JPH0767666A - フェレドキシン及びフェレドキシン還元酵素を同時に発現させるキメラｐ４５０産生菌株 - Google Patents
フェレドキシン及びフェレドキシン還元酵素を同時に発現させるキメラｐ４５０産生菌株Info
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- JPH0767666A JPH0767666A JP6190653A JP19065394A JPH0767666A JP H0767666 A JPH0767666 A JP H0767666A JP 6190653 A JP6190653 A JP 6190653A JP 19065394 A JP19065394 A JP 19065394A JP H0767666 A JPH0767666 A JP H0767666A
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- terminal
- chimeric
- reductase
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- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02P—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES IN THE PRODUCTION OR PROCESSING OF GOODS
- Y02P20/00—Technologies relating to chemical industry
- Y02P20/50—Improvements relating to the production of bulk chemicals
- Y02P20/52—Improvements relating to the production of bulk chemicals using catalysts, e.g. selective catalysts
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- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
(57)【要約】
【構成】Ｎ末端のミクロソームへの局在化シグナル配列
とＣ末端の成熟型のミトコンドリア型Ｐ４５０からなる
キメラＰ４５０、フェレドキシン及びフェレドキシン還
元酵素を同時に発現させるプラスミドおよびＮ末端のミ
クロソームへの局在化シグナル配列とＣ末端の成熟型の
ミトコンドリア型Ｐ４５０からなるキメラＰ４５０、フ
ェレドキシン及びフェレドキシン還元酵素を同時に発現
する酵母菌株。 【効果】本発明により、キメラＰ４５０はミクロソーム
画分に存在し、また酵母ミクロソーム膜上でＡＤＲから
ＡＤＸを経てキメラＰ４５０という電子伝達系を構築す
ることに成功した。したがって、本発明プラスミドを保
持する酵母菌株をステロイド化合物や活性型ビタミンＤ
3 などの水酸化反応に１ステップで行うことができる簡
便なバイオリアクターとして利用できる。特に、菌体培
養液中に基質を添加し、一定時間後に有機溶媒等で抽出
することにより容易に反応産物を回収することができる
ため、バイオリアクターとして有用である。
とＣ末端の成熟型のミトコンドリア型Ｐ４５０からなる
キメラＰ４５０、フェレドキシン及びフェレドキシン還
元酵素を同時に発現させるプラスミドおよびＮ末端のミ
クロソームへの局在化シグナル配列とＣ末端の成熟型の
ミトコンドリア型Ｐ４５０からなるキメラＰ４５０、フ
ェレドキシン及びフェレドキシン還元酵素を同時に発現
する酵母菌株。 【効果】本発明により、キメラＰ４５０はミクロソーム
画分に存在し、また酵母ミクロソーム膜上でＡＤＲから
ＡＤＸを経てキメラＰ４５０という電子伝達系を構築す
ることに成功した。したがって、本発明プラスミドを保
持する酵母菌株をステロイド化合物や活性型ビタミンＤ
3 などの水酸化反応に１ステップで行うことができる簡
便なバイオリアクターとして利用できる。特に、菌体培
養液中に基質を添加し、一定時間後に有機溶媒等で抽出
することにより容易に反応産物を回収することができる
ため、バイオリアクターとして有用である。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、Ｎ末端のミクロソーム
への局在化シグナル配列とＣ末端の成熟型のミトコンド
リア型Ｐ４５０からなるキメラＰ４５０に関する。さら
に具体的には、ミクロソームへの局在化シグナルと考え
られているウシ副腎Ｐ４５０17αのＮ末端１５アミノ酸
残基からなるシグナル配列と５０１アミノ酸からなる成
熟型ラット肝ミトコンドリアＰ４５０C25 からなるキメ
ラ体Ｐ４５０、フェレドキシン及びフェレドキシン還元
酵素を同時に酵母内で大量生産させる発現プラスミドに
関する。さらに、Ｎ末端のミクロソームへの局在化シグ
ナル配列とＣ末端の成熟型のミトコンドリア型Ｐ４５０
からなるキメラＰ４５０、フェレドキシン及びフェレド
キシン還元酵素を同時に発現する酵母菌株に関する。
への局在化シグナル配列とＣ末端の成熟型のミトコンド
リア型Ｐ４５０からなるキメラＰ４５０に関する。さら
に具体的には、ミクロソームへの局在化シグナルと考え
られているウシ副腎Ｐ４５０17αのＮ末端１５アミノ酸
残基からなるシグナル配列と５０１アミノ酸からなる成
熟型ラット肝ミトコンドリアＰ４５０C25 からなるキメ
ラ体Ｐ４５０、フェレドキシン及びフェレドキシン還元
酵素を同時に酵母内で大量生産させる発現プラスミドに
関する。さらに、Ｎ末端のミクロソームへの局在化シグ
ナル配列とＣ末端の成熟型のミトコンドリア型Ｐ４５０
からなるキメラＰ４５０、フェレドキシン及びフェレド
キシン還元酵素を同時に発現する酵母菌株に関する。
【０００２】
【従来の技術】以下、本明細書で用いるキメラ体Ｐ４５
０という言葉は、Ｎ末端のミクロソームへの局在化シグ
ナル配列と、Ｃ末端の成熟型のミトコンドリア型Ｐ４５
０からなるＰ４５０を意味する。Ｐ４５０は微生物から
哺乳動物にいたるまで広く生物界に存在するヘムタンパ
ク質であり、電子伝達系の末端酵素として種々の脂溶性
化合物を基質として１原子酸素添加反応を触媒する。電
子伝達系の末端酵素であるＰ４５０は分子種が多様であ
り、それぞれが異なる基質特異性を示すので、非常に広
範囲の脂溶性化合物を水酸化することができる。哺乳動
物のＰ４５０依存性電子伝達系はその構成酵素から、ミ
クロソーム型とミトコンドリア型に分けられる。前者で
は、フラビンアデニンジヌクレオチドとフラビンモノヌ
クレオチドを分子内に補酵素として含有するＮＡＤＰＨ
−チトクロムＰ４５０還元酵素（還元酵素）がＮＡＤＰ
Ｈからの電子をＰ４５０へ供給し、後者では、フラビン
アデニンジヌクレオチドを補酵素として分子内に含有す
るＮＡＤＰＨ−フェレドキシン還元酵素、および、非ヘ
