JPS5925689A - 微生物により生産されるα−およびβ−インタ−フエロン - Google Patents
微生物により生産されるα−およびβ−インタ−フエロンInfo
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- C07K—PEPTIDES
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
６つの型のインターフェロン、つまり、白血球インター
フェロン（インターフこＬマー１ンα、工ＦＮ−αと略
記）、繊維芽インターフェロン（インターフェロンβ、
工ＦＮ−βと略記）お、Ｌび免疫インターフェロン（イ
ンターフェロンｒ、ＩＦＮ−γト略記）が文献に記載さ
れている（ Ｗ、 Ｂ、 Ｓｔｅｗａｒｔ ｌ［、”
Ｔｈｅ工ｎｔｅｒｆｅｒｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ ”、８ｐ
ｒｉｎｇｅｔ−ＶｅｒｌａｇＶｉｅｎｎａ ／ Ｎｅｗ
Ｙｏｒｋ 、第２版（１９８１）をみよふヒト白血球
またはヒト骨髄芽細胞はライスルで刺激すると白血球イ
ンターフェロンを生産し、ヒト繊維芽細胞はライスルま
たは適尚な核ばで誘導すると繊維芽インターフェロンを
生成し、そして、マイトジェンだとへ幻、コンカナバリ
ンで訪導したヒ）−Ｔ淋巴球は免役インターフェロンを
生成する。
フェロン（インターフこＬマー１ンα、工ＦＮ−αと略
記）、繊維芽インターフェロン（インターフェロンβ、
工ＦＮ−βと略記）お、Ｌび免疫インターフェロン（イ
ンターフェロンｒ、ＩＦＮ−γト略記）が文献に記載さ
れている（ Ｗ、 Ｂ、 Ｓｔｅｗａｒｔ ｌ［、”
Ｔｈｅ工ｎｔｅｒｆｅｒｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ ”、８ｐ
ｒｉｎｇｅｔ−ＶｅｒｌａｇＶｉｅｎｎａ ／ Ｎｅｗ
Ｙｏｒｋ 、第２版（１９８１）をみよふヒト白血球
またはヒト骨髄芽細胞はライスルで刺激すると白血球イ
ンターフェロンを生産し、ヒト繊維芽細胞はライスルま
たは適尚な核ばで誘導すると繊維芽インターフェロンを
生成し、そして、マイトジェンだとへ幻、コンカナバリ
ンで訪導したヒ）−Ｔ淋巴球は免役インターフェロンを
生成する。
ざらに、たとえはセルストレインＮ（ｊ−３７，１’１
ａｌｎ＋ｌＷａ、 ＡｋｕｂａまたはＲＰＭＩ １７８
８により代表されるよりなり一淋巴球型のヒ） １１１
胞は、ウィルスで刺激すると白血球インターフェロンお
よび繊維芽インターフェロンを同時に生産する（ Ｊｏ
ｕｒｎａｌ ｏｆ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ
３８．５ｌ−５９（１９７７））。工ＦＮ−α１およ
び工ＦＩＪ−βのの生ｆａｔ ｔの比率は誘寺条件の選
択で変えうる。
ａｌｎ＋ｌＷａ、 ＡｋｕｂａまたはＲＰＭＩ １７８
８により代表されるよりなり一淋巴球型のヒ） １１１
胞は、ウィルスで刺激すると白血球インターフェロンお
よび繊維芽インターフェロンを同時に生産する（ Ｊｏ
ｕｒｎａｌ ｏｆ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ
３８．５ｌ−５９（１９７７））。工ＦＮ−α１およ
び工ＦＩＪ−βのの生ｆａｔ ｔの比率は誘寺条件の選
択で変えうる。
々のセルストレインよりつぎり割合で工ＦＮ−αおよび
工ＦＮ−βが得られる。
工ＦＮ−βが得られる。
セルストレイン 下舵するインターフェロンに対する
特異的の自分率 工ＦＮ−ａ 工ＦＮ−β 工ＦＮα十ＩＦＮ−
βＮａｍａ１ｗａ ５２ ３４
）９８Ｎｏ−３７４０５２）９７ Ａｋｕｂａ ８５ ２７
＞９８さらに、白血球よりの工ＦＮ−α遺伝子の分子ク
ローニング（Ｎａｔｕｒｅ ２８４．３１６−３２０（
１９８０） ： Ｓ（！ｌ１ｎｃｅ ２０９．１３４３
−１３４７（１９８０）およびＩＰ−ＡＩ−０，０３２
，１３４をみよ）および骨髄芽細胞よりの工ＦＮ−α遺
伝子のクローニング（Ｎａｔｕｒｅ２８７ ４１１ ４
１６＜１９８０）、向上２９０．２Ｏ−２（Ｓ（１９８
１）およびＧＢ−Ａ−２，０７９，２９１）は、少なく
とも１０ａ！の区別しうる遺伝子より成立つ遺伝子族に
より工ＦＮ−αがコードされるという結果を与えた。こ
のことは、また、これらのＤＮＡ配列の遺伝子生成物が
、単一の均一な蛋白質を構成しないことを意味する。こ
のことは工Ｉ”Ｎ−αが類似の蛋白賀の混合物であるこ
とを意味する。これらのザブ−タイプ０１、文献中では
、１ＦＮ−α１．２．３・・・と呼称されている（ Ｎ
ａｔｕｒｅ ２８７ ＋ ４１３１−４０８（１９８０
）およびＧｅｎｅ １５ 、３７９−３９４（１９８１
））またはＬｅ工ＦＮ Ａ 、 Ｂ 、 Ｏ・・・（Ｎ
ａｔｕｒｅ ２９０．２０−２６ （１９８１） ）と
呼称格れている。
特異的の自分率 工ＦＮ−ａ 工ＦＮ−β 工ＦＮα十ＩＦＮ−
βＮａｍａ１ｗａ ５２ ３４
）９８Ｎｏ−３７４０５２）９７ Ａｋｕｂａ ８５ ２７
＞９８さらに、白血球よりの工ＦＮ−α遺伝子の分子ク
ローニング（Ｎａｔｕｒｅ ２８４．３１６−３２０（
１９８０） ： Ｓ（！ｌ１ｎｃｅ ２０９．１３４３
−１３４７（１９８０）およびＩＰ−ＡＩ−０，０３２
，１３４をみよ）および骨髄芽細胞よりの工ＦＮ−α遺
伝子のクローニング（Ｎａｔｕｒｅ２８７ ４１１ ４
１６＜１９８０）、向上２９０．２Ｏ−２（Ｓ（１９８
１）およびＧＢ−Ａ−２，０７９，２９１）は、少なく
とも１０ａ！の区別しうる遺伝子より成立つ遺伝子族に
より工ＦＮ−αがコードされるという結果を与えた。こ
のことは、また、これらのＤＮＡ配列の遺伝子生成物が
、単一の均一な蛋白質を構成しないことを意味する。こ
のことは工Ｉ”Ｎ−αが類似の蛋白賀の混合物であるこ
とを意味する。これらのザブ−タイプ０１、文献中では
、１ＦＮ−α１．２．３・・・と呼称されている（ Ｎ
ａｔｕｒｅ ２８７ ＋ ４１３１−４０８（１９８０
）およびＧｅｎｅ １５ 、３７９−３９４（１９８１
））またはＬｅ工ＦＮ Ａ 、 Ｂ 、 Ｏ・・・（Ｎ
ａｔｕｒｅ ２９０．２０−２６ （１９８１） ）と
呼称格れている。
他力、１ＦＮ−βに対しては均−ＤＮＡ配列が見出ださ
れている。このことは、ただひとつの遺伝子・が繊維芽
インターフェロンをコードし、それで、サブ−タイプは
まったく知られていない（Ｎａｔｕｒｅ２８５．５４２
−５４７（１９８０））ことｔ−意味する。
れている。このことは、ただひとつの遺伝子・が繊維芽
インターフェロンをコードし、それで、サブ−タイプは
まったく知られていない（Ｎａｔｕｒｅ２８５．５４２
−５４７（１９８０））ことｔ−意味する。
工ＦＮ−α遺伝子と１ＦＮ−β遺伝子とのあいたには、
ＩＦＮ−α遺伝子層内でおこるのと逆に、クロス−ハイ
ブリダイゼーションζ−１おこらぬが、配列は約４５％
相同である（ Ｎａｔｕｒｅ ２８５．５４７−５４９
（１９８０））。（７のうち５個の）工ＦＮ−αとして
働らく遺伝子と工ＦＮ−β逗伝子とのあいだの、完全な
相同性の存在するもっとも長い配列７ラグメントは、１
３ニユクレオテド長でめる。このトリデカニュクレオチ
ドは文献より知られでいる（ Ｆｉｕｒ、 Ｊ、Ｃｅ１
１． Ｂｉｏｌ、 ２５．８−９（１９８１））。この
トリデカニュクレオチドを含有する工’ＦＮ−Ｃ１３に
伝子はＬｅ工ＦＮｊ３，０．Ｄ。
ＩＦＮ−α遺伝子層内でおこるのと逆に、クロス−ハイ
ブリダイゼーションζ−１おこらぬが、配列は約４５％
相同である（ Ｎａｔｕｒｅ ２８５．５４７−５４９
（１９８０））。（７のうち５個の）工ＦＮ−αとして
働らく遺伝子と工ＦＮ−β逗伝子とのあいだの、完全な
相同性の存在するもっとも長い配列７ラグメントは、１
３ニユクレオテド長でめる。このトリデカニュクレオチ
ドは文献より知られでいる（ Ｆｉｕｒ、 Ｊ、Ｃｅ１
１． Ｂｉｏｌ、 ２５．８−９（１９８１））。この
トリデカニュクレオチドを含有する工’ＦＮ−Ｃ１３に
伝子はＬｅ工ＦＮｊ３，０．Ｄ。
Ｆ、Ｇでｂｃ、１３ニユクレオチドのうち１２だけがＬ
θ工ＦＮＡおよびＨＫ存在している（ Ｎａｔｕｒｅ２
９０．２ｏ−２６（１９８１）をみよ）。
θ工ＦＮＡおよびＨＫ存在している（ Ｎａｔｕｒｅ２
９０．２ｏ−２６（１９８１）をみよ）。
篤＜へきことに、わらゆる種類のりコンピナン） ＤＮ
Ａ分子を含有する、既知の方法で得られる細菌の混合物
を取り、そして、このトリデカニュクレ゛オチドを用い
るコロニーハイプリダイゼイションによｐインターフェ
ロンに対する悄′＠ヲ担う細菌を同定し、それにより、
同時操作でＩＦＮ−αおｊ’１ＩＦＮ−β配列をうるこ
とによシ、タイプαおよびタイプβのインターフェロン
のＩＡｌ製を改良しうろことが分った。
Ａ分子を含有する、既知の方法で得られる細菌の混合物
を取り、そして、このトリデカニュクレ゛オチドを用い
るコロニーハイプリダイゼイションによｐインターフェ
ロンに対する悄′＠ヲ担う細菌を同定し、それにより、
同時操作でＩＦＮ−αおｊ’１ＩＦＮ−β配列をうるこ
とによシ、タイプαおよびタイプβのインターフェロン
のＩＡｌ製を改良しうろことが分った。
本発明の目的は、常法で得られそしてタイプαまたはタ
イプβのインター１フエロンに対しての遺伝子情報を担
う微生物およびそれらの変異株を分離し、それにより、
これらのインターフェロンを生産する基本的必要条件を
提供することである。
イプβのインター１フエロンに対しての遺伝子情報を担
う微生物およびそれらの変異株を分離し、それにより、
これらのインターフェロンを生産する基本的必要条件を
提供することである。
この目的を達成するにＱユ、たとえはっきり操作を用い
うる。
うる。
たとえば５ｅｎｄａｉウイルスで肪専後、工ＦＮ−αお
よびさらに１ＦＮ−βの双方を生産する適当なセルスト
レインを選択するＯＢ−淋巴球型の適当なヒト細胞には
、たとえばＮａｍａｊｗａ ＳＮ Ｏ３７、Ａｋｕｂａ
ｉたはＲＰＭ工１７８８があるが、Ｎａｍａ ｌ ｗ
ｈ株が有利である。
よびさらに１ＦＮ−βの双方を生産する適当なセルスト
レインを選択するＯＢ−淋巴球型の適当なヒト細胞には
、たとえばＮａｍａｊｗａ ＳＮ Ｏ３７、Ａｋｕｂａ
ｉたはＲＰＭ工１７８８があるが、Ｎａｍａ ｌ ｗ
ｈ株が有利である。
選択された細ａは１．ＴＦＮ −ｍＲＮＡ合成が最大の
時、代表的には、ウィルス誘導後６から１２時＋ｉ４Ｊ
。
時、代表的には、ウィルス誘導後６から１２時＋ｉ４Ｊ
。
なるべくは９時間に適当に変性きせる。核を除いたあと
、細胞質よりのＲＮＡ ｆフェノール抽出そしてアルコ
ール沈殿で精製する。ついでポリ（ＡＪ”ＲＮＡをオリ
ゴ（ｄＴ）セルロースクロマトグラフィーで分離し、イ
ンターフェロン−特異的配列（第１図の左側カラム）に
関連して勾配遠心で磯縮する。
、細胞質よりのＲＮＡ ｆフェノール抽出そしてアルコ
ール沈殿で精製する。ついでポリ（ＡＪ”ＲＮＡをオリ
ゴ（ｄＴ）セルロースクロマトグラフィーで分離し、イ
ンターフェロン−特異的配列（第１図の左側カラム）に
関連して勾配遠心で磯縮する。
このように精製したポリ（Ａ）” ＲＮＡは、逆転写酵
素を用いての一重鎖ｃＤＮＡの製造のためのマ） ＩＪ
ラックス用いる。この−重鎖のＤＮＡに相補的の第２の
ＤＮＡ鎖は、ＤＮＡ−ポリメラーゼＩを用いて合成する
。ＣＤＮＡ−合成および相補的ＤＮＡ合成は、アデノシ
ン、チミジン、グアノシンおよびシチジンのデオキシニ
ュクレオシドトリホスフエートの混合物を含有する蓄液
中で実施した。得られる二本鎖ｃＤＮＡ混合物は、Ｓ１
ヌクレアーゼを用いて鎖の内端において変型して、それ
ぞれの鎖のはみ出ている領域を除き、少なくとも６００
塩基対を含有する二本鎖ＤＮＡ分子を勾配遠心で分ける
。得られるｃＤＮＡ混合物は、各鉋の６′末端にオリゴ
デオキシシチジンを付加することにより末端トランスフ
ェラーゼで約１５ニュクレオチド分伸ばし、リコンビナ
ント分子合成のためのひとつの成分を製造する（第１図
の左欄をみよ）。
素を用いての一重鎖ｃＤＮＡの製造のためのマ） ＩＪ
ラックス用いる。この−重鎖のＤＮＡに相補的の第２の
ＤＮＡ鎖は、ＤＮＡ−ポリメラーゼＩを用いて合成する
。ＣＤＮＡ−合成および相補的ＤＮＡ合成は、アデノシ
ン、チミジン、グアノシンおよびシチジンのデオキシニ
ュクレオシドトリホスフエートの混合物を含有する蓄液
中で実施した。得られる二本鎖ｃＤＮＡ混合物は、Ｓ１
ヌクレアーゼを用いて鎖の内端において変型して、それ
ぞれの鎖のはみ出ている領域を除き、少なくとも６００
塩基対を含有する二本鎖ＤＮＡ分子を勾配遠心で分ける
。得られるｃＤＮＡ混合物は、各鉋の６′末端にオリゴ
デオキシシチジンを付加することにより末端トランスフ
ェラーゼで約１５ニュクレオチド分伸ばし、リコンビナ
ント分子合成のためのひとつの成分を製造する（第１図
の左欄をみよ）。
第２の成分として、なるべくはＥｓｃｈθｒｉｃｈｉａ
Ｃ０１１より得られた環状二本鎖シラスミドたとえばＥ
ｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉプラスミドｐＢＲ３２
２ｔ”制限エンドニュクレアーゼＰｓｔ ｌ ｆ用いて
直線状として、ｃＤＮＡ混合物と同様にして、分子の６
′末端にオリゴデオキシグアニジンを伺）ＪＩｌｌさせ
オリゴデオキシグアニジンのはみでた木Ｑ１１ｏとする
。これらの末９′＃ｌはｃＤＮＡ分子の遊離のオリゴデ
オキシシナジン末端と女定な二本＠ ＤＮＡ領域を形成
する（第１図の右世（］のカラムをみよ）。
Ｃ０１１より得られた環状二本鎖シラスミドたとえばＥ
ｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉプラスミドｐＢＲ３２
２ｔ”制限エンドニュクレアーゼＰｓｔ ｌ ｆ用いて
直線状として、ｃＤＮＡ混合物と同様にして、分子の６
′末端にオリゴデオキシグアニジンを伺）ＪＩｌｌさせ
オリゴデオキシグアニジンのはみでた木Ｑ１１ｏとする
。これらの末９′＃ｌはｃＤＮＡ分子の遊離のオリゴデ
オキシシナジン末端と女定な二本＠ ＤＮＡ領域を形成
する（第１図の右世（］のカラムをみよ）。
たとえはｐＢＲ６２２およびｃＤムＡより得られるハイ
ブリ１プラスミドを用いて、微生物、たとえばＥｓｃｈ
ｅｒｉｏｈｉａ ｃｏｌｉ ＨＥ ｌ ［Ｊ ｌを、こ
のＤＮＡの収装および発現のおこる宿主に形質転換する
。
ブリ１プラスミドを用いて、微生物、たとえばＥｓｃｈ
ｅｒｉｏｈｉａ ｃｏｌｉ ＨＥ ｌ ［Ｊ ｌを、こ
のＤＮＡの収装および発現のおこる宿主に形質転換する
。
このように得られたクローンのうち、１ＦＮ−αまたは
ＩＦＮ−βに特異的な配列を含有するクロー−”ｆｒ
、コロニーハイプリダイセ゛−ジョンで同定スる。用い
る試験物質は、インターフェロン配列に特異的であるト
リデカニュクレオチド５’ ｄＵＵＴＴＣＴＧＧＡＡＣ
’１ｌＧ３’をプライマーとし、工ＦＮ−ｍＲＮＡ″Ｆ
ｒ：含有するＲＮＡの逆転写により合成される放射ラベ
ルｃＤＮＡである。
ＩＦＮ−βに特異的な配列を含有するクロー−”ｆｒ
