JPH0773495B2

JPH0773495B2 - 耐熱・耐塩性グルタミナーゼ

Info

Publication number: JPH0773495B2
Application number: JP24508687A
Authority: JP
Inventors: 保之本川; 善範兼松; 貢笠原; 孝樹山縣; 俊夫田中; 文雄原; 博祢宜
Original assignee: SHODA SHOYU CO., LTD.
Current assignee: SHODA SHOYU CO., LTD.
Priority date: 1987-09-29
Filing date: 1987-09-29
Publication date: 1995-08-09
Anticipated expiration: 2010-08-09
Also published as: JPS6486873A

Description

【発明の詳細な説明】〔産業上の利用分野〕本発明は新規な耐熱・耐塩性グルタミナーゼに関する。

〔従来の技術〕

グルタミナーゼは食品工業、特に蛋白質を酵素的に分解
して調味食品を製造する場合に重要な役割を果たす酵素
である（例えば、特公昭49−48759号公報等参照）。

〔発明が解決しようとする問題点〕

従来公知のグルタミナーゼは、上記した特公昭49−4875
9号公報記載のものを含め、何れも耐塩性が全くない
か、あるいは比較的弱いものであるため、このようなグ
ルタミナーゼを用いて食塩を多量に含む調味料等の食品
を製造するには問題があった。

蛋白質を酵素的に分解する場合、原料蛋白質は種々の蛋
白質分解酵素の作用により、ペプタイドを経て最終的に
構成アミノ酸にまで分解される。斯かる場合に生成した
グルタミンは、グルタミナーゼ非存在下においては、非
酵素的に容易にフエノール臭、および苦味を有するピロ
グルタミン酸へと変化する。またグルタミンがプログル
タミン酸へ変化してゆく速度は高温になるほど増加す
る。このような分解系にグルタミナーゼを共存させれ
ば、グルタミンがピログルタミン酸になる変化を防止す
ることが可能であるのみならず、遊離のグルタミンに見
合う量のグルタミン酸に転換されることが知れている。
食塩存在下において高温で蛋白質を酵素的に分解し、ア
ミノ酸調味食品を製造することは、蛋白質の分解速度を
高め、雑菌による汚染を極力防止し優良な調味料を製造
する手段として極めて有効な方法である。しかしなが
ら、このような条件を採用するためには使用するグルタ
ミナーゼが耐熱性および耐塩性を有することが必要であ
る。

〔問題を解決するための手段〕

斯かる現状に鑑み、本発明者は高濃度の食塩を含有する
食品の製造に用いることのできる耐熱・耐塩性グルタミ
ナーゼを提供すべく鋭意検討を重ねた結果、新たにプレ
ラ属に属する菌の培養物から耐熱性、耐塩性に優れ、か
つ食品衛生上問題のない新規なグルタミナーゼが得られ
ることを見出し、本発明を完成した。

すなわち、本発明はブレラ属に属する菌により生産され
る次の理化学的性質を有する耐熱・耐塩性グルタミナー
ゼを提供するものである。

（ａ）作用Ｌ−グルタミンを加水分解してＬ−グルタミン酸とアン
モニアを生成する酵素である。

（ｂ）基質特異性Ｌ−グルタミンに対するKm値（ミカエリス定数）は、30
℃、pH7.5（リン酸緩衝液）で8.1×10^-4Mである。

（ｃ）至適pH及び定数pH定数至適pHはＬ−グルタミンを基した場合5.0〜9.0であり、
安定pH範囲は5.〜8.0である。

（ｄ）耐熱性 pH7.5にて各温度で30分間保存したときのグルタミナー
ゼ活性の残存率は、50℃で90％以上、60℃で71％であ
る。

（ｅ）耐塩性食塩非存在下での酵素活性を100％とした場合、10％w/
v）食塩濃度で約80％以上の相対活性を示し、20％（w/
v）食塩濃度で約70％以上の相対活性を示す（pH7.5、30
℃）。

