DK164742B - Dna-sekvens, der koder for ifn-alfa2(arg), pbr322-plasmid indeholdende en saadan dna-sekvens, fremgangsmaade til fremstilling af en klon indeholdende naevnte plasmid, og tilsvarende mikroorganisme, samt fremgangsmaader til fremstilling af henholdsvis ifn-alfa2(arg), naevnte mikroorganisme og naevnte dna-sekvens - Google Patents

Description

DK 164742 B

Den foreliggende opfindelse angår et polydeoxy-ribonucleotid (DNA-sekvens), der koder for IFN-a2(Arg), et pBR322-plasmid indeholdende en sådan DNA-sekvens, en fremgangsmåde til fremstilling af en klon indehol-5 dende nævnte plasmid, og en tilsvarende mikroorganisme, samt fremgangsmåder til fremstilling af henholdsvis IFN-a2(Arg), nævnte mikroorganisme og nævnte DNA-sekvens.

Fra litteraturen kendes tre typer af humane interferoner, nemlig leukocyt-interferon (interferon-a, 10 kort betegnelse: IFN-a), fibroblast-interferon (interferon- β, kort betegnelse: IFN-β) og immuninterferon (inter feron-γ, kort betegnelse: IFN-γ) (se W. E. Stewart II "The Interferon System", Springer-Verlag, Wien-New York, 2. oplag (1981)). Humane leukocytter eller humane myelo-15 blastoide celler, som er stimuleret med virus, producerer leukocyt-interferon, humane fibroblaster, som er induceret med virus eller en egnet nucleinsyre, producerer fibroblast-interferon, og humane T-lymfocytter, som er induceret med mitogen, f.eks. concanavalin, producerer 20 immuninterferon.

Desuden er det kendt, at humane celler af B-lym-focyttypen, som de f.eks. repræsenteres af cellelinierne NC-37, Namalwa, Akuba eller RPMI 1788, efter stimulering med virus samtidig producerer leukocyt-interferon og fi-25 broblast-interferon (se Journal of General Virology 38, 51-59 (1977)). Herved kan mængdeforholdene for produceret IFN-a og IFN-β varieres alt efter valget af induktionsbetingelserne (se Journal of Interferon Research 2, 575-585 (1982)). F.eks. opnår man ud fra med Sendai- 30 virus inducerede celler forskellige cellelinier med følgende mængdeforhold for IFN-a og IFN-β:

DK 164742 B

2

Procent interferonaktivitet, neutrali-Cellelinie seret med specifikke antisera mod IFN-α IFN-β IFN-α + IFN-β 5 Namalwa 52 34 ^98 NC-37 40 52 ^97

Akuba 85 27 ^98 RPMI 1788 68 29 ^98 1 ® Endvidere gav molekylær kloning af IFN-a-gener fra leukocytter (se Nature 284, 316-320 (1980); Science 209, 1343-1347 (1980) og EP-A1-0.032.134) og fra myelo-blastoide celler (se Nature 287, 411-416, (1980), ibid 290, 20-26 (1981) og GB-A-2.079.291) det resultat, at 15 IFN-α kodes ved hjælp af en genfamilie, som består af mindst 10 fra hinanden skelnelige gener, hvilket igen har til følge, at genprodukterne af disse DNA-sekvenser ikke udgør et ensartet protein, dvs. at IFN-cc udgør en blanding af hinanden lignende proteiner. Disse subtyper 20 betegnedes i litteraturen som IFN-a 1,2,3 ..... (se

Nature 287, 401-408 (1980) og Gene 15, 379-394 (1981) eller LeIFN A, B, C ..... (se Nature 290, 20-26 (1981).

I modsætning hertil fandtes der for IFN-β en ensartet DNA-sekvens, dvs. at kun et enkelt gen koder for fibroblast-interferon, og der kendes derfor heller ikke 25 nogen subtyper (se Nature 285, 542-547 (1980)).

Selv om der, i modsætning til hvad der er tilfældet inden for IFN-a-genfamilien, ikke finder nogen krydshybridisering sted mellem IFN-a-gener og ΙΡΝ-β-ge-net, udviser sekvenserne ca. 45% homologi (se Nature 285, 30 547-549 (1980)). Herved er det længste sekvensafsnit, ved hvilket der består fuldstændig homologi mellem de (5 af 7) funktionelle IFN-a-gener og IFN-8-genet, 13 nucleotider langt.

Dette tridecanucleotid med formlen 35 5'-dCCTTCTGGAACTG-3' beskrives i European Journal of Cell Biology 25_, 8-9 (1981), idet det samtidig foreslås at anvende dette syn-

DK 164742B

3 tetiske tridecanucleotid eller et cDNA, der er blevet syntetiseret med dette tridecanucleotid som primer, som hybridiseringsprøvemiddel for at gennemsøge en Namalwa-celle cDNA-klonbank og identificere de kloner, der inde-5 holder interferonsekvenser.

De IFN-a-gener, der indeholder dette tridecanucleotid, er LeIFN B, C, D, F og G; i LeIFN A og H er der derimod kun 12 af de 13 nucleotider tilstede (se Nature 290, 20-26 (1981)).

10 I GB-A-2 068 970 er det analogt foreslået at an vende udvalgte oligonucleotider, f.eks. et oligonucleo-tid, hvis sekvens er fælles med fibroblast- og leukocyt-interferongenet, for at registrere og isolere forskellige interferongener, der er indeholdt i humane kromosom-15 genbanker eller er tilstede i en restriktionsoplukning af totalt genomisk DNA.

Desuden foreslås det i EP-A-0 076 489 at anvende et radioaktivt mærket, syntetisk oligonucleotid, f.eks. det ovennævnte tridecanucleotid, eller et radioaktivt 20 mærket a- og B-specifikt IFN-cDNA, f.eks. et cDNA, der er blevet syntetiseret med det nævnte tridecanucleotid som primer, som prøvemiddel (sonde) til identificering af kolonier, der indeholder kromosomale IFN-α- og IFN-S-gener.

25 Ved hjælp af det ovenfor nævnte tridecanucleotid kan man under anvendelse af den ovenfor nævnte metode finde den hidtil ukendte klon IF7, der koder for det hidtil ukendte IFN-a2(Arg). Denne klon indeholder den for IFN-a2(Arg) kodende delsekvens med formlen 30 120 C CTG GCA CAG ATG AGG AGA ATC TCT CTT TTC TCC 153 TGC TTG AAG GAC AGA CGT GAC TTT GGA ITT CCC CAG GAG GAG 195 TTT GGC AAC CAG TTC CAA AAG GCT GAA ACC ATC CCT GTC CTC 237 CAT GAG ATG ATC CAG CAG ATC TTC AAT CTC TTC AGC ACA AAG 279 GAC TCA TCT GCT GCT TGG GAT GAG ACC CTC CTA GAC AAA TTC 321 TA 323 35 der koder for den i IFN-a2(Arg) indeholdte delsekvens med formlen

DK 164742 B

4

Leu Ala Gin Met Arg Arg Ile Ser Leu Phe Ser 28 Cys Leu Lys Asp Arg Arg Asp Phe Gly Phe Pro Gin Glu Glu 42

Phe Gly Asn Gin Phe Gin Lys Ala Glu Thr Ile Pro Val Leu 56

His Glu Met Ile Gin Gin Ile Phe Asn Leu Phe Ser Thr Lys 70

Asp Ser Ser Ala Ala Trp Asp Glu Thr Leu Leu Asp Lys Phe 84 5 Dette hidtil ukendte IFN-a2(Arg) adskiller sig fra alle i Nature 287, 408-41 1 ( 1980) beskrevne interferoner- med hensyn til området af aminosyrer nr. 18-84, nemlig ved at have Arg i stillingerne 23 og 34.

