JPH0460637B2 - - Google Patents
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- JPH0460637B2 JPH0460637B2 JP61222223A JP22222386A JPH0460637B2 JP H0460637 B2 JPH0460637 B2 JP H0460637B2 JP 61222223 A JP61222223 A JP 61222223A JP 22222386 A JP22222386 A JP 22222386A JP H0460637 B2 JPH0460637 B2 JP H0460637B2
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
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Description
本発明は、タラロマイセス・デユポンチ
（Talaromyces duponti）からトランスグルコシ
ダーゼを調製する新規な方法に関する。このトラ
ンスグルコシダーゼは、非常に熱安定性であり、
マルトースのパノースおよびイソマルトースへの
転化において有用である。 トランスグルコシダーゼ（また、１，４−α−
Ｄ−グルカン−６−アルフア−Ｄ−グルコシルト
ラスフエラーゼおよびトランスグルコシラーゼと
しても知られている）は、種々の微生物から得ら
れてきている。それは三糖類のパノースおよび二
糖類のイソマルトースをマルトースから結合の切
断および結合の形成によつて生成させる酵素であ
る。これらのオリゴ糖類は非発酵性であり、こう
して食品、ソフトドリンクおよび酒の工業におい
て、ならびに新しい食品の配合において使用され
る。例えば、ヌノカワらの特願昭56−27236号参
照。この特許出願には、アスペルギルス・サイト
イ（Aapergillus saitoi）またはアスペルギル
ス・ウサミ（A.usami）の株を培養することによ
つてトランスグルコシダーゼおよびグルコアミラ
ーゼを製造する方法が記載されている。トランス
グルコシダーゼを保持するが、グルコアミラーゼ
を溶離液中に存在させる樹脂含有カラムに、前記
培養物の濾液を通過させる。酢酸塩緩衝溶液でPH
5.5において前記樹脂からトランスグルコシドを
除去する。また、パズル（Pazur）ら、「菌・カ
ビのトランスグルコシラーゼの単離および作用の
モード（The Isolation and the Mode of
Action of ａ Fungal Transglicosylase）」、ネ
ブラスカ大学、生化学および栄養学部、ネブラス
カ州リンコルン、アーチーブス・オブ・バイオケ
ミストリー・アンド・バイオフイジツクス
（Archives of Biochemistry Biophysics）、
Vol.93、43−49ページ（1961）には、アスペルギ
ルス・ニガー（Aapergillus niger）を得る方法
が記載されており、この方法はDEAE−セルロー
ス（ジエチルアミノエチル−セルロース）、でん
ぷんおよびカルボキシメチルセルロースのクロマ
トグラフイーおよび吸着により、この酵素を他の
同時産生された炭水化物から分離することを含
む。 他方において、タムラらの米国特許第4247637
号は、タラロマイセス・デユポンチ
（Talaromyces duponti）の株から熱安定性グル
コアミラーゼを製造する方法を記載しており、の
方法はこの株を栄養培地中で培養し、そしてその
酵素を単離することを含む。前記株を培養し、そ
して菌糸体を濾過により除去した後、濾液を活性
粘土に通過させ、そしてグルコアミラーゼを流出
液中に存在させる。タラロマイセス・デユポンチ
（Talaromyces duponti）が、また、トランスグ
ルコシダーゼ、いうまでもなく非常に熱安定性の
トランスグルコシダーゼを分泌するであろうとい
う認識は、米国特許第4247637号にはまつたく存
在しない。 本発明は、タラロマイセス・デユポンチ
（Talaromyces duponti）の株を適当な栄養生長
培地中で培養し、そしてトランスグルコシダーゼ
をそれから単離することを特徴とするトランスグ
ルコシダーゼを調製する方法を提供する。本発明
は、また、タラロマイセス・デユポンチ（T.
duponti）種の菌・カビ（fungus）により産生さ
れたトランスグルコシダーゼを提供する。 本発明は、詳しくは、菌・カビ（fungus）の
種タラロマイセス・デユポンチ（T.duponti）か
らの酵素トランスグルコシダーゼに関する。この
酵素はこの微生物の栄養生長培地中の発酵により
提供される。発酵の間にその酵素は分泌され、そ
の発酵後、バイオマスを発酵ブイヨンから任意に
液体固体分離技術、例えば、濾過または遠心分離
およびデカンテーシヨンにより除去して、酵素含
有溶液を得ることができる。 典型的には、通常のカビを培養するために用い
られる培地がタラロマイセス・デユポンチ（T.
