエニユー 306 (72)発明者ジヤンエス．トカクツアメリカ合衆国，08854 ニユージャーシイ，ピスカタウエイ，エス．ランドルフヴイルロード 620 (72)発明者ルイスカプランアメリカ合衆国，10956 ニユーヨーク, ニユーシテイ，レキシントンロード７ (72)発明者マーガレットエス．ソーサアメリカ合衆国，07208 ニユージヤーシイ，エリザベス，リンカーンアヴエニユー 126 (72)発明者ジミーエム．フアウントウラキスアメリカ合衆国，07090 ニユージヤーシイ，ウエストフイールド，ロングフエローアヴエニユー 2421 (72)発明者ロバートエー．ジアコツベアメリカ合衆国，08735 ニユージヤーシイ，ラヴアレツト，ウエストモントアヴエニユー 230 (72)発明者プラカシユエス．マスレカーアメリカ合衆国，07060 ニユージヤーシイ，ウオーレン，クリステイドライヴ 35

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】下記式：を有する化合物。
【請求項２】1-［4,5−ジヒドロキシ−N²−（10,12−ジ
メチル−１−オキソテトラデシル）−オルニチン］−５
−（３−ヒドロキシ−グルタミン）−６−［３−ヒドロ
キシ−プロリン］エキノカンジンＢと命名される請求項
１記載の化合物。
【請求項３】請求項１記載の化合物を、医薬的に使用し
得る担体との混合物として包含することを特徴とする抗
菌剤。
【請求項４】真菌の生育を抑制するのに有用な請求項３
記載の抗菌剤。
【請求項５】ニューモサイチスカリニイの治療に有用な
請求項３記載の抗菌剤。
【請求項６】請求項１記載の化合物の抗真菌的に有用な
量を、生育を制御すべき領域に適用することを特徴とす
る真菌の生育を抑制する方法。
【請求項７】非天然アミノ酸が一次窒素源として存在す
る栄養培地中で、ザレリオンアルボリコラを培養するこ
とを特徴とする請求項１記載の化合物の製造方法。
【請求項８】一次炭素源としてマンニトールで強化した
栄養培地中で、ザレリオンアルボリコラATCC20868を培
養することを特徴とする請求項１記載の化合物の製造方
法。
【請求項９】（１）マンニトールを包含している炭素
源、（２）乳タンパク質加水分解物を包含している窒素源、
及び（３）グリシン又は無機リン酸塩を包含している緩衝液を含む水性栄養培地中で、ザレリオンアルボリコラを培
養することを特徴とする増大した収率で請求項１記載の
化合物を製造する方法。
【請求項１０】使用される栄養培地が、微量元素と乳酸
も含む請求項９記載の方法。
【請求項１１】使用される栄養培地が更に、大豆油、落
花生油又はヒマワリ油から選択される植物油を含む請求
項10記載の方法。
【請求項１２】水性培地１当たりのｇとして、Ｄ−マ
ンニトール、20〜100;KH₂P0₄,0.5〜3;グリシン、１〜4;
ペプトン化乳、２〜20;乳酸、０〜3;微量元素溶液、０
〜15ml;及び植物油、０〜20を包含する請求項９記載の
方法。
【請求項１３】マンニトールを少なくとも４重量％の量
で含む栄養培地中でザレリオンアルボリコラを培養し、
pH約5.5を維持することを特徴とする請求項１記載の式
（Ｉ）の化合物の生産速度を増加する方法。
【請求項１４】マンニトールを少なくとも４重量％及び
pH約5.5を維持するための緩衝液を含み、同化され得る
炭素、同化され得る窒素及び無機塩の栄養培地を包含す
る請求項13記載の方法。
【請求項１５】好気性条件下、同化され得る炭素源、同
化され得る窒素源及び無機塩を含む栄養培地中でMF5404
ザレリオンアルボリコラATCC20957を式（Ｉ）の化合物
の十分量を生産するまで培養し、その後生産物を培地か
ら分離することを特徴とする、一次産物として請求項１
記載の式（Ｉ）の化合物を製造する方法。