PT94555B

PT94555B - Metodo para a producao de um derivado de equinocandina b, util como antibiotico

Info

Publication number: PT94555B
Application number: PT94555A
Authority: PT
Inventors: Robert E Schwartz; Otto D Hensens; Jerrold M Liesch; Raymond F White; Henri Joshua; Dennis M Schmatz; Jan S Tkacz; Louis Kaplan; Margaret S Sosa; Jimmy M Fountoulakis; Robert A Giacobbe; Prakash S Masurekar
Original assignee: Merck & Co Inc
Priority date: 1989-06-30
Filing date: 1990-06-29
Publication date: 1997-02-28
Also published as: IL94862A; ES2057413T3; CA2020062C; DK0405997T3; NO902921L; ATE109160T1; FI93647B; AU639698B2; EP0405997B1; NO902921D0; NZ234225A; NO178343C; AU5797390A; NO178343B; KR910001068A; KR0145693B1; PT94555A; FI903280A0; FI93647C; JPH03163096A

Description

presente requerimento é dirigido a uma substância previamente não reconhecida que se verificou ser útil como um agente anti-fúngico e como um agente anti-pneumocystis e que é produzida através de cultura de Zalerion arboricola em condiçSes aerábicas, 0 requerimento é também dirigido a processos aperfeiçoados para a obtenção do composto e a um processo para a obtenção do composto como d produto principal. 0 novo produto pode ser representado pela fórmula

HO OH

HO OH □ composto pode denominado:

1-114,5-d i hidroxi-N*·- ( 10,12-d imeti 1 -1 -o xo tet radec i 1 ) orn i tina 3-5- ( 3-hidroxiglutamína)-ó-(3-hidroxi prolina5equinocandina B.

F‘ensa-se que o estereoisómero preferido seja;

O

1-C4,5-dihidroxi-N''~ ( 10,12-d imeti 1-1-oxo-tet radec i 1 ) -L-orni tina, j-5-(3-hidroxi-L-q1utamina)-6-C3-hidroxi-L-prolinaequinocand ina B.

presente invento também inclui métodos aperfeiçoados para a produção de composições enriquecidas no composto com a fórmula (I), para melhorar a taxa de produção do composto e ainda para produzir o composto como o produto principal.

A estrutura do composto foi de terminada pela, análise detalhada das características espectrais.

DADOS DQ ESPECTRO DE MASSA

Os dados do espectro de massa por impacto de electrSes (EI) foram obtidos num espectrómetro de massa Finnigan-MAT 212 a 90 eV. A análise por Cromatograf ia Sasosa-Espectrograma de Massa. (GC-MS) dos derivados do TMS (trimetilsililo) dos hidrolisados ácidos totais foi realizada no mesmo instrumento. Os espectros de massa, por bombardeamento atómico rápido (FAB) foram registados num instrumento VS20-253.

composto IA tem o peso molecular 1064 por FAB-MS (observou (M-*-Li )⁺ a m/z 1071). GC-MS do hidrolisado ácido total apresentou um equivalente de cada um de entre treonina, 4-hidroxiprolina, ácido 3-hidroxig lutãmico, 3-hidrc<xiprol ina., e um ácido gordo C_1A saturado.

DADOS DO ESPECTRO DE RMN

Composto I

Espectro RMNs em CD^OD a 4Ô0 MHz é tal como indicado na Figura 1 ; e

Desvies Químicas de ^'‘C RMN obtida em CD-.OD a 75 MHz em ppm em relação a TMS a ppm zero usando um pico de solvente a 49,© ppm como padrão interno: 11,6, 19,7, 20,2, 20,7, 27,0, 28,1, 30,30

30,34, 30,6, 30,3, 31,13, 31,24, 32,9, 34,5, 34,8, 36,7, 33,1

33.5, 39,4, 45,9, 47,0, 51,4, 55,6, 56,3, 57,1, 53,3, 62,5, 68,2

69,3, 70,55, 70,63, 71,3, 73,9, 74,3, 75,8, 76,9, 116,2(2X1

129,6(2X), 133,0, 158,5, 169,1, 172,5, 172,7, 172,9, 173,4

174.5, 175,3, 177,2 ppm.

Baseados nestes e noutros dados, pensa-se que o Composta I possui, com considerável certeza, a estrutura indicada.

composto é um sólido branco solúvel em solventes orgânicos tais como metanol, etanol, dimetilformamida, dimetil sulfóxido, acetato de etilo, etc.

composto deste invento possui propriedades ant-fúnqicas contra tanto fungos filamentosos como leveduras. é particularmente útil contra organismos que causam infecções micóticas patogénicas tais como Candida albicans. Cari d ida ruqosa, Candida parapsi1os is etc, em relação aos quais não apenas é apresentada elevada actividade mas também actividade consistentemente elevada em relação a uni extenso painel de estirpes de organismos.

Além disso, diferentemente de um certo número de agentes anti-fungioos, tais como a anfotericina B, os quais ό — embora activos contra. Candida a.I b i cans e certos outros fungas patogénicos, são limitados na. sua utilidade devido a. efeitossecundários inconvenientes e perigosos, os agentes do presente invento são não apenas agentes a.nti-fungicos muito eficazes mas são também substancialmente não tóxicos e substanciaImente livres de reacçoes secundárias indesejáveis.

A lise dos glóbulos vermelhos sanguíneos, uma reacção secundária potêncialmente fatal acompanha muitos compostos em concentrações próximas da dose terapêutica e esta propriedade tem limitado a aplicação destes compostos como medicamentos. Pensa-se que o composta com a. fórmula (I) requere uma concentração muito superior á da utilização terapêutica antes de ocorrer a lise dos glóbulos vermelhos sanguíneos.

□ composto é também a.nti-fúnqicamente eficaz contra, fungos filamentosos incluindo a espécie Aspergi 1 lus, a. espécie F'enici 11 iu.m, a espécie Fusarium, a espécie Alternaria, a espécie Neurospora, etc.

Além disso, o composto é também útil como um agente para, o tratamento de Pneumocystis carinii, o agente causador de uma pneumonia de particular gravidade para os doentes com deficiência imunitária tais como os que adquiriram o síndroma de imu.no deficiência, (SIDA).

□ composto do presente inventa e convenientemente produzido fazendo crescer uma cultura de Zalerion arboricola, iden ti f içada, como MF 5171 na colecção de culturas da Merck, que se encontra depositada de acordo com o Tratado de Budapeste na Colecção de Culturas da American Type Culture Collection em 12301 Parklawn Drive, Rockville, MD 20852 e que tem o número de acesso ATCC 20363.

Embora a produção dos novos com pos tos seja d i so u ti da aqui a seguir principalmente no que se refere a uma estirpe especifica, ATCC 20363, todas as estirpes do género Zalerian ar bor ico la e mu.tantes sao contemplados no âmbito deste invento.

Contudo, um mutante de Culturas Merck como MF-5404 Type Culture Collection como Z larmente útil na produção de mutante na produção do Compo seguir.

particular identificado na Colecção e acessível a partir da American arboricola ATCC 209í

Composto I. A sto I é também particuutilização deste descrita aqui a

A descrição das colónias e da morfologia de ATCC e de ATCC 20957 é indicada a sequir:

10308

Colónias em agar de batata-dextrose (Difco) a 2Ô'^:’C crescendo lentamente, atingindo um diâmetro de 8-12 mm numa semana. Colónias maduras (3-4 semanas) em esfreqaço de agar de batata-dextrose, com hifas submersas e aéreas, superfície peluda, lanosa, ou funicolcse, baça a moderadamente brilhante, formando colónias elevadas, densamente compactas, com uma textura substromática devida a densa formação de conidias. CÓr das colónias castanho-azeitona claro, azeitona, castanho azeitona e finalmente preto azeitona, Isabella Color, Sayal Brown, Tawny-olive, Saccardo s Uinber, Sepia, Srownish Clive, Raw Urafaer, Dark Clive, Dlivaceous Black (nomes de cores obtidos a partir de R„ Ridqway. 1912.

Color Standards and Nomenc1ature, Washington, D.C., ). As mesmas cores no reverso das colónias. Odores, exsuclados e pigmentos so1úveis ausentes.

Hifas (em 3% KOH) castanho amarelado claro a castanho azeitona, septadas, ramificadas, frequentemente com lobos laterais ou terminais, com 1-3 um de largura, com paredes delqada.s a ligeiramente delgadas, com paredes macias a

1igeiramente incrustadas ou verrugosas.. As hifas aéreas aderem írequentemente entre sí formando fascículos. Cerdas e hifopodias ausentes.