duponti）の発酵の栄養源として使用される。
種々の炭素源はよく知られており、そしてでんぷ
ん、糖蜜、コーンミールなどから選択することが
できる。窒素源も普通に知られており、そして典
型的な例は大豆、綿実油、ペプトン、コーン浸出
液、酵母エキスなどである。硫酸塩類および／ま
たは塩化物塩類、硫酸マグネシウム、塩化カルシ
ウム、塩化ナトリウムおよび塩化カリウムは、ま
た、発酵培地中に使用される。しばしば、リン酸
塩類は同じようによく緩衝剤として機能するの
で、また、使用される。さらに、発酵培地のPH
は、好ましくは中性に近い範囲内に、塩基類、例
えば、水酸化ナトリウムまたは水酸化カリウムお
よび／または酸類、例えば、塩酸または酢酸で調
節することができる。 PH、時間および温度の条件はカビを培養する分
野においてよく知られている。PHは約３〜約９の
範囲内、より好ましくは約５〜約８の範囲内でな
くてはならない。培養基のために非常に有利なPH
は中性に近い。発酵はほぼ２〜10日の任意の期
間、より好ましくはほぼ４〜８日間実施する。温
度は約25℃〜約50℃の間、より好ましくは30℃〜
45℃であるべきである。最適な生長温度は40℃の
付近である。 タラロマイセス・デユポンチ（Talaromyces
duponti）種に属する任意の菌・カビ（fungus）
類を本発明において使用することができる。非常
に有利な実施態様において、使用するタラロマイ
セス・デユポンチ（T.duponti）の株は、茨城県
つくば市の通商産業省、工業技術院微生物微生物
工業研究所に受託され、そして受託番号4566を与
えられている。この特定の菌・カビの株により産
生されるトランスグルコシダーゼは、下の実施例
において証明されるように、ことに好熱性である
ことが、予期されないことには発見された。ま
た、FERM Ｐ−4566の突然変異株を使用でき
る。タラロマイセス・デユポンチ
（Talaromyces duponti）の同定は、クーニー
（Cooney）およびエマーソン（Emerson）、「好熱
性菌・カビ類（Thermophilic Fungi）、および
アワオ（Awao）およびミツギ（Mitsugi）、
“Trans.Mycol.Soc.），Japn，Vol.14に記載され
ている。この株およびの増殖についてのそれ以上
の詳細は、米国特許第4247637号に記載されてい
る。 タラロマイセス・デユポンチ（T.duponti）の
培養物が適当な栄養培地中で所望の状態の細胞の
塊に到達したとき、バイオマスを任意の液体／固
体分離法により、例えば、濾過により、あるいは
遠心分離および引き続くデカンテーシヨンにより
除去する。次いで、この酵素を含有する溶液、す
なわち、濾液または上澄み液を濃縮、沈殿、ある
いはそれらの組み合わせにより処理する。例え
ば、この溶液を通常の方法、例えば、限外濾過お
よび／または蒸発により濃縮できる。次いで、酵
素を濃縮物から（あるいは濃縮を行わなかつた場
合、溶液から）無機塩類、例えば、硫酸アンモニ
ウムまたは硫酸ナトリウムの添加により、あるい
は有機溶媒、例えば、メタノール、エタノールま
たはアセトンの添加により、ケーキまたはスラリ
ーの形態で沈殿させることができる。酵素含有ケ
ーキを沈殿させた後、次いでそれを溶液、例え
ば、水または緩衝化した水の中でスラリー化し
て、酵素をそれから溶解するか、あるいは抽出
し、そして酵素含有抽出液を得ることができる。
PH選択手溶離のため、後述するように、クエン酸
塩−リン酸塩緩衝液（PH8.0）を使用し、次いで
望ましくは酵素含有緩衝化抽出液を、好ましくは
一夜、透析することが好ましい。 トランスグルコシダーゼ含有溶液を、前節に記
載したようにのようにそれが濃縮法、沈殿法また
はそれらの組み合わせのいずれにより得られたに
しろ、次いで、例えば、粘度の処理、クロマトグ
ラフイー、またはそれらの組み合わせにより精製
する。 例えば、クロマトグラフイーはトランスグルコ
シダーゼ含有溶液を、ジエチルアミノエチレン−
セルロース（DEAE−セルロース）のカラムに、
適当なPHにおいて通過させることによつて実施で
きる。トランスグルコシダーゼ含有溶液はほぼ７
〜９、より好ましくは８のPHに緩衝化すべきであ
り、および／またはカラムはほぼ７〜９、より好
ましくは８のPHに平衡化すべきである。これは好
ましくはクエン酸ナトリウム−リン酸塩緩衝液
（PHほぼ8.0）を使用して達成される。ほぼ７〜
９、より好ましくは８のPHにおいて、トランスグ
ルコシダーゼは流出物の分画中に存在し、これに
対して他の不純物、例えば、グルコアミラーゼは
カラム中にとどまる。追加のトランスグルコシダ
ーゼはカラムを少なくともDEAE−セルロースの
体積の体積量のより緩衝性の溶液で洗浄すること
によつて回収される。グルコアミラーゼおよび他
の不純物を実質的に含まないトランスグルコシダ
ーゼ溶液が得られる。 あるいは、バイオマスを栄養生長培地から、任
意の固体／液体分離技術、例えば、前述のもの、
により除去したてトランスグルコシダーゼ含有溶
液を得たのち、次いでトランスグルコシダーゼを
この溶液から、粘土、好ましくは粒状ベントナイ
トを、適当なPH、望ましくは３〜５のPHにおいて
添加することよつて単離することができる。アス
ペルギルス・ニガー（Aapergillus）またはリゾ
ープス（Rhizopus）からのトランスグルコシダ
ーゼおよびグルコアミラーゼの両者を含有する溶
液からトランスグルコシダーゼを除去するための
粘土の技術は、米国特許第3042584号に開示され
ている。 トランスグルコシダーゼは粘土と反応生成物を
形成し、この生成物は凝固し、そして溶液の底に
沈殿して、グルコアミラーゼを溶液中に残す。次
いで、この反応生成物を溶液から標準の固体／液
体分離技術により分離し、次いでトランスグルコ
シダーゼを粘土から溶離溶液で溶離することがで
き、ここで溶離溶液は粘土とトランスグルコシダ
ーゼが沈殿を形成する範囲外のPH、好ましくは中
性またはアルカリ性のPHを有する。 タラロマイセス・デユポンチ（Talaromyces
duponti）から得られるトランスグルコシダーゼ
は非常に熱安定性である。例えば、60℃におい
て、活性のために最適なPHはほぼ4.5〜5.0であ
る。精製されたトランスグルコシダーゼの最適温
度は70℃である。 本発明に従いタラロマイセス・デユポンチ
（T.duponti）からのトランスグルコシダーゼの
熱失活を、アスペルギルス・ニガー
（Aapergillus niger）からのトランスグルコシダ
ーゼと70℃において比較した。より詳しくは、70
℃においてわずかに60分後に、アスペルギルス・
ニガー（Aapergillus niger）からのトランスグ
ルコシダーゼは完全に失活し、これに対して活性
の40％以上がタラロマイセス・デユポンチ（T.
