JPH0774238B2 - 微生物により生産されるα−およびβ−インタ−フエロン - Google Patents
微生物により生産されるα−およびβ−インタ−フエロンInfo
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- JPH0774238B2 JPH0774238B2 JP58093886A JP9388683A JPH0774238B2 JP H0774238 B2 JPH0774238 B2 JP H0774238B2 JP 58093886 A JP58093886 A JP 58093886A JP 9388683 A JP9388683 A JP 9388683A JP H0774238 B2 JPH0774238 B2 JP H0774238B2
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- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
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- C07—ORGANIC CHEMISTRY
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- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
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Description
【発明の詳細な説明】 本考案はIFN−α２（Arg）で示される、α−インタフエ
ロンに関するものである。
ロンに関するものである。
３つの型のインターフエロン、つまり、白血球インター
フエロン（インターフエロンα、IFN−αと略記）、繊
維芽インターフエロン（インターフエロンβ、IFN−β
と略記）および免疫インターフエロン（インターフエロ
ンγ、IFN−γと略記）が文献に記載されている（W.E.S
tewart II、“The Interferon System"、Springer-Verl
ag Vienna/New York、第２版（1981）をみよ）。ヒト白
血球またはヒト骨髄芽細胞はウイスルで刺激すると白血
球インターフエロンを生産し、ヒト繊維芽細胞はウイス
ルまたは適当な核酸で誘導すると繊維芽インターフエロ
ンを生成し、そして、マイトジエンたとへばコンカナバ
リンで誘導したヒト−Ｔ淋巴球は免疫インターフエロン
を生成する。
フエロン（インターフエロンα、IFN−αと略記）、繊
維芽インターフエロン（インターフエロンβ、IFN−β
と略記）および免疫インターフエロン（インターフエロ
ンγ、IFN−γと略記）が文献に記載されている（W.E.S
tewart II、“The Interferon System"、Springer-Verl
ag Vienna/New York、第２版（1981）をみよ）。ヒト白
血球またはヒト骨髄芽細胞はウイスルで刺激すると白血
球インターフエロンを生産し、ヒト繊維芽細胞はウイス
ルまたは適当な核酸で誘導すると繊維芽インターフエロ
ンを生成し、そして、マイトジエンたとへばコンカナバ
リンで誘導したヒト−Ｔ淋巴球は免疫インターフエロン
を生成する。
さらに、たとえばセルストレイン−NC-37、Namalwa、Ak
ubaまたはRPMI 1788により代表されるようなＢ−淋巴球
型のヒト細胞は、ウイルスで刺激すると白血球インター
フエロンおよび繊維芽インターフエロンを同時に生産す
る（Journal of General Virology38、51-59（197
7））。IFN−αおよびIFN−βの生産量の比率は誘導条
件の選択で変えうる。（Journal of Interferon Resear
ch2、準備中（1982））。たとえばSendalウイルスで誘
導した種々のセルストレインよりつぎの割合でIFN−α
およびIFN−βが得られる。
ubaまたはRPMI 1788により代表されるようなＢ−淋巴球
型のヒト細胞は、ウイルスで刺激すると白血球インター
フエロンおよび繊維芽インターフエロンを同時に生産す
る（Journal of General Virology38、51-59（197
7））。IFN−αおよびIFN−βの生産量の比率は誘導条
件の選択で変えうる。（Journal of Interferon Resear
ch2、準備中（1982））。たとえばSendalウイルスで誘
導した種々のセルストレインよりつぎの割合でIFN−α
およびIFN−βが得られる。
さらに、白血球よりのIFN−α遺伝子の分子クローニン
グ（Nature284、316-320（1980）;Science209、1343-13
47（1980）およびEP-A1-0.032.134をみよ）および骨髄
芽細胞よりのIFN−α遺伝子のクローニング（Nature287
411-416（1980）、同上290、20-26（1981）およびGB-A
-2.079.291）は、少なくとも10種の区別しうる遺伝子よ
り成立つ遺伝子族によりIFN−αがコードされるという
結果を与えた。このことは、また、これらのDNA配列の
遺伝子生成物が、単一の均一な蛋白質を構成しないこと
を意味する。このことはIFN−αが類似の蛋白質の混合
物であることを意味する。これらのサブ−タイプは、文
献中では、IFN-α1,2,3…と呼称されている（Nature28
7,401-408（1980）およびGene15,379-394（1981））ま
たはLeIFN A,B,C…（Nature290、20-26（1981））と呼
称されている。
グ（Nature284、316-320（1980）;Science209、1343-13
47（1980）およびEP-A1-0.032.134をみよ）および骨髄
芽細胞よりのIFN−α遺伝子のクローニング（Nature287
411-416（1980）、同上290、20-26（1981）およびGB-A
-2.079.291）は、少なくとも10種の区別しうる遺伝子よ
り成立つ遺伝子族によりIFN−αがコードされるという
結果を与えた。このことは、また、これらのDNA配列の
遺伝子生成物が、単一の均一な蛋白質を構成しないこと
を意味する。このことはIFN−αが類似の蛋白質の混合
物であることを意味する。これらのサブ−タイプは、文
献中では、IFN-α1,2,3…と呼称されている（Nature28
7,401-408（1980）およびGene15,379-394（1981））ま
たはLeIFN A,B,C…（Nature290、20-26（1981））と呼
称されている。
他方、IFN−βに対しては均一DNA配列が見出だされてい
る。このことは、ただひとつの遺伝子が繊維芽インター
フエロンをコードし、それで、サブ−タイプはまつたく
知られていない（Nature285、542-547（1980））ことを
意味する。
る。このことは、ただひとつの遺伝子が繊維芽インター
フエロンをコードし、それで、サブ−タイプはまつたく
知られていない（Nature285、542-547（1980））ことを
意味する。
IFN−α遺伝子とIFN−β遺伝子とのあいだには、IFN−
α遺伝子族内でおこるのと逆に、クロス−ハイブリダイ
ゼーシヨンはおこらぬが、配列は約45％相同である（Na
ture285、547-549（1980））。（７のうち５個の）IFN
−αとして働らく遺伝子とIFN−β遺伝子とのあいだ
の、完全な相同性の存在するもつとも長い配列フラグメ
ントは、13ニユクレオチド長である。このトリデカニユ
クレオチドは文献より知られている（Eur.J.Cell.Biol.
25、８−９（1981））。このトリデカニユクレオチドを
含有するIFN−α遺伝子はLeIFNA B,C,D,F,Gであり、13
ニユクレオチドのうち12だけがLeIFNおよびＨに存在し
ている（Nature290、20-26（1981）をみよ）。
α遺伝子族内でおこるのと逆に、クロス−ハイブリダイ
ゼーシヨンはおこらぬが、配列は約45％相同である（Na
ture285、547-549（1980））。（７のうち５個の）IFN
−αとして働らく遺伝子とIFN−β遺伝子とのあいだ
の、完全な相同性の存在するもつとも長い配列フラグメ
ントは、13ニユクレオチド長である。このトリデカニユ
クレオチドは文献より知られている（Eur.J.Cell.Biol.
25、８−９（1981））。このトリデカニユクレオチドを
含有するIFN−α遺伝子はLeIFNA B,C,D,F,Gであり、13
ニユクレオチドのうち12だけがLeIFNおよびＨに存在し
ている（Nature290、20-26（1981）をみよ）。
驚くべきことに、あらゆる種類のリコンビナントDNA分
子を含有する、既知の方法で得られる細菌の混合物を取
り、そして、このトリデカニユクレオチド用いるコロニ
ーハイブリダイゼイシヨンによりインターフエロンに対
する情報を担う細菌を同定し、それにより、同時操作で
IFN−αおよびIFN−β配列をうることにより、タイプα
およびタイプβのインターフエロンの調製を改良しうる
ことが分つた。
子を含有する、既知の方法で得られる細菌の混合物を取
り、そして、このトリデカニユクレオチド用いるコロニ
ーハイブリダイゼイシヨンによりインターフエロンに対
する情報を担う細菌を同定し、それにより、同時操作で
IFN−αおよびIFN−β配列をうることにより、タイプα
およびタイプβのインターフエロンの調製を改良しうる
ことが分つた。
本発明の目的は、乗法で得られそしてタイプαまたはタ
イプβのインターフエロンに対しての遺伝子情報を担う
微生物およびそれらの変異株を分離し、それにより、こ
れらのインターフエロンを生産する基本的必要条件を提
供することである。
イプβのインターフエロンに対しての遺伝子情報を担う
微生物およびそれらの変異株を分離し、それにより、こ
れらのインターフエロンを生産する基本的必要条件を提
供することである。
この目的を達成するには、たとえばつぎの操作を用いう
る。
る。
たとえばSendaiウイルスで誘導後、IFN−αおよびさら
にIFN−βの双方を生産する適当なセルストレインを選
択する。Ｂ−淋巴球型の適当なヒト細胞には、たとえば
Namalwa、NC-37、AkubaまたはRPMI 1788があるが、Nama
lwa株が有利である。
にIFN−βの双方を生産する適当なセルストレインを選
択する。Ｂ−淋巴球型の適当なヒト細胞には、たとえば
Namalwa、NC-37、AkubaまたはRPMI 1788があるが、Nama
lwa株が有利である。
選択された細胞は、IFN-mRNA合成が最大の時、代表時に
は、ウイルス誘導後６から12時間、なるべくは９時間に
適当に変性させる。核を除いたあと、細胞質よりのRNA
をフエノール抽出そしてアルコール沈殿で精製する。つ
いでポリ（Ａ）+RNAをオリゴ（dT）セルロースクロマト
グラフイーで分離し、インターフエロン−特異的配列
（第１図の左側カラム）に関連して勾配遠心で濃縮す
る。
は、ウイルス誘導後６から12時間、なるべくは９時間に
適当に変性させる。核を除いたあと、細胞質よりのRNA
をフエノール抽出そしてアルコール沈殿で精製する。つ
いでポリ（Ａ）+RNAをオリゴ（dT）セルロースクロマト
グラフイーで分離し、インターフエロン−特異的配列
（第１図の左側カラム）に関連して勾配遠心で濃縮す
る。
このように精製したポリ（Ａ）+RNAは、逆転写酵素を用
いての一本鎖cDNAの製造のためのマトリツクスに用い
る。この一本鎖のDNAに相補的の第２のDNA鎖は、DNA−
ポリメラーゼＩを用いて合成する。cDNA−合成および相
補的DNA合成は、アデノシン、チミジン、グアノシンお
よびシチジンのデオキシニユクレオシドトリホスフエー
トの混合物を含有する溶液中で実施した。得られる二本
鎖cDNA混合物は、S1ヌクレアーゼを用いて鎖の両端にお
いて変型して、それぞれの鎖のはみ出ている領域を除
き、少なくとも600塩基対を含有する二本鎖DNA分子を勾
配遠心で分ける。得られるcDNA混合物は、各鎖の３′末
端にオリゴデオキシシチジンを付加することにより末端
トランスフエラーゼで約15ニユクレオチド分伸ばし、リ
コンビナント分子合成のためのひとつの成分を製造する
（第１図の左欄をみよ）。
いての一本鎖cDNAの製造のためのマトリツクスに用い
る。この一本鎖のDNAに相補的の第２のDNA鎖は、DNA−
ポリメラーゼＩを用いて合成する。cDNA−合成および相
補的DNA合成は、アデノシン、チミジン、グアノシンお
よびシチジンのデオキシニユクレオシドトリホスフエー
トの混合物を含有する溶液中で実施した。得られる二本
鎖cDNA混合物は、S1ヌクレアーゼを用いて鎖の両端にお
いて変型して、それぞれの鎖のはみ出ている領域を除
き、少なくとも600塩基対を含有する二本鎖DNA分子を勾
配遠心で分ける。得られるcDNA混合物は、各鎖の３′末
端にオリゴデオキシシチジンを付加することにより末端
トランスフエラーゼで約15ニユクレオチド分伸ばし、リ
コンビナント分子合成のためのひとつの成分を製造する
（第１図の左欄をみよ）。
第２の成分として、なるべくはEscherichia coliより
得られた環状二本鎖プラスミドたとえばEscherichia c
oliプラスミドpBR322を制限エンドニユクレアーゼPst I
を用いて直線状として、cDNA混合物と同様にして、分子
の３′末端にオリゴデオキシグアニジンを付加させオリ
ゴデオキシグアニジンのはみでた末端とする。これらの
末端はcDNA分子の遊離のオリゴデオキシシチジン末端と
安定な二本鎖DNA領域を形成する（第１図の右側のカラ
ムをみよ）。
得られた環状二本鎖プラスミドたとえばEscherichia c
oliプラスミドpBR322を制限エンドニユクレアーゼPst I
を用いて直線状として、cDNA混合物と同様にして、分子