Células conidiogénicas racnob1ásticas, espalhadas a densas, integradas, terminais e intercalares, originando-se directamente de hifas não diferenciadas, em ângulos rectos a ligeiramente·? agudos. As conidias que se originam como cadeias, filamentos ou cordas irregulares, desenvolvem-se posteriormente sob a forma de massas irregulares com 8-25 células. As células conidiais individuais, com diâmetro de 3-6 um, globosas, subglobosas, ou. ligeiramente irregulares a. lobu.ladas, macias a finamente verrugosas, de côr castanho amarelado a castanho azeitona.

□ Composto I pode ser produzido por cultura de Zalerion arboricola num meio nutritivo apropriado em condiçoes descritas aqui a seguir e em seguida recu.perando-o do meia de produção por extracção do componente activo a partir do meio de fermentação com um solvente apropriado, concentrando a solução contendo o componente desejado, e em seguida submetendo o material concentrado a. separação cromatográf ica a fim de separar o Composto I de outros metabolitos também presentes.

U Composto X que é o S„N. 382 847, registado am 7 de de S.M. 105 795 registado em 10 tema do requerimento copendente Junho, 1989 que é uma continuação de uu.tu.bro, 1987, açora abandonado, e aqui denominado como 1 C ( 4R,5R>-4,5-dihidroxi-Nⁱ-( 10, 12-d.imeti 1-1-oxo-tetradeci1)--L-orni tina 3-5-(treo-3-hidrox i-L-g1utamina > equ.inocandina B também produzida pelo organismo.

Assim, a fim de favorecer a produção do Composto I, o meio nutritivo é modificado ou utiliza-se um método de síntese directa ou mais especialmente utiliza-se o mutante ATCC 20957 tal como é aqui a seguir descrito.

PRODUÇSO

A produção do composto do presente invento pode ser realizada por qualquer um de entre vários métodos. Um método é dirigido è biossíntese, realizada substituindo no meio de fermentação, um amino ácido análogo não normalmente presente nesse meio como a fonte principal de azoto. Verificou-se que a incorporação de amino ácidos não naturais aqui a seguir referidos como incorporação de análogo ou síntese dirigida aumenta a formação de Composto I no meio de fermentação e constitui um aspecto do presente invento. Nessa síntese dirigida, o amino ácido não natural torna-se na fonte principal de azoto. Um dos amino ácidos mais eficazes para a direcção da síntese é 3,4-debidropro1ina.

Outros amino ácidos úteis incluem L-prolina e ácido L-a.zet.idina·-—2—carboxi1ico.

= utiliza a. incorporação de análogo, o meio pode ser um meio de outro modo convencional. Assim, como fontes de azoto podem existir para além dos amino ácidos não naturais, fontes complexas que fornecem azoto sob a forma de hidrolisados de levedura, auto1isados de levedura, etc. Geralmente, as fontes de carbono incluem glicerol, açucares, amidos e outros hidratos de carbono, ou derivados de hidrato de carbono tais como dextran, cerelose, assim como agentes nutritivos complexos tais como farinha de aveia, farinha de milho, milho-miúdo, trigo, etc. A quantidade exacta de fonte de carbono que é utilizada no meio dependerá, em parte, de outros ingredientes no meio, mas verifica-se bahitualmente que uma quantidade de hidrato de carbono entre O,5 e 4© por cento em peso do meio é satisfatória. Estas fontes de carbono podem ser usadas individualmente ou podem ser combinadas várias fontes de carbono no mesmo meio.

podem ser incorporados nos meios de habituais capazes de proporcionar cálcio, fosfato, sulfato, cloreto,

Entre os sais inorgânicos de agentes nutritivos, que cultura encontram-se os sais sódio, potássio, magnésio, carbonato, e iSes afins. São também incluídos metais vestigiais tais como cobalto, manganésio, ferro, molibdeno, zinco, cádmio, etc.

Meios úteis típicos são os que se sequem:;

.)

Meio I

(31 icerol	85,0	d
F‘ec tina	10,0	g
Farinha de Amendoim	4,0	g
Leite Peptonizado	4,0	g
Pasta de Tomate	4,0	o
Licor Saturado de Milho	4, y	g
Agua de Unto	4,0	g
G1 í c i n a	2,0	¹ g
kh₂po₄	2,0	¹ g
Aqua Destilada	1 . 000	ι ml
pH=7,0 Pré Estéril

Meio II

Cer e 1 u=>e	20,0	y
Farmamediaí	2,5	g
857 Lactato	2,0	g
kh₂po₄	15,0	g
Elementos Vestigiais	10,0	ml
Água Destilada	1000,0	ml

_PH 7,0

Elementos Vestiqiais

For litro de HCl 0.6N

FeSO. . 7H-0 4 xi

Mr.S0₄.4H^0 Cu Cl.-, . 2H_o0

CaCl

H^BO

1,0 g 1,0 g 0,025 g 0,1 g 0,056 Q 0,019 g # Pharmamedia é um meio nutritivo comercializado, cujo componente principal é proteína globular não hidrolisada derivada das sementes do algodão obtida a partir de Traders Protein, Buckeye Cellulose Corporation, Memphis, Tenn. 33108.

O composto 1 pode ser produzido pelo método de “incor poração análoga de um modo mais ou menos como se segue: um recipiente congelado de Zalerion arboricola cultura ATCC 20868 é inoculado num meio de sementeira apropriada com pH variando entre 5 e 8,1, óptimamente entre 6 e 7,5, e feito crescer de 2 a 30 dias, de preferência de 2 a 5 dias, a temperaturas variando entre 15°C e 30°C, de preferência 25-26°C com ou sem agitação. A agitação, quando utilizada, pode ir até 400 rpm. de preferência 200 a 220 rpm. Quando o crescimento se torna abundante, a cultura é usada para inocular o meio a ser modificado por incorporação análoga e a. ser cultivado para a produção do segundo metabolito.

análogo é adicionado cinco dias após o crescimento se ter estabelecido numa quantidade que proporcione uma concentração final de 5-8 mg/ml.

A fermentação é realizada durante um mínimo de 14 dias a 25-26°C com agitação a 220 rpm.

No fim deste período, é extraida a totatlidade do caldo com um volume igual de um solvente tal como cetona metil etílica. Outros solventes apropriados incluem acetato de etilo e acetona. 0 solvente é então removido sob pressão reduzida para se obter um resíduo que pode ser solubilizado com um volume conhecido de metanol, seco e ensaiado por HPLC, sendo o restante material submetido a processas de isolamento não se utiliza a síntese directa como um método podem ser utilizados materiais convencionais.

Quanoo para a produção.

Assim, como fontes de azoto podem ser utilizados sais de amónio, amino ácidos tais como glicina, arginina, treonina, metionina, etc. assim como agentes nutritivos complexos tais como hidrolisados de levedura, autolisados de levedura, células de levedura, pasta, de tomate, farinha de soja, hidrol isados de caseína, extractos de levedura, licores saturadas de milho, destiladores solúveis, farinha de sementes de algodão, extracto de carne, etc. As várias fontes de azoto podem ser usadas isoladamente ou em combinação em quantidades variando entre Ô,2 e 10 por cento em peso do meio.

Como fontes de carbono, podem ser utilizados materiais ρrévíamente defa.Inados, embora e.ejam preferidas composiçSes contendo glicerol ou manitol. D Meio I, préviamente descrito, ilustra um meio contendo glicerol. Os meios que se seguem, designados por RG2 e RG120 são ilustrativos dos meios contendo man i t.o 1 .

MEIO RG2

MEIO RG120 por litro por litro

Marti to 1	44 q	Manitol	71	g
Licor Saturado Milho	4	g	Licor Saturado Milho	4	g
Áqu.a ds Unto	4	q	Áqua de Unto	4	q
Pectina	10	g	Pectina	10	g
kh₂po₄	2	g	κ.η^ρο₄	2	q
pas t a de Torna, te	4	g	Pasta de Tomate	4	g
Leite Peptonizado	4	g	Leite Peptonizado	4	g
Glic ina	2	g	Gl ic ina	2	g
Farinha de Amendoim	4	g	Farinha de Amendoim	4	g
pH a j u s t ad o pa. r a 7,0			pH ajustado para 7,0	1
Além disso,	foi	des	coberto que pela utiliz	ação

certos meios contendo manitol, a produção do produto desejado pode ser aumentada. A produção aumentada pode-se manifestar no aumento de produção do Composto I em relação ao Composto X ou numa mais rápida formação de todos os metabolitos.

