JPH0768110B2

JPH0768110B2 - 口腔用組成物

Info

Publication number: JPH0768110B2
Application number: JP1127594A
Authority: JP
Inventors: 裕久水道; 利彦梅本; 勇並河
Original assignee: Sunstar Inc
Current assignee: Sunstar Inc
Priority date: 1989-05-20
Filing date: 1989-05-20
Publication date: 1995-07-26
Anticipated expiration: 2010-07-26
Also published as: JPH02306924A

Description

【発明の詳細な説明】産業上の利用分野本発明は歯周病を予防、治療する口腔内組成物に関し、
特に歯周病の発症と進行に関与している細菌の一種であ
るトレポネーマ・デンチコラ（Treponema denticola）
の口腔内定着を抑制し、歯周病を予防することができる
口腔用組成物に関する。

従来技術および課題ヒト成人の口腔内に生息するスピロヘータは、偏性嫌気
性細菌であることや細胞構造がきわめて破壊され易いこ
となど、その分離培養が困難であったが、嫌気性細菌培
養技術の最近の進歩により各種の口腔スピロヘータ菌種
が分離されるようになった。トレポネーマ・デンチコラ
は歯肉縁下歯垢中のスピロヘータのうち最も頻繁に見い
出される菌種であり、近年、歯周疾患の発症と進展に関
与する細菌として注目されている。特に、歯周疾患の発
症と進展の関連における該菌の病原性を示す事例とし
て、歯周組織内げの侵入能、トリプシン様酵素活性をは
じめとする組織破壊性の酵素の産生、宿主のリンパ系細
胞に対する障害作用などが挙げられる。

炎症歯肉ポケットでの顕著な数的増加を特徴とするこれ
らスピロヘータを原因とする歯周病を予防あるいは治療
するには、口腔内でのスピロヘータの定着を阻止し、あ
るいは増殖を抑制することが考えられる。

一般に、細菌の定着を阻止あるいは増殖を抑制する方法
としては、殺菌剤を利用する方法と当該細菌に対する特
異性の高い抗体産生を期待するワクチンを利用する、い
わゆる免疫法が考えられる。免疫法は大別すると、細菌
の全菌体を抗原とし、生体に直接注射する能動型免疫と
哺乳動物等に免疫することによって得られた血中抗体等
を投与する受動型免疫とがある。

受動型免疫を利用するには、目的とする細菌に対する高
い凝集活性を有する抗体を含むものが良く、速効性とい
う観点からも好ましいと考えられる。その場合、安全性
の面から全菌体を用いて動物免疫するよりは凝集に関与
する菌体の特定の抗原のみを免疫原として使用し、この
抗原に対する抗体のみを含む血清を用いる方がよいと考
えられる。これまで、トレポネーマ・デンチコラについ
てはこのような観点から菌の定着あるいは増殖を抑える
手法は確立していなかった。

本発明者らはこのような事情に鑑み、トレポネーマ・デ
ンチコラの口腔内定着を効果的に抑制し、歯周病をより
確実に予防・治療しうる安全性の高い方法につき鋭意研
究を行った結果、トレポネーマ・デンチコラの被膜、特
に、被膜表層に存在する蛋白質（分子量50,000＝50K、5
3,000＝53K、56,000＝56Kなど）を抗原とし、これを哺
乳動物に免疫することによって得られる血中抗体又は乳
汁中抗体あるいは鳥類に免疫することによって得られる
卵中抗体、さらには蛋白質抗原に対する抗体産生細胞と
ミエローマ細胞との細胞融合により得られるハイブリド
ーマが産生する該蛋白質抗原に対するモノクローナル抗
体、例えば、特願昭63−312348号のモノクローナル抗体
がトレポネーマ・デンチコラの口腔内定着を顕著に抑制
し、従って、これら抗体を口腔用組成物に配合すること
により、歯周病の有効な予防・治療が行えることを知見
し、本発明を完成するに至った。

課題を解決するための手段本発明の口腔用組成物はトレポネーマ・デンチコラの被
膜、特に、被膜表層に存在する蛋白質を抗原とし、これ
を哺乳動物に免疫することによって得られる血中抗体ま
たは乳汁中抗体、あるいは鳥類に免疫することによって
得られる卵中抗体、さらには被膜蛋白質抗原に対するモ
ノクローナル抗体を含有してなるものである。