の３′末端にオリゴデオキシグアニジンを付加させオリ
ゴデオキシグアニジンのはみでた末端とする。これらの
末端はcDNA分子の遊離のオリゴデオキシシチジン末端と
安定な二本鎖DNA領域を形成する（第１図の右側のカラ
ムをみよ）。
たとえばpBR322およびDNAより得られるハイブリドプラ
スミドを用いて、微生物、たとえばEscherichia coli
HB101を、このDNAの複製および発現のおこる宿主に形質
転換する。
スミドを用いて、微生物、たとえばEscherichia coli
HB101を、このDNAの複製および発現のおこる宿主に形質
転換する。
このように得られたクローンのうち、IFN−αまたはIFN
−βに特異的な配列を含有するクローンを、コロニーハ
イブリダイゼーシヨンで同定する。用いる試験物質は、
インターフエロン配列に特異的であるトリデカニユクレ
オチド５′dCCTTCTGGAACTG3′をプライマーとし、IFN-m
RNAを含有するRNAの逆転写により合成される放射ラベル
cDNAである。この目的ではトリデカニユクレオチドを、
なるべくは、γ−32P-ATPおよびT4−ポリニユクレオチ
ドキナーゼを用い、その末端において放射ラベルする。
ラベルされたトリデカニユクレオチドの過剰およびSend
aiウイルスで誘導された細胞よりのポリ（Ａ）+RNAを用
いる逆転写反応のための開始複合物を、前記条件で製造
する（第２図をみよ）。そこでこのように製造されたcD
NAは、トリデカニユクレオチドを有する、逆転写反応の
ための開始複合物が生成された時のみに、放射ラベルさ
れる。つまり、ラベルはトリデカニユクレオチドのみに
含まれるからである。その結果、本発明は、このトリデ
カニユクレオチドに相補的DNA配列を有するDNAを認識す
る際の高度の選択性を保証し、それで、α−およびβ−
インターフエロンDNA認識のための高度の選択性を保証
する。用いたトリデカニユクレオチドに対し相補性のDN
A配列を有するハイブリドプラスミドを含有する、これ
らの転換された細菌のコロニーはオートラジオグラフイ
ーにより示される（第３図をみよ）。このようにして、
約13,000個の転換された細菌コロニーより、トリデカニ
ユクレオチドで開始されたcDNAを有する、陽性シグナル
を与えた190クローンを分離した。つまり、ジーンバン
ク中のすべてのクローンの約１％が特異的配列dCCTTCTG
GAACTGを含有する。
−βに特異的な配列を含有するクローンを、コロニーハ
イブリダイゼーシヨンで同定する。用いる試験物質は、
インターフエロン配列に特異的であるトリデカニユクレ
オチド５′dCCTTCTGGAACTG3′をプライマーとし、IFN-m
RNAを含有するRNAの逆転写により合成される放射ラベル
cDNAである。この目的ではトリデカニユクレオチドを、
なるべくは、γ−32P-ATPおよびT4−ポリニユクレオチ
ドキナーゼを用い、その末端において放射ラベルする。
ラベルされたトリデカニユクレオチドの過剰およびSend
aiウイルスで誘導された細胞よりのポリ（Ａ）+RNAを用
いる逆転写反応のための開始複合物を、前記条件で製造
する（第２図をみよ）。そこでこのように製造されたcD
NAは、トリデカニユクレオチドを有する、逆転写反応の
ための開始複合物が生成された時のみに、放射ラベルさ
れる。つまり、ラベルはトリデカニユクレオチドのみに
含まれるからである。その結果、本発明は、このトリデ
カニユクレオチドに相補的DNA配列を有するDNAを認識す
る際の高度の選択性を保証し、それで、α−およびβ−
インターフエロンDNA認識のための高度の選択性を保証
する。用いたトリデカニユクレオチドに対し相補性のDN
A配列を有するハイブリドプラスミドを含有する、これ
らの転換された細菌のコロニーはオートラジオグラフイ
ーにより示される（第３図をみよ）。このようにして、
約13,000個の転換された細菌コロニーより、トリデカニ
ユクレオチドで開始されたcDNAを有する、陽性シグナル
を与えた190クローンを分離した。つまり、ジーンバン
ク中のすべてのクローンの約１％が特異的配列dCCTTCTG
GAACTGを含有する。
リコンビナントDNA分子中のインターフエロン特異的核
酸は、RNAトランスフアーハイブリダイゼーシヨン、ハ
イブリド分離、制限マツピングおよび核酸配列の決定に
より同定する。生成するインターフエロンポリペプチド
の生物学的同定は、抗ウイルス活性の測定により、イン
ターフエロンの型は免疫学的方法で行なう。
酸は、RNAトランスフアーハイブリダイゼーシヨン、ハ
イブリド分離、制限マツピングおよび核酸配列の決定に
より同定する。生成するインターフエロンポリペプチド
の生物学的同定は、抗ウイルス活性の測定により、イン
ターフエロンの型は免疫学的方法で行なう。
このように分離されたインターフエロン遺伝子は細菌中
で発現される。しかし、酵母のような他の生物でもよ
い。さらに、リボゾーム結合配列に組合わせてプロモー
ターを挿入すると、自発的発現の約104倍に達する発現
値をうることができる。
で発現される。しかし、酵母のような他の生物でもよ
い。さらに、リボゾーム結合配列に組合わせてプロモー
ターを挿入すると、自発的発現の約104倍に達する発現
値をうることができる。
それで、本発明により、２つの類似する群の遺伝子、つ
まり２つの群IFN−αおよびIFN−βを１回だけの操作で
分離するという本発明の目的が達成され、そして、必要
とするRNAの分離のための出発材料としてＢ−淋巴球型
の細胞を選びそしてハイブリダイゼーシヨン標品として
用いる、cDNAのためのプライマーとしてインターフエロ
ン特異的のオリゴニユクレオチドを用いることにより、
それら２つの群の遺伝子がインターフエロンの生産に用
いるに適当であることを示し得た。
まり２つの群IFN−αおよびIFN−βを１回だけの操作で
分離するという本発明の目的が達成され、そして、必要
とするRNAの分離のための出発材料としてＢ−淋巴球型
の細胞を選びそしてハイブリダイゼーシヨン標品として
用いる、cDNAのためのプライマーとしてインターフエロ
ン特異的のオリゴニユクレオチドを用いることにより、
それら２つの群の遺伝子がインターフエロンの生産に用
いるに適当であることを示し得た。
つぎに実施例で本発明をより詳しく説明する。
例Ａ ヒトIFN−αおよびIFN−β−mRNAを含有する、ポリ
（Ａ）+RNA生産のための適当なセルストレインの選択 文献記載の方法によりインターフエロンを生産するよう
に、Sendaiウイルスで、種々のヒト細胞株を誘導した。
24から48時間後に、ある型に特異的の抗血清で中和し、
細胞上清のIFN−αおよびIFN−β含量を測定した。試題
したセルストレインのあるものに見出だされるIFN−α
対IFN−βの割合を前記の表に示した。たとえば、Namal
wa細胞が、Sendaiウイルス誘導後たとえば50％より多く
のIFN−αを生産し、約50％までのIFN−βを生産するこ
とは明らかである。
（Ａ）+RNA生産のための適当なセルストレインの選択 文献記載の方法によりインターフエロンを生産するよう
に、Sendaiウイルスで、種々のヒト細胞株を誘導した。
24から48時間後に、ある型に特異的の抗血清で中和し、
細胞上清のIFN−αおよびIFN−β含量を測定した。試題
したセルストレインのあるものに見出だされるIFN−α
対IFN−βの割合を前記の表に示した。たとえば、Namal
wa細胞が、Sendaiウイルス誘導後たとえば50％より多く
のIFN−αを生産し、約50％までのIFN−βを生産するこ
とは明らかである。
中和試験はつぎのように実施した。
Sendaiウイルスで誘導した細胞培養物の上清よりの約10
インターフエロン単位を、つぎの材料と37℃で60から90
分インキユベートした。
インターフエロン単位を、つぎの材料と37℃で60から90
分インキユベートした。
1. IFN−αに対する抗血清；最終希釈1:100;（Researc
h Resources Branch,National Institutes of Allergy
and Infectious Diseases,Bethesda Md,USAより入
手）。
h Resources Branch,National Institutes of Allergy
and Infectious Diseases,Bethesda Md,USAより入
手）。
2. ヒトβ−IFNに対する抗血清；最終希釈1:300;（Dr.
Y.H.Tan.University of Calgary,Canadaより入手）。
Y.H.Tan.University of Calgary,Canadaより入手）。
3. １および２の混合物。
インキユベーシヨンのあと、残留インターフエロン活性
はプラーク減少試験（Journal of Interferon Research
2,in preparation（1982）をみよ）で測定した。
はプラーク減少試験（Journal of Interferon Research
2,in preparation（1982）をみよ）で測定した。
例Ｂ Sendaiウイルスで誘導したNamalwa細胞からの、ヒトIFN
−αおよびIFN−β−mRNA含有ポリ（Ａ）+RNAの調製 Namalwa細胞の培養およびSendaiウイルスを用いる誘導
は、文献既知の方法で実施した（Methods in Enzymolog
y,Vol.78A,69-75頁（1981）,Academic Press,New York
をみよ）。mRNA調製の時点は誘導後９時間とした（６か
ら12時間）。理由は、この時間をすぎるとインターフエ
ロン特異的ｍ−RNAの割合が極大になるゆえである。
−αおよびIFN−β−mRNA含有ポリ（Ａ）+RNAの調製 Namalwa細胞の培養およびSendaiウイルスを用いる誘導
は、文献既知の方法で実施した（Methods in Enzymolog
y,Vol.78A,69-75頁（1981）,Academic Press,New York
をみよ）。mRNA調製の時点は誘導後９時間とした（６か
ら12時間）。理由は、この時間をすぎるとインターフエ
ロン特異的ｍ−RNAの割合が極大になるゆえである。
細胞は、1000gで20分遠心し、NP-40緩衝液（0.14M NaC
l,1.5mM MgCl2,10mMトリス−HCl,pH7.4）中で１度洗
い、0.5％の非イオン性洗浄剤NP-40（Shell製）および2
mg/mlのベントナイトを含有するNP-40緩衝液中に懸濁さ
せた。氷浴中５分後に、上記のように遠心して細胞核を
球粒とし、細胞質（RNA含有）分画（上清）を、フエノ
ール−クロロホルムで３度そしてクロロホルムで１度
（２％SDS,5mMのEDTAおよび50mMのトリス−HCl添加後）
抽出し、RNAをアルコールで沈殿させた。ポリ（Ａ）+RN
Aは文献既知の方法で精製した（Proc.Natl.Acad.Sci.US
A.69,1408-1412（1972））。つまり、オリゴ（dT）セル
ロースクロマトグラフイーに処し、10mM酢酸ナトリウム
緩衝液、pH5.5、1mM EDTA中５−20％スクロース勾配中
で遠心し（25,000r.p.m.で20時間、Spinco SW27ロータ
ー使用）分子の大きさに従つて分け、大きさで6S（沈降
単位）から18sまでの分子を集めた（簡単のために“12S
-RNA"と称する）（第１図の左側をみよ）。
l,1.5mM MgCl2,10mMトリス−HCl,pH7.4）中で１度洗
い、0.5％の非イオン性洗浄剤NP-40（Shell製）および2
mg/mlのベントナイトを含有するNP-40緩衝液中に懸濁さ
せた。氷浴中５分後に、上記のように遠心して細胞核を
球粒とし、細胞質（RNA含有）分画（上清）を、フエノ
ール−クロロホルムで３度そしてクロロホルムで１度
（２％SDS,5mMのEDTAおよび50mMのトリス−HCl添加後）
抽出し、RNAをアルコールで沈殿させた。ポリ（Ａ）+RN
Aは文献既知の方法で精製した（Proc.Natl.Acad.Sci.US
A.69,1408-1412（1972））。つまり、オリゴ（dT）セル
ロースクロマトグラフイーに処し、10mM酢酸ナトリウム
緩衝液、pH5.5、1mM EDTA中５−20％スクロース勾配中
で遠心し（25,000r.p.m.で20時間、Spinco SW27ロータ
ー使用）分子の大きさに従つて分け、大きさで6S（沈降
単位）から18sまでの分子を集めた（簡単のために“12S
-RNA"と称する）（第１図の左側をみよ）。
インターフエロン−特異的mRNA（IFN−αおよびIFN−β
−mRNA）の含量は、“12S-RNA"をXenopus laevisの卵
細胞にミクロ注入し（J.Embryol.およびExper.Morph.2
0,401-414（1968）をみよ）そして卵細胞上清中のイン
ターフエロン活性を測定することで定量した。注入され
た“12S-RNA"の１μｇは、インターフエロンスタンダー
ド69/19をもとにして、平均して、約1000インターフエ
ロン国際単位（I.U.）のタイターを与えた。
−mRNA）の含量は、“12S-RNA"をXenopus laevisの卵
細胞にミクロ注入し（J.Embryol.およびExper.Morph.2
0,401-414（1968）をみよ）そして卵細胞上清中のイン
ターフエロン活性を測定することで定量した。注入され
た“12S-RNA"の１μｇは、インターフエロンスタンダー
ド69/19をもとにして、平均して、約1000インターフエ
ロン国際単位（I.U.）のタイターを与えた。
つまり、活性の約80％はα−型インターフエロンに対す
る抗血清で中和されえたが、活性全体は抗−αおよび抗
−β−インターフエロン抗血清によつてはじめて中和さ
れ得た。
る抗血清で中和されえたが、活性全体は抗−αおよび抗
−β−インターフエロン抗血清によつてはじめて中和さ
れ得た。
例Ｃ Namalwa-cDNAクローンバンクの調製 ６から18Sのあいだの分子の大きさのポリ（Ａ）+RNA
