JPH0779699B2 - 真核生物における分泌発現遺伝子 - Google Patents

真核生物における分泌発現遺伝子

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JPH0779699B2
JPH0779699B2 JP59000939A JP93984A JPH0779699B2 JP H0779699 B2 JPH0779699 B2 JP H0779699B2 JP 59000939 A JP59000939 A JP 59000939A JP 93984 A JP93984 A JP 93984A JP H0779699 B2 JPH0779699 B2 JP H0779699B2
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Description

【発明の詳細な説明】 発明の背景 （発明の分野） ハイブリドDNA技法は無数の種類の組成のポリペプチド
を製造する可能性に革命をもたらした。生物は蛋白質に
よって構成されており、そして制御のために蛋白質を用
いるから、これらの蛋白質を意のままに製造することが
可能であれば、これらの蛋白質の機能様式を研究し、そ
して治療及び診断においてこれらの蛋白質、これらの蛋
白質の断片又は類似体を使用する独特の機会が得られ
る。細胞による蛋白質の生産速度及び量の改良において
多くの進歩が存在する。これらの進歩のほとんどがより
大きなコピー数、より効果的なプロモーター、及び所望
の生成物の分解量を減少せしめる手段と関連している。
目的生成物たる目的ポリペプチドの分泌が可能であるこ
とが非常に望ましいことが明らかである。
さらに、多くの状況において、目的ポリペプチドは最初
のメチオニンアミノ酸を有しない。これは、目的ポリペ
プチドをコードする遺伝子中にプロセシングシグナルが
存在し、遺伝子源がそれを認識し、そして適当なペプチ
ダーゼによりポリペプチドが開裂する結果である。ほと
んどの状況において、問題の遺伝子は、その遺伝子が中
で発現する宿主にとって外来性であるから、このような
プロセシングは発現宿主中で不正確であり、そして発生
率が低い。この場合、得られる蛋白質はほとんどすべて
の配列において目的ペプチドと同じであるが、Ｎ末端に
おいて異なり、このために生理的活性が有害な影響を受
ける場合がある。
従って、分泌をコードし、そしてポリペプチド生成物を
成熟せしめるDNA配列を調製することが非常に有利であ
るとする多くの理由が存在する。さらに、目的のポリペ
プチドにとって不必要なアミノ酸を除去するプロセシン
グのための配列が見出される場合、単一転写上にタンデ
ムにコードされているであろう同一の又は異なる多数の
DNA配列が得られる可能性が存在する。
（従来技術の記載） 米国特許第4,336,336号は、通常細胞表面に又はそれを
超えて輸送される非細胞質性蛋白質をコードする原核生
物のためのリーダー配列の使用について記載しており、
この場合融合蛋白質はペレプラズム空間に輸送される。
米国特許第4,338,397号は、目的のポリペプチドからリ
ーダー配列を開裂して分泌を生じさせるリーダー配列を
用いる原核細胞について記載している。米国特許第4,33
8,397第３欄及び第４欄は有用な定義を提供しており、
この定義を引用によりこの明細書に組み入れる。
具体的には米国特許第4,338,397号には、蛋白質又はポ
リペプチドの前駆体が宿主の細胞膜を通して輸送され、
そして分泌の間に前駆体のシグナル配列の適切な切断に
より成熟蛋白質又はポリペプチドが形成されるには蛋白
質又はポリペプチドの前駆体のシグナル配列の一部分の
みが必須である旨記載されている。
クージャン（Kurjan）及びヘルスコビッチ（Herskowit
z）Cell（1982）30:933〜943は成熟α−ファクターの４
個のテンダムコピーを含む推定上のα−ファクター前駆
体について記載し、その配列を記載しそしてプロセシン
グの機構を予想している。この文献はさらに、酵母α−
ファクターの前駆体配列のＮ−末端の22個のアミノ酸が
分泌のためのシグナル配列であることを予想している。
「A Putative α−Factor Precursor Containing Four
Tandem Repeats of Mature α−Factor」と題するThe M
olecular Biology of Yeastsの1981年スプリングハーバ
ーミーティングの要約242頁において、クージャン及び
ヘルスコビッチはα−ファクターをコードする配列及び
この２個の配列の間のスペーサーについて記載してい
る。ブライア（Blair）等は「Synthesis and Processin
g of Yeast Pheremones:Identification and Character
ization of Mutants That Produce Altered α−Factor
s」と題する上記要約において、成熟α−ファクターの
生産に対する種々の変異株の効果を記載している。
発明の要約 成熟ポリペプチドの製造するための方法及び組成が提供
される。酵母リーダー配列、及びポリペプチド生成物の
分泌と成熟のための外来性遺伝子に対するプロセシング
シグナルとをコードするDNA配列を連結するDNA構成が提
供される。Ｎ−末端開裂性オリゴペプチドをコードする
DNA構成及び成熟ポリペプチド生成物をコードするDNA配
列を、酵母又は所望のポリペプチドを製造するためのプ
ロセシングシグナルを認識する他の細胞に導入するため
の適当なベクターに連結することができる。
特定の態様の記載 この発明に従えば成熟ポリペプチドを製造するために真
核細胞、特に酵母が使用され、該ポリペプチドが倍地か
ら採取される。酵母リーダー及び目的ポリペプチドに結
合したプロセシングシグナル（このポリペプチドは単一
ポリペプチドでもよくプロセシングシグナルにより分離
された多数のポリペプチドでもよい）をコードするDNA
構成を用いることによりポリペプチドが製造される。得
られたDNA構成はプレ−プロ−ポリペプチドをコード
し、プレ−プロ−ポリペプチドを分泌するためのシグナ
