JPH0372893A - 酵母による組換ポリペプチドの製造方法 - Google Patents
酵母による組換ポリペプチドの製造方法Info
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- JPH0372893A JPH0372893A JP2061304A JP6130490A JPH0372893A JP H0372893 A JPH0372893 A JP H0372893A JP 2061304 A JP2061304 A JP 2061304A JP 6130490 A JP6130490 A JP 6130490A JP H0372893 A JPH0372893 A JP H0372893A
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
発明の背景
（発明の分野）
バイブリドＤＮＡ技法は無数の種類の組成のポリペプチ
ドを製造する可能性に革命をもたらした。
ドを製造する可能性に革命をもたらした。
生物は蛋白質によって構成されてかり、そして制御のた
めに蛋白質を用いるから、これらの蛋白質を意の１１に
製造することが可能であれば、これらの蛋白質の機能様
式を研究し、そして治療及び診断に釦いてこれらの蛋白
質、これらの蛋白質の断片又は類似体を使用する独特の
機会が得られる。
めに蛋白質を用いるから、これらの蛋白質を意の１１に
製造することが可能であれば、これらの蛋白質の機能様
式を研究し、そして治療及び診断に釦いてこれらの蛋白
質、これらの蛋白質の断片又は類似体を使用する独特の
機会が得られる。
細胞による蛋白質の生産速度及び量の改良におして多く
の進歩が存在する。これらの進歩のほとんどがより大き
なコピー数、より効果的なプロモーター、及び所望の生
成物の分解量を減少せしめる手段と関連している。目的
生成物たる目的ポリペプチドの分泌が可能であることが
非常に望ましいことが明らかである。
の進歩が存在する。これらの進歩のほとんどがより大き
なコピー数、より効果的なプロモーター、及び所望の生
成物の分解量を減少せしめる手段と関連している。目的
生成物たる目的ポリペプチドの分泌が可能であることが
非常に望ましいことが明らかである。
さらに、多くの状況において、目的ポリペプチドは最初
のメチオニンアミノ酸を有しな−。これは、目的ポリペ
プチドをコードする遺伝子中にプロセシングシグナルが
存在し、遺伝子源がそれを認識し、そして適当なペプチ
ダーゼによりポリペプチドが開裂する結果Ｔある。はと
んどの状況において、問題の遺伝子は、その遺伝子が中
で発現する宿主にとって外来性であるから、このよう□
プロセシングは発現宿主中で不正確であり、そして発生
率が低い。この場合、得られる蛋白質はほとんどすべて
の配列において目的ペプチドと同じであるが、Ｎ末端に
釦いて異なり、このために生理的活性が有害な影響を受
ける場合がある。
のメチオニンアミノ酸を有しな−。これは、目的ポリペ
プチドをコードする遺伝子中にプロセシングシグナルが
存在し、遺伝子源がそれを認識し、そして適当なペプチ
ダーゼによりポリペプチドが開裂する結果Ｔある。はと
んどの状況において、問題の遺伝子は、その遺伝子が中
で発現する宿主にとって外来性であるから、このよう□
プロセシングは発現宿主中で不正確であり、そして発生
率が低い。この場合、得られる蛋白質はほとんどすべて
の配列において目的ペプチドと同じであるが、Ｎ末端に
釦いて異なり、このために生理的活性が有害な影響を受
ける場合がある。
従って、分泌をコードし、そしてポリペプチド生成物を
成熟せしめるＤＮＡ配列を調製することが非常に有利で
あるとする多くの理由が存在する。
成熟せしめるＤＮＡ配列を調製することが非常に有利で
あるとする多くの理由が存在する。
さらに、目的のポリペプチドにとって不必要なアミノ酸
を除去するプロセシングのための配列が見出される場合
、単一転写上にタンデムにコードされているであろう同
一の又は異なる多数のＤＮＡ配列が得られる可能性が存
在する。
を除去するプロセシングのための配列が見出される場合
、単一転写上にタンデムにコードされているであろう同
一の又は異なる多数のＤＮＡ配列が得られる可能性が存
在する。
以下余白
（従来技術の記載）
米国特許第４．３３６，３３６号は、通常細胞表面に又
はそれを超えて輸送される非細胞質性蛋白質をコードす
る原核生物のためのり一メー配列の使用について記載し
ておシ、この場合融合蛋白質は槓しデラズム空間に輸送
される。米国特許第４．３３８，３９７号は、目的のポ
リペプチドからリーダー配列を開裂して分泌を生じさせ
るリーダー配列を用いる原核細胞について記載している
。米国特許第４．３３８，３９７第３欄及び第４欄は有
用な定義を提供してかり、この定義を引用によりこの明
細書に組み入れる。
はそれを超えて輸送される非細胞質性蛋白質をコードす
る原核生物のためのり一メー配列の使用について記載し
ておシ、この場合融合蛋白質は槓しデラズム空間に輸送
される。米国特許第４．３３８，３９７号は、目的のポ
リペプチドからリーダー配列を開裂して分泌を生じさせ
るリーダー配列を用いる原核細胞について記載している
。米国特許第４．３３８，３９７第３欄及び第４欄は有
用な定義を提供してかり、この定義を引用によりこの明
細書に組み入れる。
クージャン（Ｋｕｒｊａｎ）及びヘルスコビッチ（Ｈｅ
ｒｓｋｏｗｉ ｔｚ） Ｃｅ １１（１９８２）３０：
９３３〜９４３は成熟α−ファクターの４個のテンダム
コピーを含む推定上のα−ファクター前駆体につ−て記
載し、その配列ｔ−記載しそしてプロセシングの機構を
予想している。ｒＡ Ｐｕｔａｔｉｖｅα−Ｆａｃｔｏ
ｒ ＰｒｅｃｕｒｓｏｒＣｏｎｔａｉｎｉｎｇ Ｆｏｕ
ｒ Ｔａｎｄｅｍ Ｒｅｐｅａｔｓ ｏｆ Ｍａｔｕｒ
ｅα−ＦａｃｔｏｒＪと題するＴｈｅ Ｍｏ１ｅｃｕｌ
ａｒ ＢｊｏｌｏｇｙｏｆＹｅａｓｔｓの１９８１年ス
プリングハーバーミ→イングの要約２４２頁において、
クージャン及びヘルスコビッチはα−ファクターをコー
ドする配列及びこの２個の配列の間のスペーサーについ
て記載して（ハる。プライア（Ｂｌａｉｒ）等はｒｓｙ
ｎｔｈｅｓｔｓａｎｄ Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ ｏｆ
Ｙｅａｓｔ Ｐｈｅｒｅｍｏｎｅｓ ：Ｉｄｅｎｔｉｆ
ｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚ
ａｔｉｏｎ ｏｆＭｕｔａｎｔｓ Ｔｈａｔ Ｐｒｏ
ｄｕｃｅ Ａｌｔｅｒｅｄ （！ −ＦａｃｔｏｒｓＪ
と題する上記要約にかいて、成熟α−ファクターの生産
に対する種々の変異株の効果を記載している。
ｒｓｋｏｗｉ ｔｚ） Ｃｅ １１（１９８２）３０：
９３３〜９４３は成熟α−ファクターの４個のテンダム
コピーを含む推定上のα−ファクター前駆体につ−て記
載し、その配列ｔ−記載しそしてプロセシングの機構を
予想している。ｒＡ Ｐｕｔａｔｉｖｅα−Ｆａｃｔｏ
ｒ ＰｒｅｃｕｒｓｏｒＣｏｎｔａｉｎｉｎｇ Ｆｏｕ
ｒ Ｔａｎｄｅｍ Ｒｅｐｅａｔｓ ｏｆ Ｍａｔｕｒ
ｅα−ＦａｃｔｏｒＪと題するＴｈｅ Ｍｏ１ｅｃｕｌ
ａｒ ＢｊｏｌｏｇｙｏｆＹｅａｓｔｓの１９８１年ス
プリングハーバーミ→イングの要約２４２頁において、
クージャン及びヘルスコビッチはα−ファクターをコー
ドする配列及びこの２個の配列の間のスペーサーについ
て記載して（ハる。プライア（Ｂｌａｉｒ）等はｒｓｙ
ｎｔｈｅｓｔｓａｎｄ Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ ｏｆ
Ｙｅａｓｔ Ｐｈｅｒｅｍｏｎｅｓ ：Ｉｄｅｎｔｉｆ
ｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚ
ａｔｉｏｎ ｏｆＭｕｔａｎｔｓ Ｔｈａｔ Ｐｒｏ
ｄｕｃｅ Ａｌｔｅｒｅｄ （！ −ＦａｃｔｏｒｓＪ
と題する上記要約にかいて、成熟α−ファクターの生産
に対する種々の変異株の効果を記載している。
発明の要約
成熟ポリペプチドの製造するための方法及び組成が提供
される。酵母リーダー配列、及びポリペプチド生成物の
分泌と成熟のための外来性遺伝子に対するプロセシング
シグナルとをコードするＤＮＡ配列を連結するＤＮＡ構
成が提供される。Ｎ−末端開裂性オリゴペゾチドをコー
ドｆルＤＮＡ’１ｇ成及び成熟ポリペデ千ト°生成物を
コードするＤＮＡ配列を、酵母又は所望のポリペプチド
を製造するためのプロセシングシグナルを認識する他の
細胞に導入するための適当なベクターに連結することが
できる。
される。酵母リーダー配列、及びポリペプチド生成物の
分泌と成熟のための外来性遺伝子に対するプロセシング
シグナルとをコードするＤＮＡ配列を連結するＤＮＡ構
成が提供される。Ｎ−末端開裂性オリゴペゾチドをコー
ドｆルＤＮＡ’１ｇ成及び成熟ポリペデ千ト°生成物を
コードするＤＮＡ配列を、酵母又は所望のポリペプチド
