JPH0779691B2 - 生理活性物質ｋ−３１２−ｃおよびその製造方法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明はキチン分解能を有する新規生理活性物質Ｋ−31
2−Ｃおよびその製造方法に関する、更に詳しくは、新
規なエキセロスポラ属に属する好熱性微生物を培養して
得られる生理活性物質Ｋ−312−Ｃおよびその製造方法
に関する。

（従来の技術） キチナーゼは多くの微生物が生産することが知られてい
る。例えば、ストレプトミセス オリエンタリス（Stre
ptomyces orientaris）（アグリカルチュアル・アンド
・バイオロジカル・ケミストリー（Agricultual and Bi
ological Chemistry）40巻、2325〜2333頁（1976
年））、アエロモナス・ハイドロフイラ・サブスペーシ
ス・アナエロゲネス（Aeromonas hybrophila subspecie
s anaerogenes）（ジャーナル・オブ・ゼネラル・アプ
ライド・マイクロバイオロジー（Journal of General A
pplied Microbiology）32巻、25〜28頁（1986年））、
ピクノポラス シナバリナス（Pycnoporus cinnabarinu
s）（佐賀大農彙50巻、１〜13頁（1981年））、ビブリ
オ属（Vi−brio）（ジャーナル・オブ・ファメンテイシ
ョン・テイノロジー（Journal of Fermentation Tecnol
−ogy）57巻、169〜177頁（1979年））およびセラチア
マルセセンス（Serratia marcesc−ens）（アナリテ
ィカル・バイオケミストリー（Analytical Biochemistr
y）127巻、402〜412頁（1982年））等の微生物が生産す
る。

（本発明が解決しようとする問題点） しかし、これらの微生物を用いてキチナーゼを生産させ
るには、炭素源として主にキチンが用いられるが、用い
られるキチンに条件がある。例えばビブリオ属の生産菌
はコロイダルキチンを必要とする。またアエロモナス属
の生産菌は除蛋白、脱カルシュウム処理したキチンを要
求する。

また、これ迄知られたキチナーゼ生産菌株はストレプト
ミセス属、アエロモナス属、ブビリオ属、ピクノポラス
属、セラチア属の常温菌が主体であり培養中に雑菌によ
る汚染の心配があった。更に、既知のキチナーゼは耐熱
性に劣るものが多く取り扱いに注意を要した。例えばア
エロモナス ハイドロフイラ サブスペーシスアナシロ
ゲネスのキチナーゼは55℃、30分間処理で完全に失活す
る。

またこうして得られる酵素をバイオリアクターなどにお
いて有効に利用するためには、高い安定性、特に温度に
対する高い安定性を有することが重要となる。すなわ
ち、バイオリアクターなどで繰り返し使用できるように
するためには、一般に酵素を固定化する必要があり、そ
の固定化のために比較的高温に曝される。耐熱性の低い
ものでは固定化操作中に失活してしまう可能性が高い。

（問題点を解決するための手段） 本発明者らは熱に対して安定なキチン分解能を有する生
理活性物質を得るべく鋭意研究した結果、中温及至高温
に生育温度を有しエキセロスポラ属に属するある種の好
熱性微生物が上記条件を備えている生理活性物質Ｋ−31
2−Ｃを生産することを見い出し、本発明を完成した。

すなわち、本発明のキチン分解能を有する新規耐熱性生
理活性物質Ｋ−312−Ｃは以下のような理化学性質を有
している。

（イ）作用 キチンに作用してこれを分解する。

（ロ）至適pH ５〜６ （ハ）pH安定性 50℃で15分間処理した場合、pH5〜９において80％以上
の残存活性を有する。

（ニ）至適温度 pH7.0においてコロイダルキチンを基質とした場合50℃
付近にある。

（ホ）温度に対する安定性 コロイダルキチン基質でpH7.0において０〜55℃、30分
間処理で95％以上の残存活性を有する。

（ヘ）失活の条件 80℃、15分間処理で完全に失活する。

（ト）阻害剤 塩化第二鉄によって阻害される。

（チ）分子量 10,000（ゲル濾過法） また本発明の新規生理活性物質Ｋ−312−Ｃはエキセロ
スポラ属に属する上記生理活性物質を菌体外に生産する
微生物を培養し、培養液中に該物質を生成、蓄積せし
め、これを分離、精製することによって得ることができ
る。