、コロニーハイプリダイセ゛−ジョンで同定スる。用い
る試験物質は、インターフェロン配列に特異的であるト
リデカニュクレオチド５’ ｄＵＵＴＴＣＴＧＧＡＡＣ
’１ｌＧ３’をプライマーとし、工ＦＮ−ｍＲＮＡ″Ｆ
ｒ：含有するＲＮＡの逆転写により合成される放射ラベ
ルｃＤＮＡである。
この目的ではトリデカニュクレオテドを、なるべくは、
ｒ −３２Ｐ−ＡＴＰおよびＴ４−ポリニュクレオチド
キナーゼを用い、その末端において放射ラベルする。ラ
ベルされたトリデカニュクレオチドの過剰および５ｅｎ
ｄａｉウイルスで誘導された細胞よｐのポリ（ＡＪ”Ｒ
ＮＡを用いる逆転写反応のための開始複合物を、前記条
件で製造する（第２図をみよ）０それでこのように製造
されたｃＤＮＡは、トリデカニュクレオチドを有する、
逆転写反応のための開始複合物が生成された時のみに、
放射ラベルされる。つまり、ラベルはトリデカニュクレ
オチドのみに含まれるからである。その結果、本発明は
、このトリデカニュクレオチドに相捕的ＤＮＡ配列を有
するＤＮＡ ’ｉ認識する際の高度の選択性を保証し、
それで、α−およびβ−インターフェロン］）ＮＡ ｇ
識のための高度の選択性を保証する。用いたトリデカニ
ュクレオチドに対し相補性のＤＮＡ配列を有するバイブ
リドプラスミドを含有する、これらの転換された細菌の
コロニーはオートラジオグラフィーによシ示される（第
６図をみよ）。°このようにして、約１３，０００個の
転換された細菌コロニーより、トリデカニュクレオチド
で開始されたｃＤＮＡを有する、陽性シグナル全力えた
１９０クローンを分離した。つまり、ゾーンバンク中の
すべてのクローンの約１％が特異的配列 ｃＬＯＯＴＴｃ！ＴＧＧＡＡＯＴＧを含有する。
ｒ −３２Ｐ−ＡＴＰおよびＴ４−ポリニュクレオチド
キナーゼを用い、その末端において放射ラベルする。ラ
ベルされたトリデカニュクレオチドの過剰および５ｅｎ
ｄａｉウイルスで誘導された細胞よｐのポリ（ＡＪ”Ｒ
ＮＡを用いる逆転写反応のための開始複合物を、前記条
件で製造する（第２図をみよ）０それでこのように製造
されたｃＤＮＡは、トリデカニュクレオチドを有する、
逆転写反応のための開始複合物が生成された時のみに、
放射ラベルされる。つまり、ラベルはトリデカニュクレ
オチドのみに含まれるからである。その結果、本発明は
、このトリデカニュクレオチドに相捕的ＤＮＡ配列を有
するＤＮＡ ’ｉ認識する際の高度の選択性を保証し、
それで、α−およびβ−インターフェロン］）ＮＡ ｇ
識のための高度の選択性を保証する。用いたトリデカニ
ュクレオチドに対し相補性のＤＮＡ配列を有するバイブ
リドプラスミドを含有する、これらの転換された細菌の
コロニーはオートラジオグラフィーによシ示される（第
６図をみよ）。°このようにして、約１３，０００個の
転換された細菌コロニーより、トリデカニュクレオチド
で開始されたｃＤＮＡを有する、陽性シグナル全力えた
１９０クローンを分離した。つまり、ゾーンバンク中の
すべてのクローンの約１％が特異的配列 ｃＬＯＯＴＴｃ！ＴＧＧＡＡＯＴＧを含有する。
リコンビナントＤＮＡ分子中のインターフェロン特異的
核酸は、ＲＮＡ ）ランスファー７１イブリダイゼーシ
ヨン、ノ・イブリド分陥、制限マツピングおよび核酸配
列の決足により同定する０生成するインターフェロンポ
リペプチドの生物羊的同足は、抗ウィルス活性の測定に
より、インターフェロンの型は免役学的方法で行なう。
核酸は、ＲＮＡ ）ランスファー７１イブリダイゼーシ
ヨン、ノ・イブリド分陥、制限マツピングおよび核酸配
列の決足により同定する０生成するインターフェロンポ
リペプチドの生物羊的同足は、抗ウィルス活性の測定に
より、インターフェロンの型は免役学的方法で行なう。
このように分離されたインターフェロン遺伝子は細菌中
で発現される。しかし、酵母のような曲の生物でもよい
。さらに、リポゾーム結合配列に組合わせでプロモータ
ーを挿入すると、自発的発現の約１０４倍に達する＠現
１１区ヲうろことができる０それで、本発明によｐ、２
つの類似する群のｉＷ伝子、つまり２つの群工ＦＮ−α
およびＩＦＮ−βを１回だけの操作で分離するという本
発明の目的が達成され、そして、必要とするＲＮＡの分
離のための出発材料としてＢ−淋巴球型の細１１＠を選
びそしてハイブリダイゼーション標品として用いる、ｃ
ＤＮＡのためのプライマーとし−〔インターフェロン特
異的のオリゴニュクレオチドを用いることによｐｌそれ
ら２つの群の遺伝子がインターフェロンの生産に用いる
に適当であることを示し得た０つぎに実施例で本発明を
より詳しく説明する。
で発現される。しかし、酵母のような曲の生物でもよい
。さらに、リポゾーム結合配列に組合わせでプロモータ
ーを挿入すると、自発的発現の約１０４倍に達する＠現
１１区ヲうろことができる０それで、本発明によｐ、２
つの類似する群のｉＷ伝子、つまり２つの群工ＦＮ−α
およびＩＦＮ−βを１回だけの操作で分離するという本
発明の目的が達成され、そして、必要とするＲＮＡの分
離のための出発材料としてＢ−淋巴球型の細１１＠を選
びそしてハイブリダイゼーション標品として用いる、ｃ
ＤＮＡのためのプライマーとし−〔インターフェロン特
異的のオリゴニュクレオチドを用いることによｐｌそれ
ら２つの群の遺伝子がインターフェロンの生産に用いる
に適当であることを示し得た０つぎに実施例で本発明を
より詳しく説明する。
例 Ａ
ヒトＩｆｊ’Ｎ −ａおよびＩＦＮ−β−ｍＲＮＡを含
有する、ポリ（Ａ）＋ＲＮＡ生産のための適当なセルス
トレインの選択 文献記載の方法によりインターフェロンを生産するよう
に、５ｅｎｄａｉウイルスで、種々のヒト細胞株を誘導
した。２４から４８時間後に、ある型に特異的の抗血清
で中和し、細胞上清のＩＦＮ−αおよびＩＦＮ−β含量
を測定した。試題したセルストレインのあるものに見出
だされるＩＦＮ−α対ＩＦＮ−βの割合を前記の表に示
した。たとえば、Ｎａｍａ１ｗａ細胞が、５ｅｎｄａｉ
ウイルス誘導後たとえば５０％より多くのＩＦＮ−αを
生産し、約５０チまでのＩＦＮ−βを生産することは明
らかである。
有する、ポリ（Ａ）＋ＲＮＡ生産のための適当なセルス
トレインの選択 文献記載の方法によりインターフェロンを生産するよう
に、５ｅｎｄａｉウイルスで、種々のヒト細胞株を誘導
した。２４から４８時間後に、ある型に特異的の抗血清
で中和し、細胞上清のＩＦＮ−αおよびＩＦＮ−β含量
を測定した。試題したセルストレインのあるものに見出
だされるＩＦＮ−α対ＩＦＮ−βの割合を前記の表に示
した。たとえば、Ｎａｍａ１ｗａ細胞が、５ｅｎｄａｉ
ウイルス誘導後たとえば５０％より多くのＩＦＮ−αを
生産し、約５０チまでのＩＦＮ−βを生産することは明
らかである。
中和試験はつぎのよ５に実施しＴこ。
５ｅｎｄａｉウイルスで誘導し定細胞培養物の上清より
の約１０インターフエロン単位を、つぎの相打と３７℃
で６０から９０分インキコーベートした。
の約１０インターフエロン単位を、つぎの相打と３７℃
で６０から９０分インキコーベートした。
１、 ：［ＦＮ−αに対する抗血清；最終希釈１：
１ｏｏ；（Ｒｅ５ｅａｒｃｈ Ｒｅ５ｏｕｒｃｅｓ Ｂ
ｒａｎｃｈ 、 ＮａｔｉｏｎａｌＩｎｓｔｉｔｕｔ
ｅｓ ｏｆ Ａｌｌｅｒｇｙ ａｎｄ Ｉｎｆｅｃｔｉ
ｏｕｓＤｉｓｅａｓｅｓ 、 Ｂｅｔｈｅｓｄａ Ｍｄ
、 ＵＳＡより入手）。
１ｏｏ；（Ｒｅ５ｅａｒｃｈ Ｒｅ５ｏｕｒｃｅｓ Ｂ
ｒａｎｃｈ 、 ＮａｔｉｏｎａｌＩｎｓｔｉｔｕｔ
ｅｓ ｏｆ Ａｌｌｅｒｇｙ ａｎｄ Ｉｎｆｅｃｔｉ
ｏｕｓＤｉｓｅａｓｅｓ 、 Ｂｅｔｈｅｓｄａ Ｍｄ
、 ＵＳＡより入手）。
２、 ヒトβ−ＩＦＮに対する抗血清；最終希釈１：ろ
ＯＯ： 、（Ｄｒ、 ｙ、Ｈ，Ｔａｎ、 Ｕｎｉｖｅｒ
ｓｉｔｙ ｏｆＣａｌｇａｒｙ 、 Ｃａｎａｄａより
入手）。
ＯＯ： 、（Ｄｒ、 ｙ、Ｈ，Ｔａｎ、 Ｕｎｉｖｅｒ
ｓｉｔｙ ｏｆＣａｌｇａｒｙ 、 Ｃａｎａｄａより
入手）。
６．１および２の混合物。
インキュベーションのあと、残留インターフエ。７活性
はゾターク減少試験（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆＩｎｔｅｒ
ｆｅｒｏｎ Ｒｅ５ｅａｒｃｈ ２ 、 ｉｎ ｐｒ
ｅｐａｒａｔｉｏｎ（１９８２）をみよ）で測定した。
はゾターク減少試験（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆＩｎｔｅｒ
ｆｅｒｏｎ Ｒｅ５ｅａｒｃｈ ２ 、 ｉｎ ｐｒ
ｅｐａｒａｔｉｏｎ（１９８２）をみよ）で測定した。
例 Ｂ
Ｓｅｎｄａｉウィルスで誘導し１コＮａｍａ１ｗａ細胞
からの、ヒトＩＦＮ −ａおよびＩＦＮ−β−ｒｕＲＮ
Ａ含有ポリ（Ａ）＋ＲＮＡの調製 Ｎａｒｒ＋ａ１ｗａ細胞の培養およびＳｅ０ロｄａｔウ
イスル用いる誘導は、文献既知の方法で実施した（ Ｍ
ｅｔｈｏｄｓ ’ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏ蓄、 Ｖｏｌ、
７８Ａ＋ ６９−７５頁（１９８１） 、 Ａｃａｄｅ
ｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、 Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ ｆｌみよ）
。ｍＲＮＡ調製の時点は誘導後９時間としＴこ（６から
１２時間）。理由は、この時間をすぎるとインターフェ
ロン特異的ｍ −ＲＮＡの割合が極大になるゆえである
。
からの、ヒトＩＦＮ −ａおよびＩＦＮ−β−ｒｕＲＮ
Ａ含有ポリ（Ａ）＋ＲＮＡの調製 Ｎａｒｒ＋ａ１ｗａ細胞の培養およびＳｅ０ロｄａｔウ
イスル用いる誘導は、文献既知の方法で実施した（ Ｍ
ｅｔｈｏｄｓ ’ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏ蓄、 Ｖｏｌ、
７８Ａ＋ ６９−７５頁（１９８１） 、 Ａｃａｄｅ
ｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、 Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ ｆｌみよ）
。ｍＲＮＡ調製の時点は誘導後９時間としＴこ（６から
１２時間）。理由は、この時間をすぎるとインターフェ
ロン特異的ｍ −ＲＮＡの割合が極大になるゆえである
。
細胞は、１０００ｇで２０分遠心し、ＮＰ−４０緩衝液
（０，１４Ｍ ＮａＣ１，１，５１ＴｉＭＭｇＣ１２，
１０ｒｒ＋ＭトリスーＨＣｌ 、 ＰＨ７，４）中で１
度洗い、０．５％の非イオン性洗浄剤ＮＰ −４０（５
ｌｌｅｌｌ製） オヨヒ２ｍ９ ／ ｒｎｌのベントナ
イトを含有するＮＰ −４０緩衝液中に懸濁させた。水
浴中５分後に、上記のように遠心して細胞核を球粒とし
、細胞質（ＲＮＡ含有）分画（上清）を、フェノール−
クロロホルムで６度そしてクロロホルムで１度（２％Ｓ
ＤＳ、５ｍＭのＥＤＴＡおよび５［１ｍＭのトリス−Ｈ
Ｃｌ添加後）抽出し、ＲＮＡをアルコールで沈殿させ−
。ポリ（Ａ ）＋＋＋ａは文献既知の方法で鞘製し１．
Ｈ（Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ。
（０，１４Ｍ ＮａＣ１，１，５１ＴｉＭＭｇＣ１２，
１０ｒｒ＋ＭトリスーＨＣｌ 、 ＰＨ７，４）中で１
度洗い、０．５％の非イオン性洗浄剤ＮＰ −４０（５
ｌｌｅｌｌ製） オヨヒ２ｍ９ ／ ｒｎｌのベントナ
イトを含有するＮＰ −４０緩衝液中に懸濁させた。水
浴中５分後に、上記のように遠心して細胞核を球粒とし
、細胞質（ＲＮＡ含有）分画（上清）を、フェノール−
クロロホルムで６度そしてクロロホルムで１度（２％Ｓ
ＤＳ、５ｍＭのＥＤＴＡおよび５［１ｍＭのトリス−Ｈ
Ｃｌ添加後）抽出し、ＲＮＡをアルコールで沈殿させ−
。ポリ（Ａ ）＋＋＋ａは文献既知の方法で鞘製し１．
Ｈ（Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ。
Ａｃａｄ、 Ｓｃｉ、ＵＳＡ、 ６９． １４０８−１
４１２（１９７２））。
４１２（１９７２））。
つまり、オリゴ（ｄＴ ）セルロースクロマトグラフィ
ーに処し、１１０Ｉｎ酢酸ナトリウム緩衝液、ｐｌ（５
，５、ｌ ｍＭ ＥＤＴＡ中５−２０チスクロース勾配
中で遠心しく ２５＋００ Ｏｒ、ｐ、ｍ、で２０時間
、５ｐｉｎｃｏ ＳＷ ２７０−ター使用）分子の大ぎ
さに従って分け、大ぎさで６８（沈降単位）から１８８
までの分子を集めた（簡単のために”１２Ｓ−ＦＩＮＡ
”と称する）（第１図の左側をみよ）。
ーに処し、１１０Ｉｎ酢酸ナトリウム緩衝液、ｐｌ（５
，５、ｌ ｍＭ ＥＤＴＡ中５−２０チスクロース勾配
中で遠心しく ２５＋００ Ｏｒ、ｐ、ｍ、で２０時間
、５ｐｉｎｃｏ ＳＷ ２７０−ター使用）分子の大ぎ
さに従って分け、大ぎさで６８（沈降単位）から１８８
までの分子を集めた（簡単のために”１２Ｓ−ＦＩＮＡ
”と称する）（第１図の左側をみよ）。
インターフェロン−特異的ｍＲＮＡ （ＩＦＮ−αおよ
びＩＦＮ−β−ｍＲＮＡ ）の含量は、”１２Ｓ−ＲＮ
Ａ″Ｙ Ｘｅｎｄｐｕｓ １ａｅｖｉｓの卯細１１ｉ！
ｌにミクロ注入しく Ｊ、 Ｅｍｂｒｙｏｌ、およびＥ
ｘｐｅｒ、 Ｍｎｒｐｈ、 ２０＋ ４０１−４１４（
１９６Ｂ）をみよ）そして卵細胞上清中のインターフェ
ロン活性を測定−４−ることで定喰した。注入されｋ”
１２ Ｓ −ＲＮＡ ”の１μμは、インターフェロン
スタンダード６９／１９”；ｉもとにして、平均して、
約１ｏｏｏインターフエロン国際単位（１，Ｕ、 ）の
タイターを与えた。
びＩＦＮ−β−ｍＲＮＡ ）の含量は、”１２Ｓ−ＲＮ
Ａ″Ｙ Ｘｅｎｄｐｕｓ １ａｅｖｉｓの卯細１１ｉ！
ｌにミクロ注入しく Ｊ、 Ｅｍｂｒｙｏｌ、およびＥ
ｘｐｅｒ、 Ｍｎｒｐｈ、 ２０＋ ４０１−４１４（
１９６Ｂ）をみよ）そして卵細胞上清中のインターフェ
ロン活性を測定−４−ることで定喰した。注入されｋ”
１２ Ｓ −ＲＮＡ ”の１μμは、インターフェロン
スタンダード６９／１９”；ｉもとにして、平均して、
約１ｏｏｏインターフエロン国際単位（１，Ｕ、 ）の
タイターを与えた。
；ブし血清により中和され
５ｅｎｄａｉウイルス誘導 卵細胞上清 るインター
フェロン活Ｎａｍａ１ｗａ細胞よりの ｍｌ当たりの
性のパーセント”１２８″ポリ（Ａ）＋ インター
ン □−−−−−−−−−−−ＲＮＡの？、）
エロン単位 ＩＦＮ−αＩＦＮ−α＋ＩＦＮ−
β１μ、９ １．０００ ８０
＞９８つまり、活性の約８０％はα−型インターフェ
ロンに対する抗血清で中和されえ１こが、活性全体は抗
−αおよび抗−β−インターフェ／ロン抗血清によって
はじめて中和され得た。
フェロン活Ｎａｍａ１ｗａ細胞よりの ｍｌ当たりの
性のパーセント”１２８″ポリ（Ａ）＋ インター
ン □−−−−−−−−−−−ＲＮＡの？、）
エロン単位 ＩＦＮ−αＩＦＮ−α＋ＩＦＮ−
β１μ、９ １．０００ ８０
＞９８つまり、活性の約８０％はα−型インターフェ
ロンに対する抗血清で中和されえ１こが、活性全体は抗