A taxa de produção pode ser aumentada várias vezes pela utilização de manital numa quantidade de pelo menos 4 por cento em peso num meio com cuidadoso controlo do pH a cerca de 5,5 em que a fonte de azoto é caseína hidrolisada e base de azoto da levedura. Para a manutenção do controlo do pH crítico, έ importante a presença de um taimpão contendo fasforo, de preferencia fosfato de potássio monbobásico. Representativos de meios líquidos apropriados são os designados TG102 e TG103.

·

MEIO TG102 MEIO TG1O5

	por litro		por litro
D-Mani to1	4Θ g	D-Man i. tol·	40 g
B a c t o- P e ρ t on a	33 q	NZ-Amina.(tipo E) #	33 g
t.;·; tracto de	10 g	Extracto de	10 g
Bacto-Levedura		Fidco—Levedura
<nh₄)₂so₄	5 g	(NH₄)₂so₄	5 g
kh₂pc₄	9 g	kh₂po₄	9 g

sem ajustamento pH sem ajustamento pH * Hidrolisado de caseina, Humko-Sheffield, Memphis,

T enn.

Além disso, certos meios contendo manitol, favorecem a produção do Composto I do presente invento em relação ao Composto X que é normalmente o principal produto na cultura de Zalerion arboricola. Pela utilização destes meios, verificou-se que o rendimento do Composto I tinha aumentado significativamente. Assim, um meio que seja substancialmente neutro e que contenha D-manitol como fonte de carbono, um hidrolisado de proteína do leite (leite peptonizado) como uma fonte complexa de azoto, glicina como amino ácido e tampáo, um tampão contendo fósforo e de preferência, contendo também ãcido láctico, elementos vestigiais, e óleos vegetais seleccionadas. óleos apropriadas são óleos de soja, amendoim e girassol. As variações úteis são as seguintes:

qramas/litro

D-manitol 2Θ-100 i<H^,F'O₄ &, 5-3 glicina 1-4

Leite peotonizada 2-20

Acido láctico 0—3

Elementos vestigiais 0-15 ml (préviamente detalhados) óleo vegetal 0-20 (soja, amendoim ou girassol) pré-esteri1ização pH=7

Para melhor rendimento tes da composição anterior devem Só (abaixo) é um meio preferido.

do composto, todos os componsnestar presentes. Assim, o meio

MEIO S2

MEIO Sò

D-Mar.itol	44	g
kh₂pq₄	·?	g
G1 i c i n a.		g
Leite peptonizado	15	g
Acido láctico	o	g
Elementos vestigiais	10	ml

ídetalhados préviamente)

D-manitol 44g

KH₂P0₄ 2 g

Glicina 2g

Leite peptonizado 15 g

Ácido láctico 2 g pré-esteri1ização pH 7,0

Elementos vestigiais 10 ml (detalhados préviamente) óleo de soja 10 g pré-esteri1ização pH 7,0 o

Para além dos meios líquidos, podem ser utilizados meios sólidos. São representativos os que se sequem:

meiq sólido F2Q4 por frasco 250-ml

Base liquida por litro

Mi1ho-miúdo Base líquida g 15 ml

Ardamins PUO 33, 0 g

Tartrato de Sódio ó,ó q

FeSQ^-TH^O 0,óó g

Gluta.mato Monos sódio 6,6 g óleo de Milho 6,6 ml sem ajustamento pH

O (autolisado de levedura fornecido por Yeast Products Inc.» Clifton, New Jersey) meio sólido F4-sf por frasco 25¾ ml

Base liquida por litro

Mi 1ho esta1ado	15 g	Ardamine PH	0,2 g
Base líquida	IO ml	kh₂po₄	0,1 g
		MgSO^H^O	0,1 q
		Tartrato de Sódio	0,1 q
		FeS0₄-7H₇0	0,01 g
		ZnS0₄-7H₂0	0,01 g

sem ajustamento do pH

Gs meios anteriores podem ser utilizados em fermentações realizadas usando um processo padrão em que em primeiro lugar, micélio veoetativo congelado de Zalerion arboricola ÍATCC 20868) é descongelado e usado para inocular um meio de sementeira o qual é então incubado durante um período mínimo de 3 dias a fim de produzir organismos que servem como sementes na produção do Composta I. 0 meio de sementeira pode ter a composição que se seque.

Meio de Sementeira (Meio KF)

Licor saturado de milho 5,0 q

	Pasta de tomate	40,0 q
	Farinha d e aveia	10,0 g
	Glucose	10,0 g
	Elementos vestigiaist	10,0 ml
	ÁQUã	1000 ml
	pH=6,8
	$ prèviamente detalhado
	Neste processo, uma secção inclinada de	um cultura
ρr e — e r vada	de ATCC 20868 è inoculada num	meio de	sementeira
nutritivo	líquida cont pH variando entre 5	e 3,1,	óptimamente
entre 6 e	7,5 e os frascos são incubados com	agi tação	a tempera-

turas variando entre cerca de 15°C e cerca de 3O'^:'C, de preferencia entre 20'^:' e 23 *C. A agitação pode ir até 400 rpm, de preferência, cerca de 200 a 220 rpm. A incubação é realizada durante; um período variando entre 2 e 30 dias, de preferência entre 2 e 14 dias. Guando o crescimento é abundante, usualmente entre 2 e 5 dias, o crescimento pode ser usado para inocular □ meio de produção para a produção de Composto I. Contudo, de preferência, ê realizado um segundo estádio de fermentação, inoculando com uma porção do crescimento da cultura e utilizando então condiçSes

1?

semelhantes mas geralmente com um período de incubação encurtado de cerca de 1 a 3 dias. D crescimento é então utilizado para inocular o meio de produção.

□ meio de produção de fermentação inoculado com o crescimento da cultura é incubado durante 3 a 30 dias, usu.almente 7 a 14 dias, com ou sem agitação. A fermentação pode ser realizada aeróbicamente a temperaturas variando entre cerca de 20*C e cerca de 4O'^:’C. Para resultados óptimos, é mais conveniente realizar estas fermentações a uma temperatura variando entre cerca de 24*C e cerca de 30°C. As temperaturas de cerca de 24^r-'-2S^oC são as mais preferidas. 0 pH do meio nutritivo apropriado para a produção destes compostos pode variar entre cerca de 5,0 e 8,5 com uma variação preferida entre cerca de 6,0 e 7,5. Contudo, para uma produção rápida, o pH deve ser mantido muito próximo de cerca de 5,5. Após o período apropriado para a produção do composto ou compostos desejados, esteís) últimoís) é (são) recuperado(s) do meio de fermentação tal como é aqui a seguir descrito com maior detalhe.

Além do que foi anteriormente referido, um método aperfeiçoado para a produção do Composto 1 utiliza um mutante específico de Zalerion arboricola na fermentação. 0 mutante específico foi obtido em primeiro lugar submetendo Z. arboricola

Lima amca :olónia de entre produzidas. cerca de oito colónias revelou ser útil ria produção do Composto I como o componente principal.

um dos anentes mutan t es. mutaqén icx

Assim.

produção do mutante, pode ser utilizado qualquer habitualmente utilizados para a produção de podem ser utilizados radiação ultravioleta, químicos, ou agente de intercalação. Mutagénios químicos apropriados incluem N-n i troso-N-meti 1 ureta.no e N-metil~N -n i t ro-N-ni t rosoguani d ί n a.

mutante Z. arboricala útil no senta invento ídí obtido tratando uma suspensão de esporos de Z„ arboricola ATCC 2©S68 em tampão tris ( hidroximeti 1 ) aminometano (TRIS) 0,3 M pH=7 com N-nitroso-N-metiluretano, revestindo a suspensão tratada com agar de dextrose de batata e incubando a fim de desenvolver colónias, isolando em seguida as colónias, transferindo as colónias separadas para planos inclinados de agar de dextrose de batata e incubando durante 10 a 14 dias a 25*C a fim de se obter culturas de mutantes de Z_. arboricola, uma das quais foi identificada experimentalmente como Z7-7 e subsequentemente mantida, como MF 5404 e depositada na colecção de cultura permanente da American type Culture Collection sendo-lhe atribuído o número de acesso ATCC 20757.

mutante pode ser utilizado substaneialmente dc· mesmo modo que o microorganísmo afim. Assim, a fermentação utilizando este mutante pode ser realizada utilizando as condiçSes anteriores de temperatura e de pH nos meios nutritivos anteriormente indicados, de preferência num dos meios identificados como Só, TG'102 ou TS103 durante um período de tempo apropriado até cerca de 30 dias. Depois da cultura ficar completa, os produtos sãc> recolhidos e o Composto I é isolado.