ム鉄を補酵素として分子内に含有するフェレドキシンが
ＮＡＤＰＨからの電子をＰ４５０へ供給することによ
り、種々の脂溶性基質に対して水酸化反応を触媒する。
０という言葉は、Ｎ末端のミクロソームへの局在化シグ
ナル配列と、Ｃ末端の成熟型のミトコンドリア型Ｐ４５
０からなるＰ４５０を意味する。Ｐ４５０は微生物から
哺乳動物にいたるまで広く生物界に存在するヘムタンパ
ク質であり、電子伝達系の末端酵素として種々の脂溶性
化合物を基質として１原子酸素添加反応を触媒する。電
子伝達系の末端酵素であるＰ４５０は分子種が多様であ
り、それぞれが異なる基質特異性を示すので、非常に広
範囲の脂溶性化合物を水酸化することができる。哺乳動
物のＰ４５０依存性電子伝達系はその構成酵素から、ミ
クロソーム型とミトコンドリア型に分けられる。前者で
は、フラビンアデニンジヌクレオチドとフラビンモノヌ
クレオチドを分子内に補酵素として含有するＮＡＤＰＨ
−チトクロムＰ４５０還元酵素（還元酵素）がＮＡＤＰ
Ｈからの電子をＰ４５０へ供給し、後者では、フラビン
アデニンジヌクレオチドを補酵素として分子内に含有す
るＮＡＤＰＨ−フェレドキシン還元酵素、および、非ヘ
ム鉄を補酵素として分子内に含有するフェレドキシンが
ＮＡＤＰＨからの電子をＰ４５０へ供給することによ
り、種々の脂溶性基質に対して水酸化反応を触媒する。
【０００３】本発明者らはすでに、数種のミクロソーム
型Ｐ４５０及び還元酵素を酵母内で生産させ、それらの
組換え体酵母菌株を用いることにより、工業的に有用な
水酸化反応を行うことに成功した。すなわち、ラット肝
Ｐ４５０c 遺伝子、ウシ副腎Ｐ４５０17α遺伝子やＰ４
５０c21 遺伝子をそれぞれ単離し、これらの遺伝子を含
む発現プラスミドを作製し、これら発現プラスミドで酵
母を形質転換することにより、該酵素を産生する酵母菌
株を得た（特開昭６１−５６０７２、特開平１−４７３
８０、特開平２−３１６８０）。これらの酵母菌株はそ
れぞれのＰ４５０分子種に依存した１原子酸素添加活性
を示した。また、ラット肝還元酵素遺伝子や酵母還元酵
素遺伝子を単離し、Ｐ４５０還元能を有する該酵素の酵
母内発現に成功した（特開昭６２−１９０８５、特開平
２−５１５２５）。さらに、発明者らは、Ｐ４５０と還
元酵素の両酵素を産生する酵母菌株（特開昭６２−１０
４５８２）や両酵素の機能を１分子内に併せ持つ新規モ
ノオキシゲナーゼの作出に成功した（特開昭６３−４４
８８８、特開平２−２３８７０、特願平１−７１２５
０）。こうした技術により、本発明者らはこれらＰ４５
０産生酵母菌株を用いて、医薬品として有用なアセトア
ミノフェンやステロイドホルモン中間体の製造を可能に
した。
型Ｐ４５０及び還元酵素を酵母内で生産させ、それらの
組換え体酵母菌株を用いることにより、工業的に有用な
水酸化反応を行うことに成功した。すなわち、ラット肝
Ｐ４５０c 遺伝子、ウシ副腎Ｐ４５０17α遺伝子やＰ４
５０c21 遺伝子をそれぞれ単離し、これらの遺伝子を含
む発現プラスミドを作製し、これら発現プラスミドで酵
母を形質転換することにより、該酵素を産生する酵母菌
株を得た（特開昭６１−５６０７２、特開平１−４７３
８０、特開平２−３１６８０）。これらの酵母菌株はそ
れぞれのＰ４５０分子種に依存した１原子酸素添加活性
を示した。また、ラット肝還元酵素遺伝子や酵母還元酵
素遺伝子を単離し、Ｐ４５０還元能を有する該酵素の酵
母内発現に成功した（特開昭６２−１９０８５、特開平
２−５１５２５）。さらに、発明者らは、Ｐ４５０と還
元酵素の両酵素を産生する酵母菌株（特開昭６２−１０
４５８２）や両酵素の機能を１分子内に併せ持つ新規モ
ノオキシゲナーゼの作出に成功した（特開昭６３−４４
８８８、特開平２−２３８７０、特願平１−７１２５
０）。こうした技術により、本発明者らはこれらＰ４５
０産生酵母菌株を用いて、医薬品として有用なアセトア
ミノフェンやステロイドホルモン中間体の製造を可能に
した。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】一方、ミトコンドリア
型Ｐ４５０に関しては、ミトコンドリア型Ｐ４５０分子
種であるラット肝Ｐ４５０c25 依存性の１原子酸素添加
活性を発揮する酵母菌株を創製した（特願２−２５８２
６２）。 しかし、ラット肝Ｐ４５０c25 依存性の１原
子酸素添加活性を発揮する酵母菌株におけるＰ４５０c2
5 産生量は低く、菌体当たりの活性が低かったため、本
発明者らは、さらに大量にＰ４５０c25 を産生する酵母
菌株を創製することを目的とした。さらに、ラット肝Ｐ
４５０c25 依存性の１原子酸素添加活性発現にはＰ４５
０c25 の他、ウシ副腎アドレノドキシン（以下、ＡＤＸ
と略す）およびウシ副腎アドレノドキシン還元酵素（以
下、ＡＤＲと略す）の２酵素が必要である。そこで本発
明者らは、１ステップの１原子酸素添加活性発現のバイ
オリアクターの作出を試みた。
型Ｐ４５０に関しては、ミトコンドリア型Ｐ４５０分子
種であるラット肝Ｐ４５０c25 依存性の１原子酸素添加
活性を発揮する酵母菌株を創製した（特願２−２５８２
６２）。 しかし、ラット肝Ｐ４５０c25 依存性の１原
子酸素添加活性を発揮する酵母菌株におけるＰ４５０c2
5 産生量は低く、菌体当たりの活性が低かったため、本
発明者らは、さらに大量にＰ４５０c25 を産生する酵母
菌株を創製することを目的とした。さらに、ラット肝Ｐ
４５０c25 依存性の１原子酸素添加活性発現にはＰ４５
０c25 の他、ウシ副腎アドレノドキシン（以下、ＡＤＸ
と略す）およびウシ副腎アドレノドキシン還元酵素（以
下、ＡＤＲと略す）の２酵素が必要である。そこで本発
明者らは、１ステップの１原子酸素添加活性発現のバイ
オリアクターの作出を試みた。
【０００５】
【課題を解決するための手段】ラット肝Ｐ４５０c25
は、５３３アミノ酸からなる前駆体として細胞質で合成
されたのち、ミトコンドリアに輸送される。その際、ミ
トコンドリアのシグナルとして機能するアミノ末端部分
の３２アミノ酸が除去され、５０１アミノ酸からなる成
熟型Ｐ４５０c25 （分子量約５７ｋＤ）がミトコンドリ
ア膜に局在する。一方、Ｐ４５０17αはウシ副腎ミクロ
ソームの酵素で、Ｎ末端の疎水性アミノ酸配列がミクロ
ソームへの局在化シグナルとして機能する。そこで、本
発明者らは、本来ミトコンドリアに存在する酵素をミク
ロソームに局在化させることにより酵母内での産生量を
上昇させることを目的として、ラット肝Ｐ４５０c25 の
ミトコンドリア移行シグナル部分をミクロソーム膜への
挿入のためのシグナルと考えられるウシ副腎Ｐ４５０17
αのＮ末端１５アミノ酸に置換したキメラＰ４５０c25
を酵母で発現させるプラスミドを構築した。また、キメ
ラＰ４５０c25 、ＡＤＸおよびＡＤＲがミクロソーム膜
上で電子伝達系を構築し、モノオキシゲナーゼ活性を発
揮することを目的としてキメラＰ４５０c25 、成熟型Ａ
ＤＸおよび成熟型ＡＤＲの３酵素を同時に発現するプラ
スミドを構築した。その際、同一のプロモーター、ター