ル及びポリペプチドを細胞内又は細胞外で成熟ポリペプ
チドにプロセシングするためのシグナルを含有するであ
ろう。
この発明のDNA構成は、プロ−ポリペプチドを規定する
少なくとも次の構造、 ((R)r-(GAXYCX)n-Gene*)y （式中、ＲはCGX又はAZZ、すなわちリジン及びアルギニ
ンをコードするコドンであってＲの各各は同一であり又
は異り;rは２〜４、通常２〜３、好ましくは２又は４の
整数であり;Xは４種のヌクレオチドすなわちT,G,C又は
Ａの内の任意のものであり;YはＧ又はＣであり、ｙは１
以上の整数であり、通常は10以下であり、さらに通常は
４以下であって、モノマー又はマルチマーを供し;ZはＡ
又はＧであり；そしてGene*はα−ファクター以外の遺
伝子、通常は酵母宿主にとって外来性（foreign）の遺
伝子、通常は異種性（heterologous）遺伝子、好ましく
は植物遺伝子又は哺乳動物遺伝子であり;nは０、又は一
般に１〜４、通常は２〜３の間で変化する整数である）
を有する。
プロ−ポリペプチドは、Gene*によりコードされるアミ
ノ酸に先行するアミノ酸を除去するペプチダーゼのため
のＮ−末端プロセシングシグナルを有する。
多くの場合、この発明のDNA構成はプレ−プロ−ポリペ
プチドを規定する少なくとも次の構造、 Ｌ−(R-S-(GAXYCX)n-Gene*)y （式中、Ｌ及びＳ以外のすべての記号は上に定義した通
りであり;SはＲと同じ意味を有し、１個のＲ及び１個の
Ｓが存在し；そしてＬはプレ−プロ−ポリペプチドの分
泌をもたらすリーダー配列である）を有する。さらに多
くのＲ及びＳを有することも可能であるが、アミノ酸を
追加することには通常利益がない。分泌をもたらす任意
のリーダー配列を用いることができ、リーダー配列は一
般に約30〜120個、通常約30〜100個のアミノ酸から成
り、疏水性領域を有しそしてＮ末端にメチオニンを有す
る。
ｎが０である場合、DNA構成はプレ−プロ−ポリペプチ
ドを規定する次の構造、 Ｌ−（(R)ｒ′−Gene*）y （式中、ｒ′以外のすべての記号は前に定義した通りで
あり；そしてｒ′は２〜４、好ましくは２又は４であ
る）を有する。
特に有利なのはクージャン及びヘルスコビッチ、（前
記）第937頁に記載されているα−ファクターのリーダ
ー配列又はその断片もしくは類似体であり、このものは
所望のポリペプチドの効果的な分泌をもたらす。さら
に、上記論文に示されているDNA配列（この配列を引用
によりこの明細書に組み入れる）は必須ではなく、所望
のオリゴペプチドをコードする任意の配列で十分であ
る。種種の配列が幾分翻訳されよう。
前記の構造が好ましいが、サプレッサー変異体において
は、所望の機能を発揮する他の配列が使用され得ること
を理解すべきである。通常、サプレッサー変異体は発現
のためには効果的でなく、従って前記配列、又は同じア
ミノ酸配列をコードする同等の配列が好ましい。変異体
が、異なるコドンから前記の配列によって発現されるア
ミノ酸と同じアミノ酸を発現する限り、そのような代替
配列も許容される。
カッコ内の配列によってコードされるジペプチドは１個
の酸性アミノ酸、すなわちアスパラギン酸又はグルタミ
ン酸、好ましくはグルタミン酸、及びそれに続く１個の
中性アミノ酸、アラニン又はプロ−リン、特にアラニン
である。
発現のためのカセットとして使用し得る有用なDNA配列
として、次の配列、 Tr−Ｌ−（(R-S)ｒ″−(GAXYCX)ｎ′−Ｗ−(Gene*)d）y （式中、Trは転写制御シグナル、特にプロモーター及び
オペレーターのごとき他の制御シグナル、アクティベー
ター、キャップシグナル、リボゾーム結合を強化するシ
グナルをコードするDNA配列、又は転写制御もしくは翻
訳制御に関与するその他の配列であり;Tr配列は一般に
約100bp以上であり、そして約2000bp以下であり；宿主
に固有のリーダー配列に連結された転写及び翻訳シグナ
ル配列を含むDNA断片を用いることができるように、Tr
配列とリーダー配列Ｌとが関連しているのが特に好まし
く；これに代えて発現生成物の強化された生産をもたら
すその他の転写及び翻訳シグナルを用いることもでき;d
は０又は１であり、ｙが１より大であるときは１であ
り;n′は一般に０〜３、さらに通常は０又は２〜３の整
数であり;r″は１又は２であり;Wは末端デオキシリボシ
ル−３′基、又はそれ自体によりもしくは隣接ヌクレオ
チドと一緒になって接着末端又は平滑末端を供する制限
部位を規定し、そして０〜最長20個のヌクレオチドを有
し；そして他の記号は前に定義した通りである）を便利
に使用することができる。
次の構成、 （式中、すでに定義したすべての記号は前記と同じ意味
を有し;aは０又は１であって、この構成が転写及び翻訳
シグナルを有するか又は有しないことを意味し；破線枠
中に示したヌクレオチドは存在しないがしかしジペプチ
ドをコードする配列を再構成（recreation）するために
HindIII開裂末端を加えることによって付加することが
できることを意味し；そしてｎ″は０〜２であり、Ｘ及
びＹの少なくとも１つが、カッコ内の配列が配列GAAGCT
とならないように１つのヌクレオチドを規定する）が特
に有利である。
コード配列の読み枠が開始コドンに整合しており、そし
てプロセシングに際して第１のアミノ酸が成熟ポリペプ
チドの正しいアミノ酸であれば、Gene*のコード配列は
末端Ｔは連結することができる。
Gene*の３′−末端はさらに容易に操作することがで
き、従って構成内の唯一の制限部位にGene*を挿入する
ことを可能にする構成を用いるのが好ましい。このよう
な構成は、読み枠が開始コドンに整合するようにGene*
が挿入される１個の制限部位を有するであろう。このよ
うな構成は次のように表示することができる。
(Tr)a−Ｌ−（Ｒ−Ｓ）ｒ″−（GAXYCX）ｎ″−Ｗ−(S
C)b−Te 式中、前に定義した記号は前記の意味を有し;SCは停止
コドン（stop codon）であり;TeはプロモーターTrに対
応する終結配列（termination sequence）であり、そし
て他のシグナル、例えばポリアデニル化シグナルを含有