本発明の生理活性物質Ｋ−312−Ｃ生産菌株は本発明者
らにより新たに自然界から検索、単離されたものであ
る。これらの菌株を国際ストレプトマイセス計画（IS
P）とワックスマン氏の方法に従って同定するとエキセ
ロスポラ属に属することが明らかになり、これをエキセ
ロスポラ エスピイ（Excellospora SP.）Ｋ−312と命
名した。

以下に単離した生理活性物質Ｋ−312−Ｃ生産菌の菌学
的諸性質を示す。

（１）形態学的性質 基生菌糸は分断することなく長く伸張し、稀に伸びたら
せんのようなジグザグ状を呈する。イースト・マルツ液
体培地で培養すると基生菌糸の一部が胞子化する。その
形は１ミクロン位のほぼ球状である。気菌糸の胞子鎖は
明確な短い胞子柄上に着生し、通常10個内外の胞子から
なり、ループ状、かぎ状、らせん状を呈する。胞子の大
きさは、巾0.3〜0.6ミクロン、長さ0.8〜1.4ミクロン
で、胞子表面はとげ状（Spiny）を呈する。また、胞子
は運動性を示さず、胞子嚢、菌核等は観察されない。

（２）各種培地における生育 37度、培養３週間目の生育状態は第１表に示す通りであ
る。

気菌糸の着生が悪く、用いた培地のうち、スターチ寒天
培地、オートミール寒天培地のみに着生し、胞子成熟に
１カ月以上を要した。胞子の色は緑色系列に属する。

（３）生育温度およびpH 生育温度 20℃〜55℃ 生育 pH ６〜９ （４）生理・生化学的性状 ゼラチンの液化 ＋ 澱粉の加水分解 ＋ メラニン様色素の生成 チロシン寒天培地、ペプト ン・イースト鉄寒天培地、 トリプトン・イースト・ブ ロス培地，共に− 脱脂牛乳の凝固 ＋ ペプトン化 ＋ 硝酸塩の還元 ＋ （５）各炭素源の利用および分解 L −アラビノース ＋ D −キシロース ＋ D −グルコース ＋ D −フラクトース ＋ シュークロース ＋ I −イノシトール ＋ Ｌ−ラムロース ＋ ラフィノース ± D −マンニトール ＋ （６）化学的分析 細胞壁タイプ IIIB 主要メナキノン MK9（H6）,MK（H8） 主要脂肪酸 C16,17,18のイソ脂肪酸 この生産菌は工業技術院微生物工業技術研究所に微工研
寄第9463号（FERM P−9463）として寄託している。

つぎに本発明のキチン分解能を有する耐熱性生理活性物
質Ｋ−312−Ｃの製造法について詳しく説明する。まず
上記の生理活性物質Ｋ−312−Ｃ生産菌を適当な培地に
接種し、25〜50℃にて、48〜72時間、好気的に培養する
が、培地としては炭素源、窒素源の他、必要に応じて無
機塩、微量栄養素を含むものを用いる。

炭素源としては従来公知の各種材料を使用することがで
きるが、多量の生理活性物質Ｋ−312−Ｃを得るために
は海老殻キチン、蟹キチン等のキチン質を用いるのが好
ましい。このキチンは除蛋白、脱カルシュウムキチン、
コロイダルキチンの様な特殊な処理を施したキチン類
や、その様な処理を施してないキチン類を用いることも
できる。また窒素源としては特に制限はなく、酵母エキ
ス、麦芽エキス、ペプトン、肉エキス、コーンスティー
プリカー、アミノ酸液、大豆粕などの有機態窒素、また
は硫安、尿素、硝酸アンモニウム、塩化アンモニウムな
どの無機態窒素などが安価かつ入手容易なものとして好
ましい。尚、有機態窒素源は炭素源ともなることはいう
までもない。更に、このような炭素源の他、一般に使用
されている各種の塩、例えばマグネシウム塩、カリウム
塩、リン酸塩、鉄塩等の無機塩、ビタミンなどを添加す
ることもできる。