ミネーターを用いると酵母の継代培養中にプラスミド内
での組み換えが起こることから、３酵素を別々のプロモ
ーター、ターミネーターにより発現させた。
は、５３３アミノ酸からなる前駆体として細胞質で合成
されたのち、ミトコンドリアに輸送される。その際、ミ
トコンドリアのシグナルとして機能するアミノ末端部分
の３２アミノ酸が除去され、５０１アミノ酸からなる成
熟型Ｐ４５０c25 （分子量約５７ｋＤ）がミトコンドリ
ア膜に局在する。一方、Ｐ４５０17αはウシ副腎ミクロ
ソームの酵素で、Ｎ末端の疎水性アミノ酸配列がミクロ
ソームへの局在化シグナルとして機能する。そこで、本
発明者らは、本来ミトコンドリアに存在する酵素をミク
ロソームに局在化させることにより酵母内での産生量を
上昇させることを目的として、ラット肝Ｐ４５０c25 の
ミトコンドリア移行シグナル部分をミクロソーム膜への
挿入のためのシグナルと考えられるウシ副腎Ｐ４５０17
αのＮ末端１５アミノ酸に置換したキメラＰ４５０c25
を酵母で発現させるプラスミドを構築した。また、キメ
ラＰ４５０c25 、ＡＤＸおよびＡＤＲがミクロソーム膜
上で電子伝達系を構築し、モノオキシゲナーゼ活性を発
揮することを目的としてキメラＰ４５０c25 、成熟型Ａ
ＤＸおよび成熟型ＡＤＲの３酵素を同時に発現するプラ
スミドを構築した。その際、同一のプロモーター、ター
ミネーターを用いると酵母の継代培養中にプラスミド内
での組み換えが起こることから、３酵素を別々のプロモ
ーター、ターミネーターにより発現させた。
【０００６】
【発明の効果】発現された、ほとんどのキメラＰ４５０
c25 はミクロソーム画分に存在した。従って、Ｐ４５０
17α由来のＮ末端１５アミノ酸残基が酵母内でミクロソ
ーム膜へのシグナルの役割を果たし、本来はミトコンド
リアの膜蛋白であるＰ４５０c25 を酵母ミクロソームで
発現させることに成功した。また、キメラＰ４５０c25
産生量は菌体当たり約２×１０5 分子であり、シグナル
の置換によりＰ４５０c25 の産生量を約１０倍上昇させ
ることができた。さらに、ミクロソーム画分は、ＡＤＸ
とＡＤＲを添加することにより、ＴＨＣ、ビタミンＤ3
、１α−ヒドロキシビタミンＤ3 に対し、高い水酸化
活性を示した。特に、１α−ビタミンＤ3 に対する水酸
化活性は元の５０１アミノ酸からなる成熟型Ｐ４５０C2
5 よりもはるかに高く、１５アミノ酸残基の付加がＰ４
５０C25 の膜における存在状態を変化させ、活性を上昇
させたと思われる。また、キメラＰ４５０C25 、ＡＤＸ
およびＡＤＲの同時発現株はモノオキシゲナーゼ活性を
発揮しているので、本発明者らは、酵母ミクロソーム膜
上でＡＤＲからＡＤＸを経てキメラＰ４５０C25 という
電子伝達系を構築することに成功した。従って、この菌
株をステロイド化合物や活性型ビタミンＤ3 などの水酸
化反応に１ステップで行うことができる簡便なバイオリ
アクターとして利用できる。特に、菌体培養液中に基質
を添加し、一定時間後に有機溶媒等で抽出することによ
り容易に反応産物を回収することができるため、バイオ
リアクターとして有用である。
c25 はミクロソーム画分に存在した。従って、Ｐ４５０
17α由来のＮ末端１５アミノ酸残基が酵母内でミクロソ
ーム膜へのシグナルの役割を果たし、本来はミトコンド
リアの膜蛋白であるＰ４５０c25 を酵母ミクロソームで
発現させることに成功した。また、キメラＰ４５０c25
産生量は菌体当たり約２×１０5 分子であり、シグナル
の置換によりＰ４５０c25 の産生量を約１０倍上昇させ
ることができた。さらに、ミクロソーム画分は、ＡＤＸ
とＡＤＲを添加することにより、ＴＨＣ、ビタミンＤ3
、１α−ヒドロキシビタミンＤ3 に対し、高い水酸化
活性を示した。特に、１α−ビタミンＤ3 に対する水酸
化活性は元の５０１アミノ酸からなる成熟型Ｐ４５０C2
5 よりもはるかに高く、１５アミノ酸残基の付加がＰ４
５０C25 の膜における存在状態を変化させ、活性を上昇
させたと思われる。また、キメラＰ４５０C25 、ＡＤＸ
およびＡＤＲの同時発現株はモノオキシゲナーゼ活性を
発揮しているので、本発明者らは、酵母ミクロソーム膜
上でＡＤＲからＡＤＸを経てキメラＰ４５０C25 という
電子伝達系を構築することに成功した。従って、この菌
株をステロイド化合物や活性型ビタミンＤ3 などの水酸
化反応に１ステップで行うことができる簡便なバイオリ
アクターとして利用できる。特に、菌体培養液中に基質
を添加し、一定時間後に有機溶媒等で抽出することによ
り容易に反応産物を回収することができるため、バイオ
リアクターとして有用である。
【０００７】以下、本発明をさらに詳細に説明する。本
発明のキメラＰ４５０がＮ末端に有するミクロソームへ
の移行シグナルとしては、ウシ副腎Ｐ４５０17αに限ら
ず、他のミクロソーム型Ｐ４５０の移行シグナルを用い
ることが可能である。さらに、本発明のキメラＰ４５０
がＣ末端に有する成熟型のミトコンドリア型Ｐ４５０と
しては、ラット肝Ｐ４５０c25 に限らず、他のミトコン
ドリア型Ｐ４５０を用いることが可能である。また、本
発明のウシ副腎Ｐ４５０17αおよびラット肝Ｐ４５０c2
5 をコードするｃＤＮＡはすでに公知であり、通常の操
作法でこれを単離することができる。本発明のキメラＰ
４５０c25 を発現する発現プラスミドはウシ副腎Ｐ４５
０17αのＮ末端アミノ酸配列に相当するｃＤＮＡを合成
し、成熟型ラット肝Ｐ４５０c25 をコードするｃＤＮＡ
領域と連結した後、遺伝子を酵母アルコール脱水素酵素
（以下、ＡＤＨと略す。）遺伝子のプロモーターおよび
同ターミネーターを保持する酵母発現ベクターｐＡＡＨ
５（Methods in Enzymology, 101, partC, p192-201 ）
に挿入し構築することができる。また、この発現プラス
ミド上に成熟型ＡＤＲおよび成熟型ＡＤＸの発現ユニッ
トを挿入することにより、３酵素を同時に発現させるた
めのプラスミドを構築することができる。ただし、プロ
モーターおよびターミネーターはＡＤＨに限定されず、
酵母内で効率的に機能するものであればよい。また、３
酵素を同時に発現させるプラスミドのプロモーターおよ
びターミネーターは同一でなく、それぞれ異なっている
ほうが好ましい。その理由は、継代培養した場合、プラ
スミド上での組み換えば起こる可能性が低いからであ
る。また、３酵素の発現ユニットへの挿入位置、挿入方
向はそれぞれ酵素の発現量にほとんど影響を与えない。
宿主として酵母を用いることが好ましいが、さらに酵母
サッカロミセス・セレビシエＡＨ２２株が、望ましい。
キメラＰ４５０c25 遺伝子を含む発現プラスミドあるい
は３酵素同時発現プラスミドによる宿主酵母の形質転換
は、アルカリ金属（ＬｉＣｌ）を用いる方法、プロトプ
ラスト法など公知の方法で行うことができる。本発明に
より得られる形質転換酵母の培養は通常のグルコース、
窒素源などを含む培地において通常の培養方法により行
うことができる。このようにして得られた形質転換酵母
菌体を培養することによりキメラＰ４５０c25 を製造す