を製造するためのプロセシングシグナルを認識する他の
細胞に導入するための適当なベクターに連結することが
できる。
特定の態様の記載
この発明に従えば成熟ポリペプチドを製造するために真
核細胞、特に酵母が使用され、該ポリペプチドが培地か
ら採取される。酵母リーダー及び目的ポリペプチドに結
合したプロセシングシグナル（このポリペプチドは単一
ポリペプチドでもよくプロセシングシグナルにより分離
された多数のポリペプチドでもよい）をコードするＤＮ
Ａ構成を用いることによシポリペプチドが製造される。
核細胞、特に酵母が使用され、該ポリペプチドが培地か
ら採取される。酵母リーダー及び目的ポリペプチドに結
合したプロセシングシグナル（このポリペプチドは単一
ポリペプチドでもよくプロセシングシグナルにより分離
された多数のポリペプチドでもよい）をコードするＤＮ
Ａ構成を用いることによシポリペプチドが製造される。
得られたＤＮＡ構成はプレーブローポリペプチドをコー
ドし、プレーブローポリペプチドを分泌するためのシグ
ナル及びポリペプチドを細胞内又は細胞外で成熟ポリペ
プチドにプロセシングするためのシグナルを含有するで
あろう。
ドし、プレーブローポリペプチドを分泌するためのシグ
ナル及びポリペプチドを細胞内又は細胞外で成熟ポリペ
プチドにプロセシングするためのシグナルを含有するで
あろう。
この発明のＤＮＡ構成は、ブローポリペプチドを規定す
る少なくとも次の構造、 （（Ｒ） （ＧＡＸＹＣＸ） −Ｇｅｎｅ＊）。
る少なくとも次の構造、 （（Ｒ） （ＧＡＸＹＣＸ） −Ｇｅｎｅ＊）。
ｒ ｎ
（式中、ＲはＣＧＸ又はＡＺＺ 、すなわちリジン及び
アルギニンをコードするコドンであってＲの各各は同一
であう又は異り：ｒは２〜４、通常２〜３、好１しくは
２又は４．の整数であり：Ｘは４種のヌクレオチドすな
わちＴ、Ｇ、Ｃ又はＡの内の任意のものであシ：Ｙ！ｄ
Ｇ又はＣであり１ｙは１以上の整数であう１通常は１０
以下であり、さらに通常は４以下であって、モノマー又
はマルチマーを供し：２はＡ又はＧであ＃）：そしてＧ
ｅ ｎｅはα−ファクター以外の遺伝子、通常は酵母宿
主にとって外来性（ｆｏｒｅｉｇｎ）の遺伝子、通常は
異種性（ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ）遺伝子、好１しく
は植物遺伝子又は哺乳動物遺伝子であシ：ｎは０１又は
一般に１−〜４、通常は２〜３の間で変化する整数であ
る）を有する。
アルギニンをコードするコドンであってＲの各各は同一
であう又は異り：ｒは２〜４、通常２〜３、好１しくは
２又は４．の整数であり：Ｘは４種のヌクレオチドすな
わちＴ、Ｇ、Ｃ又はＡの内の任意のものであシ：Ｙ！ｄ
Ｇ又はＣであり１ｙは１以上の整数であう１通常は１０
以下であり、さらに通常は４以下であって、モノマー又
はマルチマーを供し：２はＡ又はＧであ＃）：そしてＧ
ｅ ｎｅはα−ファクター以外の遺伝子、通常は酵母宿
主にとって外来性（ｆｏｒｅｉｇｎ）の遺伝子、通常は
異種性（ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ）遺伝子、好１しく
は植物遺伝子又は哺乳動物遺伝子であシ：ｎは０１又は
一般に１−〜４、通常は２〜３の間で変化する整数であ
る）を有する。
ブローポリペプチドは、Ｇｅｎｅ によシコードされ
るアミノ酸に先行するアミノ酸を除去するペプチダーゼ
のためのＮ−末端プロセシングシグナルを有する。
るアミノ酸に先行するアミノ酸を除去するペプチダーゼ
のためのＮ−末端プロセシングシグナルを有する。
多くの場合、この発明のＤＮＡ構成はプレープローポリ
ペプチドを規定する少なくとも次の構造、Ｌ−（Ｒ−８
−（ＧＡＸＹＣＸ） −Ｇｅｎｅ＊）ｙ（式中、Ｌ及び
Ｓ以外のすべての記号は上に定義した通うであり；Ｓは
Ｒと同じ意味を有し、１個のＲ及び１個のＳが存在し；
そしてＬはプレープローポリペプチドの分泌をもたらす
リーダー配列である）を有する。さらに多くのＲ及びＳ
を有することも可能であるが、アミノ酸を追加すること
には通常利益がなｈ０分泌をもたらす任意のリーダー配
列を用いることができ、リーダー配列は一般に約３０〜
１２０個、通常約３０〜１００個のアミノ酸から成シ、
疎水性領域を有しそしてＮ末端にメチオニンを有スル。
ペプチドを規定する少なくとも次の構造、Ｌ−（Ｒ−８
−（ＧＡＸＹＣＸ） −Ｇｅｎｅ＊）ｙ（式中、Ｌ及び
Ｓ以外のすべての記号は上に定義した通うであり；Ｓは
Ｒと同じ意味を有し、１個のＲ及び１個のＳが存在し；
そしてＬはプレープローポリペプチドの分泌をもたらす
リーダー配列である）を有する。さらに多くのＲ及びＳ
を有することも可能であるが、アミノ酸を追加すること
には通常利益がなｈ０分泌をもたらす任意のリーダー配
列を用いることができ、リーダー配列は一般に約３０〜
１２０個、通常約３０〜１００個のアミノ酸から成シ、
疎水性領域を有しそしてＮ末端にメチオニンを有スル。
ｎが０である場合、ＤＮＡ構成はプレープローポリペプ
チドを規定する次の構造、 Ｌ−（（Ｒ）ｒｚ−Ｇｅｎｅ ）ｙ （式中、ｒ′以外のすべての記号は前に定義した通りで
あり：そしてｒ′は２〜４、好筐しくは２又は４である
）を有する。
チドを規定する次の構造、 Ｌ−（（Ｒ）ｒｚ−Ｇｅｎｅ ）ｙ （式中、ｒ′以外のすべての記号は前に定義した通りで
あり：そしてｒ′は２〜４、好筐しくは２又は４である
）を有する。
特に有利なのはクージャン及びヘルスコビッチ、（前記
）第９３７頁に記載されているα−ファクターのリーダ
ー配列又はその断片もしくは類似体であり、このものは
所望のポリペプチドの効果的な分泌をもたらす。さらに
、上記論文に示されているＤＮＡ配列（この配列を引用
によシこの明細書に組み入れる）は必須ではなく、所望
のオリゴペプチドをコードする任意の配列で十分である
。種種の配列が幾分翻訳されよう。
）第９３７頁に記載されているα−ファクターのリーダ
ー配列又はその断片もしくは類似体であり、このものは
所望のポリペプチドの効果的な分泌をもたらす。さらに
、上記論文に示されているＤＮＡ配列（この配列を引用
によシこの明細書に組み入れる）は必須ではなく、所望
のオリゴペプチドをコードする任意の配列で十分である
。種種の配列が幾分翻訳されよう。
前記の構造が好筐しいが、サプレッサー変異体において
は、所望の機能を発揮する他の配列が使用され得ること
を理解すべきである。通常、サプレッサー変異体は発現
のためには効果的でなく、従って前記配列、又は同じア
ミノ酸配列をコードする同等の配列が好憬しい。変異体
が、異なるコドンから前記の配列によって発現されるア
ミノ酸と同じアミノ酸を発現する限り、そのような代替
配列も許容される。
は、所望の機能を発揮する他の配列が使用され得ること
を理解すべきである。通常、サプレッサー変異体は発現
のためには効果的でなく、従って前記配列、又は同じア
ミノ酸配列をコードする同等の配列が好憬しい。変異体
が、異なるコドンから前記の配列によって発現されるア
ミノ酸と同じアミノ酸を発現する限り、そのような代替
配列も許容される。
カッコ内の配列によってコードされるジペプチドは１個
の酸性アミノ酸、すなわちアスノ？ラギン酸又はグルタ
ミン酸、好ましくはグルタミン酸、及びそれに続く１個
の中性アミノ酸、アラニン又はプローリン、特にアラニ
ンである。
の酸性アミノ酸、すなわちアスノ？ラギン酸又はグルタ
ミン酸、好ましくはグルタミン酸、及びそれに続く１個
の中性アミノ酸、アラニン又はプローリン、特にアラニ
ンである。
発現のためのカセットとして使用し得る有用なりＮＡ配
列として、次の配列、 Ｔｒ−Ｌ−（（Ｒ−８）ｒ〃−（ＧＡＸＹＣＸ）ｎ、−
Ｗ−（Ｇｅｎｅ＊）ｄ）。
列として、次の配列、 Ｔｒ−Ｌ−（（Ｒ−８）ｒ〃−（ＧＡＸＹＣＸ）ｎ、−
Ｗ−（Ｇｅｎｅ＊）ｄ）。
（式中、Ｔｒは転写制御シグナル、特にプロモーター及
びオペレーターのごとき他の制御シグナル、アクティベ
ーター、キャップシグナル、ｌＪ＆シーム結合を強化す
るシグナルをコードするＤＮＡ配列、又は転写制御もし
くは翻訳制御に関与するその他の配列であり：Ｔｒ配列
は一般に約１００ｂｐ以上であり、そして約２０００
ｂｐ以下であシ；宿主に固有のリーダー配列に連結され
た転写及び翻訳シグナル配列を含むＤＮＡ断片を用いる
ことができるように、Ｔｒ配列とリーダー配列りとが関
連してしるのが特に好渣しく；これに代えて発現生成物
の強化された生産をもたらすその他の転写及び翻訳シグ
ナルを用いることもでき；ｄは０又は１であり、ｙが１
より大であるときは１であり：ｎ′は一般に０〜３、さ
らに通常ば０又は２〜３の整数であシ；ｒ“は１又は２
であり：Ｗは末端デオキシリＲシルー３′基、又はそれ
自体によりもしくは隣接ヌクレオチドと一緒になって接
着末端又は平滑末端を供する制限部位を規定し、そして
Ｏ〜最長２０個のヌクレオチドを有し：そして他の記号
は前に定義した通うである）を便利に使用することがで
きる。