RECOLHA E ISOLAMENTO

Após produção por cultura utilizando um dos métodos anteriormente descritos, o Composto I é recolhido e isolado do me ío,

Os passos exactas podem variar atê um certo ponto dependendo da fermentação, se ê realizada, num meio sólido ou líquido, do solvente utilizado e do adsorvente ou combinação de adsorventes uti1izado(s).

, Quando a fermentação é realizada num meio sólido, o primeiro passo pode ser realizado adicionando um solvente alcoólico ao meio de fermentação, misturando completamente, e em seguida filtrando, recuperando e concentrando o filtrado de álcool aquosa. 0 filtrado concentrado pode ser em primeiro lugar / extraido de novo ou lavado com um solvente hidrocarboneto alifáJ tico inferior tal como hexano ou outro alcano a fim de remover as impurezas solúveis no alcano. □ filtrado lavado com alcano pode ser extraido ou dividido com um solvente orgânico oxigenado não miscível com a âgua e a solução resultante ê concentrada, sendo então colocada sobre uma coluna cromatográfica durante pelo menos um, geralmente vários passos de separação. Colunas apropriadassão gel de sílica, gel de sílica de fase reversa e absorvente d e x t r an o Sephad e ,<¹¹ LH-20 (F’ha rmac ia).

Quando a fermentação é realizada num meio líquido, num método, os sólidos miceliais são filtrados e recuperados do meio de fermentação. Adiciona-se álcool à massa micelial, e o sólido micelial é misturado completamente com o álcool, filtrado, e o filtrado é recolhido e concen trado. Num método alternativo, todo o caldo de fermentação pode ser extraido pela adição de um volume de alcanol, de preferência metanol, e filtrado a fim de remover as impurezas sólidas. 0 extracto de alcanol é então adsorvido ) sobre resina Diaion HP-20 (copolimero estireno-divíni1benzeno,

Mitsubishi Chemical Industries, Ltd) e eluido com 1QQ7. de alcanol. Podem também ser utilizados Diaion SP-207 (brominado) ou outro copolimero estireno-divinilbenzeno comercialmente disponível. Utiliza-se um segundo passo de diluição/adsorção

HP-Cô/eluição a fim de concentrar a amostra para separações cromatográf icas. Por vezes, pode ser desejável um terceiro passo de diluição/adsorção ΗΡ-20/eluição para redução do volume.

solvente alcoólico· a ser utilizado na extracção ) inicial do agente aetivo a partir do meio nutritivo sólido ou a partir da camada micelial pode ser qualquer um dos álcoois inferiores tais como metanol, etanol, isopropanol, etc. é preferido o metanol.

Se o agente aetivo for dividido entre a solução de alcanol ou metanol, então os solventes apropriados são ésteres, tais como acetato de etilo, acetato de isopropilo, acetato de butilo, ou cetonas, tais como cetona metil etílica.

A separação cromatográfica pode ser realizada utilizando cromatograf ia de coluna convencional com resina não-iónica ou. por cromatografia líquida de elevada performance utilizando resina de fase reversa. As fracções contendo o Composto I antibiótico podem ser detectadas pelo ensaio anti-fúngico usando Candida albicans. Geralmente, são utilizados mais de um passo de separação cromatográfica. Num processo mais preferido, são realizadas uma ou mais separações utilizando cromatografia de coluna e uma separação final é realizada utilizando cromatografia líquida de elevada performance (HF'LC) com resina de fase reversa

Quando se utiliza cromatografia de coluna convencional para, separações cromatográf icas, o gel de sílica é o adsorvente preferido. SJsualmente utiliza-se mais de uma separação cromatoqráfica. O gel de sílica pode ser usado em todas as separações embora se utilizem diferentes agentes de eluição.. ContudQ, pode-se combinar vantajosamente com a utilização de um adsorvente diferente tal como o adsorvente dextrano vendido com o nome comercial de Sephadex LH-20. FOdem também ser utilizados outros adsorventes tais como alumina, copolímeros estireno-diviniIbenzeno disponíveis comercialmente como Diaion HP-20, HP-30, HP-40, SP-207 e Amberlite XAD-2, XAD-4, XAD-ló (Rohm and Haas Co.).

No fraccicnamento e recuperação do componente activo por cromatoqrafia sobre qel de sílica, misturas éster/alcool com concentrações progressivamente mais elevadas de álcool proporcionam boas separações. Verificou-se ser especialmente útil uma mistura de acetato de etilo e metanol. Estes podem ser utilizados em sistemas isocráticos de gradiente passo a passo ou de gradiente contínuo. Quando se utiliza um adsorvente dextrano tal como Sephadex LH-20, pode-se utilizar um sistema solvente clorohidrocarboneto/hidrocarboneto/alcool. Verificou-se ser especialmente útil uma mistura, de cloreto de metileno/hexano/metanol.

Ao realizar a separação por HPLC, a solução alcoólica contendo material recuperado a partir de cromatografia convencional é concentrada e o resíduo é dissolvido em metanol/água na mesma relação que foi encontrada na fase móvel e colocado numa coluna envolvida com resina de fase reversa comercial ou numa coluna preenchida com qel cie sí 1 ica/resina de fase reversa C,_ preparada tal como tem sido amplamente referido na bibliografia. Alternativamente, a solução alcoólica pode ser diluida até 52 por cento com água e bombeada para a coluna. A coluna é operada usando metanol/água (1:1 ou f acul tat.ivamente outras relações) a 800-2.O00 psi o que produz uma taxa de fluxo de cerca de 20 ml/min. A separação é monitorizada a 210 nm.

As fracções são ensaiadas quanto à sua actividade com Candida albicans e HPLC. 0 produto é recuperado a partir de qualquer um dos processos cromatográficos combinando as fracções activas de Candida albicans e concentrando sob pressão reduzida.

Quando a fermentação é realizada usando o mutante, ATCC 20957, o processo de isolamento è básicamente o mesmo. Contudo, com a eliminação de um certo número de produtos menos importantes no processo usando o mutante, o processo de isolamento que utiliza processos cromatográficos é grandemente simplificado e o número de separações cromatográficas necessárias é grandemente reduzido.

As propriedades superiores do Composto 1 como um agente terapêutico na tratamento de infecções micóticas podem ser ilustradas com os resultados da concentração fungicida mínima (MFC) em testes contra Candida albicans, Candida tropical is e Candida parapsiiosis.

A actividade pode ser observada num ensaio de diluição de microcaldo de cultura utilizando como meio uma Base de Azoto da Levedura (Difco) com 17. de dextrose (YNBD). Ao realizar o ensaio, o Composto I foi solubilizado em 10 por cento de dimetil sulfóxido (DMSO) e diluido até 2.560 pg/ml. Os compostos foram posteriormente diluídos até 256 pg/ml em YNBD. Forneceu-se então 0,15 ml da suspensão á primeira fila de uma placa com 96 recipientes (contendo cada recipiente 0,15 ml de YNBD) resultando numa concentração da droga de 123 pg/ml, Foram então feitas diluições duas vezes a fim de se obter as concentrações finais da droga variando entre 123 e 0,06 pg/ml.

As culturas de levedura, mantidas em agar de dextrose Sabouraud foram transferidas para caldo de cultura YM (Difco) e incubadas durante a noite a 35*C com agitação (250 rpm). Após incubação, cada cultura foi diluida em água estéril para proporcionar uma concentração final de 1-5 x IO'^-1 unidades formadoras de colónias (CFUJ/ml.

Microplacas com 96 recipientes foram inoculadas usando um MIC-2000 (Dynotech) que fornece 1,5 μΐ por recipiente proporcionando um inóculo final por recipiente de 1,5-7,5 x 10' células. As microplacas foram incubadas a 35°C durante 24 horas. As concentrações inibidoras mínimas (MICs) foram registadas como as concentrações mais baixas de droga que não apresentaram qualquer crescimento visível.

>

Após registo da MIC, as placas foram agitadas a fim de tornar a levar as células a suspensão. Em seguida, amostras de 1,5 μΐ a. partir dos recipientes na microplaca com 96 recipientes foram transferidas para um único tabuleiro de recipiente contendo agar de dextrose Sabouraud. Ds tabuleiros inoculados foram incubados 24 horas a 23'^:'C sendo então avaliados. A MFC é definida como a concentração mais baixa da droga não apresentando qualquer crescimento ou menos de 4 colónias por mancha.