本発明の方法において使用するのに適した培地を例示す
ると、１％の蟹殻キチン、１％の麦芽エキス、0.5％の
酵母エキス、0.1％のK₂HPO₄および0.02％のMgSO₄・7H₂O
を含有する液体培地を挙げ得る。

また、本発明の生産菌の生育pHは弱酸乃至弱アルカリの
範囲内であるので、適当な緩衝液を用いて上記所定のpH
値を維持する必要がある。このために有用な緩衝液とし
てはリン酸緩衝液を挙げることができるが、これに限定
されず、公知のものを使用できる。

本発明において使用する生産菌は生理活性物質Ｋ−312
−Ｃを菌体外に生産するので、培養液中に放出され、そ
こに蓄積された物質を分離、精製する。これらの生産菌
の培養はバッチ式、連続式のいずれも適用することがで
きる。生成される該物質の分離精製は例えば以下のよう
にして実施することができる。

培養液中の菌体を遠心分離、濾過などで除去した後、得
られる上澄液（粗酵素液）をそのまま酵素反応に適用す
ることもできる。この方法は経済的に有利である。ま
た、これを更に精製して適用することもできる。そのた
めに、例えば硫安等による塩析、エタノール、アセト
ン、イソプロピルアルコール等による溶媒沈澱法、限外
濾過法、ゲル濾過法、イオン交換樹脂等による一般的な
酵素精製法により精製することができる。

本発明の生理活性物質Ｋ−312−Ｃの活性測定及び活性
表示法は以下の通りである。すなわち、0.2％蟹殻コロ
イダルキチン（100mMリン酸緩衝液、pH7.0）2ml、およ
び酵素液0.5mlを試験管に入れ、50℃で１時間振とうし
て反応させる。100℃で10分間加熱して反応を停止した
後、上澄液1ml中の全還元糖量をソモギー・ネルソン法
により測定し、Ｎ−アセチルグルコサミン量で表示す
る。酵素活性は１分間に１μモルのＮ−アセチルグルコ
サミンに相当する還元糖を生成する酵素量を１単位とし
た。

本発明の方法によって得られるキチン分解能を有する生
理活性物質Ｋ−312−Ｃの理化学的、酵素化学的性質は
前記の他、分子量10000である。尚、この分子量はゲル
濾過法で求めたものである。また、本発明のキチン分解
能を有する耐熱性生理活性物質Ｋ−312−Ｃおよび従来
公知の微生物由来のキチナーゼの理化学的性質および酵
素化学的性質を比較して第２表に示す。

（実施例） 以下、実施例を挙げて本発明の新規生理活性物質Ｋ−31
2−Ｃの製造方法につき具体的に説明する。しかし、本
発明は実施例によって何等制限されるものではない。

実施例１ Ｋ−312菌を、１リットル容の三角フラスコ中の蟹殻キ
チン２％、麦芽エキス１％、酵母エキス0.5％を含む培
地（pH7.2）15mlに植菌し、40℃で48時間、250rpmで回
転振とう培養し、培養液を遠心分離して0.2単位/mlの粗
酵素液を得た。０℃にて10分間遠心分離して菌体を除
き、３リットルの上澄液を得る。次いで該上澄液を平均
分画分子量5,000の限外濾過膜を用いて約10倍に濃縮
し、50mM酢酸緩衝液（pH4.5）で一夜透析する。この透
析後に生じる沈澱を遠心分離で除き、得られる上澄液を
50mM酢酸緩衝液（pH4.5）で平衡化したSP−トヨパール
カラム 650Mに吸着させ、０〜0.5MのNaClを含む上記と
同様な緩衝液の濃度勾配法によって酵素を溶出させる。
溶出した活性画分を集め限外濾過膜を用いて一夜透析す
る。この濃縮酵素を0.1MNaClを含有する上記緩衝液で平
衡化したヨトパール HW55Sのゲル濾過カラムに充填
し、0.1MNaClを含む同上緩衝液で溶出する。かくして得
られたキチナーゼ活性画分を濃縮し、ポリアクリルアミ
ドゲルディスク電気泳動（ゲル濃度17％、pH8.8）にお
いて単一な生理活性物質Ｋ−312−Ｃ標品20mgが得られ
た。標品のキチナーゼ活性は1mgあたり4.6単位であっ
た。