びオペレーターのごとき他の制御シグナル、アクティベ
ーター、キャップシグナル、ｌＪ＆シーム結合を強化す
るシグナルをコードするＤＮＡ配列、又は転写制御もし
くは翻訳制御に関与するその他の配列であり：Ｔｒ配列
は一般に約１００ｂｐ以上であり、そして約２０００
ｂｐ以下であシ；宿主に固有のリーダー配列に連結され
た転写及び翻訳シグナル配列を含むＤＮＡ断片を用いる
ことができるように、Ｔｒ配列とリーダー配列りとが関
連してしるのが特に好渣しく；これに代えて発現生成物
の強化された生産をもたらすその他の転写及び翻訳シグ
ナルを用いることもでき；ｄは０又は１であり、ｙが１
より大であるときは１であり：ｎ′は一般に０〜３、さ
らに通常ば０又は２〜３の整数であシ；ｒ“は１又は２
であり：Ｗは末端デオキシリＲシルー３′基、又はそれ
自体によりもしくは隣接ヌクレオチドと一緒になって接
着末端又は平滑末端を供する制限部位を規定し、そして
Ｏ〜最長２０個のヌクレオチドを有し：そして他の記号
は前に定義した通うである）を便利に使用することがで
きる。
次の構成、
（Ｔｒ）−Ｌ−（Ｒ−８）／／−（ＧＡＸＹＣＸ）ｎＧ
ｆｉｖＡＧＣＴａ ｒ
ｎ Ｌ＝−−。−（式
中、すでに定義したすべての記号は前記と同じ意味を有
し：ａは０又は１であって、この構成が転写及び翻訳シ
グナルを有するか又は有しないことを意味し：破線枠中
に示したヌクレオチドは存在しないがしかしジペプチド
をコードする配列を再構５３Ｅ （ｒｅｃｒｅａｔｉｏ
ｎ）するためにＢｉｎｄ ＩＩＩ開裂末端を加えること
によって付加することができることを意味し：そしてｎ
“はＯ〜２であジ、Ｘ及びＹの少なくとも１つが、カッ
コ内の配列が配列ＧＡＡＧＣＴとならないように１つの
ヌクレオチドを規定する）が特に有利である。
ｆｉｖＡＧＣＴａ ｒ
ｎ Ｌ＝−−。−（式
中、すでに定義したすべての記号は前記と同じ意味を有
し：ａは０又は１であって、この構成が転写及び翻訳シ
グナルを有するか又は有しないことを意味し：破線枠中
に示したヌクレオチドは存在しないがしかしジペプチド
をコードする配列を再構５３Ｅ （ｒｅｃｒｅａｔｉｏ
ｎ）するためにＢｉｎｄ ＩＩＩ開裂末端を加えること
によって付加することができることを意味し：そしてｎ
“はＯ〜２であジ、Ｘ及びＹの少なくとも１つが、カッ
コ内の配列が配列ＧＡＡＧＣＴとならないように１つの
ヌクレオチドを規定する）が特に有利である。
コード配列の読み枠が開始コドンに整合してかｂｌそし
てプロセシングに際して第１のアミノ酸が成熟ポリペプ
チドの正しいアミノ酸であれば、＊ Ｇｅｎｅ のコード配列は末端Ｔに連結することがで
きる。
てプロセシングに際して第１のアミノ酸が成熟ポリペプ
チドの正しいアミノ酸であれば、＊ Ｇｅｎｅ のコード配列は末端Ｔに連結することがで
きる。
Ｑｅｎｅ の３′−末端はさらに容易に操作すること
ができ、従って構成内の唯一の制限部位にＧｅｎｅ＊を
挿入することを可能にする構成を用いるのが好ましい。
ができ、従って構成内の唯一の制限部位にＧｅｎｅ＊を
挿入することを可能にする構成を用いるのが好ましい。
このような構成は、読み枠が開始コドンに整合するよう
にＧｅｎｅ が挿入される１個の制限部位を有するで
あろう。このような構成は次のように表示することがで
きる。
にＧｅｎｅ が挿入される１個の制限部位を有するで
あろう。このような構成は次のように表示することがで
きる。
−（Ｔｒ） −Ｌ−（Ｒ−８） ／／−（ＧＡＸＹＣＸ
） 〃−Ｗ−（ＳＣ）５−Ｔｅａ
ｒ ｎ式中、前に定
義した記号は前記の意味を有し：ＳＣは停止コドン（ｓ
ｔｏｐ ｃｏｄｏｎ）であり：ＴｅはプロモーターＴｒ
に対応する終結配列（ｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎＳｅｑｕ
ｅｎｅりであり、そして他のシグナル、例えばポリアデ
ニル化シグナルを含有することができ；そしてｂは一般
に約Ｏ〜４、さらに通常は０〜３の間で変化する整数で
ある。Ｇｅｎｅ はそれ自体の停止コドンを含有して
いてもよい。
） 〃−Ｗ−（ＳＣ）５−Ｔｅａ
ｒ ｎ式中、前に定
義した記号は前記の意味を有し：ＳＣは停止コドン（ｓ
ｔｏｐ ｃｏｄｏｎ）であり：ＴｅはプロモーターＴｒ
に対応する終結配列（ｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎＳｅｑｕ
ｅｎｅりであり、そして他のシグナル、例えばポリアデ
ニル化シグナルを含有することができ；そしてｂは一般
に約Ｏ〜４、さらに通常は０〜３の間で変化する整数で
ある。Ｇｅｎｅ はそれ自体の停止コドンを含有して
いてもよい。
上記の構造を有する配列の例にかいてはＷが配列ＧＡで
あり、そしてｎ″ が２である。
あり、そしてｎ″ が２である。
末端ジペプチドをコードする配列がＷと一緒になってリ
ンカ−又はコネクターを規定し、これがプロセシングシ
グナルのジペプチドを規定する末端配列の再構成を可能
にしそしてＱｅｎｅ の最初のアミノ酸をコードし、
その結果コドンの解読枠がリーダーの開始コドンと整合
する場合が特に好ましい。リンカ−がずれ末端（ｓｔａ
ｇｇｅｒｅｄ ｅｎｄ）又はパットエンド（ｂｕｔｔ
ｅｎｄ）を供し、そしてＧｅｎｅ＊の連続する配列と共
に制限部位を構成する０が好ましい。リンカ−とＧｅｎ
ｅ との連結に際してＧｅｎｅ”のコドンの解読枠が
リーダーの開始コドンと整合するであろう。このように
して、プロセシングシグナル配列中の制限部位に連結さ
れる合成配列ヲ用いてプロセシングシグナルを再構成し
、他方にわいてＮ末端アミノ酸をコードするＧｅｎｅ”
の最初の塩基を得ることができる。合成配列を用いるこ
とにより、この合成リンカ−を３７−末端に便利な制限
部位を有する適合コネクター（ｔａｉｌｏｒｅｄｃｏｎ
ｎｅｃｔｏｒ ）であることができ、そしてこの合成コ
ネクターは遺伝子の５１−１末端のために必要なコト。
ンカ−又はコネクターを規定し、これがプロセシングシ
グナルのジペプチドを規定する末端配列の再構成を可能
にしそしてＱｅｎｅ の最初のアミノ酸をコードし、
その結果コドンの解読枠がリーダーの開始コドンと整合
する場合が特に好ましい。リンカ−がずれ末端（ｓｔａ
ｇｇｅｒｅｄ ｅｎｄ）又はパットエンド（ｂｕｔｔ
ｅｎｄ）を供し、そしてＧｅｎｅ＊の連続する配列と共
に制限部位を構成する０が好ましい。リンカ−とＧｅｎ
ｅ との連結に際してＧｅｎｅ”のコドンの解読枠が
リーダーの開始コドンと整合するであろう。このように
して、プロセシングシグナル配列中の制限部位に連結さ
れる合成配列ヲ用いてプロセシングシグナルを再構成し
、他方にわいてＮ末端アミノ酸をコードするＧｅｎｅ”
の最初の塩基を得ることができる。合成配列を用いるこ
とにより、この合成リンカ−を３７−末端に便利な制限
部位を有する適合コネクター（ｔａｉｌｏｒｅｄｃｏｎ
ｎｅｃｔｏｒ ）であることができ、そしてこの合成コ
ネクターは遺伝子の５１−１末端のために必要なコト。
ン乍供するであろう。
上記の方法に代えて、プロセシングシグナルから下流に
制限エンドヌクレアーゼ認識部位を導入し、余分な塩基
の開裂及び除去を可能にし、Ｇｅｎｅ＊を、開始コドン
と解読枠が整合するようにプロセシングシグナルに連結
することができる。すなわち、第１のコドンがポリペプ
チドのＮ−末端アミノ酸をコードする。ＴがＧｅｎｅ
の第１の塩基である場合には、認識部位が開裂部位よ
う下流にある制限部位を導入することができる。例えば
、５ａｕ３Ａ認識配列をプロセシングシグナルのすぐ後
に導入し、これによって開裂及びＧｅｎｅ＊の連１結を
可能にし、Ｇｅｎｅの最初のコト°ンの解読枠をリーダ
ー開始コト０ンと整合せしめることができる。開裂部位
から下流の離れたところに認識部位を有する制限エンド
ヌクレアーゼ例えば馬已Ｉを用イル場合、Ｗが、プロセ
シングシグナル配列の１部分を含有するような配列を構
成することができる。他の構成を用いることも可能であ
り、プライマー修復及び試験管内変異を用いて適当な制
限部位を導入することによυ構成中にＧｅｎｅ を便
利に挿入することができる。
制限エンドヌクレアーゼ認識部位を導入し、余分な塩基
の開裂及び除去を可能にし、Ｇｅｎｅ＊を、開始コドン
と解読枠が整合するようにプロセシングシグナルに連結
することができる。すなわち、第１のコドンがポリペプ
チドのＮ−末端アミノ酸をコードする。ＴがＧｅｎｅ
の第１の塩基である場合には、認識部位が開裂部位よ
う下流にある制限部位を導入することができる。例えば
、５ａｕ３Ａ認識配列をプロセシングシグナルのすぐ後
に導入し、これによって開裂及びＧｅｎｅ＊の連１結を
可能にし、Ｇｅｎｅの最初のコト°ンの解読枠をリーダ
ー開始コト０ンと整合せしめることができる。開裂部位
から下流の離れたところに認識部位を有する制限エンド
ヌクレアーゼ例えば馬已Ｉを用イル場合、Ｗが、プロセ
シングシグナル配列の１部分を含有するような配列を構
成することができる。他の構成を用いることも可能であ