ることができる。
発明のキメラＰ４５０がＮ末端に有するミクロソームへ
の移行シグナルとしては、ウシ副腎Ｐ４５０17αに限ら
ず、他のミクロソーム型Ｐ４５０の移行シグナルを用い
ることが可能である。さらに、本発明のキメラＰ４５０
がＣ末端に有する成熟型のミトコンドリア型Ｐ４５０と
しては、ラット肝Ｐ４５０c25 に限らず、他のミトコン
ドリア型Ｐ４５０を用いることが可能である。また、本
発明のウシ副腎Ｐ４５０17αおよびラット肝Ｐ４５０c2
5 をコードするｃＤＮＡはすでに公知であり、通常の操
作法でこれを単離することができる。本発明のキメラＰ
４５０c25 を発現する発現プラスミドはウシ副腎Ｐ４５
０17αのＮ末端アミノ酸配列に相当するｃＤＮＡを合成
し、成熟型ラット肝Ｐ４５０c25 をコードするｃＤＮＡ
領域と連結した後、遺伝子を酵母アルコール脱水素酵素
（以下、ＡＤＨと略す。）遺伝子のプロモーターおよび
同ターミネーターを保持する酵母発現ベクターｐＡＡＨ
５（Methods in Enzymology, 101, partC, p192-201 ）
に挿入し構築することができる。また、この発現プラス
ミド上に成熟型ＡＤＲおよび成熟型ＡＤＸの発現ユニッ
トを挿入することにより、３酵素を同時に発現させるた
めのプラスミドを構築することができる。ただし、プロ
モーターおよびターミネーターはＡＤＨに限定されず、
酵母内で効率的に機能するものであればよい。また、３
酵素を同時に発現させるプラスミドのプロモーターおよ
びターミネーターは同一でなく、それぞれ異なっている
ほうが好ましい。その理由は、継代培養した場合、プラ
スミド上での組み換えば起こる可能性が低いからであ
る。また、３酵素の発現ユニットへの挿入位置、挿入方
向はそれぞれ酵素の発現量にほとんど影響を与えない。
宿主として酵母を用いることが好ましいが、さらに酵母
サッカロミセス・セレビシエＡＨ２２株が、望ましい。
キメラＰ４５０c25 遺伝子を含む発現プラスミドあるい
は３酵素同時発現プラスミドによる宿主酵母の形質転換
は、アルカリ金属（ＬｉＣｌ）を用いる方法、プロトプ
ラスト法など公知の方法で行うことができる。本発明に
より得られる形質転換酵母の培養は通常のグルコース、
窒素源などを含む培地において通常の培養方法により行
うことができる。このようにして得られた形質転換酵母
菌体を培養することによりキメラＰ４５０c25 を製造す
ることができる。
【０００８】
【実施例】以下、実施例に基づき、本発明を詳細に説明
する。しかし、本発明は本実施例にのみ限定されないこ
とはいうまでもない。 実施例１ 発現プラスミドｐＡＭＳ２５および３酵素同
時発現プラスミドｐＲＸＭＳ２５の構築 以下の実施例で、制限酵素によるＤＮＡの切断、アルカ
リホスファターゼによるＤＮＡの脱リン酸化、ＤＮＡリ
ガーゼによるＤＮＡの結合などの反応は、通常２０〜２
００μｌの反応容積を用いて、これらの酵素類を市販す
るメーカー（例えば、宝酒造（株））が製品に添付した
反応条件で実施した。キメラ体Ｐ４５０ C25 発現プラス
ミドｐＡＭＳ２５を図１に従い構築した。ラット肝Ｐ４
５０c25 発現プラスミドｐＡＣ２５（特願平２−２５８
３６２）を構築した際、得られたプラスミドｐＵＣ２５
ＮをＰｓｔＩで部分消化した後ＥｃｏＲＩ消化し、得ら
れたＤＮＡ断片に合成リンカー（配列番号１に示す。）
を挿入し、得られたプラスミドからＨｉｎｄIII −Ｓａ
ｃＩ断片を調製した。一方、ｐＵＣ２５ＣＨ（特願平２
−２５８２６２）からＳａｃＩ−ＨｉｎｄIII 断片を調
製し、これら両断片をｐＵＣ１９のＨｉｎｄIII 部位に
同時に挿入することによりプラスミドｐＵＭＳ２５を得
た。次に、ｐＵＭＳ２５から得たＨｉｎｄIII 断片をベ
クターｐＡＡＨ５Ｎ（特開平２−５１５２５）のＨｉｎ
ｄIII 部位に挿入することにより発現プラスミドｐＡＭ
Ｓ２５を構築した。
する。しかし、本発明は本実施例にのみ限定されないこ
とはいうまでもない。 実施例１ 発現プラスミドｐＡＭＳ２５および３酵素同
時発現プラスミドｐＲＸＭＳ２５の構築 以下の実施例で、制限酵素によるＤＮＡの切断、アルカ
リホスファターゼによるＤＮＡの脱リン酸化、ＤＮＡリ
ガーゼによるＤＮＡの結合などの反応は、通常２０〜２
００μｌの反応容積を用いて、これらの酵素類を市販す
るメーカー（例えば、宝酒造（株））が製品に添付した
反応条件で実施した。キメラ体Ｐ４５０ C25 発現プラス
ミドｐＡＭＳ２５を図１に従い構築した。ラット肝Ｐ４
５０c25 発現プラスミドｐＡＣ２５（特願平２−２５８
３６２）を構築した際、得られたプラスミドｐＵＣ２５
ＮをＰｓｔＩで部分消化した後ＥｃｏＲＩ消化し、得ら
れたＤＮＡ断片に合成リンカー（配列番号１に示す。）
を挿入し、得られたプラスミドからＨｉｎｄIII −Ｓａ
ｃＩ断片を調製した。一方、ｐＵＣ２５ＣＨ（特願平２
−２５８２６２）からＳａｃＩ−ＨｉｎｄIII 断片を調
製し、これら両断片をｐＵＣ１９のＨｉｎｄIII 部位に
同時に挿入することによりプラスミドｐＵＭＳ２５を得
た。次に、ｐＵＭＳ２５から得たＨｉｎｄIII 断片をベ
クターｐＡＡＨ５Ｎ（特開平２−５１５２５）のＨｉｎ
ｄIII 部位に挿入することにより発現プラスミドｐＡＭ
Ｓ２５を構築した。
【０００９】成熟型ＡＤＸ（特願平２−１３６４９６に
記載）をコードするＨｉｎｄIII 断片をベクターｐＧＡ
ＨＮ（ベクターｐＡＡＨ５ＮのＡＤＨプロモーター、タ
ーミネーターのかわりにＰＧＫプロモーター、ターミネ
ーターを含む）のＰＧＫプロモーター、ターミネーター
（特願平２−１３６４９６に記載）の間に挿入すること
により発現プラスミドｐＧＸを得た。また、成熟型ＡＤ
Ｒ（特開昭６３−１１２９８６に記載）をコードするＨ
ｉｎｄIII 断片をベクターｐＰＡＨＮ（ベクターｐＡＡ
Ｈ５ＮのＡＤＨプロモーター、ターミネーターのかわり
にＧＡＰプロモーター、ターミネーター（特開昭６３−
１１２９８６に記載）を含む）のＧＡＰプロモーター、
ターミネーターの間に挿入することによりｐＰＲを得
た。ｐＰＲをＮｏｔＩで部分消化して得られたＤＮＡ断
片とｐＧＸから得られたＮｏｔＩ断片とのリガーゼ反応
を行うことによりＡＤＲ、ＡＤＸ同時発現プラスミドｐ
ＲＸ５を得た。次にｐＲＸ５をＮｏｔＩで部分消化し、
ｐＡＭＳ２５より得たＮｏｔＩ断片（３．７ｋｂ）を連
結することによりキメラＰ４５０c25 、ＡＤＸおよびＡ
ＤＲ同時発現プラスミドｐＲＸＭＳ２５を得た。
記載）をコードするＨｉｎｄIII 断片をベクターｐＧＡ
ＨＮ（ベクターｐＡＡＨ５ＮのＡＤＨプロモーター、タ
ーミネーターのかわりにＰＧＫプロモーター、ターミネ
ーターを含む）のＰＧＫプロモーター、ターミネーター
（特願平２−１３６４９６に記載）の間に挿入すること
により発現プラスミドｐＧＸを得た。また、成熟型ＡＤ
Ｒ（特開昭６３−１１２９８６に記載）をコードするＨ
ｉｎｄIII 断片をベクターｐＰＡＨＮ（ベクターｐＡＡ
Ｈ５ＮのＡＤＨプロモーター、ターミネーターのかわり
