JPH0780908B2 - ペプチド及びその製造方法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 この発明は、その構造がヒト−カルシトニン遺伝子に由
来する新規なペプチド、すなわち、いわゆる“カルシト
ニン遺伝子関連ペプチド（CGRP）”、及びその塩；対応
するDNA配列、及びこれらのDNA配列を含有しそしてこれ
らのペプチドの製造のための中間体としてこの発明のペ
プチドを製造することができる微生物；これらのペプチ
ド又はDNA配列を製造するための方法；前記ペプチド又
はその塩を含有する医薬製剤；並びに、これらのペプチ
ド又はそれらの塩の医薬としての使用に関する。

〔発明の概要〕

すなわち、第１にこの発明は特に、90個以下のアミノ酸
残基を有する大きなペプチドの部分配列として、又はそ
れのみとして、次の式（Ｉ）、 で示されるアミノ酸配列（式中、システイン残基は分子
内−又は分子間−ジスルフィド橋を形成することができ
る）を有するペプチド、並びにアミド化された末端カル
ボキシ基及び／又はアシル化された末端アミノ基を有す
るそれらの誘導体、並びにこれらの塩に関する。

前記の大きなペプチドは、特に90個以下、特に80個以
下、例えば72個以下のアミノ酸残基を有する。好ましく
は、このものは、次の式（II）、 で表わされるアミノ酸配列を有するか、又は少なくとも
１個の追加のアミノ酸残基に加えて式（Ｉ）の配列を有
する該アミノ酸配列の断片を有する。

好ましくは、２個のシステイン残基は相互に分子内シス
チン残基を形成する。しかしながら、分子間ジスルフィ
ド橋を介して、２個のペプチドが相互に頭対頭で連結さ
れるか、又は好ましくは頭対尾で連結されて、二量体が
形成されることも可能である。

末端アミノ基は、好ましくは遊離しているが、しかしま
たアシル化、例えば特にアセチル化されていてもよい。

末端カルボキシ基がアミド化された形態、すなわち特に
カルバモイル基の形態で存在する上記のペプチドが薬理
学的に活性である。末端カルボキシ基が遊離しているか
又は塩の形である上記のペプチドもまた、薬理学的に活
性なアミドの製造のための中間体として、この発明の部
分を構成する。

この発明は、第１にそして特に、次の式（III）、 で表わされるペプチドアミド（CGRP II）及びその塩に
関する。

さらに、この発明はまた、次の式（III a）、 で表わされるＮ−アセチル化ペプチド−アミドに関す
る。

この発明はまた、次の式（III b）、 〔式中、AS^Ωは、式（III）のペプチドペプチド−アミ
ドの末端アミド基のNH₂基に酵素的に分解され得るか、
又は適当な酵素の存在下でアンモニアにより置換され得
るアミノ酸、例えば、好ましくはグリシン又はチロシン
である、〕 で表わされるペプチド、及び末端アミノ基がアセチル化
されているその誘導体に関する。

〔具体的な説明〕

国際的に認められた命名法に従って、この明細書中のア
ミノ酸の略号、例えば今まで記載した略号は遊離酸を示
し、そして特にことわらない限りＬ−配置を示す。α−
アミノ基は略号の左側に存在し、そしてカルボキシ基は
右側に存在すると考えるべきである。α−アミノ基中の
Ｈ原子の不存在はそのアミノ酸の略号の左に位置するハ
イホンによって示される。カルボキシ基中のHO基の不存
在は右側に位置するハイホンにより示される。アミノ酸
の側鎖中の置換基はアミノ酸記号のすぐ後のカッコ内に
記載され、又はアミノ酸記号の上方又は下方に垂直に伸
びる線によりアミノ酸記号に連結される。

略号 はシスチンを示す。

この発明のペプチドが天然に、すなわち例えば人体中
に、それ自体として存在するか否かはまだ知られていな
い。しかしながら、もしそうだとすれば、この発明は特
に、天然に存在するよりも、又は知られているであろう
抽出物中よりも高濃度の上記のペプチド及びその塩に関
する。特に、この発明は、単離され又は精製された形
の、純粋な又は実質上純粋な形の、天然に存在するのと
異る環境での、すなわち他の混合物例えば混合された医
薬担体を伴う、医薬用途に適当な形での、特徴付けられ
た形での、そして／又は生体もしくは死体の、器官の、
細胞の、組織の、もしくは体液の外での、上記のペプチ
ドに関する。この発明は特に、合成的に又は遺伝子的に
製造されたペプチド及びそれらの塩に関する。

上記の事項に関し、“単離される”なる語は、他の物質
から、特にこの発明の化合物と一緒に天然に存在する他
の化合物から分離されることを意味する。“精製され
る”なる語は、化学的及び／又は物理的精製手段にかけ
られることを意味する。“実質的に純粋な”という表現
は、50％より高い純度を意味する。

この発明はまた、この発明のペプチドの塩、特に医薬と
して許容される無毒性塩に関する。上記のペプチドは、
酸付加塩、例えば無機酸、特に鉱酸、例えば塩酸、硫酸
もしくはリン酸との酸付加塩、あるいは有機カルボン
酸、スルホン酸もしくはスルホン酸との塩、例えば酢
酸、プロピオン酸、グリコール酸、コハク酸、マレイン
酸、ヒドロキシマレイン酸、メチルマレイン酸、フマル
酸、リンゴ酸、酒石酸、クエン酸、安息香酸、桂皮酸、
マンデル酸、サリチル酸、４−アミノサリチル酸、２−
フェノキシ安息香酸、２−アセトキシ安息香酸、エンボ
ン酸、ニコチン酸もしくはイソニコチン酸、さらにはア
ミノ酸、さらにはメタンスルホン酸、エタンスルホン
酸、２−ヒドロキシエタンスルホン酸、エタン−1,2−
ジスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、４−メチルベンゼ
ンスルホン酸もしくはナフタレン−２−スルホン酸、又
は他の酸塩有機化合物、例えばアルコルビン酸との塩を
形質することができる。

少なくとも１個のカルボキシ基及び少なくとも１個の塩
基性基、例えばアミノ基を有する上記のペプチドは内部
塩を形成することができる。

少なくとも１個の遊離カルボキシ基を含有する前記のペ
プチドは、特にそれらが塩基性基より多数のカルボキシ
基を有する場合、金属塩又はアンモニウム塩、例えばア
ルカリ金属塩及びアルカリ土類金属塩、例えばナトリウ
ム塩、カリウム塩、マグネシウム塩又はカルシウム塩、
さらには、アンモニア又は適当な有機アミンとのアンモ
ニウム塩を形成し、そして特に、脂肪族、脂環族、脂環
脂肪族又は芳香脂肪族の第一級、第二級又は第三級モノ
−、ジ−又はポリ−アミン、そしてさらに脂環式塩基、
例えば低級アルギルアミン、例えばトリエチルアミン、
ヒドロキシ−低級アルキルアミン、例えば２−ヒドロキ
シエチルアミン、ビス−（２−ヒドロキシエチル）−ア
ミン、２−ヒドロキシエチル−ジエチルアミン又はトリ
−（２−ヒドロキシエチル）−アミン、カルボン酸の塩
基性脂肪族エステル、例えば４−アミノ安息香酸２−ジ
エチルアミノエチルエステル、低級アルキレンアミン、
例えば１−エチルピペリジン、シクロアルキルアミン、
例えばジシルロヘキシルアミン、又はベンジルアミン、
例えばN,NN′−ジベンジルエチレンジアミン、さらにピ
リジン型の塩基、例えばピリジン、コリジン又はキノリ
ンとの塩を挙げることができる。10^-15モルの投与量に
おいて、この発明のペプチドアミドは血管拡張作用を有
し、そして血圧の低下、並びに心拍数及び心筋の収縮性
の上昇をもたらす。これらの作用は交感神経系の遮断
剤、例えばメトプロロール〔１−イソプロピルアミノ−
３−（４−｛２−メトキシエチル｝−フェノキシ）−プ
ロパン−２−オール〕及びトランデート（Trandate）
（商標）（ラベタロール塩酸塩）により影響されず、他
方、血清中のノルアドレナリン及びアドレナリンの作用
はこれらの物質により抑制される。

この発明のペプチド−アミド、例えばCGRP IIの約100〜
1000ngのボルス（bolus）注入は、４μg/mlのノルアド
レナリンの注入によりあらかじめ収縮された、ラットの
摘出され灌流された腸管膜層において、濃度の関数とし
て、血管拡張を誘導する。血管拡張は約5300pas（40mmH
g）までの灌流圧の低下において現われる。

脊髄を除去した（despinalised）ラット〔Gillesbie及
びMuir、Brit.J.Pharmacol.30、88−98（1967）〕にお
いて、１μg/kg/分の投与量で、この発明のペプチド−
アミド、例えばCGRP IIは、血圧を低下せしめ、心拍数
を約40/分増加し、そして交感神経系の電気刺激によ
り、及びアンジオテンシンII又はアドレナリン静脈内注
射により惹起された昇圧効果を阻害する。

この発明のペプチド−アミドは、基礎的に、そしてさら
にベタネコール（bethanechol）又はヒスタミンによる
刺激の後に、胃液の分泌（分泌容量並びに酸及びペプシ
ンの放出）を抑制する。これらはまた、中枢神経系にも
作用する。

前記ペプチド−アミドはまたカルシウム低下活性を有す
る。すなわち、これらは血液中のカルシウム含量を低下
せしめ、そして鉱物質の損失から骨を保護する。

上記の薬理学的活性のため、この発明のペプチド−アミ
ドは、医薬として、特に血管を拡張しそして組織血流を
増加せしめるため、並びに狭心症、高血圧、心臓不全又
は他の冠循環疾患に対して使用することができ、さらに
ヒト−カルシトニン、例えば商業的に入手可能なシバカ
ルシン（Cibacalcin）（商標）を使用するのと同じ症
状、例えば骨代謝不全、例えば骨粗鬆症又はページェッ
ト病のために、使用することができる。

投与量は約0.1〜50μg/kg体重、好ましくは約１〜10μg
/kg体重である。

約70kgの体重の温血動物、特にヒトに投与すべき量は、
１日当り約１μｇ〜約1000μｇ、好ましくは約10μｇ〜
約100μｇ、例えば約40μｇである。

投与は好ましくは非経腸的投与、例えば静脈内投与であ
り、１週間に５日、３箇月にわたって行う。

この発明の化合物は、それ自体公知の方法により製造す
ることができる。

上記のペプチド、ペプチド−アミド、又はアシル化され
た末端アミノ基を有するそれらの誘導体の、この発明の
製造方法は次の変法により特徴付けられる。

（ａ）遊離カルボキシル基を有する前記化合物の断片又
はその反応性カルボン酸誘導体と、遊離アミノ基を有す
る補完的断片又はその反応性誘導体とを反応せしめる
（前記の断片中の遊離官能基は、反応に関与する２個の
基を除き、所望により保護された形で存在する）ことに
より前記化合物中に存在するアミド結合を形成せしめ、
そして存在するかもしれない保護基を除去し；あるい
は、 （ｂ）分子内−又は分子間ジスルフィド橋を有する前記
化合物のいずれかを製造するために、システイン残基の
メルカプト基が遊離の形で存在するか、又はシステイン
残基のメルカプト基が反応条件下で除去される保護基に
より保護されている前記化合物のいずれかを適当な酸化
剤により酸化し；あるいは、 （ｃ）少なくとも１個の官能基が保護された形で存在す
る前記のペプチド、ペプチド−アミド、又はそれらのＮ
−アシル化誘導体において、存在する保護基を除去し；
あるいは、 （ｄ）前記のペプチドを製造するために、目的アミノ酸
配列をコードしそして発現制御配列により制御されるDN
A配列を含有する発現ベクターにより形質転換された宿
主細胞を資化性の炭素源及び窒素源を含有する液体栄養
培地中で培養し、生成物を所望により宿主細胞から遊離
せしめそして単離し、そして必要であれば、得られるか
もしれない２量体又は多量体をジスルフィド結合を開裂
せしめるのに適当な還元剤と反応せしめ、そして必要で
あれば、得られる還元された生成物をジスルフィド結合
の新たな形成に適当な酸化剤で処理し；あるいは、 （ｅ）前記のペプチド−アミドのいずれかを製造するた
めに、目的ペプチド−アミドのアミノ酸配列に加えて、
該目的ペプチド−アミドの末端アミド基のNH₂基に酵素
的に分解され得るか又は適当な酵素の存在下でアンモニ
アにより置換され得るアミノ酸AS^ΩをＣ−末端に有する
ペプチドを、場合によってはアンモニアの存在下で、適
当な酵素により処理し； 前記変法（ａ）〜（ｅ）いずれかを実施した後で、得ら
れた塩を遊離化合物に、又は得られた遊離化合物をその
塩に転換する。

次に、上記の変法を詳細に説明する。

方法（ａ） この方法に従えば、最終生成物の合成における反応の最
終段階として分子の任意の位置でアミド結合が形成され
る。遊離カルボキシ基を有する前記の断片は、単一のア
ミノ酸、又はジ−、オリゴ−もしくはポリペプチドのい
ずれであってもよく、あるいはアシル化された末端アミ
ノ基を有する誘導体である場合には、アシル化用カルボ
シ酸、例えば特に酢酸であってもよい。遊離アミノ基を
有する前記の断片は単一のアミノ酸、ジ−、オリゴ−も
しくはポリペプチドであり、又はペプチド−アミドを製
造する場合にはさらにアミン、例えば特にアンモニアで
ある。

好ましくは、この反応は一方の断片の反応性カルボン酸
誘導体と遊離アミノ基を有する補完断片とを反応せしめ
ることによって行われ、カルボン酸誘導体のカルボキシ
基の活性化はその場で行うことができる。

反応性カルボン酸誘導体は特に、反応性活性化エステル
又は反応性無水物、さらには反応性環状アミドであり、
反応性酸誘導体はその場で形成することもできる。

酸の活性化されたエステルは、特にエステル化基の連結
炭素原子において不飽和のエステル、例えば真のビニル
エステル（これらは、例えば、対応するエステルと酢酸
ビニルとのエステル交換により得ることができる；活性
化ビニルエステル法）、カルバモイルビニルエステル
（これらは、例えば、対応する酸をイソキサゾリウム試
薬で処理することにより得ることができる;1,2−オキサ
ゾリウム法、又はウードワート法）、又は１−低級アル
コキシビニルエステル（これらは、例えば、対応する酸
を低級アルコキシアセチレンで処理することによって得
ることができる；エトキシアセチレン法）、あるいはア
ミジノタイプのエステル、例えばN,N′−ジ置換アミジ
ノエステル（これらは、例えば、対応する酸を適当なN,
N′−ジ置換カルボジイミド、例えばN,N′−ジシクロヘ
キシルカルボジイミドで処理することによって得ること
ができる；カルボジイミド法）、又はN,N′−ジ置換ア
ミジノエステル（これらは、例えば、対応する酸をN,
N′−ジ置換シアンアミドで処理することによって得る
ことができる；シアンアミド法）、適当なアリールエス
テル、特に電子吸引性置換基により適切に置換されたフ
ェニルエステル（これらは、例えば、対応する酸を適当
に置換されたフェノール、例えば４−ニトロフェノー
ル、４−メチルスルホニルフェノール、2,4,5−トリク
ロロフェノール、2,3,4,5,6−ペンタクロロフェノール
もしくは４−フェニルジアゾフェノールにより、縮合
剤、例えばN,N′−ジシクロヘキシルカルボジイミドの
存在化で処理することにより得ることができる；活性化
アリールエステル法）、シアノメチルエステル（これら
は、例えば、対応する酸を塩基の存在下でクロロアセト
ニトリルで処理することにより得ることができる；シア
ノメチルエステル法）、チオエステル、特に、例えばニ
トロにより置換されている場合があるフェニルチオエス
テル（これらは、例えば、対応する酸を、場合によって
は例えばニトロにより置換されているチオフェノールに
より、特に無水物法又はカルボジイミド法の助けにより
処理することによって得ることができる；活性化チオー
ルエステル法）、アミノ又はアミドエステル（これら
は、例えば、対応する酸をＮ−ヒドロキシアミノ又はＮ
−ヒドヒドロキシアミド化合物、例えばＮ−ヒドロキシ
サクシンイミド、Ｎ−ヒドロキシピペリジン、Ｎ−ヒド
ロキシフタリミド又は１−ヒドロキシベンゾトリアゾー
ルにより、例えば無水物法又はカルボジイミド法に従っ
て処理することにより得ることができる；活性化Ｎ−ヒ
ドロキシエステル法）、又はシリルエステル（これら
は、例えば、対応する酸をシリル化剤、例えばヘキサメ
チルジシラザンで処理することによって得ることがで
き、そしてこれらはヒドロキシ基とは容易に反応するが
アミノ基とは反応しない）である。

酸無水物は、これらの酸の対称無水物又は混合無水物で
あり、例えば無機酸との無水物、例えば酸ハライド、特
に酸クロリド（これらは例えば、対応する酸を塩化チオ
ニル、五塩化リン又は塩化オキサリルで処理することに
より得られる；酸ハライド法）、アジド（これらは例え
ば、対応する酸エステルから対応するヒドラジドを介し
て、そしてこれを亜硝酸で処理することにより得られ
る；アジド法）、炭酸半誘導体、例えば対応するエステ
ル、例えば炭酸低級アルキル半エステルとの無水物（こ
れらは例えば、対応する酸をハロ蟻酸例えばクロロ蟻酸
低級アルキルエステルにより、又は１−低級アルコキシ
カルボニル−２−低級アルコキシ−1,2−ジヒドロキノ
リン、例えば１−低級アルコキシカルボニル−２−エト
キシ−1,2−ジヒドロキノリンで処理することにより得
られる；混合０−アルキル炭酸無水物法）、又はジハロ
ゲン化、特にジ塩化リン酸との無水物（これらは例え
ば、対応する酸をオキシ塩化リンで処理することにより
得られる；オキシ塩化リン法）、又は有機酸との無水
物、例えば有機カルボン酸との無水物（これらは例え
ば、対応する酸を、置換されている場合がある低級アル
カンカルボン酸ハライド又はフェニルアルカンカルボン
酸ハライド、例えばフェニル酢酸、ピバリン酸又はトリ
フルオロ酢酸クロリドで処理することにより得られる；
混合カルボン酸無水物法）、又は有機スルホン酸との無
水物（これらは例えば、対応する酸の塩、例えばアルカ
ル金属塩を、適当な有機スルホン酸ハライド、例えば低
級アルカンスルホン酸クロリド又はアリールスルホン酸
クロリド、例えばメタン−又はｐ−トルエン−スルホン
酸クロリドで処理することにより得られる；混合スルホ
ン酸無水物法）、さらには対称無水物（これらは例え
ば、カルボジイミド又は１−ジエチルアミノプロピンの
存在下で対応する酸の縮合により得られる；対称無水物
法）である。

適当な環状アミドは特に、芳香族性の５員ジアザ環との
アミド、例えばイミダゾール類、例えばイミダゾールと
のアミド（これらは例えば、対応する酸をN,N′−カル
ボニルジイミダゾールで処理することにより得られる；
イミダゾリド法）、又はピラゾール類、例えば3,5−ジ
メチルピチゾールとのアミド（これらは例えば、アセチ
ルアセトンで処理することにより酸ヒドラジドを介して
得られる；ピラゾリド法）である。

前記のように、カルボン酸誘導体はまたは、その場合で
形成することもできる。例えば、遊離アミノ基を有する
補完断片と遊離カルボン酸を有するペプチド断片との混
合物を適当なN,N′−ジ置換カルボジイミド、例えばN,
N′−ジシクロヘキシルカルボジイミドの存在下で反応
せしめることにより、N,N′−ジ置換アミジノエステル
をその場で生成せしめることができる。さらに、N,N′
−ジ置換カルボジイミド、例えばN,N′−ジシクロヘキ
シルカルボジイミドの存在下で、そしてＮ−ヒドロキシ
アミン又はＮ−ヒドロキシアミド、例えばＮ−ヒドロキ
シサクシンイミドの存在下で、場合によっては適当な塩
基、例えば４−ジメチルアミノピリジンの存在下で、対
応する酸出発物質及びアミノ出発物質の混合物を反応せ
しめることにより、アシル化されるべきアミンの存在下
で酸のアミノ又はアミドエステルを形成することができ
る。

上記の方法に代えて、変法（ａ）はまた、遊離カルボキ
シ基を有する断片をアミノ酸が反応性形で存在する補完
断片と反応せしめることによっても実施することができ
る。アミノ基は、例えばホスフィト、例えばジエチルク
ロロホスフィト、1,1−フェニレンクロロホスフィト、
エチルジクロロホスフィト、エチレンクロロホスフィト
又はテトラエチルピロホスフィトとの反応により活性化
することができる。

アミノ基はまた、ハロカルボニル、例えばクロロカルボ
ニルへの結合により活性化することができ、又はイソシ
アナート基の形で活性化することができる。

前記の断片中の遊離官能基は特にカルボキシ基、アミノ
基、ヒドロキシ基、及びメルカプト基であり、これら
は、反応に関与すべきでない場合には、保護された形で
存在するのが好ましい。

保護基、並びにその導入及び除去の方法は、例えば、
“Protective Groups in Orgamic Chemistry"、プレナ
ムプレス、ロンドン、ニューヨーク、1973年；“Method
en der organischen Chemie"ホーベン−ウェイル、第４
版、vol15/1、ゲオルグ−チーメ−フェルラーク、スタ
ットガルト、1974;及びTheodora W.Green、“Protectiv
e Groups in Organic Synthesis"、ジョンウイレー・ア
ンド・ソンズ、ニューヨーク、1981年、中に記載されて
いる。容易に、すなわち不所望の二次反応が生ずること
なく、例えば加溶媒分解、還元もしくは光分解により、
又は生理的条件下で除去され得ることが保護基の特徴で
ある。