り、プライマー修復及び試験管内変異を用いて適当な制
限部位を導入することによυ構成中にＧｅｎｅ を便
利に挿入することができる。
ＤＮＡ構成にようベクターに挿入するためのポータプル
配列が得られ、このベクターが所望の複製系を供する。
配列が得られ、このベクターが所望の複製系を供する。
すでに記載したごとく、ある場合にはリーダー配列に関
連する野性タイプのプロモーターを他のプロモーターに
代えることが好ましい。
連する野性タイプのプロモーターを他のプロモーターに
代えることが好ましい。
酵母に釦いては、解糖経路中の酵素に関与するプロモー
ターが高い転写速度を供する。これらのプロモーターは
ホスホグルコイソメラーゼ、ホスホフラクトキナーゼ、
ホスホトリオースイソメラーゼ、ホスホグルコムターゼ
、ピルビン酸キナーゼ、グリセロアルデヒド−３−ホス
フエートデヒドログナーゼ、及びアルコ−ルアヒト９０
ダナーゼのごとき酵素と関連している。これらのプロモ
ーターをリーダー配列の上流に挿入することができる。
ターが高い転写速度を供する。これらのプロモーターは
ホスホグルコイソメラーゼ、ホスホフラクトキナーゼ、
ホスホトリオースイソメラーゼ、ホスホグルコムターゼ
、ピルビン酸キナーゼ、グリセロアルデヒド−３−ホス
フエートデヒドログナーゼ、及びアルコ−ルアヒト９０
ダナーゼのごとき酵素と関連している。これらのプロモ
ーターをリーダー配列の上流に挿入することができる。
リーダー配列への５′−フランク領域を維持することが
でき又は代りのプロモーターの３１−配列で置き換える
ことができる。プロモーターを含有し、そしてそのプロ
モーターの下流に前記のごときＤＮＡ ４１１１成を挿
入するのに便利な制限部位を有するベクターを調製する
ことができ、そして報告されている。
でき又は代りのプロモーターの３１−配列で置き換える
ことができる。プロモーターを含有し、そしてそのプロ
モーターの下流に前記のごときＤＮＡ ４１１１成を挿
入するのに便利な制限部位を有するベクターを調製する
ことができ、そして報告されている。
最終構成は、宿主、特に酵母のごとき菌類中に安定に保
持され得るエピゾーム性要素である。この構成は１個又
は複数個、好甘しくば２個の複製系を有し、発現宿主中
での保持及び原核生物中でのクローニングが可能である
。さらに、１個又は複数個の選択マーカーが含有され、
これにより宿主中でエピゾーム要素を保持するための選
択圧が得られる。さらに、エピゾーム要素は高い又は低
いコピー数を有し、コピー数は一般に約１〜２００の範
囲である。高コピー数エピゾーム要素の場合、コピー数
は１０以上、好１しくは２０以上であり、そして通常約
１５０以下、さらに通常は約１００以下である。Ｇｅｎ
ｅ 、及びエピゾーム要素が宿主に与える影響に応じて
高コピー数又は低コピー数が好ましい。エピゾーム要素
の発現生成物が宿主に不利な影響を与える場合、低コピ
ー数が好ましい。
持され得るエピゾーム性要素である。この構成は１個又
は複数個、好甘しくば２個の複製系を有し、発現宿主中
での保持及び原核生物中でのクローニングが可能である
。さらに、１個又は複数個の選択マーカーが含有され、
これにより宿主中でエピゾーム要素を保持するための選
択圧が得られる。さらに、エピゾーム要素は高い又は低
いコピー数を有し、コピー数は一般に約１〜２００の範
囲である。高コピー数エピゾーム要素の場合、コピー数
は１０以上、好１しくは２０以上であり、そして通常約
１５０以下、さらに通常は約１００以下である。Ｇｅｎ
ｅ 、及びエピゾーム要素が宿主に与える影響に応じて
高コピー数又は低コピー数が好ましい。エピゾーム要素
の発現生成物が宿主に不利な影響を与える場合、低コピ
ー数が好ましい。
種々の宿主、特に所望の性質を有する変異株を用いるこ
とができる。構成の発現生成物の生産速度に依存して、
プロセシング酵素はその生産レベルにおいてプロセシン
グのために適切であり又は適切でないことを認識すべき
である。従って、プロセシング酵素の生産が強化された
変異株が好オしく、又はエピゾーム要素にようこの酵素
の生産を増強することができよう。一般に、酵素の生産
は所望の発現生成物の生産よう低オーダーであるべきで
ある。
とができる。構成の発現生成物の生産速度に依存して、
プロセシング酵素はその生産レベルにおいてプロセシン
グのために適切であり又は適切でないことを認識すべき
である。従って、プロセシング酵素の生産が強化された
変異株が好オしく、又はエピゾーム要素にようこの酵素
の生産を増強することができよう。一般に、酵素の生産
は所望の発現生成物の生産よう低オーダーであるべきで
ある。
分泌及びプロセシングのためにα−ファクターを使用す
る場合、プロセシング酵素ジペプチジルアミノペプチダ
ーゼＡの生産を高めるのが好ｌしい。この酵素は５ＴＥ
１３の発現生成物と考えられる。
る場合、プロセシング酵素ジペプチジルアミノペプチダ
ーゼＡの生産を高めるのが好ｌしい。この酵素は５ＴＥ
１３の発現生成物と考えられる。
この酵素はＸ−Ａｌａ−及びＸ−Ｐｒｏ−配列に特異的
であり１この場合のＸはアミノ酸、特にジカルＲキシア
ミノ酸である。
であり１この場合のＸはアミノ酸、特にジカルＲキシア
ミノ酸である。
前記と異り、細胞内プロセシングが好ｔＬ＜なし場合が
ある。この場合は、分泌は生ずるが生成物はプロセシン
グされな、い５ｔｅ１３変異株を取得するのが好ましい
。この方法に釦いては、生成物はその後で生体外でプロ
セシングすることができる。
ある。この場合は、分泌は生ずるが生成物はプロセシン
グされな、い５ｔｅ１３変異株を取得するのが好ましい
。この方法に釦いては、生成物はその後で生体外でプロ
セシングすることができる。
発現が調節される宿主変異株が有利に使用される場合が
ある。例えば、融合蛋白質を発現するこの発明の構成を
用いることによシ、融合蛋白質の毒性の結果として形質
転換体の増殖が低下する。
ある。例えば、融合蛋白質を発現するこの発明の構成を
用いることによシ、融合蛋白質の毒性の結果として形質
転換体の増殖が低下する。
従って、増殖中には発現を抑制して宿主を高濃度に増殖
せしめ、その後条件を発現のための条件に変える。
せしめ、その後条件を発現のための条件に変える。
制御された発現を達成するために、温度感受性ｓｉｒ変
異株を使用することができる。ＳＩＲ遺伝子のいずれか
にかける変異によ１坦隻及びＨＭＲ座に存在する通常は
静止しているＭＡＴａ及びＭＡＴα配列がその場で発現
するため、非交配表現型（ｎｏｎ −ｍａＮｎｇ ｐｈ
ａｎｏｔｙｐｅ）が生ずる。
異株を使用することができる。ＳＩＲ遺伝子のいずれか
にかける変異によ１坦隻及びＨＭＲ座に存在する通常は
静止しているＭＡＴａ及びＭＡＴα配列がその場で発現
するため、非交配表現型（ｎｏｎ −ｍａＮｎｇ ｐｈ
ａｎｏｔｙｐｅ）が生ずる。
さらに、すでに記載したように、Ｇｅｎｅ は多数の
配列、すなわち同一の配列又は異る配列を、プロセシン
グシグナルの介在を伴って縦列的（タンデム）に有する
ことができる。この場合、生成物は完全に又は部分的に
プロセシングされて、種々の配列それ自体が、又は縦列
的（タンデム）な形で得られ、これがさらに処理される
。多くの場合、個々の配列が蛋白質生成物のサブユニ、
トである種々の配列を得ることが好ましい。
配列、すなわち同一の配列又は異る配列を、プロセシン
グシグナルの介在を伴って縦列的（タンデム）に有する
ことができる。この場合、生成物は完全に又は部分的に
プロセシングされて、種々の配列それ自体が、又は縦列
的（タンデム）な形で得られ、これがさらに処理される
。多くの場合、個々の配列が蛋白質生成物のサブユニ、
トである種々の配列を得ることが好ましい。
Ｑｅｎ１！ は興味ある任意のタイプのポリペプチド
をコードすることができる。ポリペプチドは小さい８ア
ミノ酸のオリゴペプチドでもよく、あるいは１００，０
００ダルトン以上であってもよい。
をコードすることができる。ポリペプチドは小さい８ア
ミノ酸のオリゴペプチドでもよく、あるいは１００，０
００ダルトン以上であってもよい。
通常、単鎖は約３００，０００ダルトンよυ小であう、
さらに一般的には約１５０，０００よう小である。特に
好１ししのは約ｓ、ｏｏｏ〜１５０，０００ダルトンの
ポリペプチド、さらに特定すれば約５．０００〜１０，
０００ダルトンの蛋白質である。
さらに一般的には約１５０，０００よう小である。特に
好１ししのは約ｓ、ｏｏｏ〜１５０，０００ダルトンの
ポリペプチド、さらに特定すれば約５．０００〜１０，
０００ダルトンの蛋白質である。
好ｌしいポリペプチドの例には、ホルモン及び因子、側
光ば生長ホルモン、ソマトメジン上皮増殖因子、内分泌
物、例えば黄体形成ホルモン、プロラクチン等；造血因
子、例えばエリスロポイエチン、コロニー刺激因子等；
リンポカイン；グロビン；グロブリン、例えば免疫グロ
ブリン；アルブミン：インターフエロイ；側光ばα、β
及びｒインターフェロン；レプレッサー：酵ｉ：エンド
ルフィン、例、ｔばβ−エンドルフィン、エンケファリ
