JPH0774147B2 - リポソームの製造方法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明はリポソームの製造方法に関する。より詳しくは
内包物の漏れの少ないリポソームを製造する方法に関す
る。

（発明の背景） リポソームはリン脂質等の両親媒性物質を主成分とする
二分子膜から成る閉鎖小胞であり、生体膜モデルあるい
はドラッグデリバリー用薬物運搬体として基礎および応
用研究に用いられている。

リポソームの調製法は既に数多く知られており、例えば
“Methods of Biochemical Analysis"vol.33（1988）、
p.337や、「リポソーム」南江堂（1988）などに記載さ
れている。

リポソームはその内水層に薬物を内包することにより薬
物の運搬体としての機能を発揮するため、保存中および
注射後の血清中に於いて内包薬物の洩れが少ないことが
要求される。そのため膜成分物質にコレステロールを添
加したり、相転移温度の高い脂質を使用したりして漏れ
を抑える工夫がなされてきているがまだ十分ではない。
又、同じ膜成分物質を使用してもリポソームの作り方お
よび構造により内包物の漏れの程度が異なる事も知られ
ており（例えば“B.B.A."723（1983）289,“Biochemist
ry"24（1985）2833）、かなり漏れを低減できる方法も
見出されている。しかし、体内に注射して用いるために
はリポソームの粒経は直径１μｍより小さいものが好ま
しく、特に好ましいのは直径0.2μｍ以下のものである
が、この様な粒経のリポソームの漏れを低減する技術は
まだ十分ではない。

なお特開昭60−7933号には膜成分物質を水和させてリポ
ソーム分散液を調製するために加温を行うことを開示し
ているが、リポソーム分散液調製後にさらに温度を上げ
ることについは触れていない。

（発明が解決しようとする課題） 本発明の目的はしたがって内包物の漏れが少ないリポソ
ームの製造方法を開発する事にあり、特に粒経１μｍ以
下のリポソームの製造にも適用できる方法を開発する事
にある。

（課題を達成するための手段） 本発明者らは前記目的にそって鋭意検討した結果、通常
の方法で調製したリポソーム分散液を加熱処理すること
により内包物の漏れを低減できる事を見出し、本発明を
完成するに到った。すなわち本発明は、リポソーム分散
液のそのリポソーム分散液を調製した時の温度より高い
温度であって、かつ60℃以上100℃未満の温度範囲で５
分以上加熱処理することを特徴とするリポソームの製造
方法である。

本発明で用いる事のできるリポソームの調製法は特に限
定されるものではなく、前記“Methods of Biochemical
Analysis"vol.33（1988）337や「リポソーム」南江堂
（1988）に記された方法の他、どの様な方法でもかまわ
ない。他、多孔質メンプレンフィルター（例えばポリカ
ーボネートフィルター）を通過させたり、超音波照射し
たり、高圧噴射乳化器を用いたり、あるいはこれらを組
合せてサイズを揃える工程も好ましく併用する事ができ
る。

本発明において使用される膜成分物質としてはホスファ
チジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホス
ファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、ホス
ファチジン酸などの天然及び合成のリン脂質類およびこ
れらの混合物が代表的であり、水添レシチン等の加工し
た天然リン脂質も好ましく用いることができる。又、こ
れらに膜構造の安定化剤としてコレステロールやその誘
導体、ガングリオシド、アルキルアミン、脂肪酸、ジセ
チルホスフェートなどを加えても良い。

膜成分を分散させる水性溶液としては、水、生理食塩
水、緩衝液、糖類の水溶液およびこれらの混合物が好ま
しく用いられる。

膜成分物質と水性溶液との比率は、膜成分物質１重量部
に対して水性溶液３〜100重量部程度が適当である。

本発明のリポソームに内包させる化合物としては特に制
限は無いが、グルコース、デキストラン等の糖類、アミ
類、ペプチド、蛋白質類、DNA、RNAなどの核酸類、ビタ
ミン類などの他、薬物としてペニシリンＧに代表される
抗生物質、メトトレキセート、ドキソルビシンに代表さ
れる制癌剤などを用いることができ、一般にはこれらを
水性溶液として用いる。