−αおよび抗−β−インターフェ／ロン抗血清によって
はじめて中和され得た。
例 Ｃ
Ｎａｍａｌｗａ −ｃＤＮＡクローンパンクの調製６か
ら１８８のあいだの分子の大きさのポリ（Ａ）”ＲＮＡ
（”１２ Ｓ −ＥＮＡ″）（例Ｂをみよ）を、−末
鎖ｃ ＤＮＡ調製のためのマ） ＩＪソックス用い１こ
。
ら１８８のあいだの分子の大きさのポリ（Ａ）”ＲＮＡ
（”１２ Ｓ −ＥＮＡ″）（例Ｂをみよ）を、−末
鎖ｃ ＤＮＡ調製のためのマ） ＩＪソックス用い１こ
。
つまり５０ ｍＭのトリス−ｎｃｌ 、 ＰＩ＋ ８．
３１ １０ｎ’ｉＭのＭｇ”’２！ １００ ｍＭの
ＫＣＩ 、 １ｍＭ Ｏ） ｄＮＴＰｓ 、 ０．４
ｍＭのＤＴＴ、４１１１ＭのＮａピロホスフェート、２
０μｇ／ｍｌのオリゴ（ｄＴ）１２−１８（ＰＬ −Ｂ
ｉｂｃｈｅｍｉｃａｌｓ）。
３１ １０ｎ’ｉＭのＭｇ”’２！ １００ ｍＭの
ＫＣＩ 、 １ｍＭ Ｏ） ｄＮＴＰｓ 、 ０．４
ｍＭのＤＴＴ、４１１１ＭのＮａピロホスフェート、２
０μｇ／ｍｌのオリゴ（ｄＴ）１２−１８（ＰＬ −Ｂ
ｉｂｃｈｅｍｉｃａｌｓ）。
２５μｇ／ｍｌのアクチノマイシンＤ中、４０μ９／ｍ
１ｔＤボＩＪ （Ａ）＋ＲＮＡ ヲ、１０口単位／ ｍ
ｌのＡＭＶ逆転写酵素（Ｄｒ、Ｊ、 Ｂｅａｒｄ、 Ｌ
ｉｆｅ ＦＥｃｉｅｎｃｅｓ、 Ｉｎｃ。
１ｔＤボＩＪ （Ａ）＋ＲＮＡ ヲ、１０口単位／ ｍ
ｌのＡＭＶ逆転写酵素（Ｄｒ、Ｊ、 Ｂｅａｒｄ、 Ｌ
ｉｆｅ ＦＥｃｉｅｎｃｅｓ、 Ｉｎｃ。
１５０９ ’／２４９ ｔｈ ５ｔｒｅｅｔ、 ５ｏｕ
ｔｈ、 Ｓｔ、 Ｐｅｔｅｒｓ−ｂｕｒｇ、 Ｆ］、ｏ
ｒｌｄａ ３３７０７、ＵＳＡ ）と共に、４４−４５
°Ｃで４５分インキュベートシタ。ついで、ＲＮＡ −
ＤＮＡ バイブリドのＲＮＡ部分’ｆ ０．３ ＭのＮ
ａＯＨ中５０°Ｃで１時間インキュベートして除き、そ
のあと、−末鎖ｃＤＮＡを中和し、エタノールで沈殿さ
せた。
ｔｈ、 Ｓｔ、 Ｐｅｔｅｒｓ−ｂｕｒｇ、 Ｆ］、ｏ
ｒｌｄａ ３３７０７、ＵＳＡ ）と共に、４４−４５
°Ｃで４５分インキュベートシタ。ついで、ＲＮＡ −
ＤＮＡ バイブリドのＲＮＡ部分’ｆ ０．３ ＭのＮ
ａＯＨ中５０°Ｃで１時間インキュベートして除き、そ
のあと、−末鎖ｃＤＮＡを中和し、エタノールで沈殿さ
せた。
一本鎖ＤＮＡに相補的の第２のＤＮＡ鎖はつき゛の条件
で合成した。０．１２Ｍのリン酸カリウム緩衝液、ｐＨ
６，９１１Ｑ ｒｎＭのＭｇＣ１□、 、１０ ｍＭの
ＤＴＴ、１ｍＭのｄＮＴＰ中、５０ ｐｇ／ ｍｌの一
本鎖ＤＮＡを３００単位／ ｍｌのＤＮＡポリメラータ
ー （ＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒＭａｎｎｈｅｉｍ ）とイ
ンキュベートし、ついでフェノール抽出しエタノール沈
殿させた。
で合成した。０．１２Ｍのリン酸カリウム緩衝液、ｐＨ
６，９１１Ｑ ｒｎＭのＭｇＣ１□、 、１０ ｍＭの
ＤＴＴ、１ｍＭのｄＮＴＰ中、５０ ｐｇ／ ｍｌの一
本鎖ＤＮＡを３００単位／ ｍｌのＤＮＡポリメラータ
ー （ＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒＭａｎｎｈｅｉｍ ）とイ
ンキュベートし、ついでフェノール抽出しエタノール沈
殿させた。
このように製造した二本鎖ｃ ＤＮＡ混゛合物の鎖の両
端を変型してはみ出している一本鎖領域を除いた。その
ためには、０．３ＭのＮａ１１．３０ ｍＭの酢酸ナト
リウム、ｐＨ４，’５ ＋ １ｍλ４のＺｎＣｌ２中
で、上記のＤＮＡを、１２５０単位／ｍｌＯ’） ８１
− ＝ −Ｌ りＬ／アーゼ（Ｍｉｌｅｓ Ｌａｂｏｒ
ａｔｏｒｉｅｓ ）と、３０分３７°Ｇでインキュベー
トし、フェノール抽出し、エタノール沈殿させた。その
ようにして生成した”平滑末端化した”二本鎖ｃＤＮＡ
＆！、１０１１１Ｍの酢酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ５，
５およびｉ ｍＭＯＥＤＴＡ中、５−２０チスクロース
勾配で分けた。少なくとも６００の塩基対ケ有する分画
を分離した。
端を変型してはみ出している一本鎖領域を除いた。その
ためには、０．３ＭのＮａ１１．３０ ｍＭの酢酸ナト
リウム、ｐＨ４，’５ ＋ １ｍλ４のＺｎＣｌ２中
で、上記のＤＮＡを、１２５０単位／ｍｌＯ’） ８１
− ＝ −Ｌ りＬ／アーゼ（Ｍｉｌｅｓ Ｌａｂｏｒ
ａｔｏｒｉｅｓ ）と、３０分３７°Ｇでインキュベー
トし、フェノール抽出し、エタノール沈殿させた。その
ようにして生成した”平滑末端化した”二本鎖ｃＤＮＡ
＆！、１０１１１Ｍの酢酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ５，
５およびｉ ｍＭＯＥＤＴＡ中、５−２０チスクロース
勾配で分けた。少なくとも６００の塩基対ケ有する分画
を分離した。
このｃＤＮＡ混合物のうちの０６５μｓを、各鎖の３′
末端にオリゴデオキシシチジンを付加さすことにより約
１５ニュクレオチド分延ばした。それには、０．５μｙ
分を、１４０ｍＭのカリウム力コシレート、ｒＪｌ ６
．９ 、 ．５ ０ ｍＭ の ト リ ス − Ｈ
ＣＩ 、 Ｐｔ＋ ６．９ 、 ２ ｍＭの
Ｃ’０Ｃ１２，０，１ｍＭのＤＴＴ 、 ０．１ ｍ９
７ｍ１！ ０） ＢＳＡおよび５ ＢｍのｄＣＴＰ中、
５００単位／ ｍｌの末Ｖｊｇ ＋−ランスフェラーゼ
と３７℃で４分インキュベー）・した。この段階で、リ
コンビナント分子のひとつの成分を形成するｃＤＮＡが
用意される（第１図の左側をみよ）。
末端にオリゴデオキシシチジンを付加さすことにより約
１５ニュクレオチド分延ばした。それには、０．５μｙ
分を、１４０ｍＭのカリウム力コシレート、ｒＪｌ ６
．９ 、 ．５ ０ ｍＭ の ト リ ス − Ｈ
ＣＩ 、 Ｐｔ＋ ６．９ 、 ２ ｍＭの
Ｃ’０Ｃ１２，０，１ｍＭのＤＴＴ 、 ０．１ ｍ９
７ｍ１！ ０） ＢＳＡおよび５ ＢｍのｄＣＴＰ中、
５００単位／ ｍｌの末Ｖｊｇ ＋−ランスフェラーゼ
と３７℃で４分インキュベー）・した。この段階で、リ
コンビナント分子のひとつの成分を形成するｃＤＮＡが
用意される（第１図の左側をみよ）。
第２の成分は、環状の二本鎖ＤＮＡ分子である、Ｅｓｃ
ｈｅｒｉｃｈｉａ ＱｏｌｉプラスミドｐＢＲ３２２で
ある。
ｈｅｒｉｃｈｉａ ＱｏｌｉプラスミドｐＢＲ３２２で
ある。
２Ｍｇ ｐＢＲ３２２を、制限エンドニュクレアーゼＰ
ｓｔ ｌで直線状とし、ｃＤＮＡ混合物と同様にして、
突出するオリゴデオキシグアニジン末端を生ずるように
、分子の３′末端にオリゴデオキシシチジンを付加させ
て変型した（第１図の右側をみよ）。
ｓｔ ｌで直線状とし、ｃＤＮＡ混合物と同様にして、
突出するオリゴデオキシグアニジン末端を生ずるように
、分子の３′末端にオリゴデオキシシチジンを付加させ
て変型した（第１図の右側をみよ）。
こｈらのオリゴデオキシグアニジン末端は、ｃＤＮ八分
への遊離オリゴデオキシシチジン末端と塩基対を形成し
て安定なりＮＡ二本鎖領域を生じつる。それには、反応
のそれら２つの成分ｖ、０．１ＭのＮａＣ１，１ｍＭの
ＥＤＴＡ、 ２０ ｍＭのトリス−ＭＣＩ。
への遊離オリゴデオキシシチジン末端と塩基対を形成し
て安定なりＮＡ二本鎖領域を生じつる。それには、反応
のそれら２つの成分ｖ、０．１ＭのＮａＣ１，１ｍＭの
ＥＤＴＡ、 ２０ ｍＭのトリス−ＭＣＩ。
ｐＨ８中で６５℃で１０分、ついで４５℃で２．５時間
そして６７°Ｃで１夜インキユペー Ｉ−「る。
そして６７°Ｃで１夜インキユペー Ｉ−「る。
この方法で、Ｐｓｔ ｌ制限エンドニュクレアーゼによ
る切れ目を生じ、ひきつづいて、ベクターバイブリドよ
りｃ ＤＮＡ挿入物を切り出すのに利用しう る 。
る切れ目を生じ、ひきつづいて、ベクターバイブリドよ
りｃ ＤＮＡ挿入物を切り出すのに利用しう る 。
ｐＢＲ３２２およびＮａｍａｌｗａ −ｃＤＮＡよりこ
の方法で生成されるバイブリドプラスミドで、文献（Ｐ
ｒｏｃ、 Ｎａｔｌ、 Ａｃａｄ、 Ｓｃｉ、、
ＵＳＡ ６！？ 、２１１０−２１１４（１９
７２））記載の方法で、Ｅｓｃｈｅｒｊｃｈｉｇｃｏｌ
ｉ ＨＢ １ ［３１を形質転換する。このようにして
、転換され１こＥ、 ｃｏｌｉ細胞の３ （１，００［
１クローン力！得られるので、ミクロタイタープレート
中でイ固＋Ａ１１に分けた。
の方法で生成されるバイブリドプラスミドで、文献（Ｐ
ｒｏｃ、 Ｎａｔｌ、 Ａｃａｄ、 Ｓｃｉ、、
ＵＳＡ ６！？ 、２１１０−２１１４（１９
７２））記載の方法で、Ｅｓｃｈｅｒｊｃｈｉｇｃｏｌ
ｉ ＨＢ １ ［３１を形質転換する。このようにして
、転換され１こＥ、 ｃｏｌｉ細胞の３ （１，００［
１クローン力！得られるので、ミクロタイタープレート
中でイ固＋Ａ１１に分けた。
例 Ｄ
合成トリテカニュクレオチト５′ｄＣＣＴＴＣＴＧＧＡ
ＡＣ′Ｆ０６′を用いる、■ＦＮ−αおよびＩＦＮ−β
ＤＮＡ配列に関して特異的である／Ｘイブリダイゼーシ
ョン標＾ΔＪ）調製 本発明が対象としている、インターフェロン自己外含有
転換Ｅ、 ｃｏｌｉクローンを選択するブチ法（１、配
列５’ ｄＣＣＴＴＣＴＧＧＡＡＣＴＧ ３’を有する
合成ト１ノテ９カニュクレオチドの使用を基礎として〜
・る。こび）６６列は、ＩＦＮ−αの遺伝子の大部分お
よびＩＦＮ−β遺伝子のあいだで相同性の、切れ口σ）
な（・０つとも長いＤＮＡ部分である。このトリデカニ
ュクレオチドの合成はすでに記載された。こσツト１ノ
デカニュクレオチドは、５０ ｍＭのトリス−ＨＣｌ
、 ｐＨ７，５゜１０ｍＭのＭｇＣｌ２．５ ｒｎＭσ
） ＤＴＴ 、 ０．１ ｍＭスペルミジン、１μｍ
の”’Ｐ −ＡＴＰ中、６０単位／ ｍｌのＴ４−ホリ
ニュクレオチドキナーゼ（ＢｅｔｈｅｓｄａＲｅｓｅａ
ｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ ）と、６７°Ｃで
６０分インキュベートし、分子の５′末端にオｄ（・て
５００Ｃ１／ｍモルの比活性にラベルした。
ＡＣ′Ｆ０６′を用いる、■ＦＮ−αおよびＩＦＮ−β
ＤＮＡ配列に関して特異的である／Ｘイブリダイゼーシ
ョン標＾ΔＪ）調製 本発明が対象としている、インターフェロン自己外含有
転換Ｅ、 ｃｏｌｉクローンを選択するブチ法（１、配
列５’ ｄＣＣＴＴＣＴＧＧＡＡＣＴＧ ３’を有する
合成ト１ノテ９カニュクレオチドの使用を基礎として〜
・る。こび）６６列は、ＩＦＮ−αの遺伝子の大部分お
よびＩＦＮ−β遺伝子のあいだで相同性の、切れ口σ）
な（・０つとも長いＤＮＡ部分である。このトリデカニ
ュクレオチドの合成はすでに記載された。こσツト１ノ
デカニュクレオチドは、５０ ｍＭのトリス−ＨＣｌ
、 ｐＨ７，５゜１０ｍＭのＭｇＣｌ２．５ ｒｎＭσ
） ＤＴＴ 、 ０．１ ｍＭスペルミジン、１μｍ
の”’Ｐ −ＡＴＰ中、６０単位／ ｍｌのＴ４−ホリ
ニュクレオチドキナーゼ（ＢｅｔｈｅｓｄａＲｅｓｅａ
ｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ ）と、６７°Ｃで
６０分インキュベートし、分子の５′末端にオｄ（・て
５００Ｃ１／ｍモルの比活性にラベルした。
この末端ラベルトリデカニュクレオチドを（−重鎖）
ｃＤＮＡ合成のプライマーに用（・た。イ也方、５ｅｎ
ｄａ＋ウイルスで誘導したＮａｍａ１ｗａ細胞力）らの
ポリ（Ａ）”ＲＮＡ （例ＢＹみよ）をマド１ノ゛ンク
スに用いた。
ｃＤＮＡ合成のプライマーに用（・た。イ也方、５ｅｎ
ｄａ＋ウイルスで誘導したＮａｍａ１ｗａ細胞力）らの
ポリ（Ａ）”ＲＮＡ （例ＢＹみよ）をマド１ノ゛ンク
スに用いた。
反応は、５０ ｍＭのトリス−ＭＣＩ ＋ ｐ” Ｂ−
３，６０鮨のＫＣＩ、５ｍＭのＤＴＴ、５（ｌｌｔゾ／
ｍｅのアクチしプライマーを５から１０倍モル過剰とし
、１００単位／ｍｌの順逆転写酵素を用（・、６７°Ｃ
で９０分反応させｋ。ＲＮＡ−ＤＮＡ ／）イブ１ノド
のＲＩＪＡ成分Ｙ 除＜ ｒ： メｖｃ、５ ｏ ’ｃ
で０．６ＭのＮａＯＨ中で１１￥ｊ間インキュベートし
つ（・で０．３Ｍの酢酸で中牙口しγこあと、ｃＤＮＡ
をハイブリダイゼーションの標品に用いうる。このプロ
セスを第２図に模式的に示す。それで、このように製造
し７ｊ ｃＤＮＡは、インターフェロンに特異的なトリ
ぞカニュクレオチドをプライマーとして合成した分子中
のみに放射ラベルを担い、それで、ハイブリダイゼーシ
ョンにおいて、インターフェロン−ＤＮＡ配列の認識に
高い特異性を示す。
３，６０鮨のＫＣＩ、５ｍＭのＤＴＴ、５（ｌｌｔゾ／
ｍｅのアクチしプライマーを５から１０倍モル過剰とし
、１００単位／ｍｌの順逆転写酵素を用（・、６７°Ｃ
で９０分反応させｋ。ＲＮＡ−ＤＮＡ ／）イブ１ノド
のＲＩＪＡ成分Ｙ 除＜ ｒ： メｖｃ、５ ｏ ’ｃ
で０．６ＭのＮａＯＨ中で１１￥ｊ間インキュベートし
つ（・で０．３Ｍの酢酸で中牙口しγこあと、ｃＤＮＡ
をハイブリダイゼーションの標品に用いうる。このプロ
セスを第２図に模式的に示す。それで、このように製造
し７ｊ ｃＤＮＡは、インターフェロンに特異的なトリ
ぞカニュクレオチドをプライマーとして合成した分子中
のみに放射ラベルを担い、それで、ハイブリダイゼーシ
ョンにおいて、インターフェロン−ＤＮＡ配列の認識に
高い特異性を示す。
例 Ｅ
トリデカニュクレオチドヲソライマーとし７ｊｃＤＮＡ
を用いるコロニーハイブリダイゼーションここに記載す
る方法を用いて、トリデカニュク″レオチドに相補性の
ＤＮ八へ列を有するバイブリドプラスミドを含有する転
換細菌クローンを認識する。そのために、それぞれにク
ローン化された形質転換ｍの細胞は２２×１５ｃｍのニ
トロセルローズフィルター（孔のサイズ０．４５μｍ
、 ＭｉｌｌｉＴ−１ｏｒｅまたは５ｃｈｌｅｉｃｈｅ
ｒ ＆ ５ｃｈｕｅｌｌ ）上に移し、フィルター上で
培養して直径２ｒｎｍのコロニーとし、文献記載の方法
（Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔｌ、 Ａｃａｄ、 Ｓｃｉ、 Ｕ
！−＋Ａ ７２゜５９６１−３９６５（１９７５）およ
びＡｎａｌ、ｙｔｉ ｃａｔＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ
９８．６０−６３ （１９７９） ）によるコロニー
ハイブリダイゼーションに用いた。
を用いるコロニーハイブリダイゼーションここに記載す
る方法を用いて、トリデカニュク″レオチドに相補性の
ＤＮ八へ列を有するバイブリドプラスミドを含有する転
換細菌クローンを認識する。そのために、それぞれにク
ローン化された形質転換ｍの細胞は２２×１５ｃｍのニ
トロセルローズフィルター（孔のサイズ０．４５μｍ
、 ＭｉｌｌｉＴ−１ｏｒｅまたは５ｃｈｌｅｉｃｈｅ
ｒ ＆ ５ｃｈｕｅｌｌ ）上に移し、フィルター上で
培養して直径２ｒｎｍのコロニーとし、文献記載の方法
（Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔｌ、 Ａｃａｄ、 Ｓｃｉ、 Ｕ