IFN-a2(Arg), der senere er blevet betegnet som 10 IFNa-2c, udmærker sig fremfor de to kendte, genteknologisk fremstillede a2-interferoner IFNa-2a (= LeIFN A i Nature 290, 20-26 (1981))og IFNa-2b (= IFN-a2 i Science 209, 1343-1347 (1980)) ved en væsentlig ringere antige-nicitet.

15 Opfindelsen angår primært et polydeoxyribonucleo- tid, der koder for IFN-a2(Arg), hvilket nucleotid er ejendommeligt ved, at det svarer til en sekvens, der foreligger i Pstl-indføjelsen i det som pBR322(Pst)1F7 betegnede plasmid, der er deponeret i E. coli HB101 ved 20 Deutsche Sammlung von Mikroorganismen under DSM-nummer 2362. En speciel DNA-sekvens er angivet i krav 2.

Opfindelsen angår desuden et pBR322-plasmid som angivet i krav 3 og 4.

Opfindelsen angår endvidere en fremgangsmåde 25 til fremstilling af en klon, der indeholder et pBR322-plasmid ifølge opfindelsen, hvilken fremgangsmåde er ejendommelig ved det i krav 5's kendetegnende del angivne.

Opfindelsen angår yderligere en mikroorganisme 30 som angivet i krav 6 og 7, og specielt E. coli transformeret med et plasmid ifølge opfindelsen.

Opfindelsen angår ydermere en fremgangsmåde til fremstilling af IFN-a2(Arg), en fremgangsmåde til fremstilling af en mikroorganisme ifølge opfindelsen og en 35 fremgangsmåde til fremstilling af et DNA ifølge opfindelsen som angivet i henholdsvis krav 9, 10 og 11.

DK 164742 B

5

Ved den praktiske udførelse af opfindelsen kan man gå frem på følgende måde.

De udvalgte celler denatureres hensigtsmæssigt på tidspunktet med maksimal IFN-mRNA-syntese, hensigtsmæs-5 sigt 6-12 timer, dog fortrinsvis 9 timer, efter virusinduktionen. Efter fraskillelse af cellekærnerne renses RNA'et fra cellecytoplasmaen ved phenolekstraktion og alkoholfældning, og ved oligo(dT)-cellulose-chromatogra-fi isoleres derefter poly(A)+RNA'et, og dette beriges 10 ved gradientcentrifugering med hensyn til interferonspecifikke sekvenser (se venstre spalte i fig. 1).

Det således rensede poly(A)+RNA anvendes som matrice til fremstilling af enkeltstrenget cDNA ved hjælp af enzymet revers transkriptase. Den med denne enkelt-15 DNA-streng komplementære anden DNA-streng syntetiseres ved hjælp af DNA-polymerase I. cDNA-syntesen og syntesen af den komplementære anden DNA-streng foregår i en opløsning, som indeholder deoxynucleosidtriphosphatet af adenosin, thymidin, guanosin og cytidin. Den opnåede 20 dobbeltstrengede cDNA-blanding modificeres derefter i begge strengender ved hjælp af enzymet SI nuclease på en sådan måde, at overhængende enkeltstrengsregioner fjernes, og ved hjælp af gradientcentrifugering isoleres hvert dobbeltstrenget DNA-molekyle, som indeholder 25 mindst 600 basepar. Den således opnåede cDNA-blanding forlænges med ca. 15 nucleotider ved hjælp af enzymet terminal transferase ved oligodeoxycytidin-tillejring i 3'-enden af begge strenge, hvormed en del af syntesen af rekombinant-molekyler er gennemført (se venstre spalte i 30 fig. 1) .

Som anden komponent lineariseres et cirkulært dobbeltstrenget plasmid, der fortrinsvis stammer fra Escherichia coli, f.eks. Escherichia coli plasmid pBR322, ved hjælp af restriktionsendonuclease Pst I og 35 modificeres analogt med cDNA-blandingen ved tillejring af oligodeoxyguanidin til 3'-enden af molekylet på en

DK 164742 B

6 sådan måde, at der dannes overhængende oligodeoxyguani-dinender. Disse ender kan med de frie oligodeoxycytidin-ender i cDNA-molekylerne danne stabile DNA-dobbelt-strengsregioner (se højre spalte i fig. 1).

5 Med de således fremstillede hybridplasmider, f.

eks. af pBR322 og cDNA, transformeres en mikroorganisme som vært, f.eks. Escherichia coli HB 101, hvori replika-tionen og ekspressionen af dette DNA foregår.

Blandt de således fremstillede kloner påvises nu 10 dem, der indeholder for IFN-ot eller for IFN-β specifikke sekvenser, ved kolonihybridisering. Som prøvemiddel tjener radioaktivt mærket cDNA, som syntetiseres ved revers transkription af IFN-mRNA-holdigt RNA med det for interferonsekvenser specifikke tridecanucleotid 15 5'dCCTTCTGGAACTG3' som primer. Hertil mærkes trideca- 32 nucleotidet radioaktivt i enden, fortrinsvis med γ- P-ATP og T4-polynucleotid-kinase. Fremstillingen af initieringskomplekset for revers-transkriptase-reaktionen med et overskud af det mærkede tridecanucleotid og 20 poly(A)+RNA fra Sendaivirus-inducerede celler foregår analogt med de ovenfor beskrevne betingelser (se fig. 2).

Et således fremstillet cDNA bærer således kun en radioaktiv mærkning, når initieringskomplekset for revers-transkriptase-reaktionen med tridecanucleotidet har 25 fundet sted, da jo mærkningen udelukkende er indeholdt i dette segment. Herved sikres ifølge opfindelsen en høj selektivitet for erkendelsen af DNA1et med en med tridecanucleotidet komplementær DNA-sekvens og dermed for ex- og β-interferon-DNA. Synliggøreisen af de transfor-30 merede bakteriekolonier, der indeholder hybridplasmider med med det anvendte tridecanucleotid komplementære DNA-sekvenser, foregår ved autoradiografi (se fig.3). På denne måde isoleredes fra ca. 13.000 transformerede bakteriekloner 190 kloner, som med det med tridecanucleoti-35 det initierede cDNA gav et positivt signal, dvs. ca. 1% af alle kloner i genbanken indeholder den specifikke sekvens dCCTTCTGGAACTG.