（“12S-RNA"）（例Ｂをみよ）を、一本鎖cDNA調製のた
めのマトリツクスに用いた。つまり50mMのトリス−HCl,
pH8.3,10mMのMgCl2,100mMのKCl,1mMのdNTPs,0.4mMのDT
T,4mMのNaピロホスフエート、20μg/mlのオリゴ（dT）
12-18（PL-Biochemicals）,25μg/mlのアクチノマイシ
ンＤ中、40μg/mlのポリ（Ａ）+RNAを、100単位/mlのAM
V逆転写酵素（Dr.J.Beard,Life Sciences,Inc.1509 1/2
49th Street,South,St.Petersburg,Florida 33707、US
A）と共に、44-45℃で45分インキユベートした。つい
で、RNA-DNAハイブリドのRNA部分を0.3MのNaOH中50℃で
１時間インキユベートして除き、そのあと、一本鎖cDNA
を中和し、エタノールで沈殿させた。
（“12S-RNA"）（例Ｂをみよ）を、一本鎖cDNA調製のた
めのマトリツクスに用いた。つまり50mMのトリス−HCl,
pH8.3,10mMのMgCl2,100mMのKCl,1mMのdNTPs,0.4mMのDT
T,4mMのNaピロホスフエート、20μg/mlのオリゴ（dT）
12-18（PL-Biochemicals）,25μg/mlのアクチノマイシ
ンＤ中、40μg/mlのポリ（Ａ）+RNAを、100単位/mlのAM
V逆転写酵素（Dr.J.Beard,Life Sciences,Inc.1509 1/2
49th Street,South,St.Petersburg,Florida 33707、US
A）と共に、44-45℃で45分インキユベートした。つい
で、RNA-DNAハイブリドのRNA部分を0.3MのNaOH中50℃で
１時間インキユベートして除き、そのあと、一本鎖cDNA
を中和し、エタノールで沈殿させた。
一本鎖DNAに相補的の第２のDNA鎖はつぎの条件で合成し
た。0.12Mのリン酸カリウム緩衝液、pH6.9,10mMのMgC
l2,10mMのDTT,1mMのdNTP中、30μg/mlの一本鎖cDNAを30
0単位/mlのDNAポリメラーゼＩ（Boehringer Mannheim）
とインキユベートし、ついでフエノール抽出しエタノー
ル沈殿させた。
た。0.12Mのリン酸カリウム緩衝液、pH6.9,10mMのMgC
l2,10mMのDTT,1mMのdNTP中、30μg/mlの一本鎖cDNAを30
0単位/mlのDNAポリメラーゼＩ（Boehringer Mannheim）
とインキユベートし、ついでフエノール抽出しエタノー
ル沈殿させた。
このように製造した二本鎖cDNA混合物の鎖の両端を変型
してはみ出している一本鎖領域を除いた。そのために
は、0.3MのNaCl,30mMの酢酸ナトリウム、pH4.5,1mMのZn
Cl2中で、上記のDNAを、1250単位/mlのSl−ニユクレア
ーゼ（Miles Laboratories）と、30分37℃でインキユベ
ートし、フエノール抽出し、エタノール沈殿させた。そ
のようにして生成した“平滑末端化した”二本鎖cDNA
は、10mMの酢酸ナトリウム緩衝液、pH5.5および1mMのED
TA中、５−20％スクロース勾配で分けた。少なくとも60
0の塩基対を有する分画を分離した。
してはみ出している一本鎖領域を除いた。そのために
は、0.3MのNaCl,30mMの酢酸ナトリウム、pH4.5,1mMのZn
Cl2中で、上記のDNAを、1250単位/mlのSl−ニユクレア
ーゼ（Miles Laboratories）と、30分37℃でインキユベ
ートし、フエノール抽出し、エタノール沈殿させた。そ
のようにして生成した“平滑末端化した”二本鎖cDNA
は、10mMの酢酸ナトリウム緩衝液、pH5.5および1mMのED
TA中、５−20％スクロース勾配で分けた。少なくとも60
0の塩基対を有する分画を分離した。
このcDNA混合物のうちの0.5μｇを、各鎖の３′末端に
オリゴデオキシシチジンを付加さすことにより約15ニユ
クレオチド分延ばした。それには、0.5μｇ分を、140mM
のカリウムカコジレート、pH6.9,30mMのトキス−HCl,pH
6.9,2mMのCoCl2,0.1mMのDTT,0.1mg/mlのBSAおよび５μ
ｍのdCTP中、500単位/mlの末端トタンスフエラーゼと37
℃で４分インキユベートした。この段階で、リコンビナ
ント分子のひとつの成分を形成するcDNAが用意される
（第１図の左側をみよ）。
オリゴデオキシシチジンを付加さすことにより約15ニユ
クレオチド分延ばした。それには、0.5μｇ分を、140mM
のカリウムカコジレート、pH6.9,30mMのトキス−HCl,pH
6.9,2mMのCoCl2,0.1mMのDTT,0.1mg/mlのBSAおよび５μ
ｍのdCTP中、500単位/mlの末端トタンスフエラーゼと37
℃で４分インキユベートした。この段階で、リコンビナ
ント分子のひとつの成分を形成するcDNAが用意される
（第１図の左側をみよ）。
第２の成分は、環状の二本鎖DNA分子である、Escherich
ia coliプラスミドpBR322である。２μg pBR 322を、
制限エンドニユクレアーゼPst Iで直線状とし、cDNA混
合物と同様にして、突出するオリゴデオキシグアニジン
末端を生ずるように、分子の３′末端にオリゴデオキシ
グアニジンを付加させて変型した（第１図の右側をみ
よ）。これらのオリゴデオキシグアニジン末端は、cDNA
分子の遊離オリゴデオキシシチジン末端と塩基対を形成
して安定なDNA二本鎖領域を生じうる。それには、反応
のそれら２つの成分を、0.1MのNaCl,1mMのEDTA,20mMの
トリス−HCl,pH8中で65℃で10分、ついで45℃で2.5時間
そして37℃で１夜インキユベートする。
ia coliプラスミドpBR322である。２μg pBR 322を、
制限エンドニユクレアーゼPst Iで直線状とし、cDNA混
合物と同様にして、突出するオリゴデオキシグアニジン
末端を生ずるように、分子の３′末端にオリゴデオキシ
グアニジンを付加させて変型した（第１図の右側をみ
よ）。これらのオリゴデオキシグアニジン末端は、cDNA
分子の遊離オリゴデオキシシチジン末端と塩基対を形成
して安定なDNA二本鎖領域を生じうる。それには、反応
のそれら２つの成分を、0.1MのNaCl,1mMのEDTA,20mMの
トリス−HCl,pH8中で65℃で10分、ついで45℃で2.5時間
そして37℃で１夜インキユベートする。
この方法で、pST I制限エンドニユクレアーゼによる切
れ目を生じ、ひきつづいて、ベクターハイブリドよりcD
NA挿入物を切り出すのに利用しうる。
れ目を生じ、ひきつづいて、ベクターハイブリドよりcD
NA挿入物を切り出すのに利用しうる。
pBR322およびNamalwa-cDNAよりこの方法で生成されるハ
イブリドプラスミドで、文献（Proc.Natl.Acad.Sci.,US
A69,2110-2114（1972））記載の方法で、Escherichia
coli HB101を形質転換する。このようにして、転換され
たE.coll細胞の30,000クローンが得られるので、ミクロ
タイタープレート中で個別に分けた。
イブリドプラスミドで、文献（Proc.Natl.Acad.Sci.,US
A69,2110-2114（1972））記載の方法で、Escherichia
coli HB101を形質転換する。このようにして、転換され
たE.coll細胞の30,000クローンが得られるので、ミクロ
タイタープレート中で個別に分けた。
例Ｄ 合成トリデカニユクレオチド５′dCCTTCTGGAACTG3′を
用いる、IFN−αおよびIFN-βDNA配列に関して特異的で
あるハイブリダイゼーシヨン標品の調製 本発明が対象としている、インターフエロン配列含有転
換E.coliクローンを選択する方法は、配列５′dCCTTCTG
GAACTG3′を有する合成トリデカニユクレオチドの使用
を基礎としている。この配列は、IFN−αの遺伝子の大
部分およびIFN−β遺伝子のあいだで相同性の、切れ目
のないもつとも長いDNA部分である。このトリデカニユ
クレオチドの合成はすでに記載された。このトリデカニ
ユクレオチドは、50mMのトリス−HCl,pH7.5,10mMのMgCl
2,5mMのDTT,0.1mMスペルミジン、１μｍの32P-ATP中、6
0単位/mlのT4−ポリニユクレオチドキナーゼ（Bethesda
Research Laboratories）と、37℃で30分インキユベー
トし、分子の５′末端において500Ci/mモルの比活性に
ラベルした。
用いる、IFN−αおよびIFN-βDNA配列に関して特異的で
あるハイブリダイゼーシヨン標品の調製 本発明が対象としている、インターフエロン配列含有転
換E.coliクローンを選択する方法は、配列５′dCCTTCTG
GAACTG3′を有する合成トリデカニユクレオチドの使用
を基礎としている。この配列は、IFN−αの遺伝子の大
部分およびIFN−β遺伝子のあいだで相同性の、切れ目
のないもつとも長いDNA部分である。このトリデカニユ
クレオチドの合成はすでに記載された。このトリデカニ
ユクレオチドは、50mMのトリス−HCl,pH7.5,10mMのMgCl
2,5mMのDTT,0.1mMスペルミジン、１μｍの32P-ATP中、6
0単位/mlのT4−ポリニユクレオチドキナーゼ（Bethesda
Research Laboratories）と、37℃で30分インキユベー
トし、分子の５′末端において500Ci/mモルの比活性に
ラベルした。
この末端ラベルトリデカニユクレオチドを（一本鎖）cD
NA合成のプライマーに用いた。他方、Sendaiウイルスで
誘導したNamalwa細胞からのポリ（Ａ）+RNA（例Ｂをみ
よ）をマトリツクスに用いた。
NA合成のプライマーに用いた。他方、Sendaiウイルスで
誘導したNamalwa細胞からのポリ（Ａ）+RNA（例Ｂをみ
よ）をマトリツクスに用いた。
反応は、50mMのトリス−Hcl,pH8.3,60mMのKCl,5mMのDT
T,50μg/mlのアクチノマイシンＤ、4mMのMgCl2,4mMのポ
ロリン酸ナトリウムおよび0.5mMのdNTPs中、RNAに対し
プライマーを５から10倍モル過剰とし、100単位/mlのAM
V逆転写酵素を用い、37℃で90分反応させた。RNA-DNAハ
イブリドのRNA成分を除くために、50℃で0.3MのNaOH中
で１時間インキュベートしついで0.3Mの酢酸で中和した
あと、cDNAをハイブリダイゼーシヨンの標品に用いう
る。このプロセスを第２図に模式的に示す。そこで、こ
のように製造したcDNAは、インターフエロンに特異的な
トリデカニユクレオチドをプライマーとして合成した分
子中のみに放射ラベルを担い、それで、ハイブリダイゼ
ーシヨンにおいて、インターフエロン−DNA配列の認識
に高い特異性を示す。
T,50μg/mlのアクチノマイシンＤ、4mMのMgCl2,4mMのポ
ロリン酸ナトリウムおよび0.5mMのdNTPs中、RNAに対し
プライマーを５から10倍モル過剰とし、100単位/mlのAM
V逆転写酵素を用い、37℃で90分反応させた。RNA-DNAハ
イブリドのRNA成分を除くために、50℃で0.3MのNaOH中
で１時間インキュベートしついで0.3Mの酢酸で中和した
あと、cDNAをハイブリダイゼーシヨンの標品に用いう
る。このプロセスを第２図に模式的に示す。そこで、こ
のように製造したcDNAは、インターフエロンに特異的な
トリデカニユクレオチドをプライマーとして合成した分
子中のみに放射ラベルを担い、それで、ハイブリダイゼ
ーシヨンにおいて、インターフエロン−DNA配列の認識
に高い特異性を示す。
例Ｅ トリデカニユクレオチドをプライマーとしたcDNAを用い
るコロニーハイブリダイゼーシヨン ここに記載する方法を用いて、トリデカニユクレオチド
に相補性のDNA配列を有するハイブリドプラスミドを含
有する転換細菌クローンを認識する。そのために、それ
ぞれにクローン化された形質転換菌の細胞は22×15cmの
ニトロセルローズフイルター（孔のサイズ0.45μｍ、Mi
lliporeまたはSchleicher＆Schuell）上に移し、フイル
ター上で培養して直径2mmのコロニーとし、文献記載の
方法（Proc.Natl.Acad.Sci.USA72,3961-3965（1975）お
よびAnalytical Biochemistry 98,60-63（1979））によ
るコロニーハイブリダイゼーシヨンに用いた。末端ラベ
ルcDNA（例Ｄをみよ）を用いる核酸ハイプリダイゼーシ
ヨンは、50％ホルムアミド、４×SET（１×SET＝0.15M
のNaCl,5mMのEDTA,50mMのトリス−HCl,pH8）、１×Denh
ardt溶液（0.02％BSA,0.02％Ficoll,0.02％ポリビニル
ピロリドン）、0.5mg/mlの変性しせん断したさけの精子
DNA,0.1％ナトリウムピロホムフエートおよび0.1％SDS
中、37℃で48時間インキユベートして実施した。つい
で、フイルターは、50％ホルムアミドおよび0.2×SSC
（１×SSC＝0.15M NaClおよび0.015Mのくえん酸ナトリ
ウム）より成立つ溶液中で20から25℃で洗い、ついで１
×SSCの溶液を用いてすすいだ。フイルターは20から25
℃で乾燥し、マイナス70℃で、Ｘ−線フイルム（Kodak
XR）にさらした。第３図はそのような試験の代表的結果
を示す。示した表面上で1536個の細菌コロニーを培養
し、コロニーハイブリダイゼーシヨンでシクリーニング
した。矢印は、放射活性標品のシグナルを与えるハイブ
リドプラスミドDNAを有する転換細菌クローンを示す。
全体で約13,000個の転換細菌コロニーをスクリーニング
し、トリデカニユクレオチドで開始され、Sendaiウイル
スで誘導されたNamalwa細胞より得られた、cDNAの有す