ヒドロキシ−保護基は、例えばアシル基、例えば場合に
よっては置換されている、例えばハロ置換されている低
級アルカノイル、例えば2,2−ジクロロアセチル、又は
炭酸半エステルのアシル基、特にtert−ブトキシカルボ
ニル、場合によっては置換されているベンジルオキシカ
ルボニル又はジフェニルメトキシカルボニル、例えば４
−ニトロベンジルオキシカルボニル、又は２−ハロ−低
級アルコキシカルボニル、例えば2,2,2−トリクロロエ
トキシカルボニル、さらにトリチル又はホルミル、又は
有機シリルもしくはスタンニル基、さらには容易に除去
され得るエーテル化基、例えばtert−低級アルキル、例
えばtert−ブチル、２−オキサーもしくは２−チアー脂
肪族−もしくは−脂環族炭化水素基、特に１−低級アル
コキシ−低級アルキルもしくは１−低級アルキルチオ−
低級アルキル、例えばメトキシメチル、１−メトキシエ
チル、１−エトキシエチル、メチルチオメチル、１−メ
チルチオエチルもしくは１−エチルチオエチル、又は５
個もしくは６個の環原子を有する２−オキサーもしくは
２−チア−シクロアルキル、テトラヒドロフリルもしく
は２−ヒトラヒドロピラニル、もしくは対応するチア類
似体、そしてさらに場合によっては置換されている１−
フェニル低級アルキル、例えば場合によっては置換され
ているベンジル又はジフェニルメチル（フェニル基の置
換としては、例えばハロゲン、例えば塩素、低級アルコ
キシ、例えばメトキシ、及び／又はニトロが好ましい）
である。

カルボキシ基は一般にエステル化形で保護され、このよ
うなエステル基は穏和な条件下で容易に開裂され得る。
この態様で保護されているカルボキシ基は、エステル化
基として特に、１−位において分枝しているか、又は１
−位もしくは２−位において適切に置換されている低級
アルキル基を含有する。エステル化された形の好ましい
カルボキシ基は特に、tert−低級アルコキシカルボニ
ル、例えばtert−ブトキシカルボニル、１個もしくは２
個のアリール基を有するアリールメトキシカルボニル
（このアリール基は、場合によっては、低級アルキルに
より、例えばtert−低級アルキル、例えばtert−ブチル
により、低級アルコキシ、例えばメトキシにより、ヒド
ロキシ、ハロゲン、例えば塩素、そして／又はニトロに
よりモノ−又はポリ−置換されている）、例えば上記の
ように置換されている場合があるベンジルオキシカルボ
ニル、例えば４−メトキシベンジルオキシカルボニルも
しくは４−ニトロベンジルオキシカルボニル、又は場合
によっては例えば前記のように置換されているジフェニ
ルメトキシカルボニル、例えばジフェニルメトキシカル
ボニルもしくはジ−（４−メトキシフェニル）−メトキ
シカルボニル、１−低級アルコキシ−低級アルコキシカ
ルボニル、例えばメトキシメトキシカルボニル、１−メ
トキシエトキシカルボニルもしくは１−エトキシメトキ
シカルボニル、１−低級アルキルチオ−低級アルコキシ
カルボニル、例えば１−メチルチオメトキシカルボニル
もしくは１−エトキシチオエトキシカルボニル、アロイ
ルメトキシカルボニル（アロイル基は、場合によっては
ハロゲン、例えば臭素により置換されているベンゾイル
である）、例えばフェナシルオキシカルボニル、２−ハ
ロ−低級アルコキシカルボニル、例えば2,2,2−トリク
ロロエトキシカルボニル、２−ブロモエトキシカルボニ
ルもしくは２−ヨードエトキシカルボニル、又は２−
（トリ置換シリル）−エトキシカルボニル（ここで、各
置換基は、他とは独立に、場合によっては例えば低級ア
ルキル、低級アルコキシ、アリール、ハロゲン及び／又
はニトロにより置換されている、脂肪族、芳香−脂肪
族、脂環族、脂環族又は芳香族炭化水素基、例えば、場
合によっては置換されている対応する低級アルキル、フ
ェニル−低級アルキル、シクロアルキル又はフェニルで
ある）、例えば２−トリ−低級アルキルシリルエトキシ
カルボニル、例えば２−トリメチルシリルエトキシカル
ボニルもしくは２−（ジ−ｎ−ブチルメチルシリル）−
エトキシカルボニル、又は２−トリアリールシリルエト
キシカルボニル、例えば２−トリフェニルシリルエトキ
シカルボニルである。

前記の及び後記の有機シリル基又はスタンニル基は、珪
素原子又は錫原子の置換基として、好ましくはアルキ
ル、特にメチルを含有する。対応するシリル又はスタン
ニル基は、特にトリ−低級アルキルシリル、特にトリメ
チルシリル、さらにジメチル−tert−ブチルシリル、又
は対応して置換されたスタンニル、例えばトリ−ｎ−ブ
チルスタンニルである。

好ましい保護されたカルボキシ基はtert−低級アルコキ
シカルボニル、例えばtert−ブトキシカルボニル、そし
て特に、例えば前記のように置換されている場合がある
ベンジルオキシカルボニル又はジフェニルメトキシカル
ボニル、例えば４−ニトロベンジルオキシカルボニル、
そして特に２−（トリメチルシリル）−エトキシカルボ
ニル、さらには４−ベンジルオキシカルボニルベンジル
オキシカルボニルであり、ここで最初に記載したベンジ
ルオキシカルボニル基はポリマーに、すなわち例えばジ
ビニルベンゼンにより架橋されたポリスチレンに連結さ
れている。

保護されたアミノ基は、例えば、容易に開裂され得るア
シルアミノ、アリールメチルアミノ、エーテル化メルカ
プトアミノ、２−アシル−低級アルカ−１−エニルアミ
ノ、シリルアミノ又はスタンニルアミノ基の形、又はア
ジド基の形であることができる。

対応するアシルアミノ基において、アシルは例えば、炭
素原子数が例えば18個以下である有機カルボン酸のアシ
ル基、特に、場合によっては例えばハロゲンもしくはア
リールにより置換されているアルカンカルボン酸のアシ
ル基、場合によっては例えばハロゲン、低級アルコキシ
もしくはニトロにより置換されている安息香酸のアシル
基、又は炭酸半エステルのアシル基である。このような
アシル基は例えば、低級アルカノイル、例えばホルミ
ル、アセチルもしくはプロピオニル、ハロ−低級アルカ
ノイル、例えば２−ハロアセチル、特に２−クロロ−、
２−ブロモ−、２−ヨード、2,2,2−トリフルオロ−も
しくは2,2,2−トリクロロ−アセチル、場合によっては
例えばハロゲン、低級アルコキシもしくはニトロにより
置換されているベンゾイル、例えばベンゾイル、４−ク
ロロベンゾイル、４−メトキシベンゾイルもしくは４−
ニトロベンゾイル、又は低級アルキル基の１−位におい
て分枝しているか又は１−位もしくは２、位において適
切に置換されている低級アルコキシカルボニル、特にte
rt−低級アルコキシカルボニル、例えばtert−ブトキシ
カルボニル、アリールメトキシカルボニル（これは１個
又は２個のアリール基を有し、このアリール基は、場合
によっては低級アルキル、特にtert−低級アルキル、例
えばtert−ブチル、低級アルコキシ、例えばメトキシ、
ヒドロキシ、ハロゲン、例えば塩素、及び／又はニトロ
によりモノ−又はポリ−置換されているフェニルであ
る）、例えば場合によっては置換されているベンジルオ
キシカルボニル、例えば４−ニトロベンジルオキシカル
ボニル、又は置換されたジフェニルメトキシカルボニ
ル、例えばベンズヒドリルオキシカルボニル又はジ−
（４−メトキシフェニル）−メトキシカルボニル、アロ
イルメトキシカルボニル（ここで、アロイル基は好まし
くは、場合によってはハロゲン、例えば臭素により置換
されているベンゾイルである）、例えばフェナシルオキ
シカルボニル、２−ハロ−低級アルコキシカルボニル、
例えば2,2,2−トリクロロエトキシカルボニル、２−ブ
ロモエトキシカルボニルもしくは２−ヨードエトキシカ
ルボニル、又は２−（トリ−置換シリル）−エトキシカ
ルボニル（ここで、各置換基は、他とは独立に、脂肪
族、芳香−脂肪族、脂環族又は芳香族の炭化水素基であ
り、この基は15個以下の炭素原子を有しそして場合によ
っては例えば低級アルキル、低級アルコキシ、アリー
ル、ハロゲンもしくはニトロにより置換されており、そ
して例えば、場合によっては置換されている低級アルキ
ル、フェニル低級アルキル、シクロアルキル又はフェニ
ルである）、例えばトリ−アルキルシリルエトキシカル
ボニル、例えば２−トリメチルシリルエトキシカルボニ
ルもしくは２−（ジ−ｎ−ブチルメチルシリル）−エト
キシカルボニル、又は２−トリアリールシリルエトキシ
カルボニル、例えば２−トリフェニルシリルエトキシカ
ルボニルである。

アミノ−保護基としての他のアシル基はさらに、有機リ
ン酸、ホスホン酸又はホスフィン酸の対応する基、例え
ばジ−低級アルキルホスホリル、例えばジメチルホスホ
リル、ジエチルホスホリル、ジ−ｎ−プロピルホスホリ
ルもしくはジイソプロピルホスホリル、ジシクロアルキ
ルホスホリル、例えばジシクロヘキシルホスホリル、場
合によっては置換されているジフェニルホスホリル、例
えばジフェニルホスホリル、場合によっては例えばニト
ロにより置換されているジ−（フェニル−低級アルキ
ル）−ホスホリル、例えばジベンジルホスホリルもしく
はジ−（４−ニトロベンジル）−ホスホリル、場合によ
っては置換されているフェノキシフェニルホスホリル、
例えばフェノキシフェニルホスホリル、ジ−低級アルキ
ルホスフィニル、例えばジエチルホスフィニル、例えば
場合によっては置換されているジフェニルホスフィニ
ル、例えばジフェニルホスフィニルを挙げることができ
る。

モノ−、ジ−、又は特にトリ−アリールメチルアミノ基
であるアリールメチルアミノ基においてアリール基は特
に、置換されている場合があるフェニル基である。この
ような基は、例えばベンジルアミノ、ジフェニルメチル
アミノ、及び特にトリチルアミノである。

エーテル化メルカプト基により保護されたアミノ基中の
エーテル化メルカプト基は特にアリールチオ基又はアリ
ール−低級アルキルチオ基であり、ここでアリールは特
に、場合によっては例えば低級アルキル、例えばメチル
もしくはtert−ブチル、低級アルコキシ、例えばメトキ
シ、ハロゲン、例えば塩素、及び／又はニトロにより置
換されているフェニルである。対応するアミノ保護基は
例えば４−ニトロフェニルチオである。

アノミ保護基として使用することができる２−アシル−
低級アルカ−１−エン−１−イル基において、アシルは
例えば低級アルカンカルボン酸のアシル基、安息香酸
（これは場合によっては例えば低級アルキル、例えばメ
チルもしくはtert−ブチル、低級アルコキシ、例えばメ
トキシ、ハロゲン、例えば塩素、及び／又はニトロによ
り置換されている）のアシル基、又は特に炭酸半エステ
ル、例えば炭酸低級アルキル半エステルのアシル基であ
る。対応する保護基は特に、１−低級アルカノイルプロ
プ−１−エン−２−イル、例えば１−アセチルプロプ−
１−エン−２−イル、又は１−低級アルコキシカルボニ
ルプロプ−１−エン−２−イル、例えば１−エトキシ−
カルボニルプロプ−１−エン−２−イルである。

アミノ基はまたプロトン化形で保護することができ、対
応する陰イオンとして特に、強無機酸の陰イオン、例え
ば塩素イオンもしくは臭素イオン、又は有機スルホン酸
は、例えばｐ−トルエンスルホン酸の陰イオンが挙げら
れる。

好ましいアミノ−保護基は、炭酸半エステルのアシル
基、特にtert−ブトキシカルボニル、又はベンジルオキ
シカルボニルもしくはジフェニルメトキシカルボニル
（これらのそれぞれは、場合によっては例えば前記のよ
うに置換されている）、例えば４−ニトロベンジルオキ
シカルボニル、又は２−ハロ−低級アルコキシカルボニ
ル、例えば2,2,2−トリクロロエトキシカルボニル、さ
らにはトリチル又はホルミルである。

メルカプト基、例えばシステイン中のメルカプト基は、
場合によっては置換されているアルキル基によるＳ−ア
ルキル化によって、チオアセタール形成によって、Ｓ−
アシル化によって、又は非対称ジスルフィド基の形成に
よって保護することができる。好ましいメルカプト−保
護基は、例えば、場合によってはフェニル基において例
えばメトキシもしくはニトロにより置換されているベン
ジル基、例えば４−メトキシベンジル、場合によっては
フェニル成分において例えばメトキシにより置換されて
いるジフェニルメチル、例えば4,4′−ジメトキシ−ジ
フェニルメチル、トリフェニルメチル、トリメチルシリ
ル、ベンジルチオメチル、テトラヒドロピラニル、アシ
ルアミノメチク、例えばアセチルアミノメチル、ベンゾ
イル、ベンジルオキシカルボニル又はアミノカルボニ
ル、例えばエチルアミノカルボニルである。

第一カルボン酸アミド基（-CONH₂）は、例えばＮ−（９
−キサンセニル）誘導体の形で、又はＮ−（モノ−、ジ
−又はトリ−アリールメチル）誘導体の形で保護され、
ここでアリールは特に非置換フェニル、又は５個以下の
同一の又は異る置換基により置換されたフェニルであ
る。このようなフェニル置換基は好ましくは低級アルキ
ル、例えばメチル、低級アルコキシ、例えばメトキシ、
又はさらにポリマー担体である。このようなアリールメ
チル保護基の例として４−メトキシベンジル、2,4,6−
トリメトキシベンジル、ジフェニルメチル、ジ−（４′
−メトキシフェニル）−メチル、ジ−（４−メチルフェ
ニル）−メチル、及び（４−メチルフェニル）−（〔ポ
リマー担体〕−フェニル）−メチルを挙げることができ
る。

グアニジノ基は例えばトルエンスルホネートの形で保護
される。

この明細書において、保護基、例えば特にカルボキシ保
護基、さらに保護されるべき官能基例えば特にカルボキ
シ基と結合するポリマー担体は、容易に除去することが
でき、例えばメリフィールド合成のために適当なものと
して理解される。このタイプの適当なポリマー担体は、
例えば、ジビニルベンゼンとの共重合により弱く架橋さ
れたポリスチレン樹脂であり、この樹脂はペプチド残基
の可逆的結合のために適当な橋要素を担持する。

反応はそれ自体既知の方法で行うことができ、反応条件
は特に反応に関与するカルボキシ基が活性化されている
か否か、そしていかに活性化されているかに依存し、通
常は適当な溶剤もしくは希釈剤又はこれらの混合物の存
在下で、そして必要であれば縮合剤（これは例えば、反
応に関与するカルボキシ基が無水物の形で存在すれば、
さらに酸結合剤であってもよい）の存在下で、冷却又は
加熱しながら、例えば約−30℃〜約＋150℃の温度範囲
において、密閉反応容器中でそして／又は不活性ガス、
例えば窒素の雰囲気中で行う。一般的縮合剤は、例えば
カルボジイミド、例えばN,N′−ジエチル−、N,N′−ジ
プロピル、N,N′−ジシクロヘキシル−もしくはＮ−エ
チル−Ｎ′−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジ
イミド、適当なカルボニル化合物、例えばカルボニルジ
イミダゾール、又は1,2−オキサゾリウム化合物、例え
ば２−エチル−５−フェニル−1,2−オキサゾリウム−
３′−スルホネート及び２−tert−ブチル−５−メチル
−イソオキサゾルリウムパークロレート、又は適当なア
シルアミノ化合物、例えば２−エトキシ−１−エトキシ
カルボニル−1,2−ジヒドロキノリンである。一般的酸
結合縮合剤は、例えばアルカリ金属の炭酸塩又は炭酸水
素塩、例えばナトリウム又はカリウムの炭酸塩又は炭酸
水素塩（通常は硫酸塩と共に）、又は有機塩基、例えば
一般的に、立体障害されたトリ−低級アルキルアミン、
例えばN,N′−ジイソプロピル−Ｎ−エチルアミンであ
る。

保護基、例えばカルボキシ−、アミノ−、ヒドロキシ
−、カルボン酸アミド−又はメルカプト−保護基の除去
は、それ自体既知の方法により、例えば加溶媒分解によ
り、特に加水分解、アルコール分解もしくは酸分解によ
り、又は還元により、特に水素化もしくは化学的還元に
より、場合によっては複数段階で又は同時的に行われ
る。さらに、酵素的方法を用いることも可能である。

すなわち、tert−低級アルコキシカルボニル、又は２−
位において有機シリル基によりもしくは１−位において
低級アルコキシもしくは低級アルキルチオにより置換さ
れている低級アルコキシカルボニル、又は場合によって
は置換されているジフェニルメトキシカルボニルは、例
えば適当な酸、例えば蟻酸又はトリフルオロ酢酸で処理
することにより、場合によっては親核性化合物、例えば
フェノール又はアニソールを添加して、遊離のカルボキ
シに転換することができる。場合によっては置換されて
いるベンジルオキシカルボニルは、例えば水素化分解に
より、すなわち、金属性水素化触媒、例えばパラジウム
触媒の存在下で水素で処理することにより、遊離せしめ
ることができる。さらに、適切に置換されたベンジルオ
キシカルボニル、例えば４−ニトロベンジルオキシカル
ボニルはまた、化学還元により、例えばアルカリ金属ジ
チオニト、例えばナトリウムジチオニトで、又は還元性
金属塩、例えばクロム（II）塩、例えば塩化クロム（I
I）で処理することにより、通常は、水素を生成しそし
て金属と共に発生期の水素を発生することができる薬
剤、例えば、場合によっては例えばヒドロキシにより置
換されている低級アルカンカルボン酸、例えば酢酸、蟻
酸、グリコール酸、ジフェニルグリコール酸、乳酸、マ
ンデル酸、４−クロロマンデル酸もしくは酒石酸、又は
アルコールもしくはチオール（水を添加するのが好まし
い）の存在下で、遊離カルボキシに転換することもでき
る。上記のように、還元性金属又は金属塩で処理するこ
とにより、２−ハロ−低級アルコキシカルボニル（場合
によっては２−ブロモ−低級アルコキシカルボニル基を
対応する２−ヨード−低級アルコキシカルボニル基に転
換した後）又はアロイルメトキシカルボニルを遊離カル
ボキシに転換することが可能であり、アロイルメトキシ
カルボニルはまた、親核性の好ましくは塩形成性の試
薬、例えばナトリウムチオフェノレート又はヨウ化ナト
リウムで処理することによっても開裂せしめることがで
きる。置換された２−シリルエトキシカルボニルはま
た、弗素陰イオンをもたらす弗化水素酸の塩、例えば弗
化アルカリ金属、例えば弗化ナトリウム又は弗化カリウ
ムで処理することにより、巨還ポリエーテル（“クラウ
ンエーテル”）の存在下で、あるいは有機第四塩基の弗
化物、例えばテトラエチルアンモニウムフルオリド又は
テトラブチルアンモニウムフルオリドで処理することに
より、非プロトン性極性溶剤、例えばジメチルスルホキ
シド又はN,N′−ジメチルアセトアミドの存在下で、遊
離カルボキシに転換することができる。

保護されたアミノ基は、それ自体既知の方法により、そ
して保護基の性質に依存して、種々の方法により、しか
し好ましくは加溶媒分解又は還元により遊離せしめる。
２−ハロ−低級アルコキシカルボニルアミノ（場合によ
っては２−ブロモ−低級アルコキシカルボニルアミノ基
を２−ヨウド−低級アルコキシカルボニルアミノ基に転
換した後）、アロイルメトキシカルボニルアミノ、又は
４−ニトロベンジルオキシカルボニルアミノは、例えば
適当な化学還元剤、例えば適当なカルボン酸、例えば水
性酢酸の存在下での亜鉛で処理することにより、開裂せ
しめることができる。アロイルメトキシカルボニルアミ
ノはまた、親核性の好ましくは塩形成性の試薬、例えば
ナトリウムチオフェノラートで処理することにより、そ
して４−ニトロベンジルオキシカルボニルアミノはま
た、アルカリ金属ジチオニト、例えばナトリウムジチオ
ニトで処理することにより開裂せしめることができる。
場合によっては置換されているジフェニルメトキシカル
ボニルアミノ、tert−低級アルコキシカルボニルアミ
ノ、又は２−トリ置換シリルエトキシカルボニルアミノ
は、適当な酸、例えば蟻酸又はトリフルオロ酢酸で処理
することにより開裂せしめることができ、場合によって
は置換されているベンジルオキシカルボニルアミノは、
例えば水素化分解により、すなわち適当な水素化触媒、
例えばパラジウム触媒の存在下で水素で処理することに
より開裂せしめることができ、場合によっては置換され
ているトリアリールメチルアミノ又はホルミルアミノ
は、例えば酸で処理することにより、例えば鉱酸、例え
ば塩酸、又は有機酸、例えば蟻酸、酢酸又はトリフルオ
ロ酢酸で処理することにより、場合によっては水の存在
下で開裂せしめることができ、そして有機シリル基によ
り保護されたアミノ基は、例えば加水分解又はアルコー
ル分解により遊離せしめることができる。ハロアセチ
ル、例えば２−クロロアセチルにより保護されたアミノ
基は、塩基の存在下でチオ尿素で処理することにより、
又はチオ尿素のチオレート塩、例えばアルカリ金属チオ
レートで処理し、続いて、得られた縮合生成物を加溶媒
分解、例えばアルコール分解もしくは加水分解にかける
ことにより、遊離せしめることができる。２−置換シリ
ルエトキシカルボニルにより保護されたアミノ基はま
た、対応して保護されたカルボキシ基の遊離化に関して
前記したように、弗素陰イオンをもたらす弗化水素酸の
塩で処理することにより、遊離アミノ基に転換すること
ができる。