（ｆ）分子量約150,000（ゲル過法）以下、本発明の耐熱・耐塩性酵素の理化学的性質につい
て詳細に説明する。

（１）作用本酵素は、Ｌ−グルタミンを加水分解してＬ−グルタミ
ン酸とアンモニアを生成する酵素である。

（２）基質特異性第１表に示す各基質（0.25M）1.0mlを0.4Mリン酸緩衝液
（pH7.5）0.25mlに加え、これに本酵素1.25mlを加え30
℃で60分間反応させた。これに0.75N過塩素酸液0.625ml
を添加して反応を停止させ、0.75N水酸化ナトリウム0.6
25mlを加えて反応液を中和させた。なお、ブランク値は
本酵素1.25mlに0.75N過塩素酸液0.625mlを加え、これに
各基質及び緩衝液（pH7.5）を夫々、1.0ml、0.25ml加え
た液を上記と同条件で処理したもの（反応時間が０時間
のもの）を用いた。

次に、前記酵素反応により生成したアンモニアをＦ−キ
ツト尿素／アンモニア定量用キツト〔ベーリンガー社
製〕を用いて測定した。相対活性（％）は、Ｌ−グルタ
ミンを基質として酵素反応させて得られるアンモニア量
を100％とし、他の物質を基質とした場合の比較値
（％）で示した。

本酵素のＬ−グルタミンに対するKm値（ミカエリス定
数）は30℃、pH7.5（リン酸緩衝液）で8.1×10^-4Mであ
る。

（３）至適pHおよび安定pH範囲本酵素の至適pHはＬ−グルタミンを基質とした場合、第
１図に示す如く、pH5.0〜9.0である。なお第１図中○−
○はマクイルベイン緩衝液（pH4.5〜8.0）、△−△はリ
ン酸緩衝液（pH7.5〜9.0）を用いたものである。

また、安定pH範囲は、0.25単位の本酵素を含有する各緩
衝液6mlを30℃で24時間放置後、残存活性を測定するこ
とによつて調べた。その結果は第２図に示す如くであ
り、pH5.0〜8.0で安定であつた。なお第２図中、緩衝液
はマクイルベイン緩衝液（pH4.5〜8.0）を用いたもので
ある。

（４）グルタミナーゼ活性の測定法 250mM Ｌ−グルタミン溶液4.0mlに0.4Mリン酸緩衝液1.
0ml（pH7.5）及び本酵素液5.0mlを加え、30℃で60分間
反応させた後、沸騰水中で10分間加熱して反応を停止さ
せる。次に、ベーリンガー社製、Ｌ−グルタミン酸測定
用キツトにより上記の反応液0.2mlにトリエタノールア
ミン200mMを含む25mMリン酸緩衝液2.3ml（pH8.6）、6.7
mM NAD⁺溶液0.2ml、1.19mMヨードニトロテトラゾリウム
クロライド溶液0.2ml、0.1％（w/v）ジアホラーゼ溶液
0.05ml及びグルタミン酸脱水素酵素0.05mlを添加し、室
温で反応させ、分光光度計により492nmにおける吸光度
値を測定する。

更に、予め作成したＬ−グルタミン酸の検量線より、そ
の生成量を求めた。30℃、１分間当り１マイクロモルの
Ｌ−グルタミン酸を生産する酵素量を１単位とした。

（５）作用適温の範囲第３図に示す如く、本酵素の作用適温の範囲は55〜65℃
にある（反応時間60分間・pH7.5）。

（６）熱安定性本酵素を0.25単位含有する酵素液6ml（pH7.5）を各温度
に30分間放置し、残存する酵素活性量を測定した結果、
第４図に示す如く、60℃において70％の残存活性を示
し、50℃において95％の残存活性を示した。

（７）分子量本酵素の分子量はセフアクリルＳ−300（フアルマシア
社製）を用い、ゲル過法により、0.2M食塩を含有する
0.1Mリン酸緩衝液（pH7.0）にて測定した結果、約15万
であつた。