次に本発明に従ってリポソームを調製する手順について
詳しく述べる。

最初に通常の方法により、目的化合物を内包したリポソ
ームを作る。ここでは一例として薄膜法について記す
と、まず膜成分物質の有機溶媒溶液をロータリーエバポ
レーター等により蒸発乾固し、膜成分物質の薄膜を得
る。さらに減圧デシケーター中で一夜乾燥する。これに
内包する化合物の水性溶液を加えVortexミキサー等で振
とうすることによりリポソームの分散液が得られる。

この分散液をそのまま次の加熱処理に用いても良いが、
リポソームのサイズを揃えたい時はここでサイズ均一化
を行う。サイズ均一化には例えば多孔質メンブレンフィ
ルターに対する押出処理（例えばポリカーボネート性多
孔質フィルター中を高圧により繰り返し透過させる処
理）、超音波照射、高圧噴射乳化装置による処理、ある
いはこれらを組合せることによって行う事ができる。

リポソームの加熱処理は、以上の様にして得た分散液を
60〜100℃、より好ましくは90〜100℃で５分間以上、よ
り好ましくは10分間〜２時間インキュベートする事によ
って行う。

最後にリポソームと、内包されなかった化合物を分離す
るために、ゲルロ過又は遠心分離による洗浄を行う。

以上の様な操作により、加熱処理の無い場合に比べて内
包物の漏れの少ないリポソームが得られる。

（実施例） 次に実施例をあげて本発明を更に詳細に説明するが、本
発明はこれらに限定されるものではない。

実施例１ 市販のＬ−α−ジパルミトイルホスファチジルコリン
（DPPC）を用い、モデル化合物としてカルボキシフルオ
レセイン（CF）を内包するリポソームを作製した。即
ち、30mgのDPPCをクロロホルムに溶解してナスフラスコ
に入れ、ロータリーエバポレーターにて蒸発乾固した。
さらに真空ポンプを用いて減圧下１時間乾燥させた。次
に200mMのCFと150mMのNaClを含む6mMトリスバッファー
（pH7.0）を3ml加え50℃にてVortexミキサーで振とう
し、リポソーム分散液を得た。さらにサイズを均一化す
るために浴型超音波照射器にて45℃で10分間照射した
後、孔径0.2μのポリカーボネート製メンブレンフィル
ターを10回通過させた。

この様にして得られたリポソーム分散液を栓付試験管に
入れ、オイルバスを用いて95℃で20分間インキュベート
した。

最後にSepharose 4Bカラムを用いてゲルロ過を行い、リ
ポソーム外液を15mM NaClを含む6mMトリスバッファー
（pH7.0）に交換した。

以上の工程により熱処理リポソームを得た。

比較例１ 実施例１と同様にリポソーム分散液を作製した。ただ
し、95℃の熱処理工程は行わなかった。

内包されたCF量は、リポソーム分散液に界面活性剤（デ
オキシコール酸）を加えリポソームを破壊して均一溶液
とした後、蛍光光度計（492nm励起、517nm測定）を用い
て定量した。

また、リポソーム分散液を37℃30分インキュベート後の
蛍光を測定し、漏れ出たCF量を定量した。

結果を表１に示す。

表１の結果より、加熱処理をすることにより内包物の漏
れが大巾に低減することがわかる。内包量については少
し増加する傾向が見られた。

比較例２ 実施例１と同様にリポソーム分散液を作製した。

ただし95℃の熱処理の代りに50℃で20分間熱処理した。
内包されたCF量および37℃30分インキュベートして漏れ
出たCF量を比較例１と同様に測定した。

実施例２ 実施例１と同様にリポソーム分散液を作製した。ただし
95℃の熱処理の代りに75℃で５分、10分または30分熱処
理した。内包されたCF量および37℃30分インキュベート
して漏れ出たCF量を実施例１と同様に測定した。

以上から熱処理温度75℃において５、10、30分で本願発
明の効果があることが分かる。また、本願特許請求の範
囲外の熱処理条件50℃、20分の熱処理では、本願発明の
効果が得られないことが明らかである。

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】リポソームの分散液をそのリポソーム分散
   液を調製した時の温度より高い温度であって、かつ60℃
   以上100℃未満の範囲に５分以上加熱処理することを特
   徴とするリポソームの製造方法。
2. 【請求項２】前記加熱処理前のリポソーム分散液が、多
   孔質メンブレンフィルターに対する押出し処理、超音波
   処理または高圧噴射乳化装置による処理を施して調製さ
   れたものであることを特徴とする請求項第１項記載のリ
   ポソームの製造方法。