することができ；そしてｂは一般に約０〜４、さらに通
常は０〜３の間で変化する整数である。Gene*はそれ自
体の停止コドンを含有していてもよい。
上記の構造を有する配列の例においてはＷが配列GAであ
り、そしてｎ″が２である。
末端ジペプチドをコードする配列がＷと一緒になってリ
ンカー又はコネクターを規定し、これがプロセシングシ
グナルのジペプチドを規定する末端配列の再構成を可能
にしそしてGene*の最初のアミノ酸をコードし、その結
果コドンの解読枠がリーダーの開始コドンと整合する場
合が特に好ましい。リンカーがずれ末端（staggered en
d）又はバットエンド（butt end）を供し、そしてGene*
の連続する配列と共に制限部位を構成するのが好まし
い。リンカーとGene*との連結に際してGene*のコドンの
解読枠がリーダーの開始コドンと整合するであろう。こ
のようにして、プロセシングシグナル配列中の制限部位
に連結される合成配列を用いてプロセシングシグナルを
再構成し、他方においてＮ末端アミノ酸をコードするGe
ne*の最初の塩基を得ることができる。合成配列を用い
ることにより、この合成リンカーを３′−末端に便利な
制限部位を有する適合コネクター（tailored connecto
r）であることができ、そしてこの合成コネクターは遺
伝子の５′−末端のために必要なコドンを供するであろ
う。
上記の方法に代えて、プロセシングシグナルから下流に
制限エンドヌクレアーゼ認識部位を導入し、余分な塩基
の開裂及び除去を可能にし、Gene*を、開始コドンと解
読枠が整合するようにプロセシングシグナルに連結する
ことができる。すなわち、第１のコドンがポリペプチド
のＮ−末端アミノ酸をコードする。ＴがGene*の第１の
塩基である場合には、認識部位が開裂部位より下流にあ
る制限部位を導入することができる。例えば、Sau3A認
識配列をプロセシングシグナルのすぐ後に導入し、これ
によって開裂及びGene*の連結を可能にし、Geneの最初
のコドンの解読枠をリーダー開始コドンと整合せしめる
ことができる。開裂部位から下流の離れたところに認識
部位を有する制限エンドヌクレアーゼ例えばHgaIを用い
る場合、Ｗが、プロセシングシグナル配列の１部分を含
有するような配列を構成することができる。他の構成を
用いることも可能であり、プライマー修復及び試験管内
変異を用いて適当な制限部位を導入することにより構成
中にGene*を便利に挿入することができる。
DNA構成によりベクターに挿入するためのポータブル配
列が得られ、このベクターが所望の複製系を供する。す
でに記載したごとく、ある場合にはリーダー配列に関連
する野性タイプのプロモーターを他のプロモーターに代
えることが好ましい。酵母においては、解糖経路中の酵
素に関与するプロモーターが高い転写速度を供する。こ
れらのプロモーターはホスホグルコイソメラーゼ、ホス
ホフラクトキナーゼ、ホスホトリオースイソメラーゼ、
ホスホグルコムターゼ、ピルビン酸キナーゼ、グリセロ
アルデヒド−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼ、及び
アルコールデヒドロゲナーゼのごとき酵素と関連してい
る。これらのプロモーターをリーダー配列の上流に挿入
することができる。リーダー配列への５′−フランク領
域を維持することができ又は代りのプロモーターの３′
−配列で置き換えることができる。プロモーターを含有
し、そしてそのプロモーターの下流に前記のごときDNA
構成を挿入するのに便利な制限部位を有するベクターを
調製することができ、そして報告されている。
最終構成は、宿主、特に酵母のごとき菌類中に安定に保
持され得るエピゾーム性要素である。この構成は１個又
は複数個、好ましくは２個の複製系を有し、発現宿主中
での保持及び原核生物中でのクローニングが可能であ
る。さらに、１個又は複数個の選択マーカーが含有あ
れ、これにより宿主中でエピゾーム要素を保持するため
の選択圧が得られる。さらに、エピゾーム要素は高い又
は低いコピー数を有し、コピー数は一般に約１〜200の
範囲である。高コピー数エピゾーム要素の場合、コピー
数は10以上、好ましくは20以上であり、そして通常約15
0以下、さらに通常は約100以下である。Gene、及びエピ
ゾーム要素が宿主に与える影響に応じて高コピー数又は
低コピー数が好ましい。エピゾーム要素の発現生成物が
宿主に不利な影響を与える場合、低コピー数が好まし
い。
種々の宿主、特に所望の性質を有する変異株を用いるこ
とができる。構成の発現生成物の生産速度に依存して、
プロセシング酵素はその生産レベルにおいてプロセシン
グのために適切であり又は適切でないことを認識すべき
である。従って、プロセシング酵素の生産が強化された
変異株が好ましく、又はエピゾーム要素によりこの酵素
の生産を増強することができよう。一般に、酵素の生産
は所望の発現生成物の生産より低オーダーであるべきで
ある。
分泌及びプロセシングのためにα−ファクターを使用す
る場合、プロセシング酵素ジペプチジルアミノペプチダ
ーゼＡの生産を高めるのが好ましい。この酵素はSTE13
の発現生成物と考えられる。この酵素はＸ−Ala−及び
Ｘ−Pro−配列に特異的であり、この場合のＸはアミノ
酸、特にジカルボキシアミノ酸である。
前記と異り、細胞内プロセシングが好ましくない場合が
ある。この場合は、分泌は生ずるが生成物はプロセシン
グされないste13変異株を取得するのが好ましい。この
方法においては、生成物はその後で生体外でプロセシン
グすることができる。
発現が調節される宿主変異株が有利に使用される場合が
ある。例えば、融合蛋白質を発現するこの発明の構成を
用いることにより、融合蛋白質の毒性の結果として形質
転換体の増殖が低下する。従って、増殖中には発現を抑
制して宿主を高濃度に増殖せしめ、その後条件を発現の
ための条件に変える。
制御された発現を達成するために、温度感受性sir変異
株を使用することができる。SIR遺伝子のいずれかにお
ける変異によりHML及びHMR座に存在する通常は静止して
いるMATa 及びMATα 配列がその場で発現するため、非交
