DK169952B1 - DNA-sekvens, epidermalt udtrykkelsesmiddel, fremgangsmåde til fremstilling af et rekombinant polypeptid, plasmid og værtscelle, som er transformeret med DNA-sekvensen - Google Patents
DNA-sekvens, epidermalt udtrykkelsesmiddel, fremgangsmåde til fremstilling af et rekombinant polypeptid, plasmid og værtscelle, som er transformeret med DNA-sekvensen Download PDFInfo
- Publication number
- DK169952B1 DK169952B1 DK577883A DK577883A DK169952B1 DK 169952 B1 DK169952 B1 DK 169952B1 DK 577883 A DK577883 A DK 577883A DK 577883 A DK577883 A DK 577883A DK 169952 B1 DK169952 B1 DK 169952B1
- Authority
- DK
- Denmark
- Prior art keywords
- yeast
- sequence
- dna sequence
- polypeptide
- gene
- Prior art date
Links
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 title claims description 69
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 title claims description 67
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 title claims description 67
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 48
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 title claims description 39
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 title claims description 36
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 76
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 claims description 47
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 35
- 230000008569 process Effects 0.000 claims description 31
- IXKSXJFAGXLQOQ-XISFHERQSA-N WHWLQLKPGQPMY Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C1=CNC=N1 IXKSXJFAGXLQOQ-XISFHERQSA-N 0.000 claims description 27
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 22
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 claims description 21
- 230000028327 secretion Effects 0.000 claims description 20
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 19
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 claims description 14
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 14
- 102400001368 Epidermal growth factor Human genes 0.000 claims description 12
- 101800003838 Epidermal growth factor Proteins 0.000 claims description 12
- 229940116977 epidermal growth factor Drugs 0.000 claims description 12
- VBEQCZHXXJYVRD-GACYYNSASA-N uroanthelone Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O)C(C)C)[C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC=1NC=NC=1)NC(=O)[C@H](CCSC)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CNC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CS)NC(=O)CNC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O)C(C)C)[C@@H](C)CC)C1=CC=C(O)C=C1 VBEQCZHXXJYVRD-GACYYNSASA-N 0.000 claims description 11
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 claims description 7
- GVUGOAYIVIDWIO-UFWWTJHBSA-N nepidermin Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CCSC)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC=1NC=NC=1)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC=1NC=NC=1)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O)C(C)C)[C@@H](C)CC)C(C)C)C(C)C)C1=CC=C(O)C=C1 GVUGOAYIVIDWIO-UFWWTJHBSA-N 0.000 claims description 7
- -1 calcidonin Proteins 0.000 claims description 6
- NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N insulin Chemical compound N1C(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(NC(=O)CN)C(C)CC)CSSCC(C(NC(CO)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CSSCC(NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(C)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2NC=NC=2)NC(=O)C(CO)NC(=O)CNC2=O)C(=O)NCC(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)NC(C(C)O)C(=O)N3C(CCC3)C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C)C(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(O)=O)=O)NC(=O)C(C(C)CC)NC(=O)C(CO)NC(=O)C(C(C)O)NC(=O)C1CSSCC2NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(N)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)CC1=CN=CN1 NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 claims description 6
- 239000002243 precursor Substances 0.000 claims description 5
- OFHCOWSQAMBJIW-AVJTYSNKSA-N alfacalcidol Chemical compound C1(/[C@@H]2CC[C@@H]([C@]2(CCC1)C)[C@H](C)CCCC(C)C)=C\C=C1\C[C@@H](O)C[C@H](O)C1=C OFHCOWSQAMBJIW-AVJTYSNKSA-N 0.000 claims description 4
- 238000003780 insertion Methods 0.000 claims description 4
- 230000037431 insertion Effects 0.000 claims description 4
- 230000010076 replication Effects 0.000 claims description 4
- 102000009027 Albumins Human genes 0.000 claims description 3
- 108010088751 Albumins Proteins 0.000 claims description 3
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 claims description 3
- 101500025419 Homo sapiens Epidermal growth factor Proteins 0.000 claims description 3
- 102000004877 Insulin Human genes 0.000 claims description 3
- 108090001061 Insulin Proteins 0.000 claims description 3
- 108090000723 Insulin-Like Growth Factor I Proteins 0.000 claims description 3
- 102000014150 Interferons Human genes 0.000 claims description 3
- 108010050904 Interferons Proteins 0.000 claims description 3
- 108090000783 Renin Proteins 0.000 claims description 3
- 102100028255 Renin Human genes 0.000 claims description 3
- 102000013275 Somatomedins Human genes 0.000 claims description 3
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 229940116978 human epidermal growth factor Drugs 0.000 claims description 3
- 229940125396 insulin Drugs 0.000 claims description 3
- 210000005253 yeast cell Anatomy 0.000 claims description 3
- 101710089839 Dipeptidyl aminopeptidase A Proteins 0.000 claims description 2
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 claims description 2
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 claims description 2
- 125000006850 spacer group Chemical group 0.000 claims description 2
- 102000018997 Growth Hormone Human genes 0.000 claims 2
- 108010051696 Growth Hormone Proteins 0.000 claims 2
- 239000000122 growth hormone Substances 0.000 claims 2
- 229940079322 interferon Drugs 0.000 claims 2
- 241000235070 Saccharomyces Species 0.000 claims 1
- 230000005030 transcription termination Effects 0.000 claims 1
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 23
- 239000000047 product Substances 0.000 description 19
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 18
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 11
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 11
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 10
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 8
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 8
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 6
- 101000851196 Mus musculus Pro-epidermal growth factor Proteins 0.000 description 6
- 239000002585 base Substances 0.000 description 6
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 6
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 5
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 description 5
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 description 5
- 239000005556 hormone Substances 0.000 description 5
- 230000001976 improved effect Effects 0.000 description 5
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 5
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 5
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 5
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 4
- 108010016626 Dipeptides Proteins 0.000 description 4
- 101000851176 Homo sapiens Pro-epidermal growth factor Proteins 0.000 description 4
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 4
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 4
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 4
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 4
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 description 4
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 4
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 4
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 4
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 4
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 102000004594 DNA Polymerase I Human genes 0.000 description 3
- 108010017826 DNA Polymerase I Proteins 0.000 description 3
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 3
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 3
- 101150084418 EGF gene Proteins 0.000 description 3
- XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N Ethyl acetate Chemical compound CCOC(C)=O XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 3
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 3
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 3
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 3
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 3
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 3
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 3
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 3
- 108010054576 Deoxyribonuclease EcoRI Proteins 0.000 description 2
- 108010049140 Endorphins Proteins 0.000 description 2
- 102000009025 Endorphins Human genes 0.000 description 2
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 2
- JZDHUJAFXGNDSB-WHFBIAKZSA-N Glu-Ala Chemical compound OC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O JZDHUJAFXGNDSB-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 2
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N Iron Chemical compound [Fe] XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 2
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 125000001429 N-terminal alpha-amino-acid group Chemical group 0.000 description 2
- 108010038807 Oligopeptides Proteins 0.000 description 2
- 102000015636 Oligopeptides Human genes 0.000 description 2
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 2
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 2
- LCTONWCANYUPML-UHFFFAOYSA-N Pyruvic acid Chemical compound CC(=O)C(O)=O LCTONWCANYUPML-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N Trifluoroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(F)(F)F DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 2
- 230000008859 change Effects 0.000 description 2
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 2
- 230000001627 detrimental effect Effects 0.000 description 2
- 238000011049 filling Methods 0.000 description 2
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 2
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 2
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 description 2
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 description 2
- 108010049041 glutamylalanine Proteins 0.000 description 2
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 2
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 2
- 239000012139 lysis buffer Substances 0.000 description 2
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 2
- 230000035800 maturation Effects 0.000 description 2
- 125000001360 methionine group Chemical group N[C@@H](CCSC)C(=O)* 0.000 description 2
- 210000004897 n-terminal region Anatomy 0.000 description 2
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 2
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 2
- 235000019833 protease Nutrition 0.000 description 2
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 2
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 2
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 2
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 description 2
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N (2S)-2-Amino-3-hydroxypropansäure Chemical compound OC[C@H](N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- NWUYHJFMYQTDRP-UHFFFAOYSA-N 1,2-bis(ethenyl)benzene;1-ethenyl-2-ethylbenzene;styrene Chemical compound C=CC1=CC=CC=C1.CCC1=CC=CC=C1C=C.C=CC1=CC=CC=C1C=C NWUYHJFMYQTDRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- VFWCMGCRMGJXDK-UHFFFAOYSA-N 1-chlorobutane Chemical compound CCCCCl VFWCMGCRMGJXDK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- NFUCNAREVSTFNC-UHFFFAOYSA-N 2-(5-oxo-1-phenyl-2-sulfanylideneimidazolidin-4-yl)acetic acid Chemical compound O=C1C(CC(=O)O)NC(=S)N1C1=CC=CC=C1 NFUCNAREVSTFNC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102100027324 2-hydroxyacyl-CoA lyase 1 Human genes 0.000 description 1
- ULKNJYDXLYMGFB-UHFFFAOYSA-N 3-(5-oxo-1-phenyl-2-sulfanylideneimidazolidin-4-yl)propanoic acid Chemical compound O=C1C(CCC(=O)O)NC(=S)N1C1=CC=CC=C1 ULKNJYDXLYMGFB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000007698 Alcohol dehydrogenase Human genes 0.000 description 1
- 108010021809 Alcohol dehydrogenase Proteins 0.000 description 1
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 1
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 1
- CKLJMWTZIZZHCS-UHFFFAOYSA-N Aspartic acid Chemical compound OC(=O)C(N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000055006 Calcitonin Human genes 0.000 description 1