！−＋Ａ ７２゜５９６１−３９６５（１９７５）およ
びＡｎａｌ、ｙｔｉ ｃａｔＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ
９８．６０−６３ （１９７９） ）によるコロニー
ハイブリダイゼーションに用いた。
末端ラベルｃＤＮＡ （例りをみよ）を用いる核酸ノ１
イゾリダイゼーションは、５０％ホルムアミド、４Ｘ
ＳＥＴ （１Ｘ ＳＥＴ ＝ ０．１５ ＭのＮａＣ１
、５ｍＭσ）ＥＤＴＡ 、 ５ ３ ｍＭ の
ト リ ス − ＨＣＩ 、 ｐｔｌ ８ ）
、 １ ×Ｄｅｎｈａｒｄｔ溶液（０，０２％
ＢＳＡ、 ０．０２ ％ ｆｉｃｏｌｌ。
イゾリダイゼーションは、５０％ホルムアミド、４Ｘ
ＳＥＴ （１Ｘ ＳＥＴ ＝ ０．１５ ＭのＮａＣ１
、５ｍＭσ）ＥＤＴＡ 、 ５ ３ ｍＭ の
ト リ ス − ＨＣＩ 、 ｐｔｌ ８ ）
、 １ ×Ｄｅｎｈａｒｄｔ溶液（０，０２％
ＢＳＡ、 ０．０２ ％ ｆｉｃｏｌｌ。
０．０２チポリビニルビロリドン）、０．５ｍ’；／／
ｍｅの変性しせん断したさけの精子ＤＮＡ、 ０．１
％ナトリウムピロホスフェートおよび０．１％ＳＤＳ中
、３７°Ｃで４８時間インキュベートして実施した。つ
いで、フィルターは、５０％ホルムアミドおよび０．２
×ＳＳＣ（ｉ ｘ ＳＳＣ＝ Ｑ、ｌ ５ Ｍ ＮａＣ
１および０．０１５ Ｍのくえん酸ナトリウム）より成
立つ溶液中で２０から２５℃で洗い、ついでｌ Ｘ Ｓ
ＳＣの溶液を用いてすすいだ。フィルターは２０から２
５°Ｃで乾燥し、マイナス７０℃で、Ｘ−線フイルム（
Ｋｏｄａｋ ｙＲ）にさらした。第６図はそのよ５ ’
ｆ（試験の代表的結果を示す。示した表面上で１５６６
個の細菌コロ＝ −ヲ培９Ｚ Ｌ 、コロニーハイプリ
ダイぜ−ションでスクリーニングした。矢印は、放射活
性標品のシグナルを力えろバイブリドプラスミドＤＮＡ
’Ｊ有する転換細菌クローンを示す。全体で約１３，
００口個の転換細菌コロニーをスクリーニングし、トリ
デカニュクレオチドで開始され、５ｅｎｄａｉウイルス
で誘導されたＮａｍａ１ｗａ細胞より得られた、ｃＤＮ
Ａの有する陽性シグナルを与える１９０個のクローンが
得もｆ′１．１こ。それらは２個のミクロタイタープレ
ー）（ＰｌおよびＰ２）上に捕集された。つまり、この
クローンバンク上のすべてのクローンの約１％が特異的
配列ｄｃｃＴＴｃＴ（）ＯＡＡＣＴＯを含有した。
ｍｅの変性しせん断したさけの精子ＤＮＡ、 ０．１
％ナトリウムピロホスフェートおよび０．１％ＳＤＳ中
、３７°Ｃで４８時間インキュベートして実施した。つ
いで、フィルターは、５０％ホルムアミドおよび０．２
×ＳＳＣ（ｉ ｘ ＳＳＣ＝ Ｑ、ｌ ５ Ｍ ＮａＣ
１および０．０１５ Ｍのくえん酸ナトリウム）より成
立つ溶液中で２０から２５℃で洗い、ついでｌ Ｘ Ｓ
ＳＣの溶液を用いてすすいだ。フィルターは２０から２
５°Ｃで乾燥し、マイナス７０℃で、Ｘ−線フイルム（
Ｋｏｄａｋ ｙＲ）にさらした。第６図はそのよ５ ’
ｆ（試験の代表的結果を示す。示した表面上で１５６６
個の細菌コロ＝ −ヲ培９Ｚ Ｌ 、コロニーハイプリ
ダイぜ−ションでスクリーニングした。矢印は、放射活
性標品のシグナルを力えろバイブリドプラスミドＤＮＡ
’Ｊ有する転換細菌クローンを示す。全体で約１３，
００口個の転換細菌コロニーをスクリーニングし、トリ
デカニュクレオチドで開始され、５ｅｎｄａｉウイルス
で誘導されたＮａｍａ１ｗａ細胞より得られた、ｃＤＮ
Ａの有する陽性シグナルを与える１９０個のクローンが
得もｆ′１．１こ。それらは２個のミクロタイタープレ
ー）（ＰｌおよびＰ２）上に捕集された。つまり、この
クローンバンク上のすべてのクローンの約１％が特異的
配列ｄｃｃＴＴｃＴ（）ＯＡＡＣＴＯを含有した。
例 Ｆ
トリデカニュクレオチドをノライマーとし７ｊｃＤＮＡ
でハイブリダイゼーションしたクローンの配列の複雑さ
の分析 １９０個のトリデカニュクレオチド陽性クローン（例Ｅ
をみよ）中の種々の配列（配列の複雑さ）のクローンの
数を測定するために、種々のクローンより、Ｐｓｔ ｌ
消化（例Ｃをみよ）、０．８％アガロースｒル中での電
気泳動、望むノ々ンドの溶出（つまり、バンドを含有す
るデルσ）フラク゛メントを沈殿させそして透析チュー
ブ中−（・アガロースよりＤＮＡを電気泳動的に溶出す
る）により望む／々ンドを溶出しそしてこれらのｃＤＮ
Ａ挿入物を、文献（ＪｏＭｏｌ、 Ｂｉｏｌ、 １１±
、 ２３７−２５１ （１９７７））既知の方法を用
い”ｐ ｙ用いニックトランスレーション（ｎ１ｃｋ
ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ ）でラベルし１こ。トリヂカ
ニュクレオチド陽性クローン（ミクロピペットプレート
Ｐ１およびＰ２ ）およびランタゞムに】双んだミクロ
タイタープレート（Ｅ５２ ）のインク０レツシヨンを
ニトロセルローズフィルターに移し、培養し、コロニー
ノ１イプリダイゼーションの準備をしく例Ｅ’Ｙみよ）
そして種々の３２ｐ−ラベルｃＤＮＡ挿入物でハイブリ
ダイゼーションし１こ。ノ１イプリダイゼーションは例
Ｅのように実施し１こ。γこだし、５０ μｇ／ ｍｌ
のポリ（Ｕ）および１０ｔｔＭ／酩のポリ（１）：ポリ
（Ｃ）もまたノ１イブリダイゼーション溶液に加え、ノ
Ａイブ゛リダイゼーションのあと、フィルターは５０係
ホルムアミドおよび１×ＳＳＣで洗った。クローンＰＨ
（１およびＰ２Ｈ１０の挿入物を試料としたそのような
実験の結果を第４図に示す。（ＰｌＨｌはミクロタイタ
ープレー） Ｐｌ−ヒの位置Ｈ１上のクローンで、Ｐ２
Ｈ１０はミクロタイタープレートＰ２上の位置Ｈ１０で
ある）。クローンＰ１Ｈ１は、プレー） ＰｌおよびＰ
２上のトリデカニュクレオチド陽性クローンの９０％以
上とハイブリダイゼーションし、プレー） １’、５２
（第４図、パートＡ ） ｌのクローンのいくらかと
ハイブリダイゼーションすることが分った。これらのク
ローン配列の多くのものは、あとで制限分析により同定
確認された。クローンＰ２Ｈ１０は、それ自体と７１イ
ブリダイゼーシヨンするのみでなく、位１ｔ！ｔｌｃ１
２゜ＩＦ１２ 、およびＥ５２Ｅ１ Ｃ第４図、パート
Ｂ）中のクローンともハイブリダイゼーションした。ク
ローンＰＩＡ６およびＰ２Ｂ１０もこのように分析さハ
フたが、それぞれ、それ自身とだけハイブリダイゼーシ
ョンした。（この結果は表４に示してない）。
でハイブリダイゼーションしたクローンの配列の複雑さ
の分析 １９０個のトリデカニュクレオチド陽性クローン（例Ｅ
をみよ）中の種々の配列（配列の複雑さ）のクローンの
数を測定するために、種々のクローンより、Ｐｓｔ ｌ
消化（例Ｃをみよ）、０．８％アガロースｒル中での電
気泳動、望むノ々ンドの溶出（つまり、バンドを含有す
るデルσ）フラク゛メントを沈殿させそして透析チュー
ブ中−（・アガロースよりＤＮＡを電気泳動的に溶出す
る）により望む／々ンドを溶出しそしてこれらのｃＤＮ
Ａ挿入物を、文献（ＪｏＭｏｌ、 Ｂｉｏｌ、 １１±
、 ２３７−２５１ （１９７７））既知の方法を用
い”ｐ ｙ用いニックトランスレーション（ｎ１ｃｋ
ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ ）でラベルし１こ。トリヂカ
ニュクレオチド陽性クローン（ミクロピペットプレート
Ｐ１およびＰ２ ）およびランタゞムに】双んだミクロ
タイタープレート（Ｅ５２ ）のインク０レツシヨンを
ニトロセルローズフィルターに移し、培養し、コロニー
ノ１イプリダイゼーションの準備をしく例Ｅ’Ｙみよ）
そして種々の３２ｐ−ラベルｃＤＮＡ挿入物でハイブリ
ダイゼーションし１こ。ノ１イプリダイゼーションは例
Ｅのように実施し１こ。γこだし、５０ μｇ／ ｍｌ
のポリ（Ｕ）および１０ｔｔＭ／酩のポリ（１）：ポリ
（Ｃ）もまたノ１イブリダイゼーション溶液に加え、ノ
Ａイブ゛リダイゼーションのあと、フィルターは５０係
ホルムアミドおよび１×ＳＳＣで洗った。クローンＰＨ
（１およびＰ２Ｈ１０の挿入物を試料としたそのような
実験の結果を第４図に示す。（ＰｌＨｌはミクロタイタ
ープレー） Ｐｌ−ヒの位置Ｈ１上のクローンで、Ｐ２
Ｈ１０はミクロタイタープレートＰ２上の位置Ｈ１０で
ある）。クローンＰ１Ｈ１は、プレー） ＰｌおよびＰ
２上のトリデカニュクレオチド陽性クローンの９０％以
上とハイブリダイゼーションし、プレー） １’、５２
（第４図、パートＡ ） ｌのクローンのいくらかと
ハイブリダイゼーションすることが分った。これらのク
ローン配列の多くのものは、あとで制限分析により同定
確認された。クローンＰ２Ｈ１０は、それ自体と７１イ
ブリダイゼーシヨンするのみでなく、位１ｔ！ｔｌｃ１
２゜ＩＦ１２ 、およびＥ５２Ｅ１ Ｃ第４図、パート
Ｂ）中のクローンともハイブリダイゼーションした。ク
ローンＰＩＡ６およびＰ２Ｂ１０もこのように分析さハ
フたが、それぞれ、それ自身とだけハイブリダイゼーシ
ョンした。（この結果は表４に示してない）。
このことから、１９０個のトリデカニュクレオチド陽性
クローンのうち、恐らく、１０より少ない、質的に異な
る配列が存在すると推定しうる。そのような異なる配列
の４個は、ＰＩＨｌ 、 Ｐ２Ｈ１０、Ｐ１Ａ６およ
びＰ２Ｂ １０である。
クローンのうち、恐らく、１０より少ない、質的に異な
る配列が存在すると推定しうる。そのような異なる配列
の４個は、ＰＩＨｌ 、 Ｐ２Ｈ１０、Ｐ１Ａ６およ
びＰ２Ｂ １０である。
例 Ｇ
ＲＮＡ ）ランスファーハイブリダイゼーション特定の
トリデカニュクレオチドー陽性細菌クローンがインター
フェロン配列を含みうるかどうかをみるために、そのプ
ラスミドＤＮＡが、５ｅｎｄａｉウイルスによりＮａｍ
ａ１ｗａ細胞中に誘導されたｍ ＲＮＡとハイブリダイ
ゼーションするかどうかをみるための試験を行なった。
トリデカニュクレオチドー陽性細菌クローンがインター
フェロン配列を含みうるかどうかをみるために、そのプ
ラスミドＤＮＡが、５ｅｎｄａｉウイルスによりＮａｍ
ａ１ｗａ細胞中に誘導されたｍ ＲＮＡとハイブリダイ
ゼーションするかどうかをみるための試験を行なった。
その目的では、例Ｂ記載のようにして、ポリ（Ａ、）”
ＲＮ、Ａを誘導および非誘導Ｎａｍａ １ｗａ細胞より
分離し、ＩＭグリオギザール、５０％ＤＭＳ０，１０ｍ
Ｍリン酸ナトリウム緩衝液、Ｐ１１７中で５０°Ｃで１
時間インキュベートし、１．４チアガロースｒル上で分
ケ、ニトロセルロースフィルターに移した。それには文
献既知の方法（Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ、 Ａｃａｄ、 Ｓｃ
ｉ、 ＵＳＡ７７、 ５２０１−５２０５ （１９８０
））を用いた。そして、ニックトランスレーションによ
り３２ｐでラベルしたプラスミｙ ＤＮＡとハイブリダ
イゼーションさせ１こ（例Ｆをみよ）。この試験の方式
では、誘導遺伝子に由来するプラスミドＤＮＡは、誘導
細胞よりのＲＮＡとのみハイブリダイゼーションし、非
誘導細胞由来のＲＮＡとはハイブリダイゼーションしな
いであろう。第５図は、この棟の実験のオートラジオグ
ラフィーを示す。誘導されたＲＮＡ（、”ｉ”）はそれ
ぞれの場合について、対の左欄にあり、非誘導ＲＮＡ
（”ｎ”）は右欄にある。／’Ｓイブリダイゼーション
に用いたシラスばドＤＮＡは、ＰｉＨｌ （Ａ） 、
Ｐ１Ｆ１２（Ｂ、 Ｄ ）、 Ｐ２Ｈ１０（Ｃ）
、 ＰＩＡ６ （Ｅ） 、 Ｐ２Ｂ１０（Ｆ）で
ある。試験したプラスミドのうち、Ｐ１Ｆ１２ ＩＰ２
Ｈ１０およびＰ１Ａ６が誘導されｆこ細胞よりのＦ（Ｎ
Ａとのみハイブリダイゼーションし、ＰｌＨｌおよびｐ
２Ｂ １０は、非誘導細胞からのＲＮＡとのシグナルも
生成し１こ。ＰＩＦ１２およびＰ２Ｈ１０と７１イブリ
タイセ゛−シヨンするＲＮＡの分子のサイズは、１１−
１２８であり、ＰＩＡ６とハイブリダイゼーションする
ＲＮＡ０サイズは１２から１４８である。これらの分子
の太ぎさは、ＩＦＮ−βおよびＩＦ’Ｎ −ｅｘ ｒｐ
ＲＮＡについて文献に記載されている。それで、プラス
ミドＰＩＦ１２． Ｐ２１（１０およびＰＩＡ６につい
て、それらのインターフェロン−ＤＮＡ配列含有を明確
に定めるためにさらに調べてみた。
ＲＮ、Ａを誘導および非誘導Ｎａｍａ １ｗａ細胞より
分離し、ＩＭグリオギザール、５０％ＤＭＳ０，１０ｍ
Ｍリン酸ナトリウム緩衝液、Ｐ１１７中で５０°Ｃで１
時間インキュベートし、１．４チアガロースｒル上で分
ケ、ニトロセルロースフィルターに移した。それには文
献既知の方法（Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ、 Ａｃａｄ、 Ｓｃ
ｉ、 ＵＳＡ７７、 ５２０１−５２０５ （１９８０
））を用いた。そして、ニックトランスレーションによ
り３２ｐでラベルしたプラスミｙ ＤＮＡとハイブリダ
イゼーションさせ１こ（例Ｆをみよ）。この試験の方式
では、誘導遺伝子に由来するプラスミドＤＮＡは、誘導
細胞よりのＲＮＡとのみハイブリダイゼーションし、非
誘導細胞由来のＲＮＡとはハイブリダイゼーションしな
いであろう。第５図は、この棟の実験のオートラジオグ
ラフィーを示す。誘導されたＲＮＡ（、”ｉ”）はそれ
ぞれの場合について、対の左欄にあり、非誘導ＲＮＡ
（”ｎ”）は右欄にある。／’Ｓイブリダイゼーション
に用いたシラスばドＤＮＡは、ＰｉＨｌ （Ａ） 、
Ｐ１Ｆ１２（Ｂ、 Ｄ ）、 Ｐ２Ｈ１０（Ｃ）
、 ＰＩＡ６ （Ｅ） 、 Ｐ２Ｂ１０（Ｆ）で
ある。試験したプラスミドのうち、Ｐ１Ｆ１２ ＩＰ２
Ｈ１０およびＰ１Ａ６が誘導されｆこ細胞よりのＦ（Ｎ
Ａとのみハイブリダイゼーションし、ＰｌＨｌおよびｐ
２Ｂ １０は、非誘導細胞からのＲＮＡとのシグナルも
生成し１こ。ＰＩＦ１２およびＰ２Ｈ１０と７１イブリ
タイセ゛−シヨンするＲＮＡの分子のサイズは、１１−
１２８であり、ＰＩＡ６とハイブリダイゼーションする
ＲＮＡ０サイズは１２から１４８である。これらの分子
の太ぎさは、ＩＦＮ−βおよびＩＦ’Ｎ −ｅｘ ｒｐ
ＲＮＡについて文献に記載されている。それで、プラス
ミドＰＩＦ１２． Ｐ２１（１０およびＰＩＡ６につい
て、それらのインターフェロン−ＤＮＡ配列含有を明確
に定めるためにさらに調べてみた。
例 Ｈ
バイブリド−分離ＲＮＡの翻訳生成物についてのインタ
ーフェロン活性の生物学的検出 特定のバイブリドプラスミドがインターフェロン−ＤＮ
Ａ配列を含有するかどうかをみるために、生物学的試験
を基礎とする証明を、シラスミドＰＩＦ１２． Ｐ２Ｈ
１０，ＰｌＨｌおよびＰ２Ｂ１０について実施した。こ
の証明の原理はつぎのようである。試験しようとするプ
ラスミドＤＮＡをニトロセルローズフィルター上に固定
し、ついで、ハイブリダイゼーションの条件で、誘導さ
れたＮａｍａ１ｗａ細胞よりのポリ（Ａ）”ＲＮＡ （
例Ｂをみよ）とインキュベートした。結合ＤＮＡがイン
ターフェロン配列を含有するなら、インターフェロン−
ｍＲＮＡはそれとハイブリダイゼーションするであろう
。ついでハイブリダイゼーションしてないＲＮＡは洗い