DK 164742 B

7 Påvisningen af de interferonspecifikke nuclein-syresekvenser i rekombinant-DNA-molekylerne foregår ved RNA-transfer-hybridisering, hybridisolering, restriktionskortlægning og nucleinsyresekvenering. Den biolo-5 giske påvisning af de dannede inferferonpolypeptider foregår ved bestemmelse af den antivirale aktivitet, og bestemmelsen af interferontypen foregår ved immunologiske metoder.

Det på denne måde isolerede .IFN-a2(Arg)-gen kan 10 derefter bringes til ekspression i bakterier, men også i andre organismer, som f.eks. gær, hvorhos der ved indskydning af en promotor i kombination med en ribosombindingssekvens kan opnås værdier på op til ca. 104 gange den spontane ekspression.

15 Opfindelsen forklares nærmere under henvisning til tegningen, der viser følgende:

Fig. 1 er en skematisk gengivelse af fremstillingen af en cDNA-klonbank.

20 Fig. 2 er en skematisk gengivelse af fremstillin gen af et cDNA som hybridiseringsprøvemiddel, der med hensyn til dets indhold af IFN-a og IFN-fS-specifikke DNA-sekvenser er beriget ved anvendelse af en specifik tridecanucleotidprimer.

25

Fig. 3 viser resultatet af kolonihybridisering af en klonbank med tridecanucleotid-initieret cDNA fra Namalwaceller. Gengivelsen viser et autoradiografi af et nitrocellulosefilter, som bærer 1536 forskellige klo-30 ner. Pilen viser et eksempel på en tridecanucleotidpositiv klon.

Fig.4 viser autoradiografiet af en filterhybri-disering af Poly(A)+RNA fra inducerede og ikke-induce-35 rede Namalwaceller med plasmid P1A6. Det virusinducerede Poly(A)+RNA ("i" i den venstre spalte) og Poly(A)+RNA'et fra ikke-inducerede Namalwacel ler ("n" in den højre spalte) adskiltes ef-

DK 164742 B

8 ter molekylstørrelse ved elektroforese, før der blev foretaget overføring til nitrocellulosefiltre, hybridise-ring af filtrene med radioaktivt mærket plasmid-DNA og derefter autoradiografi.

5

Fig. 5 viser den skematiske sammenligning af restriktionskortene for fire DNA-indføjeiser ud fra re-kombinant-DNA-molekyler ifølge den foreliggende opfindelse. DNA-indføjelserne i plasmiderne P1A6 og 1F7 udgør 10 kodende DNA-sekvenser for to forskellige subtyper af IFN-a.

Fig. 6 viser nucleotidsekvenserne for 3'-og 5'-terminale segmenter i to indføjelser med IFN-a-DNA-spe-15 cificitet (klonerne P1A6 og 1F7). Den understregede sekvens ATG er startkodonen for translationen.

Opfindelsen belyses nærmere ved hjælp af de efterfølgende eksempler.

20

Eksempel A

Udvælgelse af en egnet cellelinie til produktion af poly (A)+RNA, som indeholder humant IFN-α- og IFN-p-mRNA.

Forskellige humane cellelinier induceredes med 25 sendaivirus til interferonproduktion efter fra litteraturen kendte fremgangsmåder, og ud fra den over cellerne stående væske efter 24 - 48 timer bestemtes indholdet af IFN-α og IFN-β ved neutralisation med typespecifikke antisera. De fundne mængdeforhold mellem IFN-α og IFN-β 30 hos nogle af de testede cellelinier er anført i tabellen på side 1. Derved viser det sig, at Namalwa-celler f. eks. producerer noget mere end 50% IFN-α og op til ca.

50% IFN-β efter induktion med Sendaivirus.

Neutralisationstesten udførtes som følger: 35 Ca 10 interferon-enheder fra den overliggende væske for de med Sendaivirus inducerede cellekulturer inkuberedes 60 - 90 minutter ved 37°C med:

DK 164742 B

9 1. Antiserum mod IFN-α ; endelig fortynding 1:100; (opnået fra Research Resources Branch, National Institutes of Allergy and Infections Deseases, Be-thesda Md, USA).

5 2. Antiserum mod humant 3~IFN; endelig fortynding 1:300; (opnået fra Dr. Y.H.Tan, University of Calgary, Canada).

3. Blanding af 1. og 2.

Efter inkuberingen bestemtes rest-interferonakti-10 viteten ved plaguereduktionstesten (se Journal of Interferon Research 2, 575-585 (1982)).

Eksempel B

Fremstilling af poly(A)+RNA, som indeholder humant IFN-o-15 og IFN-3-mRNA, ud fra med Sendaivirus inducerede Namal-waceller.

Dyrkningen af Namalwaceller og induktionen med Sendaivirus foregik efter fralitteraturen kendte metoder (se Methods in Enzymology, Vol 78a, pp 69-75 (1981), 20 Academic Press, New York). Tidspunktet for mRNA-præpa-rationen valgtes til 9 timer (6-12 timer) efter induktionen med sendaivirus, da andelen af interferonspecifikt mRNA efter dette tidsrum når et maksimum.

Cellerne fracentrifugeredes i 20 minutter ved 25 1000 g, vaskedes én gang i NP-40-puffer (0,14 M NaCl, 1,5 mM MgCl2, 10 mM Tris-HCl, pH 7,4) og resuspendere-des i NP-40-puffer med 0,5% af det ikke-ioniske deter-

DK 164742B

10 gent NP-40 (Shell) og 2 mg/ml bentonit. Efter 5 minutter i isbad pelleteredes cellekærnerne ved centrifugering som ovenfor, den (RNA-holdige) cytoplasmatiske fraktion (den overstående væske) ekstraheredes efter tilsæt-5 ning af 2% SDS, 5 mM EDTA og 50 mM Tris-HCl, pH 9, 3 x med phenol-chloroform og 1 gang med chloroform, og RNA'et fældedes derefter med alkohol. Poly(A)+RNA rensedes ved en fra litteraturen kendt metode (Proc.Natl. Acad. Sci.

USA, 69, 1408-1412 (1 972)) ved oligo- (dT)-cellulose-10 chromatografi og adskiltes efter molekylstørrelse ved centrifugering i en 5-20 % saccharosegradient i 10 mM natriumacetatpuffer, pH 5,5, 1 mM EDTA (20 timer ved 25.000 o/m med en Spinco SW 27-rotor), og molekyler af størrelsesordenen mellem 6 S (sedimentationsenheder) og 15 18S (for nemheds skyld betegnet "12S-RNA") samledes (se venstre side i fig. 1).

Indholdet af interferonspecifikt mRNA (IFN-a- og IFN-3-mRNA) bestemtes ved mikroinjektion af "12S-RNA" i Xenopus laevis-Oocyter (se J. Embryol. and Exper. Morph.

20 20, 401-414 (1968)) og måling af interferonaktiviteten i den over oocyternestående væske. Derved gav 1 μg injiceret "12S-RNA" en gennemsnitlig interferontiter på ca.