- 108060001064 Calcitonin Proteins 0.000 description 1
- 101710088194 Dehydrogenase Proteins 0.000 description 1
- 108010065372 Dynorphins Proteins 0.000 description 1
- 101100223032 Emericella nidulans (strain FGSC A4 / ATCC 38163 / CBS 112.46 / NRRL 194 / M139) dapB gene Proteins 0.000 description 1
- 102000003951 Erythropoietin Human genes 0.000 description 1
- 108090000394 Erythropoietin Proteins 0.000 description 1
- 241001131785 Escherichia coli HB101 Species 0.000 description 1
- 241001524679 Escherichia virus M13 Species 0.000 description 1
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 1
- 101000930822 Giardia intestinalis Dipeptidyl-peptidase 4 Proteins 0.000 description 1
- 102000006395 Globulins Human genes 0.000 description 1
- 108010044091 Globulins Proteins 0.000 description 1
- 108010033128 Glucan Endo-1,3-beta-D-Glucosidase Proteins 0.000 description 1
- 101001009252 Homo sapiens 2-hydroxyacyl-CoA lyase 1 Proteins 0.000 description 1
- ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N L-Proline Chemical compound OC(=O)[C@@H]1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N L-glutamic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- 102000008072 Lymphokines Human genes 0.000 description 1
- 108010074338 Lymphokines Proteins 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 101710163270 Nuclease Proteins 0.000 description 1
- 102400000050 Oxytocin Human genes 0.000 description 1
- 101800000989 Oxytocin Proteins 0.000 description 1
- XNOPRXBHLZRZKH-UHFFFAOYSA-N Oxytocin Natural products N1C(=O)C(N)CSSCC(C(=O)N2C(CCC2)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NCC(N)=O)NC(=O)C(CC(N)=O)NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(C(C)CC)NC(=O)C1CC1=CC=C(O)C=C1 XNOPRXBHLZRZKH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- 102000001105 Phosphofructokinases Human genes 0.000 description 1
- 108010069341 Phosphofructokinases Proteins 0.000 description 1
- 102000012288 Phosphopyruvate Hydratase Human genes 0.000 description 1
- 108010022181 Phosphopyruvate Hydratase Proteins 0.000 description 1
- 102000004160 Phosphoric Monoester Hydrolases Human genes 0.000 description 1
- 108090000608 Phosphoric Monoester Hydrolases Proteins 0.000 description 1
- 208000037062 Polyps Diseases 0.000 description 1
- 102100024622 Proenkephalin-B Human genes 0.000 description 1
- ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N Proline Natural products OC(=O)C1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000001253 Protein Kinase Human genes 0.000 description 1
- 101150028158 STE13 gene Proteins 0.000 description 1
- NLOAIFSWUUFQFR-CIUDSAMLSA-N Ser-Leu-Asp Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O NLOAIFSWUUFQFR-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- 102000005924 Triose-Phosphate Isomerase Human genes 0.000 description 1
- 108700015934 Triose-phosphate isomerases Proteins 0.000 description 1
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 1
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 description 1
- GXBMIBRIOWHPDT-UHFFFAOYSA-N Vasopressin Natural products N1C(=O)C(CC=2C=C(O)C=CC=2)NC(=O)C(N)CSSCC(C(=O)N2C(CCC2)C(=O)NC(CCCN=C(N)N)C(=O)NCC(N)=O)NC(=O)C(CC(N)=O)NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C1CC1=CC=CC=C1 GXBMIBRIOWHPDT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010004977 Vasopressins Proteins 0.000 description 1
- 102000002852 Vasopressins Human genes 0.000 description 1
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 1
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 239000012190 activator Substances 0.000 description 1
- 239000003513 alkali Substances 0.000 description 1
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 1
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- KBZOIRJILGZLEJ-LGYYRGKSSA-N argipressin Chemical compound C([C@H]1C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CSSC[C@@H](C(N[C@@H](CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)N1)=O)N)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCCN=C(N)N)C(=O)NCC(N)=O)C1=CC=CC=C1 KBZOIRJILGZLEJ-LGYYRGKSSA-N 0.000 description 1
- 235000003704 aspartic acid Nutrition 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N beta-carboxyaspartic acid Natural products OC(=O)C(N)C(C(O)=O)C(O)=O OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 1
- 229960004015 calcitonin Drugs 0.000 description 1
- BBBFJLBPOGFECG-VJVYQDLKSA-N calcitonin Chemical compound N([C@H](C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC=1NC=NC=1)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CO)C(=O)NCC(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(N)=O)C(C)C)C(=O)[C@@H]1CSSC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N1 BBBFJLBPOGFECG-VJVYQDLKSA-N 0.000 description 1
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 description 1
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 101150018117 cobB gene Proteins 0.000 description 1
- 210000001072 colon Anatomy 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 230000001276 controlling effect Effects 0.000 description 1
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 1
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 1
- 230000001086 cytosolic effect Effects 0.000 description 1
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 1
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 1
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N dithiothreitol Chemical compound SC[C@@H](O)[C@H](O)CS VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 230000002124 endocrine Effects 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 239000000147 enterotoxin Substances 0.000 description 1
- 231100000655 enterotoxin Toxicity 0.000 description 1
- 229940105423 erythropoietin Drugs 0.000 description 1
- 238000001704 evaporation Methods 0.000 description 1
- 230000008020 evaporation Effects 0.000 description 1
- 230000029142 excretion Effects 0.000 description 1
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 1
- 239000004744 fabric Substances 0.000 description 1
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 1
- 239000012737 fresh medium Substances 0.000 description 1
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 102000018146 globin Human genes 0.000 description 1
- 108060003196 globin Proteins 0.000 description 1
- 125000003976 glyceryl group Chemical group [H]C([*])([H])C(O[H])([H])C(O[H])([H])[H] 0.000 description 1
- 230000034659 glycolysis Effects 0.000 description 1
- 230000003394 haemopoietic effect Effects 0.000 description 1
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 1
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 1
- 238000011065 in-situ storage Methods 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 1
- 230000002452 interceptive effect Effects 0.000 description 1
- 229940047124 interferons Drugs 0.000 description 1
- 239000003456 ion exchange resin Substances 0.000 description 1
- 229920003303 ion-exchange polymer Polymers 0.000 description 1
- 229910052742 iron Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000004811 liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 108010056929 lyticase Proteins 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 1
- 150000004702 methyl esters Chemical class 0.000 description 1
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 1
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 1
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 229960001723 oxytocin Drugs 0.000 description 1
- XNOPRXBHLZRZKH-DSZYJQQASA-N oxytocin Chemical compound C([C@H]1C(=O)N[C@H](C(N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CSSC[C@H](N)C(=O)N1)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)NCC(N)=O)=O)[C@@H](C)CC)C1=CC=C(O)C=C1 XNOPRXBHLZRZKH-DSZYJQQASA-N 0.000 description 1
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 1
- 230000001766 physiological effect Effects 0.000 description 1
- 230000008488 polyadenylation Effects 0.000 description 1
- OXCMYAYHXIHQOA-UHFFFAOYSA-N potassium;[2-butyl-5-chloro-3-[[4-[2-(1,2,4-triaza-3-azanidacyclopenta-1,4-dien-5-yl)phenyl]phenyl]methyl]imidazol-4-yl]methanol Chemical compound [K+].CCCCC1=NC(Cl)=C(CO)N1CC1=CC=C(C=2C(=CC=CC=2)C2=N[N-]N=N2)C=C1 OXCMYAYHXIHQOA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 238000000159 protein binding assay Methods 0.000 description 1
- 108060006633 protein kinase Proteins 0.000 description 1
- 229940107700 pyruvic acid Drugs 0.000 description 1
- 238000001525 receptor binding assay Methods 0.000 description 1
- 230000008439 repair process Effects 0.000 description 1
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 1
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 1
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 1
- 210000003705 ribosome Anatomy 0.000 description 1
- 229920006395 saturated elastomer Polymers 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 1
- 239000006152 selective media Substances 0.000 description 1
- 101150089009 sir2 gene Proteins 0.000 description 1
- 238000000638 solvent extraction Methods 0.000 description 1
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 1
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 1
- 210000001685 thyroid gland Anatomy 0.000 description 1
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 1
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 1
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 241001515965 unidentified phage Species 0.000 description 1
- 229960003726 vasopressin Drugs 0.000 description 1
- 230000035899 viability Effects 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000003643 water by type Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/475—Growth factors; Growth regulators
- C07K14/485—Epidermal growth factor [EGF], i.e. urogastrone
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/62—DNA sequences coding for fusion proteins
- C12N15/625—DNA sequences coding for fusion proteins containing a sequence coding for a signal sequence
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/80—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi
- C12N15/81—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi for yeasts
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
- C07K2319/036—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif targeting to the medium outside of the cell, e.g. type III secretion
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/70—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction
- C07K2319/74—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction containing a fusion for binding to a cell surface receptor
- C07K2319/75—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction containing a fusion for binding to a cell surface receptor containing a fusion for activation of a cell surface receptor, e.g. thrombopoeitin, NPY and other peptide hormones
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Mycology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
Description
i DK 169952 B1
Den foreliggende opfindelse angår en hidtil ukendt DNA-sekvens, som koder for et protein, som er fremmed for gær. Opfindelsen angår endvidere et plasmid omfattende DNA-sekvensen, fremstilling af et rekombinant polypeptid 5 og en værtscelle, som er transformeret med DNA-sekvensen.
Udviklingen af hybrid-DNA-teknologien har muliggjort fremstillingen af polypeptider med vidt forskellig sammensætning. Da alle levende organismer indeholder protei-10 ner og anvender dem til regulering af livsprocesser, vil metoder til duplikering af disse proteiner tilvejebringe enestående muligheder for at undersøge den måde, hvorpå proteinerne fungerer, samt at anvende sådanne proteiner, fragmenter af sådanne proteiner eller analoge heraf til 15 terapi eller diagnose.
Der er gjort mange fremskridt til forbedring af fremstillingshastigheden og mængden af protein, der fremstilles af en celle. De fleste af disse fordele har været knyttet 20 til et større antal delinger, mere effektive promotorer og midler til at reducere mængden af nedbrydning af det ønskede slutprodukt. Det er indlysende, at det vil være meget fordelagtigt at kunne producere og udskille ønskede polypeptider.
25 I mange tilfælde har det ønskede polypeptid ikke nogen terminal methionin-gruppe. Dette skyldes sædvanligvis, at der findes et processtyrende signal i gen-koden for det Ønskede polypeptid, som gen-kilden genkender og spalter 30 ved hjælp af en egnet peptidase. Da gener af særlig betydning i mange tilfælde er heterologe overfor værten, i hvilken genet udtrykkes, sker en sådan proces upræcist og i lavt udbytte i den pågældende vært. I sådanne tilfælde vil det dannede protein, selv om det er identisk med det 35 ønskede peptid for så vidt angår hele sekvensen, afvige ved N-terminus, hvilket kan have en skadelig virkning på den fysiologiske aktivitet.