配表現型（non−mating phenotype）が生ずる。
さらに、すでに記載したように、Gene*は多数の配列、
すなわち同一の配列又は異る配列を、プロセシングシグ
ナルの介在を伴って縦列的（タンデム）に有することが
できる。この場合、生成物は完全に又は部分的にプロセ
シングされて、種々の配列それ自体が、又は縦列的（タ
ンデム）な形で得られ、これがさらに処理される。多く
の場合、個々の配列が蛋白質生成物のサブユニットであ
る種々の配列を得ることが好ましい。
Gene*は興味ある任意のタイプのポリペプチドをコード
することができる。ポリペプチドは小さい８アミノ酸の
オリゴペプチドでもよく、あるいは100,000ダルトン以
上であってもよい。通常、単鎖は約300,000ダルトンよ
り小であり、さらに一般的には約150,000より小であ
る。特に好ましいのは約5,000〜150,000ダルトンのポリ
ペプチド、さらに特定すれば約5,000〜10,000ダルトン
の蛋白質である。好ましいポリペプチドの例には、ホル
モン及び因子、例えば成長ホルモン、ソマトメジン上皮
増殖因子、内分泌物、例えば黄体形成ホルモン、プロラ
クチン等；造血因子、例えばエリスロポイエチン、コロ
ニー刺激因子等；リンポカイン；グロビン；グロブリ
ン、例えば免疫グロブリン；アルブミン；インターフェ
ロン；例えばα，β及びγインターフェロン；レプレッ
サー；酵素；エンドルフィン、例えばβ−エンドルフィ
ン、エンケファリン、ダイノルフィン等である。
この発明の構成を含有するエピゾーム要素を調製した
後、この要素を適当な宿主に導入する。この導入は常法
に従って行う。DNAを宿主に導入する方法は種々ある。
便利には、例えばHinnen等、PNAS USA（1978）75:1919
−1933;又はStinchcomb等、EP0045573A2の方法を用いて
スフェロプラストを調製する。次に、この形質転換体
を、この形質転換体のために適当な選択圧を維持した適
当な栄養培地中で増殖せしめる。発現が誘導的である場
合には、酵母を高密度に増殖せしめ、そして次に発現を
誘導する。生成物の実質的部分がペリプラズム空間に保
有される場合には、酵母細胞を酵素、例えばチモラーゼ
（zymolase）又はリティカーゼ（lyticase）で処理する
ことにより生成物を遊離せしめることができる。
生成物を常用手段により回収し、蛋白質をクロマトグラ
フィー、電気泳動、透析、溶剤／溶剤抽出等により精製
する。
この発明に従えば、広範囲の蛋白質の分泌がもたらさ
れ、これにより生成物の収量が増加し、精製が簡単にな
り、目的生成物の分解が最少となり、そして処理装置及
び工学的要求が単純化される。さらに、生産に基く栄養
の資化が強化され、この結果ポリペプチドのより経済的
且つより効率的製造が達成される。さらに、酵母を使用
することにより、原核生物の場合に存在するエンテロト
キシンが生産されず、又長期間にわたって酵母について
開発されてきた公知の技法を用いることができるという
利点が得られる。この技法には酵母生成物の分離技法が
含まれる。
次に例によりこの発明をさらに具体的に説明する。但
し、これによりこの発明の範囲を限定するものではな
い。
実験 H.Gregory及びB.M Preston,Int.J.Peptide Protein Re
s.9,107〜118（1977）により報告されたヒト−上皮増殖
因子（human epidermal growth factor）（EGF）のアミ
ノ酸配列に基ずく、次の配列を有するEGFのための合成
配列を調製した。
（式中、５′は配列のプロモーターに近い末端を示
す。） この配列をpBR328のEcoRI部位に挿入してプラスミドp32
8EGF−１を調製し、そしてクローニングした。
およそ30μｇのp328EGF−１をEcoRIで消化し、そして約
１μｇの期待される190bpEcoRI断片を分離した。これを
制限酵素HgaＩで消化した。次に、２種類の合成オリゴ
ヌクレオチドコネクターHindIII−HgaＩ及びHgaＩ−Sal
Iを159bpHgaI断片に連結した。HgaＩ−HindIIIリンカー
は次の配列を有する。
AGCTGAAGCT CTTCGATTGAG このリンカーは、HindIII消化により中断されたα−フ
ァクタープロセシングシグナルを復元し、そしてEGF遺
伝子の５′末端のHgaＩ末端をpAB112のHindIII末端に連
結する。Hga Ｉ−SalＩリンカーは次の構造を有する。
TGAGATGATAAG ACTATTCAGCT このリンカーは２つの終結コドンを有し、そしてEGF遺
伝子の３′末端のHgaＩ末端をpAB112のSalＩ末端に連結
する。
得られた181bp断片を調製用ゲル電気泳動により精製
し、そしてあらかじめ酵素HindIII及びSalＩにより完全
消化した100ngのpAB112に連結した。驚くべきことに、E
GFの３番目及び４番目のアミノ酸であるasp及びserのた
めのコドンが欠落し、そしてEGFの他の部分は維持され
た。pAB112は、HindIII及びSalI部位が除去されたpBR32
2（pAB11）のEcoRI部位でクローニングされた酵母α−
ファクター遺伝子を伴う1.75kbEcoRI断片を含有するプ
ラスミドである。pAB112は、プラスミドYEp24のBamHI部
位においてクローニングされた部分的Sau3A断片として
酵母α−ファクター遺伝子を含有するプラスミドpAB101
から誘導した。pAB101は、公表されているα−因子コー
ド領域（Kurjan及びHerskowitz,Abstracts 1981 Cold S
pring Harbor meeting on the Molecular Biology of Y
easts,242頁）と相同の合成20連オリゴヌクレオチドプ
ローブ、 （３′−GGCCGGTTGGTTACATGATT−５′）を用いて、YEp2
4について酵母ゲノムライブラリーをスクリーニングす
ることにより得られた。
得られた混合物を用いてＥ. coliHB101細胞を形質転換
し、そしてプラスミドpAB201を得た。プラスミドpAB201
（５μｇ）を酵素EcoRIにより完全消化し、そして得ら