にＧＡＰプロモーター、ターミネーター（特開昭６３−
１１２９８６に記載）を含む）のＧＡＰプロモーター、
ターミネーターの間に挿入することによりｐＰＲを得
た。ｐＰＲをＮｏｔＩで部分消化して得られたＤＮＡ断
片とｐＧＸから得られたＮｏｔＩ断片とのリガーゼ反応
を行うことによりＡＤＲ、ＡＤＸ同時発現プラスミドｐ
ＲＸ５を得た。次にｐＲＸ５をＮｏｔＩで部分消化し、
ｐＡＭＳ２５より得たＮｏｔＩ断片（３．７ｋｂ）を連
結することによりキメラＰ４５０c25 、ＡＤＸおよびＡ
ＤＲ同時発現プラスミドｐＲＸＭＳ２５を得た。
【００１０】実施例２ 発現プラスミドによる酵母の形
質転換 サッカロミセス・セレビシエＡＨ２２（ＡＴＣＣ ３８
６２６）を、５ｍｌのＹＰＤ培地（１％酵母エキス、２
％ポリペプトン、２％グルコース）中で３０℃、１８時
間培養したのち、１ｍｌの酵母培養液を遠心分離し、集
菌した。菌体を、 ０．２Ｍ ＬｉＣｌ溶液１ｍｌで洗
浄したのち、１Ｍ ＬｉＣｌ溶液２０μｌに懸濁した。
これに、７０％ポリエチレングリコール４０００溶液３
０μｌ、発現プラスミドｐＡＭＳ２５溶液１０μｌ（約
１μｇＤＮＡ）を添加して、充分に混合したのち、３０
℃で１時間インキュベートした。ついで、１４０μｌの
水を加えＳＤ合成培地プレート（２％グルコース、０．
６７％酵母窒素源アミノ酸不含、２０μｇ／ｍｌヒスチ
ジン、２％寒天）上にまき、３０℃で３日間インキュベ
ートすることにより、プラスミドを保持する形質転換体
を得た。
質転換 サッカロミセス・セレビシエＡＨ２２（ＡＴＣＣ ３８
６２６）を、５ｍｌのＹＰＤ培地（１％酵母エキス、２
％ポリペプトン、２％グルコース）中で３０℃、１８時
間培養したのち、１ｍｌの酵母培養液を遠心分離し、集
菌した。菌体を、 ０．２Ｍ ＬｉＣｌ溶液１ｍｌで洗
浄したのち、１Ｍ ＬｉＣｌ溶液２０μｌに懸濁した。
これに、７０％ポリエチレングリコール４０００溶液３
０μｌ、発現プラスミドｐＡＭＳ２５溶液１０μｌ（約
１μｇＤＮＡ）を添加して、充分に混合したのち、３０
℃で１時間インキュベートした。ついで、１４０μｌの
水を加えＳＤ合成培地プレート（２％グルコース、０．
６７％酵母窒素源アミノ酸不含、２０μｇ／ｍｌヒスチ
ジン、２％寒天）上にまき、３０℃で３日間インキュベ
ートすることにより、プラスミドを保持する形質転換体
を得た。
【００１１】実施例３ キメラ体Ｐ４５０c25 の生産 実施例３で得たＡＨ２２／ｐＡＭＳ２５株、ＡＨ２２／
ｐＲＸＭＳ２５株およびコントロールＡＨ２２／ｐＡＡ
Ｈ５株を合成培地（８％ グルコース、５．４％ 酵母
窒素源アミノ酸不含、１６０μｇ／ｍｌ ヒスチジン）
３００ｍｌでそれぞれ約２×１０7 細胞／ｍｌまで培養
し、集菌後１００ｍＭ リン酸カリウム（ｐＨ７．０）
で洗浄したのち、同緩衝液２ｍｌに懸濁した。２本のキ
ュベットに菌懸濁液を１ｍｌずつ分注し、サンプル側キ
ュベットに一酸化炭素を吹き込んだのち、両キュベット
にジチオナイト５〜１０ｍｇを添加した。よく攪拌した
のち４００〜５００ｎｍの差スペクトルを測定し、Δε
(450nm-490nm) ＝９１ｍＭ - 1 ｃｍ- 1 をもとにしてヘ
ム含有Ｐ４５０量を算出した。その結果、ＡＨ２２／ｐ
ＡＭＳ２５および、ＡＨ２２／ｐＲＸＭＳ２５株は、そ
れぞれ菌体あたり２×１０5 分子および１×１０5 分子
のヘム含有Ｐ４５０を産生することが判明した。それに
対して、コントロールＡＨ２２／ｐＡＡＨ５株ではヘム
含有Ｐ４５０の産生は認められなかった。
ｐＲＸＭＳ２５株およびコントロールＡＨ２２／ｐＡＡ
Ｈ５株を合成培地（８％ グルコース、５．４％ 酵母
窒素源アミノ酸不含、１６０μｇ／ｍｌ ヒスチジン）
３００ｍｌでそれぞれ約２×１０7 細胞／ｍｌまで培養
し、集菌後１００ｍＭ リン酸カリウム（ｐＨ７．０）
で洗浄したのち、同緩衝液２ｍｌに懸濁した。２本のキ
ュベットに菌懸濁液を１ｍｌずつ分注し、サンプル側キ
ュベットに一酸化炭素を吹き込んだのち、両キュベット
にジチオナイト５〜１０ｍｇを添加した。よく攪拌した
のち４００〜５００ｎｍの差スペクトルを測定し、Δε
(450nm-490nm) ＝９１ｍＭ - 1 ｃｍ- 1 をもとにしてヘ
ム含有Ｐ４５０量を算出した。その結果、ＡＨ２２／ｐ
ＡＭＳ２５および、ＡＨ２２／ｐＲＸＭＳ２５株は、そ
れぞれ菌体あたり２×１０5 分子および１×１０5 分子
のヘム含有Ｐ４５０を産生することが判明した。それに
対して、コントロールＡＨ２２／ｐＡＡＨ５株ではヘム
含有Ｐ４５０の産生は認められなかった。
【００１２】実施例４ 酵母のミクロソーム画分におけ
るビタミンＤ3 、１α−ヒドロキシビタミンＤ3 ２５位
水酸化活性およびＴＨＣ２７位水酸化活性の測定 ＡＨ２２／ｐＡＭＳ２５株菌体から調製したミクロソー
ム画分を用いて、活性を測定した。形質転換酵母菌株か
らの細胞分画は以下の方法に従った。形質転換体の約２
×１０7 菌体／ｍｌ培養液から約４×１０1 0 菌体分を
集菌し、ザイモアーゼ溶液（１０ｍＭ トリス−塩酸
（ｐＨ７．５）、２．０Ｍソルビトール、０．１ｍＭ
ジチオスレイトール、０．１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．３ｍ
ｇ／ｍｌザイモリアーゼ１００Ｔ）に懸濁し、３０℃で
１時間インキュベートしてスフェロプラストを調製し
た。これをソニケーションバッファー（１０ｍＭ トリ
ス−塩酸（ｐＨ７．５）、０．６５Ｍ ソルビトール、
０．１ｍＭ ジチオスレイトール、０．１ｍＭ ＥＤＴ
Ａ、１μｇ／ｍｌ ロイペプチン、１μｇ／ｍｌ ペプ
スタチン）に懸濁し、テフロンホモジナイザーでホモジ
ナイズすることにより菌体を破砕した。
るビタミンＤ3 、１α−ヒドロキシビタミンＤ3 ２５位
水酸化活性およびＴＨＣ２７位水酸化活性の測定 ＡＨ２２／ｐＡＭＳ２５株菌体から調製したミクロソー
ム画分を用いて、活性を測定した。形質転換酵母菌株か
らの細胞分画は以下の方法に従った。形質転換体の約２
×１０7 菌体／ｍｌ培養液から約４×１０1 0 菌体分を
集菌し、ザイモアーゼ溶液（１０ｍＭ トリス−塩酸
（ｐＨ７．５）、２．０Ｍソルビトール、０．１ｍＭ
ジチオスレイトール、０．１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．３ｍ
ｇ／ｍｌザイモリアーゼ１００Ｔ）に懸濁し、３０℃で
１時間インキュベートしてスフェロプラストを調製し
た。これをソニケーションバッファー（１０ｍＭ トリ
ス−塩酸（ｐＨ７．５）、０．６５Ｍ ソルビトール、
０．１ｍＭ ジチオスレイトール、０．１ｍＭ ＥＤＴ
Ａ、１μｇ／ｍｌ ロイペプチン、１μｇ／ｍｌ ペプ
スタチン）に懸濁し、テフロンホモジナイザーでホモジ
ナイズすることにより菌体を破砕した。
【００１３】３０００×ｇ、５分間の遠心分離により、
沈澱１を取り除き、上清１’を得た。沈澱１をソニケー
ションバッファーに懸濁し再度ホモジナイズしたのち、
３０００×ｇ、５分間遠心分離し沈澱１（未破砕菌体・
核画分）および上清１”を得た。上清１’および１”を