実施例２ Ｋ−312菌を、実施例１で述べた培地組成の蟹殻キチン
に代えて乾燥海老殻２％を含む培地150mlに植菌し、実
施例１と同一条件下で振とう培養し、得られた３リット
ルの培養清澄液を実施例１と同様な精製法により、1mg
あたり3.9単位のキチナーゼ活性を有する生理活性物質
Ｋ−31夫−Ｃを25mg得た。

実施例３ Ｋ−312菌を、実施例１で述べた組成の培地に植菌し、4
5℃で48時間、250rpmで回転振とう培養し、同様な精製
法により1mgあたり4.4単位のキチナーゼ活性を有する生
理活性物質Ｋ−312−C16mgを得た。

（発明の効果） 本発明によれば新規な好熱性微生物を利用したことによ
り、培養に繁雑な操作を必要とせず、キチン分解能を有
し更に高い耐熱性を有する生理活性物質Ｋ−312−Ｃを
有利に量産性良く製造することが可能となった。

また、本生理活性物質Ｋ−312−Ｃは37℃で48時間反応
させることによりキチンおよびコロイダルキチンを完全
に水解することができる。

本発明の生理活性物質は、キトオリゴ糖の製造および酵
母などのプロトプラストの生成に使用できる。また、固
定化の際に高温度下に曝された場合にも十分な酵素活性
が維持され、優れたバイオリアクター用の固定化酵素を
得ることが可能である。

Claims (4)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】以下の理化学的性質を有する新規生理活性
   物質Ｋ−312−Ｃ （イ）作用 キチンに作用してこれを分解する。 （ロ）至適pH ５〜６ （ハ）pH安定性 50℃で15分間処理した場合、pH5〜９において80％以上
   の残存活性を有する。 （ニ）至適温度 pH7.0においてコロイダルキチンを基質とした場合50℃
   付近にある。 （ホ）温度に対する安定性 コロイダルキチン基質でpH7.0において０〜55℃、30分
   間処理で95％以上の残存活性を有する。 （ヘ）失活の条件 80℃、15分間処理で完全に失活する。 （ト）阻害剤 塩化第二鉄によって阻害される。 （チ）分子量 10,000（ゲル濾過法）
2. 【請求項２】エキセロスポラ属に属し、以下の理化学的
   性質： （イ）作用 キチンに作用してこれを分解する。 （ロ）至適pH ５〜６ （ハ）pH安定性 50℃で15分間処理した場合、pH5〜９において80％以上
   の残存活性を有する。 （ニ）至適温度 pH7.0においてコロイダルキチンを基質とした場合50℃
   付近にある。 （ホ）温度に対する安定性 コロイダルキチン基質でpH7.0において０〜55℃、30分
   間処理で95％以上の残存活性を有する。 （ヘ）失活の条件 80℃、15分間処理で完全に失活する。 （ト）阻害剤 塩化第二鉄によって阻害される。 （チ）分子量 10,000（ゲル濾過法） を有する生理活性物質Ｋ−312−Ｃ生産菌を培養し、該
   生理活性物質を培養液中に生成、蓄積させ、これを採取
   することを特徴とする該生理活性物質Ｋ−312−Ｃの製
   造方法。
3. 【請求項３】培養を25〜50℃の温度範囲内で好気的に行
   う 特許請求の範囲第２項記載の新規生理活性物質Ｋ−312
   −Ｃの製造方法。
4. 【請求項４】培養液のpHが6.0〜9.0の範囲内にある 特許請求の範囲第２項または第３項記載の新規生理活性
   物質Ｋ−312−Ｃの製造方法。