アジド基の形で保護されたアミノは、例えば還元によ
り、例えば水素化触媒、例えば酸化白金、パラジウムも
しくはラネ−ニッケルの存在下での水素による触媒的水
素化により、あるいは他の方法として、酸、例えば酢酸
の存在下で亜鉛で処理することにより、遊離アミノに転
換することができる。触媒的水素化は不活性溶剤、例え
ばハロゲン化水素、例えば塩化メチル中で、又は水中、
もしくは水と有機溶剤、例えばアルコールもしくはジオ
キサンとの混合物中で、約20℃〜25℃において、又は冷
却もしくは加熱しながら実施するのが好ましい。

適当なアシル基により、有機シリル基により、又は場合
によっては置換されている１−フェニル−低級アルキル
により保護されているヒドロキシ又はメルカプトは、対
応して保護されたアミノ基と同様にして遊離せしめる。
2,2−ジクロロアセチルにより保護されたヒドロキシ又
はメルカプト基は例えば塩基性加水分解により遊離し、
そしてtert−低級アルキルにより又は２−オキサ−もし
くは２−チア−脂肪族もしくは−脂環族炭化水素基によ
りエーテル化されたヒドロキシ又はメルカプト基は、酸
分解により、例えば、鉱酸又は強カルボン酸、例えばト
リフルオロ酢酸で処理することにより遊離する。好まし
くは置換されているメチレン基により、例えば低級アル
キリデン、例えばイソプロピリデン、シクロアルキリデ
ン、例えばシクロヘキシリデン、又はベンジリデンによ
り一緒に保護されている２個のヒドロキシ基は、酸加溶
媒分解により、特に鉱酸又は強有機酸の存在下で遊離せ
しめることができる。

９−キサンセニルにより保護されたカルボン酸アミド基
は例えば、氷酢酸中臭化水素により、又はアニソールの
存在下での弗化水素により遊離する。

モノ−、ジ−又はトリ−アリールメチルにより保護され
たカルボン酸アミド基は例えば、アニソールの存在下で
弗化水素により遊離せしめることができ、さらに、ジフ
ェニルメチル保護基は例えば、炭素上パラジウム触媒の
存在下での水素化分解により除去することができ、そし
てジ−（４−メトキシフェニル）メチル保護基又は2,4,
6−トリメトキシベンジル保護基は例えば、トリフルオ
ロ酢酸により除去することができる。さらに、１個のア
リール保護基がポリマー担体に連結されているジアリー
ルメチル保護基はアニソールの存在下で弗化水素により
除去することができる。

所望により、複数の保護された官能基が存在する場合に
は、例えば酸分解により、例えばトリフルオロ酢酸もく
しは蟻酸で処理することにより、又は還元により、例え
ば亜鉛及び酢酸で処理することにより、もしくは水素及
び水素化触媒、例えば炭素上パラジウム触媒で処理する
ことにより、前記の保護基の複数が同時に除去され得る
ように、保護基を選択する。

反応変法（ａ）はさらに、ペプチド−アミドの製造方法
の次のような態様を含む。この態様においては、ペプチ
ドの末端カルボキシ基がアンモニアによってポリマー担
体から除去され、そしてこの過程で、すなわちその場
で、アミドに転換される。この場合、アンモニアは遊離
アミノ基を有する補完断片である。

方法（ｂ） ジスルフィド結合を形成するためにメルカプト基を酸化
するために適当な酸化剤は例えば、大気中酸素〔場合に
よっては触媒量の遷移金属の塩、例えば硫酸鉄（II
I）、塩化鉄（III）又は硫酸銅（II）が添加されている
ポリペプチドの水溶液に、大気中酸素を通すのが好まし
い〕；ヨウ素〔さらにはヨウ化カリウムアダクトKI₃の
形で、これは、アルコール性溶液、例えばメタノール
性、又は水性アルコール性、例えば水性メタノール性溶
液として使用するのが好ましい〕；水溶液中フェリ（II
I）シアン化カリウム;1,2−ジイオドエタン、又はアゾ
ジカルボン酸ジメチルエステルもしくはジエチルエステ
ル（これらは、水中で、又は水と水溶和性アルコール、
例えばメタノールとの混合物中で反応する）である。酸
化は好ましくは室温において実施する。

反応条件下で除去することができ、そして方法（ｂ）の
ために適当なメルカプト−保護基は、例えばアセチルア
ミノメチルである。アセチルアミノメチル保護基の場
合、方法（ｂ）は、少量の塩酸が添加された酢酸中で、
酸化剤としてヨウ素を用いて、例えば例に記載するよう
にして有利に行われる。

方法（ｃ） 考慮すべき官能基、それらの保護、及び保護基を除去す
ることによる脱保護は方法（ａ）に記載されている。方
法（ｃ）はまた、例えばメリフィールド合成において使
用され得る担体に結合した保護基の除去を含む。従って
この場合、方法（ｃ）は担体からのペプチド又はペプチ
ドアミドの除去を含む。

方法（ｄ） 形質転換に適当な宿主細胞は、例えば微生物、例えば酵
母、例えばサッカロミセス・セレビシエ−（Saccharomy
ces cervisiae）、及び特に、限酵素又は修飾酵素を有
しない細菌株、特にエシェリシャ・コリ（Escherichia
coli）の株、例えばE.コリ（E.coli）×1776、E.コリ
HB101、E.コリW3110、E.コリHB101/LM1035、E.コリJA22
1〔J.Clarke及びJ.Carbon、J.Mol.Biol 120、517（197
8）〕又はE.コリK12株294、バシルス・ズブチリス（Bac
illus Subtilis）、バシルス・ステアロサーモフィルス
（Bacillus Stearothermophilus）、シュードモナス（P
seudmonas）、ヘモフィルス（Haemophilus）、ストレプ
トコッカス（Streptococcus）、及び他の微生物、並び
に高等生物の細胞、特に樹立されたヒト又は動物のセル
ラインである。好ましい宿主細胞はE.コリの上記の株、
特にE.コリHB101、及びE.コリJA221である。

原理的には、この発明のアミノ酸配列をコードするこの
発明の異種性DNA配列を選択された宿主中で複製しそし
て発現することができるすべてのベクターが適当であ
る。

E.コリの株中でCGRP遺伝子を発現するのに適当なベクタ
ーの例は、バクテリオファージ、例えばバクテリオファ
ージλの誘導体、又は好ましくはプラスミド、例えば特
にプラスミドcolE1及びその誘導体、例えばpMB9、pSF21
24、pBR317又はpBR322である。この発明の好ましいベク
ターはプラスミドpBR322に由来する。適当なベクター
は、完全なレプリコン、並びに表現型特徴により、発現
プラスミドで形質転換された微生物の選択及び同定を可
能にするマーカー遺伝子を含有する。

適切なマーカー遺伝子は、例えば重金属、抗生物質等に
対する耐性を微生物に付与する。さらに、この発明の好
ましいベクターは、レプリコン及びマーカー遺伝子領域
のほかに、この発明のアミノ酸配列をコードするDNA配
列及び場合によっては発現制御配列を挿入することがで
きるように制限エンドヌクレアーゼ認識部位を含有す
る。好ましいベクターであるプラスミドpBR322は、無傷
のレプリコン、テトラサイクリン及びアンピシリンに対
する耐性を付与するマーカー遺伝子（tet^R及びamp^R）、
並びに制限エンドヌクレアーゼ、例えばPstI（amp^R遺伝
子中で開裂せしめ、tet^R遺伝子を無傷のまま残す）、Ba
mHI、HindIII、SalI（tet^R遺伝子中で開裂せしめ、amp^R
遺伝子を無傷のまま残す）、NruI及びEcoRIの１個のみ
存在する一連の認識配列を含有する。

CGRPの発現を制御するために複数の発現制御配列を使用
することができる。特に、形質転換されるべき宿主の強
く発現される遺伝子の発現制御配列が使用される。ハイ
ブリドベクターとしてpBR322を使用しそして宿主微生物
としてE.コリを使用する場合、適当な発現制御配列（こ
れらは特に、プロモーター及びリボゾーム結合部位を含
有する）は、ラクトースオペロン、トリプトファンオペ
ロン、アラビノースオペロン等の発現制御配列、並びに
β−ラクタマーゼ遺伝子の発現制御配列、ファージλＮ
−遺伝子又はファージfd−層蛋白質遺伝子の対応する配
列等である。β−ラクタマーゼ遺伝子（β−lac−gen
e）のプロモーターはプラスミドpBR322中にすでに含ま
れているが、他の発現制御配列がこのプラスミド中に導
入されなければならない。この発明においては、好まし
い発現制御配列はトリプトファンオペロン（trpop）の
それである。

酵母での複製及び発現のために適当なベクターは酵母−
複製開始点及び酵母用選択遺伝子マーカーを含む。酵母
複製開始点、例えば染色体性自律複製セグメント（ar
s）を含有するハイブリドベクターは、形質転換の後酵
母細胞内で染色体外に維持され、そして有糸分裂の間に
自律的に複製される。さらに、酵母２μプラスミドDNA
に相同な配列を含有するハイブリドベクターも使用する
ことができる。このようなハイブリドベクターは、細胞
中にすでに存在する２μプラスミドに組換により組み込
まれるか、又は自律的に複製する。２μ配列は、高形質
転換頻度を有するプラスミドのために特に適当であり、
そして高コピー数を許容する。酵母のために適当なマー
カー遺伝子は特に、宿主に抗生物質性を付与するもの、
又は栄養要求酵母変異株の場合には宿主の傷害を補完す
るものである。対応する遺伝子は例えば、抗生物質シク
ロヘキシミドに対する耐性を付与し、又は栄養要求性酵
母変異株に原栄養性、例えばURA3、LEU2、HIS3、又は特
にTRPI遺伝子を供給する。好ましくは、酵母ハイブリド
ベクターはさらに、ハイブリドベクター及びそれらの前
駆体の造成及びクローニングを１つの細菌宿主中で行う
ことができるように、細菌宿主、特にE.コリのための複
製開始点及びマーカー遺伝子を含有する。酵母での発現
のために適当な発現制御配列は例えばTRP1、ACHI、ADHI
I、PO3又はPHO5遺伝子のそれ、そしてさらに解糖に関与
するプロモーター、例えばPGK及びGAPDHプロモーターで
ある。

この発明のアミノ酸配列の１つをコードするDNA配列及
び発現制御配列を含有し、複製及び発現型選択が可能な
発現ベクターであって、該DNA配列が転写開始及び停止
シグナル並びに翻訳開始及び終止シグナルと共に、該発
現プラスミド中に、該発現制御配列の制御を伴って、こ
の発明の注目のアミノ酸配列が前記発現プラスミドによ
り形質転換された宿主細胞中で発現されるように配列さ
れている。発現ベクターが特に適当である。

効果的な発現を達成するため、この発明のアミノ酸配列
の１つをコードする遺伝子を発現制御配列と正しく（相
を合わせて）配置しなければならない。

発現制御領域を主mRNA起点と該発現制御配列に天然に連
結されている遺伝子コード配列（例えばβ−lacプロモ
ーターを使用する場合にはβ−lacコード配列）のATGと
の間に、目的のアミノ酸配列をコードする遺伝子〔この
遺伝子は好ましくは自らの翻訳開始シグナル及び翻訳終
止シグナル（例えばTAG）を有する〕に連結するのが有
利である。こうして効果的な転写及び翻訳が保証され
る。

例えば、ベクター、特にpBR322を制限エンドヌクレアー
ゼで開裂せしめ、そして場合によっては生ずる線状化さ
れたベクターを変形した後、対応する制限末端が設けら
れた発現制御配列を導入する。発現制御配列は３′−末
端（翻訳の方向に）に制限エンドヌクレアーゼの認識配
列を含有し、その結果、すでに発現制御配列を含有する
ベクターをその制限酵母で消化し、この発明の目的のア
ミノ酸配列をコードする、一致する末端が設けられた遺
伝子を挿入することができる。それぞれ正しい方向に、
及び正しくない方向に遺伝子を含有する２種のハイブリ
ドプラスミドの混合物が得られる。すでに発現制御配列
を含有するベクターをベクターDNA内で第２の制限エン
ドヌクレアーゼ開裂せしめ、そして生じたベクター断片
に、この発明の目的のシミノ酸配列をコードする、正し
い末端が設けられた遺伝子を挿入するのが好ましい。ベ
クターに対するすべての操作は、レプリコン及び少なく
とも１個のマーカー遺伝子の機能が害されないような態
様で行うのが好ましい。

この発明の好ましい態様においては、発現制御配列、特
に、３′−末端（主mRNA起点と第1ATGとの間）に好まし
くは接着末端を形成する制限エンドヌクレアーゼ例えば
EcoRIのための認識配列を担持するトリプトファンオペ
ロン（trp op）の発現制御配列を含有するpBR322由来の
ベクターを前記の制限エンドヌクレアーゼで消化し、そ
してベクター断片中で、平滑末端又は好ましくは接着末
端を形成する第２の制限エンドヌクレアーゼ、例えばBa
mHIで消化し、この後、こうして線状化されたベクター
を、この発明のアミノ酸配列の１つをコードする、対応
する末端（例えば、ATG開始コドンの前のEcoRI末端、及
び翻訳終止コドンの後のBamHI末端）を有する遺伝子と
連結する。この連結は既知の方法により、相補的末端
（接着末端）を対合せしめ、そして例えばT₄DNAリガー
ゼにより連結することにより行う。

合成的に又はmRNAルートにより、ゲノムDNAから得ら
れ、そして対応する接着末端（特にEcoRI及びBamHI末
端）を設けられたCGRP遺伝子はまた、例えば配列分析の
ために多量のCGRP遺伝子を得るために、ベクター、例え
ばpBR322にクローン化することができる。ハイブリドプ
ラスミドを含有するクローンの単離は、例えばCGRP−特
異的な、放射性ラベルされたオリゴデオキヌクレオチド
プローブにより行われる。CGRPの遺伝子の特徴付けは、
例えば、Maxam及びGilbertの方法〔A.M.Maxam及びW.Gil
bert、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、74 560（1977）；さ
らにMeth．Enzym．65、499（1980）を参照のこと〕に従
って行われる。

この発明の発現ベクターによる宿主細胞の形質転換は例
えば、文献、例えばS.セレビシエ−についてはA.Hinnem
等、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、75、1929（1978）;B.ズ
ブチリスについてはAnagnostopoulus等、J.Bacterio
l.、81、741（1961）；そしてE.コリについてはM.Mande
l等、J.Mol.Biol. 53159（1970）に記載されている方
法により行われる。形質転換された宿主細胞の単離は、
発現プラスミドに含有されるマーカー遺伝子がそれに対
して耐性を付与する殺生物剤が添加されている選択栄養
培地から有利に行われる。好ましくは、発現ベクターが
amp^R遺伝子を含有する場合には、栄養培地にアンピシリ
ンが添加される。発現プラスミドを含有しない細胞はこ
のような培地中で破壊される。

この発明また、この発明のペプチドを生産することがで
きる、前記の方法により得られる形質転換された細胞に
関する。

方法（ｄ）に従うこの発明の形質転換された細胞の培養
はそれ自体既知の方法で行われる。例えば、この発明の
形質転換された宿主微生物の培養のために種々の炭素源
を使用することができる。好ましい炭素源の例は、資化
性の炭水化物、例えばグルコース、マルトース、マンニ
トールもしくはラクトース、又は単独でもしくは適当な
混合物として使用され得る酢酸塩である。適当な窒素源
は例えば、アミノ酸、例えばカザミノ酸、ペプチド、及
び蛋白質及びその分解生成物、例えばトリプトン、ペプ
トンもしくは肉エキス；さらには酵毒エキス、マルトエ
キス、そしてさらにアンモニウム塩、例えば塩化アンモ
ニウム、硫酸アンモニウム又は硝酸アンモニウムであ
り、これらは単独で又は適当な混合物として使用するこ
とができる。やはり使用され得る無機塩は例えば、ナト
リウム、カリウム、マグネシウム及びカルシウムの硫酸
塩、塩化物、リン酸塩及び炭酸塩である。

さらに、栄養培地は例えば、増殖促進物質、例えば微量
元素、例えば鉄、亜鉛及びマンガン、並びに好ましく選
択圧を生じさせそして発現プラスミドを喪失した細胞の
増殖を防止する物質を含有する。すなわち、例えば、発
現プラスミドがamp^R遺伝子を含有する場合にはアンピシ
リンが培地に添加される。抗生活性物質のこのような添
加はまた、抗生物質感受性微生物を破壊する効果を有す
る。

培養は、それ自体既知の方法に従って行われる。培養条
件、例えば温度、培地のpH値、及び発酵時間は、この発
明のペプチドの最大力価が得られるように選択する。す
なわち、E.コリ又は酵母菌株は好ましくは、液体培養中
好気的条件下で、振とう又は攪拌しながら、例えば20℃
〜40℃、好ましくは30℃の温度において、そして４〜９
のpH値、好ましくはpH7にて、約４〜20時間、好ましく
は８〜12時間培養する。培養中、発現生成物（CGRP）は
細胞内に蓄積する。

Ｎ−末端メチオニンは、ある宿主細胞においては、翻訳
後に除去され得る。さらに、ある宿主細胞においてはＮ
−末端アミノ酸がアセチル化され得る。

細胞濃度が適当な値に達したとき、培養を停止し、そし
てこの発明のペプチドを微生物の細胞から遊離せしめ
る。この目的のために、細胞を例えば洗剤、例えばSDS
又はトリトンで処理することにより破壊し、あるいはリ
ゾチーム又は同様に作用する酵素により溶解する。前記
の方法に代えて、又は前記の方法に加えて、機械的力、
例えば剪断力（例えばＸ−プレス、フレンチプレス、ダ
イノーミル）、又はガラスビーズもしくは酸化アルミニ
ウムを伴う振とう、又は例えば液体窒素中での凍結と例
えば30〜40℃の解凍の反復、及び超音波を用いて細胞を
破壊することができる。蛋白質、核酸及び他の細胞成分
を含有する得られた混合物を遠心分離した後、それ自体
既知の方法により、この発明のペプチドを包含する蛋白
質成分について濃縮する。すなわち、例えば、非蛋白質
成分のほとんどどがポリエチレンイミン処理により除去
され、そしてこの発明のペプチドを包含する蛋白質は例
えば硫酸アウモニウム又は他の塩により溶液を飽和する
ことによって沈澱する。細菌蛋白質はまた、酢酸で酸性
化する（例えば0.1％、pH4〜５）ことによって沈澱せし
めることができる。この発明のペプチドのこれ以上の濃
縮は酢酸上清液をｎ−ブタノールで抽出することによっ
て達成することができる。他の精製段階は例えば、ゲル
電気泳動、クロマトグラフ法、例えばイオン交換クロマ
トグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、HPLC、
逆相HPLC等、混合物の構成成分の適当なセファデックス
（商標）カラムによる分離、透析、例えば抗体特にモノ
クローナル抗体を用いるアフィニティークロマトグラフ
ィー、及び他の方法、特に文献から知られる方法を包含
する。

例えば、この発明の発現されたペプチドの単離は次の段
階を含んで成る。

◎遠心分離による、培養液からの細胞の分離； ◎例えば細胞溶解酵素による処理及び／又は凍結と解凍
の反復による、細胞の破壊による租抽出物の調製； ◎遠心分離による不要性成分の除去； ◎ポリエチレンイミンの添加によるDNAの沈澱； ◎硫酸アンモニウムによる、この発明のペプチドを包含
する蛋白質の沈澱； ◎モノクローナル抗−CGRP抗体カラム上での、前記沈澱
物を溶解した溶液した溶液のアフィニティークロマトグ
ラフィー； ◎透析又はセファデックスG25上でのクロマトグラフィ
ーによる、得られた溶液からの塩の除去。

上記の方法に代えて、DNAを分離除去した後、細菌蛋白
質を0.1％酢酸により沈澱せしめ、そしてこの発明のペ
プチドを酸性上清液からｎ−ブタノールにより抽出し、
あるいは酸性上清液をイオン交換クロマトグラフィー
（例えばカルボキシメチルセルロース）に直接かけるこ
とができる。他の精製段階はセファデックスG50（又はG
75）上でのゲル濾過、及び逆相HPLCを包含する。塩の除
去はやはりセファデックスG25上で行われる。

この発明のペプチドを検出するために、抗−CGRP抗体
（例えば、ラビットからの抗体又はハイブリドーマ細胞
から得られるモノクローナル抗体）による試験を使用す
ることができる。

方法（ｅ） 目的ペプチド−アミドの末端アミド基のNH₂基に酵素的
に分解することができるアミノ酸AS^Ωは例えばグリシン
である。この場合に適当な酵素は、A.F.Bradbury、M.D.
A.Finnie及びD.G.Smyth、Nature，298,686−688（198
2）に記載されているようにして、脳下垂体、好ましく
はハトの脳下垂体から得ることができる。

適当な酵素の存在下でアンモニアにより置換され得るア
ミノ酸AS^Ωは例えばチロシンである。この場合に適当な
酵素は、例えばカルボキシペプチダーゼＹ（カールスベ
ルグ・バイオチミストリー社、コペンハーゲン、デンマ
ーク）〔例えば、KIaus Breddam等、Carlsberg Res.Com
m. 46,121−128（1981）を参照のこと〕である。