ン、グイノルフィン等である。
光ば生長ホルモン、ソマトメジン上皮増殖因子、内分泌
物、例えば黄体形成ホルモン、プロラクチン等；造血因
子、例えばエリスロポイエチン、コロニー刺激因子等；
リンポカイン；グロビン；グロブリン、例えば免疫グロ
ブリン；アルブミン：インターフエロイ；側光ばα、β
及びｒインターフェロン；レプレッサー：酵ｉ：エンド
ルフィン、例、ｔばβ−エンドルフィン、エンケファリ
ン、グイノルフィン等である。
この発明の構成を含有するエピゾーム要素を調製した後
、この要素を適当な宿主に導入する。この導入は常法に
従って行う。ＤＮＡを宿主に導入する方法は種々ある。
、この要素を適当な宿主に導入する。この導入は常法に
従って行う。ＤＮＡを宿主に導入する方法は種々ある。
便利には、例えばＨｊ ｎｎｅｎ等、ＰＮＡＳ ＵＳＡ
（１９７８）７５：１９１９−１９３３ ：又はＳｔｉ
ｎｃｈｃｏｍｂ等、ＥＰＯＯ４５５７３４２の方法を用
いてスフェロプラストを調製する。次に、この形質転換
体を、この形質転換体のために適当な選択圧を維持した
適当な栄養培地中で増殖せしめる。発現が誘導的である
場合には、酵母を高密度に増殖せしめ、そして次に発現
を誘導する。生成物の実質的部分がペリプラズム空間に
保有される場合には、酵母細胞を酵素、例えばチモラー
ゼ（ｚｙｍｏｌａｓｅ）又はリティカーゼ（Ｉｙｔｉｃ
ａｓｅ）で処理することによう生成物を遊離せしめるこ
とができる。
（１９７８）７５：１９１９−１９３３ ：又はＳｔｉ
ｎｃｈｃｏｍｂ等、ＥＰＯＯ４５５７３４２の方法を用
いてスフェロプラストを調製する。次に、この形質転換
体を、この形質転換体のために適当な選択圧を維持した
適当な栄養培地中で増殖せしめる。発現が誘導的である
場合には、酵母を高密度に増殖せしめ、そして次に発現
を誘導する。生成物の実質的部分がペリプラズム空間に
保有される場合には、酵母細胞を酵素、例えばチモラー
ゼ（ｚｙｍｏｌａｓｅ）又はリティカーゼ（Ｉｙｔｉｃ
ａｓｅ）で処理することによう生成物を遊離せしめるこ
とができる。
生成物を常用手段により回収し、蛋白質をクロマトグラ
フィー、電気泳動、透析、溶剤／溶剤抽出等によシ精製
する。
フィー、電気泳動、透析、溶剤／溶剤抽出等によシ精製
する。
この発明に従えば、広範囲の蛋白質の分泌がもたらされ
、これによう生成物の収量が増加し、精製が簡単になり
、目的生成物の分解が最少となシ、そして処理装置及び
工学的要求が単純化される。
、これによう生成物の収量が増加し、精製が簡単になり
、目的生成物の分解が最少となシ、そして処理装置及び
工学的要求が単純化される。
さらに、生産に基〈栄養の資化が強化され、この結果ポ
リペプチドのよシ経済的且つよシ効率的製造が達成され
る。さらに、酵母を使用することによシ、原核生物の場
合に存在するエンテロトキシノが生産されず、又長期間
にわたって酵母について開発されてきた公知の技法を用
いることができるという利点が得られる。この技法には
酵母生成物の分離技法が含まれる。
リペプチドのよシ経済的且つよシ効率的製造が達成され
る。さらに、酵母を使用することによシ、原核生物の場
合に存在するエンテロトキシノが生産されず、又長期間
にわたって酵母について開発されてきた公知の技法を用
いることができるという利点が得られる。この技法には
酵母生成物の分離技法が含まれる。
次に例にようこの発明をさらに具体的に説明する。但し
、これによりこの発明の範囲を限定するものではない。
、これによりこの発明の範囲を限定するものではない。
実験
Ｈ，Ｇｒｅｇｏｒｙ及びＢ、Ｍ Ｐｒｅｓｔｏｎ ＊
Ｉｎｔ、 Ｊ、 ＰｅｐｔｉｄｅＰｒｏｔｅｉｎ Ｒｅ
ｓ、９１１０７〜１１８（１９７７）によシ報告された
ヒト−上皮増殖因子（ｈｕｍａｎｅｐｉｄａｒｍａｌ
ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ）（ＥＧＦ）のアミノ酸配
列に基ずく、次の配列を有するＥＧＦのための合成配列
を調製した。
Ｉｎｔ、 Ｊ、 ＰｅｐｔｉｄｅＰｒｏｔｅｉｎ Ｒｅ
ｓ、９１１０７〜１１８（１９７７）によシ報告された
ヒト−上皮増殖因子（ｈｕｍａｎｅｐｉｄａｒｍａｌ
ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ）（ＥＧＦ）のアミノ酸配
列に基ずく、次の配列を有するＥＧＦのための合成配列
を調製した。
以下余白
（式中、５′は配列のプロモーターに近い末端ヲ示す。
）
この配列をｐＢＲ３２８のＥ（！ＯＲ１部位に挿入して
プラスミドル３２８ ＥＧＦ −１を調製し、そしてク
ローニングした。
プラスミドル３２８ ＥＧＦ −１を調製し、そしてク
ローニングした。
かよそ３０μＩのｐ３２８ ＥＧＦ−１をシュＲ１で消
化し、そして約１μｇの期待される１ ９０ ｂｐＥｃ
ｏＲＩ断片を分離した。これを制限酵素Ｈｇａ Ｉで消
化した。次に、２種類の合成オリゴヌクレオチドコネク
ター且罰ｄ ＩＩＩ −！ＬＩＬ！ Ｉ及び虫巳Ｉ−止
区Ｉを１５ ’ｉｔ ｂｐ Ｈｇａ Ｉ断片に連結した
。旦ｇａ ｌ −Ｈｉｎ ｄ［ｌリンカ−は次の配列を
有する。
化し、そして約１μｇの期待される１ ９０ ｂｐＥｃ
ｏＲＩ断片を分離した。これを制限酵素Ｈｇａ Ｉで消
化した。次に、２種類の合成オリゴヌクレオチドコネク
ター且罰ｄ ＩＩＩ −！ＬＩＬ！ Ｉ及び虫巳Ｉ−止
区Ｉを１５ ’ｉｔ ｂｐ Ｈｇａ Ｉ断片に連結した
。旦ｇａ ｌ −Ｈｉｎ ｄ［ｌリンカ−は次の配列を
有する。
ＡＧＣＴＧＡＡＧＣＴ
ＣＴＴＣＧＡＴＴＧＡＧ
このリンカ−は、Ｈｉｎｄｌ［Ｉ 消化によシ中断され
たα−ファクタープロセシングシグナルヲ復元シ、そし
てＥＧＦ遺伝子の５′末端のＨｇａ Ｉ末端をｐＡＢｌ
ｌ２のＨｉｎ ｄ ■末端に連結する。
たα−ファクタープロセシングシグナルヲ復元シ、そし
てＥＧＦ遺伝子の５′末端のＨｇａ Ｉ末端をｐＡＢｌ
ｌ２のＨｉｎ ｄ ■末端に連結する。
１■ｉ−１嵯Ｉリンカーは次の構造を有する。
以下余白
ＴＧＡＧＡＴＧＡＴＡＡＧ
ＡＣＴＡＴＴＣＡＧＣＴ
このリンカ−は２つの終結コドンを有し、そしてＥＧＦ
遺伝子の３′末端の力■！末端をｐＡＢ １１２の且じ
Ｉ末端に連結する。
遺伝子の３′末端の力■！末端をｐＡＢ １１２の且じ
Ｉ末端に連結する。
得られた１ ８１ ｂｐ断片を調製用ダル電気泳動によ
う精製し、そしてあらかじめ酵素Ｈｉｎｄ ｍ及び５ａ
ｉｌによシ完全消化した１ ００ ｎ、ｌｉｌ’のｐＡ
Ｂｌｌ２に連結した。驚くべきことに、ＥＧＦ（Ｄ’３
番目及び４番目のアミノ酸であるａｓｐ及びａｅｙの場
のコドンが欠落し、そしてＥＧＦの他の部分は維持され
た。
う精製し、そしてあらかじめ酵素Ｈｉｎｄ ｍ及び５ａ
ｉｌによシ完全消化した１ ００ ｎ、ｌｉｌ’のｐＡ
Ｂｌｌ２に連結した。驚くべきことに、ＥＧＦ（Ｄ’３
番目及び４番目のアミノ酸であるａｓｐ及びａｅｙの場
のコドンが欠落し、そしてＥＧＦの他の部分は維持され
た。
ｐＡＢｌｌ２は、１凰ｄｕｌｌ及び、ＬＬ４１部位が除
去されたｐＢＲ３２２（ｐＡＢｌｌ）のシ狙Ｒ１部位で
クローニングされた酵母α−ファクター遺伝子を伴う１
．７５ｋｂＥｃｏＲＩ断片を含有するプラスミドである
。
去されたｐＢＲ３２２（ｐＡＢｌｌ）のシ狙Ｒ１部位で
クローニングされた酵母α−ファクター遺伝子を伴う１
．７５ｋｂＥｃｏＲＩ断片を含有するプラスミドである
。
ｐＡＢｌｌ２は、プラスミドＹＥｐ ２４のｌ二Ｈ１部
位にふ・いてクローニングされた部分的５ａｕ３Ａ断片
として酵母α−ファクター遺伝子を含有するプラスミド
ｐＡ、Ｂ１０１から誘導した。ｐＡＢｌｏｌは、公表さ
れているα−因子コード領域（Ｋｕ ｒ ｊ ａｎ及び
Ｈｅｒｓｋｏｗｉｔｚ 、Ａｂｓｔｒａｃｔｓ １９
８１ Ｃｏ１ｄ ＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ ｍ
ｅｅｔｉｎｇ ｏｎ ｔｈｅ Ｍｏ１ｅｃｕｌａ
ｒ Ｂｉｏｌｏｇｙｏｆ Ｙｅａｓｔｓ 、 ２４２
頁）と相同の合成２０連オリゴヌクレオチドプローオ、 （３’ −ＧＧＣＣＧＧＴＴＧＧＴＴＡＣＡＴＧＡＴＴ
−５’ ）を用いて、ＹＥｐ２４について酵母ゲノム
ライブラリーをスクリーニングすることによう得られた
。
位にふ・いてクローニングされた部分的５ａｕ３Ａ断片
として酵母α−ファクター遺伝子を含有するプラスミド
ｐＡ、Ｂ１０１から誘導した。ｐＡＢｌｏｌは、公表さ
れているα−因子コード領域（Ｋｕ ｒ ｊ ａｎ及び
Ｈｅｒｓｋｏｗｉｔｚ 、Ａｂｓｔｒａｃｔｓ １９
８１ Ｃｏ１ｄ ＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ ｍ
ｅｅｔｉｎｇ ｏｎ ｔｈｅ Ｍｏ１ｅｃｕｌａ
ｒ Ｂｉｏｌｏｇｙｏｆ Ｙｅａｓｔｓ 、 ２４２
頁）と相同の合成２０連オリゴヌクレオチドプローオ、 （３’ −ＧＧＣＣＧＧＴＴＧＧＴＴＡＣＡＴＧＡＴＴ
−５’ ）を用いて、ＹＥｐ２４について酵母ゲノム
ライブラリーをスクリーニングすることによう得られた