DK 169952 B1 2
Der er derfor mange grunde til, at det er overordentligt hensigtsmæssigt at fremstille DNA-sekvenser, som kan kode for udskillelsen og modningen af polypeptidet. Hvor der * findes sekvenser for processen, som resulterer i f jernel-5 se af de for det ønskede polypeptid overflødige aminosy- * rer, er der endvidere mulighed for at have mange DNA-sekvenser, enten den samme eller forskellige, i tandem, som kan indkodes på en enkelt transskript.
10 I USA patent nr. 4 336 336 er beskrevet prokaryoter med en ledersekvens, der koder for et ikke-cytoplasmisk protein, som normalt transporteres til eller gennem celleoverfladen, hvorved fusionsproteinet overføres til det periplasmiske rum. I USA patent nr. 4 338 397 er beskre-15 vet prokaryoter, der anvender en ledersekvens, som muliggør sekretion med spaltning af ledersekvensen fra den ønskede polypeptidsekvens. I USA patent nr. 4 338 397, spalte 3 og 4, findes velegnede definitioner, der benyttes i det efterfølgende.
20
Kurjan and Herskowitz, Cell (1982) 30:933-943 beskriver en formodet alfa-faktor-precursor, indeholdende fire tandemkopier af moden alfa-faktor. Her beskrives sekvensen og postuleres en reaktionsmekanisme. Kurjan og Hersko-25 witz, Abstracts of Papers, fremlagt i 1981 ved et møde i Cold Spring Harbor om The Molecular Biology of Yeasts, page 242, et sammendrag med titlen "A Putative alfa-Fac-tor Precursor Containing Four Tandem Repeats of Mature alfa-Factor Precursor”, beskriver sekvensen, der koder 30 for alfa-faktoren og en spacer mellem to sådanne sekvenser. Biair et al., Abstracts of Papers, ibid, page 243, i et sammendrag med titlen: "Syntesis and Processing of
Yeast Pheremones: Identifikation and Characterization of Mutants That Produre Altered alfa-Factors", beskriver 35 effekten af forskellige mutanter til produktion af moden alfa-faktor. DNA-sekvensen ifølge opfindelsen har en gær-ledersekvens, proces-signaler til udformning af præ-pro- DK 169952 B1 3 polypeptidet som et modent polypeptid og et gen, som koder for et polypeptid, der er forskelligt fra vildtype-genet knyttet til den nævnte ledersekvens.
5 DNA-sekvensen ifølge opfindelsen omfatter et gen, der koder for et protein, som er fremmed for gær, og den er ejendommelig ved, at proteinets aminosyresekvens omfatter i det mindste et alfa-faktor-leder-sekvens-fragment, der muliggør sekretion, og som er knyttet til et heterologt 10 polypeptid, hvilket protein også indeholder proces-signaler, der genkendes af gæren, placeret mellem alfa-faktor-leder-sekvens-fragmentet og det heterologe polypeptid, til omdannelse af proteinet til det heterologe polypeptid.
15
Det episomale udtrykkelseselement ifølge opfindelsen er kendetegnet ved, at det omfatter en DNA-sekvens, der indeholder et gen, som koder for et mammalt protein, fortrinsvis human epidermal vækst-faktor.
20 Værtscellen ifølge opfindelsen er transformeret med en DNA-sekvens af den omhandlede art.
DNA-strukturen ifølge opfindelsen har en sammensætning, 25 som illustreres af tegningen, hvor fig. 1 viser DNA-strukturen pYeEGF-21, fig. 2 viser sekvenserne efter fusion af hEGF til vekto-30 ren, idet a til e viser sekvenserne ved den N-terminale region af hEGF, som afviger fra flere strukturer, og f viser den C-terminale region af hEGF.
Ved fremgangsmåden ifølge den foreliggende opfindelse, 35 der er ejendommelig ved det i krav 12-23 anførte, anvendes gær til produktion af modne polypeptider, hvor sådanne polypeptider kan indhøstes fra et næringsmedium.
DK 169952 B1 4
Polypeptiderne produceres ved anvendelse af en DNA-sekvens , der koder for en gærledersekvens og proces-signaler, knyttet til et ønsket polypeptid, som kan være et * enkelt polypeptid eller flere polypeptider adskilt ved 5 proces-signaler. Strukturen koder for et præ-pro-polypep-tid, som vil indeholde signalerne for udskillelse af præ-pro-polypeptidet, og produktion af polypeptidet, enten intracellulært eller extracellulært for det modne polypeptid.
10
En DNA-struktur, som udtrykker et ønsket polypeptid, omfatter i det mindste en delsekvens med følgende formel: L-((R)r-(CAXYCX)n-Gen*) 15 hvor L er en ledersekvens, der sikrer udskillelsen af po-lypeptidet, R er CGX eller AZZ, kodonerne, som koder for lysin og arginin, idet R betegner ens eller forskellige grupper; 20 r er 2, 3 eller 4, fortrinsvis 2 eller 4; X er et vilkårligt af de fire nucleotider, T, G, C, eller A; Y er G eller C; y er et helt tal fra 1 til 10, sædvanligvis højst 4, til 25 opnåelse af monomere og multimere; Z er A eller G? og *
Gen er et gen forskelligt fra alfa-faktoren, sædvanligvis fremmed for gær-organismen og sædvanligvis et heterologt gen, hensigtsmæssigt et plante- eller animalsk gen; 30 n er 0, 1, 2, 3 eller 4, sædvanligvis 2 eller 3.
*
Pro-polypeptidet har et N-terminalt proces-signal for peptidase-fjernelse af de aminosyrer, som går forud for * aminosyrerne, som koder for Gene .
35
For størstedelens vedkommende vil den omhandlede DNA-sekvens have i det mindste følgende formel: DK 169952 B1 5 L-(R-S-(GAXYCX)n)-Gene*) som koder for et præ-pro-polypeptid, hvor alle symbolerne med undtagelse af L og S har den ovenfor angivne betyd-5 ning, S har samme betydning som R, der kan være et R og et S, og L er en ledersekvens, der sikrer udskillelse af præ-pro-polypeptid. Selvom der kan være flere R og S, således som det fremgår af det efterfølgende, vil der sædvanligvis ikke være fordele ved de yderligere aminosyrer.
10 Der kan anvendes en vilkårlig ledersekvens, som forårsager udskillelse, idet ledersekvenserne generelt indeholder 30-120 aminosyrer, sædvanligvis 30-100 aminosyrer, har en hydrofob region og har en methionin ved N-termi- nus.
15
Hvis n er 0, vil DNA-strukturen have følgende formel: L-((R)r,-Gene*)y 20 som definerer et præ-pro-polypeptid, hvori alle symbolerne har den ovenfor definerede betydning med undtagelse af r', der er 2 til 4, fortrinsvis 2 eller 4.
Af særlig interesse er ledersekvensen af alfa-faktor, som 25 er beskrevet i den ovenfor omtalte reference af Kurjan og Herskowitz, side 937, eller analoge fragmenter deraf, som sikrer effektiv udskillelse af de ønskede polypeptider.
Den i artiklen omtalte DNA-sekvens er ikke væsentlig, idet enhver sekvens, som koder for det ønskede oligopep-30 tid, er tilstrækkelig. Forskellige sekvenser vil være mere eller mindre effektivt gengivet.
Selv om ovennævnte formler foretrækkes, vil det forstås, at der i forbindelse med suppressor-mutanter kan forekom-35 me andre sekvenser, som resulterer i den ønskede funktion. Normalt er suppressor-mutanter ikke så effektive til udtrykkelse, og derfor foretrækkes den ovenfor angiv- DK 169952 B1 6 ne sekvens eller en ækvivalent sekvens, der koder for samme aminosyresekvens. I den udstrækning, at en mutant vil komme fra et andet kodon, udtrykke samme aminosyre, som er udtrykt ved ovennævnte sekvens, er en sådan alter-5 nativ sekvens tilladelig.
Dipeptidet, som indkodes ved hjælp af sekvensen i paran-tesen, vil være en sur aminosyre, såsom aspartinsyre eller glutaminsyre, fortrinsvis glutaminsyre, efterfulgt af 10 en neutral aminosyre, såsom alanin eller prolin, især alanin.
Velegnede DNA-sekvenser, der kan benyttes som kassetter for udtrykkelse, kan hensigtsmæssigt have følgende for-15 mel:
Tr-L((R-S)r„-(GAXYCX)n,-W-(Gene1)d) ) hvor: 20
Tr angiver en DNA-sekvens, der koder for transskriptio-nelle reguleringssignaler, især promotorer og sådanne andre reguleringssignaler som operatører, aktivatorer, stopsignaler, signaler til forøgelse af den ribosomale 25 binding, eller andre signaler der har en transskriptionel eller translationel kontrol at gøre. Tr-sekvensen vil generelt være på mindst 100 bp og ikke over 2000 bp. Særlig velegnede er anvendelsen af Tr-sekvensen, knyttet til ledersekvensen L, således at et DNA-fragment kan anven-30 des, som inkluderer transskriptionelle og translationelle 1 signalsekvenser, knyttet til ledersekvensen endogent med værten. I stedet kan der anvendes andre transskriptionelle og translationelle signaler til at fremkalde forbedret produktion af udtrykkelses-produktet? 35 d er 0 eller 1, og er 1 hvis y er større end 1; DK 169952 B1 7 n' er et helt tal, sædvanligvis 0-3 fortrinsvis 0, 2 eller 3; r" er 1 eller 2; 5 W angiver en terminal deoxyribosyl-3'-gruppe eller en DNA-sekvens, som alene eller når n’ eller forskellig fra 0, i kombination med nucleotidet, hvortil det er knyttet, definerer W et restriktionssted, som har enten kohæsiv 10 ende eller afstumpet ende, hvori W kan have fra 0 til 20 nucleotider i den længste kæde; og de resterende symboler har den ovenfor angivne betydning.