duponti）からのトランスグルコシダーゼについ
てなお残る。これらの好熱性は下の実施例中の表
Ａ、表Ｂおよび表Ｃにさらに詳しく記載されてい
る。 本発明のトランスグルコシダーゼはマルトース
を、非発酵性の糖類である三糖類のパノースおよ
び二糖類のイソマルトースに転化するために使用
できる。これらの非発酵性オリゴ糖類の形成は、
マルトース含有溶液をトランスグルコシダーゼと
一緒にインキユベーシヨンすることによつて実施
することができる。この系において、また、形成
する発酵性糖のグルコース、ならびに多少の残留
するマルトースは得られたものの中に典型的には
存在するであろう。インキユベーシヨンは50〜70
℃で１〜６日間実施し、PHは酸性の範囲に維持す
る。非常に有利な実施態様において、インキユベ
ーシヨンは60℃およびPH4.5（0.1モルの酢酸ナト
リウムの緩衝液）において72時間実施する。 次の実施例により本発明の好ましい実施態様を
開示し、そしてこの実施例中に開示される実施態
様に本発明は限定されない。 実施例 びんの発酵器に、５％の可溶性リントナー
（Lintner）でんぷん、２％のコーン浸漬液、0.5
％のフアーマメデイア（Pharmamedia ）［トレ
イダー・プロレイン・カンパニー（Trader
Protein Co.）、0.5％の酵母エキス［デイフコ・
ラボラトリーズ（Difco Laboratories）、ミシガ
ン州デトロイトから供給される］、0.1％の硫酸マ
グネシウムおよび0.01％の塩化カルシウムを含
む、1NのNaOHでPH7.0に調節されている液状発
酵培地の10リツトルを添加した。 びん発酵器から培地の５つの100mlのアリコー
トを取り出し、各アリコートを500mlのエルレン
マイヤーフラスコ中に分配し、次いですべての５
つを20分間121℃でインキユベーシヨンして培地
を滅菌することによつて、５つの種培養物を調製
した。次いで、各滅菌した試料にタラロマイセ
ス・デユポンチ（Talaromyces duponti）株
FRI4566（アメリカン・タイプ・カルチユア・コ
レクシヨンにATCC20805として国際寄託されて
いる）を接種し、そして回転振盪器上で40℃にお
いて６時間振盪した。次いで、５つの試料を一緒
にしてほぼ500mlを得た。培地の残部をびん発酵
器内で121℃に20分間加熱し、次いで500mlのタラ
ロマイセス・デユポンチ（T.duponti）株
FRI4566を接種し、そして40℃で７日間攪拌し
た。発酵の終りにおいて、菌糸体を全発酵ブイヨ
ンから濾過により除去して、細胞不含濾液を得
た。 固体の硫酸アンモニウムを濾液に70％の飽和度
で添加することによつて、スラリーを沈殿させ
た。沈殿を遠心分離し、次いで上澄み液をデカン
テーシヨンすることによつて回収した。次いで、
次いで、酵素を200mlの0.05モルのクエン酸塩−
リン酸塩緩衝液（PH8.0）中で沈殿から溶解し、
そして同一緩衝液に対して一夜透析した。0.1モ
ルのクエン酸ナトリウム−リン酸塩緩衝液（PH
8.0）と平衡化したDEAE−セルロースカラムに、
透析した試料を通過させた。このカラムをDEAE
−セルロースの体積の２倍に等しい体積量の追加
の緩衝液（PH8.0）で洗浄した。トランスグルコ
シダーゼは流出液の分画中に見出され、これに対
してグルコアミラーゼおよび他の不純物はDEAE
−セルロースとともにカラム中にとどまる。トラ
ンスグルコシダーゼ含有分画を一緒にプールし、
そして脱イオン水に対して一夜透析した。２ミリ
アンペア／管の電流および室温において、B.J.デ
イビス（Davis）、「アナルス・オブ・ザ・ニユー
ヨーク・アカデミー・オブ・サイエンシズ
（Annals New York Acad.Sci.）」、Vol.121，
404ページ（1964）に記載される方法に従い、7.5
％のゲル含有するガラス管（0.5×７cm）中で、
２ミリアンペア／管の電流および室温においてト
リス（Tris）−グリシン緩衝液（PH8.3）中で、ポ
リアクリルアミドゲルの電気泳動を1.5時間実施
した。単離されたトランスグルコシダーゼ試料は
本質的に純粋であつた。 精製したトランスグルコシダーゼ試料を、部分
的特性づけおよびパノースの形成のために使用し
た。酵素とマルトースとのインキユベーシヨン混
合物中の糖転移生成物、すなわち、パノースの液
体クロマトグラフイーの定量的測定に基づいてト
ランスグルコシダーゼ活性をアツセイした。これ
はパズル（Pazur）ら、アーチーブス・オブ・バ
イオケミストリー・アンド・バイオフイジツクス
（Archives of Biochemistry Biophysics）、
Vol.93、43−49ページ（1961）に記載される方法
の修正法である。トランスグルコシダーゼ活性の
１単位は、20重量／容量（ｗ／ｖ）％のマルトー
ス溶液PH4.5および60℃において１マイクロモ
ル／時間のパノースを生成する酵素の量として定