Concentração Fungicida Mínima

Estirpe de Fungo Mo.	(uq/ml) Composto I
Candida albicans
MY 1585	·-· 5
fv!'·/ ί ·?ϊ/Ο
	O , U
MY 1026	1 ,0
MY 1750	0,25
MY 1783	0,5

Candida tropical is

MY 1Ô12 2,0

Candida parapsilosis .

MY 1009 3,0

MY 1010 8,0

Os resultados anteriores servem de exemplo das propriedades antimicóticas superiores e consistentes reveladas pelo )

Composto I.

composto apresenta um valor potencial como uma substituição para um agente anti-fúngico conhecido o qual embora eficaz como agente anti-fúngico apresenta uma utilidade limitada pelo facto de ter um efeito lítico sobre os glóbulos vermelhos sanguíneos com níveis de dosagem baixos.

composta é também um agente anti-fúngico de amplo espectro eficaz contra muitas espécies de fungos, tanto fungos filamentosos como leveduras.

□ composto é útil para a. inibição ou para o alívio das infecçSes pelo Pneumocystis carinii. Nessa utilização, o Composto I é administrado numa quantidade terapêuticamente eficaz ou inibidora a indivíduos infectados ou a indivíduos com compromisso imunitário susceptíveis de serem infectados com Pneumocvstis carinii. A eficácia do Composto I para fins terapêuticos e anti-infecciosos pode ser demonstrada em estudos com ratinhos ou ratos com supressão imunitária

Num estuda representativo dez ratinhos machos C3H/Hej, pesando 22-24 g cada, foram submetidos a supressão imunitária pela adição de dexametasona è água para bebcer (3,0 mg/L) durante seis semanas a fim de induzir o desenvolvimento de infecçSes por P. carinii. Para favorecer a infecçâo os ratinhos foram também mantidos com uma dieta com baixo teor proteico. No início da sétima semana os ratinhos foram divididos em dois grupos. Ambos os grupos continuaram a receber dexametasona na água de beber e dieta de baixo teor proteico durante o restante tempo de estudo. Os ratinhos do Grupo I foram injectados intraperitonealmente duas vezes por dia comi 0,5 ml de uma solução a 20'/. de DMSO como controlo do veículo. Os ratinhos do Grupo II foram injectados intraperitonealmente duas vezes por dia com 0,5 ml de água estéril contendo 0,0125 mg de Composto 1 (dissolvido em DMSO, sendo a concentração final de DMSO de 107., dose real, 0,5 mg/kg). 0 período de tratamento durou duas semanas.

No fim do período de tratamento (uma supressão imunitária num total de oito semanas) os animais foram sacrificados sendo removido o tecido pulmonar. O tecido foi então tratado a fim de determinar o número de quistos para cada animal. 0 Composto I reduziu o número de quistos em 81X em comparação com os animais de controlo.

As notáveis propriedades são utilizadas com mais eficácia quando o composto é formulado em novas compos.içSes farmacêuticas com um veículo farmaceuticamente aceitável de acordo com técnicas de composição farmacêuticas convencionais.

As novas composiçSes contêm pelo menos uma quantidade terapêutica anti-fúngica. ou antí-pneumocystis em peso do composto activo. Seralmente, as composiçSes contêm pelo menos 1 por cento em peso do Composto I. ComposiçSes concentradas apropriadas para

diluições antes da utilização podem conter 15 por cento ou mais e com algumas composiçSes 90 por cento ou mais em peso. Ao preparar as composiçSes, o Composto I é misturado intimamente com qualquer um dos meios 1armacsuticos usuais.

a 1L. Ou i =>, etc comprimidos,

As composiçSes podem ser preparadas em formas de administração oral, parentérica, tópica ou pulmonar (inalação). A administração oral pode ser feita, com preparações líquidas ou sólidas. Para as preparações líquidas, o agente terapêutico é formulado com veículos líquidos tais como áqua, glicois, óleos, Para preparações sólidas tais como cápsulas e o agente terapêutico é formulado com veículos sólidos tais como amidos, açucares, caolino, celulose etílica, carbonato de cálcio e de sódio, fosfato de cálcio, caolino, talco, lactose, geralmente com um agente de lubrificação tal como estearato de cálcio, juntamente com agentes de ligação, agentes de desintegração, etc. Devido à sua facilidade de administração, os comprimidos e cápsulas representam a forma de dosagem oral m .a i s v antajosa .

composto I pode ser formulado em composiçSes farmacêuticas para injecção. Além disso, pode ser apresentado sob a forma, de unidade de dosa.qem, em ampolas ou em recipientes com doses múltiplas, e se necessário comi a. adição de um preservativo. As composiçSes injectáveis podem apresentar formas tais como suspensões, soluções ou emulsões em veículos oleosos ou aquosos tais- como 0,85 por cento de cloreto de sódio ou 5 por cento de dextrose em áqua, ou podem ser solubilizadas em a 1cool/propilene glicol ou polietilene glicol e podem conter agentes de formulação tais como agentes de suspensão, estabi. 1 i zação e/ou dispersão. Podem ser adicionados agentes tampão assími como outros aditivos. Al ternativaiTíente, os ingredientes activos podem apresentar-se sob a forma de pá para reconstituição com um veículo apropriado antes da administração.

As composiçSes podem ser formuladas sob a forma de unidade de dosaqera. A expressão forma de unidade de dosagem tal como é usada na apresentação detalhada e nas reivindicações refere-se a unidades físicamente descontínuas, contendo cada unidade uma quantidade prédeterminada de ingrediente activa calculada para produzir o efeito terapêutico desejado em associação com o veículo farmacêutico. Exemplos dessas formas de unidade tíe dosagem são comprimidos, cápsulas, pílulas, pacotes de pó, hóstias, unidades medidas em ampolas ou em recipientes de doses múltiplas, etc. Uma. unidade de dosagem do presente invento pode conter, dependendo da utilização de 35 a 200 miligramas ou mais do componente droga.

Se a aplicação for tópica, a droga deverá ser formulada ε/n cremes e unguentos convencionais tais como petrolatum, lanolina anidra, álcool cetílico, creme cosmético de limpeza, monostearato de glicerilo, água de rosas, etc. Usualmente prepara-se uma solução de creme a 1 du 2 por centD que é aplicada à região a ser tratada.

Para utilização anti-pneumocystis, a administração por inalação pode ser particularmente útil. Para administração por inalação, o Composto I pode ser administrado sob a forma de uma pulverização de aerosol a partir de embalagens ou nebulizadores pressurizados. Ds compostos podem também ser administrados sob a forma, de pós que podem ser formulados e a composição do pó pode ser inalada com o auxílio de um dispositivo de inalação de pó por insuflação.. 0 sistema, de administração preferida pa.ra inalação é constituído por um aerosol para inalação de dose medida (MDI), que pode ser formulado como uma suspensão ou como uma solução do

Composto I em propulsores apropriados, tais como fluorocarbonetos ou hidrocarbonetos.

Devido à difícil solubilidade do composto em veículos líquidos farmaceuticamente aceitáveis e devido ao facto de ser desejável tratar o pulmão e os bronquios directamente, a administração de aerosol constitui um método de administração preferido. A insuflação é também um método desejável, especialmente quando a infecção se possa ter espalhado parai os ouvidos ou outras cavidades do corpo.

Para aplicação não médica, o produtD do presente inventes pode ser utilizado em composições num veículo inerte o que inclui diluentes sólidos ou líquidos secos finamente divididos, agentes de extensão, agentes de enchimento, condicionadores e excipientes, incluindo várias argilas, terra diatomácea, talco, etc., ou áqua e vários líquidos orgânicos tais como alcanois inferiores, por exemplo etanol e isopropanol, ou querosene, benzeno, tolueno e outras fracções da destilação do petróleo ou. suas misturas.

Na prática do invento, uma quantidade anti-fúngica das composições pode ser aplicada directamente às zonas onde se deseja obter o controlo dos fungos.

Os exemplos que se seguem ilustram são elaborados de modo limitativo:

o invento mas não

Exemplo I

Foi utilizada na -fermentação uma cultura congelada de Zalerion arboricola MF-5171, ATCC No. 20868, mantida, na colecção de culturas da Merck.

Todo o plano inclinado de uma cultura congelada com 2,5 ml foi descongelado e transferido assépticamente para um frasco com três divisórias de 250 mililitros contendo 40 mililitros de Meio I (composição préviamente detalhada).

)

Meio 1, inoculado com cultura, foi incubado a 26°C durante cinco dias com agitação a 22Θ rpm a fim de se obter um caldo maduro para sementeira.