る陽性シグナルを与える190個のクローンが得られた。
それらは２個のミクロタイタープレート（P1およびP2）
上に捕集された。つまり、このクローンバンク上のすべ
てのクローンの約１％が特異的配列dCCTTCTGGAACTGを含
有した。
るコロニーハイブリダイゼーシヨン ここに記載する方法を用いて、トリデカニユクレオチド
に相補性のDNA配列を有するハイブリドプラスミドを含
有する転換細菌クローンを認識する。そのために、それ
ぞれにクローン化された形質転換菌の細胞は22×15cmの
ニトロセルローズフイルター（孔のサイズ0.45μｍ、Mi
lliporeまたはSchleicher＆Schuell）上に移し、フイル
ター上で培養して直径2mmのコロニーとし、文献記載の
方法（Proc.Natl.Acad.Sci.USA72,3961-3965（1975）お
よびAnalytical Biochemistry 98,60-63（1979））によ
るコロニーハイブリダイゼーシヨンに用いた。末端ラベ
ルcDNA（例Ｄをみよ）を用いる核酸ハイプリダイゼーシ
ヨンは、50％ホルムアミド、４×SET（１×SET＝0.15M
のNaCl,5mMのEDTA,50mMのトリス−HCl,pH8）、１×Denh
ardt溶液（0.02％BSA,0.02％Ficoll,0.02％ポリビニル
ピロリドン）、0.5mg/mlの変性しせん断したさけの精子
DNA,0.1％ナトリウムピロホムフエートおよび0.1％SDS
中、37℃で48時間インキユベートして実施した。つい
で、フイルターは、50％ホルムアミドおよび0.2×SSC
（１×SSC＝0.15M NaClおよび0.015Mのくえん酸ナトリ
ウム）より成立つ溶液中で20から25℃で洗い、ついで１
×SSCの溶液を用いてすすいだ。フイルターは20から25
℃で乾燥し、マイナス70℃で、Ｘ−線フイルム（Kodak
XR）にさらした。第３図はそのような試験の代表的結果
を示す。示した表面上で1536個の細菌コロニーを培養
し、コロニーハイブリダイゼーシヨンでシクリーニング
した。矢印は、放射活性標品のシグナルを与えるハイブ
リドプラスミドDNAを有する転換細菌クローンを示す。
全体で約13,000個の転換細菌コロニーをスクリーニング
し、トリデカニユクレオチドで開始され、Sendaiウイル
スで誘導されたNamalwa細胞より得られた、cDNAの有す
る陽性シグナルを与える190個のクローンが得られた。
それらは２個のミクロタイタープレート（P1およびP2）
上に捕集された。つまり、このクローンバンク上のすべ
てのクローンの約１％が特異的配列dCCTTCTGGAACTGを含
有した。
例Ｆ トリデカニユクレオチドをプライマーとしたcDNAでハイ
ブリダイゼーシヨンしたクローンの配列の複雑さの分析 190個のトリデカニユクレオチド陽性クローン（例Ｅを
みよ）中の種々の配列（配列の複雑さ）のクローンの数
を測定するために、種々のクローンより、Pst I消化
（例Ｃをみよ）、0.8％アガロースゲル中での電気泳
動、望むバンドの溶出（つまり、バンドを含有するゲル
のフラグメントを沈降させそして透析チユーブ中でアガ
ロースよりDNAを電気泳動的に溶出する）により望むバ
ンドを溶出しそしてこれらのcDNA挿入物を、文献（J.Mo
l.Biol.113,237-251（1977））既知の方法を用い32Ｐを
用いニツクトランスレーシヨン（nick translation）で
ラベルした。トリデカニユクレオチド陽性クローン（ミ
クロピペツトプレートP1およびP2）およびランダムに選
んだミクロタイタープレート（E52）のインプレツシヨ
ンをニトロセルローズフイルターに移し、培養し、コロ
ニーハイブリダイゼーシヨンの準備をし（例Ｅをみよ）
そして種々の32Ｐ−ラベルcDNA挿入物でハイブリダイゼ
ーシヨンした。ハイブリダイゼーシヨンは例Ｅのように
実施した。ただし、50μg/mlのポリ（Ｕ）および10μg/
mlのポリ（Ｉ）：ポリ（Ｃ）もまたハイブリダイゼーシ
ヨン溶液に加え、ハイブリダイゼーシヨンのあと、フイ
ルターは50％ホルムアミドおよび１×SSCで洗つた。ク
ローンP1H1およびP2H10の挿入物を試料としたそのよう
な実験の結果を第４図に示す。（P1H1はミクロタイター
プレートP1上の位置H1上のクローンで、P2H10はミクロ
タイタープレートP2上の位置H10である）。クローンP1H
1は、プレートP1およびP2上のトリデカニユクレオチド
陽性クローンの90％以上とハイブリダイゼーシヨンし、
プレートE52（第４図、パートＡ）上のクローンのいく
らかとハイブリダイゼーシヨンとすることが分つた。こ
れらのクローン配列の多くのものは、あとで制限分析に
より同定確認された。クローンP2H10は、それ自体とハ
イブリダイゼーシヨンするのみでなく、位置1C12,1F12,
およびE52E1（第４図、パートＢ）中のクローンともハ
イブリダイゼーシヨンした。クローンP1A6およびP2B10
もこのように分析されたが、それぞれ、それ自身とだけ
ハイブリダイゼーシヨンした。（この結果は表４に示し
てない）。このことから、190個のトリデカニユクレオ
チド陽性クローンのうち、恐らく、10より少ない、質的
に異なる配列が存在すると推定しうる。そのような異な
る配列の４個は、P1H1,P2H10,P1A6およびP2B10である。
ブリダイゼーシヨンしたクローンの配列の複雑さの分析 190個のトリデカニユクレオチド陽性クローン（例Ｅを
みよ）中の種々の配列（配列の複雑さ）のクローンの数
を測定するために、種々のクローンより、Pst I消化
（例Ｃをみよ）、0.8％アガロースゲル中での電気泳
動、望むバンドの溶出（つまり、バンドを含有するゲル
のフラグメントを沈降させそして透析チユーブ中でアガ
ロースよりDNAを電気泳動的に溶出する）により望むバ
ンドを溶出しそしてこれらのcDNA挿入物を、文献（J.Mo
l.Biol.113,237-251（1977））既知の方法を用い32Ｐを
用いニツクトランスレーシヨン（nick translation）で
ラベルした。トリデカニユクレオチド陽性クローン（ミ
クロピペツトプレートP1およびP2）およびランダムに選
んだミクロタイタープレート（E52）のインプレツシヨ
ンをニトロセルローズフイルターに移し、培養し、コロ
ニーハイブリダイゼーシヨンの準備をし（例Ｅをみよ）
そして種々の32Ｐ−ラベルcDNA挿入物でハイブリダイゼ
ーシヨンした。ハイブリダイゼーシヨンは例Ｅのように
実施した。ただし、50μg/mlのポリ（Ｕ）および10μg/
mlのポリ（Ｉ）：ポリ（Ｃ）もまたハイブリダイゼーシ
ヨン溶液に加え、ハイブリダイゼーシヨンのあと、フイ
ルターは50％ホルムアミドおよび１×SSCで洗つた。ク
ローンP1H1およびP2H10の挿入物を試料としたそのよう
な実験の結果を第４図に示す。（P1H1はミクロタイター
プレートP1上の位置H1上のクローンで、P2H10はミクロ
タイタープレートP2上の位置H10である）。クローンP1H
1は、プレートP1およびP2上のトリデカニユクレオチド
陽性クローンの90％以上とハイブリダイゼーシヨンし、
プレートE52（第４図、パートＡ）上のクローンのいく
らかとハイブリダイゼーシヨンとすることが分つた。こ
れらのクローン配列の多くのものは、あとで制限分析に
より同定確認された。クローンP2H10は、それ自体とハ
イブリダイゼーシヨンするのみでなく、位置1C12,1F12,
およびE52E1（第４図、パートＢ）中のクローンともハ
イブリダイゼーシヨンした。クローンP1A6およびP2B10
もこのように分析されたが、それぞれ、それ自身とだけ
ハイブリダイゼーシヨンした。（この結果は表４に示し
てない）。このことから、190個のトリデカニユクレオ
チド陽性クローンのうち、恐らく、10より少ない、質的
に異なる配列が存在すると推定しうる。そのような異な
る配列の４個は、P1H1,P2H10,P1A6およびP2B10である。
例Ｇ RNAトランスフアーハイブリダイゼーシヨン 特定のトリデカニユクレオチド−陽性細菌クローンがイ
ンターフエロン配列を含みうるかどうかをみるために、
そのプラスミドDNAが、SendaiウイルスによりNamalwa細
胞中に誘導されたmRNAとハイブリダイゼーシヨンするか
どうかをみるための試験を行なつた。その目的では、例
Ｂ記載のようにして、ポリ（Ａ）+RNAを誘導および非誘
導Namalwa細胞より分離し、1Mグリオギザール、50％DMS
A,10mMリン酸ナトリウム緩衝液、pH7中で50℃で１時間
インキユベートし、1.4％アガロースゲル上で分け、ニ
トロセルロースフイルターに移した。それには文献既知
の方法（Proc.Nat.Acad.Sci,USA77,5201-5205（198
0））を用いた。そして、ニツクトランスレーシヨンに
より32ＰでラベルしたプラスミドDNAとハイブリダイゼ
ーシヨンさせた（例Ｆをみよ）。この試験の方法では、
誘導遺伝子に由来するプラスミドDNAは、誘導細胞より
のRNAとのみハイブリダイゼーシヨンし、非誘導細胞由
来のRNAとはハイブリダイゼーシヨンしないであろう。
第５図は、この種の実験のオートラジオグラフイーを示
す。誘導されたRNA（“1"）はそれぞれの場合につい
て、対の左欄にあり、非誘導RNA（“n"）は右欄にあ
る。ハイブリダイゼーシヨンに用いたプラスミドDNA
は、P1H1（Ａ）,P1F12（B,D）,P2H10（Ｃ）,P1A6
（Ｅ）,P2B10（Ｆ）である。試験したプラスミドのう
ち、P1F12,P2H10およびP1A6が誘導された細胞よりのRNA
とのみハイブリダイゼーシヨンし、P1H1およびP2B10
は、非誘導細胞からのRNAとのシグナルも生成した。P1F
12およびP2H10とハイブリダイゼーシヨンするRNAの分子
のサイズは、11-12Sであり、P1A6とハイブリダイゼーシ
ヨンするRNAのサイズは12から14Sである。これらの分子
の大きさは、IFN−βおよびIFN−α mRNAについて文献
に記載されている。それで、プラスミドP1F12,P2H10お
よびP1A6について、それらのインターフエロン−DNA配
列含有を明確に定めるためにさらに調べてみた。
ンターフエロン配列を含みうるかどうかをみるために、
そのプラスミドDNAが、SendaiウイルスによりNamalwa細
胞中に誘導されたmRNAとハイブリダイゼーシヨンするか
どうかをみるための試験を行なつた。その目的では、例
Ｂ記載のようにして、ポリ（Ａ）+RNAを誘導および非誘
導Namalwa細胞より分離し、1Mグリオギザール、50％DMS
A,10mMリン酸ナトリウム緩衝液、pH7中で50℃で１時間
インキユベートし、1.4％アガロースゲル上で分け、ニ
トロセルロースフイルターに移した。それには文献既知
の方法（Proc.Nat.Acad.Sci,USA77,5201-5205（198
0））を用いた。そして、ニツクトランスレーシヨンに
より32ＰでラベルしたプラスミドDNAとハイブリダイゼ
ーシヨンさせた（例Ｆをみよ）。この試験の方法では、
誘導遺伝子に由来するプラスミドDNAは、誘導細胞より
のRNAとのみハイブリダイゼーシヨンし、非誘導細胞由
来のRNAとはハイブリダイゼーシヨンしないであろう。
第５図は、この種の実験のオートラジオグラフイーを示
す。誘導されたRNA（“1"）はそれぞれの場合につい
て、対の左欄にあり、非誘導RNA（“n"）は右欄にあ
る。ハイブリダイゼーシヨンに用いたプラスミドDNA
は、P1H1（Ａ）,P1F12（B,D）,P2H10（Ｃ）,P1A6
（Ｅ）,P2B10（Ｆ）である。試験したプラスミドのう
ち、P1F12,P2H10およびP1A6が誘導された細胞よりのRNA
とのみハイブリダイゼーシヨンし、P1H1およびP2B10
は、非誘導細胞からのRNAとのシグナルも生成した。P1F
12およびP2H10とハイブリダイゼーシヨンするRNAの分子
のサイズは、11-12Sであり、P1A6とハイブリダイゼーシ
ヨンするRNAのサイズは12から14Sである。これらの分子
の大きさは、IFN−βおよびIFN−α mRNAについて文献
に記載されている。それで、プラスミドP1F12,P2H10お
よびP1A6について、それらのインターフエロン−DNA配
列含有を明確に定めるためにさらに調べてみた。
例Ｈ ハリブリド−分離RNAの翻訳生成物についてのインター
フエロン活性の生物学的検出 特定のハイブリドプラスミドがインターフエロン−DNA
配列を含有するかどうかをみるために、生物学的試験を
基礎とする証明を、プラスミドP1F12,P2H10,P1H1および
P2B10について実施した。この証明の原理はつぎのよう
である。試験しようとするプラスミドDNAをニトロセル
ローズフイルター上に固定し、ついで、ハイブリダイゼ
ーシヨンの条件で、誘導されたNamalwa細胞よりのポリ
（Ａ）+RNA（例Ｂをみよ）とインキユベートした。結合
DNAがインターフエロン配列を含有するなら、インター
フエロン−mRNAはそれとハイブリダイゼーシヨンするで
あろう。ついでハイブリダイゼーシヨンしてないRNAは
洗い去り、ハイブリダイゼーシヨンしたRNAをDNAより溶
融し去り、Xenopus laevisの卵細胞に注入した。卵細
胞は、注入されたmRNAを蛋白質に翻訳しうる（例Ｂをみ
よ）。ハイブリダイゼーシヨンされたRNAがインターフ
エロン−mRNAならば、インターフエロン蛋白質が卵細胞
中に生成し、その抗ウイルス性をプラツク減少試験（例
Ａをみよ）において証明しうる。詳しくは、試験をつぎ
のように実施する。10μｇの直線状したプラスミドDNA
を200μｌの0.5NのNaCHで変性し、0.5N酢酸＋20×SET
（SETの組成については例Ｅをみよ）の200μｌで中和
し、ニトロセルロースフイルタ−（2.5cm直径）上で
過して固定する。フイルターは常温で乾燥し、80℃で２
時間加熱し、50％ホルムアミド、20mMのPIPES,pH6.5,0.