（８）耐塩性本酵素を0.25単位含有する酵素液5.0mlに、反応液中食
塩濃度が０〜20％となるように食塩を加えた250mM Ｌ
−グルタミンを含有する0.4Mリン酸緩衝液5.0mlを加
え、酵素活性（pH7.5、30℃、反応時間60分）を調べ
た。その結果、第５図に示す如く、食塩非存在下での酵
素活性を100％とした場合、食塩濃度10％（w/v）では約
80％以上、20％（w/v）では約70％以上の相対活性を示
した。

（９）精製方法本酵素は後記する精製方法により精製することが出来
る。

（10）デイスク電気泳動デーヴイス〔B.J.Davis,Ann.New York Acad.Sei.,121,4
04（1964）〕のpH8.9のゲルを用いて2mA/ゲル・カラム
で５℃,90分（分離用ゲルの泳動時間）泳動し、その後
アミドブラツクにて染色すると、陽極側に移動した単一
なバンドが認められた。

（11）等電点アンフオライン・キヤリアー・アンフオライト（pH3.5
〜10）を使用して本酵素の等電点を測定したところ、4.
5±0.2であつた。

以上の如く、本酵素はその酵素化学的、物理化学的な諸
性質が従来のグルタミナーゼの何れとも異つており、殊
に著しく耐熱性、耐塩性が強い。従つて、本酵素の高濃
度の食塩存在下での使用に際し、食塩により酵素活性が
ほとんど阻害されないため有利である。

次に本発明に係る耐熱・耐食塩グルタミナーゼの製造法
について説明する。

本発明において使用されるブレラ属に属する菌として
は、例えばブレラ・オリゼー（Bullera oryzae）JCM528
1が挙げられる。尚、この菌は理化学研究所に保存され
ていて常に何人も容易に入手できるものである。

ブレラ・オリゼーJCM5281を培養し、培養物より耐熱・
耐塩性グルタミナーゼを製造する方法は次の如くして実
施される。

先ず、培養法としては、通常液体好気培養法が有利であ
り、例えばフラスコによる振盪培養法や通気撹拌装置の
付いたジヤーフアーメンター，タンクフアーメンター等
による好気培養法が挙げられる。培養温度は15〜30℃、
好ましくは20〜25℃であり、培養時間は通常16時間程度
以上である。

また使用する培地としては、液体培地が好適であり、培
地に加えられる栄養源としては、一般に微生物を培養す
る際に用いられる種々の栄養源を使用できる。即ち、炭
素源としては、例えばグルコース、マルトース等の単糖
類や少糖類等が用いられ、窒素源としては、例えばペプ
トン、肉エキス、酵母エキス、コーンステイープリカ
ー、カザミノ酸、脱脂大豆抽出液、小麦グルテンの加水
分解物、アンモニウム塩、硝酸塩等が用いられる。この
他マグネシウム、カルシウム、ナトリウム、リン酸塩等
の塩類、微量栄養物質等を添加しても良い。

このような培養法を用いて得られる培養液もしくは、該
培養液を過、遠心分離等により固液分離し、集菌して
得られる培養菌体に、細胞壁溶解酵素含有物、例えば細
胞壁溶解酵素生産能を有するリゾープス属起源の培養液
もしくは該培養液より得られる酵素液を加え、該グルタ
ミナーゼを可溶化させる。

なお、上記耐熱・耐塩性グルタミナーゼを可溶化する際
の温度は30〜50℃、好ましくは35〜45℃、液性はpH3.0
〜7.0、好ましくはpH4.0〜6.0、時間は２〜72時間、好
ましくは16〜48時間程度であり、作用時の細胞壁溶解酵
素含有濃度は0.1％（w/v）以上、好ましくは0.5〜1.5％
（w/v）程度である。

得られた耐塩性グルタミナーゼ含有液より該酵素を採取
する手段としては、例えば本酵素含有液を常法により遠
心分離して菌体を除去し、更に必要により透析、イオン
交換樹脂に吸着、溶出させる方法、ゲル過等により本
発明に係る耐熱・耐塩性グルタミナーゼを単離すること
ができる。