去シ、ハイブリダイゼーションしたＲＮＡをＤＮＡより
溶融し去り、Ｘｅｎｏｐｕｓ １ａｅｖｉｓの卵細胞に
注入した。卵細胞は、注入されたｍＲＮＡを蛋白質に翻
訳しうる（例Ｂをみよ）。ハイブリダイゼーションされ
たＲＮＡがインターフェロン−ｍＲＮＡならば、インタ
ーフェロン蛋白質が卵細胞中に生成し、その抗ウイルス
性をシラツク減少試験（例Ａをみよ）において証明しう
る。詳しくは、試験をつぎのように実施する。１０μｇ
の直線状したフ０ラスミドＤＮＡを２００ｔｔｌの＄５
０．５ Ｈの１ＪａＯＨで変性し、０．５Ｎ酢酸＋２０
Ｘ ＳＥＴ （ＳＥＴの組成については例Ｅをみよ）の
２００μｌで中和し、ニトロセルロースフィルター（２
，５ＣＴＬ直径）上で濾過して固定する。フィルターは
常温で乾燥し、８０°Ｃで２時間加熱し、５０％ホルム
アミド、２０ ｍＭのＰ工ＰＥＳ、 ｐＨ６，５。
ーフェロン活性の生物学的検出 特定のバイブリドプラスミドがインターフェロン−ＤＮ
Ａ配列を含有するかどうかをみるために、生物学的試験
を基礎とする証明を、シラスミドＰＩＦ１２． Ｐ２Ｈ
１０，ＰｌＨｌおよびＰ２Ｂ１０について実施した。こ
の証明の原理はつぎのようである。試験しようとするプ
ラスミドＤＮＡをニトロセルローズフィルター上に固定
し、ついで、ハイブリダイゼーションの条件で、誘導さ
れたＮａｍａ１ｗａ細胞よりのポリ（Ａ）”ＲＮＡ （
例Ｂをみよ）とインキュベートした。結合ＤＮＡがイン
ターフェロン配列を含有するなら、インターフェロン−
ｍＲＮＡはそれとハイブリダイゼーションするであろう
。ついでハイブリダイゼーションしてないＲＮＡは洗い
去シ、ハイブリダイゼーションしたＲＮＡをＤＮＡより
溶融し去り、Ｘｅｎｏｐｕｓ １ａｅｖｉｓの卵細胞に
注入した。卵細胞は、注入されたｍＲＮＡを蛋白質に翻
訳しうる（例Ｂをみよ）。ハイブリダイゼーションされ
たＲＮＡがインターフェロン−ｍＲＮＡならば、インタ
ーフェロン蛋白質が卵細胞中に生成し、その抗ウイルス
性をシラツク減少試験（例Ａをみよ）において証明しう
る。詳しくは、試験をつぎのように実施する。１０μｇ
の直線状したフ０ラスミドＤＮＡを２００ｔｔｌの＄５
０．５ Ｈの１ＪａＯＨで変性し、０．５Ｎ酢酸＋２０
Ｘ ＳＥＴ （ＳＥＴの組成については例Ｅをみよ）の
２００μｌで中和し、ニトロセルロースフィルター（２
，５ＣＴＬ直径）上で濾過して固定する。フィルターは
常温で乾燥し、８０°Ｃで２時間加熱し、５０％ホルム
アミド、２０ ｍＭのＰ工ＰＥＳ、 ｐＨ６，５。
０．４ＭのＭａｉｌ、 ５ ｍＭのＥＤＴＡ、 Ｉ Ｏ
％デキストランスＡ／フェート、１ ％ ５ＤＥＩ、
２０ ｄ／ｍｅのに、ｃｏｌｉｔＲＮＡおよび５０ｔ４
／ｍｌのポリ（Ａ）中、５６′Ｃかまたは６７°Ｃで１
時間プレノ・イブリダイゼーションに処し、誘導Ｎａｍ
ａｌｔｗａポリ（Ａ）”ＲＮＡの１４から４０〜を加え
たあと同じ緩衝液中で５時間ノ・イプリダイゼーション
した。ついで、０．２−１Ｘ ＳＥＴ。
％デキストランスＡ／フェート、１ ％ ５ＤＥＩ、
２０ ｄ／ｍｅのに、ｃｏｌｉｔＲＮＡおよび５０ｔ４
／ｍｌのポリ（Ａ）中、５６′Ｃかまたは６７°Ｃで１
時間プレノ・イブリダイゼーションに処し、誘導Ｎａｍ
ａｌｔｗａポリ（Ａ）”ＲＮＡの１４から４０〜を加え
たあと同じ緩衝液中で５時間ノ・イプリダイゼーション
した。ついで、０．２−１Ｘ ＳＥＴ。
０．２％ＳＤＳ、 １％デキストランスルフェート、５
μｙ／ ｍｌのｔＲＮＡ中で２５°Ｇで２０分宛６度洗
い、ついで、２ ｍＭのＥＤＴＡ、 ＰＨ８，０，０，
２％ＳＤＳ、 ｉ％デキストランスルフェートおよび５
μｇ／ｍｌのｔＲＮＡ中２５℃で１０分間宛２度、つい
で２ｍＭのＥＤＴＡ 。
μｙ／ ｍｌのｔＲＮＡ中で２５°Ｇで２０分宛６度洗
い、ついで、２ ｍＭのＥＤＴＡ、 ＰＨ８，０，０，
２％ＳＤＳ、 ｉ％デキストランスルフェートおよび５
μｇ／ｍｌのｔＲＮＡ中２５℃で１０分間宛２度、つい
で２ｍＭのＥＤＴＡ 。
ｐＨ８，０，０，２％ＳＤＳおよび５ ｔｔｇ ／ ｍ
ｅのｔＲＮＡ中で６０００で５分間１度洗った。ハイブ
リダイゼーションされたＲＮＡは、１ｄのＨ２Ｏ＋ １
０４のｔＲＮＡ中で１００°Ｃで４分間溶出した。オリ
ゴ（ｄＴ）セルロースのカラム上のクロマトグラフィー
（例Ｂをみよ）のあと、ＲＮＡはエタノールで沈殿させ
、５ｔｔｌｌのＨ２Ｏに取り、Ｘｅｎｏｐｕｓ ｌａｅ
ｖｉｅ卵細胞に注射した。常温で２日インキュベーシ
ョンしたあと、卵細胞の上清を採取し、ブラック減少試
験でインターフェロン活性をみた。
ｅのｔＲＮＡ中で６０００で５分間１度洗った。ハイブ
リダイゼーションされたＲＮＡは、１ｄのＨ２Ｏ＋ １
０４のｔＲＮＡ中で１００°Ｃで４分間溶出した。オリ
ゴ（ｄＴ）セルロースのカラム上のクロマトグラフィー
（例Ｂをみよ）のあと、ＲＮＡはエタノールで沈殿させ
、５ｔｔｌｌのＨ２Ｏに取り、Ｘｅｎｏｐｕｓ ｌａｅ
ｖｉｅ卵細胞に注射した。常温で２日インキュベーシ
ョンしたあと、卵細胞の上清を採取し、ブラック減少試
験でインターフェロン活性をみた。
結果は、ＲＮＡ トランスファーハイブリダイゼーショ
ン（例Ｇ）より明らかな仮定を確証した。つまり、クロ
ーンＰＩＦ１２およびＰ２Ｈ１（Ｊはインターフエロン
−ＤＮＡ挿入物を担うが、クローンＰｉＨ１およびＰ２
Ｂ１０は担わなかった。工１１’Ｎ−αまたは■ＰＮ−
βに対する特異的抗血清で生ずるインターフェロン活性
を中和することにより（例Ａをみよ）、クローンＰＩＦ
１２およびＰ２Ｈ１０中の挿入物がＴＦ’Ｎ−βＤＮＡ
配列であることが示された。
ン（例Ｇ）より明らかな仮定を確証した。つまり、クロ
ーンＰＩＦ１２およびＰ２Ｈ１（Ｊはインターフエロン
−ＤＮＡ挿入物を担うが、クローンＰｉＨ１およびＰ２
Ｂ１０は担わなかった。工１１’Ｎ−αまたは■ＰＮ−
βに対する特異的抗血清で生ずるインターフェロン活性
を中和することにより（例Ａをみよ）、クローンＰＩＦ
１２およびＰ２Ｈ１０中の挿入物がＴＦ’Ｎ−βＤＮＡ
配列であることが示された。
クローン インターフェロン活性 抗血／１１による中
和パーセント（単位／麻卵細胞上清） ＩＦＮ−α
ＩＦＮ−β抗血清 抗血清 Ｐ１Ｆ１２ 〜５０ ９８Ｐ２Ｈ
１０〜５０ ９８ＰＩＨ１＜ ２
−− Ｐ２Ｂ１０ ＜２ −− −−
例 １ １ＦＮ−β型のクローンの制限および配列分析クローン
ＰＩＦ１２およびＰ ２ Ｈ１０中のｃＤＮＡ挿入物を
制限エンドニュクレアーゼを用いて調べ、酵素Ｂａｍ
ＨＩ、Ｂｇｌｎ、Ｅｃｏ ＲＩ、Ｈｌｎ ｄ ｌ、Ｐｓ
ｔＩおよびＰｖｕ Ｉｆ ｉこよる切れ目の存在および
可能の位置を決定した。ＰＩＦ２およびＰ２Ｈ１０の制
限マツプと文献記載のＩＦＮ−β遺伝子（（）ｅｎｅ
１０．１１−１５（１９８０））（！：の比較を第６図
に示した。
和パーセント（単位／麻卵細胞上清） ＩＦＮ−α
ＩＦＮ−β抗血清 抗血清 Ｐ１Ｆ１２ 〜５０ ９８Ｐ２Ｈ
１０〜５０ ９８ＰＩＨ１＜ ２
−− Ｐ２Ｂ１０ ＜２ −− −−
例 １ １ＦＮ−β型のクローンの制限および配列分析クローン
ＰＩＦ１２およびＰ ２ Ｈ１０中のｃＤＮＡ挿入物を
制限エンドニュクレアーゼを用いて調べ、酵素Ｂａｍ
ＨＩ、Ｂｇｌｎ、Ｅｃｏ ＲＩ、Ｈｌｎ ｄ ｌ、Ｐｓ
ｔＩおよびＰｖｕ Ｉｆ ｉこよる切れ目の存在および
可能の位置を決定した。ＰＩＦ２およびＰ２Ｈ１０の制
限マツプと文献記載のＩＦＮ−β遺伝子（（）ｅｎｅ
１０．１１−１５（１９８０））（！：の比較を第６図
に示した。
６個のクローンのすべてがＰｖｕ Ｉｆ 、Ｐｓｔ Ｉ
およびＢｇ Ｉ Ｉｔにより切断され、それぞれの切れ
目のあいだの距離はそれぞれのクローンについて同じで
あった。クローンＰＩＦ１２おＪ、びＰ２Ｈ１０中への
挿入物がＩＦＮ−β遺伝子と同一であることの最終的な
証明として、ＤＮＡ配列の部分（Ｐｖｕ ［およびＢｇ
１ ｎの切れ目の１右側” （３’） ）をＭａｘａ
ｍおよびＧ１１ｂｅｒｔの方法（Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ １
． Ａｃａｊ。
およびＢｇ Ｉ Ｉｔにより切断され、それぞれの切れ
目のあいだの距離はそれぞれのクローンについて同じで
あった。クローンＰＩＦ１２おＪ、びＰ２Ｈ１０中への
挿入物がＩＦＮ−β遺伝子と同一であることの最終的な
証明として、ＤＮＡ配列の部分（Ｐｖｕ ［およびＢｇ
１ ｎの切れ目の１右側” （３’） ）をＭａｘａ
ｍおよびＧ１１ｂｅｒｔの方法（Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ １
． Ａｃａｊ。
Ｓｃｉ。
ＵＳＡ ７４．５６０−５６４（１９７７））を用いて
同定し、報告されたＩＦＮ−βの配列き比較した。ＰＩ
Ｆ１２およびＰ２Ｈ１０の配列はＩＦ”Ｎ −β遺伝子
に正確に同じであった。それらは第７図に示す。
同定し、報告されたＩＦＮ−βの配列き比較した。ＰＩ
Ｆ１２およびＰ２Ｈ１０の配列はＩＦ”Ｎ −β遺伝子
に正確に同じであった。それらは第７図に示す。
いずれのクローンも５′末端において完全なＩＦＮ−β
配列を有しなかった。それらは、それぞれ完成蛋白質を
コードする約６０ニユクレオチド領域を欠如する。６′
末端において、Ｐ１Ｆ１２は完全で、Ｐ２Ｈ１０はさら
に、ポリ（Ａ）ＲＮＡ由来のポリ（ｄＡ）を含む、ＩＦ
Ｎ−βｃ ＤＮＡの６′領領域体を含有する。しかし、
Ｐ２Ｈ１０はさらに著しく伸びる（１４００塩基対）。
配列を有しなかった。それらは、それぞれ完成蛋白質を
コードする約６０ニユクレオチド領域を欠如する。６′
末端において、Ｐ１Ｆ１２は完全で、Ｐ２Ｈ１０はさら
に、ポリ（Ａ）ＲＮＡ由来のポリ（ｄＡ）を含む、ＩＦ
Ｎ−βｃ ＤＮＡの６′領領域体を含有する。しかし、
Ｐ２Ｈ１０はさらに著しく伸びる（１４００塩基対）。
つまりポリ（ｄＡ）より６′に、オリゴ（ｄＣ）配列の
部分があり、ついで、由来の分らない配列がある。Ｐ２
Ｈ１０のこのｊＢ加領領域釉々のフラグメントのＤＮＡ
配列を分析してみると、それらは、ＩＦＮ−β１以伝子
、ｉ 、Ｈ１同でない。
部分があり、ついで、由来の分らない配列がある。Ｐ２
Ｈ１０のこのｊＢ加領領域釉々のフラグメントのＤＮＡ
配列を分析してみると、それらは、ＩＦＮ−β１以伝子
、ｉ 、Ｈ１同でない。
さらに、クローンＰ２Ｈ１０とクロスーノ−イブリダイ
ゼイションするクローンｐ１．Ｃ１２およびＥ５２Ｅ
１ （例Ｆ記載）は、Ｐ２Ｈ１０のそのような追加の領
域と正確にハイブリダイゼ−ションし、ＩＦ’Ｎ−β部
分とはハイブリダイゼーションしないことが分った。
ゼイションするクローンｐ１．Ｃ１２およびＥ５２Ｅ
１ （例Ｆ記載）は、Ｐ２Ｈ１０のそのような追加の領
域と正確にハイブリダイゼ−ションし、ＩＦ’Ｎ−β部
分とはハイブリダイゼーションしないことが分った。
例 Ｊ
ＩＦＮ−α−型クり−ンＰＩＡ６の分析クローンｐＩＡ
６は、１２−１４８の領域（例Ｇ記載）でウィルス−誘
導Ｎａｍａ１ｗａ ＲＮＡとノ１イプリダイゼーション
する。それは、約９００塩基対のｃＤＮＡ挿入物を含有
し、制限分析の示すように、酵素Ｂａｍ ＨＩ、Ｂｇｌ
ｎ、Ｅｃｏ ＲＩ 、 Ｈｉｎ ｄ Ｉ 、 Ｐｓｔ
ＩおよびＰｖｕ Ｉｆに対する切れ目を有しない（第６
図をみよ）。
６は、１２−１４８の領域（例Ｇ記載）でウィルス−誘
導Ｎａｍａ１ｗａ ＲＮＡとノ１イプリダイゼーション
する。それは、約９００塩基対のｃＤＮＡ挿入物を含有
し、制限分析の示すように、酵素Ｂａｍ ＨＩ、Ｂｇｌ
ｎ、Ｅｃｏ ＲＩ 、 Ｈｉｎ ｄ Ｉ 、 Ｐｓｔ
ＩおよびＰｖｕ Ｉｆに対する切れ目を有しない（第６
図をみよ）。
クローンＰ１Ａ６がＩＦＮ−α配列を有することの証明
は、ふたたび、ＤＮＡ配列分析で与えられた。
は、ふたたび、ＤＮＡ配列分析で与えられた。
ＰＩＡ６のｃＤＮＡ挿入物の配列は、挿入物に隣接する
Ｐｓｔ Ｉ切れ目より内部に向けて決定され、Ｇｏｅｄ
ｄｅｌ等の記載したＩＦＮ−α配列と比較された（ Ｎ
ａｔｕｒｅ ２９０．２Ｏ−２６Ｃ１９８１））Ｏクロ
ーンＰＩＡ６はＬｅＩＦＮ Ｃの変種であるが、４９塩
基対短かいことが分った。ｐＩＡ６の６′末端でのポリ
（Ａ）配列の存在は、クローンＰ１Ａ（Ｓが、報告され
ているクローンＬｅＩＦ’Ｎ Ｃより短かいｍＲＮＡに
由来することを示ず。ＬｅＩＦＮ Ｃ蛋白質をコードす
る領域の全体が存在ずな 例 Ｋ 別のＩＦＮ−α−型クローン（ｉＦ７）の同定および分
析 クローンＰ １Ａ６は、１９０個のトリデカニュクレオ
チド陽性クローンより同定されたただひとつのＩＦＮ−
α−型クローンであった（例Ｅをみお。
Ｐｓｔ Ｉ切れ目より内部に向けて決定され、Ｇｏｅｄ
ｄｅｌ等の記載したＩＦＮ−α配列と比較された（ Ｎ
ａｔｕｒｅ ２９０．２Ｏ−２６Ｃ１９８１））Ｏクロ
ーンＰＩＡ６はＬｅＩＦＮ Ｃの変種であるが、４９塩
基対短かいことが分った。ｐＩＡ６の６′末端でのポリ
（Ａ）配列の存在は、クローンＰ１Ａ（Ｓが、報告され
ているクローンＬｅＩＦ’Ｎ Ｃより短かいｍＲＮＡに
由来することを示ず。ＬｅＩＦＮ Ｃ蛋白質をコードす
る領域の全体が存在ずな 例 Ｋ 別のＩＦＮ−α−型クローン（ｉＦ７）の同定および分
析 クローンＰ １Ａ６は、１９０個のトリデカニュクレオ
チド陽性クローンより同定されたただひとつのＩＦＮ−
α−型クローンであった（例Ｅをみお。
さらにＩＦＮ−α−型クローンを見出だすために、麺と
’＋７）ｃＤＮＡクローンバンク（例Ｃ）よりの１８０
ＯＡ固のクローンヲ、コロニーノ飄イブリダイセ゛−ジ
ョン（例Ｆ記載）によりクローンＰＩＡ６のｃＤＮＡと
ハイブリダイゼーションさせた。も５ひさつＱ〕ＩＦＮ
−αクローン（クローンＩＦ７）はこのヨウに見出ださ
れた。ＩＦ７のｃＤＮＡ挿入物の制用分析および部分的
ＤＮＡ配列の決定は、１Ｆ７かクローン型ＬｅＩＦＮ
Ａ （Ｇｏｅｄｄａｌ ％、上記引用文献）の変型であ
るが、１７５塩基対長いことを示した。
’＋７）ｃＤＮＡクローンバンク（例Ｃ）よりの１８０
ＯＡ固のクローンヲ、コロニーノ飄イブリダイセ゛−ジ
ョン（例Ｆ記載）によりクローンＰＩＡ６のｃＤＮＡと
ハイブリダイゼーションさせた。も５ひさつＱ〕ＩＦＮ
−αクローン（クローンＩＦ７）はこのヨウに見出ださ
れた。ＩＦ７のｃＤＮＡ挿入物の制用分析および部分的
ＤＮＡ配列の決定は、１Ｆ７かクローン型ＬｅＩＦＮ
Ａ （Ｇｏｅｄｄａｌ ％、上記引用文献）の変型であ
るが、１７５塩基対長いことを示した。
ＬｅＩＦＮ Ａと同様に、１Ｆ７は、酵素Ｂｇ１■およ
びＰｖｕ ｎのそれぞれに対して２個の切断点を有しく
第６図）；挿入物の５′および６′末端に見出たされる
ＤＮＡ配列は第８図に示しである。
びＰｖｕ ｎのそれぞれに対して２個の切断点を有しく
第６図）；挿入物の５′および６′末端に見出たされる
ＤＮＡ配列は第８図に示しである。
さらに、ＩＦＮ−α−クローン（１Ｆ７）のＤＮＡ−配
列の諸部分は、Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ−プライマーを用い
、ジデオキシ法で分析した（ Ｍｅｓｓｉｎｇ ％、Ｎ
ｕｃ。