追加の操作 式（Ｉ）の（部分）配列を有しそして塩形成基を有する
化合物の塩は、それ自体既知の方法により製造すること
ができる。例えば、塩基性基より多数の酸性基を含有す
る式（Ｉ）の部分配列を有する化合物の塩は、例えば、
金属化合物、例えば適当なカルボン酸のアルカリ金属
塩、例えばα−エチルカプロン酸のナトリウム塩、又は
無機アルカリ金属塩もしくはアルカリ土類金属塩、例え
ば炭酸水素ナトリウムで処理することにより、あるいは
アンモニア又は適当な有機アミンブ処理することにより
形成することができ、この場合好ましくは理論量の又は
わずかに過剰量の塩形成剤を使用する。式（Ｉ）の配列
を有する化合物の酸付加塩は、常法に従って、例えば酸
又は適当な陰イオン交換剤で処理することにより得られ
る。例えば遊離カルボキシ基及び遊離アミノ基を有す
る、式（Ｉ）の部分配列を有する化合物の内部塩は、例
えば、塩、例えば酸付加塩を、弱塩基によって、又は液
体イオン交換体で処理することによって、等電点まで中
和することにより形成することができる。

塩は常法に従って遊離化合物に転換することができる。
金属塩又はアンモニウム塩は例えば適当な酸で処理する
ことにより遊離化合物に転換することができ、そして酸
付加塩は例えば適当な塩基性剤で処理することにより遊
離化合物に転換することができる。

この発明はまた、この発明のペプチドのアミノ酸配列を
コードするDNA配列に関する。

この発明のDNA配列は、大配列の部分配列として次の式
（IV）、 （配列中、５′−末端から始まるコード鎖のデオキシヌ
クレオチド配列、及びその下方に各トリプレットがコー
ドするアミノ酸が示してあり；そして、 Ａはアデノシルであり、 Ｔはチミジルであり、 Ｇはグアノシルであり、 Ｃはシチジルであり、 ＥはＡ、Ｔ、Ｃ、又はＧであり、 ＮがＣである場合、ＫはＡ、Ｔ、Ｃ、又はＧであり；あ
るいは、 ＮがＡである場合、ＫはＡ、又はＧであり、 ＬはＴ、又はＣであり、 ＭはＡ、又はＧであり、 ＮはＡ、又はＣであり、 ＱはＴ、又はＡであり、 Ｒ及びＳに関しては、ＱがＴである場合、ＲはＣであ
り、そしてＳはＡ、Ｔ、Ｃ、又はＧであり；あるいは、 ＱがＡである場合、ＲはＧであり、そしてＳはＴ、又は
Ｃであり、 ＸはＡ、Ｔ、Ｃ、又はＧであり、 ＹはＴ、又はＣであり、そして、 ＹがＣである場合、ＺはＡ、Ｔ、Ｃ、又はＧであり、あ
るいは、ＹがＴである場合、ＺはＡ、又はＧであり； カッコの前にある“d"は、カッコ内に示されたヌクレオ
チドが２−デオキシ−リボヌクレオシドであることを意
味する） で表わされる。

この発明のDNA配列は、コード鎖中に、好ましくは290以
下の、特に230以下の、特に200以下の、そして好ましく
は150以下の、例えば136個のデオキシヌクレオチドを含
有する。

有利には、この発明のDNA配列の末端には、その製造工
程で容易に、ベクターへの挿入を可能にする基が設けら
れ、例えば、開始コドンATG及び終始コドン、例えばTAG
と共に制限エンドヌクレアーゼの認識配列が設けられ
る。後でペプチド−アミドを製造することが意図される
場合には、ペプチド−アミドの末端アミド基のNH₂基が
それから生ずるように後で酵素的に分解され得るアミノ
酸をコードするコドンを前記DNA配列に設けることがで
きる。このように分解され得るアミノ酸は例えばグリシ
ンである。上記の方法に代えて、後でペプチド−アミド
を製造するために、適当な酵素、例えば特に適当なエキ
ソペプチダーゼ、例えばカルボキシペプチダーゼＹの存
在下でアンモニアにより置換され得るアミノ酸、例えば
特にチロシン、をコードするコドンをDNA配列に設ける
ことができる。

この発明に特にE.コリにより好まれそしてこの発明のペ
プチドのアミノ酸配列をコードするトリプレットを含有
する上記のDNA配列に関する。このようなトリプレット
は特に次のものである。

アラニン（Ala） GCT アルギニン（Arg） CGT グリシン（Gly） GGT システイン（Cys） TGC バリン（Val） GTT ロイシン（Leu） CTG セリン（Ser） TCT スレオニン（Thr） ACC フェニルアラニン（Phe） TTC チロシン（Tyr） TAC メチオニン（Met） ATG アスパラギン酸（Asp） GAC グルタミン酸（Glu） GAA リジン（Lys） AAA イソロイシン（Ile） ATC ヒスチジン（His） CAC プロリン（Pro） CCG グルタミン（Gln） CAG アスパラギン（Asn） AAC 好ましい終止コドン（NON）はコドンTAGである。

コード鎖中に200以下、例えば136のデオキシヌクレオチ
ドを有し、次のDNA配列（IVa）を含有するDNA配列が好
ましい。この配列においては５′−末端から始まるコー
ド鎖のみが示されており、そして一層よく理解できるよ
うに各トリプレットがコードするアミノ酸も示されてい
る。

コード鎖中に200以下、例えば136デオキシヌクレオチド
を有し、次のDNA配列（IV b）を含有するDNA配列が好ま
しい。この配列においては５′−末端から始まるコード
鎖のみが示されており、そして一層よく理解できるよう
に各トリプレットがコードするアミノ酸も示されてい
る。

この発明のDNA配列はそれ自体既知の方法により製造さ
れる。

DNAを合成する方法はS.A.Narang、Tetrahedron，34,3
（1983）により要約されている。既知の合成法は、良好
な収量で、高純度で、そして比較的短時間に、20塩基ま
での長さを有するポリデオキシヌクレオチドの製造を可
能にする。適切に保護されたデオキシヌクレオチドがホ
スホジエステル法〔K.L.Agarwal等、Angew.Chem.，84,4
89（1972）〕により、又は一層効果的なホスホジエステ
ル法〔C.B.Reese,Tetrahedron，34,3143（1972）又はホ
スフィトトリエステル法〔R.L.Letsinger及びW.B.Lunsf
ord,J.Am.Chem.Soc.，98,3655（1976）〕により相互に
連結される。オリゴデオキシヌクレオチド及びポリデオ
キシヌクレオチドの合成の単純化が固相法により可能に
され、この方法においてはデオキシヌクレオチド鎖が適
当なポリマーに結合される。K.Itakura等、J.Am.Chem.S
oc.，103,706（1981）は、固相合成において、個々のデ
オキシヌクレオチドではなく、ホスホトリエステル法に
より連結されたトリデオキシヌクレオチドを使用し、次
にこれを短時間で良好な収率で縮合せしめて、例えば31
塩基を有するポリデオキシヌクレオチドを形成すること
ができる。化学的に製造された短断片から酵素的に確か
な２本鎖DNAを組立てることができる。H.G.Khorana等、
J.Bioi.Chem.，251,565（1976）は、この目的のために
両DNA鎖からのオーバーラップポリデオキシヌクレオチ
ド配列を使用する。これらは塩基対合によって正しい配
置に一緒に保持され、そして次に酵素DNAリカーゼによ
って化学的に連結される。他の可能な方法は、２本のDN
A鎖のそれそれからの、短いオーパーラップセグメント
を有する１本ずつのポリデオキシヌクレオチドを４種類
の必要なデオキシヌクレオシドトリホスフェートの存在
下で、DNAポリメラーゼ、例えばDNAポリメラーゼＩ、ポ
リメラーゼＩのKlenow断片、T₄DNAポリメラーゼ、又はA
MU（鳥類骨髄芽球症ウィルス）逆転写酵素と共にインキ
ャベートすることを含んで成る。この方法においては、
２つのポリデオキシヌクレオチド配列が塩基対合によっ
て正しい配置に一緒に保持され、そして酵素により必要
なデオキシヌクレオチドで補完されて完全な２本鎖DNA
が形成される〔S.A.Narang等、Anal.Biochem.，121，35
6（1982）〕。K.Itakura等、J.Biol.Chem. 257,9226
（1982）は、この原理に基いて、ヒト白血球インターフ
ェロンα₂−遺伝子の132塩基対の長さのセグメントをDN
AポリメラーゼＩ（Klenow断片）の存在下で、39〜42塩
基の長さを有する化学合成された４個の断片から組み立
てることができる方法を記載する。この方法において
は、リガーゼのみを用いる上記の方法に比べて、化学合
成の40％の節約が達成される。

この明細書に記載するこの発明のDNA配列合成方法は次
の段階により特徴付けられる。

α）適切に保護されたデオキシヌクレオチドを固体単体
に結合せしめ； β）適切に保護されたジ−、トリ−、又はテトラーデオ
キシヌクレオチドをホスホトリエステル法又はホスフィ
ト法により製造し； γ）担体に結合したデオキシヌクレオチド又はオリゴデ
オキシヌクレオチドを、ホスホトリエステル法又はホス
フィト法に従って、適切に保護されたモノ−デオキシヌ
クレオチド、又はジ−、トリ−もしくはテトラーデオキ
シヌクレオチド〔（β）に従って製造されたもの〕と連
結し； δ）担体に結合しておりそして所望の数の塩基を有する
（γ）に従って得られるオリゴデオキシヌクレオチドを
担体から切り離し、所望により精製し、保護基を除去
し、そして遊離の５′−末端ヒドロキシ基をリン酸化
し； ε）３個以下そして好ましくは８〜15個のオーバーラッ
プ塩基対を有する、コード鎖及び相補鎖からの、δ）に
従って得られた２つのオリゴデオキシヌクレオチドを、
４種類のデオキシヌクレオシドトリホスフェートの存在
下でDNAポリメラーゼを用いて補完してCGRP遺伝子を含
有する２本鎖DNA断片を形成し、そしてリガーゼを用い
て連結して目的の構造遺伝子を形成する。

従って、式（IV）のDNA配列の合成は、例えば、固相法
に従って成長中のヌクレオチド配列上に段階的にトリヌ
クレオチドブロックを縮合せしめることにより２種類の
オリゴデオキシヌクレオチド、すなわちおよそ同じ数の
塩基を有する負鎖及び正鎖（これらのオリゴデオキシヌ
クレオチドは部分領域において相互に水素結合を形成す
る能力を有する）を形成し、個々のヌクレオチド鎖を固
体担体から切り離し、存在するすべての保護基を除去
し、例えばゲル電気泳動によって精製を行い、そしてキ
ナーゼ処理及びハイブリド形成を行った後、好ましくは
DNAポリメラーゼＩ（Klenow断片）により完全なDNAデュ
プレックスを組み立てることにより実施することができ
る。

段階（α）において、多数の固体担体材料、例えば種々
の架橋及び膨潤特性を有するポリスチレン、ポリアクリ
ルアミド、ポリアクリルアミドコポリマー、例えばシリ
カゲル、もしくはアロックスのごとき無機材料上に保持
されたポリアミド、又は官能化されたシラン、を使用す
ることができる。好ましい態様においては、使用される
固体担体材料は架橋されたポリスチレンであり、これ
は、それ自体既知の方法により、１〜５個の極性２価官
能基、例えばイミノ、オキソ、チオ、オキソカルボニル
又はアミドカルボニルにより中断された２〜12個の炭素
原子を有するアルキレン基ごとき“スペーサー”によ
り、適切に保護されたデオキシヌクレオシドの５′−OH
基に連結される。５′−位において、及び場合によって
は塩基成分において保護されている式（Ｖ）のヌクレオ
シドと無水コハク酸との反応が特に好ましい（スキーム
１）。この式において、R¹は酸によって除去され得る保
護基、例えばトリアリールメチル保護基、例えば４−メ
トキシトリチル基もしくは4,4′−ジメトキシトリチル
基、又はトリ−低級アルキルシリル保護基、例えばtert
−ブチルジメチルシリル基であり、そしてBaはチミル、
シトシル、アデニル及びグアニルから成る群から選択さ
れる場合によっては保護されている塩基である。スキー
ム１においては、場合によっては塩基、例えばピリジ
ン、トリエチルアミン又はジメチルアミノピリジンの存
在下で前記の反応を行い、次に、カルボン酸基を活性化
する試薬、好ましくはＮ−ヒドロキシサクシンイミド又
はｐ−ニトロフェノール、及び脱水剤、例えばカルボジ
イミド、例えばジシクロヘキシルカルボジイミドの助け
により、0.5〜２％のジビニルベンゼンにより架橋され
たアミノメチル化ポリスチレンと反応せしめる。スキー
ム１及びその後において、デオキシリボース残基はしば
しば習慣的に縮めた形で示される。

反応は、不活性非プロトン性溶剤、例えばピリジン、テ
トラヒドロフラン、ジオキサン、酢酸エチル、クロロホ
ルム、塩化メチレン、ジメチルホルムアミドもしくはジ
エチルアセタミド、又はこれらの混合物中で、室温にて
又はわずかに上昇もしくは低下した温度にて、例えば約
−10℃〜約50℃の温度範囲内で、好ましくは室温にて行
われる。脱水剤の存在下での反応は一層低い温度、例え
ば約０℃にて行うことができる。

段階（β）におけるジ−、トリ−、又はテトラ−ヌクレ
オチドのこの発明に従う製造（スキーム２）において
は、５′−位において、そして場合によっては塩基成分
において保護されておりR¹及びBaが前記の意味を有する
式（Ｖ）のヌクレオチドを、場合によっては脱水剤の存
在下又は塩基の存在下で、式（VII）の活性化されたリ
ン酸エステルと反応せしめる。式中X¹及びX²は相互に独
立にヒドロキシもしくはそれに由来する塩、ハロゲン、
イミダゾリル、1,2,4−トリアゾール−１−イル、テト
ラゾリル、又は１−ベンズトリアアゾリルオキシであ
り、X₂はさらに２−シアノエトキシ、２−トリハロエト
キシ、２−アリールスルホニルエトキシ、２−低級アル
キルチオエチル、２−アリールチオエトキシ、又は２−
（４−ニトロフェニル）−エトキシであり、そしてR²は
塩基により又は親核性化合物により、例えば水酸化アン
モニウム、チオフェノラートもしくはアリールアルドキ
シメートにより除去され得る保護基、例えば場合によっ
てはハロゲン、ニトロ及び／又は低級アルキルにより置
換されているフェニル、メチル、又は場合によってはニ
トロにより置換されているベンジルであり、あるいは金
属イオンにより除去され得る保護基例えば８−キノリ
ル、又は５−クロロ−８−キノリルである。

次に、R¹、X¹及びX²が前記の意味を有する得られた式
（VIII）の化合物をまず場合によっては２−置換エタノ
ール（これは、基X²を基RO³に転換する。ここでR³はシ
アノエチル、２−トリハロエチル、２−アリールスルホ
ニルエチル、２−低級アルキルチオエチル、２−アリー
ルチオエチル又は２−（４−ニトロフェニル）−エチル
である）と反応せしめ、そして次に保護基R¹を除去し、
そして式（IX）の生じた化合物を、場合によっては脱水
剤の存在下又は塩基の存在下で、式（VIII）の他の化合
物と反応せしめてジヌクレオチドＸを形成する（スキー
ム２）。場合によっては、式（VIII）の化合物を、塩基
及び水との反応によりX²がヒドロキシ又はそれに由来す
る塩である式（VIII）の異る化合物に転換する。

反応は上記の不活性溶剤のいずれかの中で、室温して、
又はわずかに上昇もしくは低下した温度において、例え
ば室温において行う。

保護基R¹の除去は、例えば酸、例えば鉱酸、例えば塩酸
もしくは硫酸、カルボン酸、例えば酢酸、トリクロロ酢
酸もしくは蟻酸、スルホン酸、例えばメタンスルホン
酸、もしくはｐ−トルエンスルホン酸、又は特にルイス
酸、例えば塩化亜鉛、臭化亜鉛、塩化アルミニウム、ジ
アルキルアルミニウムハライド、例えばジブチル−もし
くはジエチル−アルミニウムクロリド、又は三弗化ホウ
素により、10℃〜50℃にて、特に室温にて行う。ジアル
キルアルミニウムハライドを使用する場合、除去は親脂
性溶剤、特にトルエン中で行う、そして他の上記のルイ
ス酸を用いる場合、ハロゲン化炭化水素、例えば塩化メ
チレンと低級アルカノール、例えばエタノール又はイソ
プロパノールとから成る溶剤混合物中で行う。

式（Ｘ）のジヌクレオチドはまた、R¹及びBaが前記の意
味を有する式（Ｖ）のヌクレオチドを式（VII A）のホ
スフィトと反応せしめることによっても製造することが
できる。ここでX¹はハロゲン、特に塩素であり、X²はハ
ロゲン、特に塩素、又はジ−低級アルキルアミノ、特に
ジメチルアミノもしくはジイソプロピルアミノ、又はモ
ルホリノ、ピペリジノ又はピロリジノであり、そしてR²
は式（VII）についての前記の意味を有し、特にメチル
である。前記の反応は場合によっては適当な塩基の存在
下で行われる（スキーム３）。式（VIII A）の生ずる化
合物を２−置換エタノール（これは基X²を基OR³に転換
する。ここでR³は上記の意味を有する）と反応せしめ、
そして次に酸化剤、例えば塩基の存在下でのヨウ素で酸
化してホスフェートを形成し、そして保護基R¹を除去し
て式（IX）の化合物を得るか、あるいは式（IX）の化合
物と反応せしめ、次に酸化剤、例えば塩基の存在下での
ヨウ素で酸化して（Ｘ）の化合物を形成する。

トリヌクレオチドの製造のために、R¹，R²及びR³が前記
の意味を有しそしてRa¹及びBa²が相互に独立にチミル、
シトシル、アデニル又はグアニルである式（Ｘ）のジヌ
クレオチド中の保護基R¹を除去し、そして生ずる化合物
を、場合によっては脱水剤の存在下又は塩基の存在下で
式（VIII）の化合物と反応せしめるか、あるいは式（VI
II A）の化合物と反応せしめそして次に酸化して式（X
I）の化合物を得る（スキーム４）。保護基R¹の除去、
及び式（XI）のトリヌクレオチドを形成するための縮合
は、式（Ｘ）のジヌクレオチドの製造について記載した
のと同様にして行われる。

テトラヌクレオチドの製造のため、式（XI）のトリヌク
レオチドを、式（Ｘ）のジヌクレオチドについて前記し
たようにして反応せしめる。

好ましい配置においては、保護基R¹として４−メトキシ
トリチル基を、保護基R²として塩素で置換されたフェニ
ル基を、そして保護基R³として２−シアノエチル基を使
用する。式（VII）の化合物中の基X¹及びX²として１−
ベンズトリアゾリルオキシが好ましい。

式（XI）のトリヌクレオチドは好ましくは、式（Ｘ）の
ジヌクレオチドから保護基R¹を除去し、そして生じる化
合物を、X²がヒドロキシ又はそれに由来する塩である式
（VIII）の化合物と、脱水剤の存在下で反応せしめる
（スキーム４）ことにより製造される。この発明の脱水
剤は例えば、2,4,6−トリメチルベンゼンスルホニル又
はトリイソプロピルベンゼンスルホニルクロリド、イミ
ダゾール、テトラゾール、又は1,2,4−トリアゾール
（場合によってはニトロにより置換されている）であ
る。１−（2,4,6−トリメチルベンゼンスルホニル）−
３−ニトロ−1,2,4−トリアゾール（XII）が脱水剤とし
て好ましい。

使用されるヌクレオチドは好ましくは遊離アミノ基が塩
基成分において保護されているものである。好ましい保
護基は、アテニンのためにはベンゾイルであり、シトシ
ンのためにはベンゾイル又は４−メトキシベンゾイルで
あり、そしてグアニンのためにはイソブチリル又はジフ
ェニルアセチルである。チミンは、好ましくは保護基な
しで使用される。

段階（γ）に従うオリゴヌクレオチドの製造において、
溶剤及び試薬のために、半自動的又は全自動的マイクロ
プロセサー制御供給系を有するそれ自体既知の装置が使
用される。段階（α）に従って製造された式（VI）の化
合物中の保護基R¹を上記のようにして除去し、そして次
に、生じる化合物を、場合によっては脱水剤の存在下又
は塩基の存在下で式（VIII）の化合物と反応せしめる
か、あるいは式（VIII A）と反応せしめるか、あるいは
式（Ｘ）又は（XI）の化合物と反応せしめる。この場
合、保護基R³は塩基によりあらかじめ除去しておく（R³
としての基２−シアノエチルは例えば、トリ−低級アル
キルアミン、例えばトリエチルアミンにより、前記の不
活性溶剤又は溶剤混合物のいずれかの中で、10℃〜40
℃、特に室温にて除去される）。式（Ｘ）のジヌクレオ
チド又は式（XI）のトリヌクレオチドの代りに、段階
（β）に従って製造されたテトラヌクレオチドを使用す
ることが可能である。式（VIII A）のホスフィトを使用
する場合、次に、酸化剤、例えば塩基の存在下でのヨウ
素により処理する。R¹，R²及び、Baが前記の意味を有
し、そしてｎが１〜４の整数である、このようにして製
造された式（XIII）の化合物を、式（XIII）の化合物
（ｎは整数である）の製造のために必要なだけ、式（V
I）の化合物について記載した反応段階〔R¹の除去；（V
III）、（VIII A）、（Ｘ）、（XI）又は対応するテト
ラヌクレオチドとの対応；場合によっては後酸化処理〕
にかける。

この発明の好ましい態様においては、保護基R¹として４
−メトキシトリチルを使用し、そしてこの基の除去はCH
−又はNH−酸化合物、特に1,2,4−トリアゾール又はテ
トラゾールの存在下での臭化亜鉛により行われる。４−
メトキシトリチル保護基を除去するための例えば1,2,4
−トリアゾールの使用は新規であり、そして驚くべきこ
とに急速で且つ副反応を伴わない高収率の除去をもたら
す。非プロトン性溶剤とアルコール、例えば塩化メチレ
ンと２−プロパノールとから成る溶剤混合物中で20:1〜
100:1のモル比の臭化亜鉛及び1,2,4−トリアゾールを使
用するのが好ましい。