ここで、抗原作製に用いるトレポネーマ・デンチコラは
本菌種に属するものであるならいずれの菌株でもよく、
米国、メリーランド州、ロックビルのアメリカン・タイ
プ・カルチャー・コレクション（ATCC）から入手できる
菌株、例えば、トレポネーマ・デンチコラATCC33520
株、あるいは歯周炎の病巣局所から分離した菌株等が使
用される。トレポネーマ・デンチコラの培養は特に限定
するものではなく、培養が可能なものならいずれでもよ
く、例えば、TYGVS培地等が用いられる。

また、免疫に用いる抗原は例えばつぎのようにして調製
される。

TYGVS培地で嫌気培養を行ったトレポネーマ・デンチコ
ラ菌体を0.01Mリン酸緩衝液（pH7.2）に懸濁して、超音
波処理を施し、遠心分離してその上清を同緩衝液で透析
する。ついでその蛋白質成分に還元処理を施して可溶化
し、スラブ型ドデシル硫酸ナトリウム（SDS）−ポリア
クリルアミドゲル電気泳動に付し、ペプチドを展開分離
し、20K〜75K蛋白質バンド部分を切りとる。

この抗体による哺乳動物あるいは鳥類の免疫は、常法に
従って行うことができ、よく免疫される哺乳動物として
は、ウサギ、ヤギ、ヒツジ、ウシ、ウマ等が挙げられ、
鳥類としてはニワトリ、カモ、ダチョウ等が挙げられ
る。

また、被膜蛋白質に対するモノクローナル抗体の作製も
常法でよく、例えば、前記抗原をBALB/c系マウス等に免
疫し、得られる被膜蛋白質に対する抗体産生細胞とミエ
ローマ細胞を融合し、生じるハイブリドーマを培養する
ことにより得ることができる。

なお、抗体の精製は通常の精製法に従い、抗血清や乳か
ら分離することができる。抗体精製法としては塩析法、
ゲル濾過法、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニ
ティクロマトグラフィーなどを用いることができる。

本発明の口腔用組成物においては、前記抗体の１種を単
独で配合してもよく、２種以上を併用してもよい。ま
た、組成物中の抗体配合量は0.0001％〜10％（重量％、
以下同じ）、特に、0.001％〜５％が好ましく、組成物
の口腔への適用量は抗体量で0.00001g〜10g/kg/日が好
ましい。

本発明の口腔用組成物は、常法により練歯磨、粉歯磨、
液状歯磨等の歯磨類、マウスウオッシュ、トローチ、口
腔用パスタ、歯肉マッサージクリーム、うがい用溶液、
イリゲーション溶液、チューインガム、乳製品などとす
ることができ、その他、口腔用組成物の種類等に応じた
適宜な成分が用いられる。例えば、練歯磨の場合であれ
ば粘結剤、粘稠剤、発泡剤、安定化剤、香料、甘味料、
防腐剤等周知の成分が用いられる。また、マウスウオッ
シュ等のその他の形状においても、製品の性状に応じた
成分が適宜配合される。

また、本発明においては、クロルヘキシジン、塩化セチ
ルピリジニウム、塩化ナトリウム、アズレン、プロテア
ーゼ、溶菌酵素、ムタナーゼ、生薬抽出物などの有効成
分を配合することもできる。

このように、本発明による口腔用組成物は、トレポネー
マ・デンチコラの被膜特に被膜表層に存在する蛋白質を
抗原とし、これを哺乳動物に免疫することによって得ら
れる血中抗体または乳汁中抗体あるいは鳥類に免疫する
ことによって得られる卵中抗体、さらには20K〜75K蛋白
質抗原に対するモノクローナル抗体を配合したことによ
り、トレポネーマ・デンチコラの口腔内への定着を有効
に阻止し、歯周病を効果的に予防あるいは治療すること
ができる。しかも、前記抗体は特定の抗原に対するもの
でその安全性も高い。