併せて上清１とし、１０，０００×ｇ、２０分間遠心分
離し、沈澱２（ミトコンドリア画分）と上清２を得た。
上清２をさらに１２０，０００×ｇ、７０分間遠心分離
し、沈澱３（ミクロソーム画分）と上清３（細胞質画
分）に分けた。各画分の還元型ＣＯ結合差スペクトルを
測定したところ、約８０％のキメラ体Ｐ４５０c25 がミ
クロソーム画分に存在したため、ミクロソーム画分を用
いて活性を測定した。以下に示す反応系（２ｍｌ）のう
ちＮＡＤＰＨ以外を混合し、３７℃で５分間インキュベ
ートした後、ＮＡＤＰＨを添加し、反応を開始した。１
０、３０分後、反応液 0.5 ml を分取し、5 mlのベンゼ
ンを添加し、遠心分離により得られたベンゼン層を乾固
し、以下に示した条件下でＨＰＬＣにより分析した。
沈澱１を取り除き、上清１’を得た。沈澱１をソニケー
ションバッファーに懸濁し再度ホモジナイズしたのち、
３０００×ｇ、５分間遠心分離し沈澱１（未破砕菌体・
核画分）および上清１”を得た。上清１’および１”を
併せて上清１とし、１０，０００×ｇ、２０分間遠心分
離し、沈澱２（ミトコンドリア画分）と上清２を得た。
上清２をさらに１２０，０００×ｇ、７０分間遠心分離
し、沈澱３（ミクロソーム画分）と上清３（細胞質画
分）に分けた。各画分の還元型ＣＯ結合差スペクトルを
測定したところ、約８０％のキメラ体Ｐ４５０c25 がミ
クロソーム画分に存在したため、ミクロソーム画分を用
いて活性を測定した。以下に示す反応系（２ｍｌ）のう
ちＮＡＤＰＨ以外を混合し、３７℃で５分間インキュベ
ートした後、ＮＡＤＰＨを添加し、反応を開始した。１
０、３０分後、反応液 0.5 ml を分取し、5 mlのベンゼ
ンを添加し、遠心分離により得られたベンゼン層を乾固
し、以下に示した条件下でＨＰＬＣにより分析した。
【００１４】 ［反応系］ １．ミクロソーム画分：ＡＨ２２／ｐＡＭＳ２５株（0.8 nmol キメラ体P450C25 /5 .3 mg 蛋白質を含む） ＡＨ２２／ｐＡＡＨ５株 （5.3 mg 蛋白質を含む） ２．ウシ副腎アドレノドキシン還元酵素 0.8 nmol ３．アドレノドキシン 8.0 nmol ４．基質 終濃度 200 μＭ ５．ＮＡＤＰＨ 終濃度 1.0 〜2.0 mM ６．Tris-HCl (pH 7.8) 100.0 mM ７．ＥＤＴＡ 0.5 〜1.0 mM ［ＨＰＬＣ分析条件］ カラム ：μBondapakC18 （φ 4 × 300 mm ） 検出 ：Ａ265 (ヒ゛タミン D 3 , 1 α-ヒト゛ロキシヒ゛タミンD 3
),放射性検出器 (3 H-THC) 流速 ：1.0 ml/min 温度 ：50 ℃ 溶出条件 0〜 5分 80 % 5〜15分 80 % 〜 100 %の直線濃度勾配 15〜25分 100 %
),放射性検出器 (3 H-THC) 流速 ：1.0 ml/min 温度 ：50 ℃ 溶出条件 0〜 5分 80 % 5〜15分 80 % 〜 100 %の直線濃度勾配 15〜25分 100 %
【００１５】ビタミンＤ3 、および１α−ヒドロキシビ
タミンＤ3 を基質とした場合、ＡＨ２２／ｐＡＭＳ２５
株ミクロソーム画分において、２５位水酸化物の産生が
認められた。コントロールＡＨ２２／ｐＡＡＨ５株では
２５位水酸化物への変換は認められず、ＡＨ２２／ｐＡ
ＭＳ２５株における２５位水酸化活性がキメラ体Ｐ４５
０c25 に依存することが示唆された。ＡＤＲ，ＡＤＸ無
添加の場合、活性を示さないことから、ミクロソーム膜
に存在するＮＡＤＰＨ−Ｐ４５０還元酵素からは電子が
伝達されないことがわかった。また、ＮＡＤＰＨ無添加
では活性を示さず、ＮＡＤＰＨ、ＡＤＸ、ＡＤＲ添加時
に形成されるＮＡＤＰＨ→ＡＤＲ→ＡＤＸ→キメラ体Ｐ
４５０c25 という電子伝達系の構築にともなって、モノ
オキシゲナーゼ活性が発揮されたと思われる。
タミンＤ3 を基質とした場合、ＡＨ２２／ｐＡＭＳ２５
株ミクロソーム画分において、２５位水酸化物の産生が
認められた。コントロールＡＨ２２／ｐＡＡＨ５株では
２５位水酸化物への変換は認められず、ＡＨ２２／ｐＡ
ＭＳ２５株における２５位水酸化活性がキメラ体Ｐ４５
０c25 に依存することが示唆された。ＡＤＲ，ＡＤＸ無
添加の場合、活性を示さないことから、ミクロソーム膜
に存在するＮＡＤＰＨ−Ｐ４５０還元酵素からは電子が
伝達されないことがわかった。また、ＮＡＤＰＨ無添加
では活性を示さず、ＮＡＤＰＨ、ＡＤＸ、ＡＤＲ添加時
に形成されるＮＡＤＰＨ→ＡＤＲ→ＡＤＸ→キメラ体Ｐ
４５０c25 という電子伝達系の構築にともなって、モノ
オキシゲナーゼ活性が発揮されたと思われる。
【００１６】反応時間１０分において算出された代謝回
転速度は 7.4 mol/molP450/minであり、ＡＨ２２／ｐＡ
Ｃ２５株（特願２−２５８２６２）のミトコンドリア画
分において得られた代謝回転速度 0.14 mol/molP450/mi
n に比べて約５０倍高いことがわかった。また、ビタミ
ンＤ3 に対する２５位水酸化活性は 0.28 mol/molP450/
min であった。〔3 Ｈ〕−ＴＨＣを基質とした場合、Ａ
Ｈ２２／ｐＡＭＳ２５株ミクロソーム画分は、ＴＨＣ２
７位水酸化体（ＴｅＨＣ）への変換が検出された。コン
トロールＡＨ２２／ｐＡＡＨ５株では活性が認められ
ず、ＡＨ２２／ｐＡＭＳ２５株における活性がキメラ体
Ｐ４５０c25 に依存することが示唆された。反応時間１
０分において算出されたＴＨＣに対する代謝回転速度は
23 mol/molP450/min であった。
転速度は 7.4 mol/molP450/minであり、ＡＨ２２／ｐＡ
Ｃ２５株（特願２−２５８２６２）のミトコンドリア画
分において得られた代謝回転速度 0.14 mol/molP450/mi
n に比べて約５０倍高いことがわかった。また、ビタミ
ンＤ3 に対する２５位水酸化活性は 0.28 mol/molP450/
min であった。〔3 Ｈ〕−ＴＨＣを基質とした場合、Ａ
Ｈ２２／ｐＡＭＳ２５株ミクロソーム画分は、ＴＨＣ２
７位水酸化体（ＴｅＨＣ）への変換が検出された。コン
トロールＡＨ２２／ｐＡＡＨ５株では活性が認められ
ず、ＡＨ２２／ｐＡＭＳ２５株における活性がキメラ体
Ｐ４５０c25 に依存することが示唆された。反応時間１
０分において算出されたＴＨＣに対する代謝回転速度は
23 mol/molP450/min であった。
【００１７】実施例５ ３者同時発現株ＡＨ２２／ｐＲ
ＸＭＳ２５株におけるＴＨＣ２７位水酸化活性の測定 ＡＨ２２／ｐＲＸＭＳ２５株の培養液 (1.6 × 107 菌
体/ml)に終濃度１０μＭになるように［2 Ｈ］−ＴＨＣ
を添加し、１４時間後の培養液１ｍｌを分取し、ジクロ
ロメタン２ｍｌにより抽出し、ジクロロメタン層を乾固
した後８０μｌのアセトニトリルに溶解し、そのうち５
０μｌをＨＰＬＣにより実施例４に記述した条件で分析
した。但し、検出は放射活性検出装置（パッカード社
ＴＲＡＣＥ７１４０）を用いた。その結果、添加した基
質ＴＨＣの１９％がＴｅＨＣに変換したことが分かっ