義される。濾液中のトランスグルコシダーゼ活性
は20単位／mlであることがわかつた。マルトース
からの非発酵性オリゴ糖類の形成を次のようにし
て実施した：4.0mlの25％のマルトース溶液（PH
4.5）を1.0mlの酵素溶液（2.6u／ml）とともに、
60℃およびPH4.5において72時間インキユベーシ
ヨンした（0.1モルの酢酸ナトリウムで緩衝化し
た）。ガスクロマトグラフイーにより決定された
炭水化物のプロフイルは次の通りであつた：22.6
％のグルコース、46.4％のマルトース、6.5％の
イソマルトースよおよび24.6％のパノース。 次いで、このトランスグルコシダーゼをアスペ
ルギルス・ニガー（Aapergillus niger）からの
トランスグルコシダーゼと比較した。アスペルギ
ルス・ニガー（A.niger）についてのデータは、
上の節において述べたパズル（Pazur）らから取
つた。表Ａに示すように、この酵素の活性のため
の最適なPHは60℃において約4.5〜5.0であり、こ
れに対してアスペルギルス・ニガー（A.niger）
からのトランスグルコシダーゼについて、それは
30℃において3.5である。表Ｂはトランスグルコ
シダーゼ活性への温度の効果を示す。この精製さ
れた酵素の最適温度は70℃である。表Ｃはタラロ
マイセス・デユポンチ（T.duponti）およびアス
ペルギルス・ニガー（A.niger）からのトランス
グルコシダーゼの熱失活曲線を示す。この表に示
されているように、本発明の酵素はアスペルギル
ス・ニガー（A.niger）からのトランスグルコシ
ダーゼよりも非常に熱安定性である。
（Talaromyces duponti）からトランスグルコシ
ダーゼを調製する新規な方法に関する。このトラ
ンスグルコシダーゼは、非常に熱安定性であり、
マルトースのパノースおよびイソマルトースへの
転化において有用である。 トランスグルコシダーゼ（また、１，４−α−
Ｄ−グルカン−６−アルフア−Ｄ−グルコシルト
ラスフエラーゼおよびトランスグルコシラーゼと
しても知られている）は、種々の微生物から得ら
れてきている。それは三糖類のパノースおよび二
糖類のイソマルトースをマルトースから結合の切
断および結合の形成によつて生成させる酵素であ
る。これらのオリゴ糖類は非発酵性であり、こう
して食品、ソフトドリンクおよび酒の工業におい
て、ならびに新しい食品の配合において使用され
る。例えば、ヌノカワらの特願昭56−27236号参
照。この特許出願には、アスペルギルス・サイト
イ（Aapergillus saitoi）またはアスペルギル
ス・ウサミ（A.usami）の株を培養することによ
つてトランスグルコシダーゼおよびグルコアミラ
ーゼを製造する方法が記載されている。トランス
グルコシダーゼを保持するが、グルコアミラーゼ
を溶離液中に存在させる樹脂含有カラムに、前記
培養物の濾液を通過させる。酢酸塩緩衝溶液でPH
5.5において前記樹脂からトランスグルコシドを
除去する。また、パズル（Pazur）ら、「菌・カ
ビのトランスグルコシラーゼの単離および作用の
モード（The Isolation and the Mode of
Action of ａ Fungal Transglicosylase）」、ネ
ブラスカ大学、生化学および栄養学部、ネブラス
カ州リンコルン、アーチーブス・オブ・バイオケ
ミストリー・アンド・バイオフイジツクス
（Archives of Biochemistry Biophysics）、
Vol.93、43−49ページ（1961）には、アスペルギ
ルス・ニガー（Aapergillus niger）を得る方法
が記載されており、この方法はDEAE−セルロー
ス（ジエチルアミノエチル−セルロース）、でん
ぷんおよびカルボキシメチルセルロースのクロマ
トグラフイーおよび吸着により、この酵素を他の
同時産生された炭水化物から分離することを含
む。 他方において、タムラらの米国特許第4247637
号は、タラロマイセス・デユポンチ
（Talaromyces duponti）の株から熱安定性グル
コアミラーゼを製造する方法を記載しており、の
方法はこの株を栄養培地中で培養し、そしてその
酵素を単離することを含む。前記株を培養し、そ
して菌糸体を濾過により除去した後、濾液を活性
粘土に通過させ、そしてグルコアミラーゼを流出
液中に存在させる。タラロマイセス・デユポンチ
（Talaromyces duponti）が、また、トランスグ
ルコシダーゼ、いうまでもなく非常に熱安定性の
トランスグルコシダーゼを分泌するであろうとい
う認識は、米国特許第4247637号にはまつたく存
在しない。 本発明は、タラロマイセス・デユポンチ
（Talaromyces duponti）の株を適当な栄養生長
培地中で培養し、そしてトランスグルコシダーゼ
をそれから単離することを特徴とするトランスグ
ルコシダーゼを調製する方法を提供する。本発明
は、また、タラロマイセス・デユポンチ（T.