好ましい態様においては、保護基R¹が除去されている式
（VI）又は式（XIII）の化合物と保護基R³が除去されて
いる式（XI）のトリヌクレオチドとを、脱水剤、例えば
2,4,6−トリメチルベンゼンスルホニルクロリドもしく
はトリイソプロピルベンゼンスルホニルクロリド、イミ
ダゾール、テトラゾール又は場合によってはニトロによ
り置換されている1,2,4−トリアゾールの存在下で反応
せしめる。１−（2,4,6−トリメチルベンゼンスルホニ
ル）−３−ニトロ−1,2,4−トリアゾール（XII）が特に
好ましい。

保護基R¹として４−モノメトキシトリチル基を使用し、
R¹を除去するために1,2,4−トリアゾールの存在下で臭
化亜鉛を使用し、そして保護基が除去されている式（XI
II）のオリゴヌクレオチド−ポリスチレン樹脂と保護基
が除去されている式（XI）のトリヌクレオチドとの反応
のための脱水剤として式（XII）のトリアゾールを使用
することを含んで成る特に好ましい組合わせにより、短
時間で、高収率で、そして高純度で、長いヌクレオチド
を製造することが可能となる。

担体からオリゴヌクレオチドを切り離すため、及び段階
（δ）に従って保護基を除去するために、それ自体既知
の方法が使用される。担体からの切り離し、及び好まし
い２−クロロフェニル保護基の除去のための特に好まし
い試薬はアリールアルドキシメート、例えば1,1,3,3−
テトラメチルグアニジニウム２−ニトロベンザルドキシ
メートである。反応は、幾らかの水が添加された上記の
不活性溶剤のいずれか、例えば95％濃度のピリジン中
で、室温にて行われる。次に、室温又は上昇した温度、
例えば20℃〜70℃、特に50℃において水性アンモニアと
の反応を行う。

オリゴデオキシヌクレオチドの連結のために、段階
（δ）に従って５′−末端ヒドロキシ基にリン酸基を導
入する。リン酸基の導入（リン酸化）は、それ自体既知
の方法で、ATPの存在下でT₄ポリヌクレオチドキナーゼ
を用いて行う。

コードDNA鎖及び相補DNA鎖から成る、上記のようにして
製造されたオリゴヌクレオチドは３個以上、そして好ま
しくは８〜15個のオーバラップする塩基対から成るオー
バーラップ配列を含有する。このようなオリゴヌクレオ
チド対は、混合中に水素結合により一緒に保持される。
突出する単鎖末端は、段階（ε）に従って、４種類のデ
オキシヌクレオチドトリホスフェート（dATP、dCTP、dG
TP、及びTTP）の存在下でDNAポリメラーゼ、例えばDNA
ポリメラーゼＩ、DNAポリメラーゼＩのKlenow断片もし
くはT₄DNAポリメラーゼ、又はAMV逆転写酵素を用いて行
う相補鎖の合成のためのマトリクス（鋳型）として機能
する。補完の間に形成されたデュプレックスDNAは平滑
末端を有する。

段階（ε）従って得られるDNA配列はその末端に制限エ
ンドヌクレアーゼにより認識されそして開裂され得るヌ
クレオチド配列を有する。ヌクレオチド配列、そしてそ
れ故に制限エンドヌクレアーゼの選択に依存して、開裂
の間に完全塩基対合末端（平滑末端）、又はオーバーラ
ップDNA鎖を有する末端（接着末端）が形成される。

この発明はまた医薬製剤に関し、この医薬製剤は活性成
分として有効量の、特に前記の疾患の治療のために有効
な量のこの発明のペプチド−アミドのいずれか又はその
塩を、有意量の、すなわち50重量％以上の、好ましくは
95重量％以上の、特に99重量％以上の医薬担体と共に含
んで成り、このような製剤は、特に、温血動物、例えば
特にヒトに鼻内的又は非経腸的に、例えば筋肉内又は静
脈内に投与するためのものである。

活性成分の投与量は温血動物の種、体重、年齢、固体の
状態、治療されるべき疾患、及び投与の態様に依存す
る。

非経腸投与のためのこの新規な医薬製剤は、すぐに使用
するための形態において、約0.0001重量％〜約１重量
％、好ましくは約0.0005重量％〜約0.1重量％の活性成
分を含有する。この発明の医薬製剤は例えば単位投与
形、例えばアンプルの形であることができる。

好ましくは、活性成分の溶液、そしてさらに懸濁液、特
に等張水性溶液又は懸濁液が使用され、そしてこれら
は、例えば、それ自体として又は担体、例えばマンニト
ールと共に活性成分を含有する凍結乾燥製剤の場合に
は、使用する前に調製することができる。特に鼻内投与
のためには、油中懸濁液が特に適当である。医薬製剤は
無菌化することができ、そして／又は添加剤、例えば防
腐剤、安定剤、湿潤剤及び／又は乳化剤、溶解剤、浸透
圧調整塩及び／又は緩衝剤を含有することができ、そし
てそれ自体既知の方法により、例えば常用の溶解及び凍
結乾燥技法により製造される。前記の溶液又は懸濁液は
増粘剤、例えばナトリウムカルボキシメチルセルロー
ス、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリ
ビニルピロリドン、又は好ましくはゼラチンを含有する
ことができる。

油中懸濁液は、油状成分として注射用として一般的な植
物油、合成油又は半合成油を含有する。酸成分として８
〜22個、特に12〜20個の炭素原子を有する長鎖脂肪族、
例えばラウリン酸、トリデシル酸、ミリスチン酸、ペン
タデシル酸、パルミチン酸、マルガリン酸、ステアリン
酸、アラキジン酸、ベヘン酸又は対応する不飽和酸、例
えばオレイン酸、エライジン酸、エルシン酸、ブランジ
ン酸又はリノレン酸を含有する液体脂肪酸エステルを特
に挙げることができる。アルコール成分は最高６個の炭
素原子を有し、そして一価アルコール又は多価アルコー
ル、例えば一価アルコール、二価アルコール又は三価ア
ルコール、例えばメタノール、エタノール、プロパノー
ル、プタノールもしくはペンタノール又はこれらの異性
体、しかし特にグリコール又はグリセリンである。従っ
て例えば、脂肪酸エステルとして、オレイン酸エチル、
ミリスチン酸イソプロピル、パルミチン酸イソプロピ
ル、“Labrafil M 2735"（トリオレイン酸ポリオキシエ
チレングリセリン、メスルス・ガテフォセ、パリ）、
“Miglyol 812"（C₈〜C₁₂の鎖長を有する飽和脂肪酸の
トリグリセライド、メスルス・チミッシェ・ベルチ、リ
ッテン／ルール、独）、しかし特に植物油、例えば綿実
油、アーモンド油、オリーブ油、ヒマシ油、ゴマ油、大
豆油、及び特にピーナツ油を挙げることができる。

注射剤の製造、アンプル又はバイアルへのその導入、及
び容器の密封は常法に従って無菌条件下で行われる。

次に、例によりこの発明を説明する。温度は℃で示す。

R_f値は、特にことわらない限り、又は文脈から明かでな
い限り、次の溶剤系I: ジクロロメタン／メタノール（9:1） において、薄層シリカゲルプレート上で確認されたもの
である。

従って、例えばR_f（Ｉ）は溶剤系Ｉにおいて確認された
R_f値を示す。

略号 Acm ＝アセタミドメチル Boc ＝tert−ブトキシカルボニル BSA ＝ウシ血清アルブミン BZL ＝ベンジル 2CZ ＝２−クロロベンジルオキシカルボニル ｄ ＝デオキシ DMF ＝ジメチルホルムアミド DTT ＝1,4−ジチオスレイトール（1,4−ジメルカプト
−2,3−ブタンジオール） EDTA ＝エチレンジアミン四酢酸 EtBr ＝エチジウムブロミド FAB ＝急速原子衝撃 Fmoc ＝９−フルオレニルメトキシカルボニル HPLC ＝高圧液体クロマトグラフィー iBu ＝イソブチリル Ｍ ＝モル濃度 MBHA ＝モノ−（４−メチル）−ベンズヒドリルアミン Me ＝メチル mmt ＝（モノ−４−メトキシ）−トリチル MOB ＝４−メトキシベンジル MS ＝マススペクトル Mtr ＝４−メトキシ−2,3,6−トリメチルベンゼンス
ルホニル Ｎ ＝規定濃度 OD ＝光学濃度 SDS ＝ドデシル硫酸ナトリウム tBU ＝tert−ブチル TNE ＝100mM NaCl,50mM tris.HCl（pH7.5）及び5mM E
DTAを含有する溶液 TOS ＝４−トルエンスルホニル tris ＝トリス−（ヒドロキシメチル）アミノメタン tris.HCl＝trisの一塩酸塩 ｖ又はvol.＝容積（体積） XANT＝９−キサンセニル 例1. 2.0mlの50％酢酸中15mg（3.8μmol）のAla−Cys（Acm）
−Asn−Thr−Ala−Thr−Cys（Acm）−Val−Thr−His−A
rg−Leu−Ala−Gly−Leu−Leu−Ser−Arg−Ser−Gly−G
ly−Met−Val−Lys−Ser−Asn−Phe−Val−Pro−Thr−A
sn−Val−Gly−Ser−Lys−Ala−Phe−NH₂の溶液を、室
温にて５分間以内に、攪拌しながら、氷酢酸中0.1Mヨウ
素0.26ml、50％の酢酸0.33ml及び16μｌの0.1N HClの混
合物に滴加する。室温にて10分間置いた後、混合物を40
μｌの1Mアスコルビン酸水溶液の添加によって脱色し、
そして50％酢酸中セファデックス（商標）Ｇ−25に通し
て濾過する。溶出液を真空中で約1mlに濃縮し、そして
後記述のようにしてHPLC精製にかける。

次の式（III）のCGRPIIが得られる。

出発物資は次のようにして得られる。

段階1.1 30.0gのクロロメチルポリスチレン（20.1mmolのCl）
を、6.1g（40.2mmol）のｐ−ヒドロキシメチル安息香酸
と共に、150mlの脱気したジメチルホルムアミド中に導
入し、そして３分間にわたり6.0ml（40.2mmol）の1,8−
ジアザビシクロ（5,4,0）−ウンデク−７−エン（1,5,
5）を加える。反応混合物を50℃にて20時間攪拌する。
得られる樹脂を吸引濾過し、150mlずつのジメチルホル
ムアミド、ジメチルホルムアミド／水（9:1）、メタノ
ール、塩化メチレン及びメタノールで、各場合に３回ず
つ洗浄する。この樹脂を重量が一定になるまで高真空下
で乾燥し、こうしてヒドロキシベンジル−ｐ−カルボニ
ルオキシメチルポリスチレン合成樹脂を得る。

段階1.2 1.1g（4mmol）のBoc−Phe及び段階1.1で得られた樹脂3.
0g（約2mmol）を、室温にてゆるやかに攪拌しながら約
５分間、20mlの塩化メチレン及び1.5mlのジメチルホル
ムアミド中に懸濁する。この混合物を０℃〜５℃に冷却
し、そして1.8mlの塩化メチレン中865mg（4.2mmol）の
ジシクロヘキシルカルボジイミドを３回に分けて５分間
以内に加える。さらに５分間の後、24mg（0.2mmol）の
ジメチルアミノピリジン、及び10分間後、1mlの塩化メ
チレン中220μｌのＮ−メチルモルホリン（2mmol）を加
える。この混合物を０℃に１時間保持し、そして次に室
温にて20時間保持する。この樹脂を濾取し、約50mlずつ
塩化メチレン、ジメチルホルムアミド、メタノール、塩
化メチレン及びメタノールにより、各場合に５回ずつ洗
浄する。このものは、高真空下で乾燥した後3.34gの重
量を有する。未反応のヒドロキシ基をブロックするた
め、樹脂を20mlの塩化メチレンに懸濁し、1mlのピリジ
ンを加え、そして氷浴中で冷却した後、これに1mlの塩
化ベンゾイルを加える。０℃にて15分間及び室温にて１
時間置いた後、樹脂を吸引濾取し、そして50mlずつの塩
化メチレン、ジメチルホルムアミド、メタノール、塩化
メチレン及びメタノールにより、各場合に２回ずつ、次
々と洗浄する。この樹脂を、重量が一定なるまで高真空
下で乾燥する。Ｎ含量からアミノ酸負荷を0.35mmol/gと
算定する。

段階1.3 1.0gのBoc−Phe樹脂（0.35mmol）を、半自動ペプチド合
成機中で、次の操作（すべての洗浄操作は、各場合に約
20mlにより行う）にかけて、Boc基を除去し、第２アミ
ノ酸Boc−Alaにカップリングせしめ、そしてそのBoc基
を除去する。

１×1.0分間 イソプロパノール、 ３×0.5分間 エチレンジクロリド、 ３×5.0分間,1×15分間 Boc基を除去するためトリフル
オロ酢酸／エチレンクロリド、 ３×0.5分間 エンレンジクロリド、 １×2.0分間 イソプロパノール、 ２×0.5分間 エチレンジクロリド、 ２×0.5分間 脱気したジメチルアセタミド、 ３×2.0分間 ジエチルアセタミド中２％ジイソプロピ
ルエチルアミン、 ２×0.5分間 エチレンジクロリド、 ３×0.5分間 蒸留したジメチルアセタミド、 １×120分間 カップリング:1.5mmolのBoc−Ala,221mg
（1.5mmol）のヒドロキシベンゾトリアゾール、320mg
（1.6mmol）のジシクロヘキシルカルボジイミド（0.32m
lのエチレンジクロリド及び3.5mlのジメチルアセタミド
中）:20分間室温にて、100分間45°にて、 １×2.0分間 10mlの無水酢酸／ピリジン／ジメチルア
セタミド（10:10:80、v/v）（未反応アミノ基をブロッ
クするため）、 １×0.5分間 脱気したジメチルアセタミド、 １×1.0分間 イソプロパノール、 ２×0.5分間 エチレンジクロリド、 ２×0.5分間 脱気したジメチルアセタミド、 １×1.0分間 イソプロパノール ３×0.5分間 エチレンジクロリド、 ３×5.0分間,1×15分間 トリフルオロ酢酸／エチレン
クロリド（Boc基を除去するため）、 ３×0.5分間 エチレンジクロリド、 １×2.0分間 イソプロパノール、 ２×0.5分間 エチレンジクロリド、 ２×0.5分間 脱気したジメチルアセタミド、 ３×2.0分間 ジメチルアセタミド中２％ジイソプロピ
ルエチルアミン、 ２×0.5分間 エチレンジクロリド、 ３×0.5分間 蒸留したジメチルアセタミド、 段階1.4 前記のペプチド合成機中で、段階1.3に従って得られた
生成物に次のアミノ酸を次々と縮合せしめる。

Fmoc−Lys（Boc）,Fmoc−Ser（tBu）,Fmoc−Gly,Fmoc−
Val,Fmoc−Asn,Fmoc−Thr（tBu）,Fmoc−Pro,Fmoc−Va
l,Fmoc−Phe,Fmoc−Asn,Fmoc−Ser（tBu）,Fmoc−Lys
（Boc）,Fmoc−Val,Fmoc−Met,Fmoc−Gly,Fmoc−Gly,Fm
oc−Ser（tBu）,Fmoc−Arg（Mtr）,Fmoc−Ser（tBu）,F
moc−Leu,Fmoc−Leu,Fmoc−Gly,Fmoc−Ala,Fmoc−Leu,F
moc−Arg（Mtr）,Fmoc−His（Fmoc）,Fmoc−Thr（tB
u）,Fmoc−Val,Fmoc−Cys（Acm）,Fmoc−Thr（tBu）,Fm
oc−Ala,Fmoc−Thr（tBu）,Fmoc−Asn,Fmoc−Cys（Ac
m）及びBoc−Ala。

このため、各場合に次の操作サイクルを行う。各場合に
先行するアミノ酸からFmoc保護基が除去される。

１×1.0分間 イソプロパノール、 ２×0.5分間 エチレンジクロリド、 １×0.5分間 脱気したジメチルアセタミド、 １×1.0分間 イソプロパノール、 ３×0.5分間 脱気したジメチルアセタミド、 ４×2.0分間 ジメチルアセタミド中20（Vol）％ピペリ
ジン、 ２×0.5分間 脱気したジメチルアセタミド、 ２×1.0分間 水／過酸化物不含有ジオキサン（1:2 v/
v）、 ２×0.5分間 脱気したジメチルアセタミド、 ２×0.5分間 エチレンジクロリド、 ３×0.5分間 蒸留したジメチルアセタミド、 81×120分間 カップリング:1.5mmolのFmoc−アミノ
酸、又は末端においてBoc−Ala、221mg（1.5mmol）のヒ
ドロキシベンゾトリアゾール、320mg（1.6mmol）のジシ
クロヘキシルカルボジイミド（0.32mlのエチレンジクロ
リド及び3.5mlのジメチルアセタミド中）:20分間室温に
て、100分間45°にて、 １×2.0分間 10mlの無水酢酸／ピリジン／ジメチルア
セタミド（10:10:80、v/v）、 １×0.5分間 脱気したジメチルアセタミド、 １×1.0分間 イソプロパノール、 ３×0.5分間 エチレンジクロリド、及び ２×0.5分間 脱気したジメチルアセタミド。

カップリング反応の完了はニンヒドリンによる未反応ア
ミノ基の検出（Kaiserテスト）により定性的に試験す
る。この試験が陽性であれば樹脂をエチレンクロリド洗
浄し、そして3.8mlのエチレンジクロリド／トリフルオ
ロエタノール（75:25）中1.5mmolのアミノ酸誘導体及び
1.6mmolのジシクロヘキシルカルボジイミドを用いる次
のカップリング反応を室温にて120分間行う。最後のカ
ップリングの後、樹脂をジメチルアセタミド、エチレン
ジクロリド及びイソプロパノールで十分に洗浄し、そし
て高真空下で乾燥する。

段階1.5 tBu及びBoc保護基を除去するため、段階1.4に従って得
られた生成物を室温にて次のようにして処理する（各場
合に30ml）。

２×２分間 塩化メチレン、 １×５分間 トリフルオロ酢酸／塩化メチレン/1,2−エ
タンジチオール/m−クレゾール（50:43:2:5）、 １×30分間 トリフルオロ酢酸／塩化メチレン/1,2−エ
タンジチオール/m−クレゾール（50:43:2:5）、 １×60分間 トリフルオロ酢酸／塩化メチレン/1,2−エ
タンジチオール/m−クレゾール（50:43:2:5）、 １×２分間 塩化メチレン及び １×２分間 メタノール。

段階1.6 樹脂からペプチドを切り離すため及び末端カルボキシ基
をアミド化するため、段階1.5に従って得られた生成物
を、高真空下で乾燥した後、30mlのジメチルホルムアミ
ドに懸濁する。−70℃において約10mlのアンモニアを凝
縮させる。過剰のアンモニアを０℃にて蒸発除去し、そ
して混合物を圧力容器中で室温にて20時間攪拌する。樹
脂を濾去し、水で２回（20mlずつ）、メタノール／水
（1:1）で３回、及びトリフルオロエタノール／水（1:
1）で10回洗浄し、そして濾液を蒸発濃縮する。残渣を3
0mlの酢酸／水（9:1）に溶解し、そして凍結乾燥する。

段階1.7 Mtr基を除去するため、段階1.6に従って得られた凍結乾
燥物を、20mlのトリフルオロ酢酸/1,2−エタンジチオー
ル（99:1）中に溶解する。1.5mlのｍ−クレゾールを加
え、そして混合物を50℃にて２時間保持する。粗ジ−Ac
mペプチドを100mlのジエチルエーテルの添加によって沈
澱せしめ、濾取し、そしてジエチルエーテルで洗浄す
る。生成物を25mlの酢酸／水（1:1）に溶解し、濁りを
濾去し、そして濾液をHPLC中での分析的分離のために使
用する。

HPLCは次の条件下で行う。

カラム：ヌクレオシル（Nucleocil）10μｍC₁₈（マセレ
イ・ナーゲル、デュレン、西独）、200×4.8mm、Ｂ液０
％〜90％、60分間の直線グラジエント。A:水中0.1％ト
リフルオロ酢酸;B:アセトニトリル中0.1％トリフルオロ
酢酸。

主ピークに対応する物質を集め、そしてそれと目的生成
物との同一性をFAB−MSにより確認する（マスピーク:39
37.6）。

少量調製分離:100mgの粗生成物を250×21mmカラムで分
離する。集めた画分を真空蒸発せしめる。残渣を2mlの
水に溶解し、濾過し、そして凍結乾燥する。

例2. 次の式（XIV）、 で表わされるDNA挿入部を有するプラスミドを含有する
エッシェリシャ・コリのクローンを5mlのＬ培地中で、
一夜（16時間）、37℃にて250回／分で培養する。Ｌ培
地の組成は次の通りである。

バクトトリプトン 10g バクト酵母エキス 5g NaCl 5g グルコース 5g アンピシリン 0.1g この一夜培養物1mlを、次の日に25mlのM9培地に移す。M
9培地の組成は次の通りである。

Na₂HPO₄・7H₂O 13.25g KH₂PO₄ 3.0g NaCl 0.5g NH₄Cl 1.0g CaCl₂・2H₂O 0.015g MgSO₄・7H₂O 0.25g カザミノ酸 2.5g ビタミンB₁ 0.0099g グルコース 5.0g アンピシリン 0.1g 培養は37℃、250回／分にて、細菌懸濁液が約0.9〜1.0
の光学濃度（OD⁶²³）に達するまで行う。次に、細胞を
収得し（5mlの増殖培地）、そしてこの細菌を50mM tris
・HCl（pH8）及び30mM NaClの溶液0.5mlに再懸濁する。
次にこの懸濁液を1mg/mlリゾチーム（ベーリンガー）に
対して標準化し、そして氷中に30分間置く。この懸濁液
の液体窒素中での凍結及び37℃での解凍を反復すること
により、細菌を破砕する。この方法を５回反復し、そし
て混合物を16,000回／分、４℃にて30分間遠心分離す
る。上清をHPLC及び抗体によりCGRP II a含量について
試験する。