15 Af særlig interesse er følgende sekvens
(Tr) -L-(R-S) ,,-(GAXYCS) „GA AGCT
Q Γ XI
hvor alle symbolerne har den ovenfor angivne betydning; 20 a er 0 eller 1 med den betydning, at strukturen har eller ikke har de transskriptionelle og translationelle signaler; 25 den i den punkterede kasse indeholdte nucleotid ikke skal være tilstede, men må kunne tilføres ved tilsætning af et Hindlll spaltet terminus til genskabelse af sekvensen, der koder for et dipeptid; og 30 n" er 0 til 2, hvor mindst et af symbolerne Xs og Ys definerer et nucleotid, således at sekvensen i parantes er forskellig fra sekvensen GAAGCT. 1
Kodningssekvensen for Gene kan sluttes til terminalen T, 35 hvilket medfører, at kodningssekvensen er knyttet til initieringskodonet, og ved produktion vil den første aminosyre være den korrekte aminosyre for det modne polypep- DK 169952 B1 8 tid.
* 3'-Terminus af Gene kan manipuleres meget lettere, og det er derfor ønskeligt at have en struktur, som tillader * 5 indsætningen af Gene i et unikt restriktionssted i sekvensen, som derved vil være indført i rækken med initi-eringskodonet. En sådan sekvens kan symboliseres på følgende måde: 10 (Tr)a-L-(R-S)r„-(GAXYCS)n„-W-(SC)b«Te hvor alle symbolerne har den ovennævnte betydning; SC er stop-kodoner; 15
Te er en termineringssekvens, der er afbalanceret med promotoren Tr og kan omfatte andre signaler, f.eks. poly-adenylering; og 20 b er et helt tal, der generelt vil variere mellem 0 og 4 og sædvanligvis mellem 0 og 3, idet det vil forstås, at *
Gene kan inkludere dets egne stopkodoner.
Typisk for en sekvens med ovennævnte formel er en sådan, 25 hvor W er sekvensen GA og n" er 2.
Særlig hensigtsmæssigt er det, når sekvensen, der koder for terminal dipeptidet, sammen med W definerer en linker eller et forbindelsessted, som muliggør en genskabelse af 30 den terminale sekvens, der definerer dipeptidet af processignalet og koder for de initiale aminosyrer for *
Gene , således at kodonerne er i række med initierings- kodonet af ledersekvensen. Linkeren tilvejebringer en * forskudt eller stump termination, der hensigtsmæssigt de- 35 finerer et restriktionssted i forbindelse med de succes- * sive sekvenser for Gene . Ved ligering af linkeren med jp
Gene , vil kodonerne for Gene sidde i række med initi- DK 169952 B1 9 eringskodonet for ledersekvensen. På denne måde kan kan anvende en syntetisk sekvens, som kan være tilsluttet et restriktionssted i processignalsekvensen til at genskabe processignalet medens der tilvejebringes de initielle ba-* 5 ser af Gene , der koder for de N-terminale aminosyrer.
Ved at anvende en syntetisk sekvens kan den syntetiske linker være specielt udformet til at have et passende restriktionssted nær ved 3'-terminus, og den syntetiske linker vil således tilvejebringe de nødvendige kodoner 10 for 5'-terminus af genet.
I stedet kunne man indføre et restriktions-endonuclease genkendelsessted i medstrøm efter processignalet for at tillade spaltning og fjernelse af overflødige baser og k 15 muliggøre ligering af Gene til processignalet i rækkefølge med initieringskodonet. Således vil det første kodon kode for den N-terminale aminosyre af polypeptid.
*
Hvor T er den første base i Gene , kan man introducere et restriktionssted, hvor genkendelsessekvensen er indført i 20 rækken fra spaltningsstedet. F.eks. kunne en Sau3A-gen-kendelsessekvens indføres umiddelbart efter processignalet, hvilket ville muliggøre spaltning og sammenknytning * af Gene med dets initielle kodon i rækkefølge med leder-begyndelseskodonet.
25
Med restriktions-endonucleaser, som har genkendelsessekvenser fjernet fra og i række fra spaltningsstedet, f.eks. Hgal, kunne W definere en sådan sekvens, der kunne omfatte en del af processignal-sekvenserne. Andre struk-30 turer kan også anvendes, såsom primer-reparation og in vitro mutagenese for at tilvejebringe en hensigtsmæssig k indsætning af Gene i strukturen ved indføring af et passende restriktionssted.
35 Strukturen omfatter en flyttersekvens for indsætning i vektorer, hvilket tilvejebringer det ønskede replika-tionssystem. Som ovenfor angivet kan det i nogle tilfælde DK 169952 B1 10 være ønskeligt at erstatte vild-type promotoren, som er associeret med ledersekvensen, men en anden promotor. I gær kan de med enzymer involverede promotorer i den gly-colytiske bane tilvejebringe høj grad af transskription.
5 Disse promotorer er benyttet til sådanne enzymer som phosphoglucoisomerase, phosphofructokinase, phosphotri-ose-isomerase, phosphoglucomotase, enolase, pyrudruesyre-kinase, glycerylaldehyd-3-phosphat-dehydrogenase og alko-hol-dehydrogenase. Disse promotorer kan indsættes i ræk-10 ken opefter fra ledersekvensen. Vektorer kan fremstilles og kan omfatte promotorer med hensigtsmæssige restriktionssteder i række nedefter fra promotoren for indsætning af sådanne sekvenser som ovenfor beskrevet.
15 Den endelig struktur vil være et plasmid, der kan opretholdes stabilt i en vært, især en svamp, såsom gær. Strukturen vil omfatte et eller flere replikationssyste-mer, hensigtsmæssigt to replikationssystemer, der muliggør opretholdelse i en udtrykkelses-vært og klonen i en 20 prokaryot. Desuden vil en eller flere markeringer for udvælgelse være omfattet, hvilket vil muliggøre selektivt tryk for at opretholde plasmidet i værten. Endvidere kan plasmidet være til stede i et højt eller lavt reproduktionsantal, generelt i området 1 til 200. Med plasmider 25 med højt reproduktionsantal vil der generelt være mindst 10, fortrinsvis mindst 20, men sædvanligvis ikke over
150, mere sædvanlig ikke over 100 reproduktionsantal. I
* afhængighed af Gene kan enten høje eller lave reproduktionsantal være ønskelige, afhængigt af virkningen af 30 plasmidet i værten. Hvis tilstedeværelsen af udtrykkel- * sesproduktet af plasmidet kan have en skadelig effekt på værtens levedygtighed, kan et lavere reproduktionsantal være indiceret. * 35 Der kan anvendes forskellige værter, især mutanter med ønskede egenskaber. Det vil forstås, at der i afhængighed af produktionshastigheden for udtrykkelsesproduktet af DK 169952 B1 11 strukturen kan være procesenzymer, der har eller ikke har et passende produktionsniveau. Derfor kan der forekomme en mutant med forøget produktion af procesenzymet, eller forøget produktion af enzymet kan tilvejebringes ved 5 hjælp af episomal element. Generelt kan produktionen af enzymet være af en lavere grad end produktionen af det ønskede udtrykkelsesprodukt.
Hvis man anvender alfa-faktoren for udskillelse og pro-10 duktion, vil det være hensigtsmæssigt at sikre forbedret produktion af procesenzymet dipeptidyl-aminopeptidase A, der viser sig at være udtrykkelsesproduktet af STE13. Dette enzym synes at være specifikt for X-ala- og X-pro-sekvenser, hvor X i dette tilfælde forestiller en amino-15 syre, især dicarboxylsyre-aminosyre.
I stedet kan det forekomme, at intracellulær produktion ikke er ønsket. I så tilfælde vil det være nyttigt at benytte en stel3 mutant, hvor sekretion forekommer, uden at 20 produktet spaltes fra. På denne måde kan produktet i stedet produceres in vitro.
Det er hensigtsmæssigt at anvende værts-mutanter, som gør det muligt at kontrollere udtrykkeisen. F.eks. vil de om-25 handlede sekvenser, hvor et modent protein udtrykkes, have transformanter med langsom vækst, hvilket formentlig skyldes det modne proteins giftighed. Ved at inhibere udtrykkeisen under væksten kan værten således dyrkes til opnåelse af høj tæthed, før man ændrer betingelserne, så 30 udtrykkelse opnås.
En temperaturfølsom SIR mutant kan anvendes til at regulere udtrykkeisen. Mutation i enhver af SIR generne resulterer i en ikke-parret phenotype som følge af udtryk-35 kelsen in situ af de normalt hvilende MATa og MATa sekvenser, der er tilstede ved lokaliteterne HML og HMR.
DK 169952 B1 12 •k
Som allerede angivet vil Gene yderligere have en række sekvenser i tandem, enten ens eller forskellige sekvenser, med indgribende processignaler. På denne måde kan produktet dannet helt eller delvis med det resultat, at 5 der opnås forskellige sekvenser enten af sig selv eller i tandem for efterfølgende proces. 1 mange tilfælde kan det være ønskeligt at benytte forskellige sekvenser, hvor hver af sekvenserne er en underenhed af et særligt proteinprodukt .
10 *
Gene kan kode for ethvert ønsket polypeptid. Polypepti-det kan være så lille som et oligopeptid med 8 aminosyrer eller kan være på 100.000 daltons eller højere. Sædvanligvis vil enkelte kæder være mindre end ca. 300.000 dal-15 tons, mere sædvanligt mindre end 150.000 daltons. Af særlige betydning er polypeptider med 5000 til 150.000 daltons, især mellem 5000 og 100.000 daltons. Typiske polypeptider, som har kommerciel betydning, er hormoner og faktorer såsom væskthormon, somatomediner epidermal 20 vækstfaktor, de endocrine sekretioner, såsom luteinise-ringshormoner, thyroid-stimuleringshormoner, oxytocin, insulin, vasopressin, renin, calcitonin, follicle stimuleringshormoner, prolactin etc.; hematopoietiske faktorer, f.eks. erythropoietin, colon-stimuleringsfaktorer, 25 etc.; lymfokiner; globiner; globuliner, f.eks. immunoglo-buliner; albuminer; interferoner, såsom α", Æ" og r; re-pressorer; enzymer, endorfiner, f.eks. Ø-endorfine, enke-falin, dynorphin etc.