。
得られた混合物を用すてＥ、ｃｏ見ＨＢＩＯＩ細胞を形
質転換し、そしてプラスミドｐＡＢ２０１を得た。
質転換し、そしてプラスミドｐＡＢ２０１を得た。
プラスミド” ｐＡＢ２０１ （５μ、９）を酵素旦セ
Ｒ１によシ完全消化し、そして得られた断片を、（ａ）
ＤＮＡポリメラーゼＩクレノウ（）（ｌｅｎｏｗ）
フラグメントを用いて充たし： （ｂ） 過剰のＢａｍＨｌリンカ−に連結し：そして
、（ｃ） ＢａｍＨＩで消化する。
Ｒ１によシ完全消化し、そして得られた断片を、（ａ）
ＤＮＡポリメラーゼＩクレノウ（）（ｌｅｎｏｗ）
フラグメントを用いて充たし： （ｂ） 過剰のＢａｍＨｌリンカ−に連結し：そして
、（ｃ） ＢａｍＨＩで消化する。
１、７５ ｋｂｐの断片を調製用ｒルミ気泳動により分
離し、そして約１０ Ｏｎ、！７の断片を１００ Ｊの
ｐｃ１／１に連結した。このＩ）Ｃ１／１ばあらかじめ
酵素ＢａｍＨＩにより完全消化し、そしてアルカリホス
ファターゼにより処理したものである。
離し、そして約１０ Ｏｎ、！７の断片を１００ Ｊの
ｐｃ１／１に連結した。このＩ）Ｃ１／１ばあらかじめ
酵素ＢａｍＨＩにより完全消化し、そしてアルカリホス
ファターゼにより処理したものである。
プラスミドｐｃ１／１はｐＪＤＢ ２１９ 、 Ｂｅｇ
ｇｓ 。
ｇｓ 。
Ｎａｔｕｒｅ（１９７８） ２７５ ： １０４の誘導
体であう、ｐＣ１／１においては、ｐＪＤＢ ２１９に
おける細曹プラスミドｐＭＢ ９に対応する領域がｐＢ
Ｒ３２２によう置き換えられている。この混合物を用い
てｇ、ｄＨＢ １０１細胞を形質転換した。形質転換体
をアンピシリン耐性によシ選択し、そしてそのプラスミ
ドを制限エンドヌクレアーゼを用いて分析した。選択さ
れた１つのクローン（ｐｙＥＧＦ−ｓ）のＤＮＡを調製
し、そしてこれを用いて酵母ＡＢ１０３ 細胞を形質転
換した。形質転換体はｌｅｕ 表現型によシ選択した
。
体であう、ｐＣ１／１においては、ｐＪＤＢ ２１９に
おける細曹プラスミドｐＭＢ ９に対応する領域がｐＢ
Ｒ３２２によう置き換えられている。この混合物を用い
てｇ、ｄＨＢ １０１細胞を形質転換した。形質転換体
をアンピシリン耐性によシ選択し、そしてそのプラスミ
ドを制限エンドヌクレアーゼを用いて分析した。選択さ
れた１つのクローン（ｐｙＥＧＦ−ｓ）のＤＮＡを調製
し、そしてこれを用いて酵母ＡＢ１０３ 細胞を形質転
換した。形質転換体はｌｅｕ 表現型によシ選択した
。
プラスミドｐ−ＹＥＧＦ−８によシ形質転換された酵ｆ
ａ−ＡＢ１０３株（（１、−ト」４−旦ｒｔｅｕｇ−３
＊ｔｅｕ２−１１２ 、 ｕｒａ３−５２ 、垣）１−
立生△）をロイシンを含有しない培地５Ｑｍｌ中に飽和
１で（６００ｎｍの光学濃度５）増殖せしめ、そしてさ
らに１２時時間上うした。遠心分離によう細胞上清を集
めそして線維芽細胞すセデター競争結合測定法により、
ヒトＥＧＦの存在について分析した。このＥＧＦ測定は
、ヒトー包皮線維芽細胞上の結合部位にっ−て、 ■
−標識マウスＥＧＦと競争するマウス及びヒ） ＥＧＦ
の能力に基礎を置いている。このような条件のもとで、
２〜２，０ｎｊｌのｇＧＦが容易に測宏できる。ヒトー
線維芽細胞への １−標識上皮細胞増殖因子の結合に
ついての詳細はＣａｒｐｅｎｔｅｒ等、Ｊ、 Ｂｉｏｌ
、 Ｃｈｅｍ、 ２５０ 、４２９７ （１９７５）に
記載されている。この測定により１培地が１１当シフ±
１１ｎｇのヒト−ＥＧＦ’を含有することが見出される
。
ａ−ＡＢ１０３株（（１、−ト」４−旦ｒｔｅｕｇ−３
＊ｔｅｕ２−１１２ 、 ｕｒａ３−５２ 、垣）１−
立生△）をロイシンを含有しない培地５Ｑｍｌ中に飽和
１で（６００ｎｍの光学濃度５）増殖せしめ、そしてさ
らに１２時時間上うした。遠心分離によう細胞上清を集
めそして線維芽細胞すセデター競争結合測定法により、
ヒトＥＧＦの存在について分析した。このＥＧＦ測定は
、ヒトー包皮線維芽細胞上の結合部位にっ−て、 ■
−標識マウスＥＧＦと競争するマウス及びヒ） ＥＧＦ
の能力に基礎を置いている。このような条件のもとで、
２〜２，０ｎｊｌのｇＧＦが容易に測宏できる。ヒトー
線維芽細胞への １−標識上皮細胞増殖因子の結合に
ついての詳細はＣａｒｐｅｎｔｅｒ等、Ｊ、 Ｂｉｏｌ
、 Ｃｈｅｍ、 ２５０ 、４２９７ （１９７５）に
記載されている。この測定により１培地が１１当シフ±
１１ｎｇのヒト−ＥＧＦ’を含有することが見出される
。
さらに特徴付けるため、上清液中のヒ） −ＥＧＦを、
イオン交換樹脂Ｂｉｏｒｅｘ −７Ｑに吸着せしめ、そ
して８０％エタノール中１０ ｍＭ ＨＣｔで溶出する
ことによシ精製した。ＨＣｌ及びエタノールを蒸発せし
めた後、ＥＧＦを水に溶解した。この物質は、分子量約
６，０００の１種類の主たる蛋白質として移動し、真正
のマウスＥＧＦ （分子量約６，０００）とかよそ同じ
であった。このことは、α−ファクターリーダー配列が
、分泌過程にわいて適切に除去されたことを示す。高分
離液体クロマトグラフィー（ミクＯｙｔ’ンダノぞ、り
Ｃ１８，ウォーターズカラム）による分析によって、こ
の生成物は、真正のマウスＥＧＦ標準と同様の保持時間
をもって移動することが示された。しかしながら、エド
マン（Ｅｄｍａｎ）分解による蛋白、質配列決定にょう
１Ｎ末端がｇｌｕ−ａ１ｍ末端を保持していることが示
された。
イオン交換樹脂Ｂｉｏｒｅｘ −７Ｑに吸着せしめ、そ
して８０％エタノール中１０ ｍＭ ＨＣｔで溶出する
ことによシ精製した。ＨＣｌ及びエタノールを蒸発せし
めた後、ＥＧＦを水に溶解した。この物質は、分子量約
６，０００の１種類の主たる蛋白質として移動し、真正
のマウスＥＧＦ （分子量約６，０００）とかよそ同じ
であった。このことは、α−ファクターリーダー配列が
、分泌過程にわいて適切に除去されたことを示す。高分
離液体クロマトグラフィー（ミクＯｙｔ’ンダノぞ、り
Ｃ１８，ウォーターズカラム）による分析によって、こ
の生成物は、真正のマウスＥＧＦ標準と同様の保持時間
をもって移動することが示された。しかしながら、エド
マン（Ｅｄｍａｎ）分解による蛋白、質配列決定にょう
１Ｎ末端がｇｌｕ−ａ１ｍ末端を保持していることが示
された。
ｈ ＥＧＦをα−ファクター分泌リーダー配列と連結す
るための異る構成を用いて他の多くの構成を調製した。
るための異る構成を用いて他の多くの構成を調製した。
これらは異なるプロセシングシグナル及び部位変異を有
する。第２図ａ−ｅにおいて、ｈ ＥＧＦのＮ−末端部
位における融合配列を示す。
する。第２図ａ−ｅにおいて、ｈ ＥＧＦのＮ−末端部
位における融合配列を示す。
この配列は幾つかの構成の間で異る。ｆはｈ ＥＧＦの
Ｃ末端に訃ける配列を示す。これはすべての構成にかい
て同じである。これらの構成中に使用した一合成オリゴ
ヌクレオチドリンヵーは枠で囲んである。
Ｃ末端に訃ける配列を示す。これはすべての構成にかい
て同じである。これらの構成中に使用した一合成オリゴ
ヌクレオチドリンヵーは枠で囲んである。
これらの融合は次のようにして行った。構成（ａ）は前
記のようにして調製した。構成（ｂ）は構成（ａ）と同
様にして調製したがリンカ−１の代りにリンカ−２を用
いた。リンカ−２は、ｈＥＧＦ遺伝子のす＜”ｔｆｌに
追加のプロセシング部位（ｓｅｒ−１ｅｕ−ａａｐ−１
ｙｓ −ａｒｇ ）を挿入することによりα−ファクタ
ープロセシングシグナルを変更している。得られた酵母
プラスミドをｐｙαＥＣＦ −２２と称する。構成（ｃ
）はジペプチジルアミ、ノペプチターゼ成熟部位（ｇｌ
ｕ−ａｌａ）が除去されてしり、構成（ａ）の試験管内
変異によう得られそ。α−ファクターリーダー−ｈ Ｅ
ＧＦ融合を含有するＰａｔ ｌ −Ｓａｌ ｌ断片をフ
ァー−／Ｍ１３中でククーニングし、そして単鎖形を分
離した。合成３１連ヌクレオチド、５’−ＴＣＴＴＴＧ
ＧＡＴＡＡＡＡＧＡＡＡＣＴＣＣＧＡＣＴＣＣＣＧ −
３’を合威し、そしてこの７０ピコモルを、ＤＮＡポリ
メラーゼのフレノウ（Ｋ １ ｅ ｎ ｏｗ）フラグメ
ントを用いて前記のテンプレート１ピコモルから第２鎖
を合成−するためのプライマーとして使用した。補充（
ｆｉｌｌ−ｉｎ） Ｌ、そして１４℃にて１８時間連結
した後、混合物を８１ヌクレアーゼで処理（５ユニツト
、１５分間）し、そしてＥ、コリＴ Ｍ １０１細胞を
トランスフェクトするのに用いた。ｇｌｕ−ａｌａをコ
ードする領域が除去されたＤＮＡ配列を含有するバクテ
リオファージの位置を、プローブとじて３２ｐ−標識ブ
ライマーを用いるフィルタープラクハイブリッド形成に
より決定した。陽性プラクからのＲＦ ＤＮＡを分離し
、Ｐｓｔ Ｉ及び訃工■消化し、そして得られた断片を
１．あらかじめ５ａｌｌで完全消化しそしてＰｓｔ Ｉ
で部分消化しそしてアルカリホスファターゼで処理した
ｐＡＢ１１４中に挿入した。
記のようにして調製した。構成（ｂ）は構成（ａ）と同
様にして調製したがリンカ−１の代りにリンカ−２を用
いた。リンカ−２は、ｈＥＧＦ遺伝子のす＜”ｔｆｌに