れた断片を、 （ａ）DNAポリメラーゼＩクレノウ（Klenow）フラグメ
ントを用いて充たし； （ｂ）過剰のBamHIリンカーに連結し；そして、 （ｃ）BamHIで消化する。
1.75kbpの断片を調製用ゲル電気泳動により分離し、そ
して約100ngの断片を100ngのpC1/1に連結した。このpC1
/1はあらかじめ酵素BamHIにより完全消化し、そしてア
ルカリホスファターゼにより処理したものである。
プラスミドpC1/1はpJDB219,Beggs,Nature（1978）275:1
04の誘導体であり、pC1/1においては、pJDB219における
細菌プラスミドpMB9に対応する領域がpBR322により置き
換えられている。この混合物を用いて、Ｅ. コリHB101
細胞を形質転換した。形質転換体をアンピシリン耐性に
より選択し、そしてそのプラスミドを制限エンドヌクレ
アーゼを用いて分析した。選択された１つのクローン
（pYEGF−８）のDNAを調製し、そしてこれを用いて酵母
AB103細胞を形質転換した。形質転換体はleu+表現型に
より選択した。
プラスミドｐ−YEGF−８により形質転換された酵母AB10
3株（α，pep４−３，leu ２−３，leu ２−112，ura ３−
52，his ４−580）をロイシンを含有しない培地50ml中に
飽和まで（600nmの光学濃度５）増殖せしめ、そしてさ
らに12時間振とうした。遠心分離により細胞上清を集め
そして線維芽細胞リセプター競争結合測定法により、ヒ
トEGFの存在について分析した。このEGF測定は、ヒト−
包皮線維芽細胞上の結合部位について125Ｉ−標識マウ
スEGFと競争するマウス及びヒトEGFの能力に基礎を置い
ている。このような条件のもとで、２〜20ngのEGFが容
易に測定できる。ヒト−線維芽細胞への125I−標識上皮
細胞増殖因子の結合についての詳細はCarpenter等、J.B
iol. Chem. 250,4297（1975）に記載されている。この測
定により、培地が１当り７±1mgのヒト−EGFを含有す
ることが見出される。
さらに特徴付けるため、上清液中のヒト−EGFを、イオ
ン交換樹脂Biorex−70に吸着せしめ、そして80％エタノ
ール中10mM HClで溶出することにより精製した。HCl及
びエタノールを蒸発せしめた後、EGFを水に溶解した。
この物質は、分子量約6,000の１種類の主たる蛋白質と
して移動し、真正のマウスEGF（分子量約6,000）とおよ
そ同じであった。このことは、α−ファクターリーダー
配列が、分泌過程において適切に除去されたことを示
す。高分離液体クロマトグラフィー（ミクロボンダパッ
クC18,ウォーターズカラム）による分析によって、この
生成物は、真正のマウスEGF標準と同様の保持時間をも
って移動することが示された。しかしながら、エドマン
（Edman）分解による蛋白質配列決定により、Ｎ末端がg
lu−ala末端を保持していることが示された。
hEGFをα−ファクター分泌リーダー配列と連結するため
の異る構成を用いて他の多くの構成を調製した。これら
は異なるプロセシングシグナル及び部位変異を有する。
第２図ａ〜ｅにおいて、hEGFのＮ−末端部位における融
合配列を示す。この配列は幾つかの構成の間で異る。ｆ
はhEGFのＣ末端における配列を示す。これはすべての構
成において同じである。これらの構成中に使用した合成
オリゴヌクレオチドリンカーは枠で囲んである。
これらの融合は次のようにして行った。構成（ａ）は前
記のようにして調製した。構成（ｂ）は構成（ａ）と同
様にして調製したがリンカー１の代りにリンカー２を用
いた。リンカー２は、hEGF遺伝子のすぐ前に追加のプロ
セシング部位（ser−leu−asp−lys−arg）を挿入する
ことによりα−ファクタープロセシングシグナルを変更
している。得られた酵母プラスミドをpYαEGF−22と称
する。構成（ｃ）はジペプチジルアミノペプチターゼ成
熟部位（glu−ala）が除去されており、構成（ａ）の試
験管内変異により得られそ。α−ファクターリーダーhE
GF融合を含有するPstＩ−SalＩ断片をファージM13中で
クローニングし、そして単鎖形を分離した。合成31連ヌ
クレオチド、５′−TCTTTGGATAAAAGAAACTCCGACTCCCG−
３′を合成し、そしてこの70ピコモルを、DNAポリメラ
ーゼのクレノウ（Klenow）フラグメントを用いて前記の
テンプレート１ピコモルから第２鎖を合成するためのプ
ライマーとして使用した。補充（fill−in）し、そして
14℃にて18時間連結した後、混合物をS1ヌクレアーゼで
処理（５ユニット、15分間）し、そしてE. コリTM101細
胞をトランスフェクトするのに用いた。glu−alaをコー
ドする領域が除去されたDNA配列を含有するバクテリオ
ファージの位置を、プローブとして32p−標識プライマ
ーを用いるフィルタープラクハイブリッド形成により決
定した。陽性プラクからのRFDNAを分離し、PstＩ及びSa
lＩ消化し、そして得られた断片を、あらかじめSalＩで
完全消化しそしてPstＩで部分消化しそしてアルカリホ
スファターゼで処理したpAB114中に挿入した。
プラスミドpAB114は次のようにして誘導した。プラスミ
ドpAB112をHindIIIにより完全消化し、そして高いDNA濃
度（４μg/ml）において再結合せしめ、そしてα−因子
構造遺伝子から３個の63bpHindIII断片が除去されそし
て１個の成熟α−ファクターコード領域のみが残ってい
るプラスミドpAB113を得た。EcoRIで切断し、突出して
いる末端をDNAポリメラーゼのクレノウフラグメントを
用いて補充し、BamHIリンカーを結合し、BamHIにより切
断することによってプラスミドpAB11にBamHIを加え、そ
して再連結することによってpAB12を得た。プラスミドp
AB113をEcoRIにより消化し、突出している末端を補充
し、そしてBamHIリンカーに結合した。BamHIで消化した
後1500bp断片をゲル過し、そしてBamHIで消化しそし
てアルカリホスファターゼで処理したpAB12と連結し