4MのNaCl,5mMのEDTA,10％デキストランスルフエート、
１％SDS,20μg/mlのE.coli tRNAおよび50μg/mlのポリ
（Ａ）中、53℃かまたは37℃で１時間プレハイブリダイ
ゼーシヨンに処し、誘導Namalwaポリ（Ａ）+RNAの14か
ら40μｇを加えたあと同じ緩衝液中で５時間ハイブリダ
イゼーシヨンした。ついで、0.2−１×SET,0.2％SDS,1
％デキストランスルフエート、５μg/mlのtRNA中で25℃
で20分宛３度洗い、ついで、2mMのEDTA,pH8.0,0.2％ S
DS,1％デキストランスルフエートおよび５μg/mlのtRNA
中25℃で10分間宛２度、ついで2mMのEDTA,pH8.0,0.2％S
DSおよび５μg/mlのtRNA中で60℃で５分間１度洗つた。
ハイブリダイゼーシヨンされたRNAは、1mlのH2＋10μｇ
のtRNA中で100℃で４分間溶出した。オリゴ（dT）セル
ロースのカラム上のクロマトグラフイー（例Ｂをみよ）
のあと、RNAはエタノールで沈殿させ、５μｌのH2Oに取
り、Xenopus laebis卵細胞に注射した。常温で２日イ
ンキユベーシヨンしたあと、卵細胞の上清を採取し、プ
ラツク減少試験でインターフエロン活性をみた。
フエロン活性の生物学的検出 特定のハイブリドプラスミドがインターフエロン−DNA
配列を含有するかどうかをみるために、生物学的試験を
基礎とする証明を、プラスミドP1F12,P2H10,P1H1および
P2B10について実施した。この証明の原理はつぎのよう
である。試験しようとするプラスミドDNAをニトロセル
ローズフイルター上に固定し、ついで、ハイブリダイゼ
ーシヨンの条件で、誘導されたNamalwa細胞よりのポリ
（Ａ）+RNA（例Ｂをみよ）とインキユベートした。結合
DNAがインターフエロン配列を含有するなら、インター
フエロン−mRNAはそれとハイブリダイゼーシヨンするで
あろう。ついでハイブリダイゼーシヨンしてないRNAは
洗い去り、ハイブリダイゼーシヨンしたRNAをDNAより溶
融し去り、Xenopus laevisの卵細胞に注入した。卵細
胞は、注入されたmRNAを蛋白質に翻訳しうる（例Ｂをみ
よ）。ハイブリダイゼーシヨンされたRNAがインターフ
エロン−mRNAならば、インターフエロン蛋白質が卵細胞
中に生成し、その抗ウイルス性をプラツク減少試験（例
Ａをみよ）において証明しうる。詳しくは、試験をつぎ
のように実施する。10μｇの直線状したプラスミドDNA
を200μｌの0.5NのNaCHで変性し、0.5N酢酸＋20×SET
（SETの組成については例Ｅをみよ）の200μｌで中和
し、ニトロセルロースフイルタ−（2.5cm直径）上で
過して固定する。フイルターは常温で乾燥し、80℃で２
時間加熱し、50％ホルムアミド、20mMのPIPES,pH6.5,0.
4MのNaCl,5mMのEDTA,10％デキストランスルフエート、
１％SDS,20μg/mlのE.coli tRNAおよび50μg/mlのポリ
（Ａ）中、53℃かまたは37℃で１時間プレハイブリダイ
ゼーシヨンに処し、誘導Namalwaポリ（Ａ）+RNAの14か
ら40μｇを加えたあと同じ緩衝液中で５時間ハイブリダ
イゼーシヨンした。ついで、0.2−１×SET,0.2％SDS,1
％デキストランスルフエート、５μg/mlのtRNA中で25℃
で20分宛３度洗い、ついで、2mMのEDTA,pH8.0,0.2％ S
DS,1％デキストランスルフエートおよび５μg/mlのtRNA
中25℃で10分間宛２度、ついで2mMのEDTA,pH8.0,0.2％S
DSおよび５μg/mlのtRNA中で60℃で５分間１度洗つた。
ハイブリダイゼーシヨンされたRNAは、1mlのH2＋10μｇ
のtRNA中で100℃で４分間溶出した。オリゴ（dT）セル
ロースのカラム上のクロマトグラフイー（例Ｂをみよ）
のあと、RNAはエタノールで沈殿させ、５μｌのH2Oに取
り、Xenopus laebis卵細胞に注射した。常温で２日イ
ンキユベーシヨンしたあと、卵細胞の上清を採取し、プ
ラツク減少試験でインターフエロン活性をみた。
結果は、RNAトランスフアーハイブリダイゼーシヨン
（例Ｇ）より明らかな仮定を確証した。つまり、クロー
ンP1F12およびP2H10はインターフエロン−DNA挿入物を
担うが、クローンP1H1およびP2B10は担わなかつた。IFN
−αまたはIFN−βに対する特異的抗血清で生ずるイン
ターフエロン活性を中和することにより（例Ａをみ
よ）、クローンP1F12およびP2H10中の挿入物がIFN-βDN
A配列であることが示された。
（例Ｇ）より明らかな仮定を確証した。つまり、クロー
ンP1F12およびP2H10はインターフエロン−DNA挿入物を
担うが、クローンP1H1およびP2B10は担わなかつた。IFN
−αまたはIFN−βに対する特異的抗血清で生ずるイン
ターフエロン活性を中和することにより（例Ａをみ
よ）、クローンP1F12およびP2H10中の挿入物がIFN-βDN
A配列であることが示された。
例Ｉ IFN−β型のクローンの制限および配列分析 クローンP1F12およびP2H10中のcDNA挿入物を制限エンド
ニユクレアーゼを用いて調べ、酵素Bam HI、Bg 1 II、E
co RI、Hin d III、Pst IおよびPvu IIによる切れ目の
存在および可能の位置を決定した。P1F2およびP2H10の
制限マツプと文献記載のIFN−β遺伝子（Gene10、11-15
（1980））との比較を第６図に示した。
ニユクレアーゼを用いて調べ、酵素Bam HI、Bg 1 II、E
co RI、Hin d III、Pst IおよびPvu IIによる切れ目の
存在および可能の位置を決定した。P1F2およびP2H10の
制限マツプと文献記載のIFN−β遺伝子（Gene10、11-15
（1980））との比較を第６図に示した。
３個のクローンのすべてがPvu II、Pst IおよびBg 1 II
より切断され、それぞれの切れ目のあいだの距離はそれ
ぞれのクローンについて同じであつた。クローンP1F12
およびP2H10中への挿入物がIFN−β遺伝子と同一である
ことの最終的な証明として、DNA配列の部分（Pvu IIお
よびBg 1 IIの切れ目の”右側”（３′））をMaxamおよ
びGilbertの方法（Proc,Nat 1.Acad.Sci. USA74、560-564（1977））を用いて同定し、報告された
IFN−βの配列と比較した。P1F12およびP2H10の配列はI
FN−β遺伝子に正確に同じであつた。それらは第７図に
示す。
より切断され、それぞれの切れ目のあいだの距離はそれ
ぞれのクローンについて同じであつた。クローンP1F12
およびP2H10中への挿入物がIFN−β遺伝子と同一である
ことの最終的な証明として、DNA配列の部分（Pvu IIお
よびBg 1 IIの切れ目の”右側”（３′））をMaxamおよ
びGilbertの方法（Proc,Nat 1.Acad.Sci. USA74、560-564（1977））を用いて同定し、報告された
IFN−βの配列と比較した。P1F12およびP2H10の配列はI
FN−β遺伝子に正確に同じであつた。それらは第７図に
示す。
いずれのクローンも５′末端において完全なIFN−β配
列を有しなかつた。それらは、それぞれ完成蛋白質をコ
ードする約60ニユクレオチド領域を欠如する。３′末端
において、P1F12は完全で、P2H10はさらに、ポリ（Ａ）
+RNA由来のポリ（dA）を含む、IFN−β cDNAの３′領域
全体を含有する。しかし、P2H10はさらに著しく伸びる
（1400塩基対）。つまりポリ（dA）より３′に、オリゴ
（dC）配列の部分があり、ついで、由来の分からない配
列がある。P2H10のこの追加領域の種々のフラグメント
のDNA配列を分析してみると、それらは、IFN−β遺伝子
と相同でない。さらに、クローンP2H10とクロス−ハイ
ブリダイゼイシヨンするクローンP1C12およびE52E1（例
Ｆ記載）は、P2H10のそのような追加の領域と正確にハ
イブリダイゼーシヨンし、IFN−β部分とはハイブリダ
イゼーシヨンしないことが分つた。
列を有しなかつた。それらは、それぞれ完成蛋白質をコ
ードする約60ニユクレオチド領域を欠如する。３′末端
において、P1F12は完全で、P2H10はさらに、ポリ（Ａ）
+RNA由来のポリ（dA）を含む、IFN−β cDNAの３′領域
全体を含有する。しかし、P2H10はさらに著しく伸びる
（1400塩基対）。つまりポリ（dA）より３′に、オリゴ
（dC）配列の部分があり、ついで、由来の分からない配
列がある。P2H10のこの追加領域の種々のフラグメント
のDNA配列を分析してみると、それらは、IFN−β遺伝子
と相同でない。さらに、クローンP2H10とクロス−ハイ
ブリダイゼイシヨンするクローンP1C12およびE52E1（例
Ｆ記載）は、P2H10のそのような追加の領域と正確にハ
イブリダイゼーシヨンし、IFN−β部分とはハイブリダ
イゼーシヨンしないことが分つた。
例Ｊ IFN−α−型クローンP1A6の分析 クローンP1A6は、12-14Sの領域（例Ｇ記載）でウイルス
−誘導Namalwa RNAとハイブリダイゼーシヨンする。そ
れは、約900塩基対のcDNA挿入物を含有し、制限分析の
示すように、酵素Bam HI、Ba1 II、Eco RI、Hin d II
I、Pst IおよびPvu IIに対する切れ目を有しない（第６
図をみよ）。
−誘導Namalwa RNAとハイブリダイゼーシヨンする。そ
れは、約900塩基対のcDNA挿入物を含有し、制限分析の
示すように、酵素Bam HI、Ba1 II、Eco RI、Hin d II
I、Pst IおよびPvu IIに対する切れ目を有しない（第６
図をみよ）。
クローンP1A6がIFN−α配列を有することの証明は、ふ
たたび、DNA配列分析で与えられた。P1A6のcDNA挿入物
の配列は、挿入物に隣接するPst I切れ目より内部に向
けて決定され、Goeddel等の記載したIFN−α配列と比較
された（Nature290、20-26（1981））。クローンP1A6は
LeIFN Cの変種であるが、49塩基対短かいことが分つ
た。P1A6の３′末端でのポリ（Ａ）配列の存在は、クロ
ーンP1A6が、報告されているクローンLeIFN Cより短か
いmRNAに由来することを示す。LeIFN C蛋白質をコード
する領域の全体が存在する。
たたび、DNA配列分析で与えられた。P1A6のcDNA挿入物
の配列は、挿入物に隣接するPst I切れ目より内部に向
けて決定され、Goeddel等の記載したIFN−α配列と比較
された（Nature290、20-26（1981））。クローンP1A6は
LeIFN Cの変種であるが、49塩基対短かいことが分つ
た。P1A6の３′末端でのポリ（Ａ）配列の存在は、クロ
ーンP1A6が、報告されているクローンLeIFN Cより短か
いmRNAに由来することを示す。LeIFN C蛋白質をコード
する領域の全体が存在する。
例Ｋ 別のIFN−α−型クローン（1F7）の同定および分析 クローンP1A6は、190個のトリデカニユクレオチド陽性
クローンより同定されたただひとつのIFN−α−型クロ
ーンであつた（例Ｅをみよ）。さらにIFN−α−型クロ
ーンを見出だすために、もとのcDNAクローンバンク（例
Ｃ）よりの1800個のクローンを、コロニーハイブリダイ
ゼーシヨン（例Ｆ記載）によりクローンP1A6のcDNAとハ
イブリダイゼーシヨンさせた。もうひとつのIFN−αク
ローン（クローン1F7）はこのように見出だされた。1F7
のcDNA挿入物の制限分析および部分的DNA配列の決定
は、1F7がクローン型LeIFN A（Goeddel等、上記引用文
献）の変型であるが、175塩基対長いことを示した。LeI