以下、実験により本発明の効果を具体的に示す。

〔実験〕

（１）抗原の調製トレポネーマ・デンチコラ菌株（例えば、ATCC33520、A
TCC35404またはATCC35405）をTYGVS培地に接種し、37℃
にて嫌気条件下で対数増殖期まで培養した。集菌後、0.
01Mリン酸緩衝液（pH7.2）で菌体を３回洗浄した。この
洗浄菌体を超音波破壊後、15000g、30分間遠心分離した
上清をPBSで透析した。これをセファデックスＧ−75カ
ラムでゲル濾過し、OD₂₈₀の測定パターンの第一ピーク
画分を濃縮し、PBSで透析を行い、生じた沈澱を1000g、
10分間遠心分離して除去し、その上清を再び45000g、60
分間遠心分離を行い、その沈査を被膜画分とした。さら
にこれをSDS−ポリアクリルアミド電気泳動に付し、10
％アクリルアミドゲル上で分離され、クマシーブリリア
ントブルー染色剤で陽性染色された蛋白質バンドのう
ち、被膜表層の蛋白質である50K、53K、56Kなどの蛋白
質バンドを切りとり、それぞれプールした。

（２）抗体の調製前記調製した各種抗原を用いて家兎を免疫して抗体を得
た。免疫の方法は通常行われている方法に準じて行っ
た。すなわち、前記調製した各種抗原、100μｇを３〜
４日毎に計10回耳静脈内に投与した。得られた抗血清は
50％硫安で塩析後、蒸留水で透析し抗体標本とした。各
抗体標本のトレポネーマ・デンチコラATCC33520株に対
する菌体凝集活性を第１表に示す。

（３）モノクローナル抗体の調製前記調製のトレポネーマ・デンチコラATCC33520株の53K
蛋白質バンドをリン酸緩衝液中で破砕し、これと等容の
フロイントコンプリートアジュバンドとの混合物（蛋白
質量10μg/ml）を免疫原とし、複数のBALB/cマウスの腹
腔内に一回につき0.5ml14日間隔で計３回抗原を投与し
た。マウスの血中抗体価を凝集反応で測定したところ1:
256以上の凝集抗体価を得た。最終抗原投与後、３日後
にマウス脾臓を無菌的に採取し、冷RPMI−1640培地中で
脾細胞浮遊液とし、同培地で２回洗浄した脾細胞（85％
以上の生細胞率）を融合に供した。

一方、15％ウシ胎児血清含有するRPMI−1640培地（NS−
１培地と称する）で３日間培養したNS−１ミエローマ
を、融合直前にRPMI−1640培地に浮遊した。NS−１ミエ
ローマ細胞の生細胞率は85％以上であった。

融合には、脾細胞数とミエローマ細胞数の比が５になる
ように混合し、1,000rpm、５分間遠心分離した。上清を
完全に除去したのち、沈査をよくほぐし、容器に激しい
回転と振動を加えながら、37℃に保温した50％ポリエチ
レングリコール4000（メルクNo.9727）溶液1mlを１分間
で加えた。つぎの１分間は回転振動を継続し、さらに、
37℃に保温したRPMI−1640培地10mlを、５分間かけて添
加した。直ちに、1000rpmで、５分間遠心分離した後、
上清を除去した。その沈査に、脾細胞につき５×10⁶個/
mlになるように37℃に保温したHAT培地を加え、均一な
細胞懸濁液とし、前日からNS−１培地で処理した96穴平
底マイクロプレートの各ウエルに0.1mlずつ分注した
後、37℃の６％炭酸ガス培養器でバイブリドーマ形成を
行わせた。３日間隔で各ウエルに50μｌのHAT培地を追
加した。９日頃から細胞増殖が確認され、12日以降から
ハイブリドーマ増殖が確認されたものについて抗体産生
の有無をELISA法によりスクリーニングした。全体の61
％のウエルにハイブリドーマ形成が認められ、そのうち
の16％のウエルが抗体産生陽性であった。スクリーニン
グされた抗体産生陽性の各ハイブリドーマを、24穴ウエ
ルマイクロプレートに移し、HT培地で３日間培養した
後、限界希釈法によりクローニングを２回行った。他の
菌株の被膜蛋白質についても同様にモノクローナル抗体
を作製した。

このようにして得られた所望のハイブリドーマは、以下
の培地で37℃にて５％の炭酸ガス存在下で培養すること
ができた。

７〜15％ウシ胎児血清を含むRPMI−1640 ７〜15％ウシ胎児血清を含むHT培地７〜15％ウシ胎児血清を含むHAT培地また、プリスタンで前処理したBALB/c系マウスの腹腔内
においても培養させことができた。このハイブリドーマ
を、10％ジメチルスルホキシドを含む増殖培地で凍結保
存することができた。このハイブリドーマはP1−11Cと
命名され、昭和63年11月２日に工業技術院、微生物工業
技術研究所に、微工研菌寄第10381号として寄託されて
いる。