別の方法として、上記の細菌懸濁液を次のようにして処
理する。

細胞を、8000回／分以上で遠心分離することにより培養
液から分離し、そして次にダイノーミル中で機械的に破
砕し、又はリゾチームにより溶解緩衝液（pH8）中で酵
素的に破砕する。

そして、次の段階を順次実施する。

1.酢酸（最終濃度１％、pH4.0）による細菌性蛋白質のp
H−沈澱。CGRP IIは上清に残り、沈澱物は分離除去す
る。

2.回分法において、粗ペプチドをイオン交換体カラム
（CH52、ワットマン）上に吸着せしめ、そして10mM酢酸
アンモニウム（pH4.5）から300mM（pH6.5）までの塩グ
ラジエントにより溶出する。蒸留水からの凍結乾燥を反
復することにより、又は透析濾過により主成分を脱塩す
る。

3.生成物を、0.1％酢酸/n−ブタノール（1:1）の２相系
（200移行）において、Craigの多段分配法により精製す
る。溶剤をロータリーエバポレーターで除去し、そして
集めた画分を凍結乾燥する。

4.すべての残留蛋白質及び低分子成分を、セファデック
スG50（ファルマシア）上でのゲル濾過クロマトグラフ
ィーにより分離する。溶出は２％酢酸、１％β−メルカ
プトエタノールにより行う。あるいは、溶剤グラジエン
トによるヌクレオシルＣ−18カラム（Dydac 300Å、15
〜20μｍ）上でのウオーターズ製の調製用装置（LC−Pr
ep 500）での逆相HPLCにより分離を行う。

次の式（XV）、 で示されるCGRP II aが得られる。

出発材料として使用したE.コリのクローンは次のように
して得られる。

段階2.1 750mgの無水コハク酸及び910mgの４−ジメチルアミノピ
リジンを、20mlの純ピリジン中3.05g（5mmol）の５′−
（４−モノメトキシトリチル）−Ｎ−イソブチリル−デ
オキシグアノシンに加え、そして全体を16時間室温に保
持する。ピリジン溶液を濃縮した後、残渣を200mlの酢
酸エチルに入れ、各場合に10mlの飽和塩化ナトリウム溶
液を加えて200mlの0.1Mリン酸緩衝液と共に振とうする
ことにより２回抽出し、飽和塩化ナトリウム溶液で再度
洗浄し、乾燥し、濃縮し、そしてヘキサンを滴加する。
沈澱した生成物を分離し、ジエチルエーテルと共に２回
すりつぶし、次に300mlの酢酸エチルに溶解し、そして
０℃にて180mlの0.1M硫酸水素カリウム（pH2.5）と共に
振とうすることにより抽出する。水で２回洗浄した後、
酢酸エチル溶液を硫酸ナトリウムで乾燥し、濾過し、こ
れに0.5mlのピリジンを加え、そして全体を濃縮し、そ
してヘキサンを滴加して稀釈する。沈澱したコハク酸誘
導体を濾取する。

1.15gのこの化合物を190mgのＮ−ヒドロキシサクシンイ
ミドと共に4mlの酢酸エチル及び2mlのジメチルホルムア
ミド中に溶解し、そして０℃にて370mgのN,N′−ジシク
ロヘキシルカルボイミドを加える。凍蔵庫中で一夜静置
した後、沈澱したN,N′−ジシクロヘキシル尿素を濾去
し、濾液を酢酸エチルで稀釈し、冷0.1M炭酸水素ナトリ
ウム及び水で抽出し、乾燥し、そして真空蒸発により乾
燥する。残渣を酢酸エチルを用いてシリカゲル上でクロ
マトグラフ分析する。TLC:R_f＝0.55、ジクロロメタン／
メタノール（9:1）中。

100mgのこのＮ−サクシンイミドイルコハク酸エステル
を2mlのジクロロエタン及び4mlのジメチルホルムアミド
中1gのアミノメチルポリスチレン（アミン含量110μmol
/g）と共に攪拌する。ポリマー樹脂を濾去し、そしてジ
メチルホルムアミド、メタノール、ジクロロメタン及び
メタノールで洗浄する。乾燥した後、1mlの無水酢酸及
び100mgの４−ジメチルアミノピリジンと共に6mlのピリ
ジン中で樹脂を30分間攪拌することにより、未反応のア
ミノ基をアセチル化する。５′−（４−モノメトキシト
リチル）−Ｎ−イソブチリル−デオキシグアノシル−
３′−０−サクシニル基がアミノメチルポリスチレンに
連結されている、生じたポリマー樹脂をジクロロメタ
ン、ジメチルホルムアミド、メタノール及びジクロロメ
タンにより洗浄し、そして重量が一定になるまで乾燥す
る。分光的メトキシトリチル分析は32μmol/gの負荷を
示す。

段階2.2 7.73g（15mmol）の５′−（４−モノメトキシトリチ
ル）−チミジンを純ピリジンと共に蒸発せしめることに
より２回濃縮する。残渣を20mlの純テトラヒドロフラン
に溶解し、そしてこの溶液を、攪拌しながらそして湿気
を排除しながら、テトラヒドロフラン中２−クロロフェ
ニル−ジ−（１−ベンゾトリアゾリル）−ホスフェート
の0.2M溶液80mlに滴加し、そして反応混合物を室温にて
１時間攪拌する。２−クロロフェニル−１−ベンゾトリ
アゾル−５′−（４−モノメトキシトリチル）−チミジ
ン３′−ホスフェートの得られる溶液を３つに分ける。

（α）トリエチルアンモニウム２−クロロフェニル−
５′−（４−モノメトキシトリチル）−チミジン３′−
ホスフェートへの加水分解 ２−クロロフェニル−１−ベンゾトリアゾール−５′−
（４−モノメトキシトリチル）４−ミジン３′−ホスフ
ェートの上記溶液の３分の１に、冷却しながら、100ml
の0.5M炭酸水素トリエチルアンモニウムを加える。15分
間の後、ジクロロメタンにより抽出する。ジクロロメタ
ン溶液を水で洗浄し、濃縮し、そしてこれに石油エーテ
ルを滴加する。生ずる沈澱を吸引濾取し、ジエチルエー
テル／石油エーテル（1:1）で洗浄し、そして真空乾燥
する。

TLC:R_f＝0.35、ジクロロメタン／メタノール／水（75:2
2:3）中。

（β）２−シアノエチル−２−クロロフェニル−５′−
（４−モノメトキシトリチル）−チアミン３′−ホスフ
ェートへのエステル化、及び４−モノメトキシトリチル
保護基の除去 ２−クロロフェニル−１−ベンゾトリアゾリル−５′−
（４−モノメトキシトリチル）−チミジン３′−ホスフ
ェートの溶液の３分の１に、1.3mlの２−シアノエタノ
ール及び2mlのピリジンを加える。この混合物を室温に
して一夜保持する。溶剤を真空蒸留により除去し、そし
て残渣を酢酸エチルに溶解し、そして0.1Mリン酸緩衝液
（pH7）及び水と共に振とうすることにより数回抽出す
る。有機相を乾燥し、濃縮し、そしてヘキサンに滴加す
る。沈澱を濾出し、50mlのジクロロメタン／メタノール
（7:3）に溶解し、そして０℃にてこれに75mlのジクロ
ロメタン／メタノール（7:3）中3.8gのｐ−トルエンス
ルホン酸−水和物の溶液を加える。２時間後、反応溶液
をジクロロメタンで稀釈し、そして冷炭酸水素ナトリウ
ム溶液と共に振とうすることにより抽出する。有機相を
濃縮し、そしてこれにヘキサンを加える。沈澱した２−
シアノエチル−２−クロロフェニル−チミジン３′−ホ
スフェートを、ジクロロメタン／メタノール（96:4）を
用いてシリカゲル上でクロマトグラフ分析する。TLC:R_f
＝0.45、ジクロロメタン／メタノール（9:1）中。

（γ）５′−（４−メトキシトリチル）−３′−シアノ
エチル）−ビスチミジンジヌクレオチドへの縮合 2.2gの２−シアノエチル−２−クロロフェニル−チミジ
ン３′−ホスフェートを、純ピリジンとの蒸発により２
回濃縮することによって脱水し、20mlの純テトラヒドロ
フランに溶解し、そして２−クロロフェニル−１−ベン
ゾトリアゾリル−５′−（４−モノメトキシトリチル）
−チミジン３′−ホスフェートの溶液の残りの３分の１
に加える。室温にて18時間置いた後、氷冷しながら、反
応溶液に10mlの水及び200mlの酢酸エチルを加える。有
機相を炭酸水素ナトリウム及び水で数回洗浄し、硫酸ナ
トリウムで乾燥し、そして小体積に濃縮する。リン酸成
分中で並びに５′−及び３′−末端で保護されているジ
ヌクレオチドを、ジエチルエーテル／ヘキサン（1:1）
に滴加することにより沈澱せしめる。R_f＝0.48、ジクロ
ロメタン／メタノール（9:1）中。

段階2.3 9.20g（15mmol）の５′−（４−モノメトキシトリチ
ル）−Ｎ−イソブチリル−デオキシグアノシンを、純ピ
リジンとの蒸発により２回濃縮する。残渣を20mlの純テ
トラヒドロフランに溶解し、そしてこの溶液を、攪拌し
ながらそして湿気を排除しながら、テトラヒドロフラン
中２−クロロフェニル−ジ−（１−ベンゾトリアゾリ
ル）−ホスフェートの0.2M溶液75mlに滴加し、そして反
応混合物を室温にて１時間攪拌する。２−クロロフェニ
ル−１−ベンゾトリアゾリル−５′−（４−モノメトキ
シトリチル）−Ｎ−イソブチリル−グアノシル３′−ホ
スフェートの生ずる溶液を、段階2.4によりさらに処理
する。

段階2.4 十分に保護された上記のジヌクレオチド1.17g（1mmol）
を30mlのジクロロメタン／メタノール（7:3）に溶解
し、氷冷しながら、これに20mlのジクロロメタン／メタ
ノール（7:3）中1.9gのｐ−トルエンスルホン酸−水和
物の溶液を加える。２時間後、氷冷した炭酸水素ナトリ
ウム溶液を加え、そしてジクロロメタンで抽出する。有
機相を乾燥し、濃縮し、そしてヘキサン中に滴加して導
入する。遊離５′−ヒドロキシ基を有する沈澱した粗ジ
ヌクレオチドをシリカゲル上でジクロロメタン中２％〜
８％メタノールのグラジエントによりクロマトグラフ処
理する。R_f＝0.33、ジクロロメタン／メタノール（9:
1）中。

この５′−ヒドロキシ−ジヌクレオチド900mgを、ピリ
ジンとの蒸発によって２回濃縮し、次に5mlの純テトラ
ヒドロフラン中に溶解し、そしてこれに段階2.3で得ら
れた溶液10mlを加える。２時間後、2mlの氷冷水を加
え、そしてさらに１時間後、ジクロロメタンで抽出す
る。有機相を炭酸水素ナトリウム飽和溶液及び水で洗浄
し、乾燥し、そして濃縮し、そしてこれにエーテルを加
える。沈澱したトリヌクレオチドをシリカゲルクロマト
グラフィーにより精製する。R_f＝0.45、ジクロロメタン
／メタノール（9:1）中。

段階2.5 段階2.2、2.3、及び2.4と同様にして、次の一般式（XV
I）で示される保護されたトリヌクレオチドを製造す
る。

式中、Ba¹、Ba²及びBa³は、相互に独立に、次のヌクレ
オシドのいずれかの２価基である。

Ｎ−ベンゾイル−デオキシアデノシン（Ａ′） Ｎ−ベンゾイル−デオキシシチジン（Ｃ′） Ｎ−イソブチリル−デオキシグアノシン（Ｇ′）、又は
チミジン（Ｔ）。

段階2.6 段階2.4及び2.5において記載したトリヌクレオチドのそ
れぞれを次のようにして処理して２−シアノエチル保護
基を除去する。湿気を排除しながら、10μmolのトリヌ
クレオチドを60μｌのピリジン／アセトニトリル／トリ
エチルアミン（1:1:1）中に溶解する。室温にて１時間
置いた後、0.7mlの過酸化物不含有ジエチルエーテルを
滴加し、そして沈澱を遠心分離する。粗トリエチルアン
モニウム塩を50μｌのピリジンに溶解し、そして0.5ml
のジエチルエーテルにより再度沈澱せしめ、遠心分離
し、そして高真空下で15時間乾燥する。

段階2.7 段階2.6により得られた部分的に保護されたトリヌクレ
オチドと、段階2.1に従って得られた保護されたグアノ
シン−ポリスチレン樹脂とのカップリングを、次のよう
にして行う。

すべての操作は湿気を排除して150μｌ容積の反応容器
中で、マイクロプロセサーで溶剤及び試薬を添加しなが
ら行う。15mg（0.48μmol）のグアノシン−ポリスチレ
ン樹脂（段階2.1）を反応容器に入れ、そして次の操作
にかける。

1.塩化メチレン:2ml/分、４分間； 2.塩化メチレン／イソプロパノール（85:15）:2ml/分、
２分間； 3.塩化メチレン／イソプロパノール（85:15）中1M臭化
亜鉛及び0.02M1,2,4−トリアゾール:2ml/分、２〜3.5分
間； 4.塩化メチレン／イソプロパノール（85:15）:2ml/分、
４分間； 5.DMF中0.5M酢酸トリエチルアンモニウム:2ml/分、５分
間； 6.分子篩で乾燥したピリジン:2ml/分、３分間； 7.テトラヒドロフラン（過酸化物不含有、分子篩で乾
燥）:2ml/分、３分間； 8.窒素流、10分間； 9.150μｌのピリジンに溶解した10μmolのトリヌクレオ
チド（下記参照のこと）及び8.9mg（30μmol）の１−メ
シチレンスルホニル−３−ニトロ−1,2,4−トリアゾー
ル（MSNT）の注入； 10.45℃、20分間； 11.ピリジン;2ml/分、４分間； 12.ピリジン中５％の無水酢酸及び25％の４−ジメチル
アミノピリジン:2ml/分、４分間； 13.ピリジン:2ml/分、４分間； 14.ピリジン／イソプロパノール（1:1）:2ml/分、３分
間。

14のすべての操作を24回反復し、トリエチルアンモニウ
ム塩（段階2.6を参照のこと）の形の次のデオキシトリ
ヌクレオチドを、９番目の操作において次々に使用す
る。ｄ（Ａ′Ａ′Ｃ′,C′Ａ′Ｇ′,C′Ａ′Ｃ′,TA′
Ｃ′,C′Ｃ′Ａ′,TA′Ａ′,A′TT,TA′Ｇ′,A′Ｇ′T,
C′Ｇ′Ａ′,G′Ａ′Ａ′,TC′Ｇ′,T′Ｇ′Ｇ′,C′
Ｇ′T,C′Ａ′Ａ′,A′Ａ′Ｃ′,TA′Ｇ′,C′TT,A′
Ａ′Ｇ′,A′Ｇ′Ａ′,A′Ｇ′T,C′Ｃ′T,C′Ａ′Ｔ及
びＧ′TC′）。

平均カップリング収率は97％である。最終生成物は次の
構造を有し、２−クロロフェニル保護基はなお存在す
る。

ｄ（mmt−Ｇ′TC′Ｃ′Ａ′TC′Ｃ′TA′Ｇ′Ｔ′Ａ′
Ｇ′Ａ′Ａ′Ａ′Ｇ′Ｃ′TTTA′Ｇ′Ａ′Ａ′Ｃ′Ｃ′
Ａ′Ａ′Ｃ′Ｇ′TTG′Ｇ′TC′Ｇ′Ｇ′Ａ′Ａ′Ｃ′
Ｇ′Ａ′Ａ′Ｇ′TTA′Ｇ′Ａ′TTTA′Ａ′Ｃ′Ｃ′
Ａ′TA′Ｃ′Ｃ′Ａ′Ｃ′Ｃ′Ａ′Ｇ′Ａ′Ａ′Ｃ′
Ｃ′Ｇ′）−ポリスチレン合成樹脂 段階2.8 段階2.7に従って得られたポリデオキシヌクレオチド−
ポリスチレン合成樹脂を次のようにして処理して担体か
らポリヌクレオチドを除去し、そして保護基を除去す
る。

35.0mg（約0.35μmol）のポリデオキシヌクレオチド合
成樹脂64/73を、400μｌの95％ピリジン中66mg（0.04mm
ol）のｏ−ニトロベンザルドキシム及び50μｌ（0.40mm
ol）の1,1,3,3−テトラメチルグアニジンと一緒に50℃
にて３時間そして室温にて12時間保持する。ピリジンを
窒素により吹き飛ばした後、残渣に1.6mlの水性アンモ
ニア（33％）を加え、そして全体を密閉容器中で50℃に
て24時間保持する。

分離した液相から真空中でアンモニアを除去し、3mlず
つの過酸化物不含有ジエチルエーテルにより３回洗浄す
る。バイオゲルP6カラム（100〜200メッシュ、３×66c
m、0.01M炭酸水素トリメチルアンモニウム、pH7.5、1.5
ml/分）により低分子成分を除去した後、250OD（260n
m）のポリデオキシヌクレオチドを単離する。

HPLCカラム（PRP−1/ハミルトン、250×4.6mm）により
合計60ODを分離する。Ａ中30％のＢからＡ中60％Ｂまで
のグラジエント（溶液A:0.05M酢酸トリエチルアンモニ
ウム、pH7.0;溶液B:溶液A/アセトニトリル1:1）で、50
℃にて20分間、2ml/分で溶出する。親脂性主ピーク（保
持時間約14分間）を集め、DE52−セルロース（ワットマ
ン）カラムで濃縮し、溶出し、そしてエタノールで沈澱
せしめる。４−メトキシトリチル保護基を除去するた
め、沈澱を50μｌの酢酸／H₂O（4:1）に溶解し、そして
室温にて45分間保持する。反応生成物を凍結乾燥し、エ
タノールで沈澱せしめ、そして精製のため８％ポリアク
リルアミドゲル（7M尿素）上での電気泳動により分離す
る。予想されるポリヌクレオチドの大きさに対応するバ
ンドを切り取り、そして生成物を電気溶出し、DE52−セ
ルロース上で濃縮し、そして次の構造:d（GTCCATCCTAGT
AGAAAGCTTTAGAACCAACGTTGGTCGGAACGAAGTTAGATTTAACCATA
CCACCAGAACG）のポリデオキシヌクレオチド64/73をエタ
ノアルで沈澱せしめる。

段階2.9 段階2.7及び2.8と同様にしてポリデオキシヌクレオチド
（1/73）ｄ（CTGGAATTCATGGCTTGCAACACCGCTACCTGCGTTAC
CCACCGTCTGGCTGGTCTGCTGTCTCGTTCTGGTG）を得る。

段階2.10 段階2.8及び2.9に従って得られたポリヌクレオチド（64
/73、及び相補的1/73）を、Molecular Cloning,A Labor
atory Manual（T.Maniatis等により発表）Cold Spring
Harbor Lab.1982,125頁に記載されているようにして、
〔γ−³²P〕ATP、及びT₄ポリヌクレオチドキナーゼ（ベ
ーリンガー、西独）を用いて、５′−末端を放射性リン
酸化する。

段階2.11 段階2.10に従って得られたキナーゼ処理されたポリヌク
レオチドを重合せしめてデュプレックスを形成するた
め、50pmolずつのキナーゼ処理された断片1/73及びキナ
ーゼ処理された断片64/73を24μｌの水に溶解し、この
溶液を90℃にて３分間加熱し、そして５分間以内に12℃
に冷却する。４μｌのエンド−Ｒ緩衝液（0.1M Tris・H
Cl、pH7.5、66mM MgCl₂、66mM β−メルカプトエタノー
ル、0.6M NaCl）、10μｌのデオキシヌクレオシドトリ
ホスフェート混合物（dATP、dCTP、dGTP、TTP（それぞ
れ２×10^-3M）、NH₃にてpH7.0に調製〕、及び２μｌ（1
0ユニット）のDNAポリメラーゼI Klenow断片（ベーリン
ガー）を加えた後、12℃にて30分間インキュベートす
る。90℃に３分間加熱することにより反応を停止し、そ
してさらに処理するまで混合物を−80℃にて貯蔵する。