FN Aと同様に、1F7は、酵素Bg1 IIおよびPvu IIのそれ
ぞれに対して２個の切断点を有し（第６図）；挿入物の
５′および３′末端に見出だされるDNA配列は第８図に
示してある。
クローンより同定されたただひとつのIFN−α−型クロ
ーンであつた（例Ｅをみよ）。さらにIFN−α−型クロ
ーンを見出だすために、もとのcDNAクローンバンク（例
Ｃ）よりの1800個のクローンを、コロニーハイブリダイ
ゼーシヨン（例Ｆ記載）によりクローンP1A6のcDNAとハ
イブリダイゼーシヨンさせた。もうひとつのIFN−αク
ローン（クローン1F7）はこのように見出だされた。1F7
のcDNA挿入物の制限分析および部分的DNA配列の決定
は、1F7がクローン型LeIFN A（Goeddel等、上記引用文
献）の変型であるが、175塩基対長いことを示した。LeI
FN Aと同様に、1F7は、酵素Bg1 IIおよびPvu IIのそれ
ぞれに対して２個の切断点を有し（第６図）；挿入物の
５′および３′末端に見出だされるDNA配列は第８図に
示してある。
さらに、IFN−α−クローン（1F7）のDNA−配列の諸部
分は、Universal−プライマーを用い、ジデオキシ法で
分析した（Messing等、Nuc.Acid Res.9、309（1981）お
よびGardner、R.C.等、Nuc.Acid Res.9、2871（1981）
をみよ）。120から327までの位置について、つぎの部分
配列が示された。
分は、Universal−プライマーを用い、ジデオキシ法で
分析した（Messing等、Nuc.Acid Res.9、309（1981）お
よびGardner、R.C.等、Nuc.Acid Res.9、2871（1981）
をみよ）。120から327までの位置について、つぎの部分
配列が示された。
IFN−αＡ型の既知の配列（D.V.Goeddel等、Nature290.
20（1981））に比して、IFN−α−型クローン（1F7）の
新しいDNA配列は、DNA配列の120から327までの位置にお
いて、つぎの差を示す。
20（1981））に比して、IFN−α−型クローン（1F7）の
新しいDNA配列は、DNA配列の120から327までの位置にお
いて、つぎの差を示す。
つまり、137および170において、ニユクレオチドＡはニ
ユクレオチドＧに代わつている。
ユクレオチドＧに代わつている。
クローンIF7のDNA配列の残りの位置はまた、開示されて
いる標準方法（Messing等およびGafdner等の上記刊行
物）によって、通常的に決定された。これによって、IF
7は３′および５′末端にリーダー配列および非翻訳フ
ランキング配列をさらに含有する、αタイプの成熟イン
タフェロンの完全配列をコードするクローンであること
が証明された。３′末端の非コード領域はGoeddel上記
文献からのIFA-αＡに係る相当する配列よりも162bp長
い。
いる標準方法（Messing等およびGafdner等の上記刊行
物）によって、通常的に決定された。これによって、IF
7は３′および５′末端にリーダー配列および非翻訳フ
ランキング配列をさらに含有する、αタイプの成熟イン
タフェロンの完全配列をコードするクローンであること
が証明された。３′末端の非コード領域はGoeddel上記
文献からのIFA-αＡに係る相当する配列よりも162bp長
い。
したがって、公知成熟IFN-αＡの配列、クローンIF7か
ら誘導された配列、および一般的遺伝子コードから、ク
ローンIF7から得られた成熟インタフェロンのタンパク
質構造は下記のとおりである： 上記配列から明らかなように、23位にLeIFN-αＡはリジ
ンを有するのに対し、クローンIF7からのインタフェロ
ンはアルギニンを有する。さらに、34位に係り、LeIFN-
αＡはヒスチジンを有するのに対しクローンIF7から誘
導されたインタフェロン−αはアルギニンを有する。し
たがって、このクローンIF7から誘導されたインタフェ
ロンをIFN-α２（Arg）を命令した。
ら誘導された配列、および一般的遺伝子コードから、ク
ローンIF7から得られた成熟インタフェロンのタンパク
質構造は下記のとおりである： 上記配列から明らかなように、23位にLeIFN-αＡはリジ
ンを有するのに対し、クローンIF7からのインタフェロ
ンはアルギニンを有する。さらに、34位に係り、LeIFN-
αＡはヒスチジンを有するのに対しクローンIF7から誘
導されたインタフェロン−αはアルギニンを有する。し
たがって、このクローンIF7から誘導されたインタフェ
ロンをIFN-α２（Arg）を命令した。
例Ｌ ハイブリドプラスミド1F7で転換されたE.col:HB101融解
物におけるインターフエロン活性 P1A6または1F7で転換された細菌培養物の融解物につい
て、それらのなかの生物活性インターフエロン含量を調
べた。それには、細菌培養物の100mlをＬブロス中で培
養し、0.6から0.8の光学密度とし、7000r.p.m.で10分遠
心して球粒とし、50mMのトリスHcl pH8中で洗い、つい
で30mMのNaCl中で洗い、同じ緩衝液1.5ml中に最終的に
懸濁させた。1mg/mlのリゾチームと30分氷上でインキユ
ベートしたあとで、細菌の凍結融解を５度反復し40,000
r.p.m.で１時間遠心して細胞フラグメントを除いた。上
清は過して無菌とし、プラツク減少試験でインターフ
エロンを試験した。このように得られたクローン1F7の
溶融物中に約500単位/mlのインターフエロンを検出しえ
た。この試験でクローン1A6はなんらの活性を示さず、
これは恐らくプラスミドベクター中の挿入物の配向の異
なることによるのであろう。
物におけるインターフエロン活性 P1A6または1F7で転換された細菌培養物の融解物につい
て、それらのなかの生物活性インターフエロン含量を調
べた。それには、細菌培養物の100mlをＬブロス中で培
養し、0.6から0.8の光学密度とし、7000r.p.m.で10分遠
心して球粒とし、50mMのトリスHcl pH8中で洗い、つい
で30mMのNaCl中で洗い、同じ緩衝液1.5ml中に最終的に
懸濁させた。1mg/mlのリゾチームと30分氷上でインキユ
ベートしたあとで、細菌の凍結融解を５度反復し40,000
r.p.m.で１時間遠心して細胞フラグメントを除いた。上
清は過して無菌とし、プラツク減少試験でインターフ
エロンを試験した。このように得られたクローン1F7の
溶融物中に約500単位/mlのインターフエロンを検出しえ
た。この試験でクローン1A6はなんらの活性を示さず、
これは恐らくプラスミドベクター中の挿入物の配向の異
なることによるのであろう。
例Ｍ 1F7によりコードされる型のインターフエロンの発現の
改良 遺伝子をよく発現するためには、DNAについて３つの条
件をみたさねばならない。第１に、遺伝子の前にプロモ
ーター（RNA−ポリメラーゼの結合場所）が存在せねば
ならない。第２に、翻訳の開始コドンの前方において読
まれるRNAはリボゾーム結合配列（RBS）を担わねばなら
ない。第３に、RBSと開始コドンとのあいだの距離は適
当とせねばならない。
改良 遺伝子をよく発現するためには、DNAについて３つの条
件をみたさねばならない。第１に、遺伝子の前にプロモ
ーター（RNA−ポリメラーゼの結合場所）が存在せねば
ならない。第２に、翻訳の開始コドンの前方において読
まれるRNAはリボゾーム結合配列（RBS）を担わねばなら
ない。第３に、RBSと開始コドンとのあいだの距離は適
当とせねばならない。
1F7によりコードされるインターフエロンを発現するた
めに用いたプロモーター配列は、文献（Nature276、684
-689（1978））記載のSerratia marcescensのトリプト
フアンオペロンのプロモーターとした。そして用いたAB
Sは、文献（Proc.Natl.Acad.Sci.USA78、5543-5548（19
81））記載のDNA配列である。RBSと1F7の開始コドンの
至適距離を定めるために、つぎの工夫をした。二本鎖DN
Aに特異的のエキソニユクレアーゼBAL31で1F7-cDNAを短
時間消化し、種々の長さの分子の混合物とした。ついで
これらの分子は、合成リンカー配列を用い適当な方法で
連結させて“発現プラスミド”、つまりプロモーターお
よびRBSの両方を含有するプラスミドとした。E.col:HB
101をこれらのプラスミドを用いて転換し、転換物のそ
れぞれについてインターフエロン生産をみた。
めに用いたプロモーター配列は、文献（Nature276、684
-689（1978））記載のSerratia marcescensのトリプト
フアンオペロンのプロモーターとした。そして用いたAB
Sは、文献（Proc.Natl.Acad.Sci.USA78、5543-5548（19
81））記載のDNA配列である。RBSと1F7の開始コドンの
至適距離を定めるために、つぎの工夫をした。二本鎖DN
Aに特異的のエキソニユクレアーゼBAL31で1F7-cDNAを短
時間消化し、種々の長さの分子の混合物とした。ついで
これらの分子は、合成リンカー配列を用い適当な方法で
連結させて“発現プラスミド”、つまりプロモーターお
よびRBSの両方を含有するプラスミドとした。E.col:HB
101をこれらのプラスミドを用いて転換し、転換物のそ
れぞれについてインターフエロン生産をみた。
詳細には、試験はつぎのように実施した。0.5から１μ
ｇの1F7挿入物を、20mMトリスHcl.pH8.1、0.6MのNaCl、
12mMのMgCl2、12mMのCaCl2および1mMのEDTAの100μｌ中
で30℃で３分間、0.5単位のBAL31（Bethesda Research
Laboratories）とインキユベートした。ついで、300μ
ｌの15mMのEDTA、pH7.8を加えて反応を止め、反応混合
物を65℃で10分加熱し、フエノールおよびエーテル抽出
し、エタノールで沈殿させた。沈殿は、70mMトリスHC
l、pH7.5、7mMのMgCl2、1mMのDTT、0.4mMのATPの10μｌ
中に取り30から60pモルのリン酸化Hind IIIリンカー（B
ethesda Research Laboratories）を加え、0.5から１単
位のT4リガーゼ（Bethesda Research Laboratories）と
共に14℃で１夜インキユベートした。65℃に10分加熱し
て反応を止め2MのNH4アセテートを加え、インターフエ
ロン遺伝子より非連結リンカーを除くために0.6容量の
イソプロパノールで沈殿させた。沈殿は、33mMのトリス
アセテート、pH7.9、66mMのカリウムアセテート、10mM
のマグネシウムアセテートおよび100μg/mlのBSAの30か
ら50μｌに溶解し、30から50単位のHin d IIIで２から
３時間消化した。65℃に10分加熱して反応を止め2Mの酢
酸アンモニアを加えたあとで、0.6容量のイソプロパノ
ールでインターフエロン遺伝子を沈殿させた。沈殿は70
mMのトリスHCl、pH7.5、7mMのMgCl2、1mのDTTおよび0.5
mのATPの10μｌ中に溶解し、Hin d III−直線化、ホス
フアターゼ処理発現プラスミドpER103の0.2μｇと、10
-2単位のT4リガーゼを用いて14℃で１夜処理した。pER1
03は、S.marces censのトリプトフアンオペロンのプロ
モーター配列および上記の文献より知られるRBSを含有
する。pBR322誘導体である。これは、RBSの付近でHin d
IIIを用いて直線状となしうる。このように得られたプ
ラスミドはE.col:HB101の転換に用い、個々の転換物の
インターフエロン生産は、例Ｌ記載と同様にして調べ
た。自発的発現に比して、インターフエロンの発現は約
104倍となつた。