た。α−ファクター遺伝子を担持する1500bpBamHI断片
を含有するプラスミドpAB114を得た。得られたプラスミ
ド（前記の構成を含有するpAB114）をBamHIで消化し、
そしてプラスミドpC1/1中に連結した。
得られた酵母プラスミドをpYαEGF−23と称する。構成
（ｄ）は新しいKpmＩ部位を有し、構成（ｃ）について
記載したのと同様にして調製した。但し配列５′−GGGT
ACCTTTGGATAAAAGAAACTCCGACTCCGAAT−３′を有する36連
オリゴヌクレオチドプライマーを使用した。こうして得
られた酵母プラスミドをpYαEGF−24と称する。構成
（ｅ）は、構成（ｄ）をを含有するプラスミドをリンカ
ー１及び２を用いないでKpnＩ及びSalＩで消化すること
により誘導した。得られた酵母プラスミドをpYαEGF−2
5と称する。
pYαEGF−22で形質転換した酵母細胞を15mlの培地に増
殖せしめた。示された濃度及び時間において培養物を遠
心分離し、そして上清液を得、氷上に保持した。細胞ペ
レットを溶解緩衝液（0.1トリトンＸ−100,10mMNaHPO4,
pH7.5）中で洗浄し、そして１容量の溶解緩衝液及び１
容量のガラスビーズ中で渦動せしめる（氷上で冷却しな
がら１分間間隔で５分間）ことにより破砕した。遠心分
離の後上清液を集め、そして氷上に保持した。培地中及
び細胞抽出液中のhEGFの量を、線維芽細胞リセプター結
合競争測定により測定した。標準量の125I−標識マウス
EGFの結合に対する増加する量のマウスEGFの効果を測定
することにより標準曲線を得た。
蛋白質を、Bio−Rex70樹脂への吸着及び80％エタノール
中0.01NHClによる溶出によって培地から濃縮し、そして
逆相C18カラムを用いる高速液体クロマトグラフィーに
より精製した。カラムを、0.2％のトリフルオロ酢酸を
含有する５％〜80％のアセトニトリルの直線グラディエ
ントにより4ml/分の流速で60分間溶出した。蛋白質（20
0〜800ピコモル）のアミノ末端のアミノ酸配列を、エド
マン分解法により、気相蛋白質シーケンサーApplied Bi
osystems model 470Aを用いて決定した。すべての分析
に通常のPROTFAプログラムを使用した。S2（酢酸エチ
ル:20mg/l）及びS3（塩化ブチル:10mg/l）に、使用直前
にジチオスレイトールを加えた。すべての試料をメタノ
ール中1N HClにより40℃にて15分間処理することによ
り、PTH−アスパラギン酸及びPTH−グルタミン酸をこれ
らのメチルエステルに転換した。すべてのPTH−アミノ
酸の同定は、標準としてPTH−アミノ酸の既知混合物を
用いて、IBM CN HPLCカラム上での保持時間を比較する
ことにより行った。
pYαEGF−22は、天然Ｎ末端hEGFとglu−ala末端hEGFを
4:1のモル比で分泌し、他方pYαEGF−23〜25は天然Ｎ末
端hEGFのみを分泌した。hEGFの収量は、蛋白質として又
はリセプター結合測定において測定した場合５〜８μg/
mlの範囲であった。
JRY188株（ MAT sir 2-8 Leu ２−３ Leu ２−112 trp
１ ura ３ his ４ rme）をpYαEGF−21で形質転換し、
そしてロイシン原栄養株を37℃において選択した。飽和
した培養物を新鮮培地中に1/100に稀釈し、そして許容
温度（24℃）及び非許容温度（36℃）においてロイシン
選択培地中で増殖せしめ、そして培養上清液中のhEGFの
存在を前記のようにして測定した。結果を次の表に示
す。
形質転換された酵母sir３温度感受性変異株におけるhEG
Fの制御された合成及び分泌 これらの結果はハイブリッドα−因子/EGF遺伝子が、高
コピー数プラスミド上に存在する場合でも、交配型（ma
ting type）制御のもとで発現されることを示す。
この発明に従えば、ベクターに挿入される新規な構成が
提供され、これによりＮ末端リーダー配列と１個又は複
数個のプロセシングシグナルを有するポリペプチドが発
現され、そしてポリペプチドの分泌及び余分のアミノ酸
を含まない成熟ポリペプチド生成物を生じさせるプロセ
シングがもたらされる。すなわち、天然ポリペプチドと
同じ配列を有するポリペプチドが得られる。さらに、ポ
リペプチドが酵母中で生産され得るためのグリコキル化
が生ずることができ、その結果天然生成物と同じ生成物
が得られる。さらに、生成物が分泌されるため、細胞数
に基いて非常に高い収量が得られ、そしてプロセシング
及び精製が非常に単純化される。さらに、変異宿主を用
いることにより、発現の停止及び開始を意のままに制御
することができる。
以上、例示によってこの発明をいく分詳細に記載した
が、これは明確な理解に資するためのものであって、こ
れによりこの発明の範囲を限定するものではない。
なお、酵母サッカロミセス・セレビシエー（S.cerevisi
ae）AB103（pYEGF8）は、1983年１月５日A.T.C.C.に寄
託され、受け入れ番号No.20658が与えられている。
プラスミドpYαEGF23（pAB114−pC1/1）は、1983年８月
12日にA.T.C.C.寄託され、受け入れ番号No.40079が与え
られている。
【図面の簡単な説明】
第１図はプラスミドpYαEGF−21を構成するための系統
図であり、第２図はhEGFのＮ末端とリーダー配列連結部
の配列、及びhEGFのＣ末端の配列を示す図である。
フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｒ 1:865） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:865）

Claims (25)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】酵母にとって外来性のポリペプチドをコー
    ドするDNAであって、該ポリペプチドは、 （ａ）酵母α−ファクターリーダー配列の少なくとも一
    部分を含んで成る第一アミノ酸配列、ここで、該酵母α
    −ファクターリーダー配列の少なくとも一部分は、22個