た。この変換はコントロールＡＨ２２／ｐＡＡＨ５株に
は見られなかったことから、ＡＨ２２／ｐＲＸＭＳ２５
株においてキメラＰ４５０c25 、ＡＤＸおよびＡＤＲが
酵母細胞内で電子伝達系を構成し、モノオキシゲナーゼ
活性を発揮したことが分かった。
ＸＭＳ２５株におけるＴＨＣ２７位水酸化活性の測定 ＡＨ２２／ｐＲＸＭＳ２５株の培養液 (1.6 × 107 菌
体/ml)に終濃度１０μＭになるように［2 Ｈ］−ＴＨＣ
を添加し、１４時間後の培養液１ｍｌを分取し、ジクロ
ロメタン２ｍｌにより抽出し、ジクロロメタン層を乾固
した後８０μｌのアセトニトリルに溶解し、そのうち５
０μｌをＨＰＬＣにより実施例４に記述した条件で分析
した。但し、検出は放射活性検出装置（パッカード社
ＴＲＡＣＥ７１４０）を用いた。その結果、添加した基
質ＴＨＣの１９％がＴｅＨＣに変換したことが分かっ
た。この変換はコントロールＡＨ２２／ｐＡＡＨ５株に
は見られなかったことから、ＡＨ２２／ｐＲＸＭＳ２５
株においてキメラＰ４５０c25 、ＡＤＸおよびＡＤＲが
酵母細胞内で電子伝達系を構成し、モノオキシゲナーゼ
活性を発揮したことが分かった。
【００１８】本発明により提供される形質転換酵母は分
子内にヘムを含有するキメラ体Ｐ４５０c25 を産生す
る。キメラ体Ｐ４５０c25 は酵母のミクロソーム膜に局
在し、ウシ副腎ＡＤＸおよびＡＤＲの添加によりビタミ
ンＤ3 および１α−ヒドロキシビタミンＤ3 に対して２
５位水酸化活性を示し、ＴＨＣに対し２７位水酸化活性
を示した。本来、Ｐ４５０c25 はミトコンドリア内膜に
存在するタンパク質であるが、ミトコンドリアへの輸送
シグナルを除去し、ミクロソーム型Ｐ４５０17αのＮ末
端１５アミノ酸残基（ミクロソーム膜へのシグナルとし
て機能する）を付加することにより、酵母細胞内局在性
をミトコンドリアからミクロソームへ変換することがで
きた。このような膜酵素の局在性の変換はこれまでに例
がない。Ｐ４５０17αのＮ末端１５アミノ酸残基は疎水
性が高く、ミクロソーム膜へのシグナルの役割を果たし
ていると考えられるが、シグナルとしての特殊性はな
く、他のミクロソーム膜タンパク質のシグナルとの代替
も可能である。
子内にヘムを含有するキメラ体Ｐ４５０c25 を産生す
る。キメラ体Ｐ４５０c25 は酵母のミクロソーム膜に局
在し、ウシ副腎ＡＤＸおよびＡＤＲの添加によりビタミ
ンＤ3 および１α−ヒドロキシビタミンＤ3 に対して２
５位水酸化活性を示し、ＴＨＣに対し２７位水酸化活性
を示した。本来、Ｐ４５０c25 はミトコンドリア内膜に
存在するタンパク質であるが、ミトコンドリアへの輸送
シグナルを除去し、ミクロソーム型Ｐ４５０17αのＮ末
端１５アミノ酸残基（ミクロソーム膜へのシグナルとし
て機能する）を付加することにより、酵母細胞内局在性
をミトコンドリアからミクロソームへ変換することがで
きた。このような膜酵素の局在性の変換はこれまでに例
がない。Ｐ４５０17αのＮ末端１５アミノ酸残基は疎水
性が高く、ミクロソーム膜へのシグナルの役割を果たし
ていると考えられるが、シグナルとしての特殊性はな
く、他のミクロソーム膜タンパク質のシグナルとの代替
も可能である。
【００１９】シグナルの置換に基づく膜酵素の局在性を
ミトコンドリアからミクロソームへ変化させることによ
り、酵母菌体あたりのＰ４５０c25 産生量は約１０倍
に、またＰ４５０分子あたりの１α−ヒドロキシビタミ
ンＤ3 ２５位水酸化活性を約５０倍に上昇させることが
できた。したがって、菌体あたりの１α−ヒドロキシビ
タミンＤ3 ２５位水酸化能は約５００倍に上昇したこと
になる。キメラ体Ｐ４５０c25 をバイオリアクターとし
て用いることにより、カルシウムの代謝調節、細胞分化
促進や細胞性免疫機能を調節に重要な役割を果たし、骨
粗そう症、慢性腎不全、ビタミンＤ抵抗性クル病などの
治療に有効である１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ
3 を製造することが可能である。
ミトコンドリアからミクロソームへ変化させることによ
り、酵母菌体あたりのＰ４５０c25 産生量は約１０倍
に、またＰ４５０分子あたりの１α−ヒドロキシビタミ
ンＤ3 ２５位水酸化活性を約５０倍に上昇させることが
できた。したがって、菌体あたりの１α−ヒドロキシビ
タミンＤ3 ２５位水酸化能は約５００倍に上昇したこと
になる。キメラ体Ｐ４５０c25 をバイオリアクターとし
て用いることにより、カルシウムの代謝調節、細胞分化
促進や細胞性免疫機能を調節に重要な役割を果たし、骨
粗そう症、慢性腎不全、ビタミンＤ抵抗性クル病などの
治療に有効である１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ
3 を製造することが可能である。
【００２０】また、キメラ体Ｐ４５０c25 、ＡＤＸおよ
びＡＤＲの同時発現株菌体をバイオリアクターとして用
いることは現在行われている活性型ビタミンＤ3 の複雑
な化学合成法を単純化するのに有効な手段であると考え
られる。一方、大量に産生されるキメラＰ４５０c25 は
容易に精製することができ、これに対する抗体を脳腱黄
色腫症の診断薬として利用することができる。
びＡＤＲの同時発現株菌体をバイオリアクターとして用
いることは現在行われている活性型ビタミンＤ3 の複雑
な化学合成法を単純化するのに有効な手段であると考え
られる。一方、大量に産生されるキメラＰ４５０c25 は
容易に精製することができ、これに対する抗体を脳腱黄
色腫症の診断薬として利用することができる。
【００２１】また、Ｐ４５０c25 だけではなく、他のミ
トコンドリア型Ｐ４５０をキメラＰ４５０として大量に
生産することも可能である。それにより、前記のＰ４５
０c25 が示す２５位水酸化活性だけでなく、他の部位を
水酸化することが可能となるので、そのようなキメラＰ
４５０は、バイオリアクターとして有用である。
トコンドリア型Ｐ４５０をキメラＰ４５０として大量に
生産することも可能である。それにより、前記のＰ４５
０c25 が示す２５位水酸化活性だけでなく、他の部位を
水酸化することが可能となるので、そのようなキメラＰ
４５０は、バイオリアクターとして有用である。
配列番号：１ 配列の長さ： 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成リンカー 配列 1 AATTCAAGCT TAAAAAAATG TGGCTGCTCC TGGCTGTCTT TCTGCTCACC CTCGCCTATT 60 GTTCGA ATTTTTTTAC ACCGACGAGG ACCGACAGAA AGACGAGTGG GAGCGGATAA TAGCGATCCC TGCA 74 ATCGCTAGGG
【図１】本発明の発現プラスミドｐＡＭＳ２５の構築工
程の説明図である。制限酵素切断部位は、Ｅ：ＥｃｏＲ
Ｉ，Ｎｃ：ＮｃｏＩ，Ｓ：ＳａｃＩ，Ｈ：ＨｉｎｄIII,
Ｐ：ＰｓｔＩ，Ｎ：ＮｏｔＩを示す。