得られるDNA−デュプレックスは次の構造を有する。

このデュプレックスを以後“Fo"と称する。

段階2.12 10μｇのプラスミドpBRHtrp〔独国出願公開3,111,405
（ゼネンテック）〕を50ユニットのEcoR I（ビオラブ
ス）により37℃にて60分間開裂せしめ、そしてフェノー
ル抽出の後、消化混合物をTST41（コントロンAG）ロー
ター中で50mM tris・HCl（pH8.0）、1mM EDTA中シュー
クロース密度グラジエント（５％〜23％）により分画す
る。遠心分離を40,000回／分、15℃にて14時間続ける。
1ml/分にて、ISCOグラジエントコレクターにより0.3ml
の画分を集める。小断片を含有する画分を一緒にし、こ
の溶液をTNEに対して標準化し、そして−20℃にて２容
量のエタノールで沈澱せしめる。エッペンドルフ遠心機
中で遠心した後、DNAを100μｌの10mMtris・HCl（pH7.
5）、0.5mM EDTAに溶解する。５μｇのこのDNA断片を５
ユニットのBgl II（ビオラブス）により37℃にて60分間
開裂せしめる。反応混合物をフェノール及びクロロホル
ムで抽出し、そしてDNAを２容量のエタノールと共に−8
0℃にて10分間インキュベートし、そしてDNAを遠心分離
により集め、そして再度50μｌの50mM tris・HCl（pH8.
0）に溶解する。この溶液の２μｌを取り（0.2μｇのDN
A）、そして50mM tris・HCl（pH8.0）中10ng/μｌのDNA
濃度にて、１ユニットのウシ腸アルカリホスファターゼ
（ベーリンガー）と共に37℃にて30分間インキュベート
する。溶液を65℃にて60分間加熱することにより酵素を
不活性化する。0.04μｇのDNAを取り、そして20μｌの
反応容積中で、50mM tris・HCl（pH9.4）、10mM MgCl₂
及び5mM DTT中10μCiの〔γ−³²P〕−ATP（＞5000Ci/mm
ol、アマーシャム）及び５ユニットのT₄ポリヌクレオチ
ドキナーゼ（Ｐ−Ｌビオケミカルス）と共に37℃にて30
分間インキュベートすることにより５′−末端を放射性
リン酸化する。放射性サンプルを未ラベルサンプル（上
記を参照のこと）と混合し、そしてDNA断片をTST60ロー
ター中で、50mM tris・HCl（pH8.0）、1mM EDTA中５％
−23％シュークロース勾配を通して分画する。遠心を6
0,000回／分、15℃にて５時間行う。0.2mlの画分を集め
る。セレンコフ放射を測定することによって各画分の放
射能を決定し、そしてこれによって断片を同定する。小
DNA断片を含有する目的の画分を一緒にし、DNAを２容量
のエタノールで沈澱せしめ、そして遠心分離の後、20μ
ｌの10mM tris・HCl（pH7.5）、0.5mM EDTA中に再度溶
解する。³² P−ラベルされたEcoR I−Bgl II DNA断片を、50μｌ
容量中で0.2ユニットのTaq I（ビオラブス）により37℃
にて10分間部分開裂せしめる。反応混合物を0.2％SDS、
10％グリセリン、10mM EDTA、0.05％ブロムフェノール
ブルーに対して標準化し、そしてDNA断片をtris−ボレ
ート−EDTA中６％ポリアクリルアミドゲル上で分離する
〔A.C.Peacook等、Biochemy−stry6,1818（1967）〕。
目的とするEcoR I−Taq I断片（最も大きな部分断片）
を含有するバンドをオートラジオグラフ上で同定する。
この断片をゲルから抽出し、そして精製し〔W.Mller
等、J.Mol.Biol.,124 343（1978）〕そして10μｌの10m
M Tris・HCl（pH7.5）、1mM EDTAに溶解する。

Cla I及びEcoR Iで開裂されたpBR322を受容体プラスミ
ドとして使用する。２μｇのpBR322を、４ユニットのCl
a I（ビオラブス）により20μｌの反応容量中で37℃に
て60分間消化する。蛋白質をフェノールで抽出し、そし
て次にDNAを２容積のエタノールにより−80℃にて10分
間沈澱せしめる。DNAを遠心分離により集め、そして次
に10ユニットのEcoR I（ビオラブス）により37℃にて30
分間、20μｌの反応容積中に消化する。次に、この溶液
に２容量の0.1M tris・HCl（pH8.7）を加え、そして全
体を１ユニットのウシアルカリホスファターゼ（ベーリ
ンガー）と共に37℃にて30分間インキュベートする。次
に、65℃にて60分間インキュベートすることによりホス
ファターゼを不活性化する。

100ngの受容体プラスミドを、10mM MgCl₂、20mMtris・H
Cl（pH7.8）、10mM DTT、0.5mM ATP中、15μｌの反応容
積中で、５μｌの断片Ｌ−DNAと共に、反応容積μｌ当
り30ユニットのT₄DNAリガーゼ（ビオラブス）を用いて
２時間インキュベートする。

５μｌのこの溶液を、200μｌの全容積中、10mM MgC
l₂、10mM CaCl₂及び10mM tris・HCl（pH7.5）中で、塩
化カルシウムで処理されたE.コリHB101細胞（14）150μ
ｌを含む溶合物に加える。この混合物を20分間氷冷し、
42℃にて１分間加熱し、そして20℃にて10分間インキュ
ベートする。1mlのトリプトン培地〔１の蒸留水中10g
のバクト−トリプトン（ディフコ）、1gの酵母エキス
（ディフコ）、1gのグルコース、8gのNaCl及び294mgのC
aCl₂・2H₂O〕を加え、そしてこの混合物を、300回／分
で振とうしながら37℃にて30分間インキュベートする。
この混合物を、50μg/mlのアンピシリン（シグマ）を補
充した寒天プレート（マッコンキー寒天、ディフコ、0.
6ml/プレート）２枚にプレートする。このプレートを37
℃にて12〜17時間インキュベートする。

10個の異るコロニーのプラスミドDNAを次のようにして
単離する。

上記のコロニーを使用して、25mlのエルレンマイヤーフ
ラスコ中の10mlのトリプトン培地（50μg/mlアンピシリ
ンが補充されている）に接種する。培養物を、37℃、30
0回／分にて15〜18時間振とうする。細胞を遠心分離
（ソルバル、HS−４ローター、10分間、400回／分、４
℃）により収得する。約0.1gの細胞を得、そしてこれを
1mlの50mM tris・HCl（pH8.0）に再懸濁する。0.25mlの
リゾチーム溶液〔50mM tris・HCl（pH8.0）中10mg/ml、
リゾチームはシグマから販売〕を加え、そして０℃にて
10分間インキュベートした後、0.15mlの0.5M EDTA（pH
7.5）を加える。０℃にてさらに10分間置いた後、60μ
ｌの２％トリトンＸ−100（メルク）を加える。０℃に
て30分間置いた後、サンプルを、ソルバルSA−600ロー
ター中で15,000回／分、４℃にて30分間遠心分離する。
上清を、１容積のフェノール（TNE中に飽和）により脱
蛋白する。5000回／分、４℃にて10分間遠心分離する
（ソルバルHB−４ローター）ことにより相を分離する。
上相を１容積のクロロホルムで２回抽出する。最終濃度
が20μg/μｌとなるまですい臓RNAゼＡ（シグマ、TNE中
10mg/ml、85℃にて10分間前加熱）を加え、混合物を37
℃にて40分間インキュベートする。次に、溶液を1M NaC
l及び10％ポリエチレングリコール6000（フルカ、120℃
にて20分間オートクレーブ処理したもの）に対して標準
化し、そして−10℃にて２時間インキュベートする。ソ
ルバルHB−４ローター中で沈澱を集め（10,000回／分、
０℃にて20分間）、そして再度100μｌのTNEに溶解す
る。DNA溶液を１容積のフェノールにより抽出し、そし
てDNAを２容積のエタノールにより−80℃にて10分間沈
澱せしめる。エッペンドルフ遠心機中での遠心分離によ
り沈澱を集め、そしてDNAを再度20μｌの10mM tris・HC
l（pH7.5）及び0.5mM EDTAに溶解する。10mlの培養物か
ら８〜10μｇのプラスミドDNAが得られる。

プラスミドDNAを、次のようにして制限酵素で消化する
ことにより分析する。

各場合に0.5μｇのプラスミドDNAを、酵素の製造者によ
り特定された方法により、Hpa I（ビオラブス）によ
り、そしてさらにHpa I（ビオラブス）及びEcoR I（ビ
オラブス）により、そしてCla I（ビオラブス）により
開裂せしめる。DNAを、40mM tris・アセテート（pH7.
8）、1mM EDTA及び0.5μg/mlエチジウムブロミド中１％
アガロースゲル上で分画する。目的とするプラスミドは
Hpa I部位を含有し、そして３回消化した後大DNA断片の
ほかにpBR322の小EcoR I−Cla I断片より大きな２個の
小断片をもたらす。これらのプラスミドの１つをp159と
命名する。

段階2.13 ２μｇのp159DNAを10ユニットのEcoR I（ビオラブス）
により37℃にて30分間消化する。DNAをフェノールによ
り消化し、エタノールにより沈澱せしめ、そして遠心分
離した後10μｌの10mM tris・HCl（pH7.5）、0.5mM EDT
Aにより溶解する。次に、EcoR Iで消化されたDNAを、５
ユニットのDNAポリメラーゼ（Klenow断片）（ベーリン
ガー）により、10mM MgCl₂、10mM β−メルカプトエタ
ノール、50nM NaCl、0.1mM dATP（Ｐ＆Ｌビオラブ
ス）、0.1mM d（TTP）（Ｐ＆Ｌビオラブス）中で15分間
12℃にてさらに処理する。次に、85℃にて５分間インキ
ュベートすることによりこのポリメラーゼを不活性化す
る。反応混合物を20mM tris・HCl（pH7.8）、10mM MgCl
₂、10mM DTT、0.5mM ATP（シグマ）中に稀釈し、そして
反応混合物μｌ当り30ユニットのT₄DNAリガーゼと共に1
5℃にて１時間インキュベートする。

50ngのDNAをE.コリ中に形質転換（前記のようにして）
し、そして50μg/mlのアンピシリンを補充したマッコン
キー寒天プレート上にプレートする。

10個の異るコロニーのプラスミドDNAを前記のようにし
て単離する。プラスミドをEcoR Iで消化することにより
分析する。この分析は前記のようにして行う。目的とす
るプラスミドの１つをHRi145と命名する。

段階2.14 ２μｇのpHRi145DNAを５ユニットのCla I（ベーリンガ
ー）で37℃にて60分間処理し、そしてフェノール抽出に
より脱蛋白する。DNAをエタノールで沈澱せしめ、そし
て次に20μｌの10mM tris・HCl（pH7.5）、0.5mM EDTA
に溶解する。突出末端を上記のようにしてDNAポリメラ
ーゼＩ（Klenow断片）により補完する。但しdATP及びdT
TPをdCTP（Ｐ＆Ｌビオケミカルス）及びdGTP（Ｐ＆Ｌビ
オケミカルス）で置き換える。85℃にて５分間インキュ
ベートすることによりポリメラーゼを不活性化する。２
容積の0.1M tris・HCl（pH8.7）を反応混合物に加え、
そして全体を0.5ユニットのウシホスファターゼ（ベー
リンガー）と共に37℃にて30分間インキュベートする。
反応混合物をフェノール抽出により脱蛋白する。DNAを
エタノールにより沈澱せしめ、そして８μｌの10mM tri
s・HCl（pH7.5）,0.5mM EDTA中に溶解する。

次の式： ５′−GAATTCCATGGTACCATGGAATTC−３′ で表わされる化学合成したDNAリンカーを、0.1mM rATP
（シグマ）、50mM tris・HCl（pH9.5）、10mM MgCl₂、5
mM DTT及び２ユニットのT₄ポリヌクレオチドキナーゼ
（Ｐ＆Ｌビオケミカルス）を含有する８μｌの反応容積
中で、8pmolの該リンカーと５μCiの〔γ−³²P〕−ATP
（5500Ci・mmol^-1、アマーシャム）とを37℃にて30分間
インキュベートすることにより、５′−末端においてリ
ン酸化する。

次に、この放射性ラベルされたリンカーを１μｇのCla
I及びホスファターゼで処理し、そして0.5mM rATP（シ
グマ）、10mM DTT（カルビオケム）、20mM tris・HCl
（pH7.8）、1mM MgCl₂及び800ユニットのT₄DNAリガーゼ
（ビオラブス）を含有する20μｌの反応溶液中でpHRi14
5DNA（前記）と連結する。15℃にて２時間インキュベー
トする。85℃にて10分間インキュベートすることにより
リガーゼを不活性化する。次に、２容積の水を加え、塩
化ナトリウム濃度を10mMに調整し、そして20ユニットの
Kpn I（ビオラブス）を37℃にて30分間にわたって加え
る。フェノール及びクロロホルムで抽出した後、この混
合物を、40mMtris・アセテート（pH7.8）、1mM EDTA及
び0.5μg/mlエチジウムブロミド中で0.9％低融アガロー
スゲル（ビオラド）を通して分画する。同じサイズのマ
ーカーDNAと同じ移動度を示すUV−照射により可視化さ
れるバンドをピンセットで切り取る。ゲル片を65℃にて
５分間溶融せしめ、そして37℃に冷却する。約20μｌの
容積が得られる。この溶液の５μｌを取り、そして0.5m
M ATP、10mM DTT、10mM MgCl₂、20mM tris・HCl（pH7.
8）に対して標準化された10μｌの反応容積中で400ユニ
ットのT₄リガーゼ（ビオラブス）と共に15℃にて12時間
インキュベートする。

100mMtris・HCl（pH7.5）、100mM CaCl₂及び100mM MgCl
₂を含有する溶液1/10容積をリガーゼ混合物（15℃にて
固化）に加え、そして65℃にて５分間インキュベートす
る。次にこの溶液を用いて、前記のようにして、カルシ
ウムにより処理しておいたE.コリHB101細胞を形質転換
する。50μg/mlのアンピシリンを補充されたマッコンキ
ー寒天プレート上にプレートする。

10個の異るコロニーのプラスミドDNAを前記のようにし
て単離し、そしてDNAを次の制限酵素分析にかける。各
場合に0.5μｇのプラスミドDNAを、酵素の製造者の指示
に従って、Kpn I（ビオラブス）、Nco I（ビオラブス）
及びEcoR I（ビオラブス）により次々と開裂せしめる。
この開裂生成物を、40mM tris・アセテート（pH7.8）、
1mM EDTA、0.5μg/mlエチジウムブロミド中１％アガロ
ースゲル上で分画する。すべてのプラスミドは目的通り
に、それぞれこれらの酵素開裂部位の１つを示す。１つ
をHRi148と命名する。

プラスミドHRi148はトリプトファン−プロモータ／オペ
レーター及びリボゾーム結合部位からATGまで（これを
含む）を含有し、そして広範囲の用途を有する発現プラ
スミドである。

段階2.15 pHRi148のプラスミドDNA5μｇを制限エンドヌクレアー
ゼEcoR I及びBamH Iで消化する。切断した後、ベクター
pHRi148/EcoR I/BamH Iを密度勾配遠心法により単離す
る。

得られる線状化されたベクターの製造はまた“Hans Rin
k等、Nucleic Acids Research，12,6369−6387（198
4）”に記載されており、この文献においてはこの明細
書において、pHRi148と称されるプラスミドがpHR148と
呼ばれている。

段階2.16 段階2.11に従って得られる20μｇのDNA配列Foを、50μ
ｌの10mM tris・HCl（pH7.5）、50mM NaCl及び100μg/m
lのゼラチンの50μｌの溶液の内の20μｌ中で、制限酵
素EcoR I及びBamH Iにより次々に消化する。

溶液をTNEに対して標準化し、そして次に30μｇ（＝50n
mlの末端）のベクターDNApHRi148/EcoR I/BamH Iを加え
る。溶液をフェノール／クロロホルムで抽出し、そして
DNAをアルコールにより沈澱せしめる。DNA沈澱物を50mM
tris・HCl（pH7.8）、10mM MgCl₂、10mM DTT、0.5mM A
TP及び100μg/mlゼラチンの溶液20μｌ中で、25ユニッ
ト／μｌのT₄DNAリガーゼ（ビオラブス）により、15℃
にて３時間処理する。こうして、組換プラスミド（pML1
050）が溶液中に形成される。

段階2.17 段階2.16に従って得られたプラスミドpML1050によるE.
コリHB101の形質転換を次のようにして行う。

形質転換に必要とされるカルシウム処理されたE.コリHB
101細胞をMandel等、J.Mol.Bilo.,53,159（1970）に記
載されているようにして調製する。

組換プラスミドpML1050を含有する段階2.16に従って得
られた溶液を、65℃にて10分間加熱してT₄DNAリガーゼ
を不活性化し、そして次に37℃に冷却する。この反応混
合物10μｌを、10mM MgCl₂、及び10mM tris・HCl（pH7.
5）中カルシウム処理されたE.コリHB101細胞150μｌに
加えて全容積200μｌにする。次に、この混合物を30分
間氷冷し、42℃にて２分間加熱し、そして次に1mlのＬ
培地（例２の最初の記載を参照のこと）中に37℃にて50
分間放置する。次に、混合物の0.2mlのアリコートを、6
0μg/mlのアンピシリン（セルバ）を含有する５枚のプ
レート（マッコンキー寒天、ディフコ）に適用する。寒
天プレートを37℃にて16〜18時間保持する。形質転換さ
れたE.コリHB101のアンピシリン耐性コロニー109個が得
られる。

段階2.18 段階2.17に従って得られた形質転換されたコロニー30個
を、段階2.11のDNA配列Foの断片の含有につき、次のよ
うにして試験する。

形質転換されたコロニーをニトロセルロースフィルター
B85（Schleicher及びSchll）上に押し付ける。Grunst
ein及びHognes,Proc.Natl.Acad.Sci.USA，72,3960（197
9）に従って、コロニーを溶解し、そしてそれらの変性
されたDNAをフィルターに固定する。20ml（フィルター
当り）の４×SET〔30mM tris・HCl（pH8）、150mM NaC
l、1mM EDTAの溶液〕、0.1w/v％フィコール400（ファル
マシア）、0.5％SDS、50μg/mlの変性されたウシ胸腺DN
A中で、64℃にて４時間フィルターの前ハイブリダイゼ
ーションを行う。次に、ニトロセルロースフィルター
を、20ml（フィルター当り）の５×SET（w/v）フィコー
ル400、0.2％SDS及び50μg/mlの変性されたウシ胸腺DNA
中で、64℃にて16時間、³²P−放射性標識プローブ（フ
ィルター当り約10³〜10⁴セレンコフcpm）で処理する。
オリゴデオキシヌクレオチド64/73（段階2.10を参照の
こと）をプローブとして用いる。

次に、フィルターを２×SET、0.2％SDS中で室温にて２
回、そして２×SET、0.5％SDS中で60℃にて２回（最初3
0分間、次に60分間）洗浄する。次に、フィルターを3MM
ペーパー（ワットマン）の間で乾燥し、そして−80℃に
てＸ−線フィルム（フジ）上に、強化スクリーン（イル
フォード）と共に１〜２日間置く。

得られるオートラジオグラフは、さらに処理することが
できる陽性コロニー（クローン）20個を示す。これらの
内５個をpML1050、pML1051、pML1052、pML1053、及びpM
L1054と命名する。

段階2.19 段階2.18に従って得られたクローンpML1050中の挿入さ
れたDNA配列、すなわちDNA挿入部の特徴付けを次のよう
にして行う。

組換プラスミドpML1050のDNAを、Ish−Hor−owitz,Mole
cular Cloning,A Laboratory Manual（T.Maniatis等に
より発表）、Colb Spring Harbor Lab.1982,368頁、に
従って単離する。FoDNA挿入部のヌクレオチド配列をMax
am及びGilbert〔Proc.Acad.Sci.USA，74,560（1977）；
さらにMeth.Enzym.，65,499（1980）を参照のこと〕に
従って決定する。この目的のため、pML1050のプラスミ
ドDNA10μｇをEcoR I及びBamH I制限エンドヌクレアー
ゼにより開裂せしめ、そして線状化されたDNAをアガロ
ースゲルからゲル−溶出により単離する。この目的のた
め、線状化されたDNAを、tris−アセテート−EDTA緩衝
液（pH8）中１％低融アガロース（ビオラド）上でのゲ
ル−電気泳動により精製する。アガロースゲル中でEtBr
によりDNAを着色した後、DNAバンドを含有するゲルの領
域をゲルから切り出し、そして65℃にて10分間液化す
る。このDNA溶液に20容積のTNEを加え、DE−52クロマト
グラフィーによりMueller等〔J.Mlo.Biol.,124,343（19
78）〕に従ってDNAを精製し、フェノール／クロロホル
ムで抽出し、そしてDNAをアルコールにより−20℃にて
一夜沈澱せしめる。DNA沈澱物を50μｌの0.01M tris・H
Cl（pH8）、0.1mM EDTAに溶解し、そして使用するまで
−20℃に貯蔵する。次に、単離されたDNAをアルカリホ
スファターゼで消化し、そしてDE−52上でクロマトグラ
フ処理する。次に、このDNAを、〔γ−³²P〕ATP（比活
性＞5000Ci/mmol、アマーシャム）及びT₄ポリヌクレオ
チドキナーゼ（Ｐ−Ｌ−ビオチミカルス）を用いて、
５′−末端において放射性ラベルする。

次に、放射性ラベルされたDNAを第２の制限エンドヌク
レアーゼ、例えばPvu II及びPst Iで開裂せしめる。生
ずるDNA断片をゲル−溶出によりアガロースから単離す
る。次に、Pvu II−EcoR I^*断片及びPst I−BamH I^*断
片から、FoDNAのヌクレオチド配列を決定する。（^*は放
射性ラベルされたDNA末端を示す。） 例3.CGRP II aを決定するためのモノクローナル−抗−C
GRP II抗体を用いる試験キット、競争的ラジオイムノア
ッセイ a.モノクローナル抗−CGRP抗体の製造 Ａ）マウスの免疫感作 凍結乾燥形の純CGRP II（3mg）（例１に従って製造され
たもの）を少量の0.1％酢酸に溶解し、そして次にリン
酸緩衝化塩化ナトリウム溶液により3mlにする。pHを7.2
に調整する。この抗原溶液の部分を同じ体積の完全フロ
インドアジュバント又はリン酸緩衝化塩溶液と混合す
る。

雌性Balb/cマウス（８週齢、ティールファーム・シッセ
ルン、スイスから入手）に、緩衝化塩溶液中100μｇのC
GRP II溶液を静脈内注射する。４日後、脾臓を摘出して
融合のために用いる。

Ｂ）ハイブリドーマの調製及び抗体試験 得られた脾細胞と骨髄腫細胞系X63−Ag8.6.5.3〔J.F.Ke
arney等，J.Immunol.，123,1548（1979）〕との融合に
よりハイブリドーマ細胞を製造する。このために10⁸個
の脾細胞及び10⁷個の骨髄腫細胞を使用する。融合は、
S.Alkan等、Mol.Immunol.20,203（1983）に記載されて
いるようにして行う。