    のアミノ酸から成るシグナル配列の少なくとも一部分で
    あって分泌を提供するものを含有している、 （ｂ）酵母プロセシングシグナルを含んで成る第二アミ
    ノ酸配列、ここで、該酵母プロセシングシグナルは該第
    二アミノ酸配列のＣ−末端に位置し、且つ配列（Ｎ−末
    端）−R1−R2−（Ｃ−末端）（ここで、R1はリジン又は
    アルギニンであり、そしてR2はリジン又はアルギニンで
    ある）を有する、及び （ｃ）異種性ポリペプチド配列、 を含んで成り、ここで、前記第二アミノ酸配列はそのＮ
    −末端において前記第一アミノ酸配列に連結されてお
    り、そしてそのＣ−末端において前記異種性ポリペプチ
    ド配列に連結されており、該第一アミノ酸配列は該異種
    性ポリペプチド配列の細胞外分泌を行うことができ、そ
    して該第二アミノ酸配列は前記（ｂ）及び（ｃ）を含ん
    で成る前駆体ポリペプチドからアミノ酸を除去して該異
    種性ポリペプチドを生成させることを可能にするもので
    ある、ことを特徴とするDNA。
  2. 【請求項２】前記異種性ポリペプチドが哺乳類蛋白質を
    含んで成る特許請求の範囲第１項に記載のDNA。
  3. 【請求項３】前記哺乳類蛋白質がヒト上皮成長因子であ
    る特許請求の範囲第１項に記載のDNA。
  4. 【請求項４】次の式： ５′−Tr−Ｌ−Ｓ−Gene*−Te−３′ （式中、 Trは、酵母プロモーター配列であり； Ｌは、細胞外分泌を提供する前記酵母α−ファクターリ
    ーダー配列の少なくとも部分をコードしており； Ｓは、前記プロセシングシグナルをコードしているスペ
    ーサーであり； Gene*は、酵母にとって外来性であるポリペプチドをコ
    ードしており；そして Teは、Trに対応する転写終止シグナルである）で表わさ
    れる特許請求の範囲第１項に記載のDNA。
  5. 【請求項５】ＳがジペプチジルアミノペプチダーゼＡの
    ためのプロセシングシグナルを含有しない特許請求の範
    囲第４項に記載のDNA。
  6. 【請求項６】Gene*が哺乳類蛋白質をコードしている特
    許請求の範囲第４項〜第５項のいずれか１項に記載のDN
    A。
  7. 【請求項７】前記哺乳類蛋白質がヒト上皮成長因子であ
    る特許請求の範囲第６項に記載のDNA。
  8. 【請求項８】Ｌがサッカロミセス（Saccharomyces）α
    −ファクターリーダーからの配列をコードしている、特
    許請求の範囲第４項〜第７項に記載のDNA。
  9. 【請求項９】前記サッカロミセスがサッカロミセス、セ
    レビシエー（Saccharomyces cerevisiae）である特許請
    求の範囲第８項に記載のDNA。
  10. 【請求項１０】Ｓが（５′）−リジンのコドン−アルギ
    ニンのコドン−（３′）を含んで成る特許請求の範囲第
    ４項〜第９項のいずれか１項に記載のDNA。
  11. 【請求項１１】酵母宿主中で安定に維持される複製系及
    びDNAを含んで成る発現ベクターであって、該DNAは酵母
    にとって外来性のポリペプチドをコードしており、該ポ
    リペプチドは、 （ａ）酵母α−ファクターリーダー配列の少なくとも一
    部分を含んで成る第一アミノ酸配列、ここで該酵母α−
    ファクターリーダー配列の少なくとも一部分は、22個の
    アミノ酸から成るシグナル配列の少なくとも一部分であ
    って分泌を提供するものを含有している、 （ｂ）酵母プロセシングシグナルを含んで成る第二アミ
    ノ酸配列、ここで、該酵母プロセシングシグナルは該第
    二アミノ酸配列のＣ−末端に位置し、且つ配列（Ｎ−末
    端）−R1−R2−（Ｃ−末端）（ここで、R1はリジン又は
    アルギニンであり、そしてR2はリジン又はアルギニンで
    ある）を有する、及び （ｃ）異種性ポリペプチド配列、 を含んで成り、ここで、前記第二アミノ酸配列はそのＮ
    −末端において前記第一アミノ酸配列に連結されてお
    り、そしてそのＣ−末端において前記異種性ポリペプチ
    ド配列に連結されており、該第一アミノ酸配列は該異種
    性ポリペプチド配列の細胞外分泌を行うことができ、そ
    して該第二アミノ酸配列は前記（ｂ）及び（ｃ）を含ん
    で成る前駆体ポリペプチドからアミノ酸を除去して該異
    種性ポリペプチドを生成させることを可能にするもので
    ある、ことを特徴とする発現ベクター。
  12. 【請求項１２】前記異種性ポリペプチドが哺乳類蛋白質
    を含んで成る特許請求の範囲第11項に記載の発現ベクタ
    ー。
  13. 【請求項１３】前記哺乳類蛋白質がヒト上皮成長因子で
    ある特許請求の範囲第12項に記載の発現ベクター。
  14. 【請求項１４】次の式： ５′−Tr−Ｌ−Ｓ−Gene*−Te−３′ （式中、 Trは、酵母プロモーター配列であり； Ｌは、細胞外分泌を提供する前記酵母α−ファクターリ
    ーダー配列の少なくとも部分をコードしており； Ｓは、前記プロセシングシグナルをコードしているスペ
    ーサーであり； Gene*は、酵母にとって外来性であるポリペプチドをコ
    ードしており；そして Teは、Trに対応する転写終止シグナルである）で表わさ
    れる特許請求の範囲第11項に記載の発現ベクター。
  15. 【請求項１５】ＳがジペプチジルアミノペプチダーゼＡ
    のためのプロセシングシグナルを含有しない特許請求の
    範囲第14項に記載の発現ベクター。
  16. 【請求項１６】Ｓが（５′−）リジンのコドン−アルギ
    ニンのコドン（−３′）を含んで成る、特許請求の範囲
    第14項又は第15項に記載の発現ベクター。
  17. 【請求項１７】プラスミドpCl/1を含んで成る特許請求
    の範囲第11項に記載の発現ベクター。
  18. 【請求項１８】前記DNAがプラスミドpCl/1にEcoRI部位
    において挿入されており、該DNAが次の段階、すなわ