1000 internationale interferonenheder (I.E.) beregnet på interferonstandarden 69/19: 25 _______

Procent interferon- ' aktivitet neutrali-

Enheder seret med antisera Mængde "12S"-Poly (A)* interferon mod: 30 RNA fra Sendaivirus- pr. ml over inducerede Namalwa- oocyterne IFN-α IFN-a + IFN-β celler stående væske 1 //g 1.000 80 > 98

Ca. 80% af denne aktivitet kunne således neutraliseres med antiserum mod interferon af α-typen, medens den totale aktivitet kun kunne neutraliseres med en 35

DK 164742B

1 1 blanding af anti-α- og anti-B-interferon-antiserum.

Eksempel C

Fremstilling af en Namalwa-cDNA-klonbank.

5 Poly(A)+RNA'et, som har en molekylstørrelse mel lem 6-18S ("12S-RNA'') (se eksempel B) anvendtes som matrice til fremstilling af enkeltstrenget cDNA, idet 40 ug/ml poly(A)+RNA inkuberedes i 45 minutter ved 44-45°C i 50 mM Tris-HCl, pH 8,3, 10 mM MgCl2, 100 mM KC1, 10 1 mM dNTPs, 0,4 mM DTT, 4 mM Na-pyrophosphat, 20 μg/άnl oligo (dT)^2_-|8 (Pb-Biochemicals) , 25 ug/ml actinomycin D med 100 enheder/ml AMV Revers Transkriptase (Dr. J.

Beard, Life Sciences, Inc. 1509½ 49^ Street, South, St. Petersburg, Florida 33707, USA). Derefter fjernedes 15 RNA-delen af RNA-DNA-hybridet ved én times inkubering i 0,3 M NaOH ved 50°C, hvorefter det enkeltstrengede cDNA neutraliseredes og fældedes med ethanol.

Den med enkelt-DNA-strengen komplementære anden DNA-streng syntetiseredes under følgende betingelser: 30 20 μg/ml enkeltstrenget cDNA inkuberedes i 0,12 M kalium-phosphatpuffer, pH 6,9, 10 mM MgCl2, 10 mM DTT, 1 mM dNTPs med 300 enheder/ml DNA polymerase I (Boehringer Mannheim), i 6 timer ved 15°C og ekstraheredes derefter med phenol og fældedes med ethanol.

25 Den således fremstillede dobbeltstrengede cDNA- blanding modificeredes i de to strengender på en sådan måde, at overhængende enkeltstrengsregioner fjernedes.

Dertil inkuberedes DNA'et i 30 minutter ved 37°C i 0,3 M NaCl, 30 mM natriumacetat, pH 4,5, 1 mM ZnCl2 med 30 1250 enheder/ml S1-nuclease (Miles Laboratories), og der efter ekstraheredes der med phenol og fældedes med ethanol. Det således fremstillede "stumpendede" dobbeltstrengede cDNA adskiltes i en 5-20% saccharosegradient i 10 mM natriumacetatpuffer, pH 5,5, 1 mM EDTA, og man 35 isolerede de fraktioner, som udviste en længde på mindst 600 basepar.

Af denne cDNA-blanding blev 0,5 μg ved oligodeoxy-cytidintillejring til 3'-enden i begge strenge, ved in-

DK 164742 B

12 kubering i 140 mM kaliumcacodylat, pH 6,9, 30 mM Tris- HC1, pH 6,9, 2inM C0CI2, 0,1 mM DTT, 0,1 mg/ml BSA, 5 μΜ dCTP med 500 enheder/ml terminal transferase, i 4 minutter ved 37°C, forlænget med ca. 15 nucleotider. Med 5 dette skridt er cDNA-blandingen, som én bestanddel af rekombinant-molekylet, færdiggjort (se venstre side i fig. 1).

Som anden komponent anvendtes Escherichia coli-plasmidet pBR322, et cirkulært dobbeltstrenget DNA-mole-10 kyle. En delmængde på 2 ug pBR322 lineariseredes ved hjælp af restriktionsendonuclease Pst I og modificeredes på lignende måde som cDNA-blandingen ved tillejring af oligodeoxyguanidin til 3'-enderne af molekylet, således at der frembragtes overhængende oligodeoxyguanidinender 15 (højre side i fig. 1). Disse oligodeoxyguanidinender kan ved baseparring med de frie oligodeoxycytidinender i cDNA-molekylet give stabile DNA-dobbeltstrengsregioner.

Dertil inkuberes de to komponenter til denne reaktion i 0,1 M NaCl, 1 mM EDTA, 20 mM Tris-HCl, pH 8, i ti mi-20 nutter ved 65°C, derefter i 2,5 timer ved 45°C, og derpå natten over ved 37°C.

Ved denne metode regenereres Pst I restriktions-endonuclease-spaltningsstedet og kan fremtidig benyttes til at udskære cDNA-indføjelsen fra vektorhybridet.

25 De ved denne metode fremstillede hybridplasmider af pBR322 og Namalwa-cDNA anvendtes til transformation af Escherichia coli HB 101 ved en fra litteraturen kendt metode (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 69, 2110-2114 (1972)).

Med denne metode opnåedes 30.000 kloner af transforme-30 rede E.coliceller og fordeltes enkeltvis i mikrotiter-plader.

Eksempel D

Fremstilling af et med hensyn til IFN-ot- og IFN-3-DNA-35 sekvenser specifikt hybridiseringsprøvemiddel under anvendelse af et syntetisk tridecanucleotid S'dCCTIOrGGAACTGS1.

Den til grund for den foreliggende opfindelse liggende selektionsmetode for transformerede E.coli kloner, der in-

DK 164742 B

13 deholder interferonsekvenser, er baseret på anvendelsen af et syntetisk tridecanucleotid med sekvensen: 5'dCCTTCTGGAACTG3'. Denne sekvens udgør det længste, u- afbrudte DNA-segment, i hvilket der foreligger homologi 5 mellem de fleste IFN-a-gener og IFN-Ø-genet. Syntesen af tridecanucleotidet er allerede beskrevet. Trideca-

nucleotidet mærkedes i 50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 10 mM

32

MgCl2, 5 mM DTT, 0,1 mM spermidin, 1 μΜ Ρ-γ-ΑΤΡ med 60 enheder/ml T4-polynucleotidkinase (Bethesda Research 10 Laboratories) i 30 minutter ved 37°C til en specifik aktivitet på ca. 500 Ci/mmol i 5'-enden af molekylet.

Dette endemærkede tridekanucleotid anvendtes som primer til (enkeltstrenget) cDNA-syntese, idet poly(A)+-RNA fra Sendaivirus-inducerede Namalwaceller (se eksem-15 pel B) tjente som matrice. Reaktionen udførtes ved et 5-10 gange molært overskud af primer i forhold til RNA i 50 mM Tris-HCl, pH 8,3, 60 mM KC1, 5 mM DTT, 50 μ9/ιη1 actinomycin O, 4 mM MgCl2, 4 mM natriumpyrophosphat, 0,5 mM dNTPs med 100 enheder/ml AMV Reverse Transkripta-20 se, i 90 minutter ved 37°C. Efter fjernelse af RNA-de-len fra RNA-DNA-hybridet ved én times inkubering i 0,3 M NaOH ved 50°C og efterfølgende neutralisation med 0,3 M eddikesyre er cDNA'et anvendeligt som hybridiserings-prøvemiddel. En skematisk fremstilling af denne frem-25 gangsmåde er gengivet i fig. 2. Et således fremstillet cDNA bærer følgelig kun den radioaktive mærkning i molekyler, der er blevet syntetiseret ud fra det interferonspecifikke tridecanucleotid som primer, og viser dermed en høj specificitet for erkendelsen af interferon-DNA-30 sekvenser ved hybridiseringer.