ハイブリドーマの上清中の抗−CGRP II活性の決定はラ
ジオニムノアッセイにより行う〔RIA,T.Chard,An Intro
duction to Radioimmunoassay and related Technique
s,Narth Holland Publ.Comp.,アムステルダム,1978〕。

Ｃ）腹水からの抗−CGRP II抗体の単離及び精製 Balb/cマウスを、0.4mlのプリスタン（カール・ロス）
により腹腔内前処理する。１週間後、２〜５×10⁶個の
クローン化ハイブリドーマ細胞を腹腔内注射する。各マ
ウスから繰り返し腹水を採取し、そして−80℃にて凍結
する。集めた液体を解凍し、そして４℃にて30分間16,0
00回／分、遠心分離する。脂肪を吸引濾去し、そして０
℃で攪拌しながら、細胞片を含まない上清液に、0.9容
積の飽和硫酸アンモニウム溶液をゆっくり滴加する。生
じた粗免疫グロブリン画分を、0.1M tris・HCl（pH8.
2）を用いながら、製造者により記載されているように
してセファクリルG2000（ファルマシア）に通す。活性
画分を集め、そしてアミコンXM50フィルター（アミコ
ン）により濃縮する。

b.競争的ラジオイムノアッセイのための試験キット 例3aCに従って製造した抗−CGRP II抗体の溶液をリン酸
緩衝化塩溶液（PBS溶液）により稀釈して１μg/100μｌ
の濃度とする。この溶液100μｌを小形のプラスチック
チューブ中又はプラスチック製ミクロタイタープレート
±で37℃にて２時間インキュベートし、抗体をプラスチ
ック表面上に非特異的に吸着せしめる。プラスチック表
面上のなお遊離している活性部位を飽和するため、ウシ
血清アルブミン溶液（BSA溶液）により後処理を行う。

サンプル溶液の又は標準溶液のBSA溶液中一連の稀釈物
のそれぞれを、既知の方法で放射性¹²⁵ヨウ素によりラ
ベルされそして10,000cpm/50μｌの活性を有するCGRP I
Iの溶液50μｌに加え、そして次にプラスチック表面上
で37℃にて２時間インキュベートし、そして次に４℃に
て12時間インキュベートする。小形チューブ又はミクロ
タイタープレートをリン酸緩衝化塩溶液で洗浄し、そし
て放射能を測定する。標準溶液を用いて調製した換算曲
線によりサンプル中のCGRP IIの濃度を決定する。

前記のラジオイムノアッセイ用試験キットは次のものを
含む。

◎１〜10mg/mlの濃度の、例3aCからの抗−CGRP II抗体
の溶液:2ml; ◎リン酸緩衝化塩溶液（PBS溶液）:100ml; ◎PBS溶液中0.3％ウシ血清アルブミン及び0.1％ナトリ
ウムアジド:100ml; ◎200,000cpm/mlの活性を有する放射性CGRP IIの溶液:2
ml; ◎100mg/mlのCGR IIを含有する標準溶液:2ml; ◎プラスチック材料製の小形チューブ又はミクロタイタ
ープレート。

例4.ゼラチン溶液 CGRP IIの無菌濾過した水溶液を、加熱しながら、無菌
条件下で、防腐剤としてフェノールを含有する無菌ゼラ
チン溶液と混合して、1.0mlの溶液が次の組成を有する
ようにする。

CGRP II 10.0μｇ ゼラチン 150.0mg フェノール 4.7mg 蒸留水 1.0mlとなる量。

この混合物を無菌条件下で1.0mlのバイアルに導入す
る。

例5.注射用無菌乾燥剤 ５μｇのCGRP IIを20mlのマンニトールを含有する1mlの
水溶液に溶解する。この溶液を無菌濾過し、そして無菌
条件下で、2mlのアンプルに入れ、深冷凍結し、そして
凍結乾燥する。使用前に、この凍結乾燥物を1mlの蒸留
水又は1mlの生理食塩水に溶解する。この溶液は筋肉内
又は静脈内に投与される。この溶液はまた、２重室シリ
ンジアンプルに導入することもできる。

例6.鼻内スプレー 200μｇの微粉砕した（＜5.0μ）CGRP IIを、3.5mlの
“Miglyol 812"と0.08gのベンジルアルコールとの混合
物中に懸濁する。この懸濁液を、計量バルブで有する容
器に導入する。次に5.0mlの“Freon 12"を、バルブを通
して加圧下に容器に入れる。“Freon"は、振とうにより
Miglyol/ベンジルアルコール混合物中に溶解する。

例7. 0.6M酢酸アンモニウム/0.1M LCl/1mM EDTAの溶液2mlを
濃アンモニア溶液によりpH8に調整し、そして100μｌの
1M CGRP II a水性溶液（例２を参照のこと）と混合す
る。次に0.7mgのカルボキシペプチダーゼＹ（カールス
ベルグ・ビオテクノロジー社、コペンハーゲン、デンマ
ーク）を加える。25℃にて30分間置いた後、全体を6M H
ClにてpH1に酸性化する。反応生成物を精製し、そして
段階1.7に記載した条件下でHPLCにより単離する。式（I
II）のCGRP IIが得られ、これは例１に従って得られた
生成物と同一である。

例8. 例２と同様にして、次の式（XVII）、 で表わされるDNA配列を有するプラスミドを含有するエ
ッセリシャ・コリ(Escherichia coli)のクローンを培養
し、そして同様に処理することによって、次の式（XI
X）、 で表わされるCGRP II bを得る。

出発材料は例２と同様にして得られる。

例9. 4mgのCGRP II b（例８を参照のこと）を、37℃にて、1m
lの20mM NaCl及び5mMリン酸ナトリウム中で、pH7にて20
時間、A.F.Bradbury、M.D.A.Finnie及びD.G.Smyth、Nat
ure 298,686−688（1982）に記載されているようにし
てブタの脳下垂体100gから単離されたアミド化酵素と共
にインキュベートする。次に、100μｌの1M HClを用い
て酸性化する。段階1.7に記載した条件下でHPLCにより
反応生成物を精製し、そして単離する。式（III）のCGR
P IIが得られ、これは例１に従って得られる生成物と同
一である。

例10. 次の式、 で表わされる、段階10.2において得られたペプチド−ア
ミドを2.8mlのトリフルオロ酢酸／水（9:1）に溶解し、
そして1.5時間室温に置いた後、30mlの冷ジエチルエー
テルで沈澱せしめ、そして吸引濾過する。濾過残渣を5.
2mlのトリフルオロ酢酸／水（95:5）に溶解し、そして5
0℃にて50分間置き、室温に冷却し、そして60μｌの1M
ヨウ化アンモニウムを加えた後、室温にて10分間置く。
30mlの冷ジエチルエーテルに滴加することによりペプチ
ド−アミドを沈澱せしめる。吸引濾過し、そして乾燥し
た後、ペプチド−アミドを3mlの0.1M酢酸に溶解し、そ
しておな存在する痕跡のヨウ素を15μｌの1Mチオ硫酸ナ
トリウムの添加により還元する。得られた溶液をイオン
交換カラム〔アンバーライト（商標）〕IRA92、アセテ
ート形、1.2×8cm〕に通して濾過し、そして0.1M酢酸に
より溶出する。蒸発により乾燥するまで濃縮した後、残
渣を3mlの再蒸留水に溶解し、アルゴンのもとで室温に
て一夜置き、この溶液を用いて次の条件下で調製用HPLC
で精製する。カラム:Vydac 5μmC18、250×10mm（ザ・
セパレーションズ・グループ、ヘスペリア、カリホルニ
ア、アメリカ）；溶液Ａ（水中0.1容量％のトリフルオ
ロ酢酸と25〜30容量％のＢ（アセトニトリル中0.1容量
％のトリフルオロ酢酸からなるグラジエント30分間、及
びさらにＡ及び30〜40容量％のＢからなるグラジエン
ト；流速4ml/分；検出:210nm。画分中の主ピークを集
め、そしてその純度を次の条件下で分析用HPLCにより決
定する。カラム:Vydac 5μmC18、250×4.6mm;A及びB:45
分間中に20〜45％B;A及びＢは前記の通り。純粋な画分
を蒸発濃縮する。トリフルオロ酢酸を上記のようにして
イオン交換により除去し、そして式（III）のCGRP IIを
凍結により得る。上記分析用HPLCの保持時間:24分;FAB/
MS:MH⁺3794（計算上の分子量3793.4）;Rf（シリカゲ
ル）＝0.57（ｎ−ブタノール／ピリジン／氷酢酸／水
（35:35:7:23）、Rf（セルロース）＝0.64（ｎ−ブタノ
ール／ピリジン／氷酢酸／水（38:24:8:30）、Rf（セル
ロース）＝0.55（ｎ−ブタノール／ピリジン／濃アンモ
ニア／水（42:24:4:30）。

出発物質は次のようにして得られる。

段階10.1 例１、段階1.4に従って得られたペプチド樹脂を次のよ
うに処理して樹脂から保護されたペプチドを切り離し、
そして末端カルボキシ基をアミド化する。

325mgのペプチド樹脂及び10mlのジメチルホルムアミド
をオートクレーブに入れ、−70℃で6gのアンモニアを凝
縮せしめ、そして全体を室温にて20時間反応せしめる。
アンモニアを蒸留除去した後、残りの懸濁液に50mlのジ
エチルエーテルを加える。０℃にて２時間置いた後、沈
澱を吸引濾過する。保護されたペプチド−アミドを樹脂
から氷酢酸により抽出し（5mlで５回）、酢酸を凍結乾
燥により除去し、そして残渣を20mlのメタノール／水
（9:1）中に懸濁する。

保護されたペプチド−アミドを遠心分離し、洗浄し、そ
して乾燥して、その77mgを得る。

段階10.2 ジスルフィドに転換するため、14mlの氷酢酸／水（4:
1）中段階10.1に従って得られた生成物69mgの溶液を、
室温にて攪拌しながら、34mlの氷酢酸及び16mlの水中16
4mgのヨウ素の溶液に、４分間にわたり滴加する。さら
に10分間置いた後、1.4mlの1M酢酸ナトリウム及び0.68m
lの1Mアスコルビン酸を添加することにより反応を停止
する。ビオゲルP2カラム〔2.5×34cm、氷酢酸／水（6:
4）中〕で塩を分離する。濃縮した後、ペプチド含有画
分を凍結乾燥し、残渣を5mlのメタノールに懸濁し、そ
して不溶性の保護されたペプチド−アミドを遠心分離及
び乾燥により得る。

例11. 1gのＨ−Ala−Cys（MOB）−Asn（XANT）−Thr（BZL）−
Ala−Thr（BZL）−Cys（MOB）−Val−Thr（BZL）−His
（TOS）−Arg（TOS）−Leu−Ala−Gly−Leu−Leu−Ser
（BZL）−Arg（TOS）−Ser（BZL）−Gly−Gly−Met−Va
l−Lys（2CZ）−Ser（BZL）−Asn（XANT）−Phe−Val−
Pro−Thr（BZL）−Asn（XANT）−Val−Gly−Ser（BZL）
−Lys（2CZ）−Ala−Phe−MBHA樹脂、及び1mlのアニソ
ーリを、10mlの乾燥HFと共にテフロン装置中で０℃にて
１時間攪拌する。HFを蒸留除去しそして高真空下で乾燥
した後、残渣を10mlのジエチルエーテルで５回抽出す
る。ペプチドを樹脂から、脱気した0.1N酢酸により抽出
し、脱気した水により500mlに希稀し、そしてアンモニ
アによりpHを8.4に調整する。室温にて一夜攪拌した
後、遊離メルカプト基は検出され得ない。溶液を高度に
濃縮しそして凍結乾燥し、そして例10に記載したように
して残渣を調製用HPLCにより精製する。得られる画分
を、シリカゲル上ｎ−ブタノール／ピリジン／氷酢酸／
水（35:35:7:23）系中で、薄層クロマトグラムでのそれ
らの純度について試験する。一緒にした純粋な画分を真
空蒸発により濃縮し、そして残渣を水から凍結乾燥す
る。式（III）のCGRP IIが得られる。Rf（セルロース）
＝0.64（ｎ−ブタノール／ピリジン／氷酢酸／水（38:2
4:8:30）。

出発物質は次のようにして得られる。

段階11.1 1gのMBHA−ポリスチレンヒドロクロリド〔幾つかのフェ
ニル基がアミノ−（４−メチルフェニル）−メチル置換
基を担持している、ジビニルベンゼンにより架橋された
ポリスチレン樹脂〕を、例１、段階1.2に記載した機械
中で、次のようにして処理する。

３×0.5分間 脱気したジメチルアセタミド； ３×２分間 ジメチルアセタミド中10％ジイソプロピル
エチルアミン； ６×0.5分間 蒸留したジメチルアセタミド； １×120分間 カップリング:455mg（1.7Mmol）のBoc−P
he,230mgのヒドロキシベンゾトリアゾール、385mgのジ
シクロヘキシルカルボジイミド（0.36mlのエチレンクロ
リド及び4mlのジメチルアセタミド中）：室温にて120分
間； １×５分間 10mlの無水酢酸／ピリジン／ジメチルアセ
タミド（10:10:80）； １×0.5分間 脱気したジメチルアセタミド； １×１分間 イソプロパノール； ２×0.5分間 エチレンクロリド； ２×0.5分間 ジメチルアセタミド； １×１分間 イソプロパノール； ３×0.5分間 エチレンクロリド／エタンジチオール（9
9:1）； ２×５分間,1×15分間 Boc基を除去するため、トリフ
ルオロ酢酸／エチレンクロリド／エタンジチオール（5
0:49:1）； ３×0.5分間 エチレンクロリド／エタンジチオール（9
9:1）。

このサイクルを最初から繰り返し始める。

次のアミノ酸を次々と縮合せしめる。

Boc−Ala,Boc−Lys（2CZ）,Boc−Ser（BZL）,Boc−Gly, Boc−Val,Boc−Asn（XANT）,Boc−Thr（BZL）,Boc−Pr
o, Boc−Val,Boc−Phe,Boc−Asn（XANT）,Boc−Ser（BZ
L）， Boc−Lys（2CZ）,Boc−Val,Boc−Met,Boc−Gly,Boc−Gl
y, Boc−Ser（BZL）,Boc−Arg（TOS）,Boc−Ser（BZL）， Boc−Leu,Boc−Leu,Boc−Gly,Boc−Ala,Boc−Leu, Boc−Arg（TOS）,Boc−His（TOS）,Boc−Thr（BZL）， Boc−Val,Boc−Cys（MOB）,Boc−Thr（BZL）,Boc−Ala, Boc−Thr（BZL）,Boc−Asn（XANT）,Boc−Lys（MOB）及
びBoc−Ala。

。 カップリング反応の完了をカイゼル試験を用いて定性的
に試験する。試験が陽性であればカップリングを反復す
る。最後のアラニンからBoc基を除去した後、高真空下
で樹脂を乾燥する。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ａ６１Ｋ 38/00 ＡＢＲ ＡＣＪ 38/22 ＡＡＢ ＡＤＤ 39/395 Ｃ１２Ｎ 1/00 Ｕ 8828−4Ｂ 15/09 Ｃ１２Ｐ 21/00 Ｃ 9282−4Ｂ Ｇ０１Ｎ 33/50 Ｐ (Ｃ１２Ｎ 1/00 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｐ 21/00 Ｃ Ｃ１２Ｒ 1:19） Ａ６１Ｋ 37/02 ＡＣＪ 37/24 ＡＡＢ ＡＤＤ 9281−4Ｂ Ｃ１２Ｎ 15/00 Ａ (72)発明者 パウル ヘルマン ステーンベルグ オランダ国，3981 フアウゲー ブーニツ ク，コン．ビルヘルミナシユトラート ４ (72)発明者 ハンス リンク スイス国，4125 リーヘン，レーベンシユ トラーセ 10 (72)発明者 ペーター ジイバー スイス国，4153 ライナツハ，バツハマツ トベーク 10

Claims (9)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】次のアミノ酸配列： Ala−Cys−Asn−Thr−Ala−Thr−Cys−Val−Thr−His−
   Arg−Leu−Ala−Gly−Leu−Leu−Ser−Arg−Ser−Gly−
   Gly−Met−Val−Lys−Ser−Asn−Phe−Val−Pro−Thr−
   Asn−Val−Gly−Ser−Lys−Ala−Phe−Ｘ （配列中、Ｘは隣接するPheのカルボキシル基と結合し
   てアミド基を形成したアミノ基、隣接するPheのカルボ
   キシル基に結合したGly、又は隣接するPheのカルボキシ
   ル基に結合したTyrであり、配列中の２個のCysは遊離で
   あってよく又はジスルフィド結合を形成していてもよ
   い）を有するペプチド、又はその塩。
2. 【請求項２】次の式： で表わされる、請求項１に記載のペプチド又はその医薬
   として許容される塩。
3. 【請求項３】次の式： で表わされる請求項１に記載のペプチド又はその塩。
4. 【請求項４】次の式： で表わされる請求項１に記載のペプチド又はその塩。
5. 【請求項５】50％以上の純度を有する、請求項１〜４の
   いずれか１項に記載のペプチド又はその塩。
6. 【請求項６】請求項１〜５のいずれか１項に記載の医薬
   として許容される塩。
7. 【請求項７】次のアミノ酸配列： Ala−Cys−Asn−Thr−Ala−Thr−Cys−Val−Thr−His−
   Arg−Leu−Ala−Gly−Leu−Leu−Ser−Arg−Ser−Gly−
   Gly−Met−Val−Lys−Ser−Asn−Phe−Val−Pro−Thr−
   Asn−Val−Gly−Ser−Lys−Ala−Phe−Ｘ （配列中、Ｘは隣接するPheのカルボキシル基と結合し
   てアミド基を形成したアミノ基、隣接するPheのカルボ
   キシル基に結合したGly、又は隣接するPheのカルボキシ
   ル基に結合したTyrであり、配列中の２個のCysは遊離で
   あってよく又はジスルフィド結合を形成していてもよ
   い）を有するペプチド、又はその塩の製造方法におい
   て、 （ａ）遊離カルボキシル基を有する前記化合物の断片又
   はその反応性カルボン酸誘導体と、遊離アミノ基を有す
   る補完的断片又はその反応性誘導体とを反応せしめ、こ
   こで前記の断片中の遊離官能基は、反応に関与する２個
   の基を除き、所望により保護された形で存在し、ことに
   より前記化合物中に存在するアミド結合を形成せしめ、
   そして存在するかもしれない保護基を除去し；あるい
   は、 （ｂ）ジスルフィド橋を有する前記化合物のいずれかを
   製造するために、システイン残基のメルカプト基が遊離
   の形で存在するか、又はシステイン残基のメルカプト基
   が反応条件下で除去される保護基により保護されている
   前記化合物のいずれかを適当な酸化剤により酸化し；あ
   るいは、 （ｃ）少なくとも１個の官能基が保護された形で存在す
   る前記のペプチド、ペプチド−アミド、又はそれらのＮ
   −アシル化誘導体において、存在する保護基を除去し；
   そして所望により、 得られた塩を遊離化合物に、又は得られた遊離化合物を
   塩に転換する、ことを特徴とする方法。
8. 【請求項８】次のアミノ酸配列： Ala−Cys−Asn−Thr−Ala−Thr−Cys−Val−Thr−His−
   Arg−Leu−Ala−Gly−Leu−Leu−Ser−Arg−Ser−Gly−
   Gly−Met−Val−Lys−Ser−Asn−Phe−Val−Pro−Thr−
   Asn−Val−Gly−Ser−Lys−Ala−Phe−Ｘ （配列中、Ｘは隣接するPheのカルボキシル基に結合し
   たGly、又は隣接するPheのカルボキシル基に結合したTy
   rであり、配列中の２個のCysは遊離であってよく又はジ
   スルフィド結合を形成していてもよい）を有するペプチ
   ド、又はその塩の製造方法において、上記アミノ酸配列
   をコードしそして発現制御配列により制御されるDNA配
   列を含有する発現ベクターにより形質転換された細菌細
   胞を資化性の炭素源及び窒素源を含有する液体栄養培地
   中で培養し、生成物を所望により宿主細胞から遊離せし
   めそして単離し、そして必要であれば、得られるかもし
   れない２量体又は多量体をジスルフィド結合を開裂せし
   めるのに適当な還元剤と反応せしめ、そして必要であれ
   ば、得られる還元された生成物をジスルフィド結合の新
   たな形成に適当な酸化剤で処理し；そして所望により、 得られた塩を遊離化合物に、又は得られた遊離化合物を
   その塩に転換する、ことを特徴とする方法。
9. 【請求項９】次のアミノ酸配列： Ala−Cys−Asn−Thr−Ala−Thr−Cys−Val−Thr−His−
   Arg−Leu−Ala−Gly−Leu−Leu−Ser−Arg−Ser−Gly−
   Gly−Met−Val−Lys−Ser−Asn−Phe−Val−Pro−Thr−
   Asn−Val−Gly−Ser−Lys−Ala−Phe−Ｘ （配列中、Ｘは隣接するPheのカルボキシル基と結合し
   てアミド基を形成したアミノ基であり、配列中の２個の
   Cysは遊離であってよく又はジスルフィド結合を形成し
   ていてもよい）を有するペプチド、又はその塩の製造方
   法において、Ｘが酵素的に分解されて-NH₂に転換される
   アミノ酸である上記アミノ酸配列を有するペプチドを該
   酵素により処理し、あるいはＸが酵素の存在下でアンモ
   ニアにより置換され得るアミノ酸である上記アミノ酸配
   列を有するペプチドをアンモニアもしくはアンモニウム
   の存在下で該酵素により処理し；そして所望により、 得られた塩を遊離化合物に、又は得られた遊離化合物を
   塩に転換する、ことを特徴とする方法。