追加のプロセシング部位（ｓｅｒ−１ｅｕ−ａａｐ−１
ｙｓ −ａｒｇ ）を挿入することによりα−ファクタ
ープロセシングシグナルを変更している。得られた酵母
プラスミドをｐｙαＥＣＦ −２２と称する。構成（ｃ
）はジペプチジルアミ、ノペプチターゼ成熟部位（ｇｌ
ｕ−ａｌａ）が除去されてしり、構成（ａ）の試験管内
変異によう得られそ。α−ファクターリーダー−ｈ Ｅ
ＧＦ融合を含有するＰａｔ ｌ −Ｓａｌ ｌ断片をフ
ァー−／Ｍ１３中でククーニングし、そして単鎖形を分
離した。合成３１連ヌクレオチド、５’−ＴＣＴＴＴＧ
ＧＡＴＡＡＡＡＧＡＡＡＣＴＣＣＧＡＣＴＣＣＣＧ −
３’を合威し、そしてこの７０ピコモルを、ＤＮＡポリ
メラーゼのフレノウ（Ｋ １ ｅ ｎ ｏｗ）フラグメ
ントを用いて前記のテンプレート１ピコモルから第２鎖
を合成−するためのプライマーとして使用した。補充（
ｆｉｌｌ−ｉｎ） Ｌ、そして１４℃にて１８時間連結
した後、混合物を８１ヌクレアーゼで処理（５ユニツト
、１５分間）し、そしてＥ、コリＴ Ｍ １０１細胞を
トランスフェクトするのに用いた。ｇｌｕ−ａｌａをコ
ードする領域が除去されたＤＮＡ配列を含有するバクテ
リオファージの位置を、プローブとじて３２ｐ−標識ブ
ライマーを用いるフィルタープラクハイブリッド形成に
より決定した。陽性プラクからのＲＦ ＤＮＡを分離し
、Ｐｓｔ Ｉ及び訃工■消化し、そして得られた断片を
１．あらかじめ５ａｌｌで完全消化しそしてＰｓｔ Ｉ
で部分消化しそしてアルカリホスファターゼで処理した
ｐＡＢ１１４中に挿入した。
プラスミドｐＡＢ １１４は次のようにして誘導した。
プラスミドｐＡＢ １１２をＨｉｎｄｕ により完全
消化し、そして高いＤＮＡ濃度（４μｍ／／ｍｌ ）に
か−て再結合せしめ、そしてα−因子構造遺伝子から３
個の６３ ｂｐ Ｈｉｎｄｕ［Ｉ 断片が除去されそ
して１個の成熟α−ファクターコード領域のみが残って
いるプラスミドｐＡ８１１３を得た。旦ｃｏＲＩで切断
し、突出している末端をＤＮＡポリメラーゼのフレノウ
フラグメントを用いて補充し、ＢａｍＨＩ リンｉｙ
’５ｒ結合し、ＢａｍＨＩによυ切断することによっ
てプラスミドｐＡＢ１１にＢａｍＨＩｔ加え、そして再
連結することによってｐＡＢ １２を得た。プラスミド
ｐＡＢ１１３をＥｃｏＲＩによシ消化し、突出している
末端を補充し、そしてＢａｍＨＩ ！ｊンカーに結合
した。
消化し、そして高いＤＮＡ濃度（４μｍ／／ｍｌ ）に
か−て再結合せしめ、そしてα−因子構造遺伝子から３
個の６３ ｂｐ Ｈｉｎｄｕ［Ｉ 断片が除去されそ
して１個の成熟α−ファクターコード領域のみが残って
いるプラスミドｐＡ８１１３を得た。旦ｃｏＲＩで切断
し、突出している末端をＤＮＡポリメラーゼのフレノウ
フラグメントを用いて補充し、ＢａｍＨＩ リンｉｙ
’５ｒ結合し、ＢａｍＨＩによυ切断することによっ
てプラスミドｐＡＢ１１にＢａｍＨＩｔ加え、そして再
連結することによってｐＡＢ １２を得た。プラスミド
ｐＡＢ１１３をＥｃｏＲＩによシ消化し、突出している
末端を補充し、そしてＢａｍＨＩ ！ｊンカーに結合
した。
Ｂａｍ Ｈｌで消化した後１５００ ｂｐ断片をケ０ル
済過し、そしてＢａｍＨＩで消化しそしてアルカリホス
ファターゼで処理したｐＡＢ１２と連結した。α−ファ
クター遺伝子を和持する１ ５００ ｂｐ ＢａｍＨＩ
断片を含有するプラスミドｐＡＢ１１４を得た。得られ
たプラスミド（前記の構成を含有するｐＡＢ１１４ ）
をルエＨ１で消化し、そしてプラスミドｐｃ１／１中に
連結した。
済過し、そしてＢａｍＨＩで消化しそしてアルカリホス
ファターゼで処理したｐＡＢ１２と連結した。α−ファ
クター遺伝子を和持する１ ５００ ｂｐ ＢａｍＨＩ
断片を含有するプラスミドｐＡＢ１１４を得た。得られ
たプラスミド（前記の構成を含有するｐＡＢ１１４ ）
をルエＨ１で消化し、そしてプラスミドｐｃ１／１中に
連結した。
得られた酵母プラスミドをｐｙαＥＧＦ −２３と称す
る。構成（ｄ）は新しいＫｐｍ １部位を有し、構成（
ｃ）について記載したのと同様にして調製した。但し配
列５’−ＧＧＧＴＡＣＣＴＴＴＧＧＡＴＡＡＡＡＧＡＡ
ＡＣＴＣＣＧＡＣＴＣＣＧＡＡＴ−３′を有する３６連
オリゴヌクレオチドプライマーを使用した。こうして得
られた酵母プラスミドをｐｙαＥＧＦ −２４と称する
。構成（ｅ）は、構成（ｄ）をを含有するプラスミドを
リンカ−１及び２を用いないで五と１及びむユ■で消化
することによう誘導した。得られた酵母プラスミドをｐ
ｙαＥＧＦ’ −２５と称する。
る。構成（ｄ）は新しいＫｐｍ １部位を有し、構成（
ｃ）について記載したのと同様にして調製した。但し配
列５’−ＧＧＧＴＡＣＣＴＴＴＧＧＡＴＡＡＡＡＧＡＡ
ＡＣＴＣＣＧＡＣＴＣＣＧＡＡＴ−３′を有する３６連
オリゴヌクレオチドプライマーを使用した。こうして得
られた酵母プラスミドをｐｙαＥＧＦ −２４と称する
。構成（ｅ）は、構成（ｄ）をを含有するプラスミドを
リンカ−１及び２を用いないで五と１及びむユ■で消化
することによう誘導した。得られた酵母プラスミドをｐ
ｙαＥＧＦ’ −２５と称する。
ｐｙαＫＧＦ −２２で形質転換した酵母細胞を１５ｍ
１の培地に増殖せしめた。示された濃度及び時間におい
て培養物を遠心分離し、モして上清液を得、氷上に保持
した。細胞ペレットを溶解緩衝液（０１トリトンＸ −
１０，Ｏ−１０ｍＭ ＮａＨＰＯ４−ｐ！（７，５）中
で洗浄し、そして１容量の溶解緩衝液及び１容量のがラ
スビーズ中で渦動せしめる（氷上で冷却しながら１分間
間隔で５分間）ことによシ破砕した。遠心分離の後上清
液を集め、そして氷上に保持した。培地中及び細胞抽出
液中のｈ ＥＧＦ’の量を、線維芽細胞すセデター結合
競争測定によシ測定した。標準量の ！−標識マウスＥ
ＧＦの結合に対する増加する量のマウスＥＧＦの効果を
測定することによう標準曲線を得た。
１の培地に増殖せしめた。示された濃度及び時間におい
て培養物を遠心分離し、モして上清液を得、氷上に保持
した。細胞ペレットを溶解緩衝液（０１トリトンＸ −
１０，Ｏ−１０ｍＭ ＮａＨＰＯ４−ｐ！（７，５）中
で洗浄し、そして１容量の溶解緩衝液及び１容量のがラ
スビーズ中で渦動せしめる（氷上で冷却しながら１分間
間隔で５分間）ことによシ破砕した。遠心分離の後上清
液を集め、そして氷上に保持した。培地中及び細胞抽出
液中のｈ ＥＧＦ’の量を、線維芽細胞すセデター結合
競争測定によシ測定した。標準量の ！−標識マウスＥ
ＧＦの結合に対する増加する量のマウスＥＧＦの効果を
測定することによう標準曲線を得た。
−蛋白質を、Ｂｉｏ−Ｒｅｘ ７０樹脂への吸着及び８
０係エタノール中０．０１ＮＨＣ２による溶出によって
培地から濃縮し、そして逆相Ｃ１８カラムを用いる高速
液体クロマトグラフィーによう精製した。
０係エタノール中０．０１ＮＨＣ２による溶出によって
培地から濃縮し、そして逆相Ｃ１８カラムを用いる高速
液体クロマトグラフィーによう精製した。
カラムを、０．２１のトリプルオロ酢酸を含有する５俤
〜８０係のアセトニトリルの直線グラデイエンドによｌ
）４ｍｔ１分の流速で６０分間溶出した。
〜８０係のアセトニトリルの直線グラデイエンドによｌ
）４ｍｔ１分の流速で６０分間溶出した。
蛋白質（２００〜８００ピコモル）のアミノ末端のアミ
ノ酸配列を、工；（マン分解法によシ、気相蛋白質シー
ケンサ−Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏａｙｓｔｅｍｓｍｏｄ
ｅｌ ４７ＯＡを用いて決定した。すべての分析に通常
のＰＲＯＴＦＡプログラムを使用した。Ｓ２（酢酸エチ
ル：２０ｒｎ ｘｏ１ｎ９／Ａ）に、使用直前にジチオスレイトールを
加えた。すべての試料をメタノール中ＩＮＨＣｔによシ
４０℃にて１５分間処理することにより、ＰＴＨ−アス
ノソラギン酸及びＰＴＨ−グルタミン酸をこれらのメチ
ルエステルに転換した。すべてのＰＴＨ−アミノ酸の同
定は、標準としてＰＴＨ−アミノ酸の既知混合物を用い
て、ＩＢＭ ＣＮ ＨＰＬＣカラ人上での保持時間を比
較することにより行った。
ノ酸配列を、工；（マン分解法によシ、気相蛋白質シー
ケンサ−Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏａｙｓｔｅｍｓｍｏｄ
ｅｌ ４７ＯＡを用いて決定した。すべての分析に通常
のＰＲＯＴＦＡプログラムを使用した。Ｓ２（酢酸エチ
ル：２０ｒｎ ｘｏ１ｎ９／Ａ）に、使用直前にジチオスレイトールを
加えた。すべての試料をメタノール中ＩＮＨＣｔによシ
４０℃にて１５分間処理することにより、ＰＴＨ−アス
ノソラギン酸及びＰＴＨ−グルタミン酸をこれらのメチ
ルエステルに転換した。すべてのＰＴＨ−アミノ酸の同
定は、標準としてＰＴＨ−アミノ酸の既知混合物を用い
て、ＩＢＭ ＣＮ ＨＰＬＣカラ人上での保持時間を比
較することにより行った。
ｐＹ（ｚＥＧＦ − ２ ２は、天然Ｎ末端ｈ ＥＧＦ
とｇｌｕ−ａｌａ末端ｈＥＧＦを４：１のモル比で分泌