30 Når der er fremstillet plasmider indeholdende DNA-sekven-sen ifølge opfindelsen, kan man derefter indføre et sådant plasmid i en egnet vært. Den måde, hvorpå indførelsen sker, er konventionel, idet der er vidt forskellige måder at indføre DNA på in vært. F.eks. kan fremstilles 35 spheroplaster under anvendelse af metoder beskrevet af Hinnen et al., PNAS USA (1978) 75:-1919-1933 eller Stinch-comb et al., EP 0 045 573 A2. Transformanterne kan DK 169952 B1 13 derefter dyrkes i et passende næringsmedium, og det kan være hensigtsmæssigt at opretholde selektivt tryk på transformanterne. Hvis udtrykkeisen er inducibel, kan væksten af gæren foregå til høj tæthed, hvorefter udtryk-5 kelsen induceres. I sådanne tilfælde, hvor en væsentlig mængde af produktet kan opretholdes i de periplasmiske områder, kan produktet frigives ved behandling af gærcellerne med et enzym, såsom zymolase eller lyticase.
10 Produktet kan indhøstes på i og for sig kendt måde, idet proteinet renses ved kromatografi, elektroforese, dialyse, opløsningsmiddelekstraktion etc.
Ifølge den foreliggende opfindelse kan der tilvejebringes 15 sekretion af vidt forskellige polypeptider, således at der kan opnås et forbedret produktudbytte, forenklet rensning, minimal nedbrydning af det ønskede produkt og forenklet produktion, udstyr og teknisk udformning. Endvidere kan udnyttelsen af næringsmidler baseret på pro-20 duktivitet forbedres stærkt, således at mere økonomisk og effektiv produktion af polypeptider kan opnås. Endvidere har anvendelsen af gær mange fordele med hensyn til at undgå enterotoxiner, der kan forekomme i forbindelse med prokaryoter, og anvendelse af kendt teknik, som har været 25 udviklet for gær gennem lange tider, herunder metoder til isolation af gærprodukter.
Opfindelsen skal i det efterfølgende illustreres nærmere ved hjælp af nogle eksempler.
30
Eksperimentelle eksempler
Der fremstilles en syntetisk sekvens af human epidermal vækstfaktor (EGF), baseret på den aminosyresekvens, som 35 er rapporteret af H. Gregory og B.M. Preston Ing. J. Peptide Protein Res. 9, 107-118 (1977), og som har følgende sekvens: DK 169952 B1 14
51 AACTCCGACTCCGAATGTCCATTGTCCCACGACGGTTACTGTTTGCACGACGGTGTTTGT 3' TTGAGGCTGAGGCTTACAGGTAACAGGGTGCTGCCAATGACAAACGTGCTGCCACAAACA
Γ
ATGTACATCGAAGCTTTGGACAAGTACGCTTGTAACTGTGTTGTT'GGTTACATCGGTGAA 5 TACATGTAGCTTCGAAACCTGTTCATGCGAACATTGACACAACAACCAATGTAGCCACTT
*
AGATGTCAATACAGAGACTTGAAGTGGTGGGAATTGAGATGA
TCTACAGTTATGTCTCTGAACTTCACCACCCTTAACTCTACT, 10 hvor 5' angiver den promotor-tilgrænsende ende af sekven sen. Sekvensen var indsat i EcoRI-sædet på pBR328 til at producere et plasmid p328EGF-l og klonet.
Tilnærmelsesvis 30 ug af p328EGF-l blev omsat med EcoRI, 15 og tilnærmelsesvis 1 ug af det forventede 190 basepar
EcoRI-fragment blev isoleret. Dette blev efterfulgt af omsætning med restriktionsenzymet Hgal.
To syntetiske oligonucleotid-forbindelsesled Hindlll-Hgal 20 og Hgal-Sall blev derpå ligeret til 159 base-par Hgal fragment. Hgal-HindiII leddet havde følgende sekvens:
AGCTGAAGCT
CTTCGATTGAG
25
Denne linker genskaber alfa-faktor-processignaler, afbrudt af HindiII-digestion og forbinder Hgal-enden ved 5'-enden af EGF-genet til Hindlll-enden af pAB112.
30 Hgal-Sall linkeren havde følgende sekvens:
TGAGATGATAAG
ACTATTCAGCT
35 Denne linker har to stop-kodoner og forbinder Hgal-enden ved 3'-enden af EGF-genet til Sall-enden af pAB112.
DK 169952 B1 15
Det dannede 181 basepar-fragment rensedes ved præparativ gel-elektroforese og ligeres til 100 ng pAB112, som forud var helt omsat med enzymerne HindiII og Sall. Overraskende forekom en deletion, hvor kodonet for de 3. og 4. ami-5 nosyrer af EGF, asp og ser, var udeladt, idet resten af EGF opretholdtes.
pAB112 er et plasmid indeholdende et 1,75 kb EcoRI fragment med gær-alfa-faktor genet klonet ved EcoRl-sædet af 10 pBR322, hvori Hindlll- og Sall-stederne er udeladt (pABll). pAB112 afledtes fra plasmid ρΑΒΙΟΙ, som indeholder gær-alfa-faktorgenet som et partialt Sau3A-fragment klonet ved BamHi-sædet af plasmid YEp24, ρΑΒΙΟΙ opnåedes ved screening af en gær-genomisk database i YEp24 med en 15 syntetisk 20-mer oligonucleotid-prøve (3'-GGCCGGTTGGTTACATGATT-5')-homolog til den kendte alfa-faktor kodningsregion (Kurjan og Herskowitz, Abstracts 1981 Cold Spring Harbor meeting on the Mole cular Biology of Yeasts page 242).
20
Den resulterende blanding blev anvendt til at transformere E. coli HB101 cellerne og plasmid pAB201 blev opnået. Plasmidet pAB201 (5 ug) blev omsat helt med enzymet EcoRI, og de dannede fragmenter blev: 25 a) fyldt op med DNA-polymerase i Klenow-fragment, b) ligeret til et overskud af BamHI-forbindelser, og 30 c) omsat med BamHi. 1,75 kbp EcoRI-fragment blev isoleret ved præparativ gel-elektroforese og ca. 100 ng af fragmentet blev ligeret til 100 ng pCl/1, som forud var omsat helt med restriktionsenzymet BamHi og behandlet med alkaliphosphatase.
Plasmid pCL/1 er et derivat af pJDB219, Breggs, Nature (1978) 275:194, hvori regionet svarende til bakteriel 35 DK 169952 B1 16 plasmid pMB9 i pJDB219 er erstattet af pBR322 i pCl/1.
Denne blanding blev anvendt til at transformere E. coli HB191 celler. Transformanter blev udvalgt som ampicillin-resistente, og deres plasmider analyseredes ved restrik-5 tionsendonuclease. DNA fra en udvalgt klon (pYEGF-8) blev * fremstillet og anvendt til at transformere gær AB103 celler. Transformanter blev udvalgt efter deres leu+ phenotype.
10 50 ml kulturer af gærstammen AB103 (a, pep 4-3, leu 2-3, leu 2-112, ura 3-52, his 4-580) transformeret med plasmid pYEGF-8 blev dyrket ved 30 °C i et leu-medium til mætning (optisk densitet ved 600 nm på 5) og underkastet rystning ved 30 °C i yderligere 12 timer. Celle-supernatanter blev 15 opsamlet ved centrifugering og analyseret på nærværelse af human EGF under anvendelse af fibroblast-receptor-kom-petetionsbindingsprøven. Prøven for EGF er baseret på evnen til for både muse- og humant EGF at konkurrere med 125 I-mærkede muse EGF for bindingssteder på human for- 20 huds-fibroblaster. Standardkurver kan opnås ved måling af effekterne for stigende kvantiteter af EGF på binding af 125 en standardmængde af I-mærkede muse EGF. Under disse betingelser er 2 til 20 ng EGF let målelig. Detaljer om 125 binding af I-mærkede epidermal vækstfaktor for humane 25 fibroblaster er beskrevet af Carpenter et al., J. Biol.
Chem. 250, 4297 (1975). Under anvendelse af denne prøve har det vist sig, at dyrkningsmediet indeholder 7 + 1 mg humant EGF pr. liter.
30 Til yderligere karakterisation blev humant EGF i superna-tanten renset ved adsorption til en ion-bytterharpiks Biorex-70 og elueret med 10 mM HC1 i ethanol. Efter for-dampning af saltsyren og ethanolet blev EGF opløst i vand. Dette materiale migrerer som en enkelt hovedprote-35 infraktion af molekylvægt ca. 6000 i 17,5% SDS-geler, tilnærmelsesvis det samme for autentisk muse EGF (molvægt svarende til 6000). Dette viser, at alfa-faktor-lederse- DK 169952 B1 17 kvensen er passende afskåret under sekretionsprocessen. Analyse ved høj opløselighedsvæskekromatografi (mikrobon-dapak Cl8, Waters kolonne) indiceret, at produktet migre-rer med en retentionstid svarende til autentisk muse EGF-5 standard. En protein-rækkefølge bestemt ved Edman-ned-brydning viste dog, at N-terminus opretholdt glu-ala-se-kvensen.
Et antal andre sekvenser blev fremstillet under anvendel-10 se af forskellige konstruktioner for sammenbinding af hEGF til alfa-faktor-sekretorisk ledersekvens således, at der dannes forskellige processignaler og sted-mutagenese.
I fig. 2a til e. ses sekvensen af fusionen ved en N-ter-minelle region af hEGF, hvilken sekvens afviger for ad-15 skillige strukturer, f. viser sekvenserne ved C-terminal-regionen af hEGF, der er ens for alle strukturerne. Syntetiske oligonucleotid-linkere, der anvendes ved disse strukturer, er indsat i rammer.