ｇの1F7挿入物を、20mMトリスHcl.pH8.1、0.6MのNaCl、
12mMのMgCl2、12mMのCaCl2および1mMのEDTAの100μｌ中
で30℃で３分間、0.5単位のBAL31（Bethesda Research
Laboratories）とインキユベートした。ついで、300μ
ｌの15mMのEDTA、pH7.8を加えて反応を止め、反応混合
物を65℃で10分加熱し、フエノールおよびエーテル抽出
し、エタノールで沈殿させた。沈殿は、70mMトリスHC
l、pH7.5、7mMのMgCl2、1mMのDTT、0.4mMのATPの10μｌ
中に取り30から60pモルのリン酸化Hind IIIリンカー（B
ethesda Research Laboratories）を加え、0.5から１単
位のT4リガーゼ（Bethesda Research Laboratories）と
共に14℃で１夜インキユベートした。65℃に10分加熱し
て反応を止め2MのNH4アセテートを加え、インターフエ
ロン遺伝子より非連結リンカーを除くために0.6容量の
イソプロパノールで沈殿させた。沈殿は、33mMのトリス
アセテート、pH7.9、66mMのカリウムアセテート、10mM
のマグネシウムアセテートおよび100μg/mlのBSAの30か
ら50μｌに溶解し、30から50単位のHin d IIIで２から
３時間消化した。65℃に10分加熱して反応を止め2Mの酢
酸アンモニアを加えたあとで、0.6容量のイソプロパノ
ールでインターフエロン遺伝子を沈殿させた。沈殿は70
mMのトリスHCl、pH7.5、7mMのMgCl2、1mのDTTおよび0.5
mのATPの10μｌ中に溶解し、Hin d III−直線化、ホス
フアターゼ処理発現プラスミドpER103の0.2μｇと、10
-2単位のT4リガーゼを用いて14℃で１夜処理した。pER1
03は、S.marces censのトリプトフアンオペロンのプロ
モーター配列および上記の文献より知られるRBSを含有
する。pBR322誘導体である。これは、RBSの付近でHin d
IIIを用いて直線状となしうる。このように得られたプ
ラスミドはE.col:HB101の転換に用い、個々の転換物の
インターフエロン生産は、例Ｌ記載と同様にして調べ
た。自発的発現に比して、インターフエロンの発現は約
104倍となつた。
上記した性質は、本発明により製造されるリコンビナン
DNA−分子が、α−またはβ−インターフエロンをコー
ドする配列を含有することを示す。本発明に準じ得られ
るプラスミドのうちのひとつは、インターフエーロンα
を発現することが示されている。
DNA−分子が、α−またはβ−インターフエロンをコー
ドする配列を含有することを示す。本発明に準じ得られ
るプラスミドのうちのひとつは、インターフエーロンα
を発現することが示されている。
つぎに示す微生物およびリコンビナトDNA分子は、1982
年５月17日に“Deutsche Sammlung von MiRro-Organism
en、Grisebachstrasse 8、3400 Gottingen"に寄託さ
れ、つぎのDSM番号を受けている。
年５月17日に“Deutsche Sammlung von MiRro-Organism
en、Grisebachstrasse 8、3400 Gottingen"に寄託さ
れ、つぎのDSM番号を受けている。
2362（1F7）、2363（P1A6）、2364（P1F12）および2365
（P2H10） これらはBudapest協約により入手しうる。
（P2H10） これらはBudapest協約により入手しうる。
使用用語および略称 （ｄ）A:（デオキシアデノシン） 抗血清：抗体含有血清 ATP:アデノシン三リン酸 オートラジオグラフ法：放射活性検出のための写真法 塩基対:2個の相補的ニユクレオチド、たとへばＡ−Ｔ、
Ｇ−Ｃ 平滑末端：一本鎖がはみ出している末端と区別して、二
本鎖DNA分子の完全に塩基対となつている末端 BSA:牛血清アルブミン （ｄ）C:（デオキシ）シチジン cDNA:RBSに相補的のDNA cDNAプール：種々の配列のcDNAの混合物 コードする：ある物についての情報を担うこと;DNAは、
蛋白質のアミノ酸配列についての情報をニユクレオチド
配列中に担う。
Ｇ−Ｃ 平滑末端：一本鎖がはみ出している末端と区別して、二
本鎖DNA分子の完全に塩基対となつている末端 BSA:牛血清アルブミン （ｄ）C:（デオキシ）シチジン cDNA:RBSに相補的のDNA cDNAプール：種々の配列のcDNAの混合物 コードする：ある物についての情報を担うこと;DNAは、
蛋白質のアミノ酸配列についての情報をニユクレオチド
配列中に担う。
DMSO:ジメチルスルホキサイド DNA:デオキシリボ核酸 DNA配列：ホスホジエステル結合で連結されたニユクレ
オチドの直鎖状配列 DTT:ジチオスレイトール EDTA:エチレンジニトロテトロ酢酸 電気泳動：電場中、分子の大きさにより（DNAまたはRN
S）分子を分けること 発現：遺伝子の情報を転写によりmRNAに、ついで翻訳に
よりポリペプチド（蛋白質）に変換すること フイルターハイブリダイゼーシヨン：ひとつのパートナ
ーをフイルターに固定しておいて、核酸をハイブリダイ
ゼーシヨンすること （ｄ）G:（デオキシ）グアノシン 遺伝子（ジーン）：ひきつづき蛋白質に翻訳されうる特
異的転写（RNA分子）に対する情報を荷うDNAフラグメン
ト 遺伝子族：きわめて類似した生成物（サブ−タイプ）を
コードする遺伝子の一族 遺伝子生成物:RNA（転写生成物）：蛋白質（翻訳生成
物） 勾配：シクロース勾配をみよ 相同性（DNA配列の）：類似したニユクレオチド配列を
示するDNA配列のあいだの関係 ハイブリド：少なくとも部分的に相補的のDNAの２つの
鎖の安定な複合物 ハイブリダイゼーシヨン（核酸の）：相互に相補的のDN
AまたはRNAの個々の鎖のあいだの安定な複合物の形成 ハイブリダイゼーシヨン標品：相補的な配列を発見する
ために用いられる放射ラベル核酸 ハイブリドプラスミド：外来性DNAフラグメントを含有
するプラスミド I:イノシン IFN−α：白血球インターフエロン IFN−β：繊維芽インターフエロン IFN−γ：免疫インターフエロン インビトロ−：試験管内 誘導（インターフエロン生産の）：誘導物質（ウイル
ス、二本鎖RNA）マイトジエン処理により、細胞がイン
ターフエロンを生産するように刺激すること 開始コドン:mRNA上にあり、翻訳の開始を信号するAUG配
列 開始複合体:cDNA合成を開始させる、逆転写酵素とmRNA
とプライマーとの組合せ 挿入物、cDNA挿入物：ハイブリドプラスミド中に見出だ
される外来性DNAのフラグメント（つまりcDNA） クローン:1個だけの細菌に由来する細菌コロニークロー
ンバンク、cDNA クローンバンク:cDNA挿入物を有するハイブリドプラス
ミドを、すべてが含有する細菌クローンのコレクシヨン クローニング：クローンの生産；ふつうハイブドプラス
ミドを含有するクローンの生産の意味にとられている コロニーハイブリダイゼーシヨン：フイルターに補足し
た変性細菌コロニーを用いるハイブリダイゼーシヨン 相補性：相互に適合すること（DNA中のニユクレオチド
で:AはＴに相補性、ＧはＣに相補性） クロス−ハイブリダイゼーシヨン：同じではないが相同
のDNA配列のあいだのハイブリドダイゼーシヨン リゲーシヨン：酵素リガーゼによるDNA配列の共有結合
による凍結 ミクロタイタープレート:1−12およびＡ−Ｚの座標を特
徴とする96のくぼみを含有するプレート マイトジエン：細胞の核分裂（細胞分裂）を促進する物
質 分子クローニング：クローニングをみよ mRNA:メツセンジヤーRNA、蛋白質をコードするRNA 中和：抗体を用いる抗原の不活化 dNTP:dATP、dTTP、dCTGおよびdGTPの４種ニユクレオチ
ドの混合物 ニユクレオチド:DNAまたはRNAの構成単位：（ｄ）Ａ、
（ｄ）Ｃ、（ｄ）Ｇ、（ｄ）Ｔ オリゴニユクレオチド：ホスホジエステル結合で相互に
凍結された数個のニユクレオチド オリゴ（Ｃ）：ホスホジエステル結合で凍結されたＣ残
基のオリゴマー オリゴ（dT）：ホスホジエスエル結合で凍結されたdT残
基のオリゴマー オリゴ（dT）セルロース：ポリ（Ａ）+RNAのクロマトグ
ラフイーのためにセルロースに結合されたオリゴ（dT）
残基 PIPES:ピペラジン−N,N′−ビス（２−エタンスルホン
酸） プラスミド：自動的に増殖する、環状の、染色体外にあ
る細菌性DNA ポリ（Ａ）または（dA）：ホスホジエステル結合で連結
された、ＡまたはdA残基の重合体 ポリ（Ａ）+RNA:核酸配列の３′末端にホモ重合体性の
ポリ（Ａ）の領域を有するmRNA ポリ（Ｃ）または（dC）：ホスホジエステル結合で連結
されたＣまたはdC残基の重合体 ポリ（Ｉ）：ホスホジエステル結合で連結されたＩ残基
の重合体 ポリ（Ｉ）：ポリ（Ｃ）：鎖がポリ（Ｉ）およびポリ
（Ｃ）である二本鎖核酸 ポリ（Ｕ）：ホスホジエステル結合で結合されたＵ残基
の重合体 プライマー:cDNA合成が始まる、RNA分子の部分に対して
相補的のオリゴニユクレオチド 標品：ハイブリダイゼーシヨン標品 プロモーター:RNAポリメラーゼが結合するDNAの配列 RBS:リボゾーム結合配列をみよ リコンビナントDNA:インビトローで相互に結合された、
種々の由来のDNAフラグメントより成立つDNA配列 複製（DNAの）:DNA分子の複製 制限分析：制限エンドニユクレアーゼにより生ずる切れ
目に関連するDNA分子のマツピング（mapping） 制限エンドニユクレアーゼ：あるDNA配列の部分でDNA二
本鎖を切断する酵素 制限マツピング：制限分析をみよ 逆転写:RNA分子をマトリツクスとしそしてオリゴニユク
レオチドをプライマーとするcDNAコピーの製造 リボゾーム結合配列：リボゾームに結合しうるmRNAの部
分 RNA:リボ核酸 RNAポリメラーゼ:DNAに相補性のRNAの一本鎖を合成しう
る酵素 スクロース勾配：（RNA）分子の混合物をそれらの大き
さに従つて分割する手段 SDS:ナトリウムドデシルスルフエート スクリーニング：特定の性質を求めて調べてゆくこと 配列の複雑さ：特定量のDNA中の実的に異なるDNA配列の
数を示す値 サブ−タイプ：遺伝子族をみよ （ｄ）T:（デオキシ）チミジン 形質転換菌：形質転換により外来性DNAを受け入れた細
菌 形質転換：外来性DNAを細菌に導入すること 転写:mRNAをそれに相補性のDNA配列でコピーすること 翻訳:mRNAの情報をポリペプチド（翻訳生成物）に変換
すること トリデカニユクレオチド:13個の成分を有するオリゴニ
ユクレオチド トリデカニユクレオチドポジテイブ：トリデカニユクレ
オチドでハイブリダイゼーシヨンすること トリス：トリスヒドロキシメチルアミノメタン U:ウリジン ベクター：外来性DNAを細菌中に加えるためのビヒク
ル、ふつうはプラスミド ベクターハイブリド：ハイブリドプラスミドをみよ
オチドの直鎖状配列 DTT:ジチオスレイトール EDTA:エチレンジニトロテトロ酢酸 電気泳動：電場中、分子の大きさにより（DNAまたはRN
S）分子を分けること 発現：遺伝子の情報を転写によりmRNAに、ついで翻訳に
よりポリペプチド（蛋白質）に変換すること フイルターハイブリダイゼーシヨン：ひとつのパートナ
ーをフイルターに固定しておいて、核酸をハイブリダイ
ゼーシヨンすること （ｄ）G:（デオキシ）グアノシン 遺伝子（ジーン）：ひきつづき蛋白質に翻訳されうる特
異的転写（RNA分子）に対する情報を荷うDNAフラグメン
ト 遺伝子族：きわめて類似した生成物（サブ−タイプ）を
コードする遺伝子の一族 遺伝子生成物:RNA（転写生成物）：蛋白質（翻訳生成
物） 勾配：シクロース勾配をみよ 相同性（DNA配列の）：類似したニユクレオチド配列を
示するDNA配列のあいだの関係 ハイブリド：少なくとも部分的に相補的のDNAの２つの