duponti）種の菌・カビ（fungus）により産生さ
れたトランスグルコシダーゼを提供する。 本発明は、詳しくは、菌・カビ（fungus）の
種タラロマイセス・デユポンチ（T.duponti）か
らの酵素トランスグルコシダーゼに関する。この
酵素はこの微生物の栄養生長培地中の発酵により
提供される。発酵の間にその酵素は分泌され、そ
の発酵後、バイオマスを発酵ブイヨンから任意に
液体固体分離技術、例えば、濾過または遠心分離
およびデカンテーシヨンにより除去して、酵素含
有溶液を得ることができる。 典型的には、通常のカビを培養するために用い
られる培地がタラロマイセス・デユポンチ（T.
duponti）の発酵の栄養源として使用される。
種々の炭素源はよく知られており、そしてでんぷ
ん、糖蜜、コーンミールなどから選択することが
できる。窒素源も普通に知られており、そして典
型的な例は大豆、綿実油、ペプトン、コーン浸出
液、酵母エキスなどである。硫酸塩類および／ま
たは塩化物塩類、硫酸マグネシウム、塩化カルシ
ウム、塩化ナトリウムおよび塩化カリウムは、ま
た、発酵培地中に使用される。しばしば、リン酸
塩類は同じようによく緩衝剤として機能するの
で、また、使用される。さらに、発酵培地のPH
は、好ましくは中性に近い範囲内に、塩基類、例
えば、水酸化ナトリウムまたは水酸化カリウムお
よび／または酸類、例えば、塩酸または酢酸で調
節することができる。 PH、時間および温度の条件はカビを培養する分
野においてよく知られている。PHは約３〜約９の
範囲内、より好ましくは約５〜約８の範囲内でな
くてはならない。培養基のために非常に有利なPH
は中性に近い。発酵はほぼ２〜10日の任意の期
間、より好ましくはほぼ４〜８日間実施する。温
度は約25℃〜約50℃の間、より好ましくは30℃〜
45℃であるべきである。最適な生長温度は40℃の
付近である。 タラロマイセス・デユポンチ（Talaromyces
duponti）種に属する任意の菌・カビ（fungus）
類を本発明において使用することができる。非常
に有利な実施態様において、使用するタラロマイ
セス・デユポンチ（T.duponti）の株は、茨城県
つくば市の通商産業省、工業技術院微生物微生物
工業研究所に受託され、そして受託番号4566を与
えられている。この特定の菌・カビの株により産
生されるトランスグルコシダーゼは、下の実施例
において証明されるように、ことに好熱性である
ことが、予期されないことには発見された。ま
た、FERM Ｐ−4566の突然変異株を使用でき
る。タラロマイセス・デユポンチ
（Talaromyces duponti）の同定は、クーニー
（Cooney）およびエマーソン（Emerson）、「好熱
性菌・カビ類（Thermophilic Fungi）、および
アワオ（Awao）およびミツギ（Mitsugi）、
“Trans.Mycol.Soc.），Japn，Vol.14に記載され
ている。この株およびの増殖についてのそれ以上
の詳細は、米国特許第4247637号に記載されてい
る。 タラロマイセス・デユポンチ（T.duponti）の
培養物が適当な栄養培地中で所望の状態の細胞の
塊に到達したとき、バイオマスを任意の液体／固
体分離法により、例えば、濾過により、あるいは
遠心分離および引き続くデカンテーシヨンにより
除去する。次いで、この酵素を含有する溶液、す
なわち、濾液または上澄み液を濃縮、沈殿、ある
いはそれらの組み合わせにより処理する。例え
ば、この溶液を通常の方法、例えば、限外濾過お
よび／または蒸発により濃縮できる。次いで、酵
素を濃縮物から（あるいは濃縮を行わなかつた場
合、溶液から）無機塩類、例えば、硫酸アンモニ
ウムまたは硫酸ナトリウムの添加により、あるい
は有機溶媒、例えば、メタノール、エタノールま
たはアセトンの添加により、ケーキまたはスラリ
ーの形態で沈殿させることができる。酵素含有ケ
ーキを沈殿させた後、次いでそれを溶液、例え
ば、水または緩衝化した水の中でスラリー化し
て、酵素をそれから溶解するか、あるいは抽出
し、そして酵素含有抽出液を得ることができる。
PH選択手溶離のため、後述するように、クエン酸
塩−リン酸塩緩衝液（PH8.0）を使用し、次いで
望ましくは酵素含有緩衝化抽出液を、好ましくは
一夜、透析することが好ましい。 トランスグルコシダーゼ含有溶液を、前節に記
載したようにのようにそれが濃縮法、沈殿法また
はそれらの組み合わせのいずれにより得られたに
しろ、次いで、例えば、粘度の処理、クロマトグ
ラフイー、またはそれらの組み合わせにより精製
する。 例えば、クロマトグラフイーはトランスグルコ
シダーゼ含有溶液を、ジエチルアミノエチレン−
セルロース（DEAE−セルロース）のカラムに、
適当なPHにおいて通過させることによつて実施で
きる。トランスグルコシダーゼ含有溶液はほぼ７