Os caldos de cultura semeados foram preparados de um modo semelhante a partir do Meio II da composição também préviamente detalhadas. As sementeiras do Meio I e do Meio II foram então inoculadas em 7,5 mililitros de Meio I e de Meio II, respectivamente, a um nível de 5 por cento e incubadas a 26*C a fim de estabelecer o crescimento. No fim deste período, foram adicionados os amino ácidos que se seguem aos tubos separados de cada meio: L-prolina, D-prolina, ácido L-azetidina-2-carhoxí 1 ico, j e 3,4-dihidro-L-prolina, e Composto X como controlo. Os tubos foram incubados a 26'^:'C a 220 rpm durante 14 dias.

No fim deste período o caldo em cada um dos tubos foi diluido com u.m volume igual de metanol, sendo a mistura homogenizada e clarificada por filtração. A mistura de metanol foi submetida a pressão reduzida a fim de remover o metanol e recuperar um resíduo o qual foi. então extraido duas vezes com 10 mililitros de acetato de etilo. A solução de acetato de etilo foi seca sobre sulfato de magnésio.

Em operações separadas, as soluções secas foram concentradas até à secura e reconstituídas com 0,5 ml de metanol. Cada ão diluida coluna de Composto X I)e 8,29 solução resultante foi diluida 1:5, e 10 pl da soluç foram utilizados num ensaio HPLC analítico sobre uma '* Zorbax QDS (DuPont) usando acetonitrilo/água 1:1 com que tinha tempos de retenção de 8,38 minutos (Meio ao qual se o tubo do L-azetidinede retenção um tempo de X .

minutos (Meio II) como controlos. 0 tubo do Meio I tinha adicionado L-prolina e 3,4-dehidro-L-prolina e Meio II ao qual se tinha adicionado L-prolina, ácido carboxílico e 3,4-dehidro-L-prolina revelaram picos variando entre os 7,39-7,43 minutos para além de retenção de 3,23-8,38 minutos atribuível ao Composto

Os ensaios de HPLC bioautográficos foram também realizados nas mesmas amostras de fermentação de 10 pl que tinham sido usadas para HPLC analítica. Foram usados 10 microlitros de amostra por injecção fazendo-se a eluição com acetonitrilo/água (1:1) com uma taxa de fluxo de 1 ml/min e 200 microlitros/corte com um volume de vácuo de 1,5 mililitros. As fracções foram recolhidas numa placa de microtitulação, com 96 recipientes. □ solvente da HPLC foi evaporado e adicionou-se a cada recipiente 0,2 mililitros de caldo de dextrose de batata que tinha sido inoculado com Candida albicans MY-1028 e feito crescer durante 24 horas. Actividade para além da atribuível ao Composta X foi encontrada na amostra obtida a partir do meio ao qual se tinha adieionado 3,4—dehidro—L—prolina na fracção, o que corresponde a um pico encontrado aos 7,57 minutos. Este pico corresponde aos 7,39 a 7,48 minutos encontrados na avaliação analítica de HPLC.

Uma pequena quantidade do composto foi isolada a partir da determinação bioautográfica por HPLC. 0 espectro de massa FAB deste constituinte menos importante a partir da biossíntese dirigida usando 3,4-dehidro-L-prolina revelou um ião com menos 14 unidades de massa do que o Composto X.

mo 1 ecu lar

Exemplo II

Fermentação □s conteúdos de um frasco congelado (aproximadamente 2 mililitros) de cultura MF 5171 (Zalerion arboricola) foram inoculados em 54 mililitros de meio de sementeira KF num frasco de Erlenmeyer de 250 mililitros sem divisórias. A cultura foi incubada a 25^C'C durante 3 dias a 220 rpm num agitador recíproco. Uma amostra da cultura (5 ml) foi inoculada num frasco de Erlenmeyer sem divisórias de 2 litros contendo 500 mililitros de meio de sementeira KF e cultivada, a 25^C'C durante três dias com agitação a 22Θ rpm.

No fim deste período de três dias, 5 mililitros de cultura foram inoculados em cada um dos cinco frascos de Erlenmeyer sem divisórias de 2 litros contendo 500 mililitros do meio de sementeira e cultivados a 25°C durante 3 dias a 220 rpm. Estes frascos foram reunidos e inoculados num recipiente agitado de 75 litros contendo 50 litros do meio de produção com a composição que se segue;

)

Meio de Produção

Material

Licor daturado de milho (MH₄)₂so₄

Água, de unto

CoC 1 óH.-JJ éleo de fígado de bacalhau Pasta de tomate Citrato de Na G1icero1

Polietilene glicol 2000 pH = 7,0 antes da esteri1icação

Concentração (q/L)

5, O mL 2,0 5,0

10,0 mg 2,0 mL 5,0 2,0

75,0 2,0 ml_ a 121 ^C’C durante 35 minutos

A cultura foi mantida, durante S dias a 25-'C com uma taxa de agitação de 300 rpm e um fluxo de ar de 5 1itros/minuto. Em seguida, o caldo de fermentação foi recolhido para isolamento.

Isolamento □ caldo de cultura total do lote de fermentação de 70 litros anterior foi filtrada e a massa micelial foi extraida com 10 litros de metanol. 0 extracto de metanol foi filtrado e diluido com 10 litros de ãgua e adsorvido para 1,2 litros de resina. HP-20 e eluido com 1007. de metanol. D corte rico em metanol, com um valor de 1.500 mililitros, foi concentrado até 150 mililitros.

□ concentrado foi diluido até uma mistura de 407. de metanol/607. de água e adsorvido em 200 mililitros de HP-20. A coluna foi lavada suoessivamente com metanol/água (50:50), ãgua, e acstonitrilo/águ.a Cz5:50), sendo então os metabolitos eluidos da coluna com acetonitrilo/água (50:50).

Setenta mililitros dos 400 mililitros do corte da adsorção em HP-20, rico em actividade biológica, foi diluido até 300 mililitros com égua, filtrado e carregado com uma taxa de fluxo de 10 ml/min para uma coluna de Zorbax ODS de SS mililitros que tinha sido equilibrada com acetonitrilo/água (12,5/67,5). A coluna foi eluida com uma taxa de fluxo de 20 mili1itros/minuto com acetoni tri lo/áqu.a (40/60), seguindo-se acetonitrilo/água (50/50). Ds compostos foram eluidos com acetonitrilo/água 50/50. A coluna foi monitorizada por meio de UV a 210 nm e os ensaios anti-fúngicos com Can d ida, al bicans MY-1028, e as avaliações por meio de HPLC analítica foram realizadas nas fracções. Tendo como base estas análises, certas fracções foram c ombi nad as»

Uma amostra das fracções combinadas após concentração até à secura e avaliação por HPLC analítica revelou ser constituída por uma. mistu.ra. 1 : 1 de Composto X e de Composto I .

A amostra anterior cujo teor ia até cerca de 7,5 mg de Composto X e 7,5 mg de Composto I em 3,2 mililitros de metanol foi diluida até 10 mililitros com água e injeutada numa uoluna Dyna.ma.x “-60 ΑΘμΜ CIS 21,4 mn ID x 25 cm (equipada, com uma coluna ds vigia de 5 cm (Rainin Instrument Co., Inc. Woburn, HA)) que tinha sido préviamente equilibrada cc<m acetonitrilo/água (60/40). A mistura foi então eluida com o mesmo eluente acetonitrilo/água a 10 mi 1i1itros/minuto à temperatura ambiente e foram recolhidas fracções cada uma delas com 15 mililitros. Trinta minutas após a injecção, foi iniciado um gradiente linear durante 60 minutos o qual aumentou a concentração de acetonitrilo de 40 por cento para 60 por cento. As avaliações a 210 nm e a. subsequente análise por con tendo

Composto

HF'LC dos cortes indicou oue existiam três fracções Composto I„ A fracção mediana contendo a maior parte do I e a sua porção mais pura foi concentrada até à secura e foi feita uma determinação espectral da massa preliminar.