列の諸部分は、Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ−プライマーを用い
、ジデオキシ法で分析した（ Ｍｅｓｓｉｎｇ ％、Ｎ
ｕｃ。
Ａｃ１ｄ Ｒｅｓ、 ９．３［１９（１９８１）および
Ｇａｒｄｎｅｒ ％Ｒ，Ｃ，等、Ｎｕｃ、Ａｃ１６ Ｒ
ｅｓ、 ９．２８７１（１９８１）をみよ）。１２０か
も６２７までの位置について、つぎの部分配列が示され
た。
Ｇａｒｄｎｅｒ ％Ｒ，Ｃ，等、Ｎｕｃ、Ａｃ１６ Ｒ
ｅｓ、 ９．２８７１（１９８１）をみよ）。１２０か
も６２７までの位置について、つぎの部分配列が示され
た。
５０
２７
ＩＦＮ−αＡ型の既知の配列（Ｄ、Ｖ、Ｃ）ｏｅｄｄｅ
ｌ 寺、Ｎａｔｕｒｅ ２９０ 、２０ （１９８１）
）に比して、ＩＦＮ−α−型クローン（ＩＦ７）の新
しいＤＮＡ配列は、ＤＮＡ配列の１２０から６２７まで
の位置において、つぎの差を示す。
ｌ 寺、Ｎａｔｕｒｅ ２９０ 、２０ （１９８１）
）に比して、ＩＦＮ−α−型クローン（ＩＦ７）の新
しいＤＮＡ配列は、ＤＮＡ配列の１２０から６２７まで
の位置において、つぎの差を示す。
つまり、１６７および１７０において、ニュクレオチド
人はニュクレオチドＧに代わっている。
人はニュクレオチドＧに代わっている。
例 Ｌ
バイブリドプラスミドＩＦ７で転換されたＥ、 ｃｏｌ
：ＨＢ １０１融解物におけるインターフェロン活性
ＰＩＡ６オたはＩＦ７で転換された細菌培を物の融解物
について、それらのなかの生物活性インターフェロン含
量を調べた。それには、細に４ 培養物の’＋ｏｏｍｅ
をＬブロス中で培藷゛し、（Ｊ、６から０．８の光学密
度とし、７０００ ｒ、ｐ、ｍ、で１０分遠心して球粒
とし、５０ｍＭのトリスｏｃ１ ｐＨ（３中で洗い、つ
いで３０ｍＭのＮａＣ１中で洗い、同じ（、ニ。
：ＨＢ １０１融解物におけるインターフェロン活性
ＰＩＡ６オたはＩＦ７で転換された細菌培を物の融解物
について、それらのなかの生物活性インターフェロン含
量を調べた。それには、細に４ 培養物の’＋ｏｏｍｅ
をＬブロス中で培藷゛し、（Ｊ、６から０．８の光学密
度とし、７０００ ｒ、ｐ、ｍ、で１０分遠心して球粒
とし、５０ｍＭのトリスｏｃ１ ｐＨ（３中で洗い、つ
いで３０ｍＭのＮａＣ１中で洗い、同じ（、ニ。
両液１．５ｍｌ中に最終的に懸濁させた。１ｍ９／ ｒ
ｎｔのリゾチームと６０分氷上でインキュベートしたあ
とで、細菌の凍結融解を５度反復し４０，０００ ｒ、
ｐ、ｍ。
ｎｔのリゾチームと６０分氷上でインキュベートしたあ
とで、細菌の凍結融解を５度反復し４０，０００ ｒ、
ｐ、ｍ。
で１時間遠心して細胞フラグメントを除いた。上清は濾
過して無菌とし、７０ラツク減少試験でインターフェロ
ンを試験した。このように得られたりローンＩＦ７の融
解物中に約５ＵＵ、１位／１ｎｌのインターフェロンを
検出しえた。この試験でクローンＩＡ６はなんらの活性
を示さず、これは恐らくプラスミドベクター中の挿入物
の配向の異なることによるのであろう。
過して無菌とし、７０ラツク減少試験でインターフェロ
ンを試験した。このように得られたりローンＩＦ７の融
解物中に約５ＵＵ、１位／１ｎｌのインターフェロンを
検出しえた。この試験でクローンＩＡ６はなんらの活性
を示さず、これは恐らくプラスミドベクター中の挿入物
の配向の異なることによるのであろう。
例 Ｍ
１Ｆ７によりコードされる型のインターフェロンの発現
の改良 遺伝子をよく発現するためには、ＤＮＡについて６つの
条件をみたさねばならない。第１に、遺伝子の前にプロ
モーター（ＲＮＡ−ポリメラーゼの結合場ｐＪＴ）が存
在せねばならな（、ａ。第２に、翻訳の開始コドンの前
方において：ａ ｉれるＦｔＪＪＡはリボゾーム結合配
列（ＲＢＳ ）を担わねばならない。第３に、ＲＥＳ、
：開始コドンとのあいたの距離は適当と゛せねばならな
い。
の改良 遺伝子をよく発現するためには、ＤＮＡについて６つの
条件をみたさねばならない。第１に、遺伝子の前にプロ
モーター（ＲＮＡ−ポリメラーゼの結合場ｐＪＴ）が存
在せねばならな（、ａ。第２に、翻訳の開始コドンの前
方において：ａ ｉれるＦｔＪＪＡはリボゾーム結合配
列（ＲＢＳ ）を担わねばならない。第３に、ＲＥＳ、
：開始コドンとのあいたの距離は適当と゛せねばならな
い。
１Ｆ７によりコードされるインク・−フエロンを発現す
るために用いたプロモーター配列は、文献（Ｎａｔｕｒ
ｅ ２７６．６８４−６８９＜ １９７８））記載の５
ｅｒｒａｔｉａ ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓのトリフ０トフ
ァンオペロンのプロモーターとした。そして用いたＲＢ
Ｓは、文献（Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、
ＵＳＡ ７８．５５４３−５５４８（１９８１） ）
ａ己ｇ の ＤＮＡ Ｈ＋己列である。ＲＢＳとＩＦ７
の開始コドンの至適距＾１トを定めるために、つぎの工
夫をした。二本％ｌ ＤＮＡに特異的のエキソニュクレ
アーゼＢＡＬ ３１で１Ｆ′７− ｃＤＮＡを短時間消
化し、種々の長さの分子の混合物とした。ついでこれら
の分子は、合成ＩＪンカー配列を用い適当な方法で理詰
させて１元机プラスミド１、つまりプロモーターおよび
ＲＢＳ Ｏ，） ｎ’１１方を含有するプラスミドとし
た。Ｅ、ｃｏｌ ： ＨＢ １０１をこれらのプラスミ
ドを用いて転換し、転例物のそれぞれについてインター
フェロン生理をみた。
るために用いたプロモーター配列は、文献（Ｎａｔｕｒ
ｅ ２７６．６８４−６８９＜ １９７８））記載の５
ｅｒｒａｔｉａ ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓのトリフ０トフ
ァンオペロンのプロモーターとした。そして用いたＲＢ
Ｓは、文献（Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、
ＵＳＡ ７８．５５４３−５５４８（１９８１） ）
ａ己ｇ の ＤＮＡ Ｈ＋己列である。ＲＢＳとＩＦ７
の開始コドンの至適距＾１トを定めるために、つぎの工
夫をした。二本％ｌ ＤＮＡに特異的のエキソニュクレ
アーゼＢＡＬ ３１で１Ｆ′７− ｃＤＮＡを短時間消
化し、種々の長さの分子の混合物とした。ついでこれら
の分子は、合成ＩＪンカー配列を用い適当な方法で理詰
させて１元机プラスミド１、つまりプロモーターおよび
ＲＢＳ Ｏ，） ｎ’１１方を含有するプラスミドとし
た。Ｅ、ｃｏｌ ： ＨＢ １０１をこれらのプラスミ
ドを用いて転換し、転例物のそれぞれについてインター
フェロン生理をみた。
詳細には、試験はつぎのように英雄した。Ｕ、５から１
μＩのＩＦ７挿入物を、２０ｍＭトリス）ｉｃｌ。
μＩのＩＦ７挿入物を、２０ｍＭトリス）ｉｃｌ。
ＰＨ８，１，０，６ＭのＮａＣ１ｓ １２ ｒ＋＋Ｍの
ＭｇＣｌ２．１２庫のＣａＣｌ２および１ｍＭのＥＤＴ
Ａの１００ ｔｔｌ中で６０℃で６分間、０．５単位の
ＢＡＬ ３１（ＢｅｔｂｅｓｄａＲｅｓｅａｒｃｈ Ｌ
ａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ ）とインキュベートした。
ＭｇＣｌ２．１２庫のＣａＣｌ２および１ｍＭのＥＤＴ
Ａの１００ ｔｔｌ中で６０℃で６分間、０．５単位の
ＢＡＬ ３１（ＢｅｔｂｅｓｄａＲｅｓｅａｒｃｈ Ｌ
ａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ ）とインキュベートした。
ついで、６【）０μｍ０１５ｍＭのＥＤＴＡ 、 Ｐｌ
ｌ ７，８を加えて反応を止め、反応混合物を６５°Ｃ
て１０分加熱し、フェノールおよびエーテル抽出し、エ
タノールで沈殿させた。沈殿は、７０ＴｎＭトリスＨＣ
Ｉ、ＰＨ７，５，７１１１ＭのＭｇＣｌ２、ｉｍＭのＤ
ＴＴ 、 ３．４ ｍＭのＡＴＰの１０μｍ中に取り３
０かも６０ｐモルのリン酸化用ｎｄ Ｗリンカ−（Ｂｅ
ｔｈｅｓｄａ Ｒｅ５ｅａｒｃｈＬａｂｏｒａｔｏｒｉ
ｅｓ ）を加え、０．５から１単位のＴ４リガーゼ（Ｂ
ｅｔｈｅｓｄａ Ｒｅ５ｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏ
ｒｉｅｓ ）と共に１４°Ｃで１夜インキユベートした
。６５°Ｃに１０分加熱して反応を止め２ＭのＮＨ４ア
セテートを加え、インターフェロン遺伝子より非連結リ
ンカ−を除くために０．６容量のインプロパツールで沈
殿させた。沈殿は、３３ｎ＋Ｊｖｌのトリスアセテート
、Ｐ！−１７，９，６６ｒＱＭのカリウムアセテート、
１０ｍＭのマグネシウムアセテートおよび１００ｐ、！
９／ ｍｌｔのＢＳＡの６０から５０μｍに浴解し、６
０かも５０単位のＨｉｎ ｄ １で２から６時間消化し
た。
ｌ ７，８を加えて反応を止め、反応混合物を６５°Ｃ
て１０分加熱し、フェノールおよびエーテル抽出し、エ
タノールで沈殿させた。沈殿は、７０ＴｎＭトリスＨＣ
Ｉ、ＰＨ７，５，７１１１ＭのＭｇＣｌ２、ｉｍＭのＤ
ＴＴ 、 ３．４ ｍＭのＡＴＰの１０μｍ中に取り３
０かも６０ｐモルのリン酸化用ｎｄ Ｗリンカ−（Ｂｅ
ｔｈｅｓｄａ Ｒｅ５ｅａｒｃｈＬａｂｏｒａｔｏｒｉ
ｅｓ ）を加え、０．５から１単位のＴ４リガーゼ（Ｂ
ｅｔｈｅｓｄａ Ｒｅ５ｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏ
ｒｉｅｓ ）と共に１４°Ｃで１夜インキユベートした
。６５°Ｃに１０分加熱して反応を止め２ＭのＮＨ４ア
セテートを加え、インターフェロン遺伝子より非連結リ
ンカ−を除くために０．６容量のインプロパツールで沈
殿させた。沈殿は、３３ｎ＋Ｊｖｌのトリスアセテート
、Ｐ！−１７，９，６６ｒＱＭのカリウムアセテート、
１０ｍＭのマグネシウムアセテートおよび１００ｐ、！
９／ ｍｌｔのＢＳＡの６０から５０μｍに浴解し、６
０かも５０単位のＨｉｎ ｄ １で２から６時間消化し
た。
６５°Ｃに１０分加熱して反応を止め２Ｍの酢酸アンモ
ニウムを加えたあとで、０．６容量のインプロパツール
でインターフェロン遺伝子を沈殿させた。
ニウムを加えたあとで、０．６容量のインプロパツール
でインターフェロン遺伝子を沈殿させた。
沈殿は７ＱｍＭのトリスＨＣ’ｌ、ＰＨ７，５，７ｍＭ
のＭｇＣ１２，１ｍのＤＴＴおよび０．５１１１のＡＴ
Ｐの１０μｍ中に浴解し、Ｈｉｎ ｄ ｍ−直線化、ホ
スファターゼ処理発現プラスミドｐＥＲ１０３の０．２
μｇと、１０−２単位のＴ ４１Ｊが一ゼを用いて１４
°Ｃで１夜処理した。ｐＥＲ１０３は、Ｓ、ｍａｒｃｅ
ｓ ｃｅｎｓのトｌｊブトファンオペロンのプロモータ
ー配列および上記の文′献より知られるＲＢＳを含有す
る。ｐＢＲろ２２肪導体である。これは、ＲＪ１３Ｓの
付近でＢｉｎ ｄ ＩＩを用いて直線状となしうる。こ
のように得られたプラスミドはＥ、ｃｏｌ ： ＨＢ
１０１の転換に用い、個々σ）転換物のインターフェロ
ン生！碓は、例り記載と同様にして調べた。自発的発現
に比して、インターフニーロンの発現は約１０’倍とな
った。
のＭｇＣ１２，１ｍのＤＴＴおよび０．５１１１のＡＴ
Ｐの１０μｍ中に浴解し、Ｈｉｎ ｄ ｍ−直線化、ホ
スファターゼ処理発現プラスミドｐＥＲ１０３の０．２
μｇと、１０−２単位のＴ ４１Ｊが一ゼを用いて１４
°Ｃで１夜処理した。ｐＥＲ１０３は、Ｓ、ｍａｒｃｅ
ｓ ｃｅｎｓのトｌｊブトファンオペロンのプロモータ
ー配列および上記の文′献より知られるＲＢＳを含有す
る。ｐＢＲろ２２肪導体である。これは、ＲＪ１３Ｓの
付近でＢｉｎ ｄ ＩＩを用いて直線状となしうる。こ
のように得られたプラスミドはＥ、ｃｏｌ ： ＨＢ
１０１の転換に用い、個々σ）転換物のインターフェロ
ン生！碓は、例り記載と同様にして調べた。自発的発現
に比して、インターフニーロンの発現は約１０’倍とな
った。
上記した性質は、本発明により製造されるリコンビナン
トＤＮＡ−分子が、α−またはβ−インターフェロンを
コードする配列を含有することを７」Ｚす。本発明に準
じ得られるプラスミドのうちσ）ひとつは、インターフ
ェロンαを発現することが示されている。
トＤＮＡ−分子が、α−またはβ−インターフェロンを
コードする配列を含有することを７」Ｚす。本発明に準
じ得られるプラスミドのうちσ）ひとつは、インターフ
ェロンαを発現することが示されている。
つきに示す微生物およびリコンビナントＤＮＡ分子は、
１９８２年５月１７日に” ＤｅｕｔｓｃｈｅＳａｍｍ
ｌｕｎｇ ｖａｎ ＭｉＲｒｏ −Ｏｒｇａｎｌｓｍｅ
ｎ １Ｇｒｉｓｅｂａｃｈｓｔｒａｓｓｅ Ｆ３．３４
００（）δｔｔｉｎｇｅｎ ’に寄託され、つぎのＤＳ
Ｍ番号を受けている。
１９８２年５月１７日に” ＤｅｕｔｓｃｈｅＳａｍｍ
ｌｕｎｇ ｖａｎ ＭｉＲｒｏ −Ｏｒｇａｎｌｓｍｅ
ｎ １Ｇｒｉｓｅｂａｃｈｓｔｒａｓｓｅ Ｆ３．３４
００（）δｔｔｉｎｇｅｎ ’に寄託され、つぎのＤＳ
Ｍ番号を受けている。
２６６２ＣＩＦ７）、２３６３（ＰＩＡｌｌＳ）、２３
６４（ＰＩＦ１２）および２３６５（Ｐ２Ｈ１０） これらはＢｕｄａｐｅｓｔ 協約により入手しつる。
６４（ＰＩＦ１２）および２３６５（Ｐ２Ｈ１０） これらはＢｕｄａｐｅｓｔ 協約により入手しつる。
使用用語および略称
（ｃｉ）ｋ ： （デオキシアデノシン）抗血清；抗体
含有血清 ＡＴＰ ：アデノシン三リン酸 オートラジオグラフ法：放射活性検出のための写真法 塩基対：２個の相補的ニュクレオチド、たとへはＡ−Ｔ
、Ｇ−Ｃ 平滑末端ニ一本願がはみ出している末端と区別して、二
本鎖ＤＮＡ分子の完全にＪｍ＆対となっている末端 ＢＳＡ ：牛血清アルブミン （ｄ）Ｃ：（デオキシ）シチジン ｃＤＮＡ ： ＲＮＡに相補的のＤＮＡｃＤＮＡプー
ル：種々の配列のｃＤＮＡの混合物コードする：ある物
についての情報を担うこと：ＤＮＡは、蛋白質のアミノ
酸配列につ いての情報をニュクレオチド配列中 に担う。 ゛ ＤＭＳＯ：ジメチルスルホキサイド ＤＮＡ ：デオキシリポ核ｒ肢 ＤＮＡ配列：ホスホジエステル結合で連結されたニュク
レオチドの直伸状配列 Ｄ″ｌ″Ｔ ：ゾチオスレイトール ＥＤＴＡ ：エチレンシニトロテトラ＊ｉ： 酸箪気
泳劫；篭場中、分子の大きさｌこより（ＤＮＡ ”４た
はＭＡ ）分子を分けること 発現 ＋ ｊ−１！を伝子の情報を転写によりｍＲＮＡ
に、ついで翻訳によりポリペプチド（蛋白１′ｉ）に変
換すること フィルターハイブリダイゼーション：ひとつのパートナ
−をフィルターに固定しておいて、核酸をハイブリダイ
ゼーションすること（ｃｌ）Ｇ ： （デオキシ）グ
アノシン遺伝子（ゾーン）：ひきつづき蛋白質に翻訳さ
れうる特異的転写（ＲＮＡ分子）に対する情報を荷うＤ
ＮＡフラグメント 遺伝子族；きわめて類似した生成物（サブ−タイ７°）
をコードする遺伝子の一族 遺伝子生成物： ＲＮＡ （転写生成物）：蛋白質（翻
訳生成物） 勾配 ニス′クロース勾配をみよ 相同性（ＤＮＡ配列の）：類似したニュクレオチド配列
を示するＤＮＡ配列のあいたの関係バイブリド：少なく