    ち、 酵母ゲノムライブラリーからα−ファクターをコードす
    る配列を含んで成るEcoRI断片を取り、 該EcoRI断片からHindIII−SalI断片を除去し、 該除去された断片の代りに異種性ポリペプチドをコード
    する配列を挿入し、そして、 前記EcoRI断片から、前記HindIII部位のすぐ前に位置す
    る（Glu−Ala）をコードする配列を除去する 段階を含んで成る方法により作製されたものである、特
    許請求の範囲第17項に記載の発現ベクター。
  19. 【請求項１９】プラスミドpYαEGF23（ATCC No.40079）
    を含んで成る、特許請求の範囲第11項に記載の発現ベク
    ター。
  20. 【請求項２０】酵母α−ファクターリーダー配列の22個
    のアミノ酸から成るシグナル配列の少なくとも一部分で
    あって分泌を提供するものを含んで成るアミノ酸配列
    と、該アミノ酸配列に酵母プロセシングシグナルを介し
    て連結されている異種性ポリペプチドとを含んで成る酵
    母にとって異種性のポリペプチドをコードするDNAの製
    造方法であって、 酵母ゲノムライブラリーからα−ファクターをコードす
    る配列を有するEcoRI断片を取り、 該断片からHindIII−SalI断片を除去し、 該除去された断片に代って異種性ポリペプチドをコード
    する配列を挿入し、そして 前記DNAから、HindIII部位のすぐ前に位置する（Glu−A
    la）をコードする配列を除去することを特徴とする方
    法。
  21. 【請求項２１】前記異種性ポリペプチドがEGFである、
    特許請求の範囲第20項に記載の方法。
  22. 【請求項２２】酵母にとって外来性のポリペプチドをコ
    ードするDNAにより形質転換された酵母細胞であって、
    該ポリペプチドは、 （ａ）酵母α−ファクターリーダー配列の少なくとも一
    部分を含んで成る第一アミノ酸配列、ここで、該酵母α
    −ファクターリーダー配列の少なくとも一部分は、22個
    のアミノ酸から成るシグナル配列の少なくとも一部分で
    あって分泌を提供するものを含有している、 （ｂ）酵母プロセシングシグナルを含んで成る第二アミ
    ノ酸配列、ここで、該酵母プロセシングシグナルは該第
    二アミノ酸配列のＣ−末端に位置し、且つ配列（Ｎ−末
    端）−R1−R2−（Ｃ−末端）（ここで、R1はリジン又は
    アルギニンであり、そしてR2はリジン又はアルギニンで
    ある）を有する、及び （ｃ）異種性ポリペプチド配列、 を含んで成り、ここで、前記第二アミノ酸配列はそのＮ
    −末端において前記第一アミノ酸配列に連結されてお
    り、そしてそのＣ−末端において前記異種性ポリペプチ
    ド配列に連結されており、該第一アミノ酸配列は該異種
    性ポリペプチド配列の細胞外分泌を行うことができ、そ
    して該第二アミノ酸配列は前記（ｂ）及び（ｃ）を含ん
    で成る前駆体ポリペプチドからアミノ酸を除去して該異
    種性ポリペプチドを生成させることを可能にするもので
    ある、ことを特徴とする酵母細胞。
  23. 【請求項２３】次の式： ５′−Tr−Ｌ−Ｓ−Gene*−Te−３′ （式中、 Trは、酵母プロモーター配列であり； Ｌは、細胞外分泌を提供する前記酵母α−ファクターリ
    ーダー配列の少なくとも部分をコードしており； Ｓは、前記プロセシングシグナルをコードしているスペ
    ーサーであり； Gene*は、酵母にとって外来性であるポリペプチドをコ
    ードしており；そして Teは、Trに対応する転写終止シグナルである）で表わさ
    れるDNAにより形質転換された特許請求の範囲第22項に
    記載の酵母細胞。
  24. 【請求項２４】酵母宿主中で安定に維持される複製系及
    びDNAを含んで成る発現ベクターにより形質転換された
    酵母細胞であって、該DNAは酵母にとって外来性のポリ
    ペプチドをコードしており、該ポリペプチドは、 （ａ）酵母α−ファクターリーダー配列の少なくとも一
    部分を含んで成る第一アミノ酸配列、ここで該酵母α−
    ファクターリーダー配列の少なくとも一部分は、22個の
    アミノ酸から成るシグナル配列の少なくとも一部分であ
    って分泌を提供するものを含有している、 （ｂ）酵母プロセシングシグナルを含んで成る第二アミ
    ノ酸配列、ここで、該酵母プロセシングシグナルは該第
    二アミノ酸配列のＣ−末端に位置し、且つ配列（Ｎ−末
    端）−R1−R2−（Ｃ−末端）（ここで、R1はリジン又は
    アルギニンであり、そしてR2はリジン又はアルギニンで
    ある）を有する、及び （ｃ）異種性ポリペプチド配列、 を含んで成り、ここで、前記第二アミノ酸配列はそのＮ
    −末端において前記第一アミノ酸配列に連結されてお
    り、そしてそのＣ−末端において前記異種性ポリペプチ
    ド配列に連結されており、該第一アミノ酸配列は該異種
    性ポリペプチド配列の細胞外分泌を行うことができ、そ
    して該第二アミノ酸配列は前記（ｂ）及び（ｃ）を含ん
    で成る前駆体ポリペプチドからアミノ酸を除去して該異
    種性ポリペプチドを生成させることを可能にするもので
    ある、ことを特徴とする酵母細胞。
  25. 【請求項２５】次の式： ５′−Tr−Ｌ−Ｓ−Gene*−Te−３′ （式中、 Trは、酵母プロモーター配列であり； Ｌは、細胞外分泌を提供する前記酵母α−ファクターリ
    ーダー配列の少なくとも部分をコードしており； Ｓは、前記プロセシングシグナルをコードしているスペ
    ーサーであり； Gene*は、酵母にとって外来性であるポリペプチドをコ
    ードしており；そして Teは、Trに対応する転写終止シグナルである）で表わさ
    れる発現ベクターにより形質転換された特許請求の範囲
    第24項に記載の酵母細胞。
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