鎖の安定な複合物 ハイブリダイゼーシヨン（核酸の）：相互に相補的のDN
AまたはRNAの個々の鎖のあいだの安定な複合物の形成 ハイブリダイゼーシヨン標品：相補的な配列を発見する
ために用いられる放射ラベル核酸 ハイブリドプラスミド：外来性DNAフラグメントを含有
するプラスミド I:イノシン IFN−α：白血球インターフエロン IFN−β：繊維芽インターフエロン IFN−γ：免疫インターフエロン インビトロ−：試験管内 誘導（インターフエロン生産の）：誘導物質（ウイル
ス、二本鎖RNA）マイトジエン処理により、細胞がイン
ターフエロンを生産するように刺激すること 開始コドン:mRNA上にあり、翻訳の開始を信号するAUG配
列 開始複合体:cDNA合成を開始させる、逆転写酵素とmRNA
とプライマーとの組合せ 挿入物、cDNA挿入物：ハイブリドプラスミド中に見出だ
される外来性DNAのフラグメント（つまりcDNA） クローン:1個だけの細菌に由来する細菌コロニークロー
ンバンク、cDNA クローンバンク:cDNA挿入物を有するハイブリドプラス
ミドを、すべてが含有する細菌クローンのコレクシヨン クローニング：クローンの生産；ふつうハイブドプラス
ミドを含有するクローンの生産の意味にとられている コロニーハイブリダイゼーシヨン：フイルターに補足し
た変性細菌コロニーを用いるハイブリダイゼーシヨン 相補性：相互に適合すること（DNA中のニユクレオチド
で:AはＴに相補性、ＧはＣに相補性） クロス−ハイブリダイゼーシヨン：同じではないが相同
のDNA配列のあいだのハイブリドダイゼーシヨン リゲーシヨン：酵素リガーゼによるDNA配列の共有結合
による凍結 ミクロタイタープレート:1−12およびＡ−Ｚの座標を特
徴とする96のくぼみを含有するプレート マイトジエン：細胞の核分裂（細胞分裂）を促進する物
質 分子クローニング：クローニングをみよ mRNA:メツセンジヤーRNA、蛋白質をコードするRNA 中和：抗体を用いる抗原の不活化 dNTP:dATP、dTTP、dCTGおよびdGTPの４種ニユクレオチ
ドの混合物 ニユクレオチド:DNAまたはRNAの構成単位：（ｄ）Ａ、
（ｄ）Ｃ、（ｄ）Ｇ、（ｄ）Ｔ オリゴニユクレオチド：ホスホジエステル結合で相互に
凍結された数個のニユクレオチド オリゴ（Ｃ）：ホスホジエステル結合で凍結されたＣ残
基のオリゴマー オリゴ（dT）：ホスホジエスエル結合で凍結されたdT残
基のオリゴマー オリゴ（dT）セルロース：ポリ（Ａ）+RNAのクロマトグ
ラフイーのためにセルロースに結合されたオリゴ（dT）
残基 PIPES:ピペラジン−N,N′−ビス（２−エタンスルホン
酸） プラスミド：自動的に増殖する、環状の、染色体外にあ
る細菌性DNA ポリ（Ａ）または（dA）：ホスホジエステル結合で連結
された、ＡまたはdA残基の重合体 ポリ（Ａ）+RNA:核酸配列の３′末端にホモ重合体性の
ポリ（Ａ）の領域を有するmRNA ポリ（Ｃ）または（dC）：ホスホジエステル結合で連結
されたＣまたはdC残基の重合体 ポリ（Ｉ）：ホスホジエステル結合で連結されたＩ残基
の重合体 ポリ（Ｉ）：ポリ（Ｃ）：鎖がポリ（Ｉ）およびポリ
（Ｃ）である二本鎖核酸 ポリ（Ｕ）：ホスホジエステル結合で結合されたＵ残基
の重合体 プライマー:cDNA合成が始まる、RNA分子の部分に対して
相補的のオリゴニユクレオチド 標品：ハイブリダイゼーシヨン標品 プロモーター:RNAポリメラーゼが結合するDNAの配列 RBS:リボゾーム結合配列をみよ リコンビナントDNA:インビトローで相互に結合された、
種々の由来のDNAフラグメントより成立つDNA配列 複製（DNAの）:DNA分子の複製 制限分析：制限エンドニユクレアーゼにより生ずる切れ
目に関連するDNA分子のマツピング（mapping） 制限エンドニユクレアーゼ：あるDNA配列の部分でDNA二
本鎖を切断する酵素 制限マツピング：制限分析をみよ 逆転写:RNA分子をマトリツクスとしそしてオリゴニユク
レオチドをプライマーとするcDNAコピーの製造 リボゾーム結合配列：リボゾームに結合しうるmRNAの部
分 RNA:リボ核酸 RNAポリメラーゼ:DNAに相補性のRNAの一本鎖を合成しう
る酵素 スクロース勾配：（RNA）分子の混合物をそれらの大き
さに従つて分割する手段 SDS:ナトリウムドデシルスルフエート スクリーニング：特定の性質を求めて調べてゆくこと 配列の複雑さ：特定量のDNA中の実的に異なるDNA配列の
数を示す値 サブ−タイプ：遺伝子族をみよ （ｄ）T:（デオキシ）チミジン 形質転換菌：形質転換により外来性DNAを受け入れた細
菌 形質転換：外来性DNAを細菌に導入すること 転写:mRNAをそれに相補性のDNA配列でコピーすること 翻訳:mRNAの情報をポリペプチド（翻訳生成物）に変換
すること トリデカニユクレオチド:13個の成分を有するオリゴニ
ユクレオチド トリデカニユクレオチドポジテイブ：トリデカニユクレ
オチドでハイブリダイゼーシヨンすること トリス：トリスヒドロキシメチルアミノメタン U:ウリジン ベクター：外来性DNAを細菌中に加えるためのビヒク
ル、ふつうはプラスミド ベクターハイブリド：ハイブリドプラスミドをみよ
第１図は、cDNAクローンバンク製造の模式図である。 第２図は、特異的トリデカニユクレオチドプライマーを
用いることにより、IFN−αおよびIFN−β−特異的DNA
配列をより高濃度とされたハイブリダイゼーシヨン標品
としてのcDNAの調製を模式的に示す。 第３図は、クローンバンクを、Namalwa細胞からのトリ
デカニユクレオチド−開始cDNAとコロニーハイブリダイ
ゼーシヨンさせた結果を示す。図は、1536個の異なるク
ローンを担う、ニトロセルローズフイルターのオートラ
ジオグラフイーを示す。矢印は、トリデカニユクレオチ
ド陽性クローンの例を示す。 第４図は、２つのトリデカニユクレオチド陽性クローン
（クローンP1H1およびP2H10）と、190個のトリデカニユ
クレオチド陽性クローンのすべて（ミクロタイタープレ
ートP1およびP2）および対照としてのランダムに選ばれ
たミクロタイタープレート（E52）との、コロニーハイ
ブリダイゼーシヨン反応を示す。 第５図は、誘導および非誘導Namalwa細胞よりのポリ
（Ａ）+RNAといくつかのプラスミドとのフイルターハイ
ブリダイゼーシヨンのオートラジオグラフイーを示す。 ウイルス誘導ポリ（Ａ）+RNA（各対の左側カラムの
“i"）および非誘導Namalwa細胞よりのポリ（Ａ）+RNA
（各対の右側カラム中の“n"）は、電気泳動で分子サイ
ズに従つて分けてからニトロセルロースフイルター上に
移し、ついで、フイルターと放射ラベルプラスミドDNA
とをハイブリダイゼーシヨンさせ、オートラジオグラフ
イーをとつた。 第６図は、本発明に準ずるリコンビナントDNA分子の４
個のDNA挿入物の制限マツプの比較を模式的に示す。プ
ラスミドP1F12およびP2H10のDNA挿入物は、IFN−β DNA
制限パターンと相同であることが示され、プラスミドP1
A6および1F7のDNA挿入物は、IFN−α DNAの２つの異な
るサブタイプと相同性を示す。 第７図は、IFN−β DNA特異性を示す２つのクローン
（クローンP1F12およびP2H10）で同じニユクレオチド配
列の部分を示す。 第８図は、IFN−α−DNA特異性を示す２つの挿入物（ク
ローンP1A6および1F7）の３′および５′末端セグメン
トのニユクレオチド配列を示す。下線を付した配列ATG
は翻訳のための開始コドンである。
用いることにより、IFN−αおよびIFN−β−特異的DNA
配列をより高濃度とされたハイブリダイゼーシヨン標品
としてのcDNAの調製を模式的に示す。 第３図は、クローンバンクを、Namalwa細胞からのトリ
デカニユクレオチド−開始cDNAとコロニーハイブリダイ
ゼーシヨンさせた結果を示す。図は、1536個の異なるク
ローンを担う、ニトロセルローズフイルターのオートラ
ジオグラフイーを示す。矢印は、トリデカニユクレオチ
ド陽性クローンの例を示す。 第４図は、２つのトリデカニユクレオチド陽性クローン
（クローンP1H1およびP2H10）と、190個のトリデカニユ
クレオチド陽性クローンのすべて（ミクロタイタープレ
ートP1およびP2）および対照としてのランダムに選ばれ
たミクロタイタープレート（E52）との、コロニーハイ
ブリダイゼーシヨン反応を示す。 第５図は、誘導および非誘導Namalwa細胞よりのポリ
（Ａ）+RNAといくつかのプラスミドとのフイルターハイ
ブリダイゼーシヨンのオートラジオグラフイーを示す。 ウイルス誘導ポリ（Ａ）+RNA（各対の左側カラムの
“i"）および非誘導Namalwa細胞よりのポリ（Ａ）+RNA
（各対の右側カラム中の“n"）は、電気泳動で分子サイ
ズに従つて分けてからニトロセルロースフイルター上に
移し、ついで、フイルターと放射ラベルプラスミドDNA
とをハイブリダイゼーシヨンさせ、オートラジオグラフ
イーをとつた。 第６図は、本発明に準ずるリコンビナントDNA分子の４
個のDNA挿入物の制限マツプの比較を模式的に示す。プ
ラスミドP1F12およびP2H10のDNA挿入物は、IFN−β DNA
制限パターンと相同であることが示され、プラスミドP1
A6および1F7のDNA挿入物は、IFN−α DNAの２つの異な
るサブタイプと相同性を示す。 第７図は、IFN−β DNA特異性を示す２つのクローン
（クローンP1F12およびP2H10）で同じニユクレオチド配
列の部分を示す。 第８図は、IFN−α−DNA特異性を示す２つの挿入物（ク
ローンP1A6および1F7）の３′および５′末端セグメン
トのニユクレオチド配列を示す。下線を付した配列ATG
は翻訳のための開始コドンである。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｒ 1:19） (72)発明者 ギユンタ−・アドルフ オ−ストリア国ウイ−ン・ヨハナガツセ20 −７ (72)発明者 ペ−タ−・マインドル オ−ストリア国ウイ−ン・ホツケガツセ63 −１ (72)発明者 ゲルハルト・ボドウ オ−ストリア国ウイ−ン・ベルゴフエルガ ツセ27 (72)発明者 ペ−タ−・スウエトリイ オ−ストリア国ウイ−ン・ヒエツジンガ −・ハウプトストラ−セ40ビ−−９ (56)参考文献 Ｅｕｒ．Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．, 1981〔25〕Ｐ．８−９ Ｎｕｅｌｅｉｃ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅ ｓ．，1981〔９〕Ｐ．731−741
Claims (1)
- 【請求項１】式 を有し、実質的に他の細胞物質を含まないIFN−α２（A
rg）で示されるα−インタフェロン。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE19823220116 DE3220116A1 (de) | 1982-05-28 | 1982-05-28 | Mikrobiologisch hergestellte (alpha)- und ss-interferone, dna-sequenzen, die fuer diese interferone codieren, mikroorganismen, die diese genetische information enthalten, und verfahren zu ihrer herstellung |
| DE3220116.8 | 1982-05-28 |
Related Child Applications (1)
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