20 Disse fusioner blev fremstillet som angivet i det følgende. Struktur (a) blev fremstillet som ovenfor beskrevet. Struktur (b) blev fremstillet på tilsvarende måde med den ændring, at linker 2 blev anvendt i stedet for linker 1. Linker 2 modificerer alfa-faktor-processignalet ved ind-25 sætning af endnu et processted (ser-leu-asp-lys-arg)
umiddelbart forud for hEGF-genet. Det dannede gær-plasmid kaldes pYaEGF-22. Struktur (c), hvori dipeptidyl-amino-peptidase-modningsstedet (glu-ala) er blevet fjernet, blev opnået ved in vitro mutagenese af sekvens (a). Pstl-30 Sall-fragment indeholdende alfa-faktorledersekvens-hEGF
fusion blev klonet i phage M13 og isoleret i en enstrenget form. En syntetisk 31-mer af sekvensen 5'-TCTTTGGATAAAAGAAACTCCGACTCCCG-31 blev syntetiseret, og 70 picomol blev anvendt som primer til syntese af den an-35 den streng fra 1 picomol af ovennævnte formel ved hjælp af Klenow-fragment fra DNA-polymerase. Efter indfyldning og ligering ved 14 °C i 18 timer blev blandingen behand- DK 169952 B1 18 let med S^-nuclease (5 enheder i 15 minutter) og overført til E. coli JM101 celler. Bakteriophag indeholdende DNA-sekvenser, hvori regionen, der koder for (glu-ala), var fjernet, blev placeret ved filterpladehybridisering under 32 4 5 anvendelse af -P-mærkede primer som prøve. RF DNA fra positive plader blev isoleret, omsat med PstI og Sall og det dannede fragment indsat i pAB114, som forud var omsat fuldstændig med Sall og partielt med Pstl og behandlet med alkaliphosphatase.
10
Plasmidet pAB114 blev fremstillet på følgende måde: plasmid pAB112 blev omsat helt med Hindlll og derefter genligeret ved lav (4 ug/ml) DNA-koncentration, og plasmidet pAB113 blev opnået, hvori 63 bp HindIII-fragmenter var 15 udeladt fra alfa-faktor strukturgenet, så der kun blev efterladt en enkelt kopi af moden alfa-faktor kodningsregion. Et BamHl-sæde blev sat til plasmid pABll ved spaltning med EcoRI, idet der blev fyldt op ved de overhængende ender med Klenow-fragment af DNA-polymerase, ligering 20 af BamHI-forbindelsesled, spaltning med BamHI og relige-ring til opnåelse af pAB12. Plasmid pAB113 blev omsat med EcoRI, de overhængende ender blev fyldt op, og der blev ligeret BamHI-linker. Efter omsætning med BamHI blev 1500 bp fragmentet gelrenset og ligeret til pAB12, som var om-25 sat med BamHI og behandlet med alkali-phosphatase. Plasmid pABI14, som indeholder et 1550 bp BamHI-fragment, indeholdende alfa-fraktor-genet, blev opnået. Det dannede plasmid (pAB114 med indhold af den ovennævnte sekvens fremstilles derefter med BamHI og ligeres til plasmid 30 pCl/1.
Det dannede gær-plasmid kaldes pYaEGF-23. Strukturen (d), hvori der var genereret et nyt Knpl-sted, blev fremstillet som beskrevet for sekvensen (c) med den ændring, at 35 den 36-mer oligonucleotid-primer af sekvensen 5'-GGGTACCTTTGGATAAAAGAAACTCCGACTCCGAAT-3' blev brugt.
Det dannede gær-plasmid er kaldt pYaEGF-24. Strukturen DK 169952 B1 19 (e) blev afledt ved omsætning af plasmidet der indeholder sekvens (d) med Kpnl og Sall i stedet for forbindelsesled 1 og 2. Det dannede gær-plasmid er kaldt pYaEGF-25.
5 Gærceller transformeret med pYaEGF-22 blev dyrket i 15 ml kulturer. Ved de angivne densiteter eller tider blev kulturen centrifugeret, og den ovenstående væske blev udvundet og holdt på is. Celleklumperne blev vasket i lysisbuffer (0,1 triton X-100, 10 mM NaHPO^, pH 7,5) og søn-10 derbrudt (5 min. med 1 min. intervaller under mellemliggende afkøling på is) i et rumfang lysis-buffer og et rumfang glaskugler. Efter centrifugering blev supernatan-ten opsamlet og holdt på is. Mængden af hEGF i dyrkningsmediet og celleekstrakterne blev målt under anvendelse af 15 fibroblast-receptorbindings-kompetetionsprøven. Standard kurver blev udarbejdet af målinger af effekterne af stigende mængder af muse EGF på binding af standardmængder 125 -1-mærkede muse EGF.
20 Proteinerne blev udvundet af dyrkningsmediet ved absorp tion på Bio-Rex 70 harpiks og eluering med 0,01 saltsyre i 80% ethanol og renset ved højtryksvæskekromatografi (HPLC) på en omvendt fase Cl8 kolonne. Kolonnen blev elu-eret med en strømningshastighed på 4 ml/min med en lineær 25 gradient på 5% til 80% acetonitril indeholdende 0,2% trifluoreddikesyre i 60 min. Proteiner (200-800 picomol) blev afskåret ved amino-terminal-enden ved Edman nedbrydningsmetoden under anvendelse af gas-fase protein-sequencer Applied Biosystems model 470A. Det normale PROTFA-30 program blev anvendt ved alle analyser. Dithiothreitol sattes til S2 (ethylacetat: 20 mg/liter) og S3 (butyl-chlorid: 10 ml/liter) umiddelbart før anvendelsen. Alle prøver blev behandlet med IN HC1 i methanol ved 40 °C i 15 min. til omdannelse af PTH-aspartinsyre og PTH-glut-35 aminsyre til deres methylestere. Alle PTH-aminosyre-iden-tifikationerne blev udført ved reference til retentionstider på en IBM CN HPCL-kolonne under anvendelse af kend- DK 169952 B1 20 te blandinger af PTH-aminosyre som standard.
Sekretion fra pYaEGF-22 gav et 4:1 molforhold af nativ N- c terminus hEGF til glu-ala-termineret hEGF, medens sekre-5 tion fra pYaEGF-23-25 kun gav nativt N-termineret hEGF. f.
Udbytter af hEGF varierede fra 5 til 8 ul/ml, målt enten som protein eller ved en receptor-bindingsprøve.
Stammen JRY188 (MAT sir3-8 leu2-3 leu2-112 trpl ura3 his4 10 rme) blev transformeret med pYaEGF-21 og leucin-prototro-fer udvalgt ved 37 °C. Mættede kulturer blev derefter fortyndet 1/100 i frisk medium og dyrket i leucin-selek-tivt medium ved tolerante (24 °C) og ikke-tolerante (36 °C) temperaturer og kultur-supernatanten blev prøvet for 15 tilstedeværelse af hEGF som ovenfor beskrevet. Resultaterne fremgår af efterfølgende tabel:
Reguleret syntese og sekretion af hEGF i transformert gær sir2 temperatur-sensitive mutanter 20 -
Temperatur Transformant O.D.650 hEGF ^g/ml) 36 °C 3a 3,5 0,010 5.4 0,026 25 3b 3,6 0,020 6.4 0,024 24 °C 3a 0,4 34 1.3 145 30 2,1 1075 4,0 3250 3b 0,4 32 1.4 210 2 2,2 1935 35 4,2 4600 21 DK 169952 B1
Disse resultater viser, at hybrid-alfa-faktor/EGF-genet udtrykkes under par-type-regulering selv om det er tilstede i form af et stort antal kopier i plasmidet.
5 Det er muligt at fremstille hidtil ukendte DNA-sekvenser, som kan indsættes i vektorer til opnåelse af udtrykkelse af polypeptider, der har en N-terminalledersekvens og et eller flere processignaler til at sikre sekretion af po-lypeptidet samt til at producere et modent polypeptidpro-10 dukt, der er fri for overflødig aminosyre. Således kan man gå et polypeptid med en identisk sekvens sammenlignet med naturligt forekommende polypeptid. Da polypeptidet desuden kan produceres i gær, kan der indføres glycogrup-per, således at produkterne kan fås identiske med natur-15 ligt forekommende produkter. Da produkterne er udskilte, kan der endvidere opnås væsentlig forbedrede udbytter baseret på celleformering, og fremstillingen og rensningen er stærkt forenklet.
20 25 30 35
Claims (24)
1. DNA-sekvens til indsætning i gærceller, hvilken DNA-5 sekvens omfatter et gen, der koder for et protein, som er * fremmed for gær, kendetegnet ved, at proteinets aminosyresekvens omfatter i det mindste et alfa-fak-tor-leder-sekvens-fragment, der muliggør sekretion, og som er knyttet til et heterologt polypeptid, hvilket pro-10 tein også indeholder proces-signaler, der genkendes af gæren, placeret mellem alfa-faktor-leder-sekvens-fragmen-tet og det heterologe polypeptid, til omdannelse af proteinet til det heterologe polypeptid.
2. DNA-sekvens ifølge krav 1, kendetegnet ved, at den yderligere indeholder en gær-promotor ved 5'-enden.
3. DNA-sekvens ifølge krav 1 eller 2, k en deteg-20 net ved, at det heterologe polypeptid er et mammalt protein.
4. DNA-sekvens ifølge ethvert af kravene 1-3, kendetegnet ved, at den har formlen: 25 •k 5'-Tr-L-Sp-Gene -Te-3' hvor Tr er en gær-promotor-sekvens, L koder for i det mindste et alfa-faktor-leder-sekvens-fragment, der mulig-30 gør sekretion fra gær, Sp er en spacer-sekvens, der koder for processignaler, der genkendes af gær, til omdannelse af precursor-polypeptidet, som er udkodet af L-Sp-Gene , «fe til dannelse af polypeptidet, som er udkodet af Gene , 9 * idet Gene koder for et for gær fremmed polypeptid, og Te 35 er en transskriptions-termineringssekvens, såsom et transskriptionelt termineringssignal, der er afbalanceret med Tr. DK 169952 B1
5. DNA-sekvens ifølge krav 4, kendetegnet ved, at Tr udgør en gær-alfa-faktor-promotor-sekvens.
6. DNA-sekvens ifølge krav 4 eller 5,ke nd eteg-5 net ved, at Sp indeholder sekvensen 5,-R1-R2-3' direkte knyttet til sekvensen Gene , R^ er et kodon for lysin eller arginin, R2 er et kodon for arginin, men koder ikke for et processignal for dipeptidylaminopeptidase A.