このようにして得られた５種類のハイブリドーマの培養
上清の50％飽和硫安画分をモノクローナル抗体標本と
し、それぞれのモノクローナル抗体のトレポネーマ・デ
ンチコラATCC33520株に対する菌体凝集活性、ウェスタ
ンブロット法により調べた各モノクローナル抗体の認識
蛋白質抗原、オクテルロニー法により調べた各モノクロ
ーナル抗体のサブクラスを第２表に示す。

この結果から明らかなごとく、得られたモノクローナル
抗体のサブクラスはIgG₁あるいはIgG₃であり、それぞれ
活性に違いはあるものの菌体凝集活性を示した。

（４）家兎血清抗体及びモノクローナル抗体によるマク
ロファージ貧食能増強効果モルモット腹腔マクロファージを用い、トレポネーマ・
デンチコラに対する貧食能に及ぼす前記抗体の増強効果
を検討した。

ハンクス液にグリコーゲン刺激４日目のモルモット腹腔
マクロファージ、７日間培養したトレポネーマ・デンチ
コラATCC33520株および各種抗体（最終濃度10％）を加
え、37℃で嫌気的に振盪培養し、０、0.5、１、２時間
後に生菌数を測定した。加えたマクロファージ数は5.0
×10⁵個/mlであり、供試菌数は1.0×10⁶個/mlであっ
た。結果を第３表に示す。

第３表に示すごとく、対象群であるリン酸緩衝液（0.1
M,pH7.2）に比較し、各種抗体にマクロファージ貧食増
強効果が認められるが、その効果は、抗全菌体抗体、抗
超音波処理画分抗体に比べ、抗被膜画分抗体や抗53K蛋
白質抗体、モノクローナル抗体の方がより強かった。

（５）家兎血清抗体及びモノクローナル抗体によるトレ
ポネーマ・デンチコラのラット口腔内定着阻止効果７日間培養したトレポネーマ・デンチコラATCC35404株
をpH7.2の10mMPBSに濁度がOD₆₆₀＝1.0となるよう懸濁
し、各種抗体と容量比1:1で混合し、37℃で30分間反応
させた。対照群として抗体液の代りにリン酸緩衝液と混
合したのを使用した。

各群６匹のラットの前もって７日間木綿糸を結紮下顎第
一臼歯に上記の各処理菌液を0.1mlずつ連続５日間接種
した。その１週間後に結紮糸を取り、結紮糸中の全菌数
に占めるトレポネーマ・デンチコラの割合を蛍光抗体顕
微鏡法により算定した。

結果を第４表に示す。

第４表に示すごとく、供試したいずれの抗体もトレポネ
ーマ・デンチコラの口腔内定着を有無に阻止することが
認められた。供試抗体の中では抗全菌体抗体や抗超音波
処理画分抗体は他の抗体に比べ、定着阻止効果は低かっ
た。

実施例つぎに、実施例を挙げて本発明をさらに詳しく説明す
る。ここで％はいずれも重量％を示す。

〔実施例１〕練歯磨第２リン酸カルシウム・２水和物 50.0％ソルビトール 20.0％カルボキシメチルセルロース 1.5％ソジウムラウリルサルフェート 1.0％香料 1.0％サッカリン 0.1％水残 100.0％以上の成分にヤギ抗被膜画分血清0.1％〜0.5％またはヤ
ギ抗20K〜75K蛋白血清0.1％〜0.5％を配合する。

〔実施例２〕練歯磨第２リン酸カルシウム・２水和物 50.0％グリセリン 10.0％ソルビトール 10.0％ソジウムラウリルサルフェート 1.5％香料 1.0％サッカリン 0.1％クエン酸 0.5％水残 100.0％以上の成分にウシ抗被膜画分血清0.2％と、モノフルオ
ロリン酸ナトリウム0.2％または塩化セチルピリジニウ
ム0.1％を配合する。

〔実施例３〕練歯磨シリカ・２水和物 40.0％ソルビトール 20.0％２酸化チタン 5.0％カルボキシメチルセルロース 2.0％ショ糖モノラウレート 2.0％香料 1.0％サッカリン 0.1％水残 100.0％以上の成分にウシ抗20K〜75K蛋白質血清0.01％とクロル
ヘキシジングルコン酸塩0.05％または溶菌酵素0.05％を
配合する。