〔発明の効果〕

本発明に係る耐熱・耐塩性グルタミナーゼは、高濃度の
食塩存在下においても食塩により酵素の活性がほとんど
阻害されないため、高濃度の食塩を含む調味料等の食品
を製造するのに用いれば、旨味成分であるグルタミン酸
が著しく増強された食品を効率良く得ることができ、食
品生産上極めて有意義である。

〔実施例〕

以下に本発明の実施例示す。

実施例１プレラ・オリゼー（Bullera Oryzae）JCM5281を500ml坂
口フラスコ中でグルコース１％、酵母エキス0.3％、麦
芽エキス0.3％、ペプトン0.5％を含みpH5.5に調整した
液体培地100mlに植菌し、25℃、48時間培養した。この
種培養物を５ジヤーフアーメンター中、上記の組成と
同じ培地３に接種し、通気量１/min、撹拌速度300r
pmの条件下で25℃、48時間培養し、培養物を遠心分離機
にて遠心分離して集菌した。

得られた菌体のうち、150gに0.2M酢酸緩衝液（pH5.0）
を１加え、菌をよく分散させた。次に、これに細胞壁
溶解酵素としてグルクザイム6000（天野製薬社製）を8g
加え、40℃で16時間撹拌し、その後遠心分離後にて遠心
分離（10000rpm、10分間）して上清液を得た。

上記の上清液に、0.02M酢酸緩衝液（pH5.0）で緩衝化し
たアンバーライトCG−50を添加し、１時間撹拌して酵素
を吸着させ、0.02M酢酸緩衝液（pH5.0）で良く洗浄し、
続いて７％（w/v）硫酸アンモニウム（pH7.0）で溶出し
て活性区分を集めた。

次に、この酵素溶液に硫酸アンモニウムを0.8飽和とな
るように加えた後、遠心分離機にて、遠心分離（10,000
rpm、10分間）して沈澱物を得た。

得られた沈澱物を0.02Mリン酸緩衝液（pH6.5）にて溶解
し、さらに0.02Mリン酸緩衝液（pH6.5）で透析し、粗酵
素液を得た。

上記の粗酵素液を、0.02Mリン酸緩衝液（pH6.5）で緩衝
化したDEAE−トヨパール650Mカラム（東洋ソーダ社製）
に通し、酵素を吸着させ、0.02M酢酸緩衝液（pH6.5）で
よく洗浄し、続いてNaCl0〜0.5モルの濃度勾配で溶出し
て活性区分を集めた。次にこの酵素溶液を限外過装置
（分画膜10,000,アミコン社製）にて濃縮した。濃縮さ
れた酵素液を0.2Mの食塩を含む0.1Mリン酸緩衝液（pp7.
0）で緩衝化しておいたセフアクリルＳ−300を充填した
カラム（5.0×80cm）にかけゲル過した。

得られた活性区分を限外過装置にて濃縮し単一な酵素
標品4.7mgを得た。その結果、本酵素の比活性は5.5単位
/mgであつた。

実施例２ブレラ・オリゼー（Bullera Oryzae）JCM5281を500ml坂
口フラスコ中でグルコース１％、酵母エキス0.3％、麦
芽エキス0.3％、ペプトン0.5％を含みpH5.5に調整した
液体培地100mlに植菌し、25℃、48時間培養した。この
種培養物を５ジヤーフアーメンター中、上記の組成と
同じ培地３に接種し、通気量１/min、撹拌速度300r
pmの条件下で25℃、48時間培養し、培養物を遠心分離機
にて遠心分離して集菌した。

得られた菌体のうち、150gに0.2M酢酸緩衝液（pH5.0）
を１加え、菌をよく分散させた。次に、細胞壁溶解酵
素としてグルクザイム6000（天野製薬社製）を0.02M酢
酸緩衝液に溶解し、0.02M酢酸緩衝液（pH5.0）で緩衝化
したセフアデツクスＧ−50（フアルマシア社製）を充填
したカラム（580cm）にかけゲル過し、得られた細胞
壁溶解活性を有する画分を全量加えて、40℃、16時間撹
拌し、その後、遠心分離機にて遠心分離（10,000rpm,10
分間）して上静液を得た。