7. DNA-sekvens ifølge krav 6, kendetegnet ved, at Sp er 5'-R^-R2-3', hvor R^ og R2 har den i krav 6 angivne betydning.
8. DNA-sekvens ifølge krav 4, 5 eller 6, k e n d e - * 15 tegnet ved, at Gene koder for et mammalt protein, fortrinsvis humman epidermal vækst-faktor.
9. Episomalt udtrykkelseselement, kendetegnet ved, at det omfatter en DNA-sekvens som angivet i krav 8 20 og et replikationssystem, som tilvejebringer stabil opretholdelse i en gær-vært.
10. Plasmid ifølge krav 9, kendetegnet ved, at det består af pYEGF8, ATCC nr. 20658. 25
11. Plasmid ifølge krav 9, kendetegnet ved, at det består af pYaEGF23, ATCC nr. 40079.
12. Fremgangsmåde til fremstilling af et rekombinant po-30 lypeptid, kendetegnet ved, at man tilvejebringer en gærvært, der er transformeret med en DNA-sekvens, som koder for et protein, der er fremmed for gær, hvilken protein omfatter i det mindste et alfa-faktor-leder-se-kvens-fragment, der muliggør sekretion og er knyttet til 35 et heterologt polypeptid, hvilket protein også indeholder processignaler, der genkendes af gæren, mellem alfa-faktor- leder- sekvens -fragmentet og det heterologe polypeptid DK 169952 B1 til omdannelse af proteinet til det heterologe polypeptid, at den nævnte transformerede gærvært dyrkes i et dyrkningsmedium under betingelser, hvor proteinet, der er fremmed for gær, udtrykkes i væsentlig grad og omdannes 5 til det nævnte heterologe polypeptid, som derpå udvindes i af dyrkningsmediet.
13. Fremgangsmåde til fremstilling af et rekombinant po-lypeptid ifølge krav 12 i en gærkultur under udskillelse 10 af polypeptidet i dyrkningsmediet, kendetegnet ved, at man dyrker en gærkultur, i hvis celler der er indført plasmider omfattende en DNA-sekvens som angivet i krav 4, under betingelser, hvor precursor-polypeptidet, som DNA-sekvensen koder for, udtrykkes i væsentlig grad 15 og udskilles i dyrkningsmediet, hvorpå det dannede heterologe polypeptid udvindes.
14. Fremgangsmåde ifølge krav 13, kendetegnet ved, at Tr i den i krav 4 anførte formel er en gær-alfa- 20 faktor-promotor-sekvens.
15. Fremgangsmåde ifølge krav 13 eller 14, kendetegnet ved, at plasmidet indeholder den i krav 6 anførte DNA-sekvens. 25
16. Fremgangsmåde ifølge krav 13 eller 14, kendetegnet ved, at plasmidet indeholder den i krav 7 anførte DNA-sekvens.
17. Fremgangsmåde ifølge ethvert af kravene 13-16, * kendetegnet ved, at Gene koder for et mammalt polypeptid, fortrinsvis en epidermal vækstfaktor. ^
18. Fremgangsmåde ifølge ethvert af kravene 13-16, 35 kendetegnet ved, at gæren er en AB103-stamme, ATCC 20658. DK 169952 B1
19. Fremgangsmåde ifølge krav 12, kendetegnet ved, at det heterologe polypeptid er et mammalt protein.
20. Fremgangsmåde ifølge krav 12, kendetegnet 5 ved, at gær-alfa-faktoren er en saccharomyces alfa-faktor.
21. Fremgangsmåde ifølge krav 12, kendetegnet ved, at det heterologe polypeptid transformeres intracel- 10 lulært eller extracellulært til dannelse af et modent po-lypeptid, såsom væksthormon, somatomedin, epidermal vækstfaktor, insulin, renin, calcidonin, albumin eller interferon.
22. Fremgangsmåde ifølge ethvert af kravene 13, 15 eller Jc 17, kendetegnet ved, at det af Gene kodede polypeptid transformeres intracellulært eller extracellu-lært til dannelse af et modent polypeptid, såsom væksthormon, somatomedin, epidermal vækstfaktor, insulin, 20 renin, calcidonin, albumin eller interferon.
23. Fremgangsmåde ifølge ethvert af kravene 12-22, kendetegnet ved, at gæren er en AB103-stamme, ATCC 20658.
24. Værtcelle, transformeret med en DNA-sekvens ifølge ethvert af kravene 1, 4, 6 eller 7. 30 35
Applications Claiming Priority (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US45732583A | 1983-01-12 | 1983-01-12 | |
| US45732583 | 1983-01-12 | ||
| US52290983A | 1983-08-12 | 1983-08-12 | |
| US52290983 | 1983-08-12 |
Publications (3)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| DK577883D0 DK577883D0 (da) | 1983-12-15 |
| DK577883A DK577883A (da) | 1984-07-13 |
| DK169952B1 true DK169952B1 (da) | 1995-04-10 |
Family
ID=27038554
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| DK577883A DK169952B1 (da) | 1983-01-12 | 1983-12-15 | DNA-sekvens, epidermalt udtrykkelsesmiddel, fremgangsmåde til fremstilling af et rekombinant polypeptid, plasmid og værtscelle, som er transformeret med DNA-sekvensen |
Country Status (5)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0116201B1 (da) |
| JP (2) | JPH0779699B2 (da) |
| CA (1) | CA1341297C (da) |
| DE (1) | DE3382547D1 (da) |
| DK (1) | DK169952B1 (da) |
Families Citing this family (62)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4943529A (en) | 1982-05-19 | 1990-07-24 | Gist-Brocades Nv | Kluyveromyces as a host strain |
| JPS60501140A (ja) * | 1983-04-22 | 1985-07-25 | アムジエン | 酵母による外因性ポリペプチドの分泌 |
| NZ207926A (en) * | 1983-04-25 | 1988-04-29 | Genentech Inc | Use of yeast #a#-factor to assist in expression of proteins heterologus to yeast |
| ATE95236T1 (de) | 1983-04-25 | 1993-10-15 | Chiron Corp | Hybrid-dns-synthesis von reifen insulinaehnlichen wachstumsfaktoren. |
| US7198919B1 (en) | 1983-04-25 | 2007-04-03 | Genentech, Inc. | Use of alpha factor sequences in yeast expression systems |
| IL71991A (en) | 1983-06-06 | 1994-05-30 | Genentech Inc | Preparation of human FGI and FGE in their processed form through recombinant AND tranology in prokaryotes |
| US5639639A (en) * | 1983-11-02 | 1997-06-17 | Genzyme Corporation | Recombinant heterodimeric human fertility hormones, and methods, cells, vectors and DNA for the production thereof |
| JPS61502795A (ja) * | 1984-07-09 | 1986-12-04 | レモント，ジェフリ−・エフ | 酵母クロ−ニング ビ−クル |
| JPS61502655A (ja) * | 1984-07-09 | 1986-11-20 | インテグレ−テッド・ジェネティックス・インコ−ポレ−テッド | 酵母クロ−ニングビヒクル |
| DE3587205T2 (de) * | 1984-07-30 | 1993-08-26 | Wakunaga Seiyaku Kk | Verfahren zur herstellung eines proteins und dafuer zu verwendender vektor, rekombinante dns und transformierte zelle. |
| JPS61503002A (ja) * | 1984-07-31 | 1986-12-25 | アプライド・リサーチ・システムズ・エイアールエス・ホールディング・ナムローゼ・フェンノートシャップ | 酵母クロ−ニングベクタ− |
| WO1986001515A1 (en) * | 1984-08-29 | 1986-03-13 | Chiron Corporation | Expression of human connective tissue activator and related peptides |
| EP0487116B1 (en) * | 1984-10-12 | 1999-12-29 | ZymoGenetics, Inc. | Biologically active PDGF analogs in eucaryotic cells |
| US5498600A (en) * | 1984-10-12 | 1996-03-12 | Zymogenetics, Inc. | Biologically active mosaic proteins |
| US5187263A (en) * | 1984-10-12 | 1993-02-16 | Zymogenetics, Inc. | Expression of biologically active PDGE analogs in eucaryotic cells |
| EP0200757B1 (en) * | 1984-10-19 | 1992-03-11 | Chiron Corporation | Promotion of wound healing with human epidermal growth factor prepared from recombinant dna |
| AU588819B2 (en) * | 1984-10-29 | 1989-09-28 | Immunex Corporation | Cloning of human granulocyte-macrophage colony stimulating factor gene |
| CA1341482C (en) | 1984-10-31 | 2005-05-10 | Paul A. Luciw | Process for preparing fragments of aids-associated retroviruses |
| US7273695B1 (en) | 1984-10-31 | 2007-09-25 | Novartis Vaccines And Diagnostics, Inc. | HIV immunoassays using synthetic envelope polypeptides |
| US7285271B1 (en) | 1984-10-31 | 2007-10-23 | Novartis Vaccines And Diagnostics, Inc. | Antigenic composition comprising an HIV gag or env polypeptide |
| US5045633A (en) * | 1985-02-25 | 1991-09-03 | Zymogenetics, Inc. | Expression of biologically active PDGF analogs in eucaryotic cells |
| DE3515336C2 (de) * | 1985-04-27 | 1994-01-20 | Boehringer Ingelheim Int | Verfahren zur Herstellung und Reinigung von â-Interferon |
| FR2593518B1 (fr) * | 1985-05-02 | 1989-09-08 | Transgene Sa | Vecteurs d'expression et de secretion de l'hirudine par les levures transformees |
| US5821079A (en) * | 1985-05-02 | 1998-10-13 | Transgene S.A. | Vectors for the expression and secretion of hirudin by transformed yeasts |
| IL78775A (en) * | 1985-05-15 | 1992-06-21 | Biotech Australia Pty Ltd | Oral vaccines |
| JPS61271988A (ja) * | 1985-05-27 | 1986-12-02 | Agency Of Ind Science & Technol | プラスミド |
| AU5912586A (en) * | 1985-06-20 | 1986-12-24 | Salk Institute Biotechnology/Industrial Associates, Inc., The | Alpha-factor leader peptide-facilitated secretion from transformed s cerevisiae |