とも部分的に相補的のＤＮＡの２つの仙の安定な複合物 ハイブリダイゼーション（核酸の）：相互に相補的のＤ
ＮＡまたはＲＮＡの個々の鎖のあいたの安定な複合物の
形成 ハイブリダイゼーション標品：相補的な配列を発見する
ために用いられる放射ラベル核バイブリドシラスミ「：
外来性ＤＮＡフラグメントを含有するフ０ラスミド エ：イノシン ＩＦＮ−α二白血球インターフェロン ＩＦＮ−β：鐵維芽インターフェロン ＩＦＮ−γ：免疫インターフェロン インビトロー：試験管内 誘導（インターフェロン生理の）：、ｔｌＪ＝！ｌｉ賀
（ウィルス、二本ｌｉ ＲＮＡ ）マイトジェン処理（
こより、細月包がインターフェロンを生産するように刺
倣するこさ 開始コドン： ｍＲＮＡ上にあり、ｌ＋Ｉ＋１訳の開始
を１乙号するＡＵＧ配列 開始初合体： ｃＤＮＡ合成を開始させる、逆転与［１
１素（！： ｍＲＮＡとプライマーとの１１１合せ挿入
物、ｃＤＮＡ挿入物：バイブリドプラスミド中に見出た
される外米性ＤＮＡのフラグメント（つまりｃＤＮＡ
） クローンバンクだけの細菌に由来する細菌コロニークロ
ーンパンク、ｃＤＮＡ クローンバンク： ｃＤＮＡ挿入物を有するバイブリド
プラスミドを、すべてが含有する細菌クローンのコレク
ション クローニング：クローンの生産；ふつうバイブリドプラ
スミドを含有するクローンの生産の意味にきられている コロニーハイブリダイゼーション：フィルターに補捉し
た変性細菌コロニーを用いるハイブリダイゼーション 相補性：相互に適合すること（ＤＮＡ中のニュクレオチ
ドで：ＡはＴに相補イ〆ｌ、ＱはＣに相補性） クロスーハイプリダイセ゛−ジョン：同シではないが相
同のＤＮＡ配列のあいたのハイブリダイゼーション リゾ−ジョン：酵素りが−ゼによるＤＮＡ配列の共有結
合による連結 ミクロタイタープレー１１−１２およびＡ−Ｚの座標を
特徴きする９乙のくぼみを含有するプレート マイトジェン：細胞の核分裂（細胞分裂）を促進する物
質 分子クローニング；クローニングをみよｍＲＮ、Ａ
：メッセンジャーＲＮＡ １蛋白實をコートスるＲＮＡ 中和：抗体を用いる抗原の不法化 ｄＮＴＰ： ｄＡＴＰ 、 ｄＴＴＰ 、 ｄＣＴＧお
よびｄＧＴＰの４十Φニユクレオチドので九台ｑ勿 ニュクレオチド： ＤＮＡまたはＦＬＥＡの構成年位：
（ａ）Ａ、 （ａ）ｃ 、 （ｄ）ｏ 、 （ｄ）
ｒオリゴニュクレオチド：ホスホジエステル粘合て相互
に連結された数個のニュクレオチドオリゴ（Ｃ）：ホス
ホジエステル結合で連結されたＣ残基のオリゴマー オリゴ（ｄＴ） ：ホスホジエステル結合で連結さ第１
たｄＴ残基のオリゴマー オリゴ（ｄＴンセルロース：ポリ（Ａ）”ｌ−ｍＡのク
ロマトグラフィーのためにセルロースに結合されたオリ
ゴ（ｄＴ）残基 ＰＩＦＥＳ ：ビペラシンーＮ、シービス（２−エタン
スルホン酸 プラスミド：自動的に増殖する、環状の、染色体外にあ
る細菌性ＤＮＡ ポリ（Ａ、）または（ｄＡ） ：ホスホゾエステル結
合でポリ（Ａ）の領域を有するｍＲＮＡ ボＩＪ （Ｃ）または（ｄｃ） ：ホスホジエステル
結合で連結されたＣまたはｄＣ残基の重合体 ポリ（Ｉ） ：ホスホジエステル結合で連結された。。
含有血清 ＡＴＰ ：アデノシン三リン酸 オートラジオグラフ法：放射活性検出のための写真法 塩基対：２個の相補的ニュクレオチド、たとへはＡ−Ｔ
、Ｇ−Ｃ 平滑末端ニ一本願がはみ出している末端と区別して、二
本鎖ＤＮＡ分子の完全にＪｍ＆対となっている末端 ＢＳＡ ：牛血清アルブミン （ｄ）Ｃ：（デオキシ）シチジン ｃＤＮＡ ： ＲＮＡに相補的のＤＮＡｃＤＮＡプー
ル：種々の配列のｃＤＮＡの混合物コードする：ある物
についての情報を担うこと：ＤＮＡは、蛋白質のアミノ
酸配列につ いての情報をニュクレオチド配列中 に担う。 ゛ ＤＭＳＯ：ジメチルスルホキサイド ＤＮＡ ：デオキシリポ核ｒ肢 ＤＮＡ配列：ホスホジエステル結合で連結されたニュク
レオチドの直伸状配列 Ｄ″ｌ″Ｔ ：ゾチオスレイトール ＥＤＴＡ ：エチレンシニトロテトラ＊ｉ： 酸箪気
泳劫；篭場中、分子の大きさｌこより（ＤＮＡ ”４た
はＭＡ ）分子を分けること 発現 ＋ ｊ−１！を伝子の情報を転写によりｍＲＮＡ
に、ついで翻訳によりポリペプチド（蛋白１′ｉ）に変
換すること フィルターハイブリダイゼーション：ひとつのパートナ
−をフィルターに固定しておいて、核酸をハイブリダイ
ゼーションすること（ｃｌ）Ｇ ： （デオキシ）グ
アノシン遺伝子（ゾーン）：ひきつづき蛋白質に翻訳さ
れうる特異的転写（ＲＮＡ分子）に対する情報を荷うＤ
ＮＡフラグメント 遺伝子族；きわめて類似した生成物（サブ−タイ７°）
をコードする遺伝子の一族 遺伝子生成物： ＲＮＡ （転写生成物）：蛋白質（翻
訳生成物） 勾配 ニス′クロース勾配をみよ 相同性（ＤＮＡ配列の）：類似したニュクレオチド配列
を示するＤＮＡ配列のあいたの関係バイブリド：少なく
とも部分的に相補的のＤＮＡの２つの仙の安定な複合物 ハイブリダイゼーション（核酸の）：相互に相補的のＤ
ＮＡまたはＲＮＡの個々の鎖のあいたの安定な複合物の
形成 ハイブリダイゼーション標品：相補的な配列を発見する
ために用いられる放射ラベル核バイブリドシラスミ「：
外来性ＤＮＡフラグメントを含有するフ０ラスミド エ：イノシン ＩＦＮ−α二白血球インターフェロン ＩＦＮ−β：鐵維芽インターフェロン ＩＦＮ−γ：免疫インターフェロン インビトロー：試験管内 誘導（インターフェロン生理の）：、ｔｌＪ＝！ｌｉ賀
（ウィルス、二本ｌｉ ＲＮＡ ）マイトジェン処理（
こより、細月包がインターフェロンを生産するように刺
倣するこさ 開始コドン： ｍＲＮＡ上にあり、ｌ＋Ｉ＋１訳の開始
を１乙号するＡＵＧ配列 開始初合体： ｃＤＮＡ合成を開始させる、逆転与［１
１素（！： ｍＲＮＡとプライマーとの１１１合せ挿入
物、ｃＤＮＡ挿入物：バイブリドプラスミド中に見出た
される外米性ＤＮＡのフラグメント（つまりｃＤＮＡ
） クローンバンクだけの細菌に由来する細菌コロニークロ
ーンパンク、ｃＤＮＡ クローンバンク： ｃＤＮＡ挿入物を有するバイブリド
プラスミドを、すべてが含有する細菌クローンのコレク
ション クローニング：クローンの生産；ふつうバイブリドプラ
スミドを含有するクローンの生産の意味にきられている コロニーハイブリダイゼーション：フィルターに補捉し
た変性細菌コロニーを用いるハイブリダイゼーション 相補性：相互に適合すること（ＤＮＡ中のニュクレオチ
ドで：ＡはＴに相補イ〆ｌ、ＱはＣに相補性） クロスーハイプリダイセ゛−ジョン：同シではないが相
同のＤＮＡ配列のあいたのハイブリダイゼーション リゾ−ジョン：酵素りが−ゼによるＤＮＡ配列の共有結
合による連結 ミクロタイタープレー１１−１２およびＡ−Ｚの座標を
特徴きする９乙のくぼみを含有するプレート マイトジェン：細胞の核分裂（細胞分裂）を促進する物
質 分子クローニング；クローニングをみよｍＲＮ、Ａ
：メッセンジャーＲＮＡ １蛋白實をコートスるＲＮＡ 中和：抗体を用いる抗原の不法化 ｄＮＴＰ： ｄＡＴＰ 、 ｄＴＴＰ 、 ｄＣＴＧお
よびｄＧＴＰの４十Φニユクレオチドので九台ｑ勿 ニュクレオチド： ＤＮＡまたはＦＬＥＡの構成年位：
（ａ）Ａ、 （ａ）ｃ 、 （ｄ）ｏ 、 （ｄ）
ｒオリゴニュクレオチド：ホスホジエステル粘合て相互
に連結された数個のニュクレオチドオリゴ（Ｃ）：ホス
ホジエステル結合で連結されたＣ残基のオリゴマー オリゴ（ｄＴ） ：ホスホジエステル結合で連結さ第１
たｄＴ残基のオリゴマー オリゴ（ｄＴンセルロース：ポリ（Ａ）”ｌ−ｍＡのク
ロマトグラフィーのためにセルロースに結合されたオリ
ゴ（ｄＴ）残基 ＰＩＦＥＳ ：ビペラシンーＮ、シービス（２−エタン
スルホン酸 プラスミド：自動的に増殖する、環状の、染色体外にあ
る細菌性ＤＮＡ ポリ（Ａ、）または（ｄＡ） ：ホスホゾエステル結
合でポリ（Ａ）の領域を有するｍＲＮＡ ボＩＪ （Ｃ）または（ｄｃ） ：ホスホジエステル
結合で連結されたＣまたはｄＣ残基の重合体 ポリ（Ｉ） ：ホスホジエステル結合で連結された。。
工残基の重合体
ボＩＩ （１） ：ボＩＩ （Ｃ） ：鎖がポリ（１）
およびポリ（Ｃ）である二本鎖核酸 ボｌ （Ｕ） ：ホスホジエステル結合で結合されたＵ
残基の重合体 プライマー： ｃＤＮＡ合成が始まる、ＲＮＡ分子の部
分に対して相補的のオリゴニュクレオチド 標品：ハイブリダイゼーション標品 プロモーター二囲Ａポリメラーゼが結合するＤＮＡの配
列 ＲＢＳ ： １１ボゾ一ム結合配列をみよリコンビナン
トＤＮＡ ：インビトローでイ１ゴ互に結合された、（
重々の由来のＤＮＡフラグメントより成立つＤＮＡ配列 複製（ＤＮＡの） ： ＤＮＡ分子の複製制限分析二制
限エンドニュクレアーゼにより生する切れ目に関連する
ＤＮＡ分子のマツピング（ｍａｐｐｉｎｇ） 制限エンドニュクレアーゼ：あるＤＮＡ配列の部分でＤ
ＮＡ二本釦を切断する酵素 制限マツピング：制限分析をみよ 逆転写： ＲＮＡ分子をマトリックスとしそしてオリゴ
ニュクレオチドをプライマー“とするｃＤＮＡコピーの
製造 リボゾーム結合配列：リボデームに結合しうるｍＲＮＡ
の部分 ＲＮＡ ：リボ核酸 ＲＮＡポリメラーゼ： ＤＮＡに相補性のＲＮＡの一本
夕ａを合成しうる酵素 スクロース勾配： （ＲＮＡ）分子の混合物をそれらの
大きさに従って分割する手段 ＳＤＳ ：ナトリウムドデシルスルフエートスクリーニ
ング：特定の性質を求めて調べてゆくこと 配列の複軸さ：特に量のＤＮＡ中のＴｊ的に異なるＤＮ
Ａ配列の数を示ず１ｊ１１Ｉ サブ−タイプ：遺伝子族をみよ （ｄ）Ｔ ： （デオキシ）チミジン 形質転侯凶：形質転換により外来性ＤＮＡを受は入れた
細菌 形賀転換；外米性ＤＮＡをｌ１ＩＩ菌に畳入すること転
写： Ｈ＋ＲＮＡをそれに相補性のＤＮＡ配列でコピー
すること 翻訳： ｍＲＩＪＡの１１報をポリペプチド（翻訳生成
物）に変換すること トリデカニュクレオチド＋ １３１１．’ｌ＋の成分を
有するオリゴニュクレオチド トリデカニュクレオチドボゾデイプ：トリデカニユクレ
オチドでハイプリダイセ゛−ジョンすること トリス：トリスヒドロキシメチルアミノメタンＵ：ウリ
ジン ベクター：外来性ＤＮＡを細凶中に加えるためのビヒク
ル、ふつうはプラスミド ベクターハイブリド：ハイプリドブラスミドをみよ
およびポリ（Ｃ）である二本鎖核酸 ボｌ （Ｕ） ：ホスホジエステル結合で結合されたＵ
残基の重合体 プライマー： ｃＤＮＡ合成が始まる、ＲＮＡ分子の部
分に対して相補的のオリゴニュクレオチド 標品：ハイブリダイゼーション標品 プロモーター二囲Ａポリメラーゼが結合するＤＮＡの配
列 ＲＢＳ ： １１ボゾ一ム結合配列をみよリコンビナン
トＤＮＡ ：インビトローでイ１ゴ互に結合された、（
重々の由来のＤＮＡフラグメントより成立つＤＮＡ配列 複製（ＤＮＡの） ： ＤＮＡ分子の複製制限分析二制
限エンドニュクレアーゼにより生する切れ目に関連する
ＤＮＡ分子のマツピング（ｍａｐｐｉｎｇ） 制限エンドニュクレアーゼ：あるＤＮＡ配列の部分でＤ
ＮＡ二本釦を切断する酵素 制限マツピング：制限分析をみよ 逆転写： ＲＮＡ分子をマトリックスとしそしてオリゴ
ニュクレオチドをプライマー“とするｃＤＮＡコピーの
製造 リボゾーム結合配列：リボデームに結合しうるｍＲＮＡ
の部分 ＲＮＡ ：リボ核酸 ＲＮＡポリメラーゼ： ＤＮＡに相補性のＲＮＡの一本
夕ａを合成しうる酵素 スクロース勾配： （ＲＮＡ）分子の混合物をそれらの
大きさに従って分割する手段 ＳＤＳ ：ナトリウムドデシルスルフエートスクリーニ
ング：特定の性質を求めて調べてゆくこと 配列の複軸さ：特に量のＤＮＡ中のＴｊ的に異なるＤＮ
Ａ配列の数を示ず１ｊ１１Ｉ サブ−タイプ：遺伝子族をみよ （ｄ）Ｔ ： （デオキシ）チミジン 形質転侯凶：形質転換により外来性ＤＮＡを受は入れた
細菌 形賀転換；外米性ＤＮＡをｌ１ＩＩ菌に畳入すること転
写： Ｈ＋ＲＮＡをそれに相補性のＤＮＡ配列でコピー
すること 翻訳： ｍＲＩＪＡの１１報をポリペプチド（翻訳生成
物）に変換すること トリデカニュクレオチド＋ １３１１．’ｌ＋の成分を
有するオリゴニュクレオチド トリデカニュクレオチドボゾデイプ：トリデカニユクレ
オチドでハイプリダイセ゛−ジョンすること トリス：トリスヒドロキシメチルアミノメタンＵ：ウリ
ジン ベクター：外来性ＤＮＡを細凶中に加えるためのビヒク
ル、ふつうはプラスミド ベクターハイブリド：ハイプリドブラスミドをみよ
第１図は、ｃＤＮＡクローンバンク製造の模式し１であ
る。 第２図は、特異的トリデカニュクレオチドフ０ライマー
を用いることにより、１ＦＮ−αおよびＩＦＮ−β−特
異的ＤＮＡ配列をより市碗度とされたハイブリダイゼー
ション標品としてのｃＤＮＡの６陶製を模式的に示す。 第６図は、クローンバンクを、Ｎａｍａ１ｗａ旧１１座
からのトリデカニュクレオチドー開始ｃＤＮＡとコロニ
ーハイブリダイゼーションさせた粕釆を７Ｊりず。 図は、１５６６個の異なるクローンを担う、ニトロセル
ローズフィルターのオートラジオグラフィーを示す。矢
印は、トリデカニュクレオチド陽性クローンの例を示す
。 第４図は、２つのトリデカニュクレオチド陽性クローン
（クローンＰＩＨ１およびＰ２Ｈ１０）と、１９０（固
のトリデカニスクレオチド１場性クローンのすべて（ミ
クロタイタープレートＰ１およびＰ２）および対朋キし
てのランタ゛ムに選ばれたミクロタイタープレー）（Ｅ
５２）との、コロニーハイブリダイゼーション反応を示
す。 第５図は、誘導および非誘４ Ｎａｍａ１ｗａ細胞より
のポリ（Ａ）＋ＦｔＮＡといくつかのプラスミドとのフ
ィルターハイブリダイゼーションのオートラジオグラフ
ィーを示す。 ウィルス訪尋ボＩＪ （Ａ）＋ＲＩｑＡ（谷対の左側カ
ラムの１１′）および非ｖｊ ４ Ｎａｍａ１ｗａ細月
但よりのポリ（Ａ）”ＲＮＡ （谷対の右側カラム中の
ｌ ｎｌ ）は、通気泳動で分子サイズに従って分けて
からニトロセルロースフィルター上に移し、ついで、フ
ィルターと放射ラベルプラスミドＤＮＡとをハイブリダ
イゼーションさせ、オートラジオグラフィーをとった。 第６図は、本発明に準するリコンビナン） ＤＮＡ分子
の４個のＤＮＡ挿入物の’ｄｉｉｌ限マツプの比ｌ１１
ｉ：を模式的に示す。プラスミドＰｌＦ１２およびＰ２
Ｈ１０のＤＮＡ挿入物は、ＩＦＮ−βＤＮＡ １ｆｉｌ
ｌ限パターンと相同であることが示され、プラスミドＰ
１Ａ６および１Ｆ７のＤＮＡ押入物は、ＩＦＮ−αＤＮ
Ａの２つの異なるザブタイプとＡ１回性を示す。 第７図は、■ＦＮ−βＤＮＡ特異１隼をボず２つのクロ
ーン（クローンｐ １ ｐ’ １２ ｓ；よひＰ２Ｈ１
０）で同じニュクレオチド配列の部分を示す。 第８図は、ＩＦＮ−α−Ｌ）ＮＡ特異性を７廖ず２つの
押入物（クローンＰＩＡ６および１Ｆ７）の６′および
５′末端セグメントのニュクレオチド配列ヲホす。下線
を付した配列ＡＴＧはＩＩＩ＋１６Ｒのための開始コド
ンである。 代理人 浅 村 晧 第２図 ５′３′ ｍＲＮＡ ＣＡＧＴＴＣＣＡＧＡＡＧＧ
ｊ−”Ｉ ＩＡ）ｃＤＦＪＡ ” ＧＴＣＡＡＧ
ＧＴＣＴＴＣＣ−３２Ｐ５’第３図 オ６図 Ｐｖｕ Ｐａｔ ｓｇｔ ＦＮ−８ Ｐ２Ｈ，ｏＰｖｕＰａｊ ９１ Ｐ″１８°