Qs espectros de massa por bombardeamento atómico rápido litiado ÍFAB-MS) indicou um peso molecular de 1064. Ds espectros de massa por cromatograma gasoso (GC-MS> do derivado trimetilsilílico (TMS) do hidrolísado ácido total indicaram como componentes principais a treonina, 4—hidroxiprol ina, um produto de oxidação do composto afim da ornitina, ácido 3-hidrox.ig lutamico, um ácido aordo C,, e 3-hidroxiprolina. Na base desta análise, foi proposta a estrutura do Composto I.

componente desta fracção foi ainda purificado dissolvendo a fracção em 33 μΐ de metanol , 100 μΐ de áqua e 10 μΐ de ãcido triflucroacético (TFA) e cromatografando a solução resultante numa coluna de Dynamax-óO A C18 10 mm ID 25 cm que tinha sido equilibrada com 557. de 0,17. de TFA em água/457, de acetonitrilo. A eluição com o mesmo sistema solvente a 4 ml/min á temperatura ambiente levou três fracções a terem um pico de adsorção 2T0 nm. Duas das fracções foram evaporadas até à secura e analisadas por ¹H RMN. ¹H RMN preliminar apoiou a fórmula do Composto I.

Uma amostra purificada do compostç I tem ' espectrais de massa préviamente detalhados de H RMN da Figura 1 e de ^-'C RMN.

)

EXEMPLO III

Cinquenta mililitros de meio de sementeira KF num frasco de Erlenmeyer sem divisórias foram inoculados com frasco congelado de Z arboricola e agitados a 220 rpm e 25°C durante 72 horas. Dois mililitros desta sementeira foram usados para inocular 50 mililitros de meio KF e foram horas. 0 segunda estadia foi usado produção.

feitos crescer durante 72 para inocular o meio de

')

Quarenta mililitros de meio préviamente detalhado como meio S-6 em frascos de Erlenmeyer sem divisórias de 250 mililitros foram inoculados com 2 mililitros de sementeira e os frascos foram agitados a 220 rpm e 25*C durante 14 dias. Reuniu—se um total de 125 frascos a fim de se obter 5 litros do caldo de cultura, final.

caldo de cultura total foi filtrado sob vácuo através de uma camada com 1 polegada de Super-Cel(Manvi11e). NSo foi detectada qualquer actividade no caldo de cultura filtrado. A massa micelial foi extraida com 1 litro de metanol durante a noite com agitação. 0 extracto de metanol foi ensaiado quanto à presença de componentes biosctivos usando um ensaio de difusão em disco com C. albicans MY 1028 e ensaio com HPLC íacetcnitri1o/fos fato de potássio 0,01 M 50/50, pH 7,0) e comparando os resultados com uma amostra obtida previamente do Composto X como padrão. □ extracto de metanol foi diluído até uma concentração final de metanol aquoso a 50 por cento e adsorvido numa coluna HP-20 de 200 mililitros com uma taxa de fluxo de 20 ml/min. A coluna foi lavada com tres volumes da coluna de metanol aquoso a 50 por cento. A actividade foi eluida com seis volumes da coluna de metanol aquoso a 75 por cento. Os componentes desejados foram as fracções apropriadas com Composto I e Composto X foram combinados até 1,7 litros.

A amostra contendo componentes bioactivos foi diluida com 1,7 litros de água para obter uma composição metanol/água 50:50 e a composição foi filtrada a fim de remover partículas .insolúveis. Esta preparação foi então adsorvida numa coluna.

.or ba;·;

0,05 de aS mililitros (pré-equi1ibrada :om metanol/água

50:50) a 20 ml/mirt. A coluna foi eluida com acetonitrilo/áqua foram colhidas fracções de vinte mililitros após um volume de vácuo de 30 mililitros. At cromatograf ia foi monitorizada por meio cie UV a 210 nm, por meio de HMLC analítica e por meio de bioensaio anti-fúngico (C. albicans MY 1028). Certas fracções foram combinadas, tendo como base principalmente HPLC analítica; uma. mistura de Composto I e de Composto X que ia até 80 miligramas revelou conter 19,8 miligramas de Composto I.

)

EXEMPLO IV

Os conteúdos de um frasco de micélio vegetativo congelado de Zalerion arboricola, ATCC 20863, foram descongelados e usados para, inocular 54 mililitros de meio de sementeira KF o qual foi então incubado durante 3 dias a 25°C a 220 rpm num agitador rotativo com um lançamento de 5 centímetros a fim de produzir uma cultura de sementeira.

Porções de dois mililitros de cultura, de sementeira foram inoculadas num frasco de Erlenmeyer de 250 mililitros contendo 5€* mililitros de meio TG103 e incubadas durante 5 dias a 25*C com agitação.

No fim deste período, o caldo de fermentação foi recolhido. Ao ser recolhido, a cultura líquida foi centrifugada a fim de separar a.s células da cultura flutuante. As células foram misturadas com uma porção de 20 ml de metanol e a extracção foi deixada continuar durante a. noite à temperatura ambiente. Os sólidos foram removidos por centrifugação, e o extracto metanólico foi então injectado numa coluna “Ultrasphere (Beckman Enqineering) de 5 μ (4,6 mm x 25 cm) que foi eluida isocráticamente com acetonítrilo/áqua 48/52 com uma taxa de fluxo de €*,75 ml/min. 0 efluente foi monitorizada a 210 nm, e foram recolhidas fracções de 0,25 ml em placas de microtitulação com 76 recipientes. O solvente foi removido a partir das placas in vacuo, e as placas foram ensaiadas quanto à biocativida.de colocando em cada recipiente um extracto de levedura, peptona, caldo de dextrose e da composição que se sequ.e:

í YEF'D) q/litro

Extracto de levedura Bacto 10

Peptona Bacto 20

D e x t r o s e 2 0 sem ajustamento do pH que tinha sido semeada com Candida albicans MY 102 durante a noite a 37^,;‘C. Ds resultados revelaram Composto I. 0 Composta X é também produzido.

J e incubando produção do )

EXEMPLO V

Foram preparados frascos de 250 molilitros contendo 54 mililitros de Meio de sementeira KF (préviamente indicado) e um plano inclinado de aqar de MF5404 Z_.

incubados a 25°C durante quatro dias a amostra de 20 mililitros para inocular inoculados a partir de arboricola ATCC 20957 e

220 rpm. Foi usada uma cada um de quatro frascos de litros contenda 500 ml de meio KF.

Os frascos foram incubados a 25°C durante três dias a 220 rpm. Os conteúdos dos frascos foram então reunidos para utilização como um inóculo para um fermentador de sementeira de 300 litros contendo 180 litros de meio KF e 2 ml/litro de polipropilene glicol P-2000 (Dow Chemical Co.) adicionados para reduzir a formação de espuma. 0 fermentador da sementeira foi operado durante três dias a uma temperatura de 25°C, um fluxo de ar de 90 litros/min, uma pressão de calibre 0,7 kg/cm* , e uma velocidade de agitação de 200 rpm. Foi usada uma amostra de 25 litros para de produção de 800 litros contendo 475 composição préviamente indicada mas aos quais tinham sido adicionados 2 ml/litro de polipropilene glicol P-2000 e esterilizados a 120°C durante 25 minutos. A fermentação foi realizada durante cinco dias a uma temperatura de 25°C, com um fluxo de ar de 250 litros/minuto, uma pressão de calibre 0,7 kg/cm-, e uma velocitade do agitador de 150 rpm. Deixou-se o pH descer para um valor inicial de 6,0 a 5,5, sendo então mantido a 5,5 ± 0,4 usando MaCH e H^SO^. Após cinco dias o caldo dos dois lotes foi recolhido para isolamento do produto.

inocular um fermentador litros de Meio TG103 da óetecentos e cinquenta litros de metanol foram adicionados a 750 litros de caldo total de fermentação e a mistura foi agitada, durante 8 horas. □ extracto do caldo de fermentação total foi centrifugado a fim de remover os sólidos de fermentação )

insolúveis e para proporcionar 1436 litros de produto flutuante clarificado, cujo pH foi ajustado para pH 7.

Uma camada de 77 litros de Diaion SP-207 (Mitsubishi Chemical Industries) foi preparada lavando com metanol e pré— -equilibrando com metanol água 50:50 (Me 40H/H_o0). 0 produto flutuante clarificado foi então carregado para SP-207 numa direcção do fluxo para cima com uma taxa da camada fluidificada de 5,7 litros por minuto. Após carregamento, a coluna foi lavada com 567 litros de metanol água 65:35 e eluida com 454 litros de metanol a 1007.

Os cortes S0-207 Me0H/H_o0/H_o0 65:35 e 1007. MeOH da coluna SP-207 foram combinados e ajustados até uma composição de Me0H/H_o0 50:50 pela adição de H_,Q para proporcionar um corte rico de 945 litros. Este corte rico foi carregada numa coluna Diaion HP-20 de 108 litros (lavada com metanol e pré-equi1ibrada com MeOH/H^.0 50:50) com uma taxa de fluxo de 2-4 litros por minuto. A resina foi então lavada com 567 litros de MeOH/H^O 65:35 e eluida com 454 litros de 1007. de MeOH.

corte de HP-20 rico em Composto I foi concentrado até um volume de 6 litros, por meio de uma primeira diluição com H_o0 e em seguida por adsorção e eluição a partir de uma coluna HP-20 mais pequena (1O litros) de um modo semelhante ao utilizado na coluna HP-20 maior.