上記の上静液に、0.02M酢酸緩衝液（pH5.0）で緩衝化し
たアンバーライトCG−50添加し、１時間撹拌して酵素を
吸着させ、0.02M酢酸緩衝液（pH5.0）で良く洗浄し、続
いて７％（w/v）硫酸アンモニウム（pH7.0）で溶出して
活性区分を集めた。次にこの酵素溶液に硫酸アンモニウ
ムを0.8飽和となるように加えた後、遠心分離機にて遠
心分離（10,000rpm,10分間）して沈澱を得た。得られた
沈澱物を0.02Mリン酸緩衝液（pH6.5）にて溶解し、さら
に0.02Mリン酸緩衝液（pH6.5）で透析し、粗酵素液を得
た。

上記の粗酵素液を、0.02Mリン酸緩衝液（pH6.5）で緩衝
化したDEAE−トヨパール650M（東洋ソーダ社製）に通
し、酵素を吸着させ、0.02Mリン酸緩衝液（pH6.5）でよ
く洗浄し、続いてNaCl0〜0.5Mの濃度勾配で溶出して活
性区分を集めた。次に、この酵素溶液を限外過装置
（分画膜10,000,アミコン社製）にて濃縮した。濃縮さ
れた酵素液を0.2Mの食塩を含む0.1Mリン酸緩衝液（pH7.
0）で緩衝化しておいたセフアクリルＳ−300を充填した
カラム（５×80cm）にかけゲル過した。

得られた活性区分を0.02M酢酸緩衝液（pH5.0）で透析
し、0.02M酢酸緩衝液（pH5.0）で緩衝化したDEAE−トヨ
パール650M（東洋ソーダ社製）に通し、酵素を吸着さ
せ、0.02M酢酸緩衝液（pH5.0）でよく洗浄し、続いてNa
Cl0〜0.1Mの濃度勾配で溶出して活性区分を集めた。次
に、この酵素溶液を限外過装置（分画膜10,000,アミ
コン社製）にて濃縮した。濃縮された酸素液を0.2Mの食
塩を含む0.1Mリン酸緩衝液（pH7.0）で緩衝化しておい
たセフアクリルＳ−300を充填したカラム（５×80cm）
にかけゲル過した。得られた活性区分を限外過装置
にて濃縮し、単一な酵素標品1.15mgを得た。この結果、
本酵素の比活性は22.5単位/mgであつた。

【図面の簡単な説明】

第１図は本酵素の至適pHを示す図面、第２図は安定pH範
囲を示す図面、第３図は作用適温の範囲を示す図面、第
４図は熱安定性を示す図面、第５図は耐塩性を示す図面
である。

フロントページの続き (72)発明者田中俊夫滋賀県長浜市神前町10―52 エクセレント神前105号 (72)発明者原文雄埼玉県川越市大字的場947―３ (72)発明者祢宜博埼玉県入間郡大井町緑ケ岡２―23―16

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】ブレラ属に属する菌により生産される次の
理化学的性質を有する耐熱・耐塩性グルタミナーゼ。（ａ）作用Ｌ−グルタミンを加水分解してＬ−グルタミン酸とアン
モニアを生成する酵素である。（ｂ）基質特異性Ｌ−グルタミンに対するKm値（ミカエリス定数）は、30
℃、pH7.5（リン酸緩衝液）で8.1×10^-4Mである。（ｃ）至適pH及び安定pH範囲至適pHはＬ−グルタミンを基質とした場合5.0〜9.0であ
り、安定pH範囲は5.0〜8.0である。（ｄ）耐熱性 pH7.5にて各温度で30分間保存したときのグルタミナー
ゼ活性の残存率は、50℃で90％以上、60℃で71％であ
る。（ｅ）耐塩性食塩非存在下での酵素活性を100％とした場合、10％（w
/v）食塩濃度で約80％以上の相対活性を示し、20％（w/
v）食塩濃度で約70％以上の相対活性を示す（pH7.5、30
℃）。（ｆ）分子量約150,000（ゲル過法）