Eksempel E

Kolonihybridisering med tridecanucleotid-primet cDNA.

Den her gengivne metode tjener til erkendelse af 35 de transformerede bakteriekloner, som indeholder hybrid-plasmider med med tridecanucleotidet komplementære DNA-sekvenser. Dertil overførtes celler af enkelte klonede transformanter til 22 x 15 cm nitrocellulosefiltre (po-

DK 164742 B

14 restørrelse 0,45 μιη, Millipore eller Schleicher &

Schuell), dyrkedes til en kolonistørrelse på 2 mm i diameter på filtrene og forberedtes efter en fra litteraturen kendt metode til kolonihybridiseringen (Proc. Natl.

Acad. Sci. USA 72/ 3961-3965 (1975) og Analytical Bio-5 chemistry 9j5, 60-63 (1979)). Nucleinsyrehybridiseringen med endemærket cDNA (se eksempel D) udførtes i 48 timer ved 37°C i 50% formamid, 4 x SET (1 x SET = 0,15 M NaCl, 5 mM EDTA, 50 mM Tris-HCl, pH 8), 1 x Denhardt's opløsning (0,02% BSA, 0,02% Ficoll, 0,02% polyvinylpyr-10 rolidon), 0,5 mg/ml denatureret og overskåret laksesperma DNA, 0,1% natriumpyrophosphat og 0,1% SDS. Filtrene vaskedes derefter i en opløsning bestående af 50% formamid og 0,2 x SSC (1 x SSC = 0,15 M NaCl, 0,015 M natriumcitrat) ved 20-25°C i flere timer (6-8 timer) og skylledes 15 derefter med en opløsning af 1 x SSC. Filtrene tørredes ved 20-25°C og eksponeredes ved -70°C med en røntgenfilm (Kodak XR). Fig. 3 viser et typisk resultat af et sådant forsøg; På den afbildede flade dyrkedes 1536 bakteriekolonier og screenedes ved kolonihybridisering. Pi-20 len viser et eksempel på en transformeret bakterieklon, hvis hybridplasmid-DNA giver et signal med det radioaktive prøvemiddel. Ved screening af ca. 13.000 transformerede bakteriekolonier isoleredes der 190 kloner, som med det med tridecanucleotidet initierede cDNA fra Sen-25 daivirus-inducerede Namalwaceller gav et positivt signal: de samledes på 2 mikrotiterplader (P1 og P2). Ifølge dette indeholdt ca. 1% af alle kloner i klonbanken den specifikke sekvens dCCTTCTGGAACTG.

30 Eksempel F

Analyse af sekvenskompleksiteten af de med tridecanucleo-tid-primet cDNA hybridiserede kloner.

For at fastslå antallet af kloner med forskellig sekvens (sekvenskompleksitet) i de 190 tridecanucleotid-35 positive kloner (se eksempel E), isoleredes fra forskellige kloner cDNA-indføjelserne ved Pst I-digestion (se eksempel C), elektroforese i 0,8% agarosegeler og elue-

DK 164742 B

15 ring af de ønskede bånd (ved udskæring af det båndene indeholdende gelstykke og elektroforetisk eluering af DNA'et fra agarosen i en dialyseslange) og mærkedes ved 32 nick-translation med P ved en fra litteraturen kendt 5 metode (J. Mol. Biol. 1_1_3, 237-251 (1977)). Aftryk af de tridecanucleotid-positive kloner (mikrotiterpladerne P1 og P2) og af en vilkårlig valgt mikrotiterplade (E52) overførtes til nitrocellulosefiltre, opformeredes, forberedtes til kolonihybridisering (se eksempel E) og hy- 32 10 bridiseredes med de forskellige P-mærkede cDNA-indfø-jeiser. Hybridiseringerne udførtes som beskrevet i eksempel E, bortset fra at der til hybridiseringsopløs-ningen også sattes 50 μg/ml poly(U) og 10 ug/ml poly(I): poly (C), og at filtrene efter hybridiseringen vaskedes 15 i 50% formamid og 1 x SSC.

Klon P1A6 analyseredes på denne måde og hybridi-serede til enhvert tid kun med sig selv.

Eksempel G

20 RNA-transfer-hybridiseringer.

For at finde ud af om en bestemt tridecanucleo-tid-positiv bakterieklon kunne indeholde interferonsekvenser, afprøvedes det, om dens plasmid-DNA hybridise-rer med et i Namalwaceller med Sendaivirus induceret 25 mRNA. Dertil isoleredes poly(A)+RNA fra inducerede og ikke-inducerede Namalwaceller analogt med den i eksempel B angivne måde, denatureredes ved inkubering i en time ved 50°C i 1 M glyoxal, 50% DMSO, 10 mM natriumphosphat-puffer, pH 7, adskilles på en 1,4% agarosegel, overføres 30 efter en fra litteraturen kendt metode (Proc. Nat. Acad.

Sci. USA 22, 5201-5205 (1980)) til nitrocellulosefiltre 32 og hybridiseres med ved nick-translation P-mærket (se eksempel F) plasmid-DNA. Plasmid-DNA, der stammer fra et induceret gen, vil i denne forsøgsanordning kun hy-35 bridisere med RNA fra inducerede celler, men ikke med RNA fra uinducerede celler. Fig. 4 viser autoradiogra-fiet af et sådant forsøg: induceret RNA ("i") er i den venstre spalte, og ikke-induceret RNAC'n")

DK 164742 B

16 i den højre spalte. Det til hybridiseringen anvendte plasmid-DNA P1A6 hybridiserer kun med RNA fra inducerede celler. Molekylstørrelsen af det med P1A6 hybridiserende RNA ligger ved 12-14S. Plasmidet P1A6 undersøgtes derfor 5 yderligere for entydigt at fastslå dets indhold af in-terferon-DNA-sekvens.

Eksempel H

Analyse af IFN-oc-type klonen P1A6.

10 Klonen P1A6 hybridiserer med virus-induceret Na- malwa-RNA i regionen på 12-14S (beskrevet i eksempel G).

Den indeholder en cDNA-indføjelse på ca. 900 basepar, der, som det viste sig ved restriktionsanalyse, ikke udviste overskæringssteder for enzymerne Bam HI, Bgl II, 15 Eco RI, Hin dm, Pst I og Pvu II (se fig. 5).