Dois litros (de um total de 6 litros) do corte rico de HP-20 concentrado foram diluídos com 2 litros de água e carregados num sistema HPLC Preparativo 80OA (Tecnologia de Separações) equipado com uma coluna CIS de 3,9 litros (Amicon) pré—lavada com MeOh e pré-equ.i 1 ibrada com MeOH/H-,0 50:50. A carga foi seguida por SOO mililitros de Me0H/H₂0 50:50 e eluida com uma taxa de fluxo de 212 ml/min com um gradiente linear a partir de MeOH/H^O

50:50 a I00 par cento de MeOH num períada de tempo de 60 minuto Ae fracções foram analisadas por meio de HPLC·, combinadas concentradas até á secura para proporcionarem aproximadamente gramas de Composto I com SS por cento de pureza.

.)

Exemplo VI

A partir do concentrado de 6 litros do corte de HP-20 rico em Composto I obtido tal como foi descrito no Exemplo V, foram retirados 900 mililitros para purificação.

A 900 mililitros adicionou-se um volume iqual metanol e adicionaram-se à solução resultante 900 mililitros âgua, 900 mililitros de hexano e 900 mililitros isopropilo agitando-se vigorosamente. Resultou ae de de acet •cA to de uma emulsão inseparável, adicionando-se então 450 mililitros de metanol para se obter duas camadas. A camada inferior com 2,5 litros foi adicionada a 900 mililitros de hexano, 900 mililitros de acetato de isopropilo e 450 mililitros de metanol e de novo agitação vigorosa recuperando-se uma camada inferior de 3 litros. 0 passo de separação foi realizado uma terceira vez na camada inferior a fim de qerar uma outra camada inferior de 3 litros.

A camada inferior final a partir das experiências de separação foi concentrada até á secura. 0 resíduo (4 gramas) foi adicionado a 50 mililitros de uma mistura de CH₇C1^/CH_.OH/57.CH^COOH (72,5/27,5/10) e em seguida foi dissolvido na camada inferior. Esta solução foi cromatografada sobre 2 litros de gel de sílica (malha 230-400) a 50 ml/min usando o mesmo CH^Cl_n/CH_,0H/57CH_,C00K (72,5/27,5/10) (72,5/27,5/10) como a fase móvel para se obter Composto I de elevada pureza separado de componentes importantes.

menos

Exemplo VII

Ι,,ΟΟΘ comprimidos prensados contendo cada um miligrama de Composto I são preparados a partir da formulação que se segue

Gramas

Composto I

Amido

Fosfato de cálcio dibésico hídrico Estearato de cálcio

500

750

5.000

Us granulados ingrediente com IO por s reduzidos a pó fino são bem cento de pasta de amido. A g misturado ranu1ação seca e prensada em comprimidos.

Exemplo VIII

1.0Θ0 cápsulas de gelatina dura, contendo cada uma 210 miligramas de Composto IA são preparadas a partir da. formulação que se segue:

Composto

Gramas

Composto I	5C0
Amido	250
Lactose	750
T a. 1 c o	250
Estearato de cálcio	10

έ preparada uma mistura uniforme dos ingredientes por mistura que é usada para introduzir em cápsulas de gelatina dura de duas peças.

Exemplo IX

Um unguento apropriada para aplicação tópica pode ser preparado dispersando íntimamente 13 miligramas de Composto I em 1 grama de gel polietileno/hidrocarboneto comercialmente disponível .

)

Exemplo X

Uma suspensão	injectável (IM) pode ser preparada como
se segue:

	mq / m 1
Composto I	1 0,0
Celulose metílica	5,0
Tween	0,5
Álcool benzilico	?,0
Cloreto de benzalcónio	1 , ©
Água	até 1 ml Exemplo XI Por Lata
Composto I	24 mg
Concentrado líquido de	1,2 mg
Lecitina MF
Triclorofluorometano	4,025 g
Diclorod ifluorometano	12,15 g

Claims

REIVINDICAÇÕES lâ. - Método para a produção de um composto tendo a fórmu1a HO OH HO OH caracterizado por compreender a cultura de Zalerion arboricola num meio nutritivo em que esteja presente um aminoácido não natural como fonte principal de azoto. 2â. - Método para a produção do composto da Reivindicação 1, caracterizado por compreender a cultura de Zalerion arboricola ATCC 203ó3 num meio nutritiva enriquecido em manitol como a principal fonte de carbono. Ta cação 1 com um der a cultura que contem.·: Método para a produção do composto da Reivindirendimento aumentado, caracterizado por compreende Zalerion arboricola num meio nutritivo aquoso )

(1) uma fonte de carbono compreendendo manitol.
(2) uma fonte de azoto compreendendo um hidrolisado de proteina do leite, e (3) um tampão compreendendo glicina ou um fosfato inorgânico.

4ê. -· Método de acordo com a Reivindicação 3, rizado por o meio nutritiva utilizado conter também vestigiais e ácido láctico.

caracteelementos

5è« - Método de acordo com a Reivindicação 4, caracterizado por o meio nutritivo utilizado conter, adicionalmente, um óleo vegetal seleccionado de entre óleos de soja, amendoim ou girassol.

óé. - Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado por o composto preparado ser denominada

O por l-C4,5-di-hidroxi-N^x'-< 10,12-dimetil-l-oxotetradecil) -ornitinaJ-5- (3-hidrDxi-g lutamina)-6-E3-hidroxi-prol inalequinocandina B.

7â. - Processo para a preparação de uma composição, caracterizado por se incluir na referida composição o composto preparado de acordo com qualquer uma das Reivindicações 1 a. ó, misturado com um veículo farmaceuticamente aceitável.

8â. - Processo de acordo com a Reivindicação 7, caracterizado por se preparar uma composição que é útil para a inibição do crescimento dos fungos.

9é. - Processo de acordo com a Reivindicação 8, terizado por se preparar uma composição que é útil para o mento de Rnsumocystis carinii.

caractrata)

10â. - Método para a inibição do crescimento das fungos, caracterizado por compreender a aplicação à superfície onde o seu crescimento deva ser controlado de uma maneira eficaz contra os fungos do composto preparado de acordo com qualquer uma das Reivindicações 1 a 6, sendo a gama de dosagem eficaz de 5 a IO mg por quilograma duas vezes ao dia durante 4 dias.

llã. - Método para α tratamento de ou para a prevenção de infecçSes pelo Pneumocystis carinii em mamíferos, caracterizado por compreender a administração a mamíferos de uma quantidade anti-infecciosa do composto preparado de acordo com qualquer uma das Reivindicações 1 a 6, sendo a gama de dosagem eficaz de 1 a IO mg por quilograma quatro vezes ao dia.

12â. - Processo para a preparação de um meio nutritivo útil para a produção de rendimentos aumentados do composto preparado de acordo com qualquer uma das Reivindicações la 6, caracterizado por se incluir no referido meio nutritivo, em gramas por litro de meio aquosa: D-manital, 20-100; KH^PO^, 0,5-3; glicina, 1-4; leite peptonizado, 2-20; ácido láctico, 0-3; solução de elementos vestigiais, 0-15 ml; e óleo vegetal, 0-20.

13â. - Método para aumentar a taxa de produção do composto de fórmula. (I), referida na reivindicação 1, caracterizada par compreender a cultura da Zalerion arboricola em meio nutritivo que contem manitol numa, quantidade de pelo menos 4 por cento em peso e mantendo o pH a cerca de 5,5.

14â. - Processo para a preparação de um meio nutritivo útil para aumentar a taxa de produção do composto com a fórmula I, referida na Reivindicação 1, caracterizado por se incluir, no referida meio nutritivo, carbono assimilável, azoto assimilável e sal orgânico que contenha pelo menos 4 por cento em peso de manitol e um tampão para manter o pH a cerca de 5,5.

15â. - Método para produzir um composto com a fórmula (I) referida na Reivindicação 1, como o produto principal, caracterizado por compreender a cultura de MF 5404 Zalerion arhoricola ATCC 20957 num meio nutritivo contendo fontes assimiláveis de carbono, azoto e sais inorgânicos em condiçSes aeróbicas até ser produzida uma quantidade suficiente do composto com a fórmula (I) separando em seguida o produto do meio.