し、他方ｐＹαＥＧＦ − ２ ３〜２５は天然Ｎ末端
ｈ ＥＧＦ’のみを分泌した。ｈ ＥＧＦの収量は、蛋
白質として又はリセゾター結合測定にかいて測定した場
合５〜８μθ／ｍ７！ の範囲であった。
とｇｌｕ−ａｌａ末端ｈＥＧＦを４：１のモル比で分泌
し、他方ｐＹαＥＧＦ − ２ ３〜２５は天然Ｎ末端
ｈ ＥＧＦ’のみを分泌した。ｈ ＥＧＦの収量は、蛋
白質として又はリセゾター結合測定にかいて測定した場
合５〜８μθ／ｍ７！ の範囲であった。
ＪＲＹ１８８株（ＭＡＴ虫２−圧胎２−１シ巳ヱー工
幻１１ 上口 肚にＤをｐｙαＥＧＦ −２１で形質転
換し、そしてロイシン原栄養株を３７℃にかいて選択し
た。飽和した培養物を新鮮培地中に１／１００に稀釈し
、そして許容温度（２４℃）及び非許容温度（３６℃）
においてロイシン選択培地中で増殖せしめ、そして培養
上清液中のｈ ＥＧＦの存在を前記のようにして測定し
た。
幻１１ 上口 肚にＤをｐｙαＥＧＦ −２１で形質転
換し、そしてロイシン原栄養株を３７℃にかいて選択し
た。飽和した培養物を新鮮培地中に１／１００に稀釈し
、そして許容温度（２４℃）及び非許容温度（３６℃）
においてロイシン選択培地中で増殖せしめ、そして培養
上清液中のｈ ＥＧＦの存在を前記のようにして測定し
た。
結果を次の表に示す。
形質転換された酵母１匡３温度感受性変異株にかけるｈ
ＥＧＦの制御された合成及び分泌以下余Ｅ 温 度 形質転換体 ０．Ｄ、６５０ ｈＥＧＦ（μ
Ｉ／ｆｎｌ ）４ ０．０２４ ４．０ ３２５０ ４．２ ４６００ これらの結果はハイブリット°α−因子／ＥＧＦ遺伝子
が、高コピー数プラスミド上に存在する場合でも、交配
型（ｍａｔｉｎｇ ｔｙｐｅ）制御のもとで発現される
ことを示す。
ＥＧＦの制御された合成及び分泌以下余Ｅ 温 度 形質転換体 ０．Ｄ、６５０ ｈＥＧＦ（μ
Ｉ／ｆｎｌ ）４ ０．０２４ ４．０ ３２５０ ４．２ ４６００ これらの結果はハイブリット°α−因子／ＥＧＦ遺伝子
が、高コピー数プラスミド上に存在する場合でも、交配
型（ｍａｔｉｎｇ ｔｙｐｅ）制御のもとで発現される
ことを示す。
この発明に従えば、ベクターに挿入される新規な構成が
提供され、これによｆｉＮ末端リーダー配列と１個又は
複数個のプロセシングシグナルを有するポリペプチドが
発現され、そしてポリペプチドの分泌及び余分のアミノ
酸を含ｔｆＬい成熟ポリペプチド生成物を生じさせるプ
ロセシングがもたらされる。すなわち、天然ポリペプチ
ドと同じ配列を有するポリペプチドが得られる。さらに
、ポリペプチドが酵母中で生産され得るためグリコキル
化が生ずることができ、その結果天然生成物と同じ生成
物が得られる。さらに、生成物が分泌されるため、細胞
数に基いて非常に高い収量が得られ、そしてプロセシン
グ及び精製が非常に単純化される。さらに、変異宿主を
用いることによシ、発現の停止及び開始を意の１．１に
制御することができる。
提供され、これによｆｉＮ末端リーダー配列と１個又は
複数個のプロセシングシグナルを有するポリペプチドが
発現され、そしてポリペプチドの分泌及び余分のアミノ
酸を含ｔｆＬい成熟ポリペプチド生成物を生じさせるプ
ロセシングがもたらされる。すなわち、天然ポリペプチ
ドと同じ配列を有するポリペプチドが得られる。さらに
、ポリペプチドが酵母中で生産され得るためグリコキル
化が生ずることができ、その結果天然生成物と同じ生成
物が得られる。さらに、生成物が分泌されるため、細胞
数に基いて非常に高い収量が得られ、そしてプロセシン
グ及び精製が非常に単純化される。さらに、変異宿主を
用いることによシ、発現の停止及び開始を意の１．１に
制御することができる。
以上、例示によってこの発明をいく分詳細に記載したが
、これは明確な理解に資するためのものであって、これ
によりこの発明の範囲を限定するも−のではない。
、これは明確な理解に資するためのものであって、これ
によりこの発明の範囲を限定するも−のではない。
なお、酵母史−１友！ヌー七λ・１にζＺ毛二（Ｓ。
ｃｅｒｅｖｉａｔａｅ）ＡＢ１０３ （ｐＹＥＧＦ８
）は、１９８３年１月５日Ａ、’ｒ、ｃ、ｃ、に寄託さ
れ、受は入れ番号煮２０６５８が与えられている。
）は、１９８３年１月５日Ａ、’ｒ、ｃ、ｃ、に寄託さ
れ、受は入れ番号煮２０６５８が与えられている。
グラスミドｐｙαＥＧＦ ２３ （ｐＡＢ１１４−ｐｃ
１／１）は、１９８３年８月１２日にＡ、Ｔ、Ｃ，Ｃ０
寄託され、受は入れ番号４４００７９が与えられている
。
１／１）は、１９８３年８月１２日にＡ、Ｔ、Ｃ，Ｃ０
寄託され、受は入れ番号４４００７９が与えられている
。
第１図はグラスミドｐＹαＥＧＦ −２１を構成するた
めの系統図であり、第、２図はｈＥＧＦのＮ末端とリー
ダー配列連結部の配列、及びｈＥＣ；ＦのＣ末端の配列
を示す図である。
めの系統図であり、第、２図はｈＥＧＦのＮ末端とリー
ダー配列連結部の配列、及びｈＥＣ；ＦのＣ末端の配列
を示す図である。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １、酵母において組換ポリペプチドを生産せしめそして
該ポリペプチドを培地中に分泌せしめる方法であって、 酵母にとって外来法の蛋白質をコードするＤＮＡ構成物
により形質転換された酵母宿主を用意し、該蛋白質のア
ミノ酸配列が異種性ポリペプチド配列に連結された分泌
を提供するための酵母ａ−ファクターリーダー配列の少
なくとも部分を含んで成り、前記蛋白質はさらに該蛋白
質を前記異種性ポリペプチドにプロセシングするための
酵母プロセシングシグナルを含んで成り； 前記培地中で前記形質転された酵母を、前記蛋白質が発
現され、少なくとも部分的に前記ポリペプチドにプロセ
シングされそして該培地中に分泌される条件下で増殖せ
しめ；そして 前記培地から前記分泌されたポリペプチドを回収する； ことを特徴とする方法。 ２ 前記ＤＮＡ構成物が次の式： ▲数式、化学式、表等があります▼ （式中、 Ｔｒは、酵母プロモーター配列であり； Ｌは、分泌を提供する酵母ａ−ファクターリーダー配列
の少なくとも部分をコードしており；Ｓは、Ｌ−Ｓ−Ｇ
ｅｎｅ＾＊によりコードされている前駆体ポリペプチド
をＧｅｎｅ＾＊によりコードされているポリペプチドに
プロセシングするためのプロセシングシグナルをコード
しているスペーサーであり；Ｇｅｎｅ＾＊は、酵母にと
って外来性であるポリペプチドをコードしており；そし
て Ｔｅは、Ｔｒに対応する転写終止シグナルである） で表わされることを特徴とする特許請求の範囲第２項に
記載の方法。 ３、Ｔｒが酵母α−ファクタープロモーター配列を含ん
で成る特許請求の範囲第２項記載の方法。 ４、Ｓが前記配列Ｇｅｎｅ＾＊にすぐ隣接して配列５′
−Ｒ＿１−Ｒ＿２−３′を含有し、ここでＲ＿１はリジ
ン又はアルギニンのコドンであり、Ｒ＿２はリジン又は
アルギニンのコドンであり、但しＳは配列５′−Ｌｙｓ
−Ａｒｇ−Ｘ−３′を含有せず、ここでＸはジペプチジ
ルアミノペプチダーゼＡのためのプロセシングシグナル
をコードしている、特許請求の範囲第２項に記載の方法
。 ５、Ｓが５′−Ｒ＿１−Ｒ＿２−３′であって、Ｒ＿１
がリジンでありそしてＲ＿２がアルギニンである特許請
求の範囲第４項に記載の方法。 ６、Ｇｅｎｅ＾＊が哺乳類蛋白質をコードしている特許
請求の範囲第２項〜第４項のいずれか１項に記載の方法
。 ７、前記哺乳類蛋白質がヒト上皮成長因子である特許請
求の範囲第６項に記載の方法。 ８、前記酵母がサッカロミセス属の酵母である特許請求
の範囲第１項〜第６項のいずれか１項に記載の方法。 ９、前記ポリペプチドがＥＧＦであり、そして前記ＤＮ
Ａ構成物が該ＤＮＡを含んでなるプラスミドの形で形質
転に使用され、ここで該ＤＮＡ構成物は該プラスミド中
の選択された制限エンドヌクレアーゼ酵母部位に挿入さ
れており、そして次の方法、すなわち、酵母ゲノムライ
ブラリーからα−ファクターをコードする配列を含む選
択された制限エンドヌクレアーゼ酵母ＤＮＡ断片を得、
該α−ファクターをコードする断片から選択された制限
エンドヌクレアーゼ酵母ＤＮＡ断片を除去し、そして該
除去された断片に代えてＥＧＦをコードする配列を残り
のＤＮＡ断片に挿入することにより鋼製したものである
、特許請求の範囲第１項〜第６項のいずれか１項に記載
の方法。 １０、前記ポリペプチドがＥＧＦであり、そして前記Ｄ
ＮＡ構成物がプラスミド中の選択された制限エンドヌク
レアーゼ酵母部位に挿入されており、そして次の方法、
すなわち、酵母ゲノムライブラリーからα−ファクター
をコードする配列を含む選択された制限エンドヌクレア
ーゼ酵母ＤＮＡ断片を得、該α−ファクターをコードす
る断片から選択された制限エンドヌクレアーゼ酵母ＤＮ
Ａ断片を除去し、そして該除去された断片に代えてＥＣ
Ｆをコードする配列を残りのＤＮＡ断片に挿入すること
により調製したものである、特許請求の範囲第１項に記
載の方法。
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