Beviset for, at klon P1A6 indeholder IFN-α-sekvenser, opnåedes igen ved DNA-sekvensanalyse: sekvensen for cDNA-indføjelsen i P1A6 bestemtes indad fra de indføjelsen begrænsende Pst I-overskæringssteder (se fig. 6) og 20 sammenlignedes med de af Goeddel et al. (Nature 290, 20-26 (1981)) beskrevne IFN-α-sekvenser. Det viste sig, at klon P1A6 udgør en 49 basepar kortere variant af LeIFN C. Tilstedeværelsen af poly(A)-sekvenser i 3'-enden af P1A6 henviser til, at klon P1A6 stammer fra et 25 kortere mRNA end den offentliggjorte klon LeIFN C. Den for LeIFN C-protein kodende region er dog fuldstændig tilstede.

Eksempel I

30 Identifikation og analyse af en yderligere IFN-a-type-klon (1F7) .

Klon P1A6 var den eneste IFN-α-type-klon, der kunne identificeres fra samlingen af de 190 tridecanuc-leotid-positive kloner (se eksempel E). For at opspore 35 yderligere IFN-oc-type-kloner hybridiseredes 1800 kloner fra den oprindelige cDNA-klonbank (eksempel C) ved kolo-nihybridisering (som beskrevet i eksempel F) med cDNA-indføjelsen i klonen P1A6. På denne måde fandtes en

DK 164742 B

17 yderligere IFN-ot-klon (klon 1F7). Restriktionsanalyse og delvis DNA-sekvenering af cDNA-indføjelsen i 1F7 viste, at det med hensyn til 1F7 drejer sig om en 175 basepar længere variant af klontypen LeIFN A (Goeddel et 5 al., se ovenfor). 1F7 indeholder ligesom FelFN A to overskæringssteder for hvert af enzymerne Bgl II og PvuII (fig. 5); de konstaterede DNA-sekvenser i 5'- og i 3'-enden af indføjelsen er angivet i fig. 6.

Endvidere analyseredes dele af DNA-sekven-10 sen i IFN-^c-type-klonen (1F7) med en universal-primer efter dideoxy-metoden (se Messing et al. i Nuc. Acid.

Res. 309 (1981) og Gardner, R.C. et al. i Nuc. Acid.

Res. 9, 2871 (1981)). For positionerne 120 til 327 fandtes følgende delsekvens: 15

.....CCTGGCACAGATGAGGAGAATCTCTCTTTTCTCCTGCTTGAAGGACAGACG

TGACTTTGGATTTCCCCAGGAGGAGTTTGGCAACCAGTTCCAAAAGGCTGAAACCA

TCCCTGTCCTCCATGAGATGATCCAGCAGATCTTCAATCTCTTCAGCACAAAGGAC

TCATCTGCTGCTTGGGATGAGACCCTCCTAGACAAATTCTA......

20 Sammenlignet med den fra litteraturen kendte se kvens for IFN-aA-typen (se D.V. Goeddel et al. i Nature 290, 20 (1981)) udviste den nye DNA-sekvens for IFN-a-type-klonen (1F7) i området med nucleotiderne nr. 120 -327 følgende forskelle: 25 I stilling 137 og 170 er i begge tilfælde nucleotidet A erstattet af G.

Eksempel J

Interferonaktivitet i lysater af E. coli HB101, trans-30 formeret med det hybride plasmid 1F7.

Lysater af med P1A6 eller 1F7 transformerede bakteriekulturer undersøgtes for deres indhold af biologisk aktivt interferon. Dertil dyrkedes 100 ml bakteriekultur i L-Broth-Medium til en optisk tæthed på 0,6 - 0,8, 35 pelleteredes ved centrifugering i 10 minutter ved 7000 o/m, vaskedes 1 gang i 50 mM Tris-HCl, pH 8, 30 mM NaCl, og suspenderedes til sidst i 1,5 ml af den samme puffer. Efter inkubering med 1 mg/ml lysozym i 30 minutter på is

DK 164742 B

18 blev bakterierne 5 gange frosset og optøet, og herefter fjernedes cellebrudstykkerne ved centrifugering i en time ved 40.000 o/m. Den overliggende væske filtreredes steril og testedes ved Plaguereduktionstesten for inter-5 feronaktivitet. I på denne måde vundne lysater af klon 1F7 kunne der påvises ca. 500 enheder pr. ml af interferon. Klon 1A6 viste ingen aktivitet ved denne test, hvilket formodentlig kan føres tilbage til en anden orientering af indføjelsen i plasmidvektoren.

10

Eksempel K

Forbedring af ekspressionen af det af 1F7 kodede interferon .

For at opnå god ekspression af et gen må der på 15 DNA-niveauet være opfyldt tre forudsætninger: for det første må der før genet ligge en promotor (et ENA-poly-merase-bindingssted), for det andet må det aflæste RNA før startkodonen for translationen bære en ribosombindingssekvens (RBS), og for det tredie må afstanden mel-20 lem RBS og startkodonen have en egnet længde.

Til ekspression af det af 1F7 kodede interferon anvendtes som promotorsekvens den fra litteraturen kendte promotor for tryptophanoperonen i Serratia mar-cescens (Nature 276, 684-689 (1978)) og som RBS en fra 25 litteraturen kendt DNA-sekvens (proc. Natl. Acad. Sci.

USA 78, 5543-5548 (1981)). Til bestemmelse af den optimale afstand mellem RBS'et og startkodonen i 1F7 valgtes følgende strategi: lF7-cDNA-sekvensen underkastedes kortvarig digestion med den for dobbeltstrenget DNA spe-30 cifikke exonuclease BAL 31, hvorved der opnåedes en blanding af molekyler af forskellig længde. Disse molekyler ligeredes derefter ved hjælp af syntetiske koblersekvenser på egnet måde til et "ekspressionsplasmid", dvs. til et plasmid, som indeholder promotor og RBS. E.coli HB 35 101 transformeredes med disse plasmider, og enkelte transformanter testedes for interferonproduktion.

I enkeltheder udførtes forsøget som følger: 0,5- 1 ug lF7-indføjelse inkuberedes i 100 μΐ 20 mM Tris-