〜９、より好ましくは８のPHに緩衝化すべきであ
り、および／またはカラムはほぼ７〜９、より好
ましくは８のPHに平衡化すべきである。これは好
ましくはクエン酸ナトリウム−リン酸塩緩衝液
（PHほぼ8.0）を使用して達成される。ほぼ７〜
９、より好ましくは８のPHにおいて、トランスグ
ルコシダーゼは流出物の分画中に存在し、これに
対して他の不純物、例えば、グルコアミラーゼは
カラム中にとどまる。追加のトランスグルコシダ
ーゼはカラムを少なくともDEAE−セルロースの
体積の体積量のより緩衝性の溶液で洗浄すること
によつて回収される。グルコアミラーゼおよび他
の不純物を実質的に含まないトランスグルコシダ
ーゼ溶液が得られる。 あるいは、バイオマスを栄養生長培地から、任
意の固体／液体分離技術、例えば、前述のもの、
により除去したてトランスグルコシダーゼ含有溶
液を得たのち、次いでトランスグルコシダーゼを
この溶液から、粘土、好ましくは粒状ベントナイ
トを、適当なPH、望ましくは３〜５のPHにおいて
添加することよつて単離することができる。アス
ペルギルス・ニガー（Aapergillus）またはリゾ
ープス（Rhizopus）からのトランスグルコシダ
ーゼおよびグルコアミラーゼの両者を含有する溶
液からトランスグルコシダーゼを除去するための
粘土の技術は、米国特許第3042584号に開示され
ている。 トランスグルコシダーゼは粘土と反応生成物を
形成し、この生成物は凝固し、そして溶液の底に
沈殿して、グルコアミラーゼを溶液中に残す。次
いで、この反応生成物を溶液から標準の固体／液
体分離技術により分離し、次いでトランスグルコ
シダーゼを粘土から溶離溶液で溶離することがで
き、ここで溶離溶液は粘土とトランスグルコシダ
ーゼが沈殿を形成する範囲外のPH、好ましくは中
性またはアルカリ性のPHを有する。 タラロマイセス・デユポンチ（Talaromyces
duponti）から得られるトランスグルコシダーゼ
は非常に熱安定性である。例えば、60℃におい
て、活性のために最適なPHはほぼ4.5〜5.0であ
る。精製されたトランスグルコシダーゼの最適温
度は70℃である。 本発明に従いタラロマイセス・デユポンチ
（T.duponti）からのトランスグルコシダーゼの
熱失活を、アスペルギルス・ニガー
（Aapergillus niger）からのトランスグルコシダ
ーゼと70℃において比較した。より詳しくは、70
℃においてわずかに60分後に、アスペルギルス・
ニガー（Aapergillus niger）からのトランスグ
ルコシダーゼは完全に失活し、これに対して活性
の40％以上がタラロマイセス・デユポンチ（T.
duponti）からのトランスグルコシダーゼについ
てなお残る。これらの好熱性は下の実施例中の表
Ａ、表Ｂおよび表Ｃにさらに詳しく記載されてい
る。 本発明のトランスグルコシダーゼはマルトース
を、非発酵性の糖類である三糖類のパノースおよ
び二糖類のイソマルトースに転化するために使用
できる。これらの非発酵性オリゴ糖類の形成は、
マルトース含有溶液をトランスグルコシダーゼと
一緒にインキユベーシヨンすることによつて実施
することができる。この系において、また、形成
する発酵性糖のグルコース、ならびに多少の残留
するマルトースは得られたものの中に典型的には
存在するであろう。インキユベーシヨンは50〜70
℃で１〜６日間実施し、PHは酸性の範囲に維持す
る。非常に有利な実施態様において、インキユベ
ーシヨンは60℃およびPH4.5（0.1モルの酢酸ナト
リウムの緩衝液）において72時間実施する。 次の実施例により本発明の好ましい実施態様を
開示し、そしてこの実施例中に開示される実施態
様に本発明は限定されない。 実施例 びんの発酵器に、５％の可溶性リントナー
（Lintner）でんぷん、２％のコーン浸漬液、0.5
％のフアーマメデイア（Pharmamedia ）［トレ
イダー・プロレイン・カンパニー（Trader
Protein Co.）、0.5％の酵母エキス［デイフコ・
ラボラトリーズ（Difco Laboratories）、ミシガ
ン州デトロイトから供給される］、0.1％の硫酸マ
グネシウムおよび0.01％の塩化カルシウムを含
む、1NのNaOHでPH7.0に調節されている液状発
酵培地の10リツトルを添加した。 びん発酵器から培地の５つの100mlのアリコー
トを取り出し、各アリコートを500mlのエルレン
マイヤーフラスコ中に分配し、次いですべての５
つを20分間121℃でインキユベーシヨンして培地
を滅菌することによつて、５つの種培養物を調製
した。次いで、各滅菌した試料にタラロマイセ
ス・デユポンチ（Talaromyces duponti）株
FRI4566（アメリカン・タイプ・カルチユア・コ
レクシヨンにATCC20805として国際寄託されて
いる）を接種し、そして回転振盪器上で40℃にお