| GB8529014D0 (en) * | 1985-11-25 | 1986-01-02 | Biogen Nv | Enhanced secretion of heterologous proteins |
| US5024941A (en) * | 1985-12-18 | 1991-06-18 | Biotechnica International, Inc. | Expression and secretion vector for yeast containing a glucoamylase signal sequence |
| EP0234862A3 (en) * | 1986-02-28 | 1988-10-05 | Merck & Co. Inc. | Expression of recombinant proteins in yeast |
| EP0234871A3 (en) * | 1986-02-28 | 1988-10-12 | Merck & Co. Inc. | Regulatable expression of recombinant proteins in yeast |
| ZA885536B (en) * | 1987-07-28 | 1989-04-26 | Gist Brocades Nv | Kluyveromyces as a host strain |
| US5010182A (en) * | 1987-07-28 | 1991-04-23 | Chiron Corporation | DNA constructs containing a Kluyveromyces alpha factor leader sequence for directing secretion of heterologous polypeptides |
| US7442525B1 (en) | 1987-12-24 | 2008-10-28 | Novartis Vaccines And Diagnostics, Inc. | Method for expressing HIV polypeptides |
| CA1340772C (en) | 1987-12-30 | 1999-09-28 | Patricia Tekamp-Olson | Expression and secretion of heterologous protiens in yeast employing truncated alpha-factor leader sequences |
| US6018026A (en) * | 1988-01-22 | 2000-01-25 | Zymogenetics, Inc. | Biologically active dimerized and multimerized polypeptide fusions |
| US5567584A (en) * | 1988-01-22 | 1996-10-22 | Zymogenetics, Inc. | Methods of using biologically active dimerized polypeptide fusions to detect PDGF |
| ES2092468T3 (es) * | 1988-01-22 | 1996-12-01 | Zymogenetics Inc | Metodos para producir analogos de receptores secretados. |
| US5750375A (en) * | 1988-01-22 | 1998-05-12 | Zymogenetics, Inc. | Methods of producing secreted receptor analogs and biologically active dimerized polypeptide fusions |
| JPH0771509B2 (ja) * | 1988-07-12 | 1995-08-02 | 工業技術院長 | ヒトβ−ＮＧＦの発現法 |
| DE68928124T2 (de) | 1988-09-02 | 1997-10-16 | Chiron Corp., Emeryville, Calif. | Makrophagenabgeleiteter entzündungsmediator(mip-2) |
| US6194140B1 (en) | 1990-04-04 | 2001-02-27 | Chiron Corporation | HCV NS3 protein fragments having helicase activity and improved solubility |
| FR2686899B1 (fr) | 1992-01-31 | 1995-09-01 | Rhone Poulenc Rorer Sa | Nouveaux polypeptides biologiquement actifs, leur preparation et compositions pharmaceutiques les contenant. |
| US6040172A (en) * | 1992-08-14 | 2000-03-21 | The Rockefeller University | Defective DNA viral vector comprising a neural tissue-specific promoter for in vivo expression of a gene |
| AU6582594A (en) * | 1993-04-26 | 1994-11-21 | Dae Woong Pharmaceutical Co., Ltd. | A novel gene coding human epidermal growth factor and process for preparing the same |
| EP0697888B1 (en) | 1993-05-12 | 2003-09-17 | Chiron Corporation | Conserved motif of hepatitis c virus e2/ns1 region |
| US6500645B1 (en) | 1994-06-17 | 2002-12-31 | Novo Nordisk A/S | N-terminally extended proteins expressed in yeast |
| ZA9610456B (en) * | 1995-12-20 | 1997-06-20 | Novo Nordisk As | N-terminally extended proteins expressed in yeast |
| GB9526733D0 (en) | 1995-12-30 | 1996-02-28 | Delta Biotechnology Ltd | Fusion proteins |
| EP1975177B1 (en) | 1996-03-01 | 2011-04-13 | Novo Nordisk A/S | An appetite-suppressing peptide, its compositions and use |
| US6087128A (en) * | 1998-02-12 | 2000-07-11 | Ndsu Research Foundation | DNA encoding an avian E. coli iss |
| US6926898B2 (en) | 2000-04-12 | 2005-08-09 | Human Genome Sciences, Inc. | Albumin fusion proteins |
| US6946134B1 (en) | 2000-04-12 | 2005-09-20 | Human Genome Sciences, Inc. | Albumin fusion proteins |
| US7507413B2 (en) | 2001-04-12 | 2009-03-24 | Human Genome Sciences, Inc. | Albumin fusion proteins |
| WO2005003296A2 (en) | 2003-01-22 | 2005-01-13 | Human Genome Sciences, Inc. | Albumin fusion proteins |
| CA2841097A1 (en) | 2001-12-21 | 2003-07-24 | Human Genome Sciences, Inc. | Albumin and g-csf fusion proteins |
| CA2925807C (en) | 2002-09-13 | 2020-09-15 | Cornell Research Foundation, Inc. | Using mutations to improve aspergillus phytases |
| US7118901B2 (en) | 2002-12-18 | 2006-10-10 | Roche Diagnostics Operations, Inc. | Recombinant bovine pancreatic desoxyribonuclease I with high specific activity |
| ATE517919T1 (de) | 2005-09-14 | 2011-08-15 | Sanofi Aventis Deutschland | Spaltung von insulinvorstufen durch eine trypsinvariante |
| JP2010507381A (ja) * | 2006-10-24 | 2010-03-11 | ノボザイムス アクティーゼルスカブ | ポリペプチド製造用の改良されたα因子シグナル・ペプチド |
| EA037848B1 (ru) | 2016-07-14 | 2021-05-27 | Общество С Ограниченной Ответственностью "Биохимический Агент" | Гибридный белок, полинуклеотид, генетическая конструкция, продуцент, препарат для регенерации хряща (варианты) |
| WO2022049409A1 (en) | 2020-09-02 | 2022-03-10 | Sia Terragen | Express diagnosticum for sars-cov-2 |
Family Cites Families (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4411994A (en) * | 1978-06-08 | 1983-10-25 | The President And Fellows Of Harvard College | Protein synthesis |
| US4338397A (en) * | 1980-04-11 | 1982-07-06 | President And Fellows Of Harvard College | Mature protein synthesis |
| FI64813C (fi) * | 1980-12-31 | 1984-01-10 | Ilkka Antero Palva | Foerfarande foer producering av ett utvalt aeggviteaemne och vid foerfarandet anvaenda rekombinantplasmidvektorer |
| NZ199722A (en) * | 1981-02-25 | 1985-12-13 | Genentech Inc | Dna transfer vector for expression of exogenous polypeptide in yeast;transformed yeast strain |
| IE53517B1 (en) * | 1981-06-17 | 1988-12-07 | Celltech Ltd | Process for the production of a polypeptide |
| DK368882A (da) * | 1981-08-25 | 1983-02-26 | Alan John Kingsman | Expessions vektorer |
| NZ201705A (en) * | 1981-08-31 | 1986-03-14 | Genentech Inc | Recombinant dna method for production of hepatitis b surface antigen in yeast |
| US4775622A (en) * | 1982-03-08 | 1988-10-04 | Genentech, Inc. | Expression, processing and secretion of heterologous protein by yeast |
-
1983
- 1983-10-26 DE DE8383306507T patent/DE3382547D1/de not_active Expired - Lifetime
- 1983-10-26 EP EP83306507A patent/EP0116201B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1983-11-18 CA CA 441501 patent/CA1341297C/en not_active Expired - Fee Related
- 1983-12-15 DK DK577883A patent/DK169952B1/da not_active IP Right Cessation
-
1984
- 1984-01-09 JP JP59000939A patent/JPH0779699B2/ja not_active Expired - Lifetime
-
1990
- 1990-03-14 JP JP2061304A patent/JPH0779710B2/ja not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CA1341297C (en) | 2001-09-25 |
| JPH0779699B2 (ja) | 1995-08-30 |
| EP0116201B1 (en) | 1992-04-22 |
| DK577883D0 (da) | 1983-12-15 |
| DK577883A (da) | 1984-07-13 |
| JPS59132892A (ja) | 1984-07-31 |
| EP0116201A1 (en) | 1984-08-22 |
| JPH0372893A (ja) | 1991-03-28 |
| JPH0779710B2 (ja) | 1995-08-30 |
| DE3382547D1 (de) | 1992-05-27 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CA1341297C (en) | Secretory expression in eukaryotes | |
| US4870008A (en) | Secretory expression in eukaryotes | |
| Clare et al. | Production of mouse epidermal growth factor in yeast: high-level secretion using Pichia pastoris strains containing multiple gene copies | |
| JP3730255B2 (ja) | イーストにおいて発現されたｎ末端に伸長した蛋白質 | |
| AU660161B2 (en) | A method of constructing synthetic leader sequences | |
| US5759802A (en) | Production of human serum alubumin A | |
| EP0792367B1 (en) | A dna construct encoding the yap3 signal peptide | |
| JP2708518B2 (ja) | 合成酵母リーダーペプチド | |
| FI100995B (fi) | Hiivan alfa-faktoriekspressiojärjestelmä | |
| EP0341215B1 (en) | Improvements in the production of polypeptides | |
| NO174351B (no) | Fremgangsmaate for fremstilling av human insulinforloeper samt DNA-sekvens og vektor til anvendelse av fremgangsmaaten | |
| CZ364196A3 (en) | Dna expression cassette, yeast expression vector, yeast cell and process for preparing a polypeptide in yeast | |
| EP0123228A2 (en) | Hybrid DNA synthesis of mature insulin-like growth factors | |
| EP0329684A4 (en) | COMPOSITE YEAST VECTORS. | |
| EP0946735A1 (en) | N-terminally extended proteins expressed in yeast | |
| EP0868523B1 (en) | Vector for expression of n-terminally extended proteins in yeast cell | |
| KR970005584B1 (ko) | 폴리 펩타이드의 개선된 제조방법 | |
| FI96121B (fi) | DNA-rakenne ja menetelmä heterologisen proteiinin tuottamiseksi | |
| EP0188555A4 (en) | YEAST CLONING VEHICLE. |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| B1 | Patent granted (law 1993) | ||
| PUP | Patent expired |