DK 164742 B

19 HC1, pH 8,1/ 0,6 M NaCl, 12 mM MgCl2, 12 mM CaCl2, 1 mM EDTA, i tre minutter ved 30°C med 0,5 enheder BAL-31 (Bethesda Research Laboratories). Herefter afsluttedes reaktionen ved tilsætning af 300 μΐ 15 mM EDTA, pH 5 7,8, og der opvarmedes i 10 minutter til 65°C, ekstrahe-redes med phenol og ether og fældedes med ethanol. Bundfaldet blev optaget i 10 μΐ 70 mM Tris-HCl, pH 7,5, 7 mM MgCl2, 1 mM DTT, 0,4 mM ATP, sammen med 30 - 60 pmol phosphorylerede Hin dlll-koblere (Bethesda Research 10 Laboratories) og inkuberedes med 0,5 - 1 enhed T4-ligase (Bethesda Research Laboratories) natten over ved 14°C. Reaktionen afsluttedes ved opvarmning i 10 minutter til 65°C, 2 M NH4-acetat tilsattes, og interferongenerne rensedes for ikke-ligerede koblere ved fældning med 0,6 15 volumen isopropanol. Det udfældede materiale opløstes i 30 - 50 μΐ 33 mM Tris-acetat, pH 7,9, 66 mM K-acetat, 10 mM Mg-acetat, 100 μg/ml BSA, og underkastedes digestion i 2 - 3 timer med 30 - 50 enheder Hin dill. Reaktionen afsluttedes ved opvarmning i 10 minutter til 65°C, 20 og efter tilsætning af 2 M NH^-acetat fældedes interferongenerne med 0,6 volumen isopropanol. Bundfaldet opløstes i 10 μΐ 70 mM Tris-HCl, pH 7,5, 7 mM MgCl2, 1 mM DTT, 0,5 mM ATP, og ligeredes natten over ved 14eC -2 ved hjælp af 10 enheder T4-ligase med 0,2 μg Hin dlll-25 lineariseret, phosphatasebehandlet ekspressionsplasmid pER103. pER103 er et pBR322-derivat, som indeholder promotorsekvensen for tryptophanoperonen i S.marcescens og en fra litteraturen kendt RBS (se ovenfor); det kan lineariseres med Hin dill i nærværelse af RBS. De såle-30 des opnåede plasmider anvendtes til transformation af E. coli HB 101, og interferonproduktionen hos enkelte transformanter testedes på den i eksempel J beskrevne måde. Der konstateredes en stigning i interferonekspressionen på op til ca. 10^ gange værdien for den 35 spontane ekspression.

DK 164742 B

20 Følgende mikroorganismer og rekombinant-DNA-mo-lekyler deponeredes ved deponeringsinstitutionen "Deutsche Sammlung von Mikro-Organismen, Grisebach-strasse 8, 3400 Gottingen", den 17. maj 1982 under DSM-5 numrene 2362 (1F7) og 2363 (P1A6), og er offentligt tilgængelige i overensstemmelse med Budapesttraktaten.

UIS. IO^/^ D

21

Anvendte begreber og forkortelser (d)A: (Deoxy)adenos in 5 Antiserum: et serum, som indeholder antistof ATP: Adenosintriphosphat

Autoradiografi: fotografisk metode til påvisning af radioaktivitet

Basepar: 2 komplementære nucleotider, f.eks.

10 A-T, G-C

Stumpe ender: fuldstændigt baseparrede ender hos et DNA-dobbeltstrengsmolekyle, til forskel fra overhængende enkeltstrengsender 15 BSA: Bovinserumalbumin (d)C: (Deoxy)cytidin

cDNA: et med RNA komplementært DNA

cDNA-Pool: Blanding af cDNA'er med forskellig sekvens

20 Kode: bære informationen for noget; DNA

bærer i nucleotidsekvensen informationen for aminosyresekvensen i et protein DMSO: Dimethylsulfoxid DNA: Deoxyribonucleinsyre 25 DNA-sekvens: en liniær anordning af nucleotider, som er sammenknyttet ved hjælp af phosphorcliesterbindinger DTT: Dithiothreitol EDTA: Ethylendinitrilotetraeddikesyre 30 Elektroforese: Adskillelse af (DNA- eller RNA-) mole kyler efter molekylstørrelse i et elektrisk felt

Ekspression: omsætning af informationen i et gen til mRNA ved transkription og efter-35 følgende til polypeptid (protein) ved translation

Filterhybridi- hybridisering af nucleinsyrer, hvorveden sering: partner er filterbundet

DK 164742 B

22 (d)G: (Deoxy) guanosin

Gen: Afsnit af DNA'et, som bærer infor mationen for et bestemt transkript (RNA-molekyle), der efterfølgende kan 5 oversættes til et protein.

Genfamilier: Familier af gener, der koder for nært beslægtede produkter (subtyper)

Genprodukt: RNA (transkript), protein (transla tionsprodukt) 10 Gradient: se saccharosegradient

Homologi (af DNA- sekvenser); Slægtsskab mellem DNA-sekvenser, der viser sig ved en lignende nucleotid-rækkefølge 15 Hybrid: Stabilt kompleks af to med hinanden i det mindste delvis komplementære DNA-strenge

Hvbridisering (af nuclein- 20 syrer): Dannelse af stabile komplekser mellem med hinanden komplementære enkelte DNA-eller RNA-strenge

Hybridiserings- prøvemiddel: Radioaktivt mærket nucleinsyre, der 25 tjener til finding af dermed komplemen tære sekvenser . Hybridplasmid: Plasmid, som indeholder et DNA-afsnit fra en fremmed organisme I: Inosin 30 IFN-a: Leukocytinterferon IFN-3: Fibroblastinterferon IFN-γ: Immuninterferon in vitro: i reagensglas

Induktion (af in-35 terferonproduk- tion): Stimulering af celler til syntese af interferon ved behandling med indukto- rer (vira, dobbeltstrenget RNA,mitogener).

DK 164742 B

23

Startkodon: Sekvens AUG i mRNA, som signalerer på begyndelsen af translationen

Initiationskom- 5 pleks; Forbindelse af revers transkriptase med mRNA og primer, som muliggør påbegyndelsen af cDNA-syntesen

Indføjelse, cDNA-indføjelse: Det stykke af fremmed DNA (f.eks. et 10 cDNA), som befinder sig i et hybrid- plasmid

Klon: Bakteriekoloni stammende fra en enkelt bakterie

Klonbank, cDNA- 15 klonbank: En samling af bakteriekloner, der alle indeholder et hybridplasmid med en cDNA-indføj else

Kloning: Fremstilling af kloner? for det meste forstået som fremstilling af kloner, 20 der indeholder et hybridplasmid

Kolonihybridi- sering: Hybridisering med filterbundne denature rede bakteriekolonier

Komplementær: Passende med hinanden (nucleotider i 25 DNA: A er komplementær med T, G er kom plementær med C)

Krydshybridi- sering: Hybridisering mellem ikke-identiske, men homologe DNA-sekvenser 30 Ligere: Kovalent sammenknytning af DNA-sekven ser ved hjælp af enzymet ligase

Mikrotiterplade: Plade med 96 fordybninger, der er karakteriseret ved koordinaterne 1-12 og A-Z

35 Mitogen: Substans, som stimulerer celler til mi tose (celledeling)

Molekylær kloning: Se kloning

DK 164742 B

24 mRNA: Meddeler-RNA, er et for proteiner ko

dende RNA

Neutralisation: Inaktivering af et antigen med anti- 5 stof dNTPs: Blanding af de 4 nucleotider dATP,

dTTP, dCTG, dGTP

Nucleotider: Byggesten i et DNA eller RNA; (d)A,

(d)C, (d)G, (d)T

10 Oligonucleotider: Nogle få med hinanden gennem phos- phordiesterbindinger sammenknyttede . nucleotider

Oligo(C): Oligomer af C-rester, sammenknyttet gennem phosphordiesterbindinger 15 Oligo(dT): Oligomer af dT-rester, sammenknyttet gennem phosphordiestecbindinger

Oligo(dT)-cellulose: Til cellulose bundne oligo(dT)-rester, til chromatografi af Poly(A)+RNA 20 PIPES: Piperazin-Ν,Ν1-bis(2-ethansulfonsyre)