程の説明図である。制限酵素切断部位は、Ｅ：ＥｃｏＲ
Ｉ，Ｎｃ：ＮｃｏＩ，Ｓ：ＳａｃＩ，Ｈ：ＨｉｎｄIII,
Ｐ：ＰｓｔＩ，Ｎ：ＮｏｔＩを示す。
【図２】発現プラスミドｐＲＸＭＳ２５の構築工程の説
明図である。制限酵素切断部位は、Ｈ：ＨｉｎｄIII 、
Ｎ：ＮｏｔＩを示す。
明図である。制限酵素切断部位は、Ｈ：ＨｉｎｄIII 、
Ｎ：ＮｏｔＩを示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 (Ｃ１２Ｎ 1/19 Ｃ１２Ｒ 1:865） (Ｃ１２Ｐ 33/06 Ｃ１２Ｒ 1:865） (Ｃ１２Ｎ 9/04 Ｃ１２Ｒ 1:865） (72)発明者 大川 秀郎 兵庫県宝塚市高司４丁目２番１号 住友化 学工業株式会社内
Claims (11)
- 【請求項１】Ｎ末端のミクロソームへの局在化シグナル
配列とＣ末端の成熟型のミトコンドリア型Ｐ４５０から
なるキメラＰ４５０、フェレドキシン及びフェレドキシ
ン還元酵素を同時に発現させるプラスミド - 【請求項２】ウシ副腎Ｐ４５０17αのＮ末端１５アミノ
酸残基からなるシグナル配列とＣ末端の成熟型ミトコン
ドリア型Ｐ４５０からなるキメラＰ４５０、フェレドキ
シン及びフェレドキシン還元酵素を同時に発現させるプ
ラスミド - 【請求項３】Ｎ末端のミクロソームへの局在化シグナル
配列と５０１アミノ酸からなる成熟型のラット肝ミトコ
ンドリアＰ４５０c25 からなるキメラＰ４５０c25 、フ
ェレドキシン及びフェレドキシン還元酵素を同時に発現
させるプラスミド - 【請求項４】Ｎ末端のミクロソームへの局在化シグナル
配列と５０１アミノ酸からなる成熟型のラット肝ミトコ
ンドリアＰ４５０c25 からなるキメラＰ４５０c25 、ウ
シ副腎アドレノドキシン還元酵素およびウシ副腎アドレ
ノドキシンを同時に発現させるプラスミド - 【請求項５】下の制限酵素地図で表される発現プラスミ
ドｐＲＸＭＳ２５ - 【請求項６】Ｎ末端のミクロソームへの局在化シグナル
配列とＣ末端の成熟型のミトコンドリア型Ｐ４５０から
なるキメラＰ４５０、フェレドキシン及びフェレドキシ
ン還元酵素を同時に発現する酵母菌株 - 【請求項７】ウシ副腎Ｐ４５０17αのＮ末端１５アミノ
酸残基からなるシグナル配列とＣ末端の成熟型のミトコ
ンドリア型Ｐ４５０からなるキメラＰ４５０、フェレド
キシン及びフェレドキシン還元酵素を同時に発現する酵
母菌株 - 【請求項８】Ｎ末端のミクロソームへの局在化シグナル
配列と５０１アミノ酸からなる成熟型のラット肝ミトコ
ンドリアＰ４５０c25 からなるキメラＰ４５０c25 、フ
ェレドキシン及びフェレドキシン還元酵素を同時に発現
する酵母菌株 - 【請求項９】ウシ副腎Ｐ４５０17αのＮ末端１５アミノ
酸残基からなるシグナル配列と５０１アミノ酸からなる
成熟型のラット肝ミトコンドリアＰ４５０c25 からなる
キメラＰ４５０c25 、フェレドキシン及びフェレドキシ
ン還元酵素を同時に発現する酵母菌株 - 【請求項１０】ウシ副腎Ｐ４５０17αのＮ末端１５アミ
ノ酸残基からなるシグナル配列と５０１アミノ酸からな
る成熟型のラット肝ミトコンドリアＰ４５０c25 からな
るキメラＰ４５０c25 、ウシ副腎アドレノドキシン還元
酵素、ウシ副腎アドレノドキシンを同時に発現する酵母
菌株 - 【請求項１１】プラスミドｐＲＸＭＳ２５を保持する酵
母菌株
Priority Applications (1)
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|---|---|---|---|
| JP6190653A JP2517894B2 (ja) | 1994-08-12 | 1994-08-12 | フェレドキシン及びフェレドキシン還元酵素を同時に発現させるキメラｐ４５０産生菌株 |
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| JP3120123A Division JP2500543B2 (ja) | 1990-09-26 | 1991-05-24 | キメラｐ４５０産生菌株 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
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| JP2517894B2 JP2517894B2 (ja) | 1996-07-24 |
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ID=16261672
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|---|---|
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| EP1997587A2 (en) | 2007-05-29 | 2008-12-03 | Sumitomo Electric Industries, Ltd. | Method of polishing compound semiconductor substrate, compound semiconductor substrate, method of manufacturing compound semiconductor epitaxial substrate, and compound semiconductor epitaxial substrate |
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| JPS6463383A (en) * | 1987-03-14 | 1989-03-09 | Boehringer Ingelheim Int | Human manganese super oxide dismutase |
-
1994
- 1994-08-12 JP JP6190653A patent/JP2517894B2/ja not_active Expired - Fee Related
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| EP2386634A4 (en) * | 2009-01-07 | 2012-07-18 | Mitsubishi Chem Corp | STEROL SIDE CHAINS COLUMNY ENZYM PREBONE AND USE THEREOF |
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| JP2014076066A (ja) * | 2014-01-29 | 2014-05-01 | Mitsubishi Chemicals Corp | ステロール側鎖切断酵素蛋白質およびその利用 |
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