いて６時間振盪した。次いで、５つの試料を一緒
にしてほぼ500mlを得た。培地の残部をびん発酵
器内で121℃に20分間加熱し、次いで500mlのタラ
ロマイセス・デユポンチ（T.duponti）株
FRI4566を接種し、そして40℃で７日間攪拌し
た。発酵の終りにおいて、菌糸体を全発酵ブイヨ
ンから濾過により除去して、細胞不含濾液を得
た。 固体の硫酸アンモニウムを濾液に70％の飽和度
で添加することによつて、スラリーを沈殿させ
た。沈殿を遠心分離し、次いで上澄み液をデカン
テーシヨンすることによつて回収した。次いで、
次いで、酵素を200mlの0.05モルのクエン酸塩−
リン酸塩緩衝液（PH8.0）中で沈殿から溶解し、
そして同一緩衝液に対して一夜透析した。0.1モ
ルのクエン酸ナトリウム−リン酸塩緩衝液（PH
8.0）と平衡化したDEAE−セルロースカラムに、
透析した試料を通過させた。このカラムをDEAE
−セルロースの体積の２倍に等しい体積量の追加
の緩衝液（PH8.0）で洗浄した。トランスグルコ
シダーゼは流出液の分画中に見出され、これに対
してグルコアミラーゼおよび他の不純物はDEAE
−セルロースとともにカラム中にとどまる。トラ
ンスグルコシダーゼ含有分画を一緒にプールし、
そして脱イオン水に対して一夜透析した。２ミリ
アンペア／管の電流および室温において、B.J.デ
イビス（Davis）、「アナルス・オブ・ザ・ニユー
ヨーク・アカデミー・オブ・サイエンシズ
（Annals New York Acad.Sci.）」、Vol.121，
404ページ（1964）に記載される方法に従い、7.5
％のゲル含有するガラス管（0.5×７cm）中で、
２ミリアンペア／管の電流および室温においてト
リス（Tris）−グリシン緩衝液（PH8.3）中で、ポ
リアクリルアミドゲルの電気泳動を1.5時間実施
した。単離されたトランスグルコシダーゼ試料は
本質的に純粋であつた。 精製したトランスグルコシダーゼ試料を、部分
的特性づけおよびパノースの形成のために使用し
た。酵素とマルトースとのインキユベーシヨン混
合物中の糖転移生成物、すなわち、パノースの液
体クロマトグラフイーの定量的測定に基づいてト
ランスグルコシダーゼ活性をアツセイした。これ
はパズル（Pazur）ら、アーチーブス・オブ・バ
イオケミストリー・アンド・バイオフイジツクス
（Archives of Biochemistry Biophysics）、
Vol.93、43−49ページ（1961）に記載される方法
の修正法である。トランスグルコシダーゼ活性の
１単位は、20重量／容量（ｗ／ｖ）％のマルトー
ス溶液PH4.5および60℃において１マイクロモ
ル／時間のパノースを生成する酵素の量として定
義される。濾液中のトランスグルコシダーゼ活性
は20単位／mlであることがわかつた。マルトース
からの非発酵性オリゴ糖類の形成を次のようにし
て実施した：4.0mlの25％のマルトース溶液（PH
4.5）を1.0mlの酵素溶液（2.6u／ml）とともに、
60℃およびPH4.5において72時間インキユベーシ
ヨンした（0.1モルの酢酸ナトリウムで緩衝化し
た）。ガスクロマトグラフイーにより決定された
炭水化物のプロフイルは次の通りであつた：22.6
％のグルコース、46.4％のマルトース、6.5％の
イソマルトースよおよび24.6％のパノース。 次いで、このトランスグルコシダーゼをアスペ
ルギルス・ニガー（Aapergillus niger）からの
トランスグルコシダーゼと比較した。アスペルギ
ルス・ニガー（A.niger）についてのデータは、
上の節において述べたパズル（Pazur）らから取
つた。表Ａに示すように、この酵素の活性のため
の最適なPHは60℃において約4.5〜5.0であり、こ
れに対してアスペルギルス・ニガー（A.niger）
からのトランスグルコシダーゼについて、それは
30℃において3.5である。表Ｂはトランスグルコ
シダーゼ活性への温度の効果を示す。この精製さ
れた酵素の最適温度は70℃である。表Ｃはタラロ
マイセス・デユポンチ（T.duponti）およびアス
ペルギルス・ニガー（A.niger）からのトランス
グルコシダーゼの熱失活曲線を示す。この表に示
されているように、本発明の酵素はアスペルギル
ス・ニガー（A.niger）からのトランスグルコシ
ダーゼよりも非常に熱安定性である。
【表】
表Ｂ
基質として0.1モルの酢酸ナトリウムでPH4.5に
緩衝化した20％（ｗ／ｖ）マルトースを使用した
タラロマイセス・デユポンチ（T.duponti）のト
ランスグルコシダーゼ活性への温度の効果 温度（℃） 相対的活性（％） 40 12.6 50 24.4 60 48.9 70 100.0 80 64.9 90 0.0
緩衝化した20％（ｗ／ｖ）マルトースを使用した
タラロマイセス・デユポンチ（T.duponti）のト