Plasmid: Cirkulært, ekstrachromosomalt bakte- rie-DNA, der undergår selvstændig re-plikation

Poly(A) eller 25 (dA): Polymer af A- eller dA-rester, sam menknyttet gennem phosphordiesterbindinger

Poly(A)+RNA: mRBA, der i 3'enden af nucleinsyre- sekvensen har en homopolymer region 30 af poly(A)

Poly(C) eller (dC): Polymer af C- eller dC-rester, sam menknyttet gennem phosphordiesterbindinger 35 Poly(I): Polymer af I-rester, sammenknyttet gennem phosphordiesterbindunger

Poly(I): poly(C): dobbeltstrenget nucleinsyre, hvis strenge er Poly(I) og Poly(C)

DK 164742 B

25

Poly(U): Polymer af U-rester, sammenknyttet gennem phosphordiesterbindinger Prime.r: Oligonucleotid, komplementær med en 5 del af et RNA-molekyle, ud fra hvil ket cDNA-syntesen foregår Prøvemiddel: Se hybridiseringsprøvemiddel

Promotor: DNA-sekvens, til hvilken RNA-polymer binder 10 RBS; Se ribosombindingssekvens

Rekombinant-DNA: DNA-sekvens, som består af DNA-af- snit af forskellig herkomst, der er blevet sammenknyttet med hinanden in vitro 15 Replikation (af DNA): Duplikering af et DNA-molekyle Restriktionsanalyse: Kortlægning af et DNA-molekyle med hensyn til overskæringssteder for re-striktionsendonucleaser 20 Restriktionsendo- nuclease: Enzym, som ved en bestemt DNA-se kvens overskærer DNA-dobbeltstrengen

Restriktionskortlægning: Se restriktionsanalyse 25 Revers transkrip- tion: Fremstilling af en cDNA-kopi med et RNA-molekyle som matrice og et oligonucleotid som primer

Ribosombindings- 30 sekvens: Del af mRNA, der kan binde til ribo some t RNA: Ribonucleinsyre RNA-polymerase: Enzym, som kan syntetisere en med DNA komplementær RNA-streng 35 Saccharosegradient: Middel til adskillelse af en blanding af (RNA-)molekyler efter deres størrelse SDS: Natriumdodecylsulfat

DK 164742 B

26

Screening: Gennemsøgning med henblik på en bestemt egenskab

Sekvenskompleksitet: En værdi for antallet af kvalita- 5 tivt forskellige DNA-sekvenser i

en bestemt mængde DNA

Subtyper: Se genfamilier (d) T: (Deoxy)thymidin

Transformant: Bakterie, som har modtaget frem- 10 med DNA ved transformation

Transformation: Indslusning af fremmed DNA i bak terier

Transkription: Kopiering af mRNA fra en dermed komplementær DNA-sekvens

15 Translation: Omsætning af information fra mRNA

til et polypeptid (translationsprodukt)

Tridecanucleotid: Oligonucleotid med 13 nucleotid- bestanddele 20 Tridecanucleotid- positiv: Hybridiserende med tridecanucleo- tidet

Tris: Trishydroxymethylaminomethan U: Uridin 25 Vektor: Vehikel til indslusning af frem med DNA i bakterier, for det meste et plasmid

Vektorhybrid: Se hybridplasmid.

Claims (10)

1. Polydeoxyribonucleotid, der koder for IFN-a2(Arg), kendetegnet ved, at det svarer til en sekvens, der foreligger i Pstl-indføjelsen i det som pBR322(Pst)1F7 betegnede plasmid, der er depo- 5 neret i E. coli HB101 ved Deutsche Sammlung von Mikroorganismen under DSM-nummer 2362.

2. DNA-Sekvens ifølge krav 1, kendetegnet ved, at den for IFN-a2(Arg) kodende sekvens indeholder en delsekvens med formlen 10 120 C CTG GCA C AG ATG AGG AG A ATC TCT CTT TTC TCC 153 TGC HG AAG GAC AGA CGT GAC TTT GGA TTT CCC CAG GAG GAG 195 TTT GGC AAC CAG TTC CAA AAG GCT G AA ACC ATC CCT GTC CTC 237 CAT GAG ATG ATC CAG CAG ATC TTC AAT CTC TTC AGC ACA AAG 279 GAC TCA TCT GCT GCT TGG GAT GAG ACC CTC CTA GAC AAA TTC 321 TA 323 3. pBR322-Plasmid, kendetegnet ved, at det i Pstl-indføjelsen indeholder en DNA-sekvens ifølge krav 1 eller 2.

4. Det som pBR322(Pst)1F7 betegnede plasmid ifølge krav 3, der i E. coli HB101 er deponeret ved

20 Deutsche Sammlung von Mikroorganismen under DSM-nummer 2362.

5. Fremgangsmåde til fremstilling af en klon, der indeholder et plasmid ifølge krav 3, kendte-tegnet ved, at man fremstiller en tilsvarende 25 klonbank ud fra cDNA, der er blevet syntetiseret med RNA fra Namalwa-celler induceret med Sendaivirus, og ud fra denne bank a) ved hjælp af tridecanucleotidet med formlen 5' -dCCTTCTGGAACTG-3' 30 ved hybridisering opsporer en klon, der indeholder dette tridecanucleotid og koder for LeIFN-B, C, D, F eller G, og b) derefter udvælger en klon, der koder for IFN-a2(Arg), ved hybridisering med cDNA-indføjelsen 35 af en ifølge a) opnået klon.

6. Mikroorganisme, kendetegnet ved, at den i et plasmid indeholder et for IFN-a2(Arg) kodende DK 164742 B polydeoxyribonucleotid ifølge krav 1 eller 2.

7. Mikroorganisme ifølge krav 6, kendetegnet ved, at den er transformeret med et plasmid ifølge krav 3 eller 4. 5 8. E. coli transformeret med et plasmid ifølge krav 3 eller 4.

9. Fremgangsmåde til fremstilling af IFN-a2(Arg), der i området af aminosyrer nr. 18-84 indeholder delsekvensen med formlen 10 Leu Ala Gin Met Arg Arg Ile Ser Leu Phe Ser 28 Cys Leu Lys Asp Arg Arg Asp Phe Gly Phe Pro Gin Glu Giu 42 Phe Gly Asn Gin Phe Gin Lys Ala Glu Thr Ile Pro Val Leu 56 His Giu Met Ile Gin Gin Ile Phe Asn Leu Phe Ser Thr Lys 70 Asp Ser Ser Ala Ala Trp Asp Glu Thr Leu Leu Asp Lys Phe 84 15kendetegnet ved, at man dyrker en mikroorganisme ifølge krav 6, 7 eller 8 og isolerer det ved mikroorganismens vækst dannede interferon.

10. Fremgangsmåde til fremstilling af en mikroorganisme ifølge krav 6-8, kendetegnet ved, 20 at et plasmid ifølge krav 3 eller 4 transformeres i en passende vært.

11. Fremgangsmåde til fremstilling af et DNA ifølge krav 2, kendetegnet ved, at man isolerer DNA'et fra et plasmid ifølge krav 3 eller 4.