〔実施例４〕粉歯磨第２リン酸カルシウム・２水和物 50.0％炭酸カルシウム 30.0％ソルビトール 10.0％デキストラン 0.5％香料 1.0％パラチノース 0.1％水残 100.0％以上の成分にヒツジ抗53K蛋白質血清0.05％と塩化セチ
ルピリジニウム0.05％または溶菌酵素0.05％を配合す
る。

〔実施例５〕液状歯磨ポリアクリン酸ナトリウム 50.0％グリセリン 30.0％香料 1.0％パラチノース 0.1％エタノール 3.0％水残 100.0％以上の成分にウシ抗被膜画分母乳0.01％または0.02％
と、塩化亜鉛0.1％またはプロテアーゼ100単位/gを配合
する。

〔実施例６〕マウスウオッシュエタノール 20.0％香料 1.0％カッカリン 0.05％色素 0.5％水残 100.0％以上の成分に鶏卵抗20K〜75K蛋白質抗体の0.01％または
0.02％と、塩化セチルピリジニウム0.05％またはクロル
ヘキシジングルコン酸塩0.05％を配合する。

〔実施例７〕トローチアラビアゴム 10.0％乳糖 60.0％ゼラチン 3.0％香料 0.5％ｌ−メントール 0.1％ペパーミント油 0.1％トコフェロール 0.1％水残 100.0％以上の成分に抗53K蛋白質モノクローナル抗体0.05％ま
たは0.1％と塩化セチルピリジニウム0.01％またはアズ
レン0.01％を配合する。

〔実施例８〕歯肉マッサージクリーム白色ワセリン 10.0％プロピレングリコール 3.0％ステアリルアルコール 4.0％ポリエチレングリコール6000 20.0％ポリエチレングリコール600 40.0％ショ糖オレイン酸エステル 0.5％水残 100.0％以上の成分にウシ抗被膜画分血清0.01％又は0.02％と塩
化リゾチーム0.05％または生薬抽出物0.05％またはトラ
ネキサム酸0.1％を配合する。

〔実施例９〕口腔用パスタポリオキシエチレンモノステアレート 2.0％ソルビタンモノオレエート 3.0％オレインアルコール 4.0％ポリエチレングリコール 10.0％カルボキシメチルセルロース 5.0％ゼラチン 1.0％ペパーミント油 0.5％水残 100.0％以上の成分に抗50K蛋白質モノクローナル抗体01％また
は0.2％と、オイゲノール0.1％または溶菌酵素0.05％ま
たは生薬抽出物0.05％を配合する。

〔実施例10〕ヨーグルト脱脂乳 200kg 加糖練乳^＊＊ 50kg パラチノース 10kg 以上の成分を常法により醗酵する。^＊＊ウシ抗被膜画分母乳10％を含有以上の成分にバクテリオシン0.01％または溶菌酵素0.02
％またはムタナーゼ1000単位/gを配合する。

発明の効果本発明によれば、トレポネーマ・デンチコラの口腔内定
着を顕著に抑制し、歯周病の予防、治療に有効な口腔用
組成物が得られる。

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】トレポネーマ・デンチコラ被膜を抗原と
し、これを哺乳動物に免疫することによって得られる血
中抗体または乳汁抗体を含有してなることを特徴とする
トレポネーマ・デンチコラの口腔内定着抑制用口腔用組
成物。
【請求項２】トレポネーマ・デンチコラ被膜表層に存在
する蛋白質を抗原とし、これらを哺乳動物に免疫するこ
とによって得られる血中抗体または乳汁抗体を含有して
なることを特徴とするトレポネーマ・デンチコラの口腔
内定着抑制用口腔用組成物。
【請求項３】トレポネーマ・デンチコラ被膜または該被
膜表層に存在する蛋白質を抗原とし、これを鳥類に免疫
し、その卵中に含まれる抗体を含有してなることを特徴
とするトレポネーマ・デンチコラの口腔内定着抑制用口
腔用組成物。
【請求項４】トレポネーマ・デンチコラの被膜蛋白質抗
原に対する抗体産生細胞とミエローマ細胞との細胞融合
により得られるハイブリドーマより産生される蛋白質抗
原に対するモノクローナル抗体を含有してなることを特
徴とするトレポネーマ・デンチコラの口腔内定着抑制用
口腔用組成物。