ランスグルコシダーゼ活性への温度の効果 温度（℃） 相対的活性（％） 40 12.6 50 24.4 60 48.9 70 100.0 80 64.9 90 0.0
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １ タラロマイセス・デユポンチ
（Talaromyces duponti）の菌株を適当な栄養
生長培地中で培養し、そしてトランスグルコシ
ダーゼをそれから単離することを特徴とする、
次の理化学的性質 （） 作用：マルトースからグルコース、三
糖類のパノースおよび二糖類のイソマルトース
を生成する （） 基質特異性：マルトース （） 至適PH：60℃において4.5〜5.0 （） 安定PH範囲：60℃において3.5〜7.0 （） 至適温度：70℃ （） 安定温度範囲：40〜90℃ （） PH4.5において70℃で60分間加熱した後
の活性残存率：40％以上 を有するトランスグルコシダーゼの調製方法。 ２ タラロマイセス・デユポンチ（T.duponti）
の菌株がFERM Ｐ−4566として同定される特許
請求の範囲第１項記載の方法。 ３ トランスグルコシダーゼを、栄養生長培地か
ら、次の工程： ａ バイオマスを栄養生長培地から除去してトラ
ンスグルコシダーゼ含有溶液を得、 ｂ トランスグルコシダーゼ含有ケーキを沈澱さ
せ、次いでそれからトランスグルコシダーゼを
抽出してトランスグルコシダーゼ含有抽出物を
得ることによつて前記溶液を処理し、 ｃ トランスグルコシダーゼ含有抽出物を精製
し、そして ｄ グルコアミラーゼおよび他の不純物を実質的
に含有しない精製されたトランスグルコシダー
ゼを回収すること、 によつて単離する特許請求の範囲第１項記載の方
法。 ４ 工程(b)の前または後に濃縮を行なう特許請求
の範囲第３項記載の方法。 ５ 工程(c)における精製を、工程(b)から得られる
処理したトランスグルコシダーゼ含有抽出物を適
当なPHにおいてDEAE−カラムに通過させること
によつて達成し、そして工程(d)をトランスグルコ
シダーゼ含有流出液を前記カラムから回収するこ
とによつて達成する特許請求の範囲第３項記載の
方法。 ６ (a) バイオマスを栄養生長培地から除去して
トランスグルコシダーゼ含有溶液を得、 (b) トランスグルコシダーゼ含有溶液に粒状粘土
を適当なPH範囲において添加してトランスグル
コシダーゼと前記粘土との反応生成物を生成せ
しめることによつて、トランスグルコシダーゼ
を前記溶液から単離し、そして (c) 前記粘土／トランスグルコシダーゼ反応生成
物を前記溶液から固体／液体分離技術によつて
回収する特許請求の範囲第１項記載の方法。 ７ (d)工程(b)における粘土／トランスグルコシダ
ーゼ反応生成物を生ずるPH範囲外のPH範囲を有す
る溶離溶液で前記反応生成物からトランスグルコ
シダーゼを溶離することをさらに含む特許請求の
範囲第６項記載の方法。 ８ タラロマイセス・デユポンチ
（Talaromyces duponti）の菌株によつて産生さ
れる、次の理化学的性質 （） 作用：マルトースからグルコース、三糖
類のパノースおよび二糖類のイソマルトースを
生成する （） 基質特異性：マルトース （） 至適PH：60℃において4.5〜5.0 （） 安定PH範囲：60℃において3.5〜7.0 （） 至適温度：70℃ （） 安定温度範囲：40〜90℃ （） PH4.5において70℃で60分間加熱した後
の活性残存率：40％以上 を有することを特徴とする熱安定性トランスグル
コシダーゼ。 ９ タラロマイセス・デユポンチ（T.duponti）
FERM Ｐ−4566により産生される特許請求の範
囲第８項記載のトランスグルコシダーゼ。 １０ マルトースを、タラロマイセス・デユポン
チ（Talaromyces duponti）の菌株によつて産
生される、次の理化学的性質 （） 作用：マルトースからグルコース、三糖
類のパノースおよび二糖類のイソマルトースを
生成する （） 基質特異性：マルトース （） 至適PH：60℃において4.5〜5.0 （） 安定PH範囲：60℃において3.5〜7.0 （） 至適温度：70℃ （） 安定温度範囲：40〜90℃ （） PH4.5において70℃で60分間加熱した後
の活性残存率：40％以上 を有する熱安定性トランスグルコシダーゼと接触
させることを特徴とするマルトースを非発酵性糖
類および発酵性糖類に転化する方法。 １１ マルトースの接触が、マルトースをトラン
スグルコシダーゼとともに50℃〜70℃および酸性
のPHにおいて１〜６日間インキユベーシヨンし、
そしてグルコース、マルトース、イソマルトース
およびパノースを回収することから本質的に成る
特許請求の範囲第１０項記載の方法。
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