”１ｒｔ２ｏｏｂｐ 第４図 Ａ Ｂ ＰＩＨＩ Ｐ２Ｈ１０ 第５図 ＡＢＣＤＥＦ ｉｎ ｉｎ ｉｎ 第１頁の続き ■発 明 者 マーク−ブルース・ドウオーキン アメリカ合衆国ニューヨーク州 ニューヨーク・アブト６−ジエ イ・モーニング・サイド・ドラ イブ９０ ＝ｌ 明 者 ギュンター・アドルフオーストリア国
ウィーン・ヨハ ナガツセ２Ｏ−７ （Ｃ発 明 者 ベーター・マインドルオーストリア国
ウィーン・ホラ ケガツセ６３−１ ＠発 明 者 ゲルハルト・ボドウ オーストリア国ウィーン・ベル ゴフエルガツセ２７ （老発 明 者 ベーター・スウエトリイオーストリア
国ウィーン・ヒエ ッジンガー・ハウプトストラー セ４０ビー−９ 手続補正書（方式） ％式％ １、事件の表示 昭和 ５８年特許願第 ９３８８６ 号３、補正
をする者 事件との関係 特ＩＩ出願人 ４、代理人 ５、補正命令の日付 昭和５８年 ８月 ３０日 ６、補正により増加する発明の数 ７、補正の対象
る。 第２図は、特異的トリデカニュクレオチドフ０ライマー
を用いることにより、１ＦＮ−αおよびＩＦＮ−β−特
異的ＤＮＡ配列をより市碗度とされたハイブリダイゼー
ション標品としてのｃＤＮＡの６陶製を模式的に示す。 第６図は、クローンバンクを、Ｎａｍａ１ｗａ旧１１座
からのトリデカニュクレオチドー開始ｃＤＮＡとコロニ
ーハイブリダイゼーションさせた粕釆を７Ｊりず。 図は、１５６６個の異なるクローンを担う、ニトロセル
ローズフィルターのオートラジオグラフィーを示す。矢
印は、トリデカニュクレオチド陽性クローンの例を示す
。 第４図は、２つのトリデカニュクレオチド陽性クローン
（クローンＰＩＨ１およびＰ２Ｈ１０）と、１９０（固
のトリデカニスクレオチド１場性クローンのすべて（ミ
クロタイタープレートＰ１およびＰ２）および対朋キし
てのランタ゛ムに選ばれたミクロタイタープレー）（Ｅ
５２）との、コロニーハイブリダイゼーション反応を示
す。 第５図は、誘導および非誘４ Ｎａｍａ１ｗａ細胞より
のポリ（Ａ）＋ＦｔＮＡといくつかのプラスミドとのフ
ィルターハイブリダイゼーションのオートラジオグラフ
ィーを示す。 ウィルス訪尋ボＩＪ （Ａ）＋ＲＩｑＡ（谷対の左側カ
ラムの１１′）および非ｖｊ ４ Ｎａｍａ１ｗａ細月
但よりのポリ（Ａ）”ＲＮＡ （谷対の右側カラム中の
ｌ ｎｌ ）は、通気泳動で分子サイズに従って分けて
からニトロセルロースフィルター上に移し、ついで、フ
ィルターと放射ラベルプラスミドＤＮＡとをハイブリダ
イゼーションさせ、オートラジオグラフィーをとった。 第６図は、本発明に準するリコンビナン） ＤＮＡ分子
の４個のＤＮＡ挿入物の’ｄｉｉｌ限マツプの比ｌ１１
ｉ：を模式的に示す。プラスミドＰｌＦ１２およびＰ２
Ｈ１０のＤＮＡ挿入物は、ＩＦＮ−βＤＮＡ １ｆｉｌ
ｌ限パターンと相同であることが示され、プラスミドＰ
１Ａ６および１Ｆ７のＤＮＡ押入物は、ＩＦＮ−αＤＮ
Ａの２つの異なるザブタイプとＡ１回性を示す。 第７図は、■ＦＮ−βＤＮＡ特異１隼をボず２つのクロ
ーン（クローンｐ １ ｐ’ １２ ｓ；よひＰ２Ｈ１
０）で同じニュクレオチド配列の部分を示す。 第８図は、ＩＦＮ−α−Ｌ）ＮＡ特異性を７廖ず２つの
押入物（クローンＰＩＡ６および１Ｆ７）の６′および
５′末端セグメントのニュクレオチド配列ヲホす。下線
を付した配列ＡＴＧはＩＩＩ＋１６Ｒのための開始コド
ンである。 代理人 浅 村 晧 第２図 ５′３′ ｍＲＮＡ ＣＡＧＴＴＣＣＡＧＡＡＧＧ
ｊ−”Ｉ ＩＡ）ｃＤＦＪＡ ” ＧＴＣＡＡＧ
ＧＴＣＴＴＣＣ−３２Ｐ５’第３図 オ６図 Ｐｖｕ Ｐａｔ ｓｇｔ ＦＮ−８ Ｐ２Ｈ，ｏＰｖｕＰａｊ ９１ Ｐ″１８°
”１ｒｔ２ｏｏｂｐ 第４図 Ａ Ｂ ＰＩＨＩ Ｐ２Ｈ１０ 第５図 ＡＢＣＤＥＦ ｉｎ ｉｎ ｉｎ 第１頁の続き ■発 明 者 マーク−ブルース・ドウオーキン アメリカ合衆国ニューヨーク州 ニューヨーク・アブト６−ジエ イ・モーニング・サイド・ドラ イブ９０ ＝ｌ 明 者 ギュンター・アドルフオーストリア国
ウィーン・ヨハ ナガツセ２Ｏ−７ （Ｃ発 明 者 ベーター・マインドルオーストリア国
ウィーン・ホラ ケガツセ６３−１ ＠発 明 者 ゲルハルト・ボドウ オーストリア国ウィーン・ベル ゴフエルガツセ２７ （老発 明 者 ベーター・スウエトリイオーストリア
国ウィーン・ヒエ ッジンガー・ハウプトストラー セ４０ビー−９ 手続補正書（方式） ％式％ １、事件の表示 昭和 ５８年特許願第 ９３８８６ 号３、補正
をする者 事件との関係 特ＩＩ出願人 ４、代理人 ５、補正命令の日付 昭和５８年 ８月 ３０日 ６、補正により増加する発明の数 ７、補正の対象
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 （１） 適当なＲＮＡ ｉマトリックスとして合成さ
れたｃＤＮＡよυクローンバンクを？Ａ訳し、そして、
このクローンバンクより、相互に関連がめるが必ずしも
クロス−ハイブリダイゼーションするトハ限らない２つ
または２つより多くの遺伝子のＪｉ（伝子族中に保有さ
れているオリゴニュクレオチド全ノライマーとして用い
て合成された（ｊＤＮＡを〕飄イブリダイゼーション標
品に用いるか、または、そのオリゴニュクレオチド自体
をハイブリダイゼ−ション標品に用いて、望む遺伝子生
成物の生合成のための遺伝子情報を含有するクローンを
同定し、そして、既知の方法により、同定されたクロー
ンを培養し、そして培養中に生成した遺伝子生成物を分
離することを特徴とする、上記したような２つまたは２
つより多くの遺伝子のスλ伝子生賊吻を同時に生産する
方法。 （２）Ｂ−淋巴球型の肪導されたヒト細胞よりのＲＮＡ
’ｉｉマトリックスとして合成されたｃＤＮＡよｐク
ローンバンクｆ：脚製し、このクローンバンクより、イ
ンターフェロン配列を含有するＲＮＡをマトリックスと
しそしてインターフェロン特異的オリゴニュクレオチド
をプライマーとしで合成したｃＤＮＡ ｆハイブリダイ
ゼーション標品として用いるか、または、そのオリゴニ
ュクレオチド自体をハイブリダイゼーション標品として
用いて、型αまたは型βのインターフェロンの生合成の
ための遺伝子情報を含有するクローンを同定し、そして
、既知の方法により、同定されたクローンを培養し、そ
して培養中に生成した遺伝子生成物を分離することを特
徴とする、型αおよびβのインターフェロンを同時に生
産するための、上記（１）項記載の方法０ （３）トリデカニュクレオチド５’ ｄｏＯＴＴＯＴＧ
ＧＡＡＯＴＧ３’をインターフェロン特異的オリゴニュ
クレオチドとして用いることを特徴とする、上記（２）
項記載の方法。 （４） セルストレイ７ Ｎｏ−３７、ｌ−１ｐ＋
ｍ ａ ｌ ν＋ａ 、 Ａ１［ｕｂａまたにＬＲＰＬ
汀１７８８の細胞をＢ−Ｍ・巴琢型のヒト細胞として用
いることを’ｉＭ Ｖ、＜とする、−にＢＬ２（２）お
よび（３）項記載の方法。 （５） Ｈａ ｍ ａ ｌ ｗ ａ、ｌｊ ）胞をＢ
−淋巴球型のヒト組Ｊ抱として用いることを特徴とす。 、上Ｈ己（２）および（３）項記載の方法。 （６） 型αのインターフェロンの生合成をコードす
るＤＮＡ配列が式 ％式％ の部分配列を含有する、上記（２）から（５）項までに
記載の方法。 （力 Ｂ−淋巴球型の誘導ヒト細胞よりのＲＮＡ ｆマ
トリックスとして合成されたｃＤＮＡよシのクローンバ
ンクヲ調製し、そして、インターフェロン配列含有Ｒ２
ＪＡをマトリックスに用いぞしてインターフェロンに特
異的のオリゴニ；Ｌクレオチド全ゾライマーとして合成
したｃＤＮＡ ｆハイブリダイゼーション標品に用いる
か、または、オリゴニュクレオチド自体をハイブリダイ
ゼーション標品に用い、タイプαまたはタイプβのイン
ターフェロンの合成のための遺伝子情報を含有するクロ
ーンを同定することによシ得られるＤＮＡ配列中に遺伝
子情報が含有されることを特徴とする、上口己（２）か
ら（６）項までに記載の型αまたは型βのインターフェ
ロンの合成のための遺伝子情報ヲハイブリドプラスミド
中に含有する微生物。 （８）微生物がＥｉｓｃｈｅｒｉｏｈｉａ ｃｏｌｉお
よびそれより常法で得られる変異株であることを特徴と
する。 上記（７）項記載の微生物。 （９）微生物がＥｓｃｈｅｒｉｏｈｉａ ｃｏｌｉの）
ｉＢ １０１株およびそれよシ常法で得られる変異株で
あることを特徴とする、上記（力および（８）項記載の
微生物。 ０１ ハイブリトノラスミドのｃＤＮＡ成分がＰ工Ａ
６ ＋１Ｆ７．ＰＩＦ１２またはＰ２１（１０である、
上記（７）から（９）項記載の微生物およびそれより常
法で得られる変異株。 ０υ バイブリドプラスミドがｐＢＲ３２２（ＰＳｔ）
Ｐ１Ａ６゜ｐＢＲ３２２（ＰＳｔ）１．Ｆ７＋ｐＢＲ３
２２（ＰＳｔ）”ＩＦ１２またはｐＢＲ３２２（Ｐｅｔ
）Ｐ２Ｈ１Ｑ である上記（７）かう（９）項記載の
微生物およびそれより常法で得られる変異株。 ０２ タイプαのインターフェロンの生合成全コードす
るハイブリトノラスミドｐＢＲ３２２（Ｐ日し）ＩＦ７
のＤＮＡ配列が ２０ ２７ である微生物およびそれより常法で得られる変異株Ｏ α３Ｊ Ｂ−淋巴球型のＢ４ヒト細胞より０ＲＮＡを
マトリックスとして合成さ扛たｃＤＮＡよりのクローン
バンクをＴｈｅし、そして、インターフェロン配列台ｗ
ＲＮＡをマトリックスに用いそしてインターフェロン
に特異的のオリゴニコークレオチドをプライマーとして
合成したｃＤＮＡ ’ｃノへイブリグイセ９−ジョン裸
品に用いるか、またなよ、オリゴ９ニユクレオテド目体
をハイブリダイゼーション標品に用いて、タイプαまた
はタイプβのインターフェロンの合成のための遺伝子情
報を含有するクローン全同足することにより得られるＤ
ＮＡ配列中に遺伝子情報が含Ｍされていることを特徴と
する、上記（２）から（６）項までに記載の、タイプα
またはタイプβのインターフェロンの生合成のための遺
伝子情報を含有する・・イプリｒプラスミド。 （１４）ベタター成分がｐＢＲ３２２である、上記（１
３１項記載のバイブリドプラスミド。 時 ｃＤＮＡ戟分がＰＩＡ６＋ＩＦ７．Ｐｌｌ”１２ま
たはＰ２Ｈ１０である、上記０１項記載の）・イブリド
プラスミ ド。 ｏｅ タイプαのインターフェロンのアミノ酸配列をコ
ードするＤＮＡ配列が、式 の部分配列を含鳴する、上６己０：（１項記載のバイブ
リドプラスミド。 ０７）上記ａυから（Ｉ四項までに記載のようなバイブ
リドプラスミドより分離された、タイプαまたはタイ７
”βのインターフェロンのアミノ酸配列をコードするＣ
ＤＮＡ。 （１８１微生物、なるべくはＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ
ｃｏｌｉ ｆ、上記０迦から０５１項までに記載のよう
な〕−イブリドプラスミドで転換することを特徴とする
、上ａ己（７（からｕり項までに記載の微生物の製造方
法。 （１１プラスミド、なるべくはプラスミドｐＢＲ３２２
を上記α７）項に記載のようなｃＤＮＡと組合わせるこ
とを特徴とする、上記圓から（１５）項までに記載の／
・イブリドプラスミドの製造方法。 （２０） ヒト細胞よｐ ＲＮＡを得、それよＶ）
ｍＲＮＡ ｆ＜分離し、そして、そのｍＲＮＡ ｆ用い
て、既知の方法でｃＤＮＡを製造することを特徴とする
、上記α９項記載のｃＤＮＡの製造方法。
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Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS61282098A (ja) * | 1985-04-27 | 1986-12-12 | ベ−リンガ− インゲルハイム インタ−ナシヨナル ゲゼルシヤフト ミツト ベシユレンクテル ハフツンク | α−インタ−フエロンの製造方法 |
| JPH083791B2 (ja) * | 1985-11-27 | 1996-01-17 | モトロ−ラ・インコ−ポレ−テッド | データプロセッサ制御装置 |
Families Citing this family (30)
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|---|---|---|---|---|
| DE3247922A1 (de) * | 1982-12-24 | 1984-06-28 | Boehringer Ingelheim International GmbH, 6507 Ingelheim | Dna-sequenzen, deren herstellung, diese sequenzen enthaltende plasmide und deren verwendung zur synthese eukaryotischer genprodukte in prokaryoten |
| CA2025180A1 (en) * | 1989-10-12 | 1991-04-13 | William G. Weisburg | Nucleic acid probes and methods for detecting pathogenic candida yeasts |
| US6685933B1 (en) | 1998-07-28 | 2004-02-03 | The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services | Interferon α hybrids |
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| DE3106982A1 (de) * | 1981-02-25 | 1982-09-09 | Dr. Karl Thomae Gmbh, 7950 Biberach | "neues tridecadeoxynukleotid, verfahren zu seiner herstellung und verwendung" |
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Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| EUR.J.CELL.BIOL=1981 * |
| NUCLEIC ACIDS RESEARCH=1981 * |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS61282098A (ja) * | 1985-04-27 | 1986-12-12 | ベ−リンガ− インゲルハイム インタ−ナシヨナル ゲゼルシヤフト ミツト ベシユレンクテル ハフツンク | α−インタ−フエロンの製造方法 |
| JPH083791B2 (ja) * | 1985-11-27 | 1996-01-17 | モトロ−ラ・インコ−ポレ−テッド | データプロセッサ制御装置 |
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